CN111019882A - 一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法 - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

本发明公开了一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，包括以下步骤：S1：将皮肤表皮破碎，采用不含血清培养基对皮肤表皮干细胞进行培养，当细胞融合度在65％至75％范围内，移去培养基，换成新鲜不含血清的培养基继续对皮肤表皮干细胞进行培养；S2：去除所述S1中的皮肤表皮干细胞，过滤；S3：将所述S2中过滤后的培养液移入离心管中，低温离心，收集上层液；S4：对所述S3中得到的粗液进行过滤处理，对过滤后的粗液浓缩处理，加入PBS缓冲液，高速离心，去除上清液，收集沉淀；S5：取所得沉淀物，通过电镜进行观察鉴定。本发明操作简单，不需要大型且昂贵的设备就能进行作业，成本低，对皮肤表皮干细胞的外泌体分离纯化度高，提高了实验效率。

Description

一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体为一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法。
背景技术
外泌体是由细胞内的多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30～150nm的膜性囊泡。很多细胞均能分泌外泌体，如T细胞、B细胞、树突细胞、肥大细胞和表皮干细胞等。皮肤是人体最大的器官,在抵御微生物入侵、紫外线辐射及防止水分的丢失、调节体温上起重要作用，同时也是免疫系统的组成部分之一，人体表皮干细胞是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞，可使皮肤再生，由于皮肤表皮干细胞再生周期长，随着年龄的增长，皮肤表皮的干细胞数量也在逐渐减少，人体表皮皮肤愈合能力及应对各种皮肤病机能在逐渐下降，了解皮肤表皮干细胞之间传递信息的相互调控机制，有助于解决各种皮肤病问题，所以，需要对表皮干细胞的外泌体进行分离纯化，进而来进行研究，现有技术中对外泌体的提取比较复杂，对皮肤表皮干细胞外泌体的分离纯化研究较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离纯化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，包括如下步骤：
S1：皮肤表皮干细胞培养：将皮肤表皮破碎，采用不含血清培养基对皮肤表皮干细胞进行培养，当细胞融合度在65％至75％范围内，移去培养基，收集皮肤表皮干细胞，换成新鲜不含血清的培养基继续对皮肤表皮干细胞进行培养；
S2：去除所述S1中的皮肤表皮干细胞，过滤；
S3：将所述S2中过滤后的培养液移入离心管中，低温离心，收集上层液得到皮肤表皮干细胞外泌体粗液；
S4：对所述S3中得到的粗液进行过滤处理，对过滤后的粗液浓缩处理，加入PBS缓冲液，高速离心，去除上清液，收集沉淀；
S5：取所得沉淀物，通过电镜进行观察鉴定。
优选的，所述皮肤表皮组织为活性组织，其来源可以是人或其他表皮与人相似的动物。
优选的，所述S1中将皮肤表皮组织破碎成0.8-1mm×0.8-1mm大小的虚。
优选的，所述S1中对皮肤表皮干细胞进行第二次培养时间在24h至36h范围内，待其细胞融合度在85％至95％范围内时，再进行以下操作。
优选的，所述S2中采用0.45μm的过滤膜过滤进行过滤。
优选的，所述S3中离心条件为：4℃，5000-6000g离心25-35min。
优选的，所述S4中采用0.22μm的过滤膜过滤进行过滤，高速离心条件为：常温，20000g离心10-15min。
优选的，所述缓冲液为0.01M PBS缓冲液，缓冲液的PH值在7.3至7.4范围内。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明操作简单，不需要大型且昂贵的设备就能进行作业，成本低，对皮肤表皮干细胞的外泌体分离纯化度高，提高实验效率。
附图说明
图1为本发明的操作流程图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：
一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，包括以下步骤：
S1：取来源于实验白鼠的活性皮肤表皮组织进行破碎，破碎破碎成0.8-1mm×0.8-1mm大小的虚，采用不含血清培养基对皮肤表皮干细胞进行培养，当细胞融合度在65％至75％范围内，移去培养基，收集皮肤表皮干细胞，换成新鲜不含血清的培养基继续对皮肤表皮干细胞进行培养，培养24h-36h，待其细胞融合度在85％至95％范围内时，再进行以下操作；
S2：去除所述S1中的皮肤表皮干细胞，采用0.45μm的过滤膜过滤进行过滤；
S3：将所述S2中过滤后的培养液移入离心管中，在4℃下，5000-6000g离心25-35min，收集上层液得到皮肤表皮干细胞外泌体粗液；
S4：对所述S3中得到的粗液采用0.22μm的过滤膜进行过滤处理，对过滤后的粗液浓缩处理，加入0.01M、PH值在7.3至7.4范围内PBS缓冲液，在常温下，20000g离心10-15min，去除上清液，收集沉淀；
S5：取所得沉淀物，通过电镜进行观察鉴定。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：皮肤表皮干细胞培养：将皮肤表皮破碎，采用不含血清培养基对皮肤表皮干细胞进行培养，当细胞融合度在65％至75％范围内，移去培养基，收集皮肤表皮干细胞，换成新鲜不含血清的培养基继续对皮肤表皮干细胞进行培养；
S2：去除所述S1中的皮肤表皮干细胞，过滤；
S3：将所述S2中过滤后的培养液移入离心管中，低温离心，收集上层液得到皮肤表皮干细胞外泌体粗液；
S4：对所述S3中得到的粗液进行过滤处理，对过滤后的粗液浓缩处理，加入PBS缓冲液，高速离心，去除上清液，收集沉淀；
S5：取所得沉淀物，通过电镜进行观察鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，其特征在于：所述皮肤表皮组织为活性组织，其来源可以是人或其他表皮与人相似的动物。
3.根据权利要求1所述的一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，其特征在于：所述S1中将皮肤表皮组织破碎成0.8-1mm×0.8-1mm大小的虚。
4.根据权利要求1所述的一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，其特征在于：所述S1中对皮肤表皮干细胞进行第二次培养时间在24h至36h范围内，待其细胞融合度在85％至95％范围内时，再进行以下操作。
5.根据权利要求1所述的一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，其特征在于：所述S2中采用0.45μm的过滤膜过滤进行过滤。
6.根据权利要求1所述的一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，其特征在于：所述S3中离心条件为：4℃，5000-6000g离心25-35min。
7.根据权利要求1所述的一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，其特征在于：所述S4中采用0.22μm的过滤膜过滤进行过滤，高速离心条件为：常温，20000g离心10-15min。
8.根据权利要求1所述的一种皮肤表皮干细胞外泌体的分离和纯化方法，其特征在于：所述缓冲液为0.01M PBS缓冲液，缓冲液的PH值在7.3至7.4范围内。
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