CN107411050A - 灵芝孢子粉提取物的提取方法及其应用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明公开了一种灵芝孢子粉提取物的提取方法及其应用。本发明将灵芝孢子粉破壁后，加25～32倍量乙醇加热至沸腾后保温2小时，经筛网过滤，滤液泵入药液贮罐中；滤渣再用相同的方法重复提取2次，滤液泵入药液贮罐中；将过滤后的滤渣再加25～32倍量饮用水加热至85～95℃，保温2小时，经筛网过滤后，滤液泵入药液贮罐中，滤渣再用相同的方法提取2次，滤液泵入药液贮罐中，合并滤液统一浓缩至相对密度1.04±0.5，得到油状提取物，即灵芝孢子粉提取物。本发明显著地提高了灵芝有效成分的提取率，普遍优于国内现有的提取方法；而且采用本发明的组合物还具有增强免疫力的特点，为保健药品提供了更多品种，便于消费者选用。
Description
技术领域
本发明涉及一种灵芝孢子粉提取物的提取方法及其应用，属于食品医药技术领域。
背景技术
灵芝为多孔菌科(Polyporaceae)真菌赤芝(Leyss.exFr.)Karst.或紫芝G.sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体。灵芝是祖国中医药宝库中的珍品，素有“仙草”之誉。灵芝的子实体具有强烈的药理学活性，有止痛、镇静、解毒的作用，可以抗肿瘤、调节免疫力、降低血糖，具有滋补强身、延年益寿的功效。灵芝孢子是灵芝的精华，如子实体一样，其富含大量生物活性物质，包括脂类、维生素类、三萜类、生物碱类、多糖类、甾醇类、无机离子、蛋白质和氨基酸等。资料显示灵芝孢子粉具有广泛的医用功效，例如，心血管保护、肝损伤保护、调节血糖、调节免疫功能等，其中以免疫调节活性的研究资料最为丰富，且与灵芝补益作用的传统认识相一致。在光学显微镜下，灵芝孢子呈椭圆形，直径为5-8μm，具有双层细胞壁，其主要成分为几丁质酸、木质素、纤维素及Si、Ca、Fe、Mg等金属离子，孢子细胞壁十分结实坚硬，可耐酸、碱、高温及消化酶的作用，灵芝孢子壁阻碍有效成分的溶出，影响体内吸收，因此，对灵芝孢子粉进行适当的加工处理是十分有必要的。
目前灵芝孢子粉常见的处理方法为：破壁及提取。灵芝孢子粉的破壁方法有机械方法和酶法，机械方法通过碾压、挤压、喷射粉碎、气流粉碎、撞击等机械作用破坏灵芝孢子壁，常用的设备有球磨机、高速气流机、碾压机、喷射机等。机械破壁的方法简单易行、破壁率高，易于规模化生产，但所用的机械设备结构复杂、价格及运行成本较高，而且破壁后的孢子粉容易氧化变质；酶法主要通过生物酶(如纤维素酶、几丁质酶等)酶解软化细胞壁，然后再用机械方法进行破壁。该方法的优点是孢子粉的破壁率高，但操作过程比较复杂，且生产成本较高。
灵芝孢子粉的提取方法包括水提法和超临界CO2萃取法。传统的水提法是用水和乙醇在较高温度下对孢子粉进行提取，该方法操作较简单，生产成本较低，但灵芝孢子粉中有效成分的提取不完全，提取物杂质较多，提取率不高。超临界CO2萃取技术是利用CO2在超临界状态下对中草药进行萃取，具有对脂溶性物质提取效率高，无溶剂残留等优点，且该方法工艺简单、能耗低、萃取剂无毒、易回收。但超临界CO2萃取技术所使用的设备价格及运行成本较高，设备维护较为复杂，难以实现大规模的生产。
发明内容
本发明的目的，是提供一种灵芝孢子粉提取物的提取方法及其应用。本发明显著地提高了灵芝孢子粉的提取率，普遍优于国内现有的提取方法；而且采用本发明的组合物还具有增强免疫力的特点，为保健药品提供了更多品种，便于消费者选用。
为达到上述目的，本发明提供的技术方案如下:一种灵芝孢子粉提取物的提取方法，该方法是通过对灵芝孢子粉的破壁、提取及浓缩制备而成。
前述的灵芝孢子粉提取物的提取方法中，将灵芝孢子粉筛选后放置于-15～-5℃环境中保存10～15小时，进行真空干燥处理，使含水量小于5％；在常温环境中对灵芝孢子粉进行机械粉碎破壁，使其破壁率为99％以上、细度在800目间；将破壁后的灵芝孢子粉置于多功能提取罐中，加一定量乙醇加热至沸腾后，保温一定时间然后过滤，滤液泵入药液贮罐中；滤渣再用相同的方法重复提取2～4次，滤液泵入药液贮罐中；将过滤后的滤渣再加水加热至80～95℃，保温一定时间后过滤，滤液泵入药液贮罐中，滤渣再用相同的方法提取2～4次，滤液泵入药液贮罐中，将药液贮罐中的全部滤液统一浓缩至相对密度1.04±0.5，得到油状提取物，即灵芝孢子粉提取物。
前述的灵芝孢子粉提取物的提取方法中，将灵芝孢子粉用300目筛进行筛选，过滤杂质并冲洗；将灵芝孢子粉放置于-12～-9℃环境中保存12小时，进行真空干燥处理，使含水量小于5％；在常温环境中用剪切式破壁粉碎机对灵芝孢子粉进行机械粉碎破壁，使其破壁率为99％以上、细度在800目间；将破壁后的灵芝孢子粉置于多功能提取罐中，加25～32倍量乙醇加热至沸腾后，保持温度2小时，经100目筛网过滤得滤液A和滤渣A，将滤液A泵入药液贮罐中,滤渣A再用相同的方法重复提取1次得滤液B和滤渣B，滤液B泵入药液贮罐中,滤渣B再用相同的方法重复提取1次得滤液C和滤渣C，滤液C泵入药液贮罐中；将过滤后的滤渣C再加25～32倍量饮用水加热至85～95℃，保温2小时，经100目筛网过滤后得滤液D和滤渣D，将滤液D泵入药液贮罐中,滤渣D再用相同的方法重复提取1次得滤液E和滤渣E，滤液E泵入药液贮罐中,滤渣E再用相同的方法重复提取1次得滤液F和滤渣F，滤液F泵入药液贮罐中；将药液贮罐中的全部滤液(即滤液A、滤液B、滤液C、滤液D、滤液E和滤液F)统一浓缩至相对密度1.04±0.1，得到油状提取物，即灵芝孢子粉提取物。
含有前述的灵芝孢子粉提取物的组合物，由灵芝孢子粉提取物，及药学或食品学上可接受的辅料组成；所述的辅料包括溶剂、增溶剂、着色剂、填充剂、矫味剂、防腐剂、包衣材料、芳香剂、稀释剂。
前述的药学或食品学上可接受的辅料，主要是指淀粉、乳糖、环糊精、三氯蔗糖中的一种或多种。
含有前述的灵芝孢子粉提取物的组合物的灵芝孢子粉提取物制剂，所述制剂的剂型为片剂、胶囊剂、微乳剂、脂质体剂、口服液、糖浆剂、颗粒剂、丸剂、微丸剂、散剂、膏剂、丹剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴丸剂、贴剂或缓释制剂。
前述的制剂中，所述颗粒剂的制备方法是，将乳糖及孢子粉提取物置湿法混合颗粒机中制软材，混合5分钟；软材置摇摆式颗粒机中16目筛制粒；制粒后将湿颗粒置热风循环烘箱烘干，控制温度在65±5℃，干燥1.5小时得干颗粒；干颗粒置振荡筛中，用14目、50目筛整粒；将整粒后合格颗粒置多向运动混合机中混合10分钟，得颗粒剂。
前述的制剂中，所述胶囊的制备方法是，在槽形混合机中加入浓缩的孢子粉提取物和淀粉，混合20分钟后送烘箱75±5℃烘3小时，20目粉碎,过40目筛，再75±5℃烘3小时得细粉，将烘干后的细粉于多向运动混合机中混合30分钟，检验合格后，采用1号胶囊填充，得胶囊。
前述的制剂中，所述口服液的制备方法是，将提取后的灵芝孢子粉提取物和适量普罗沙姆188倒入烊糖锅内，搅拌均匀后，加入适量纯化水；加热使其处于微沸并保温一小时；按溶液计加入3％的环糊精和0.05％三氯蔗糖，加纯化水，定容，保温(100℃，0.5h)，放出，降温，过滤，置冷库中冷藏(-2℃～5℃，24h)；将药液用板框过滤机过滤至澄清，得口服液。
前述的制剂中，所述片剂的制备方法是，称取PVPK30(聚维酮K30)，溶于纯化水中配成5％的溶液，过80目筛后作为粘合剂待用；将MCC(微晶纤维素)、L-HPC(羟丙纤维素)、PVPP(交联聚维酮)分别过100目筛，与50目～100目的灵芝孢子粉提取物一起，置湿法混合颗粒机中混合10分钟；缓慢加入粘合剂进行制软材，混5分钟，可在加完5％聚维酮K30溶液后加适量纯化水进行制成软材，纯化水量为可利用物料量的80％；将软材置摇摆式颗粒机中30目筛制粒，湿颗粒置热风循环烘箱内60～65℃烘6小时；干燥后颗粒用20目筛整粒，颗粒除铁，十二烷基硫酸钠过100目筛，先手工将其与一部分颗粒于不锈钢盆中混合4次，每次混合1分钟左右，与剩余的颗粒一起置于多向运动混合机中混合10分钟，放出颗粒并置于压片机中压片，得片剂。
与现有技术比较，本发明对灵芝孢子粉提取物的提取方法作了研究和深入分析后，改进了提取方法和参数，显著地提高了灵芝孢子粉提取物的提取率，普遍优于国内现有的提取方法；而且采用本发明的组合物还具有增强免疫力的特点，为保健药品提供了更多品种，便于消费者选用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但应注意本发明的范围并不受这些实例的任何限制。
实施例1：灵芝孢子粉提取物的提取方法
一、灵芝孢子粉的破壁
1.筛选：将灵芝孢子粉用300目筛进行筛选，过滤杂质；
2.漂洗：用水冲洗过滤后的灵芝孢子粉；
3.真空干燥：将灵芝孢子粉放置于-10℃环境中保存12小时，进行真空干燥处理，含水量小于5％，并将冷冻干燥处理后的灵芝孢子粉置于0℃冷库中保存，确保产品不变质；
4.破壁：在常温环境中用剪切式破壁粉碎机对灵芝孢子粉进行机械粉碎破壁；
5.破壁率检测：检测灵芝孢子粉破壁率，破壁率为99％以上、细度在800目间时，达到合格标准；
6.存储：将破壁后的灵芝孢子粉低温保存备用。
二、灵芝孢子粉的提取
将破壁后的灵芝孢子粉10Kg置于多能提取罐中，加30倍量乙醇加热至沸腾后，保持温度2小时，经100目筛网过滤，滤液泵入药液贮罐中。滤渣再用相同的方法重复提取2次，滤液泵入药液贮罐中。将过滤后的滤渣再加30倍量饮用水加热至90℃，保温2小时，经100目筛网过滤后，滤液泵入药液贮罐中，滤渣再用相同的方法提取2次，滤液泵入药液贮罐中，将药液贮罐中的全部滤液统一浓缩，得到灵芝孢子粉提取物3.98Kg，滤渣5.82Kg。
分别检测原料、灵芝孢子粉提取物和滤渣中多糖及甘油三油酸酯含量，其结果如下表所示：
检测结果表明，灵芝孢子粉提取物中甘油三油酸酯的含量是破壁孢子粉的3倍多，而且经过水提、醇提后，滤渣中基本没有甘油三油酸酯，其提取率达到95％，说明甘油三油酸酯提取比较完全。经提取后多糖含量提高13.6倍。
实施例2：灵芝颗粒剂的制备方法
1.处方
灵芝孢子粉提取物 1500g
乳糖 适量
制成1000袋
2.配料混合、制软材、制粒
将乳糖及灵芝孢子粉提取物置湿法混合颗粒机中制软材，混5分钟。软材置摇摆式颗粒机中16目筛制粒。
3.干燥、整粒、总混
制粒后将湿颗粒置热风循环烘箱烘干，控制温度在65±5℃，干燥1.5小时得干颗粒。
干颗粒置振荡筛中，用14目、50目筛整粒。将整粒后合格颗粒置多向运动混合机中混合10分钟，颗粒半成品检验。
4.包装
将检验合格颗粒置自动包装机中，理论装量为2g，控制装量差异在内控范围±6％(1.88g～2.12g)内。
实施例3：灵芝胶囊的制备方法
1.处方
灵芝孢子粉提取物 1500g
淀粉 适量
共制成1000粒胶囊,每粒装0.2g
2.混合、干燥、粉碎
在槽形混合机中加入浓缩的灵芝孢子粉提取物和淀粉，混合20分钟后送烘箱75±5℃烘3小时，20目粉碎,过40目筛，再75±5℃烘3小时。
3.总混
将烘干后的细粉于多向运动混合机中混合30分钟，半成品检验。
4.填充、灯检、抛光
半成品检验合格的细粉，采用1号胶囊填充，装量为0.2g/粒，使装量稳定在内控±8％(0.276-0.324)之间。将填充好的胶囊送到灯检室灯检，注意湿度≤55％。灯检完毕送到抛光室抛光。
实施例4：
灵芝口服液的制备方法
1.前处理、配液
将提取后的灵芝孢子粉提取物和适量普罗沙姆188倒入烊糖锅内，搅拌均匀后，加入适量纯化水。加热使其处于微沸并保温一小时。按溶液计加入3％的环糊精和0.05％三氯蔗糖，加纯化水，定容，保温(100℃，0.5h)，放出，降温，过滤，置冷库中冷藏(-2℃～5℃，24h)。
2.过滤
将药液用板框过滤机过滤至澄清。
3.灌封
取干净瓶盖，挑选合格后装入下盖斗中，再将检验合格的药液倒入灌封机的贮液筒内，然后调节装量至符合规定后，开机灌封。灌封开始时每十五分钟检查一次装量，稳定后每三十分钟检查一次装量，检查瓶盖的紧密度，灌封时要及时将灌封好的瓶用方盘接取和换上空盘，操作完成后作记录。
4.灭菌
将已灌封的瓶用盘装满后，移至灭菌室的煮瓶机的进料口，由灭菌机传送带缓慢移至沸水中，进行灭菌。沸水温度应控制在95～100℃，传送带行速为全程75～90分钟，以确保药液瓶能在沸水中30～40min内，灭菌完成后，接取已灭菌的方盘，检查漏封后送灯检室，操作完成后作记录。
5.灯检
完成灭菌后，连盘送入灯检室，将瓶整齐推入灯检机进料斗中，先调整视镜清晰度后，开机进行灯检。并剔除破损和不合格品，完成后作记录。
实施例5：灵芝片剂的制备方法
1.处方
2.配料混合、制软材
称取PVPK30(聚维酮K30)，溶于纯化水中配成5％的溶液，过80目筛后作为粘合剂待用。将MCC(微晶纤维素)、L-HPC(羟丙纤维素)、PVPP(交联聚维酮)分别过100目筛，与50目～100目的灵芝孢子粉提取物一起，置湿法混合颗粒机中混合10分钟。缓慢加入粘合剂进行制软材，混5分钟，可在加完5％聚维酮K30溶液后加适量纯化水进行制软材，纯化水量为可利用物料量的80％。
3.制粒、烘干
将软材置摇摆式颗粒机中30目筛制粒，湿颗粒置热风循环烘箱内60～65℃烘6小时。
4.整粒、总混
干燥后颗粒用20目筛整粒，颗粒除铁，十二烷基硫酸钠过100目筛，先手工将其与一部分颗粒于不锈钢盆中混合4次，每次混合1分钟左右，与剩余的颗粒一起置于多向运动混合机中混合10分钟，放出颗粒。颗粒半成品检验。
5.压片、挑片
颗粒半成品检验合格后，置于压片机中，使用浅凹￠9mm上冲、下冲，控制片重差异在±4.5％范围内，硬度在7.0～10.0kg/cm2范围内。压片时每10分钟检查一次片重、硬度并记录。
6.包衣、挑片
将30g欧巴代-93018359和167ml纯化水配置成包衣粉混悬液。包衣液用80目筛过滤，包衣过程中应对包衣液进行搅拌。将检验合格后的素片置于包衣锅中，旋转素片，将包衣液喷射到素片上，喷完后晾片30分钟后取出包衣片。整个过程应保证包衣均匀，避免粘片。
实施例6：增强免疫力动物实验
用近交系雄性小鼠C57BL/6J，6～8周龄，体重18～22g。根据受试物的人口服推荐量设样品低、中、高剂量组分别为250、500、1000mg/kg BW，同时设1个阴性对照组，实验每组15只小鼠。将实施例1中制备的灵芝孢子粉提取物，分别加水配置成1.25、2.50、5.00mg/ml浓度溶液(按样品总重量配置)，给予相应剂量组动物灌胃，灌胃体积为0.2ml/10g BW，阴性对照组给予等体积的纯水，每天灌胃1次，给予时间30天。
1.MTT法ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
1.1仪器和材料
RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)
纱布、200目筛网、24孔培养板，96孔培养板(平底)，手术器械、大号注射器内芯、二氧化碳培养箱、酶标仪、分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。
1.2实验步骤
1.2.1试剂配制
完全培养液RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨酰胺(200mmol/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100ug/L)及5×10－5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。
ConA液用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(-20℃)保存。
无菌Hank's液用前以3.5％的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。
MTT液将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。
酸性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临用前配制。
1.2.2脾细胞悬液制备
无菌取脾，置于盛有适量(3-5ml)无菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3×106个/mL。
1.2.3淋巴细胞增殖反应
将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μl ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，超声震荡(2秒)或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，分光光度计上在波长570nm测定OD值。
1.3数据处理及结果
ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验结果(见表1)表明，样品3个剂量组小鼠的淋巴细胞转化能力均高于阴性对照组(F＝3.514，P＝0.025)，其中高剂量组与阴性对照组比较差异有统计学意义。
表1小鼠免疫功能相关试验结果
2二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应(耳肿胀法)
2.1材料
DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。
2.2实验步骤
2.2.1试剂配制
DNFB溶液DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液(丙酮：麻油＝1：1)，倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250μl注射器通过瓶盖取用。
2.2.2致敏
每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm、用DNFB溶液50μl均匀涂抹致敏。
2.2.3迟发型变态反应(DTH)的产生与测定
5天后，用DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。
2.2.4数据处理与结果
迟发型变态反应试验结果如表1所示，表明样品三个剂量组小鼠的左右耳片重量差值均高于阴性对照组，其中高剂量组与阴性对照组相比差异有统计学意义。
从ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验和迟发型变态反应试验结果，可以判定细胞免疫试验结果阳性。
3.抗体生成细胞检测
3.1仪器和材料
溶血空斑自动图象分析仪、二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、200目筛网、SRBC、补体(豚鼠血清)、Hank's液、RPMI1640培养液、SA缓冲液(C4H4N2O3 0.46g,MgCl2 0.1g,CaCl2.2H2O 0.2g,NaCl 8.38g,NaHCO3 0.252g andC8H11N2NaO3 0.3g,加蒸馏水至1000mL)、灭菌生理盐水、琼脂糖。
3.2实验步骤：
3.2.1 SRBC
绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，生理盐水2500rpm/min，15min，洗涤3次，制备压积SRBC，放入4℃冰箱保存备用。
3.2.2完全培养基的制备：新生小牛血清经绵羊红细胞(v/v，5：1)吸收，4℃，30-60min后，加入不完全培养基RPMI1640中，制备成含20％小牛血清的完全培养基。
3.2.3补体制备
股动脉取血，静置30-60min，2500rpm/min，15min分离血清，将5-10只豚鼠血清混合后，与压积SRBC以5：1(v/v)比例混合，4℃冰箱放置30-60min，间或震荡，2500rpm/min，15min分离血清，分装，-80℃冰箱保存。用时以完全培养基1：10(v/v)比例稀释。
3.2.4免疫动物
压积SRBC以生理盐水制成2％(v/v)的细胞悬液(约1×108个SRBC)，每只鼠腹腔注射0.2mL。
3.2.5脾细胞悬液制备
将SRBC免疫4-5天后的小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾脏，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液，200目筛网过滤，1000rpm/min，10min，去上清，Hank’液洗2遍，以完全培养基RPMI 1640制备成5×106～1×107个细胞/mL的脾细胞悬液。
3.2.6空斑的测定
3.2.6.1底层培养基制备0.5g琼脂糖加入100mL灭菌生理盐水中，加热溶解，待温度于50℃左右时，以1mL/孔的量加至六孔培养板中，琼脂凝固后备用。
3.2.6.2顶层培养基制备0.5g琼脂糖加入100mL Hank’s液中(PH7.2-7.4),加热溶解，以0.5mL/试管的量加至46-50℃恒温的试管中。
3.2.6.3铺板50μl 20％SRBC(生理盐水配制，v/v)、200μl脾细胞悬液先后加入含有0.5mL顶层的试管中，迅速混匀，倒入六孔板中并铺平顶层混合液，每个样本做两个平行孔。
3.2.6.4空斑测定：已制备好培养板放入37℃、5％CO2培养箱中孵育1h，然后每孔加入500μl以完全培养基稀释的补体(v/v，1：10)，继续孵育2h，自动图象分析仪读取溶血空斑图象分析软件计数溶血空斑数。取平行孔空斑数的平均值为样本的溶血空斑数值，以空斑数/106脾细胞表示。
3.3数据处理及结果
抗体生成细胞测定结果如表1所示，其结果表明样品各剂量组小鼠的抗体生成细胞数均高于阴性对照组。
4.血清溶血素的测定(血凝法)
4.1仪器和材料
SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机
4.2实验步骤
4.2.1 SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
4.2.2免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫。4～5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。
4.2.3凝集反应用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μl，再加入100μl0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。
4.3数据处理及结果
血清溶血素测定结果(如表1所示)，表明样品各剂量小鼠的抗体积数均高于阴性对照组。
5.小鼠碳廓清实验
5.1仪器和试剂
分光光度计、全自动酶标仪、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3
5.2实验步骤
5.2.1溶液配制
注射用墨汁 将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍。
Na2CO3溶液 取0.1gNa2CO3，加蒸馏水至100mL。
5.2.2注射墨汁 称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重0.1mL计算。待墨汁注入，立即计时。
5.2.3测定
注入墨汁2分钟和10分钟后，分别从内眦静脉丛取血20μl，并立即将其加到2mL0.1％Na2CO3溶液中。用分光光度计或全自动酶标仪在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。
将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。
以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a：
K＝(lgOD1-lgOD2)/(t2－t1)
5.2.4数据处理及结果
小鼠碳廓清实验结果如表2所示，其结果表明样品各剂量组小鼠的小鼠碳廓清能力均高于阴性对照组。
表2小鼠免疫功能相关试验结果
6.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球试验方法
6.1仪器和材料
Hank's液，小牛血清，PBS缓冲液，生理盐水，荧光微球(φ2μm)，1％小牛血清白蛋白(BSA)。
流式细胞仪，超声清洗仪，二氧化碳细胞培养箱，离心机，6孔培养板，细胞刮，过滤器(75m),流式上样管，流式细胞仪专用鞘液，移液枪及吸头，白细胞计数板，手术器械一套，注射器，滴管，胶头吸管。
6.2实验步骤
6.2.1试剂配制
6.2.1.1 含5％小牛血清的Hank's液：取10ml小牛血清加入200ml Hank's液中，混匀，临用前配。
6.2.1.2 PBS缓冲液的配制方法：KH2PO46.66g，Na2HPO4·12H2O 6.38g，将上述试剂溶于1000ml蒸馏水中调PH值至7.2即成。
6.2.1.3 2％绵羊红细胞悬液的配制方法：实验前取绵羊颈静脉血，置于盛有玻璃珠(20个左右)的三角瓶内，连续顺一个方向充分摇动5～10分钟，除去纤维蛋白，用生理盐水洗涤3次，每次1500rPm，离心10分钟，4℃冰箱保存。实验前弃去上清，按血球压积用生理盐水配制成2％的红细胞悬液。
6.2.1.4 1％BSA的配制：0.5gBSA溶于50mlPBS缓冲液中，临用前配较好。
6.2.1.5荧光微球预调理：100μl荧光微球与10ml 1％BSA37℃避光孵育30min,超声处理5min，临用前配。
6.2.2腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球过程
实验前4天给每只小鼠腹腔注射0.2ml 2％绵羊血红细胞激活小鼠巨噬细胞，实验当天用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液3ml/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔洗液2ml用75μm过滤器过滤至试管内，调整巨噬细胞数为4～6×105/ml。用移液枪吸取1ml腹腔洗液于6孔培养板中，加入已经预调理过的荧光微球(1×107/板)，37℃二氧化碳细胞培养箱(或室温)避光孵育90～120分钟，孵育结束后弃上清(含未贴壁细胞和多余荧光微球)，每次使用1.0mlPBS缓冲液轻轻洗涤2次，去上清后再加入4℃PBS缓冲液0.3ml，用细胞刮刮下贴壁细胞，轻轻吹打均匀后经75μm过滤器过滤后上机分析。
6.2.3流式细胞仪检测分析
6.2.3.1设门：首先设立FSC-SSC二维散点图，通过调节FSC和SSC电压值，以巨噬细胞设门界定分析的巨噬细胞群，最大限度地排除其它有核细胞、细胞碎片等的干扰；
6.2.3.2获取：在荧光微球发射光的荧光通路检测巨噬细胞的荧光强度，每份样本获取5000个巨噬细胞，数据可显示于二维散点图和直方图中。在二维散点图中可通过设门圈定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球的巨噬细胞群；在直方图中可通过标尺标定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球的巨噬细胞群，全部数据经相关软件分析未吞噬荧光微球的巨噬细胞和吞噬不同数量荧光微球的巨噬细胞的比例。
6.3数据处理及结果
吞噬百分率(％)＝吞噬荧光微球的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数＝被吞噬的荧光微球总数/计数的巨噬细胞数
以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行数据转换，式中P为吞噬百分率，用小数表示，然后再进行方差分析。
其结果如表2所示，结果表明样品各剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬指数及吞噬率均高于阴性对照组。
7.NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶测定法)
7.1仪器和材料
酶标仪、全自动细胞计数仪、YAC-1细胞、Hank's液(pH7.2～7.4)、RPMI1640完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.2)、1％NP40或2.5％Triton
7.2实验步骤
7.2.1LDH基质液的配制
乳酸锂5×10-2mol/L
硝基氯化四氮唑(INT)6.6×10-4mol/L
吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)2.8×10-4mol/L
氧化型辅酶Ⅰ(NAD)1.3×10-3mol/L
将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH8.2)
7.2.2靶细胞的传代(YAC-1细胞)
实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。
7.2.3脾细胞悬液的制备(效应细胞)
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s液，1000rpm，10min离心，然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞；或用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
7.3NK细胞活性检测
取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100μl；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
按下式计算NK细胞活性：
NK细胞活性％＝(反应孔OD－自然释放孔OD)/(最大释放孔OD－自然释放孔OD)×100％
7.4数据处理及结果
NK细胞活性需进行数据转换，式中P为NK细胞活性，用小数表示，然后再进行方差分析。
其结果如表2所示，结果表明样品各剂量组小鼠的NK细胞活性均高于阴性对照组。
8.结论
通过ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖转化功能检测，迟发型变态反应检测，小鼠抗体生成细胞数检测，小鼠血清溶血素水平检测，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬红细胞能力检测，碳廓清能力检测，NK细胞活性测定，结果表明本发明所述灵芝孢子粉提取物具有增强免疫力的功能。
Claims (6)
1.灵芝孢子粉提取物的提取方法，其特征在于:该方法是通过对灵芝孢子粉的破壁、提取及浓缩制备而成。
2.根据权利要求1所述的灵芝孢子粉提取物的提取方法，其特征在于:将灵芝孢子粉筛选后放置于-15～-5℃环境中保存10～15小时，进行真空干燥处理，使含水量小于5％；在常温环境中对灵芝孢子粉进行机械粉碎破壁，使其破壁率为99％以上、细度在800目间；将破壁后的灵芝孢子粉置于多能提取罐中，加一定量乙醇加热至沸腾后，保温一定时间然后过滤，滤液泵入药液贮罐中；滤渣再用相同的方法重复提取2～4次，滤液泵入药液贮罐中；将过滤后的滤渣再加水加热至80～95℃，保温一定时间后过滤，滤液泵入药液贮罐中，滤渣再用相同的方法提取2～4次，滤液泵入药液贮罐中，将药液贮罐中的全部滤液统一浓缩至相对密度1.04±0.5，得到油状提取物，即灵芝孢子粉提取物。
3.根据权利要求1或2所述的灵芝孢子粉提取物的提取方法，其特征在于:将灵芝孢子粉用300目筛进行筛选，过滤杂质并冲洗；将灵芝孢子粉放置于-12～-9℃环境中保存12小时，进行真空干燥处理，使含水量小于5％；在常温环境中用剪切式破壁粉碎机对灵芝孢子粉进行机械粉碎破壁，使其破壁率为99％以上、细度在800目间；将破壁后的灵芝孢子粉置于多能提取罐中，加25～32倍量乙醇加热至沸腾后，保持温度2小时，经100目筛网过滤，滤液泵入药液贮罐中；滤渣再用相同的方法重复提取2次，滤液泵入药液贮罐中；将过滤后的滤渣再加25～32倍量饮用水加热至85～95℃，保温2小时，经100目筛网过滤后，滤液泵入药液贮罐中，滤渣再用相同的方法提取2次，滤液泵入药液贮罐中，将药液贮罐中的全部滤液统一浓缩至相对密度1.04±0.1，得到油状提取物，即灵芝孢子粉提取物。
4.含有权利要求1或2所述的灵芝孢子粉提取物的组合物，其特征在于：由灵芝孢子粉提取物，及药学或食品学上可接受的辅料组成；所述的辅料包括溶剂、增溶剂、着色剂、填充剂、矫味剂、防腐剂、包衣材料、芳香剂、稀释剂。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述辅料，选自淀粉、乳糖、环糊精、三氯蔗糖中的一种或多种。
6.含有权利要求4所述的灵芝孢子粉提取物的组合物的灵芝孢子粉提取物制剂，其特征在于：所述制剂的剂型为片剂、胶囊剂、微乳剂、脂质体剂、口服液、糖浆剂、颗粒剂、丸剂、微丸剂、散剂、膏剂、丹剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴丸剂、贴剂或缓释制剂。
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