CN103804499A

CN103804499A - 一种检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂及其用途

Info

Publication number: CN103804499A
Application number: CN201410028297.2A
Authority: CN
Inventors: 肖洋炯; 王颖; 沈浩; 王慧宇; 田兆峰; 赖允鑫
Original assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2034-01-22
Also published as: CN103804499B

Abstract

本发明公开了一种检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂及其用途。通过γ干扰素释放实验和血清酶联免疫方法，公开了一种结核杆菌免疫阳性试剂Rv0733，包括抗原或多肽及其类似物，用于检测结核病患者特异性细胞免疫和体液免疫应答水平。用本发明试剂免疫小鼠后，小鼠能产生特异性的γ干扰素等细胞因子及抗体。利用本发明体外刺激结核病人或正常人群T细胞，检测γ干扰素释放细胞的数量或培养上清中γ干扰素含量，能区分结核病人及正常人群；通过检测外周血清中抗本发明的特异性抗体的水平，可提高结核病患者的检测灵敏度和特异性；利用跟踪结核病患者治疗过程中Rv0733特异性免疫应答对比实验，能揭示结核病人的临床预后情况。

Description

一种检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂及其用途

技术领域

本发明属于生物医学检验领域，具体涉及一种用于检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂及其用途。

背景技术

结核病是全球三大传染性疾病之一，2011年，WHO估测中国结核病总病例140万人，占全球1200万总病例中的11.67％，仅次于印度的310万（25.83％），位居全球第二，其中新发病例91.2万，死亡4.7万人。结核病给我国造成了巨大经济和社会负担。

随着研究的不断深入，结核病的临床诊断方法有了较大的发展，但是在诊断的特异性和敏感性方面还存在一定不足，需要加以改进。免疫学检测方法是现阶段检测结核分枝杆菌感染的重要辅助方法之一，其中以抗原特异性刺激后的γ干扰素释放实验（IGRA）为主。现有的商业试剂盒有T-spot.TB和QuantiFERON(QFT)-IT。其中，T-spot.TB使用的抗原是ESAT-6和CFP-10，而QuantiFERON(QFT)-IT使用的抗原是ESAT-6、CFP-10和TB7.7。这些抗原都由结核分枝杆菌特异性的RD（Region of Difference）区基因编码，能较好地避免已接种的BCG（卡介苗）的干扰。

然而，现有报道表明ESAT-6，CFP-10和TB7.7等基因主要表达于结核分枝杆菌的早期感染阶段，而且其他非结核分枝杆菌类的M.kansasii，M.szulgai，M.marinum或M.gordonae等也表达ESAT-6，CFP-10或TB7.7，所以当患者感染此类细菌时会出现结果的假阳性。而且已有文献表明我国人群存在较严重的非结核分枝杆菌感染情况，所以T-spot.TB和QuantiFERON(QFT)-IT在我国结核病诊断应用中的效果不理想，表现为其检测的敏感性和特异性介于80％－90％之间，而且这二个试剂盒在结核病的临床预后跟踪后的检测价值较差。

因此新的T细胞反应性抗原的筛选，是提高结核病患者的诊断准确性及临床预后观察的新策略。人体在感染结核分枝杆菌后，体内会产生结核分枝杆菌特异性T细胞。体外用相同的抗原再次刺激机体T细胞时，能检测到大量的γ干扰素等细胞因子或分泌细胞因子的细胞，从而能区分出正常健康人和被结核分枝杆菌感染的人群。在临床针对性治疗进程中，随着患者体内结核分枝杆菌菌量会下降和病原抗原的消失，体内的抗原特异性T细胞会发生大量凋亡而进入收缩期，只保留少数的抗原特异性T细胞存在于体内，所以，在体外用抗原刺激不同治疗阶段的患者T细胞时，细胞因子的分泌量或分泌细胞因子的细胞数量与治疗前相比都会下降，并与疾病的缓解相一致，因而具有较好的临床预后价值。同时BCG表达的抗原与结核分枝杆菌毒性株中特有的抗原相比其安全性高。所以具有更好的亚单位或重组疫苗的研究价值和应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种新的用于检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂。

本发明要解决的技术问题之二是提供上述试剂的用途。

在本发明的一方面，提供一种检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂，包括Rv0733（Adenylate kinase，ADK）抗原或多肽或其类似物；所述Rv0733抗原的氨基酸序列从N端到C端如下：

VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLAEKLGIPQISTGELFRRNIEEGTKLGVEAKRYLDAGDLVPSDLTNELVDDRLNNPDAANGFILDGYPRSVEQAKALHEMLERRGTDIDAVLEFRVSEEVLLERLKGRGRADDTDDVILNRMKVYRDETAPLLEYYRDQLKTVDAVGTMDEVFARALRALGK，如SEQ ID NO:1所示；

本发明中，所述多肽为一种氨基酸聚合物，其长度包含但不限于20个氨基酸残基。所述其类似物为与其同源性在75％以上的多肽及经过天然或人工修饰后的氨基酸聚合物。所述多肽为编号ADK0-ADK16的氨基酸聚合物，其氨基酸顺序从N端到C端列于下：

ADK0：VRVLLLGPPG AGKGTQAVKL，如SEQ ID NO:2所示；

ADK1：AGKGTQAVKL AEKLGIPQIS，如SEQ ID NO:3所示；

ADK2：AEKLGIPQIS TGELFRRNIE，如SEQ ID NO:4所示；

ADK3：TGELFRRNIE EGTKLGVEAK，如SEQ ID NO:5所示；

ADK4：EGTKLGVEAK RYLDAGDLVP，如SEQ ID NO:6所示；

ADK5：RYLDAGDLVP SDLTNELVDD，如SEQ ID NO:7所示；

ADK6：SDLTNELVDD RLNNPDAANG，如SEQ ID NO:8所示；

ADK7：RLNNPDAANG FILDGYPRSV，如SEQ ID NO:9所示；

ADK8：FILDGYPRSV EQAKALHEML，如SEQ ID NO:10所示；

ADK9：EQAKALHEML ERRGTDIDAV，如SEQ ID NO:11所示；

ADK10：ERRGTDIDAV LEFRVSEEVL，如SEQ ID NO:12所示；

ADK11：LEFRVSEEVL LERLKGRGRA，如SEQ ID NO:13所示；

ADK12：LERLKGRGRA DDTDDVILNR，如SEQ ID NO:14所示；

ADK13：DDTDDVILNR MKVYRDETAP，如SEQ ID NO:15所示；

ADK14：MKVYRDETAP LLEYYRDQLK，如SEQ ID NO:16所示；

ADK15：LLEYYRDQLK TVDAVGTMDE，如SEQ ID NO:17所示；

ADK16：TVDAVGTMDE VFARALRALG K，如SEQ ID NO:18所示。

本发明中所述多肽可通过化学合成得到，也可通过基因工程技术得到，此技术为行业内所熟悉。

本发明所述抗原可以天然分离得到，也可以通过克隆技术和基因工程的方法获得融合蛋白，此技术为行业内所熟悉。

在本发明的另一方面，提供该试剂的用途，包括：本发明所述抗原或多肽可用于制备检测结核菌感染的试剂，此试剂可包含部分或全部蛋白质氨基酸序列。本发明所述抗原或多肽可用于制备结核亚单位疫苗或用于重组结核疫苗开发。本发明所述试剂可用于区分临床中不同类型的结核病，如单纯肺结核与肺结核合并支气管结核。

本发明所述结核分枝杆菌感染人群包括有临床症状的活动性结核病人和无症状的潜伏感染者。此处临床症状包括但不限于发热，咳嗽，胸痛，咳血，胸片异常等。

本发明所述释放γ干扰素的细胞包括但不限于T细胞和T细胞依赖性的可释放γ干扰素的细胞，如自然杀伤（NK）细胞。

本发明所述T细胞包括但不限于CD4^＋T细胞，CD8^＋T细胞和γδT细胞。

一种体外检测结核分枝杆菌感染的方法，主要通过使用Rv0733抗原或多肽体外刺激T细胞，并检测释放γ干扰素细胞的数量或培养上清中γ干扰素含量，确定结核分枝杆菌的感染情况。

本发明还公开了一种新的检测结核分枝杆菌感染的方法，主要基于检测抗原特异性的抗体或抗原依赖性的γ干扰素等细胞因子的分泌量。

本发明公开了一种体外检测结核分枝杆菌感染的方法，通过ELISA的方法，检测结核病人或正常人外周血中本发明所述试剂的特异性抗体的含量，确定结核分枝杆菌的感染情况。

本发明公开了一种体外检测临床结核病特异性治疗效果的方法，主要通过使用Rv0733抗原或多肽体外刺激T细胞，并检测释放γ干扰素细胞数量或培养上清中γ干扰素含量，确定结核病人的临床预后情况。

此处检测方法包括但不限于：ELISPOT、ELISA、LUMINEX、细胞增殖、胞内染色和免疫杂交等。此检测方法中T细胞来源包含但不限于：血液、胸水、肺泡灌洗液、淋巴液及其它含有T细胞的生物样本。此检测方法中释放γ干扰素的细胞包括但不限于T细胞和T细胞依赖性的可释放γ干扰素的细胞，如自然杀伤（NK）细胞。

本发明实施方案之一中，采用ELISPOT（酶联免疫斑点检测，原理：用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来）的方法，检测活动期结核病患者外周淋巴细胞体外经本发明所述试剂刺激后γ干扰素对应的斑点数，每个斑点代表一个分泌γ干扰素的细胞，用以区分结核病患者和正常人；通过监测治疗过程中活动性结核病人的本发明所述试剂刺激后的特异性刺激后释放γ干扰素的细胞数量，反映治疗的有效性，即预后情况。

本发明实施方案之二中，通过检测活动性结核病患者外周针对本发明所述试剂的特异性抗体水平，用以活动期结核病患者的血清学辅助诊断。

本发明实施方案之三中，通过用本发明所述试剂免疫小鼠，用ELISA的方法，检测体外经本发明所述试剂刺激外周血单个核细胞（PBMC）后的γ干扰素的释放量，和本发明实施方案之四中小鼠外周血血浆或血清中特异性抗体水平，反映出本发明所述试剂的免疫原性，用以将本发明所属试剂作为结核亚单位疫苗的前期实验阶段数据支持。

本发明所述试剂和方法能有效地检测活动性结核病人和潜伏感染者，并且操作简单，易于推广。

本发明的临床样本来自于结核病人和健康人群。基于全血（whole blood）或用Ficoll密度梯度分离法获得外周血单个核细胞（PBMC）的γ干扰素释放实验。通过实验表明，Rv0733能很好的区分结核病人和正常人群，敏感性和特异性分别为94.94％和95.24％。

经过前期对结核分枝杆菌中表达的大量T细胞特异性应答的抗原筛选工作，本发明公开了一种试剂（Rv0733）和方法能很好的区分结核患者和正常对照人群，其敏感性和特异性分别为94.94％和95.24％。并且本发明所述试剂和方法用于临床预后观察时，在治疗一个月后即有显著差异，P<0.05。小鼠实验(实施例3和实施例4)表明，本发明所述试剂能在小鼠体内同时诱导特异性T细胞应答和B细胞应答，预示其具有良好的疫苗开发潜力。

用本发明所述试剂免疫小鼠后，小鼠能产生特异性的γ干扰素等细胞因子及抗体。利用本发明体外刺激结核病人或正常人群T细胞，检测其中γ干扰素释放细胞的数量或培养上清中γ干扰素含量，能区分出结核病人及正常人群；通过检测外周血清中抗本发明的特异性抗体的水平，可以提高结核病患者的检测灵敏度和特异性；利用跟踪结核病患者治疗过程中的Rv0733特异性免疫应答对比实验，本发明能揭示出结核病人的临床预后情况。

附图说明

图1为本发明实施例1中Rv0733融合蛋白的SDS－PAGE示意图。

图2为本发明实施例2中结核病人及正常对照人群外周血PBMC中Rv0733特异性γ干扰素释放细胞数量比较示意图。

图3为本发明实施例2中治疗过程中活动性结核病人外周血PBMC中Rv0733特异性γ干扰素释放细胞数量的变化示意图。

图4为本发明实施例3中结核病人及正常对照人群外周血中Rv0733特异性抗体含量的示意图。

图5为本发明实施例4中经Rv0733抗原免疫二周后，小鼠外周血PBMC经Rv0733刺激后γ干扰素的释放量的示意图。

图6为本发明实施例5中经Rv0733抗原免疫二周后，小鼠外周血中Rv0733特异性抗体含量的示意图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，如有未尽之处，可以参考相应的PCR和基因测序的实验手册。本发明所述实施方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：结核分枝杆菌Rv0733多肽及抗原的制备。

一、Rv0733融合蛋白(抗原)的制备实验步骤具体如下：

1.用PCR方法从结核分枝杆菌DNA中克隆Rv0733基因，经测序后，将基因片段插入E.coli表达质粒pET28a中，构建获得pET28a-Rv0733原核表达质粒。

2.将pET28a-Rv0733原核表达质粒转化E.coli BL21（DE3），构建表达工程菌。

3.用0.4mM IPTG于30℃,220rpm,诱导表达3h。

4.超声裂解菌体并于离心后收集上清蛋白液。

5.用Ni-NTA磁珠纯化获得Rv0733融合蛋白。

6.融合蛋白浓度用BCA（Pierce,23227）方法进行检测，并保存于－80℃冰箱。

7.蛋白纯度和浓度用SDS－PAGE方法进行验证，结果见图1。

8.经测序，该Rv0733融合蛋白(抗原)的氨基酸序列从N端到C端如下：

VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLAEKLGIPQISTGELFRRNIEEGTKLGVEAKRYLDAGDLVPSDLTNELVDDRLNNPDAANGFILDGYPRSVEQAKALHEMLERRGTDIDAVLEFRVSEEVLLERLKGRGRADDTDDVILNRMKVYRDETAPLLEYYRDQLKTVDAVGTMDEVFARALRALGK，如SEQ ID NO:1所示。

二、Rv0733多肽编号分别为从ADK0到ADK16多肽氨基酸顺序从N端到C端列于下，Rv0733多肽可用常规化学合成方法获得，该方法为行业内所熟悉。

ADK0：VRVLLLGPPG AGKGTQAVKL，如SEQ ID NO:2所示；

ADK1：AGKGTQAVKL AEKLGIPQIS，如SEQ ID NO:3所示；

ADK2：AEKLGIPQIS TGELFRRNIE，如SEQ ID NO:4所示；

ADK3：TGELFRRNIE EGTKLGVEAK，如SEQ ID NO:5所示；

ADK4：EGTKLGVEAK RYLDAGDLVP，如SEQ ID NO:6所示；

ADK5：RYLDAGDLVP SDLTNELVDD，如SEQ ID NO:7所示；

ADK6：SDLTNELVDD RLNNPDAANG，如SEQ ID NO:8所示；

ADK7：RLNNPDAANG FILDGYPRSV，如SEQ ID NO:9所示；

ADK8：FILDGYPRSV EQAKALHEML，如SEQ ID NO:10所示；

ADK9：EQAKALHEML ERRGTDIDAV，如SEQ ID NO:11所示；

ADK10：ERRGTDIDAV LEFRVSEEVL，如SEQ ID NO:12所示；

ADK11：LEFRVSEEVL LERLKGRGRA，如SEQ ID NO:13所示；

ADK12：LERLKGRGRA DDTDDVILNR，如SEQ ID NO:14所示；

ADK13：DDTDDVILNR MKVYRDETAP，如SEQ ID NO:15所示；

ADK14：MKVYRDETAP LLEYYRDQLK，如SEQ ID NO:16所示；

ADK15：LLEYYRDQLK TVDAVGTMDE，如SEQ ID NO:17所示；

ADK16：TVDAVGTMDE VFARALRALG K，如SEQ ID NO:18所示。

实施例2：ELISPOT检测Rv0733及其抗原肽刺激后的特异性γ干扰素释放细胞数量

实验步骤具体如下：

1.用IFN－γ抗体包被ELISPOT用96孔PVDF板（Millipore MSIPS4510），4℃过夜。

2.用每孔200μl PBS或RPMI1640洗涤3次，用含有10％FBS的RPMI1640于37℃封闭1小时。

3.肝素钠，柠檬酸钠或EDTA二钾抗凝管收集结核病患者或正常对照人群外周约5毫升。

4.用Ficoll密度梯度离心法，1000×g，18-22℃，离心22min。分离获得外周血单个核细胞（PBMC）。

5.PBMC用5－10ml PBS或RPMI1640洗涤2次并重悬于含10％FBS的RPMI1640中，计数，度调整至终浓度2.5×10⁶cell/ml。

6.封闭后的ELISPOT板中每孔加入100μl细胞悬液，即0.25million细胞每孔。实验孔中加入抗原或多肽，抗原或单条多肽终浓度为10μg/ml，多肽库中每条多肽终浓度为2μg/ml。阳性对照孔加入2.5μg/ml PHA，阴性孔加入相同体积的含10％FBS的RPMI1640。

7.于CO₂培养箱中培养20小时，37℃，5％CO₂，100％湿度。

8.每孔250μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次。每孔加入100μl生物素标记的IFN－γ抗体。用96孔板封口膜封闭各孔，37℃，孵育1小时。

9.每孔250μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次，每孔加入100μl亲和素标记辣根过氧化物酶标记（HRP）。37℃，孵育1小时。

10.每孔250μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次，每孔加入100μl AEC显色液，室湿显色30分钟。

11.用蒸馏水冲洗以终止反应。并用蒸馏水洗涤5次，闭光于室温过夜凉干或37℃2－4小时烘干。

12.用酶联斑点计数仪计算斑点数，设置75μm为分界值。ROC曲线分析表明，Rv0733抗原区分结核病人和正常人群的敏感性和特异性分别为94.94％和95.24％。肺结核合并支气管结核病人外周血中Rv0733抗原特异性γ干扰素释放细胞数量比单纯肺结核病人显著增多。结果见图2a到图2c。利用多肽合成的方法，我们分析了ADK的T细胞表位分布结果见图2d。图2显示了结核病患者及正常对照人群外周血PBMCs中Rv0733特异性γ干扰素释放细胞数量和T细胞表位分布。其中，图2a显示了Rv0733融合蛋白体外刺激结核病人及正常人外周血PBMCs后IFN－γ斑点数比较，水平线代表mean±SD。图2b,的ROC曲线分析Rv0733区分结核病人与正常人的敏感性和特异性。图2c显示Rv0733融合蛋白体外刺激单纯肺结核及肺结核合并支气管结核病人外周血PBMCs后IFN－γ斑点数比较，水平线代表mean±SD。图2d是ADK抗原中T细胞表位分布图，水平线代表平均值。多肽序列为从N端到C端依次用化学方法合成，编号分别为从ADK0到ADK16。每条20个氨基酸，相邻二条间10个氨基酸重叠，最后一条即ADK16为21个氨基酸。SFU/250,000：每250000个细胞为斑点形成单位（spot forming unit per250,000cells）。AUC：曲线下面积（area under curve）。95%CI：95%置信区间（confidence interval）。P:假定值（P value）。pulmonary:单纯肺结核病人。pulmonary/bronchial:肺结核合并支气管结核病人。error bar:mean±SD。***:P<0.001，*:P<0.05。

13.在不同治疗时间点（0,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9月）收集结核病人的外周血样本，用ELISPOT方法可监测结核病人体内Rv0733抗原特异性γ干扰素释放细胞数量。可反映临床治疗情况。结果表明有效地治疗1个月后，结核病人体内Rv0733抗原特异性γ干扰素释放细胞数量会显著下降，见图3。图3显示临床治疗过程中结核病人外周血PBMCs中Rv0733特异性γ干扰素释放细胞数量的变化。在不干预临床治疗的条件下，分别于特定时间点收集相同一患者外周血，分离获得PBMCs并在体外经Rv0733抗原刺激，监测不同治疗过程中结核病人外周血Rv0733特异性γ干扰素释放细胞数量。水平横线代表平均值。统计分析各时间点与未治疗时间点（0month）的差异。*:P<0.05。

实施例3：ELISA结核病人及正常对照人群外周血中Rv0733特异性抗体量检测。

实验步骤具体如下：

1.用1μg/ml Rv0733融合蛋白包被ELISA96孔板（Corning9018），4℃，过夜。

2.弃上清液，每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次，每次于吸水纸上拍干。

3.用含1％明胶的PBS，37℃，封闭1小时。

4.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS（PBST）洗涤5次。每孔加入1：100稀释的结核病人或正常人外周血血浆100μl,稀释液为含1％明胶的PBST。37℃，孵育1小时。

5.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤6次。每孔加入100μl用1％明胶的PBST稀释的HRP标记的抗人IgG抗体，37℃，孵育1小时。

6.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤6次。每孔加入100μl TMB显色液，室温避光显色15分钟。

7.每孔加入50μl2N硫酸终止反应。

8.分光光度计于450nm读取吸光度（OD）值。结果见图4。图4显示ELISA检测结核病人及正常对照人群外周血血浆中Rv0733特异性抗体含量。血浆稀释度为100倍稀释。水平线代表mean±SD。***:P<0.001。

实施例4：ELISA检测Rv0733抗原在小鼠体内诱导细胞免疫应答的免疫原性。

实验步骤具体如下：

1.每只6－8周的C57BL/6小鼠每次背部皮下注射经dioctadecylammonium bromide(DDA，D2779SIGMA)和monophosphoryl lipid A(MPL，L6638SIGMA)乳化的Rv0733融合蛋白10μg，用PBS补充至总体积200μl。总共6-12只小鼠。每隔2周免疫一次，总共三次。

2.最后一次免疫后二周，取小鼠外周血，用Ficoll分离获得PBMC。

3.PBMC用5－10ml PBS或RPMI1640洗涤2次。PBMC重悬于含10％FBS的RPMI1640中，计数，度调整至终浓度2.5×10⁶cell/ml。

4.于96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液，即0.25×10⁶细胞/孔。

5.每孔加入终浓度10μg/ml的Rv0733融合蛋白或覆盖全蛋白的多肽库，每条多肽终浓度为2μg/ml。阳性对照孔加入5μg/ml CoA，阴性孔加入相同体积的含10％FBS的RPMI1640。用含10％FBS的RPMI1640补充至每孔200μl体积。

6.于CO₂培养箱中培养72小时，37℃，5％CO₂，100％湿度。

7.用抗小鼠IFN－γ抗体包被ELISA用96孔板（Corning9018）,4℃过夜。

8.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次。每孔加入200μl ELISA稀释液(ebioscience,00-4202-56)室温封闭1小时。

9.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次。每孔加入100μl细胞培养上清液，或者小鼠IFN－γ标准品。空白孔加入100μl ELISA稀释液，室温孵育2小时。

10.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次。每孔加入100μl生物素标记的抗鼠IFN－γ抗体，室温孵育1小时。

11.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次。每孔加入100μl亲和素标记的辣根过氧化物酶标记（HRP），室温孵育1小时。

12.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤7次。每孔加入100μl TMB显色液，室温显色15分钟。

13.每孔加入50μl2N硫酸终止反应。

14.于分光光度计读取吸光度（OD_450nm）值，根据标准曲线计算各样本浓度值。结果见图5。图5显示ELISA检测经Rv0733抗原或抗原肽免疫二周后，小鼠外周血淋巴细胞经Rv0733刺激后γ干扰素的释放量。ADJ：佐剂组。ADJ＋ADK：佐剂加Rv0733抗原组。*:P<0.05。

实施例5：ELISA检测免疫小鼠外周血中Rv0733特异性抗体含量。

实验步骤具体如下：

3.用含5％脱脂奶粉的PBS室温封闭2小时。

4.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次。每孔加入100μl各浓度梯度稀释的免疫后小鼠血浆。稀释液为含5％脱脂奶粉的PBS。6个对照孔加入100μl1：100稀释的未免疫小鼠血浆。2个空白孔加入100μl含5％脱脂奶粉的PBS，室温孵育2小时。

5.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次。每孔加入100μl生物素标记的抗小鼠IgG抗体，室温孵育2小时。

6.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤5次。每孔加入100μl亲和素标记的碱性磷酸酶（AP），室温孵育1小时。

7.每孔300μl含0.05％Tween-20的PBS洗涤7次。每孔加入100μl碱性磷酸酶底物（S0942，SIGMA）显色液，室温显色20分钟。

8.每孔加入50μl5N氢氧化钠溶液终止反应。

9.分光光度计于450nm读取吸光度（OD）值。以

小鼠读数平均值加2SD为阈值，样本孔读数大于等于阈值时的最大稀释度计为抗体滴度值，接近抗体滴度时样本的稀释倍数以2为梯度。结果见图6。图6显示ELISA检测经Rv0733抗原免疫二周后，小鼠外周血浆中Rv0733特异性抗体水平。其中，图6a显示OD450检测Rv0733特异性抗体水平，errorbar代表SD值。图6b,显示Rv0733免疫小鼠后血浆中特异性抗体的滴度值，水平线代表mean±SD。每组6－12只小鼠。ADJ：佐剂组。ADJ＋ADK：佐剂加Rv0733抗原组。Blank:空白孔。***:P<0.001。