CN109943523A

CN109943523A - 胚胎多肽粉末的制备方法

Info

Publication number: CN109943523A
Application number: CN201910219329.XA
Authority: CN
Inventors: 林耕宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2019-06-28

Abstract

本发明提出了一种胚胎多肽粉末的制备方法，包括(1)选取第3‑5代胚胎干细胞，当细胞汇合度达60％‑80％，加入含有体积分数为10％预处理胎牛血清的DMEM/F12培养基培养48‑72h，收集细胞上清，超速离心得到外泌体；(2)将上述外泌体以2500‑3000转/分的离心速度离心40‑60min，取上清液，得生物活性多肽提取液，得到的生物活性多肽提取液用0.6um的滤膜抽滤，再用截留分子量为6kD的超滤膜超滤，室温搅拌2‑3h后过滤，除去活性炭，再经真空浓缩、喷雾干燥，得到胚胎多肽粉末。本发明选用第3‑5代胚胎干细胞的外泌体制备多肽粉末，更利于人体吸收。

Description

胚胎多肽粉末的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽物质领域，特别是指一种胚胎多肽粉末的制备方法。

背景技术

泌体是细胞内源性的小囊泡，由大多数细胞分泌。在抗原呈递细胞中的外泌体发挥作用的报道后，人们对外泌体的兴趣增强，并且观察到它们可以在体内刺激免疫应答。在20世纪80年代，外泌体被描述为从网织红细胞分泌的内体来源的囊泡。人们对这些细胞外囊泡的兴趣逐渐增加，因为它们似乎参与了很多细胞过程。外泌体携带蛋白质、脂质和RNAs，介导体内不同细胞类型之间的细胞间通讯，从而影响正常和病理状态。

肽涉及人体的各个领域，如神经、细胞生长、激素和生殖。人体很多活性物质都是以肽的形式存在的。多肽能够调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应。目前肽的生产方法包括如下几种：固相合成法、液相合成法、酸解法、碱解法以及酶法等，但都有各自的局限性。

发明内容

本发明提出一种胚胎多肽粉末的制备方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种胚胎多肽粉末的制备方法，包括：

(1)选取第3-5代胚胎干细胞，当细胞汇合度达60％-80％，加入含有体积分数为10％预处理胎牛血清的DMEM/F12培养基培养48-72h，收集细胞上清，超速离心得到外泌体；

(2)将上述外泌体以2500-3000转/分的离心速度离心40-60min，取上清液，得生物活性多肽提取液，得到的生物活性多肽提取液用0.6um的滤膜抽滤，再用截留分子量为6kD的超滤膜超滤，室温搅拌2-3h后过滤，除去活性炭，再经真空浓缩、喷雾干燥，得到胚胎多肽粉末。

作为优选的技术方案，所述预处理胎牛血清为胎牛血清经100000g离心并过滤后进行预处理。

作为优选的技术方案，所述超速离心的步骤如下：

2 000g 4℃离心20min去除细胞，10 000g 4℃离心30min去除细胞碎片，100 000g4℃离心70min后，上清为无外泌体培养基，移去并保存，利用1mL PBS重悬沉淀后，100 000g4℃离心70min，100μL PBS重悬沉淀。

作为优选的技术方案，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞或羊胚胎干细胞。

有益效果

(1)本发明选用第3-5代胚胎干细胞的外泌体制备多肽粉末，更利于人体吸收。

(2)本发明的超速离心方法便于获取外泌体。

(3)本发明的制备方法简单，便于推广应用。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种胚胎多肽粉末的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制体积分数为10％预处理胎牛血清的DMEM/F12培养基。

其中胎牛血清经100000g离心3h并过滤后进行预处理。

(2)提取外泌体

选取第3-5代人胚胎干细胞，当细胞汇合度达60％-80％，加入含有体积分数为10％预处理胎牛血清的DMEM/F12培养基培养48-72h，收集细胞上清，利用超速离心法分离外泌体，首先2 000g 4℃离心20min去除细胞，10 000g 4℃离心30min去除细胞碎片，100000g 4℃离心70min后，上清为无外泌体培养基，移去并保存，利用1mL PBS重悬沉淀后,100000g 4℃离心70min，100μL PBS重悬沉淀。

(3)提取多肽

将步骤(2)中的外泌体以2500-3000转/分的离心速度离心40-60min，取上清液，得生物活性多肽提取液,得到的生物活性多肽提取液用0.6um的滤膜抽滤，再用截留分子量为6kD的超滤膜超滤，室温搅拌2-3h后过滤，除去活性炭，再经真空浓缩、喷雾干燥，得到胚胎多肽粉末。

其中第3-5代人胚胎干细胞可以通过下述方法制得；

(a)将含有人胚胎干细胞的冻存管从液氮罐中取出，迅速放置在37℃的水浴锅中连续摇晃冻存管使其快速溶解。将溶解后的细胞悬液置于离心管中，在离心机中以1000g×5min离心。移除上清液，加入新的培养液，吹打，完成复苏过程。

(b)将复苏的细胞适量的接种在培养瓶中，加入2.5mL-3mL培养液，摇匀。水平放置在恒温恒湿二氧化碳培养箱中培养，培养条件为37℃，C0₂浓度5％，相对湿度90％。隔天换培养液，先将原有培养液倒出，用Hank’S缓冲溶液清洗1-2次，后加入新的培养液。到细胞生长到80％左右时，可进行传代培养。

(c)将可传代的胚胎干细胞中培养液去除，用Hank’S缓冲液清洗1-2次，加入胰酶放入培养箱进行消化(胰酶的量为lmL/cm²)1min-2min至细胞脱落，再加入大于胰酶体积的新培养液，终止消化反应，吹打均匀，加入离心管，1000gx5min离心。去上清，加入培养液，吹打均匀，按1；2的比例转入新的培养瓶或培养板中，放入培养箱培养。

上述制备的胚胎多肽的作用：

一.胚胎多肽在人体起活性作用

人体的一切活性物质都是以肽的形式存在的。人体如果没有肽，也就没有活性，人体没有活性，生命也将停止，人体活着，也就是肽还存在，肽还在起作用，人体的一切生命活动，都与肽存在有关，人体如果缺乏肽，疾病就会来。人体如果有足够肽，生命旺盛、健康，生命永长久。

二、胚胎多肽在人体起着激素的作用

肽在人体起着多种激素的作用，它是人体多种激素的底物，也是多种激素的来源和源泉。如果缺乏肽这种激素的底物和源泉，激素也就成了无源之水、无本之木，激素就无法形成，甚至枯竭，人体缺乏激素，生命也将停止。

三、胚胎多肽在人体起着促进生长发育的作用

人体的生长发育和许多因素有关，特别是人体蛋白质，人体蛋白质又是以肽的形式存在的，人体生长发育首要的物质基础是肽；人体生长发育离不开激素，而激素也是肽的一种表现形式。因此，人体生长发育无论从哪个方面讲，都离不开肽，肽在人体的生长发育中起着重要作用。

四、胚胎多肽在人体起着神经递质的作用

人体活着的神经，都是以肽的形式存在，肽在人体起着神经递质作用，它可以传递信息，使人体更敏捷，更灵通，使人体各部位、各器官配合更一致，使人体的一切生命活动更完美、更协调、更一致、更成功。人体如果缺乏肽，神经缺乏活性，一切生命活动就反应出迟钝、麻痹，疾病就会发生。

五、胚胎多肽在人体起着载体的作用

肽在人体的载体作用，主要表现在，它可将人体平常所食的各种营养物质，如钙、铁、锌、锰、硒等常量元素和微量元素载在自己的本体上，输送到人体所需部位，发挥各种不同的生理活性作用，以满足人体所需的各种营养物质。所有的钙类、常量元素和铁、锌、锰、硒等各种微量元素，都必须与肽结合，否则就不能被人体吸收，会产生就地沉淀，而被排出体外，因此，补钙不补肽，就等于白补钙。

六、胚胎多肽在人体起着运输工具的作用

肽在人体作为运输工具，将外界进入人体、人体业已存在的各种营养物质运输到人体所需的部位，使人体所需的各种营养物质通过肽的运输，顺利的到达人体所需部位，以满足人体营养准时需求。

七、胚胎多肽在人体起调节作用

所有的肽进入人体以后都能合成细胞，同时也能调节细胞的功能活动，还可以通过DNA转录，影响特异的蛋白合成。

八、胚胎多肽在人体起免疫调节和抗体作用

当肽进入人体后，首先与人的细胞膜融合，将自己的遗传物质打入细胞核，使细胞产生免疫抗体。这样，当病毒细胞进入人体后，它也要与人体的细胞膜融合，也要将自己的遗传物质打入细胞核，然后使细胞发炎、感染，继而影响诸多细胞，发炎、感染产生疾病，危及生命。可是当它们进入人体后，肽已经与细胞膜融合了，并产生了抗体，病毒细胞就不得入内，只有停留在血液中流淌，4小时后，便自行凋亡，人体也不会产生疾病或被病毒感染。

九、胚胎多肽在人体起动力作用

肽在被人体吸收时不需耗费人体的能量，而其他物质的吸收是要耗费人体能量的，肽是以自己的动力促使人体吸收，它不管人体有没有吸收能力，它都能以自己的动力使人体吸收，肽对其他营养物质起载体和运输作用时，也都是以自己的动力作用将它们运输和输送到人体所需部位，肽在人体的动力作用是显而易见的。

十、胚胎多肽在人体的能量作用

肽在人体的一切生理活动和生理作用及生理功能，都表现出肽的能量作用，它作为人体中的一种正能量，使人体能够健康存在，在人体中所反应出的能量，是人体健康的源泉、动力，是活性、活力之本。

实施例2

与实施例1不同的是，把其中的人胚胎干细胞替换为羊胚胎干细胞。其余同实施例1。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种胚胎多肽粉末的制备方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的一种胚胎多肽粉末的制备方法，其特征在于，所述预处理胎牛血清为胎牛血清经100000g离心并过滤后进行预处理。

3.根据权利要求1所述的一种胚胎多肽粉末的制备方法，其特征在于，所述超速离心的步骤如下：

2 000g4℃离心20min去除细胞，10 000g4℃离心30min去除细胞碎片，100 000g4℃离心70min后，上清为无外泌体培养基，移去并保存，利用1mL PBS重悬沉淀后,100 000g4℃离心70min，100μL PBS重悬沉淀。

4.根据权利要求1所述的一种胚胎多肽粉末的制备方法，其特征在于，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞或羊胚胎干细胞。