CN105457102B - 复合生物活性因子的提纯浓缩方法及浓缩液 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供一种复合生物活性因子的提纯浓缩方法及浓缩液,通过提供包含复合生物活性因子的组织工程皮肤条件培养液,对其进行除杂处理,以除去其中分子量大于30kD的物质,获得包含该复合生物活性因子的中间液体;再用切向流超滤浓缩组件浓缩该中间液体,截留该中间液体中分子量大于3kD的物质,获得包含该复合生物活性因子的浓缩液。工艺简单,实现方便,能够对多种生物活性因子同时提纯和浓缩,提高对种类繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率,且获得的复合生物活性因子纯度高,包含的生物活性因子种类多。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种复合生物活性因子的提纯浓缩方法及浓缩液。
背景技术
对于人体组织损伤导致的功能障碍,传统的修复方法是自体组织移植术,自体组织移植术会牺牲自体健康组织,并且会导致很多并发症及附加损伤。
组织工程指在体外构建人工组织器官,例如,通过对人源或者动物源的细胞在组织工程培养液中进行原代培养、传代培养并大量扩增,构建人工组织器官。对于人体组织损伤,通过人工组织器官作为修复材料,可以达到较好的修复效果,并且避免了自体组织移植术的各种缺点。
体外构建人工组织器官过程中,细胞可以自分泌和旁分泌氨基酸、多肽或蛋白质等多种生物活性因子到培养液中,形成组织工程皮肤条件培养液。常见的细胞分泌的生物活性因子有hEGF(中文:人表皮生长因子,英文:human epidermal growth factor),FGF(中文:成纤维细胞生长因子,英文:fibroblast growth factor),VEGF(中文:血管内皮生长因子,英文:vascular endothelial growth factor)等。
包含多种生物活性因子的组合体可以称为复合生物活性因子。复合生物活性因子除了具备各种生物活性因子自身的功能外,各种生物因子之间还可以相互促进,所以,复合生物活性因子在医疗和化妆品等行业具有重要作用。
组织工程皮肤条件培养液中除了包含有用的复合生物活性因子之外,还包含多种杂质,而且,复合生物活性因子的含量相对于杂质的含量比较低,所以,为了有效利用复合生物活性因子,对于复合生物活性因子的提纯和浓缩就变得非常重要。
但是,现有技术提供的提纯和浓缩技术一般仅适用于单种生物活性因子,例如,阳离子交换层析方法,对种类繁多的复合生物活性因子进行提纯浓缩的效率和产率较低。
发明内容
本发明的主要目的在于,提供一种复合生物活性因子的提纯浓缩方法及浓缩液,提高对复合生物活性因子提纯浓缩的效率和产率,且工艺简单,方便实现。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一方面,提供一种复合生物活性因子的提纯浓缩方法,包括:
提供包含所述复合生物活性因子的组织工程皮肤条件培养液;
对所述组织工程皮肤条件培养液进行除杂处理,以除去所述组织工程皮肤条件培养液中分子量大于30kD的物质,获得包含所述复合生物活性因子的中间液体;
用切向流超滤浓缩组件浓缩所述中间液体,截留所述中间液体中分子量大于3kD的物质,获得包含所述复合生物活性因子的浓缩液。
进一步的,所述复合生物活性因子包括:hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF。
可选的,所述提供包含所述复合生物活性因子的组织工程皮肤条件培养液,具体包括:
收集组织工程皮肤条件培养液;
将收集的组织工程皮肤培养液密封后冻存;
取需要量的组织工程皮肤条件培养液进行化冻,获得包含所述复合生物活性因子的组织工程皮肤条件培养液。
可选的,对所述组织工程皮肤条件培养液进行除杂处理,具体包括:
将所述组织工程皮肤条件培养液在0.9-1.8bar的压力下,通过第一切向流超滤浓缩组件,收集透过液,获得所述中间液体。
优选的,在对组织工程皮肤条件培养液进行除杂处理之前,还包括:
将所述组织工程皮肤条件培养液在4000rpm-8000rpm转速下离心。
优选的,所述第一切向流超滤浓缩组件的规格为30kD或者50kD。
进一步的,所述对所述组织工程皮肤条件培养液进行除杂处理的步骤,在将所述组织工程皮肤条件培养液在0.9-1.8bar的压力下,通过第一切向流超滤浓缩组件的过程中,还包括:对未透过所述第一切向流超滤浓缩组件的组织工程皮肤条件培养液进行洗滤,其中,未透过第一切向流超滤浓缩组件的组织工程皮肤条件培养液包括:被第一切向流超滤浓缩组件截留的组织工程皮肤条件培养液,以及尚未处理的组织工程皮肤条件培养液。
可选的,所述用切向流超滤浓缩组件浓缩所述中间液体,具体包括:
将所述中间液体在0.9-1.8bar的压力下,通过第二切向流超滤浓缩组件进行浓缩,收集滞留液,在滞留液的体积为所述中间液体的1/10-1/20时,停止操作;所述滞留液是指未透过超滤浓缩组件的液体。
将所述收集的滞留液在0.9-1.8bar的压力下,再次通过所述第二切向流超滤浓缩组件,在滞留液的体积为所述中间液体的1/50-1/100时,停止操作,收集滞留液,得到包含所述复合生物活性因子的浓缩液。
优选的,所述第二切向流超滤浓缩组件包含3-5块串联分布的超滤膜包,所述超滤膜包的规格为3kD。
另一方面,本发明实施例提供一种浓缩液,包括:hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF。
本发明实施例提供的一种复合生物活性因子的提纯浓缩方法,工艺简单,实现方便,能够对成分复杂的组织工程皮肤条件培养液中的多种生物活性因子同时提纯和浓缩,提高对种类繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率,且获得的复合生物活性因子纯度高,包含的生物活性因子种类多。
本发明实施例提供的浓缩液,包含9种生物活性因子,可以有效的与皮肤细胞发生作用,促进上皮细胞的营养代谢,预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害,还可以促使真皮层胶原细胞的增生。因此对皮肤术后可以加速修复,并具有抚平细纹,延缓皮肤老化等功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种超滤浓缩装置的结构图;
其中,1为原液桶,2为进口端,3为蠕动泵,4为调压阀,5为进口端压力表,6为切向流超滤浓缩组件,7为回流端压力表,8为透过端,9为滤液桶,10为回流端。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。因此,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。
本发明实施例提供了一种复合生物活性因子的提纯浓缩方法,包括步骤:
步骤1、提供包含复合生物活性因子的组织工程皮肤条件培养液;
步骤2、对该组织工程皮肤条件培养液进行除杂处理,以除去所述组织工程皮肤条件培养液中分子量大于30kD的物质,获得包含复合生物活性因子的中间液体;
步骤3、用切向流超滤浓缩组件浓缩所述中间液体,截留所述中间液体中分子量大于3kD的物质,获得包含复合生物活性因子的浓缩液。
通过步骤1至步骤3,能够对成分复杂的组织工程皮肤条件培养液中的多种生物活性因子同时提纯和浓缩,提高对种类繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率,且获得的复合生物活性因子纯度高,包含的生物活性因子种类多。
下面对本发明实施例的具体实现方式和优选实现方式进行说明。
组织工程皮肤为一种组织化工程组织。组织工程皮肤条件培养液是指在基本培养基中添加其他辅助成分(例如,血清等),采用组织工程方法在体外构建组织工程皮肤后,包含除组织工程皮肤之外各种分泌物和遗留物的混合液。其中,可以根据选择培养的细胞来确定培养基,例如,DMEM,F12等商品化的培养基。本发明实施例中组织工程皮肤条件培养液可以为利用现有技术中各种方法进行组织工程皮肤构建得到的混合液。本发明实施例具体不进行限制。
作为一种优选的实施方式,本实施例中所述组织工程皮肤条件培养液中至少包含如表1所示的生物活性因子。
表1
其中,hEGF(中文:人表皮生长因子,英文:human epidermal growth factor),是由53个氨基组成的生物活性多肽,藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化,达到修补增生肌肤表层细胞,对受伤、受损之表皮肌肤拥有较佳疗效;能够促进细胞的增殖分化,从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。并且,hEGF还能止血,并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合,消炎镇痛,防止溃疡的功效。
VEGF(中文:血管内皮生长因子,英文:vascular endothelial growth factor),具有促进血管内皮细胞分裂与增殖,增加微静脉、小静脉的通透性,诱导丝氨酸蛋白酶和间质胶原酶的表达,使细胞质钙聚集,诱导血管生成,在创伤愈合、胚胎发育、肿瘤生长和转移过程中起着重要的作用。
FGF(中文:成纤维细胞生长因子,英文:fibroblast growth factor)是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白,可诱导多种细胞的增殖与分化,对神经系统有重要作用。在美容护肤方面具有抗皱,预防衰老;美白,祛斑;防晒和晒后修复;防粉刺以及去疤痕等作用。
TGF-β(中文:转化生长因子-β,英文:transforming growth factors-β)是一多功能蛋白质,作用于中胚层,在机体的免疫调节、细胞生长和分化、细胞外基质的合成和贮存、胚胎发育、创伤和瘢痕修复等方面都发挥着重要的作用。
IGF-1(中文:类胰岛素一号增长因子,英文:insulin-like growth factors-1),是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。IGF-1在婴儿的生长和在成人体内持续进行合成代谢作用上具有重要意义。具有降血糖、降血脂、舒张血管、促进骨的合成代谢保持其正常结构功能、促生长、促细胞分化、创伤修复等多种功能。
IGF-2(中文:类胰岛素二号增长因子,英文:insulin-like growth factors-2),IGF-2的表达状况与肿瘤,以及潜在肿瘤的发生发展关系密切,在肿瘤治疗方面起重要作用。
KGF(中文:角质细胞生长因子,英文:keratinocyte growth factor),作用于新生或老化的上皮细胞,通过其特异性受体在刺激上皮细胞生长的同时,能启动上皮细胞对皮下间质组织的协调信号反馈,促进新组织的形成,安全性好,无潜在的副作用,以此达到皮肤除疤痕和抗辐射损伤的功能。
PDGF(中文:血小板衍生生长因子或血小板衍生因子英文:platelet derivedgrowth factor),是一种重要的促有丝分裂因子,具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力,促进纤维母细胞生成和胶原蛋白(尤其是I型及Ⅲ型胶原)产生,增加皮肤弹性抚平皱纹。
所以,包含上述9种生物活性因子的复合生物活性因子可以有效的与皮肤细胞发生作用,促进上皮细胞的营养代谢,预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害,还可以促使真皮层胶原细胞的增生。因此对皮肤术后可以加速修复,并具有抚平细纹,延缓皮肤老化等功能。
需要说明的是,对于步骤1,为了提高组织工程皮肤条件培养液的利用效率以及方便提纯浓缩的进行,一种优选的实现方式包括:
a、收集组织工程皮肤条件培养液;
b、将收集的组织工程皮肤培养液分装至不同的容器内,将每个所述容器密封后,在-20℃条件下冻存;
c、取需要量的组织工程皮肤条件培养液,在25℃-37℃化冻,获得包含所述复合生物活性因子的组织工程皮肤条件培养液。
化冻时具体需要几个容器的组织工程皮肤条件培养液,可以根据生产的具体要求确定,例如,若需要提供的组织工程皮肤条件培养液的体积为1000mL,每个容器的容积为200mL,则取5个容器的组织工程皮肤条件培养液进行化冻即可。
通过对组织工程皮肤条件培养液的冻存,可以在不减小复合生物活性因子活性的前提下保存较长时间,进而方便提纯浓缩生产的进行。对于冻存的温度,需要满足不破坏生物活性因子的活性,并能使生物活性因子保存较长时间。因为组织工程皮肤条件培养液包含多种生物活性因子,每种生物活性因子活性降低的温度不同,所以需要兼顾多种生物活性因子的活性确定冻存温度。本发明实施例优选冻存温度为-20℃,可以使大部分生物活性因子在保持较高活性下保存较长时间。
对于化冻的时间,温度越高化冻的时间越短,但是过高的温度会导致生物活性因子失活,本发明实施例优选化冻温度为25℃-37℃,可以使大部分生物活性因子在保持较高活性下快速化冻。
对于步骤2,一种可能的实施方式为:将所述组织工程皮肤条件培养液在0.9-1.8bar的压力下,通过第一切向流超滤浓缩组件,收集透过液,获得所述中间液体。
因为组织工程皮肤条件培养液中的成分非常复杂,除多种生物活性因子外,还含有细胞碎片、动物源性蛋白等大分子杂质,以及小分子细胞代谢物、无机盐、禁限用成分(例如:氯化胆碱、氢化可的松、七水硫酸锌)等小分子杂质。步骤2可以去除组织工程皮肤条件培养液大分子杂质以及细胞碎片。
超滤浓缩是采用切向横流的方式实现对原液的净化、提纯和浓缩的目的,超滤浓缩以切向流超滤浓缩组件两侧的压力差为驱动力,以切向流超滤浓缩组件为过滤介质,在一定的压力下,当组织工程皮肤条件培养液流过切向流超滤浓缩组件时,切向流超滤浓缩组件密布许多细小的微孔,分子量小于切向流超滤浓缩组件规格的物质通过而成为透过液,而组织工程皮肤条件培养液中分子量大于切向流超滤浓缩组件规格的物质则被截留在超滤膜包的进液侧,成为滞留液。通过收集透过液,即可获得去除大分子物质的中间液体。
例如,参见图1,示出了一种超滤浓缩的装置,该装置包括原液桶1,切向流超滤浓缩组件6和滤液桶9,其中,原液桶1与切向流超滤浓缩组件6的进口端2和回流端10分别连通,滤液桶9和切向流超滤浓缩组件的透过端8连通,进口端2与切向流超滤浓缩组件6之间依次设置有蠕动泵3,调压阀4和进口端压力表5,回流端10与切向流超滤浓缩组件6之间设置有回流端压力表7。
其中,切向流超滤浓缩组件6可以由超滤膜包组成或者中空纤维柱组成。优选的,超滤膜包可以选择具有高通量和低剪切速率的材料。从而可以保证高的产品产率和最小的对剪切力敏感的生物活性因子活性的损失。中空纤维柱可以由不同的易于防止生物活性因子粘附的材料制成。例如,能够使用由纤维素系、聚烯烃系、聚乙烯醇系、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)系、聚砜系等各种材料构成的中空纤维柱。尤其优选使用由聚乙烯等拉伸度高的材质构成的中空纤维柱。
在一种可能的实现方式中,切向流超滤浓缩组件6由串联的至少一块超滤膜包组成(图中未示出)。将组织工程皮肤条件培养液置于原液桶1,组织工程皮肤条件培养液在蠕动泵3的作用下,从原液桶1经过进口端2进入切向流超滤浓缩组件6。优选的,可以通过调压阀4将进口端压力表5(用于指示切向流超滤浓缩组件6的进口端2与透过端8之间的压力差)调为0.9-1.8bar,使切向流超滤浓缩组件6的进口端2和透过端8的压力差为0.9-1.8bar,组织工程皮肤条件培养液在该压力差的作用下,流过切向流超滤浓缩组件6,这样,分子量大于切向流超滤浓缩组件6规格的物质不能透过切向流超滤浓缩组件6,形成滞留液;分子量小于切向流超滤浓缩组件6的物质透过切向流超滤浓缩组件6,经透过端8进入滤液桶9,滤液桶9中的液体即为中间液体,该中间液体相对于组织工程皮肤条件液,去除了大分子蛋白和细胞碎片。
需要说明的是,由于生物活性因子的分子量主要分布在3kD-50kD范围之间,而组织工程皮肤条件培养液中的大分子杂质主要为动物源性蛋白即牛血清蛋白(BSA)和免疫球蛋白(IgG),其分子量分别为66kD和150kD,所以,优选的,组成切向流超滤浓缩组件6的超滤膜包的规格为30kD-50kD。
优选的,为了提高生物活性因子的产率,切向流超滤浓缩组件6由一块超滤膜包组成,采用一块超滤膜包,分子量较大的生物活性因子(与超滤膜包规格接近的生物活性因子)通过该超滤膜包后即可进入中间液体,避免在去除大分子杂质的过程中被截留,造成生物活性因子的损失,从而提高生物活性因子的产率。
需要说明的是,组成切向流超滤浓缩组件6的进口端2和透过端8压力差的大小对于提纯浓缩的效率和复合生物活性因子的活性都具有较大影响,例如,压力差越大,组织工程皮肤条件培养液透过切向流超滤浓缩组件6的速率也越大,从而提高滤液通量,进而提高提纯浓缩的效率,但是,这也同时增加了切向流超滤浓缩组件6被堵塞的风险,以及,会使得透过切向流超滤浓缩组件6时产生的剪切应力增加,较高的剪切应力可能会使部分生物活性因子的活性降低,所以,为了保证较高的提纯浓缩的效率以及较高的生物活性,将进口端2和透过端8压力差设为0.9-1.8bar。
进一步优选的,为了提高中间液体包含的复合生物活性因子的产率,滞留液可以任选地返回至原液桶1,例如,如图1所示,滞留液经过回流端10回流到原液桶1,并可以通过稀释装置(图1中未示出)向原液桶1注入洗滤液,对原液桶1中的液体进行洗滤,其中,洗滤液可以按照实际需要,分批的注入原液桶1,本发明实施例对此不进行具体限定。通过洗滤液的洗滤,可以稀释原液桶1中滞留的大分子杂质的浓度,并对粘附在切向流超滤组件6上的大分子杂质起到清洗作用,避免滞留的大分子杂质粘附在切向流超滤浓缩组件6上,进一步的,可以清洗粘附在大分子杂质上的生物活性因子,提高生物活性因子的透过率。其中,洗滤液可以为纯水或者PBS缓冲液。
进一步优选的,在通过第一切向流超滤浓缩组件对组织工程皮肤条件培养液超滤浓缩之前,还可以包括:将该组织工程皮肤条件培养液在4000-8000rpm转速下离心。优选的,离心时间为5-7分钟。
经过离心,可以去除较大颗粒的杂质(基本为肉眼可见的杂质)。因为较大颗粒的杂质更容易粘附于切向流超滤组件6,而造成堵塞,并且使得切向流超滤组件6清洗困难。所以,经过离心可减小在后续超滤浓缩除杂的阶段,切向流超滤组件6堵塞的风险,从而提高生物活性因子的产率以及超滤的效率,并且,可以提高切向流超滤组件6的使用寿命,降低生产成本。
对于步骤3:一种优选的实现方式为:将所述中间液体在0.9-1.8bar的压力下,通过第二切向流超滤浓缩组件进行浓缩,收集滞留液,在滞留液的体积为所述中间液体的1/10-1/20时,停止操作;
将所述收集的滞留液在0.9-1.8bar的压力下,再次通过所述第二切向流超滤浓缩组件,在滞留液的体积为所述中间液体的1/50-1/100时,停止操作,收集滞留液,得到包含所述复合生物活性因子的浓缩液。
组织工程皮肤条件培养液除了包含一些大分子蛋白杂质和细胞碎片外,还包含一些化妆品或药品等的禁限用物质,例如氯化胆碱、氢化可的松、七水硫酸锌等,这些禁限用物质一般属于小分子杂质。所以,还需要除去这些小分子杂质。
优选的,可以选用超滤浓缩的方式去除这些小分子杂质,在对中间液体进行浓缩的同时去除小分子杂质,提高效率,简化工艺。例如,同样可以利用图1所示的超滤浓缩的装置,只是不同的是,该超滤浓缩装置的切向流超滤浓缩组件6的规格为3kD。
优选的,切向流超滤浓缩组件6由3-5块串联的超滤膜包组成。将中间液体置于原液桶1,组织工程皮肤条件培养液在蠕动泵3的作用下,从原液桶1经过进口端2进入切向流超滤浓缩组件6。优选的,可以通过调压阀4将进口端压力表5(用于指示切向流超滤浓缩组件6的进口端2与透过端8之间的压力差)调为0.9-1.8bar,使切向流超滤浓缩组件6的进口端2和透过端8的压力差为0.9-1.8bar,组织工程皮肤条件培养液在该压力差的作用下,流过切向流超滤浓缩组件6,这样,分子量大于超滤膜包规格的生物活性因子不能透过切向流超滤浓缩组件6,形成滞留液;分子量小于切向流超滤浓缩组件6的小分子杂质透过切向流超滤浓缩组件6,经透过端8进入滤液桶9,收集滞留液,得到包含所述复合生物活性因子的浓缩液。为了提高滞留液包含的复合生物活性因子的产率,可以将中间液体多次通过切向流超滤浓缩组件6,滞留液可以任选地返回至原液桶1,例如,如图1所示,滞留液经过回流端10回流到原液桶1。
一种优选的实现方式为,本实施例中选择中间液体两次通过切向流超滤浓缩组件6,第一次滞留液的体积为中间液体的1/20-1/10,第二次滞留液的体积为中间液体的1/50-1/100。
另一种可能的实现方式为:本实施例中选择中间液体一次通过切向流超滤浓缩组件6,在滞留液的体积为中间液体的1/50-1/100时,收集滞留液,得到包含所述复合生物活性因子的浓缩液。
需要说明的是,由于小分子杂质主要为氯化胆碱、氢化可的松、七水硫酸锌等,分子量一般小于0.5kD,所以,本发明实施例组成切向流超滤浓缩组件6的超滤膜包的规格为3kD。
优选的,为了使得防止生物活性因子在去除小分子杂质的过程中流失,切向流超滤浓缩组件6由3-5块串联的超滤膜包组成,采用3-5块超滤膜包,分子量较大的生物活性因子(与超滤膜包规格接近的生物活性因子)需要依次通过所有超滤膜包才能到达透过端,所以,采用3-5块超滤膜包的方法,可以防止生物活性因子在去除小分子杂质的过程中流失,提高生物活性因子的产量。
实施例
下面的实施例用来说明本发明,并不是想限制本发明的范围。
实施例1
收集30L的组织工程皮肤条件培养液,经灭菌后分装在6个容器中,每个容器的容积为5L,将封装后的培养液于-20℃冻存。
取1个容器的组织工程皮肤条件培养液,置于25℃水浴中化冻。
将化冻后的组织工程皮肤条件培养液在0.9bar压力下,使其流过30kD的超滤膜包,并用1:1体积的洗滤液清洗未透过超滤膜包的组织工程皮肤条件培养液,收集透过液(中间液体)10L。
将上述步骤中所得中间液体在0.9bar压力下,流过3块串联的规格为3kD的超滤膜包,收集滞留液。当滞留液的体积达到500mL时,即停止操作,得到复合生物活性因子的初步浓缩液。
利用上述步骤所得复合生物活性因子的初步浓缩液进行二次浓缩,当滞留液的体积达到50mL时,即停止操作,得到复合生物活性因子的浓缩液。
结论,所得浓缩液包含组织工程皮肤条件培养液83%以上种类的生物活性因子,主要为hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF,并且浓缩液中的大分子杂质和小分子杂质基本去除完全,复合生物活性因子的浓度较高,从而提高了对种类繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率和产率。并且,获得的浓缩液的体积可以达到原液体积的1/100。
实施例2
收集30L的组织工程皮肤条件培养液,经灭菌后分装在6个容器中,每个容器的容积为5L,将封装后的培养液于-20℃冻存。
取1个容器的组织工程皮肤条件培养液,置于25℃水浴中化冻。
在4000rpm的转速下离心7分钟,收集上清液。
将该上清液在0.9bar压力下,流过30kD的超滤膜包,并用1:1体积的洗滤液清洗未透过超滤膜包的组织工程皮肤条件培养液,收集透过液(中间液体)10L。
将上述步骤中所得中间液体在1.2bar压力下,流过3kD的中空纤维柱,收集滞留液。滞留液的体积为100mL时,停止操作,得到复合生物活性因子的浓缩液。
结论,所得浓缩液包含组织工程皮肤条件培养液86%以上种类的生物活性因子,主要为hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF,并且浓缩液中的大分子杂质和小分子杂质基本去除完全,复合生物活性因子的浓度较高,从而提高了对种类繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率和产率。并且,获得的浓缩液的体积可以达到原液体积的1/50。
实施例3
收集5L组织工程皮肤条件培养液。
将收集的组织工程皮肤条件培养液在8000rpm的转速下离心5分钟,收集上清液。
将该上清液在1.2bar压力下,流过50kD的超滤膜包,并用1:1体积的洗滤液清洗未透过超滤膜包的组织工程皮肤条件培养液,收集透过液(中间液体)10L。
将上述步骤中所得中间液体在1.2bar压力下,流过3kD的中空纤维柱,收集滞留液。滞留液的体积为100mL时,停止操作,得到复合生物活性因子的浓缩液。
结论,所得浓缩液包含组织工程皮肤条件培养液83%以上种类的生物活性因子,主要为hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF,并且浓缩液中的大分子杂质和小分子杂质基本去除完全,复合生物活性因子的浓度较高,从而提高了对种类繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率和产率。并且,获得的浓缩液的体积可以达到原液体积的1/50。
实施例4
收集30L的组织工程皮肤条件培养液,经灭菌后分装在6个容器中,每个容器的容积为5L,将封装后的培养液于-20℃冻存。
取1个容器的组织工程皮肤条件培养液,置于37℃水浴中化冻。
在6000rpm的转速下离心6分钟,收集上清液。
将该上清液在1.0bar压力下,流过30kD的超滤膜包,并用1:1体积的洗滤液清洗未透过超滤膜包的组织工程皮肤条件培养液,收集透过液(中间液体)10L。
将上述步骤中所得中间液体在1.0bar压力下,流过3块串联的规格为3kD的超滤膜,收集滞留液。当滞留液达到1000mL时,终止操作,得到复合生物活性因子的初步浓缩液。
利用上述步骤所得复合生物活性因子的初步浓缩液进行二次浓缩,当滞留液的体积为67mL时,终止操作,得到复合生物活性因子的浓缩液。
结论,所得浓缩液包含组织工程皮肤条件培养液84%以上种类的生物活性因子,主要为hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF,并且浓缩液中的大分子杂质和小分子杂质基本去除完全,复合生物活性因子的浓度较高,从而提高了对种类繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率和产率。并且,获得的浓缩液的体积可以达到原液体积的1/75。
实施例5
收集30L的组织工程皮肤条件培养液,经灭菌后分装在6个容器中,每个容器的容积为5L,将封装后的培养液于-20℃冻存。
取1个容器的组织工程皮肤条件培养液,置于25℃水浴中化冻。
将化冻后的组织工程皮肤条件培养液在0.9bar压力下,流过50kD的超滤膜包,并用1:1体积的洗滤液清洗未透过超滤膜包的组织工程皮肤条件培养液,收集透过液(中间液体)10L。
将上述步骤中所得中间液体在0.9bar压力下,流过3块串联的规格为3kD的超滤膜,收集滞留液。当滞留液达到800mL时,停止操作,得到复合生物活性因子的初步浓缩液。
将上述步骤所得复合生物活性因子的初步浓缩液进行二次浓缩,当滞留液的体积为62.5mL时,停止操作,得到复合生物活性因子的浓缩液。
结论,所得浓缩液包含组织工程皮肤条件培养液85%以上种类的生物活性因子,主要为hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF,并且浓缩液中的大分子杂质和小分子杂质基本去除完全,复合生物活性因子的浓度较高,从而提高了对种类繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率和产率,并且,获得的浓缩液的体积可以达到原液体积的1/80。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种复合生物活性因子的提纯浓缩方法,其特征在于,包括:
提供包含所述复合生物活性因子的组织工程皮肤条件培养液;
对所述组织工程皮肤条件培养液进行除杂处理,以除去所述组织工程皮肤条件培养液中分子量大于30kD的物质,获得包含所述复合生物活性因子的中间液体;
用切向流超滤浓缩组件浓缩所述中间液体,截留所述中间液体中分子量大于3kD的物质,获得包含所述复合生物活性因子的浓缩液;
对所述组织工程皮肤条件培养液进行除杂处理,具体包括:将所述组织工程皮肤条件培养液在0.9-1.8bar的压力下,通过第一切向流超滤浓缩组件,收集透过液,获得所述中间液体;
在对组织工程皮肤条件培养液进行除杂处理之前,还包括:将所述组织工程皮肤条件培养液在4000rpm-8000rpm转速下离心。
2.根据权利要求1所述的复合生物活性因子的提纯浓缩方法,其特征在于,所述复合生物活性因子包括:人表皮生长因子hEGF、血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类胰岛素二号增长因子IGF-2、角质细胞生长因子KGF、血小板衍生生长因子PDGF。
3.根据权利要求1或2所述的复合生物活性因子的提纯浓缩方法,其特征在于:提供包含所述复合生物活性因子的组织工程皮肤条件培养液,具体包括:
收集组织工程皮肤条件培养液;
将收集的组织工程皮肤培养液密封后冻存;
取需要量的组织工程皮肤条件培养液进行化冻,获得包含所述复合生物活性因子的组织工程皮肤条件培养液。
4.根据权利要求1所述的复合生物活性因子的提纯浓缩方法,其特征在于:所述第一切向流超滤浓缩组件的规格为30kD或者50kD。
5.根据权利要求1所述的复合生物活性因子的提纯浓缩方法,其特征在于:在所述组织工程皮肤条件培养液进行除杂处理的过程中,还包括:对未透过所述第一切向流超滤浓缩组件的组织工程皮肤条件培养液进行洗滤。
6.根据权利要求1-2任一项所述的复合生物活性因子的提纯浓缩方法,其特征在于:所述用切向流超滤浓缩组件浓缩所述中间液体,具体包括:
将所述中间液体在0.9-1.8bar的压力下,通过第二切向流超滤浓缩组件进行浓缩,收集滞留液,在滞留液的体积为所述中间液体的1/10-1/20时,停止操作;
将所述收集的滞留液在0.9-1.8bar的压力下,再次通过所述第二切向流超滤浓缩组件,在滞留液的体积为所述中间液体的1/50-1/100时,停止操作,收集滞留液,得到包含所述复合生物活性因子的浓缩液。
7.根据权利要求6所述的复合生物活性因子的提纯浓缩方法,其特征在于:所述第二切向流超滤浓缩组件包含3-5块串联分布的超滤膜包,所述超滤膜包的规格为3kD。
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Citations (5)
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2003089629A (ja) * | 2001-09-18 | 2003-03-28 | Kakunai Juyotai Kenkyusho:Kk | 新規化粧品、新規外用剤及び新規浴剤の製造方法 |
CN1557478A (zh) * | 2004-01-15 | 2004-12-29 | 高春平 | 促进皮肤、结缔组织、骨生长的组合物 |
CN1958793A (zh) * | 2006-11-23 | 2007-05-09 | 西安组织工程工程技术研究中心 | 一种天然细胞复合生长因子的制备方法 |
CN101121753A (zh) * | 2007-06-06 | 2008-02-13 | 天津溥瀛生物技术有限公司 | 对多种皮肤细胞修复具持续作用的人血清白蛋白重组融合蛋白 |
CN101371925A (zh) * | 2007-12-21 | 2009-02-25 | 周建大 | 一种纳米银-细胞生长因子缓释复合体及其制备方法与用途 |
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