JPH01257263A - Ｓｍ−ｄ抗原、ｓｍ−ｄ抗原のクローニングとｓｍ−ｄ抗原使用による播種性エリテマトーデの検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮五欠ｌ この発明は生物が播種性エリテマトーデを持っているか
どうかを検出するために、生物の血清試料を試験する方
法に関連している。そのうえ特に、この発明は生物が播
種性エリテマトーデをもっているかどうか検出するため
にＳｍ−Ｄポリペプチドと生物の血清試料を反応させる
方法に関連している。さらにこの発明はＳｍ−Ｄポリペ
プチドのｃＤＮＡの単離をクローニングの方法に関連し
ている。まなこの方法は播種性エリテマトーデによって
冒された人の抗体とＳｍ−Ｄ抗原の反応を示す物質をＳ
ｍ−Ｄ抗原の結合体に関連している。

良米韮韮 自己免疫病において、体の免疫システムはその体自身の
細胞成分と反応する抗体を作り上げる。

免疫複合体の結果形成物はさまざまな病的状態へ導くこ
とができる。いくつかのリューマチ病は自己免疫病であ
る。このようなリューマチ病の１つの型が播種性エリテ
マトーデである。

抗核抗体は自己免疫病を証明するものである。

抗体は抗咳である。なぜならそれらは生物の細胞の核に
おける成分に対して作用するからである。

これら抗体の測定を基本とする試験は種々のリューマチ
病の診断に対して臨床研究所で確立されている。（１，
２）一般的な試験はこれら抗体の的として精製された抗
原を使用しない、このように試験は比較的粗末なもので
ある。これは、細胞の抽出物を慣例として抗原の源とし
て取り扱っており、それゆえ内部のコントロールとして
役立つ定義された基準がないという事実からの結果であ
る。

これら自己免疫抗体に対する的の抗原の分子的性質が比
較的複雑であるので、この問題は困難なものであった。

ここ数年間に、技術的に卓越した人々が自己免疫抗体に
対する的の抗原の分子的性質を解読し始めた。そして特
に、それらが一部であるだろう巨大な構造的成分に関連
したそれらの複雑さを認識し始めた。巨大な構造的成分
は明確に言えばリボ核タンパク質（ＲＮＰ）又はデオキ
シリポ核タンパク質（ＤＮＰ）粒子であろう、技術的に
卓越した人々はまた生物の細胞の機能におけるそれらの
役割に関連したこれら抗原の複雑さを認識し始めた。（
３）このような情報の出現と共に、定義づけられた豊富
な抗原試薬の発展と感受性が大きく定量的な臨床試験の
発展におけるこれら試薬の使用に対する可能性が存在し
ている。

試みはリューマチ病のような自己免疫病における抗体を
検出することにおける抗原として比較的単純なポリペプ
チド又はタンパク質を単離するために行なわれた。これ
らポリペプチド又はタンパク質は単純な抗原であるけれ
ども、それらは実際にはさらにずっと複雑な細胞構造の
一部である。

結果として、このような抗体と反応するポリペプチド又
はタンパク質を単離することは困難であった。更に、こ
のような抗原をリューマチ病のような自己免疫病の抗体
を検出するために使う試験を発展させることは困難であ
った。

播種性エリテマトーデと命名されているリューマチ病に
対する定義された豊富な抗原を開発することは特に、困
難であった。なぜなら（Ｓｍと命名されている）ｌｌｋ
種性エリテマトーデに対する抗原は５ｎＲＮＰ（核内低
分子リボ核タンパク質）と呼ばれる保護種タンパク質と
結合している。

（４）Ｓｍ抗原と結合しているＳ　ｒｒｔ核内低分子リ
ボすタンパク質（ｓｎＲＮＰ）は５種のＬＪｓｎＲＮＡ
　（ｔＪｌ、ｔＪ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６）と少なくとも
１１のポリペプチドを含んでいる。ＵｓｎＲＮＡはウリ
ジンが豊富である。

１−句 本発明者及び他の当業者達はＳｍ５ｎＲＮＰを固定した
（５−８）、本発明者は今回、播種性工リテマトーデと
結合したＳ　ｒｎ　−Ｄポリペプチド抗原を単離した。

Ｓｍ−Ｄポリペプチドは約１３゜０００の分子量を持っ
ている。また本発明者は、生物が播種性エリテマトーデ
に冒されているかどうかを同定するために、このような
抗原を生物の血清試料と共に使える単純で効果的な比色
分析を形式化した。

乳−風 この発明の１つの具体化において、５ｎＲＮＡタンパク
質は播種性エリテマトーデによって冒された生物の血清
試料からの抗体を使った免疫アフィニティークロマトグ
ラフィーによって単離される０次にＳｍ−Ｄポリペプチ
ドはゲル電気泳動と電気溶離によって５ｎＲＮＰタンパ
ク質から単離される。それからＳｍ−Ｄポリペ１チドの
アミノ末端は配列化され、このアミノ酸配列を暗号化し
ている相補的なヌクレオチド配列を用いて標識されたＤ
ＮＡプローブは合成される。ラムダクローニングヘクタ
ーにおけるヒトｃＤＮＡライブラリーはニトロセルロー
スフィルターのような適当なフィルターに移される。こ
のようなフィルターは標識されたプローブと対をなす配
列を用いてライブラリーにおけるｃＤＮＡクローンを同
定するため標識されたプローブと共にハイブリッド形成
することによりスクリーニングされる。

Ｓｍ−Ｄタンパク質を暗号化するｃＤＮＡはそれから継
代クローンされる。Ｓｍ−Ｄポリペプチドはそれから免
疫アフィニティータロマドグラフィーによって、そして
もしさらに望むならば、ＨＰＬＣクロマトグラフィーに
よって＃離される。

次に試験は、生物が播種性エリテマトーデに冒されてい
るかどうかを決定する為に生物の血清試料と共にＳｍ−
Ｄポリペプチドを反応させることにより、単離されたＳ
ｍ−Ｄポリペプチドを用いて作られる。この試験は、酵
素指示薬と共有結合的に結合した抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ
抗体を使用する、というような酵素と連結した免疫吸着
試咳として実行されるかもしれない、ラクトペロキシダ
ーゼ／アルカリフォスファターゼは、それぞれ区別でき
る色によって、冒された人を支持する酵素指示薬の例で
ある。

裏腹ヱ （ＳｍｓｎＲＮＰの単離〉 この発見の１つの具体化において、Ｓｍ５ｎＲＮＰは免
疫アフィニティークロマトグラフィーによって単離され
た。このような手順における最初の段階において、播種
性エリテマトーデによって冒された患者のプラズマフェ
レシスはヒト抗−８ｍＶｃ体の源として得られた。免疫
グロブリン（ＩｇＧ）は、半飽和硫安分画やＤＢＡＥ−
セファロースカラムを通過することにより精製された。

単能されたＩｇＧは、カリボニル−ジイミダゾール処理
によりセファロースＣＬ−４Ｂに連結された＜１０）。

抽出物は、０．３５ＭＮａＣｊ　、１０ｍＭＴｒｉ　５
−ＨＣＪ　、、ｐＨ７，４，１，５ｍＭＭｇＣ１□、０
．２ｍＭフェニルメチルサルフオニルフッ化物において
、すべての細胞の音波処理によって、ＨｅＬａと命名さ
れているヒトの細胞系の懸濁培養液から準備された（８
）、細胞抽出物は準備後すぐに手順の節で討議したよう
に準備された抗−３ｍ免疫アフィニティーカラムを通過
させた。

その後カラムは抽出＊ｉ液で洗われ、０．１ＭＮａｃｊ
　、６Ｍ尿素、０．２ｍＭフェニルメチルサルフオニル
フッ化物を含む１０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ、ｐＨ７
，４で溶離された。担体ＲＮＡ（２０μｓ／ｍｊ）は希
薄なタンパク質の濃縮における次のＳｍ５ｎＲＮＰの沈
澱を容易にする為に、溶出液に加えられた。それからＳ
ｍ５ｎＲＮＰは２倍量のエタノール（２）を加えること
によって、−２０℃で一晩沈澱させた。

免疫アフィニティ力ラムの溶出液はドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動後コマッシーブルー染色に
よって全タンパク質含有量に対して分析された（特徴的
Ｓｍ５ｎＲＮＰプロフイールを含む）、抗原のポリペプ
チドはニトロセルロースへの転移後、免疫プロットによ
って検出された。（１２，１３）、この方法において、
３ｍ抗原は直接的な生化学的分析に対して十分な純度に
おいて精製された。この方法は、ＳｍｓｎＲＮＰがプロ
テアーゼやヌクレアーゼにさらされることを極小限にし
た（９）。

く個々のＳｍ５ｎＲＮＰポリペプチドの単離〉本発明者
はクロマトグラフィーの技術で難なくＳｍ５ｎＲＮＰ粒
子を単離することができたけれども、それらはクロマト
グラフィーの技術によってＳｍ５ｎＲＮＰ粒子を明確に
分画することはできなかった。かわりに本発明者はＳｍ
５ｎＲＮＰ粒子をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動と電気溶離を使うことによって分画した。これを完結
するために本発明者によって使われた手順〈と装置）は
、タンパク質のマイクロダラム量を単離するためにＨｕ
ｎｋａｐ　ｉ　ｌ　Ｉｅｒ氏他（１４）によって使用さ
れたものであった。この手順は本発明者の目的に対して
理想的であった。なぜならそれぞれのポリペプチドバン
ドに対して、それらはアクリルアミドゲル（１０〜１ｌ
ａｉの幅／１．５１１１１の厚さ）の大きな断片から小
容量（３００〜５００μｊ）に少量のタンパク質（１０
〜２０μｇ）を溶離することができた。

１１ｕｎｋａｏｉ　ｌ　Ｉｅｒ氏他の手順で本発明者が
行なった唯一の修正は、ゲルを横切る個々のバンドを切
除。

するより前に染色条件を変えたことであった。この変化
は関心のある多くのペプチドは長いゲル（２０ｃｍ　）
においてさえかなり近くに位置したのでなされた。普通
の脱染色期間である２時間後、関心のあるこのようなペ
プチドの間が明確に区別されるために、コマッシーブル
ーはｌ１ｕｎｋａｐｉ　Ｉ　ｌｅｒ氏池の本来の手順か
ら０．０５％に減少された。

ペプチドの個々のバンドの電気溶離後、それぞれのバン
ドは、ＳＤＳゲル電気泳動後の銀染色によって同種性に
対して検査しく１１）、さらにタンパク質プロットによ
って免疫反応性に対して検査された（１２．１３）。

くタンパク質配列〉 本発明者はＳｍ−Ｄポリペプチドにおけるアミノ酸を配
列化するために、ガス相システムを選んだ、なぜなら、
はんのｐｍｏ　ｌ　ｅｔのタンパク質が要求されるだけ
だからである（１５．１６）。

配列化はＳｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　１４ｉｓｓｏｕｒｉ、
ワシントン大学、タンパク質化学研究所で行なわれたく
料金による助力提供施設）９本発明者はＳｍ−Ｄポリペ
プチドのアミノ末端におけるＳｍ−Ｄポリペプチドに対
する１１の配列が得られた。配列は次の通りである。　
ｎｅｔ　ｌｙｓ　ｌｅｕ　ｖａｔ　ａｒｌＪ　ｐｈｅ　
ｌｅｕ　ｌ１ｅｔ　１ｙｓｌｅｕ　Ｓｅｒ ＜　Ｓ　ｒｎ　−Ｄタンパク質ｃＤＮＡの分子クローニ
ング〉 （ａ）プローブの設計 本発明者は２個、２６のオリゴタクンオチドプローブを
合成した（ＡＢ　Ｉシンセサイザー、Ａａｏｕｒｏｎ研
究所）、これは、Ｓｍ−Ｄタンパク質を暗号化するｃＤ
ＮＡをクローンするためである。

これらのプローブはＳｍ−Ｄポリペプチドの配列化から
手に入いるアミノ酸配列から推論される塩基構成を用い
て合成された。これらのプローブはＤ１１０−ブとＤ２
プローブと命名された。

この１０−ブは放射性リンによって標識された。

Ｄ１プローブ、Ｄ２１０−ブは次のような形をとる。

ＩＩＱｔ　　ｌｙｓ　　ｌｅｕ　　ｖａｌ　　ａｒｇ　
　ｐｈｅ　　ｌｅｕ　　ｎｅｔ　　ｌｙｓＣＣＣＡＣ ｃｃｃ　　　　　　ｃ これはまた１図にも示されている。上記の配列において
、“Ｎ″はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４つのどのヌクレオチドで
も表わす、“１′はヌクレオチド“Ｃ”以外の４つのヌ
クレオチドすべてに対して代用させる。これはデオキシ
イノシンに相当する。

みられるように、Ｄ１プローブはもつとも不明瞭なコド
ンの３番目の位置でデオキシイノシンを使うことを設計
した。（１７）、Ｄ１プローブは、したがって６４の異
なったオリゴヌクレオチドの混合物として形成された。

Ｄ２１０−ブにおいては、すべての４つのヌクレオチド
は重複したコドンの３番目の位置で含まれている。その
上、コドン使用を基礎として（１８）、本発明者はロイ
シントリブレヅトの最初の位置でシトシンのみを考えた
。結果としてＤ２プローブに対する分子種の全体の数は
１０２４に減少された。

（ｂ）ライブラリースクリーニング ｃＤＮＡの源として、λｇｔｌＯクローニングベクター
を含みヒトβリンパ球ｐｏｌｙＡ−ＲＮＡから作られた
ライブラリーは、カリフォルニア、パロアルト、クロー
ンチック（ｃ＋ｏｎｅｔｅｃｈ）研究所から購入された
。約２５０，０００独立λ組換えプラークはＢ、ｃｏｌ
ｉ　　Ｙ１０９０細菌ローンの上にル−トされ、ニトロ
セルロースフィルターに移される（１９）、これらフィ
ルターは［３２ｐ］で標識されたＤ１１０−ブと共にそ
れらをハイブリダイゼイションによってスクリーニング
された。スクリーニングの最初の１回から、６０のプラ
ークは［”ｐｌで標識したＤ１プローブと共にハイブリ
ダイゼイションしたものとして同定された。

ニトロセルロースフィルターはそれからＤ１１０−ブか
ら取り去られた。プラークはそれから［”ｐｌで標識し
たＤ２プローブと共に再スクリーニングされた。このス
クリーニングにおいて、２３のプラークは［”ｐｌで標
識されたＤ２１０−ブと共にハイブリダイゼイションし
たものとして同定された。これら２３の正のプローブの
なかで、１５は以前に［”ｐｌで標識されたＤ１グロー
ブと共にパイプリダイゼイションした正のラムダとして
同定されている。２３の正のλ組換え体は、Ｄ２１０−
ブの使用を含む２つの追加のサイクルの精製を受けた。

ハイブリダイゼイションのこのような２つの追加のサイ
クルの後、全１８の純粋な正のクローンが得られた。

（Ｃブクローニングと丙　嘗イ １８のラムダの正クローンからａＤＮＡは準備され（１
９）そしてＥＣ０ＲＩ酵素により消化された。ｃＤＮＡ
インサートのサイズはこのような消化後決定された。イ
ンサートは７つのグループに分類され、それぞれはヌク
レオチド長の特別な区域内のインサートを含んでいる。

これらのグループの長さの範囲は０．６５ｋｂから２．
５ｋｂであった。７つのグループのそれぞれから１標本
はＭ１３ｍｐ１８として命名されている一群のベクター
にサブクローンされた。そしてヌクレオチド配列はジデ
オキシ法を使うことによって決定された。（２１）、λ
Ｄ４５−２として本発明者によって同定されたクローン
はＳｍ−Ｄポリペプチドにおける１１のアミノ酸の知ら
れた配列に対してコドン構成が完全に対をなすＤＮＡ配
列を含んでいることが判明した。さらにλＤ４５−２ク
ローンからのＢｃｏＲＩ断片は、大腸菌（Ｅ、Ｃ。

ｉｔ）中で生産された組換えＤタンパク質の抗原性を試
験するために、ｐＵｃ１８（２２）として命名された一
群のベクターにインサートされた。

（ｄ）組　えＳｍ−Ｄタンパク　の　現Ｓｍ−Ｄタンパ
ク質の発現はＥ、ｃｏｌｉにおいて準備されるかもしれ
ない、この選択には２つの大きな理由がある。（１）こ
のバクテリアは生理学的に、遺伝学的に、分子生物学的
に最も研究され、理解されている生物である。（２）広
く多様の便利な発現ベクターがすでに存在している。

（２３〜２６）、これらのベクターは高レベルのクロー
ン化遺伝子生産物合成のなしとげるためにバクテリアの
転写のそして翻訳のシグナルを使う。

クローン化遺伝子生産物によるバクテリア増殖の阻害の
問題を防ぐために、クローン化遺伝子生産物の発現は転
写の誘導できるプロモーターを使用することによって条
件付きに活性化されるかもしれない０例えば、プラスミ
ドρＩＮ−ｍ（２３＞やｐＫＫ２３３−２　（２４）は
それぞれＪａｃやｔａｃプロモーターを含んでいる６両
者は培養のなかにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
シド（ＩＤＴＧ）を加えることによって誘導できる。

プラスミドＲＡＳＩ　（２５）は３０℃から４２℃へ恒
温温度を変えることによって活性化されるλｐＬ７”ロ
モーターを生じる。もう１つのシステム（２６）は２つ
の１ラスミドの使用を基礎としている。１つの１ラスミ
ドｐａｐ１−２は＾ｐＬプロモーターの制御のもとでＴ
７ＲＮＡポリメラーゼを暗号化する。関心の遺伝子は、
Φ１０Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御のも
とて第２のプラスミドｐＴ７−３においてクローンされ
る。

最初の段階として、Ｓ　ｒｒｔ　−Ｄタンパク質を暗号
化するｃＤＮＡは上で引用されたすべてのベクターにお
いてクローンされるかもしれない、第２に、組換えＳｍ
−Ｄタンパク質の発現は、バクテリアの転写のプロモー
ターの誘導前後の最高の恒温粂件を決定することによっ
て最も効果的にされるかもしれない、クローンされたＳ
ｍ−Ｄポロペプチドの発現のレベルは、［１９Ｓ］−メ
チオニンと共に新たに合成されたポリペプチドをラベル
し、異なった時間の試料を取り、それからＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動やオートラジオグラフィーに変わ
ることによって検査されることができる。

く抗−３ｍ抗体に対する試験〉 直接的な試験は患者のような生物における抗体の反応性
を決定するために使われるかもしれない。

直接的な試験の主な限界は一般的に比較的大量の抗原が
このような試験をするのに要求されることである。これ
は特に完全かそれに近い同質性において抗原をもつこと
が要求されるとき本当のことである。

大量の抗原は前の２つの節で討議されたように生産され
るかもしれない０例えば、Ｓｍ−Ｄ抗原は“Ｓｍｓ　ｎ
ＲＮＰの単離”と題目を付けた節において討議されたよ
うに、免疫ｌフィンティクロマトグラフィーによって単
離されるかもしれない。

このような免疫アフィニティクロマトグラフィーにおい
て、多クローン性ヒト血清は使用されるかもしれない、
二者択一的に、マウスのモノクローナル抗体がＳｍ−Ｄ
バンドに対して特異性をもつもとして使用されるかもし
れない（２８）、もしこれが望ましく考慮に入れられる
ならば、予価のＨＰＬＣクロマトグラフィーは最終精製
段階として抗原において使われるかもしれない。

酵素と結合した免疫吸着試験（２７）は、より好ましい
試験である。精製されたＳｍ−Ｄポリペプチドは、ミク
ロタイター板の表面に好んで吸着される。ミクロタイタ
ー板上のあらゆるさらされた表面は好んで濃縮された非
反応性タンパク質溶液（例えばウシ血清アルブミン）を
用いてブロッキングされる。試験される血清試料は好ん
でＳｍ−り抗原と直接的に反応することが許される。

Ｓｍ−Ｄ抗原と共に血清試料が反応することの結果とし
て形成される抗原−抗体免疫複合体は、酵素指示薬（例
えばラクトペロキシダーゼ／アルカリフォスファターゼ
）と共有結合的に結合して抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ抗体に
よって好んで検出される。結合した酵素指示薬の定量は
比色分析によって示されるかもしれない、その上、ミク
ロタイター板は自動プレート読み取り機において読まれ
ることができる。またバックグラウンド測定は、負の応
答を供給するために、冒されていないヒトからの血清を
使うことによって、そして正の応答を得るために既知の
ヒトの抗−Ｂｍ自己抗体（２９）かマウスの抗−３ｍ−
Ｄ−モノクローナル抗体を使うことによっての適当なコ
ントロールを通して得られることかできる。

上で述べられた方法はある重要な利点をもっている。そ
れらはＳｍ−Ｄ抗原のクローニングが播種性エリテマト
ーデを検出することを供給する。

それらはまたヒトが播種性エリテマトーデに冒されてい
るかどうかを見つけるためにヒトの血清試料とこの抗原
の反応に対して供給する。

酵素を用いたらう１つの抗体は、播種性エリテマトーデ
の抗体が抗原−抗体複合体を生産するためにＳｍ−Ｄ抗
原と反応した時、区別できる色を生産することが含まれ
得る。そして他の酵素と連結した抗体は抗原抗体複合体
と反応し酵素活性に対して比色分析によって検出される
。この区別できる色は、試験された患者が播種性エリテ
マトーデに冒されていることを示すこととして検出され
ることができる。

また上に述べられた方法は他の重要な利点がある。抗原
はＳｍ−Ｄタンパク質や他の多くのポリペプチドやタン
パク質を含んでいる複合体というよりは唯一のＳｍ−Ｄ
タンパク質であるので、播種性エリテマトーデの抗体と
のＳｍ−Ｄポリペプチドの反応は、以前の技術において
のこのような抗体とのこのような複合体の反応よりさら
に特異的で敏感である。これが以前の技術の複合体にお
ける試験よりさらに明確で確がである検出の申請者の方
法の原因となる。

この発見は特別な具体化に関して発表され、説明されて
いるけれども、含まれる原理は当事者等に明白である様
な他の多くの具体化における使用に対して可能である。

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Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　　Ｃｏ１ｄ
　５ｐｒｉｎａ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒ
ｙ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎａ　Ｈａｒ
ｂｏｒ、　　ＮＹ。

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Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７４：５４６３゜ ２２、　　Ｖａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　　Ｃ，、Ｊ
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３゜２３、　　Ｈａｓｕｉ、　　’Ｖ、、　　Ｊ、　　
Ｃ０Ｉｅ１１ａｎ、　　ａｎｄ　　Ｈ，■ｎｏｕｙｅ、
　　１９８３、　　Ｉｎ　　ＥＸＥ［１ｒｉｌｅｎｔａ
ｌ　　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒ
ｅｓｓ、　　Ｉｎｃ、　　ＮｅｗＷｏｒｋ、　　ＮＹ、
　　ｌ）ｇｌ、１５．２４．＾１ａｎｎ、　　Ｅ、、　
　ａｎｄ　Ｊ。

Ｂｒｏｓｉｕｓ、　　１９８７．　　Ｇｅｎｅ、　　Ｉ
ｎ　ｐｒｅｓｓ。

２５、　５ｈａｔｚｉａｎ、　　＾、、　　Ｙ−３Ｈｏ
、　　ａｎｄ　Ｈ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ。

１９８３．１ｎ　　Ｅｘｐｅｒｉａｅｎｔａｌ　　Ｍａ
ｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆＧｅｎｅ　ＥＸＤｒｅＳＳ
ｉＯｎ、　　Ａｃａｄｅｌｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｉ
ｎｃ、ｆｌｅｗ　Ｙｏｒｋ、　　ＮＹ、　　ＤＤ、１゜
２６、Ｔａｂｏｒ、Ｓ、ａｎｄ　Ｃ，Ｃ，Ｒｉｃｈａｒ
ｄｓｏｎ、１９８５゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾、８２：１６７４゜２７、ＥｎＱＶ
ａｌｌ、Ｅ、ａｎｄ　　Ｐｅｒｌｉａｎｎ、１９７１．
ｌｌｌ１ｕｎＯ−ｃｈｅｌｓｔｒｙ　８：８７１゜ ２８、　８ｉｌｌｉｎｇｓ、　　Ｐ、　　Ｂ、、　　Ｒ
，ｌ１１．　　Ａ１１ｅｎ、　　Ｆ、　　Ｃ。

Ｊｅｎｓｅｎ　　ａｎｄ　　Ｓ、０．Ｈｏｃｈ、　　１
９８２．Ｊ、　　ｌ１ｉｕｎＯｌ。

１２８：１１７６゜ ２９、　　Ｔａｎ、　　Ｅ、　　Ｈ，、Ｈ，Ｊ、　　Ｆ
ｒ１ｔＺｌｅｒ、　　Ｊ、　　Ｓ、　　ＨＣ−Ｄｏｕｇ
ａｌ、　　ｒ、　　ｃ、　　Ｒｅ１ｉｅｒ、　　Ｇ、　
　Ｃ，５ｈａｒＥ１．　　Ｐ、　　Ｈ。

５ｃｈｕｒ、　　Ｍ、　　Ｒ，Ｗｉｌｓｏｎ　　ａｎｄ
　　Ｒ，Ｊ、　　旧ｎｃｈｅｓｔｅｒ１９８２　、　　
＾ｒｔｈｒｉｔｉｓ　　Ｒｈｅｕｌ、２５：１００３゜

【図面の簡単な説明】

添付の図面はＳｍ−Ｄポリペプチドのアミノ末端におけ
るいくつかのアミノ酸配列を示しており、さらにこのよ
うなアミノ酸配列を暗号化するｃＤＮＡと共にハイブリ
ッド形成するために合成されたプローブを示している説
明図である。 特許出願人　ジ　アゲロン　インステイチュートー　　
　ヘ ロ　　　　ロ ｎいい いｎｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物が播種性エリテマトーデに冒されているかどう
   かを検出する方法において、 Ｓｍ−Ｄポリペプチドは生物の血清試料、その血清試料
   中には抗体を含んでいるが、これと反応し、 生物が播種性エリテマトーデを持っているかどうかを生
   物の血清試料中の抗体とＳｍ−Ｄポリペプチドの反応性
   から決定する、 ことを特徴とする方法。 ２、上記第１項において、その中にＳｍ−Ｄポリペプチ
   ドは約１３，０００の分子量をもっていることを特徴と
   する方法。 ３、上記第２項において、その中に生物の血清試料にお
   ける抗体とＳｍ−Ｄポリペプチドの反応は酵素指示薬が
   共有結合的に結合している抗ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体との混
   合物と反応することによって検出される。 ４、上記第１項において、その中にＳｍ−Ｄポリペプチ
   ドはそのアミノ末端で【アミノ酸配列があります】のア
   ミノ酸配列をもっている。 ５、播種性エリテマトーデによって生物が冒されている
   かどうかを検出する方法において、ｓｎＲＮＰタンパク
   質を単離するために播種性エリテマトーデによって冒さ
   れた生物の血清試料からの抗体を使用し、 ｓｎＲＮＰタンパク質から約１３，０００の分子量を含
   むポリペプチドを単離し、 約１３，０００の分子量を含む単離されたポリペポプチ
   ドをクローンし、 生物の血清試料とクローンされたポリペプチドを反応し
   、 生物の血清試料とクローンされたポリペプチドの反応性
   から生物における播種性エリテマトーデの存在を決定す
   ることを特徴とする方法。 ６、上記第５項において、その中で血清試料とクローン
   されたポリペプチドの反応性は酵素指示薬と共有結合分
   子に結合した抗−ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体を加えることによ
   つて決定されることを特徴とする方法。 ７、上記第５項において、その中で単離されたポリペプ
   チドはＳｍ−Ｄポリペプチドであることを特徴とする方
   法。 ８、上記第５項において、その中で単離されたポリペプ
   チドはそのアミノ末端において、配列【アミノ酸配列が
   あります】 をもっていいることを特徴とする方法。 ９、播種性エリテマトーデによって生物が冒されている
   かどうかを検出する方法において、Ｓｍ−Ｄポリペプチ
   ドのクローニングし、そして生物の血清試料との反応性
   に対してクローンされたＳｍ−Ｄポリペプチドを準備す
   ることを特徴とする方法。 １０、上記第９項において、 ＳｍｓｎＲＮＰタンパク質を単離し、 ｓｎＲＮＰタンパク質からＳｍ−Ｄポリペプチドを単離
   し、 そして単離されたＳｍ−Ｄポリペプチドからのアミノ酸
   配列を基礎としてＳｍ−Ｄポリペプチドを暗号化するＤ
   ＮＡ配列をクローニングすることを特徴とする方法。 １１、上記第９項において、Ｓｍ−Ｄポリペプチドは約
   １３，０００の分子量をもっていることを特徴とする方
   法。 １２、上記第９項において、Ｓｍ−Ｄポリペプチドはそ
   のアミノ末端において【アミノ酸配列があります】のア
   ミノ酸配列をもっていることを特徴とする方法。 １３、生物が播種性エイテマトーデによって冒されてい
   るかどうか試験する方法において、Ｓｍ−Ｄポリペプチ
   ドを暗号化するｃＤＮＡのクローニングし、 ｃＤＮＡからＳｍ−Ｄポリペプチドの単離し、ミクロタ
   イター板の表面における単離されたＳｍ−Ｄポリペプチ
   ドを吸着し、 あらゆるさらされた表面のブロッキングをし、ミクロタ
   イター板におけるブロックされたＳｍ−Ｄポリペプチド
   と生物の血清試料を反応し、このような反応からあらゆ
   る抗原−抗体免疫複合体の形成の検出することを特徴と
   する方法。 １４、上記第１３項において、その中に抗原−抗体免疫
   複合体の形成は酵素指示薬と共有結合的に結合した抗−
   ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ抗体によって検出されることを特徴
   とする方法。 １５、上記第１３項において、その中にミクロタイター
   板におけるＳｍ−Ｄポリペプチドのさらされた表面に濃
   縮された非反応性タンパク質溶液を用いてブロックされ
   ることを特徴とする方法。 １６、上記第１４項において、その中にＳｍ−Ｄポリペ
   プチドは免疫アフィニティークロマトグラフィーによっ
   てｃＤＮＡから単離され、そしてミクロタイター板にお
   けるＳｍ−Ｄポリペプチドのさらされた表面は濃縮され
   た非反応性タンパク質溶液を用いてブロックされること
   を特徴とする方法。 １７、上記第１６項において、その中に酵素指示薬はラ
   クトペロキシダーゼ／アルカリフォスファターザであり
   、これは抗原−抗体免疫複合体に対する区別できる色に
   よる試験を供給することを特徴とする方法。 １８、播種性エリテマトーデによって生物が冒されてい
   るかどうかを検出するための結合体において、 生物が播種性エリテマトーデによって冒された時、生物
   の抗体と反応することに対するＳｍ−Ｄ抗原、 Ｓｍ−Ｄ抗原が生きているヒトの血清試料と混合され、
   そして生きているヒトが播種性エリテマトーデに冒され
   ている時、抗原−抗体免疫複合体と共に反応することに
   対する追加の抗体、そして、抗原−抗体免疫複合体が形
   成され、追加の抗体が抗原−抗体免疫複合体とつながれ
   るようになる時、適当な基質の追加において、区別でき
   る色を発生するための追加の抗体と連結した酵素、を有
   することを特徴とする結合体。 １９、上記第１８項において、追加の抗体は抗−ヒトＩ
   ｇＧ／ＩｇＭ抗体であり、そして酵素は追加の抗体と共
   有結合的に結合していることを特徴とする結合体。 ２０、上記第１９項において、前孔酵素がラクトペロキ
   シダーゼ又はアルカリフォスファターゼで構成されるこ
   とを特徴とする結合体。