JPS60501556A - ヒトの表皮成長方法、産出物およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの表皮成長方法、産出物およびその用途発明の背景 本発明は有用なシート状産出物を産出するためのヒトの表皮細胞の成長、得られ た産出物およびその用途、例えば皮膚移植片細胞としての用途に関するものであ る。

さらに特に、本発明およびそのプＬ１セスの具体化は一部、表皮細胞への表皮の 解離、および免疫刺激抗原を表示しない表皮細胞から本来成る表皮層への表皮細 胞の成長に関するものである。本発明の他の面は、培養成長した少なくとも１層 の表皮から成り、本来無免疫コンピテント表皮細胞から成るシート状産出物、お よび皮膚移植片細胞としての用途を含む。

以前に、本発明者および共同研究者は共同して表皮シートを形成するためのヒト の表皮細胞成長方法を開発した。エイシンガーおよび共同発明者としてヘフトン によるＵ　、　Ｓ　、　４．２５４．２２６を参照。Ｕ　、　Ｓ　、　４．２５ ４．、２２６は後に放棄した母出願連続番号第７４９号の連続出願として出願さ れた。エイレンガ−１人の発明者のｔ前で、火傷被害者の治療におけるエイシン ガーとへフトンの表皮シートの用途をクレームしたＵ　、　Ｓ　、　４．２９９ ．８１９号は連続番号第７４９号の分割出願として出願した。エイシンガーとへ フトンのプロセスおよび表皮シート産出物に関する仕事はエイシンガーらによる ［ヒトの表皮細胞培養：皮膚−特表昭ＧＯ−５０１５５Ｇ　（３） コンポーネントまたは培地追加のない場合の成長と分化」、プロシープインク・ オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイーｒンシズ・オブ・ザ゛・ユナ イデッド・ステーク・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＩＩ、Ｓ、Ａ。

第７６巻、第１０号５３４０〜５３４４頁（１９７９年１０月）に記載されてい る。また、エイシンガーらによる「分散した単細胞調製物からの生体外の表皮細 胞成長のシートによる傷［］の被覆」、サージエリ−、セント・ルイス、第８８ 巻第２号２８７〜２９３頁（１９８０年８月）を参照。

エイシンガーとへフトンの上記従来技術のプロセスは要約すると、ヒトの皮膚の 表皮を真皮から分離し、表皮を表皮細胞に解離し、表皮細胞を組織培養培地で成 長させる一連の工程を広く含む。特定のプロセス条件はエイシンガーらによって 上記工程の各々に使用するために開示されているが、一定のこれらのプロセス条 件は本発明の細胞成長プロセスの具体化における相当するプロセス工程に関連し て以下に詳細に述べる。

多くの従来技術のプロセスがあるが、例えば表皮細胞を成長させるためのエイシ ンガーとへフトンの方法では、ある程度゛まで得られた産出物は前駆体細胞の供 与者に血縁関係のない受容者のための皮膚移植片として用いられる場合拒否反応 を示したが、この理由は成長組織のヒト表皮細胞の副集団の移植免疫原が存在す るため受容者による皮膚移植片細胞の拒否反応があるからである。移植免疫原は ランゲルハンス細胞と他の細胞側集団に存在し、後者は恐らく樹枝状表皮細胞で あろう。上記引用の刊行物、エイシンガー、１，９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、よれば、へＴＰアーセ染色は免疫コンピテントラン ゲルハンス細胞の存在を決定するための分析手段として用いられ、この細胞は移 植拒否反応を起こす表面抗原を運搬する細胞に含マれる。エイシンカーとへフト ンの産出物は２〜３％のＡＴＰアーセ陽性細胞を含む。

モレンらの［−土潜養したヒＩ−の表皮細胞はＩＩＬＡ−１］ｒを合１友しない −１、す・シ＋−−−ナル・オブ・インベスチゲーｉイフーテ゛ルマトロジー（ Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　（汀１ｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ１１ｃｒｍａｔｏｌ ｏｇｙ）７８：３２−３７（１９８２）は、７　Ｅｌまたはそれ息子の培養期間 に続いて、免疫刺激抗体（Ｉ（Ｌ、△−１１ｒ）もランゲルハンス細胞も含まな いコラーゲンケルまたはセラチン膜の一４二で成長した表皮細胞培養が？−られ ることを述べでいる。本発明者はモレンの産出物においてＨＬ　Ａ１１ｒ免疫原 が存在しないのは、多分ｍＪコラーゲンたはセラチン基質の使用を含め−Ｃ１培 養因ｒの組合せに依存し、中に培養の持続にだけ依存するのではない、Ｔｈ（ｉ している。、本発明者はモレンらと同し程度の長さの時間で表皮細胞の培養を１ ｊっだ３、さらに、モレンらは、（１）これらの培養皮ＪＲ細胞はランゲルハン ス細胞であると期待されるが若干の免疫適格性を有する非うンケルノ＼ンス樹枝 状細胞のタイプではない場合、若干のΔＴＰアーセ陽性細胞を含むことを述べて いる、（２）表皮細胞から成る完全な自己保持シー１−を産出する方法は記述し ていない。モレンの裏構造はそれ自体が、コラーゲンまたはセラチン基質を含め 、皮膚移植片としてあまり適さない。

本発明者らの初期の仕事はへフトンらの「てんしくねずみの表皮細胞培養：集密 的シートの開発とその移植−］フェデ７　Ａ／　・ブロシーディンクス（Ｆｅｄ ｅｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）。

第３９巻３７６　（１９８０）によって要約され、移植を同系動物に行ったが、 ヘフトンらによる１−ヒトの表皮細胞は培養成長後には同系リンパ球をも早刺激 しない」ジャーナル・オブ・インベスチゲーティブ・デルマｌ−ロジー、第７６ 巻３０８　（１９８１）では培養細胞集団はＨ’　ＬＡ−１］「抗原４示す細胞 を低い割合でまだ含んでいた。

従って、本発明の目的は、皮膚移植片きして有用な、集密的または会合したヒト の表皮細胞から形成した表皮シートを提供することにある。

本発明の他の目的は１またはこれ以上の層の△Ｔ　Ｐアーゼ陰性ヒト表皮細胞か ら本来形成した冗全な自己保持表皮シートを提供するこさにある。

、さらに本発明の他の目的は同種移植片２−５シて慣用な、すなわち供給者上血 縁関係のない患者のための表皮シートを提供することにある。

本発明の他の１」的は１またはこれ息子の層のヒトの表皮細胞の完全な自己保持 シーＩ−を生成するためのヒト表皮細胞を培養する方法に関するものであり、シ ートは本来△ＴＰアーゼ陽性細胞と移植免疫適格抗原を含む他の細胞とを含まな い。

さらに本発明の他の目的は、ここに開示したような表皮細胞を、影響を及ぼす領 域に適用するように、皮膚移植片を必要とする火傷者または他の患者を治療する ための方法を提供することにある。本発明の表皮シートの他の用途は当業者には 明らかであるが、その若干を以下に述べる。

本発明によれば、皮膚成分の存在しない生体外でヒトの表皮細胞を成長させて免 疫コンピテント細胞を含まな己保持シートを形成し、解離した表皮細胞を組織成 長前に本来免疫コンピテント細胞の全部を選択的に除くことができる方法で処理 する。本発明の具体例のひとつでは：細胞を酵素的に処理し、ｔ（ＬＡ−Ｏｒ抗 原を示す細胞および全部のＡＴＰアーゼ陽性細胞を含めて、本来全部の免疫コン ピテント細胞を破壊する。他の具体例では、解離表皮細胞を、ΔＴＰアーセ陽性 細胞を含めて、免疫コンピテント細胞に選択的に結合するプロティンで処理する 。

さらに特に、本発明の上記第１のプロセス例の好ましい面によれば、ＡＴＰアー ゼ陽性細胞および／または他の免疫刺激細胞を含有する表皮細胞の単細胞けん濁 液をデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）の存在で培養し、そのままの細胞 を収集し、次いで収集した細胞を培養し純粋な表皮細胞の自己保持シートを生成 する。

本発明の上記第２のプロセス例の好ましい面によれば、ＡＴＰアーゼ陽性細胞お よび／または他の免疫刺激細胞を含有する表皮細胞の単細胞けん濁液をタバコグ リコプロティン（ＴＣＰ）の存在で培養し、ＴＣＰが結合しない表皮細胞を収集 し、収集した細胞を培養し純粋な表皮組織の自己保持シートを生成する。

本発明の好適例では、収集した細胞を約６．５〜７．２のｐｔ＋を有する組織培 地中プラスチックフラスコで成長させる。

発明の詳細な説明 本発明の実施において、ヒトの皮膚を、可能な皮膚移植受容者に血縁関係のない 死体のような適当な供与者から得る。゛従って、本発明の皮膚移植産出物を、定 量的に製造し、受容者による免疫拒否反応に関係することなく必要な際に効力を 与える条件下に包装し貯蔵することができる。

特に、表皮シート製造プロセスは、ヒトの皮膚の表皮を従来法の技術を用いて真 皮から分離することができる。一般に、トリプシン含有培質中で皮膚標本を培養 し、続いて表皮を真皮から機械的に分離する。しかし、ここで推奨する方法では 、トリプシン濃度を従来技術で教示されていると考えられる水準を超えて高くす る。上述のエイシンガーとへフトンの方法およびモレンの論文には真皮を表皮か ら容易に分離するように０，２５％と０．３％のトリプシン溶液の使用を開示し ている。また、本発明者の好ましい方法は０．５％のトリプシン溶液での培養を 採用している。推奨できる工程では、約３２〜４０℃、好ましくは約３７℃にて 、約４５〜１２０分間、好ましくは約９０分間、約０．３〜０．７５％のトリプ シン溶液、好ましくは約０．５％のトリプシン溶液中で培養する。

真皮を表皮から分離後、表皮を主として単細胞中に解離し、液体媒質中に表皮細 胞の単細胞けん濁液を生成する。解離と付随して、または解離後であるが相当な 組織シート成長前に、表皮細胞を免疫コンピテント細胞を全体の表皮細胞集団か ら選択的に除去することができるように処理する。

上述のように、本発明はＡＴＰアーゼ陽性細胞と他の免疫コンピテント細胞を残 りの表皮細胞から除去することができる２種のプロセス技術を含む。これら２種 の広い具体例を他方を除外して１方を実施するために開示するが、これには、不 適当な実験をすることなく、両方の技術を用いる組合せた同時または連続した方 法を用いることができる。

望ましくないＡＴＰアーゼ陽性細胞と他の免疫コンピテント細胞を残部から分離 することができる好ましいプロセス具体例は、ＤＮアーゼ中の表皮単細胞の培養 を含む。単細胞を約０．１〜０．６％のＤＮアーゼの水溶液に都合よく分散する ことができ、中の温度を約１８〜３７℃の温度、好ましくは約２０〜２５℃の温 度に保持し、約１０〜６０分間、例えば殺菌ガラス棒を用いてはげしくかきまぜ る。

上記−ＤＮアーゼ濃度は、蛋白質１ｍｇ当たり約１４．０００クニツ（Ｋｕｎｉ ｔｚ）ユニットの活性を有するシグマ（ミズリー州セントルイス）から入手でき る００７５１　（ＯＮ−１００）　Ｄ　Ｎアーゼを使用したものに基づく。ＤＮ アーゼ濃度の調製は、機械的計算と実験によって、使用したＤＮアーゼの活性に 基づいて行う必要がある。従来の分析技術、例えばＨＬＡ−叶抗原のための免疫 螢光染色、ランゲルハンス細胞の超構造同定、ＡＴＰア゛−ゼ染色等を用いてＤ Ｎアーゼ培養工程をモニターすることができる。上記低範囲に対するＤＮアーゼ の濃度は一層高いＤＮアーゼ濃度の使用よりも培養時間が長いことが期待される 。現在、推奨されるＤＮアーゼ濃度は約０．５％である。ＤＮアーゼを等張力性 媒質、例えばＭＥＭ、ＰＢＳ、通常の食塩水等に溶解することができる。本発明 者らは約３０分間約２１℃にて０．０２５％のＤＮアーゼ培養を使用すると、培 養前の５〜７％の前記細胞と比較して、培養の２日後に、細胞が同種Ｔ細胞を刺 激する必要があるＨＬＡ−Ｏｒ抗原を持った約０．５％の細胞が残っていること を見出した。特にＭＳＬＲ（混合皮膚細胞リンパ球反応）における同種１９７８ 球の増殖を刺激するための表皮細胞の能力は、組織不適合性の１つの測定として 役に立つことができる。

上記から、ΔＴＰアーゼ陽性細胞と他の免疫刺激細胞の全部を除去しない条件下 で上皮単細胞を懸濁処理し、残りの細胞が培養中に消散するような範囲まで水準 を減らすことができる。ＤＮアーゼを用いた処理は、ＡＴＰアーゼ陽性細胞と他 の免疫刺激細胞の全部を細胞培養前に除去する条件下であることが好ましい。

望ましくないＡＴＰアーゼ陽性細胞と他の免疫刺激細胞の除去のための第２の技 術は、望ましくない免疫コンピテント細胞に選択的結合するクリコブロチインと 表皮単細胞が付着することである。付着と同時にまたは付着後に、グリコプロテ ィンが付着した細胞を所望の（非免疫刺激）ｗＥ胞から分離し、この細胞はグリ コプロティンＩ−会合しない。現在、好ましいクリコブロチインはタバコグリニ Ｊプロティン（ＴＣＰ）であり、これはべ・ンカーらにっ−Ｃ「タバコ、ココア 、コーヒー、およびブタク勺：因子Ｘｌｌ従属系路を活性化する交叉反応アレル ゲン４Ｉブラツト（Ｂｌｏｏｄ）　、第５８巻第５号、８６１頁（１９８１）に 詳細に記載されている。他のプロティンは、ルチン、ココア抗原等のような構造 的に′ｉ’　ｃ　ｐに関係がある少なくとも若干のものを含め−Ｃ１通常の実験 によって本発明のＴＧＰと置換するこＬができる。Ｔ　ＣＰの使用を含めて用い られた提案されたプロセスはＴ　ＣＰを固相、例えばガラスヒ′−ズまたはセフ ァロースカラムに付着させ、例えばｉ”　Ｇ　Ｐセファローズカラム単細胞懸濁 液を通過させて、この懸尚液と固相を接触させ、固相から解離した残部の細胞を 回収する（アフィニティクロマトクラフィー）。

１）　Ｎアーセの用途に戻ると、培養処理後、全細胞を濾過装置を用いて通し濾 過を行う一方、単細胞よりも大きいくずの塊を残す。酵素および／またはその断 片によって破壊される細胞は一緒に単細胞より大きい単位に固まらせる。例えば 、殺菌ガーゼフィルターを用いることがＨできる。その後、細胞を収集し、遠心 分離によって例えば１０分間２００　ｇにて濃縮する。

望ましくないＡＴＰアーセ陽性細胞と他の免疫コンピテント細胞の除去後、残り の表皮細胞を組織培地で成長上記エイシンガーとへ丹ンのプロセスを、この段階 で用いることができ、組織成長は培地のｐＨを約ｐＨ６，５〜７．２に調製する と増大することを見出した。このとき推奨される組織培養成長条件は３７℃付近 の温度、１００％のａ度、約２０％のウシ胎児血清を含有する細胞培地を用いる ことＩ　であり、細胞は培地１　ｍｐにつき約１−０Ｓ〜１０８個の最終密度に なるようにプラスチック組織培養容器に接種する。

培地によって被覆されたフラスコの表面積５　ｃｍ２につき培地１　ｍｌを各フ ラスコに添加する。従って接種密度は、フラスコ表面積５ｃｍ２につき１０５〜 １０’個の細胞さして表わすことができる。

所望の組織シートの厚さによって継代培養を約７〜２１日間行うことができる。

時には表皮細胞の単層から成る表皮シートが有用であるが、大抵の場合移植産出 物の生成を含めて、多層の完全表皮シートが好ましい。単層生成物または若干の 細胞層を有する生成物を傷の深さ、傷の大きさ等の因子に基づき使用する。

表皮シートはプラスチック培養フラスコに付着する。

表皮シートを除くため、組織シートとプラスチックの境界面にて優先的に働く酵 素を用いることができ、例えば約０．１〜１．０％の濃度でディスパーザを用い る。このディスパーゼ濃度は酵素の特定活性に依存し、ここで用いたディスパー ザは凍結乾燥した酵素１ｍｇにつき０．５単位の特定活性を有する。通常の実験 では使用すべき正しい量の酵素を示す。

移転部分、例えば豚皮の皮膚側、コラーゲンスポンジ。

ポリビニリデンポリマー、ポリエステルまたはヒドロゲルのシートまたはワセリ ン含浸ガーゼを表皮シートをプラスチック成長フラスコから移すために用いるこ ２ができる。表皮シートをこの種の除去のための移転部分に浮かべるかまたは直 接適用する範囲、例えば火傷患者の患部に浮かばせる。

上述のように、本発明の顕著な利点は免疫刺激抗原を含まないヒトの表皮細胞か ら成る単または多層表皮シートの供給である。ここに使用する「免疫コンピテン ト細胞を本来含まない」の語は、関連のない受容者に対し組織を皮膚移植片よし て使用する場合に免疫拒否反応が起こらない程、免疫コンビテン１−細胞の水準 が低いことを意味する。同様に、「△ＴＰアーゼ陽性細胞を本来含まない−４の 語は血縁関係のない受容者に対しａ織を皮膚移植片として使用する場合に拒否反 応を起こす水準よりもΔ′１゛Ｐアーゼ陽性細胞の水準が低いことを意味する。

以下に示す実施例は免疫螢光染色によっておよびΔＴＰアーゼ染色によって試験 するとき何も免疫コンピテント細胞を含まない表皮細胞組織を与えた。従って、 供与者さ血縁関係のない火傷患者に移植を行うことができ供与者は死体でもよい 。勿論、本発明によって提供される表皮シートについて他の用途もあり、例えば 薬品試験等、すなわち、例えば皮膚に接触するシャンプーや化粧品のような種々 の物質の試験に対する用途がある。

以下の実施例は本発明の具体例を示すものである。

実施例　１ 部分的に厚い皮膚片をケラトム（ｋｅｒａ　ｔｏｍｅ）を用いて除去シ、ペニシ リンＬ　０ＯＯＩＪ／＋＋＋　１２　、ストレプトマイシン１、０００ｍｃｇ　 ／　ｍ（２，菌類帯２５ｍｃｇ　／　ｍ　Ｒおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ ）を用いて、４℃にてイークルの最小必須培地（ＭＥＭ）’（二。−ヨーク州　 グランド　アイランド　ビオロジカル　コンパニイ）に浸した。次いテ皮膚を５ ｍｍ２の破片に切断し、９０分間３７℃にてリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（ＧＩＢ ＣＯ）に溶がしり０．５　％ト！Ｊ　７”シン（１：２５０．ミシガン州デトロ イト　ディフコ）溶液で培養した。

培養後、表皮層を下にある真皮から分離し、ＰＢＳ中０．５　％ＤＮ７−セ（Ｄ Ｏ７５１（ＤＮ−１００）、ミスーリ州セントルイス　シクマ）に単細胞を分肢 させ、約３０分間室温にてはげしくかきまぜＤＮアーゼ中に保持する。殺菌ガー ゼを通して濾過後、細胞を遠心分離（１ｏ分、　２００ｇ）によッテ収集し、ｐ Ｈ５，８−６，０ニテ完全培地（ＣＭ：ＭＥＭプラス２　ｍＭ６Ｄ　ｌ−グルタ ミン（ＧＩＢｃｏ）、２０％ノＦ　Ｂ　Ｓ　。

ペニシリン１０００／ｍ　１　、ストレプトマイシン１００ｍｃｇ／ｍ　１２菌 類帯２．５ｍｃｇ／ｍ！およびヒドロコーチシン０．１ｍＭ（ペンシルベニア州 ウェスト　ポイント　メルク　シャープ　アンド　ドーム）に懸濁させる。こ・ の方法で調製した細胞の生存度はトリパンブルー色素排除によって９０〜９０％ であった。細胞を培地１　ｍｆｆにつき細胞２Ｘ１０５〜１０８個の最終密度で プラスチック組織培養フラスコに接種した。

培養物を３７℃空気にて９５％１００２５％の雰囲気で１００％湿度において培 養した。培地を３日毎に変えると培養物は１４〜２１日後に集密的になった。培 養した表皮細胞を集合毎に、例えばこの特別な場合に３〜４週間後、組織培養フ ラスコから除くことができる。フラスコから除去した後、細胞を２４時間ＦＢＳ のないＭＥＭで培養した。

リン１．００００’／ｍβ、菌類帯２！５　ｍｃｇ／ｍＡおよび１０％ウシ胎児 血清（ＦＢ’Ｓ）を用いて４℃にてイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）に浸しな 。次いで皮膚を５ｍｍ２片にて切断し、９０分間３７℃にてリン酸緩衝溶液（Ｐ ＢＳ）（ＧＩＢＣｏ）に溶かした０、５％トリプシン（１：２５０．ミシガン州 デトロイト　ディフコ）溶液で培養した。細胞を収集しＰＢＳ溶液に移した。

タバコグリコプロティン（ＴＣＰ）（またはウシ血清アルブミンと共役したルチ ン（ルチン−ＢＳＡ））をベラカーらの方法によって単離した。次いでＴＣＰま たはルチン−ＢＳＡをセファローズ−４Ｂにカップルし、カラム（１，５Ｘ２０ ｃｍ）に充填し、室温にてＭＥＭで洗浄した。カラムをＰＢＳ溶液で平行にした 。表皮単細胞をカラムに与え、ＭＥＭを加えてケラチン生成細胞を洗い流出液を 集める一方、免疫コンピテント細胞はグリコプロティン被覆ビーズに付着した。

カラムに通した後、細胞を遠心分離（１０分、　２００ｇ）によって集め、完全 培地（Ｃ：ＭＥＭプラス２ｍＭの１−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）、２０％ＦＢＳ 、ペニシリン１００Ｕ／ｍ　ＩＩ　、ストレプトフィシン１００ｍｃｇ／ｍβ、 菌類帯２．５ｍｃｇ／ｍ　ＩＩおよび０．１ｍＭハイドロコーチシン（ペンシル ベニア州ウェスト　ポイント　メルク　シャープ　アンド　ドーム）にｐＨ５， ８〜６．０にて再懸濁させた。この方法で調製した細胞の生存度はトリパンブル ー色素排除によって９０〜９５％であった。細胞を培地１　ｍｌにつき細胞１０ ５〜１０８個の最終密度でプラスチック組織培養フラスコに接種した。培養物を ３７℃にて空気９５％／Ｃ０２５％の雰囲気で１００％湿度において培養した。

培地を３日毎に変えると培養物は１４〜２１日後に集密的になった。培養した表 皮細胞を集合毎にディスパーザのよう列中性プロテアーゼを用いて組織培養フラ スコから除くことができる。

免疫コンピテント細胞の不在は、２つの試験法につきゼロパーセントの免疫テコ ンピテント細胞を含む本発明の細胞集団を用いて、２つの試験法（細胞集団をシ ート成長後の単細胞懸濁液として試験することができる）によって決定した。

ＡＴＰアーゼ染色 この方法では培養細胞を６％の冷中性ホルマリン溶液に固定する。次いで細胞を ３０ｍｊ？の０．２％硝酸塩および５　ｍ（ｌの蒸留水と混合した０、２Ｍ１− ’Ｊス緩衝液に溶かした５ｍβの１．２５％グリセロリン酸ナトリウムに１８０ 分間３７℃にて培養させる。培養後、培養細胞を生水で洗浄し、数分間希硫化ア ンモニウムに浸す。調製物をグリセリンで覆い光学顕微鏡で観察する。ＡＴＰア ーゼ活性を含む細胞は硫化鉛の黒い沈澱によって現れる。

免疫螢光染色 １０６個の細胞を含有する細胞懸濁液を２％のウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−Ｂ ＳＡ）　（ベンテックス）および０．１％のアジ化す）　ＩＪウムを含有するリ ン酸塩緩衝食塩水で２回洗浄した。細胞を遠心分離（２’００ｇ、　１０分）に よって収集し、市販品として入手できる抗Ｏｒ血清＜１：１００希釈）２０μβ に再懸濁させて、３０分間４℃にて培養した。この培養後、細胞をＰＢＳ−ＢＳ Ａで２回洗浄し遠心分離（２００ｇ、　１０分）によって収集した。抗体結合は 細胞を３０分間４℃にてうさぎ１ｇ６分子に対して向けられた山羊抗血清からの 市販品として入手できる螢光インチオシアネー）　（ＰＩＴＣ）共役Ｆ（ａｂ’ ）２破片を用いて培養することによって視覚化させた。この培養後、細胞を２回 ＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄、遠心分離（２００ｇ、　１０分）によって収集した。細 胞小球を少量のＰＢＳ−ＢＳＡに再懸濁させ、次いで付随した照明のために装備 されたレイン・オクトラックス顕微鏡を用いて密閉カバースリップ下に螢光を調 べた。

本発明の純表皮細胞シートを血縁関係のない受容者に移植するために用いた。使 用した手順は、切除後、３〜４日間殺菌した豚皮で第２度に火傷した傷をおおい 、早く肉芽が発生するように寝かしておいた。次いで豚皮を除き、傷に面したシ ートの片側を用いて肉芽組織の上に培養表皮細胞シートを置いた。次いで傷を湿 った包帯で手当する。移植後表皮細胞が２４〜４８時間で付着した後、培養移植 片を閉塞または半閉塞させた包帯で再手当することができる。ゆ着した移植領域 は拒否反応を何も示すことなく、従来の厚さが薄い自家移植片を用いて移植した 第２の火傷領域に似ていた。

ここで示した百分率は全部容量である。

本発明の産出物の他の用途は当業者に明らかであり、例えば美容外科または外科 腫瘍を受けている患者、火傷とは別の外傷を有する患者などに移植する。本発明 の他の変更は、ここに開示された培養方法の改良を含めて、本発明の精神と領域 から離れることなく、熟練した技術者によって認められるであろう。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒトの皮膚の表皮を真皮から分離し、表皮を免疫コンピテント細胞および非 免疫コンピテント細胞を有する解離した表皮細胞に解離し、解離した表皮細胞を 組織培地に成長させて表皮細胞シートを形成する組織培地におけるヒトの表皮細 胞成長方法において、免疫コンピテント細胞を本来台まない解離した表皮細胞の 副次集団を分離し、細胞の前記副次集団から表皮細胞の完全な自己保持シートを 成長させる工程から成るヒトの表皮細胞成長方法。 ２　前記解離した表皮細胞を選択的に免疫コンピテント細胞を破壊する酵素で処 理し、次いで非免疫コンピテント細胞を免疫コンピテント細胞を本来台まない細 胞の前記副次集団として回収する請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　前記解離した表皮細胞を選択的に免疫コンピテント細胞に付着するプロテ ィンで処理し、次いで付着したプロティンを有する細胞を４１１着したプロティ ンを有しない細胞から分離し、付着したプロティンを有する細胞を回収し、免疫 コンピテント細胞を本来台まない細胞の前記副次集団として使用する請求の範囲 第１項記載の方法。 ４、　酵素がＤＮアーゼである請求の範囲第２項記載の方法。 ５、ＯＮアーゼの濃度が約０．１〜０．６％である請求の範囲第４項記載の方法 。 ６、　処理を約２０〜２５℃にて約１０〜６０分間行う請求の範囲第５項記載の 方法。 ７、　プロティンがタバコクリコブロチインまたはルチンである請求の範囲第３ 項記載の方法。 ８、　プロティンを固相に付着し、次いで解離した表皮細胞を固相と接触させる 請求の範囲第３項記載の方法。 ９、　プロティンを固相に付着し、次いで解離した表皮細胞を固相と接触させる 請求の範囲第７項記載の方法。 １０、細胞の副次集団がＡＴＰアーゼ陰性細胞から成る請求の範囲第１項記載の 方法。 １１、細胞の副次集団がＡＴＰアーゼ陰性細胞から成る請求の範囲第２項記載の 方法。 １２、細胞の副次集団がＡＴＰアーゼ陰性細胞から成る請求の範囲第３項記載の 方法。 １３、細胞の副次集団がＨＬＡ−Ｏｒ抗原を示さない細胞から成る請求の範囲第 １項記載の方法。 る請求の範囲第２項記載の方法。 １５、細胞の副次集団がＨＬＡ−叶抗原を示さない細胞から成る請求の範囲第３ 項記載の方法。 １６、細胞の副次集団がＨＬＡ−叶抗原を示さない細胞から成る請求の範囲第１ ０項記載の方法。 １７、細胞の副次集団が旧、Ａ−叶抗原を示さない細胞から成る請求の範囲第１ １項記載の方法。 １８、細胞の副次集団が肛Ａ−Ｏｒ抗原を示さない請求の範囲第１２項記載の方 法。 ｌ°９０組織培養を約６．５〜７．２のｐｕにて行う請求の範囲第１項記載の方 法。 ２０、組織培養を約６．５〜７．２のｐｕにて行う請求の範囲第２項記載の方法 。 ２１、組織培養を約６．５．〜７．２のｐｌにて行う請求の範囲第３項記載の方 法。 ２２、組織培地を１　ｍ（ｌにつき細胞１０５〜１０８個の密度にて接種する請 求の範囲第１９項記載の方法。 ２３、組織培地を１ｍｌにつき細胞１０５〜１０８個の密度にて接種する請求の 範囲第２０項記載の方法。 ２４、組織培地を１　ｍｌｌにつき細胞１０５〜１０８個の密度にて接種する請 求の範囲第２１項記載の方法。 ２５、表皮細胞のシートが組織培養容器に付着し、シートを中性プロテアーゼを 用いて処理して容器から分離する請求の範囲第３項記載の方法。 ２６、真皮からの表皮の分離を０．３〜０．７５％トリプシン溶液中で皮膚培養 によって促進する請求の範囲第１項記載の方法。 ２７、請求の範囲第１項記載の方法によって産出した表皮シート。 ２８、請求の範囲第２項記載の方法によって産出した表皮シート。 ２９、請求の範囲第３項記載の方法によって産出した表皮シート。 ３０、組織培養において成長し、免疫コンピテント細胞を本来台まない非免疫コ ンピテントヒト表皮細胞を本来有する自己保持表皮シート。 ３１、前記シートがＡＴＰアーゼ陰性細胞から成る請求の範囲第３０項記載の表 皮シート。 ３２、前記シートがＨＬＡ−Ｏｒ陰性細胞から成る請求の範囲第３０項記載の表 皮シート。 ３３、前記シートがＨＬＡ−Ｏｒ陰性細胞から成る請求の範囲第３１項記載の表 皮゛シート。 ３４、非免疫コンピテント細胞から成る請求の範囲第３０項記載の表皮シート。 ３５、請求の範囲第２７項記載の表皮シートを患部に適用することから成る皮膚 移植を必要とする患者を治療する方法。 ３６、請求の範囲第３０項記載の表皮シートを患部に適用することか°ら成る皮 膚移植を必要とする患者を治療する方法。 ３７、患部が火傷である請求の範囲第３５項記載の方法。 ３８、患部が火傷である請求の範囲第３６項記載の方法。