CN110283938B - 一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，特别涉及一种PEDV和PDCoV的双重RT‑RAA检测引物组、试剂盒及应用。所述的PEDV和PDCoV的双重RT‑RAA检测引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示，本发明还提供了一种包含上述引物组的试剂盒，该引物组和试剂盒可快速检测PEDV和PDCoV，特异性好，灵敏度高，重复性与稳定性好，非常适用于疫病病原确诊、病原净化检测和流行病学调查，例如:实验室、出入境现场、养殖场等，与传统检测方法相比，具有更加安全、可靠、灵敏、快速等特点，为我国进行猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒的快速鉴别诊断提供了准确可靠的检测技术。

Description

一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，特别涉及一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组、试剂盒及应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因组是单股正链具有感染性的RNA，与其他冠状病毒相似，其基因组5′端有一个帽子结构(cap)，3′端有1个Poly(A)尾，基因组全长为28033nt。该病毒可导致猪呕吐、水样腹泻、脱水和仔猪高致死率为特征的高度接触性消化道传染病。该病一年四季均有发生，但是多发生于冬春季节。1971年该病首次报道于英国，随后许多国家相继报道，我国于1976年发现该病，各日龄的猪均可感染猪流行性腹泻，其中哺乳仔猪受到的危害最严重，给生猪养殖造成了巨大的经济损失。
猪丁型冠状病毒(猪δ型冠状病毒，PDCoV)是近年来新发现的单股正链RNA病毒，一种能够引起仔猪急性水样腹泻的新发δ冠状病毒，也是危害世界生猪养殖业潜在的因素。在2012年研究者Woo等曾在猪粪便样品中检测到了猪丁型冠状病毒，接着美国俄亥俄州从腹泻仔猪中也首次发现了猪丁型冠状病毒，随后加拿大和韩国等也相继报道了猪丁型冠状病毒，且阳性检出率达25％。在2004～2014年Dong等对我国安微、广西、湖北、江苏4个地区病料检测中也陆续发现了猪丁型冠状病毒。
近年来，畜牧业规模化养殖迅猛发展，由于环境和畜禽个体等因素的相互作用，导致细菌病毒发生变异而难以控制，造成经济上的巨大损失。例如，引起仔猪腹泻疾病的猪流行性腹泻变异毒株目前在全国范围内普遍传播，疫苗免疫也很难有效的防控。而且当前许多疾病的临床症状极为相似，病毒的混合感染并发症非常严重、难以诊断。如引起仔猪腹泻病的猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒多混合感染，引起的疾病的临床症状、剖检病变和流行病学特征有很多相似之处，临床很容易将由这两种病毒所引起的疾病相混淆。给临床确诊带来了难度。
因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒联合检测鉴别方法，准确认别猪感染的病因并对症下药，对生猪养殖行业意义重大。
目前检测这两种病毒的常用检测方法主要有病毒分离、血清学检测以及PCR检测等。但病毒分离、血清学检测方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性且影响因素多，成本高。而PCR检测的方法主要以某一病毒类型的单一检测为主，不能进行多种病毒类型的联合PCR检测，并且检测灵敏性与特异性也参差不齐。而多重PCR反应时间长，且需要PCR仪来改变反应中的温度，成本高。这些方法操作比较繁复，耗费时间长且难以准确区分。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组。
本发明的另一目的在于提供一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供上述PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组和试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组，包含引物PEDV-F、PEDV-R和PDCoV-F、PDCoV-R，其核苷酸序列如下所示：
引物PEDV-F：5′-TCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGG-3′；
引物PEDV-R：5′-GTAGTGAGAAGCGCGTCAGTTTCAGGATTG-3′；
引物PDCoV-F：5′-CACGTTGATGGGCAGCTTGATGTAGTTATT-3′；
引物PDCoV-R：5′-GACTCCAATCTGTTCCGTACCTATCATCAC-3′；
所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组在检测PEDV和PDCoV领域中的应用；
所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组在检测PEDV和PDCoV中的应用，不包含疾病的诊断目的；
一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒包含上述PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组；
所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒还包含RNase Free ddH2O、dNTPMixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)、Random primer、RNase inhibitor、M-MLV、5×M-MLVBuffer、基础缓冲液、基础反应单元、乙酸镁；
所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒进一步优选包含RNase FreeddH2O、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)、Random primer、RNase inhibitor、M-MLV、5×M-MLV Buffer、基础缓冲液、基础反应单元、乙酸镁，浓度为10μmol/L的引物PEDV-F、浓度为10μmol/L的引物PEDV-R和浓度为10μmol/L的引物PDCoV-F、浓度为10μmol/L的引物PDCoV-R；
所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒在检测PEDV和PDCoV中的应用；
所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒在检测PEDV和PDCoV中的应用，优选包含如下步骤：
(1)以待测样品RNA为模板，以Random primer为扩增引物，配制反转录反应体系，进行样品RNA的反转录反应，得到cDNA；
(2)以步骤(1)制得的反转录反应产物cDNA为模板，以混合引物PEDV-F、PEDV-R和PDCoV-F、PDCoV-R为扩增引物，配制双重RT-RAA反应体系，进行双重RT-RAA反应；
(3)将步骤(2)制得的双重PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；结果判定方法为：226bp处出现目的条带的判定为PEDV阳性扩增，321bp处出现目的条带的判定为PDCoV阳性扩增；226bp处未出现目的条带的判定为PEDV阴性扩增，321bp处未出现目的条带的判定为PDCoV阴性扩增；
步骤(1)中所述的反转录反应的反应体系优选为：
步骤(1)中所述的反转录反应的反应参数如下所示：
42℃反应60min；72℃终止反应1min；
步骤(2)中所述的双重RT-RAA反应的反应体系中，引物PEDV-F、PEDV-R和PDCoV-F、PDCoV-R的体积比优选为2:2:3:3；
步骤(2)中所述的双重RT-RAA反应的反应体系优选为:
步骤(2)中所述的双重RRA反应的参数如下所示：
38℃反应45min；
所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒在检测PEDV和PDCoV领域中的应用，不包含疾病的诊断目的；
需要指出的是，本发明的检测用于对离体样品的检测，检测的直接结果是病毒的量值，而并非诊断结果，本发明直接目的不是诊断，本发明的引物组、试剂盒的应用以及方法均不属于诊断方法。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明提供的快速检测PEDV和PDCoV的双重RT-RAA引物组特异性好，灵敏度高，重复性与稳定性好，适用于PEDV和PDCoV的鉴别诊断。
(2)本发明提供的快速检测PEDV和PDCoV的双重PCR引物组和试剂盒采用一次性RAA(重组酶介导的核酸扩增)反应，该反应机制可高效、快速、特异地实施针对两种病原体的鉴别诊断。
(3)本发明应用重组酶介导的的核酸扩增技术，45min即可得出检测结果，且不需要昂贵复杂的仪器设备，以及实验室环境的需求，能够在生产上对病毒进行快速检测，检测结果灵敏准确，操作更加方便、污染少。
(4)本发明提供的快速区分PEDV和PDCoV的双重RT-RAA试剂盒非常适用于疫病病原确诊、病原净化检测和流行病学调查，例如:实验室、出入境现场、养殖场等。
(5)本研究建立RAA检测方法较之传统检测方法具有更加安全、可靠、灵敏、快速等特点，为我国进行猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒的快速鉴别诊断提供了准确可靠的检测技术。
附图说明
图1是实施例1中引物初筛初筛结果图；其中，A：PDCoV初筛结果，A中泳道1～8分别代表引物1～8，B：PEDV初筛结果，B中泳道1～8分别代表引物1～7，泳道M为DNA MarkerDL1000，P为阳性质控。
图2是PEDV和PDCoV的单重RT-PCR反应结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1、3分别代表PDCoV和PEDV的PCR结果，泳道2、4分别代表PDCoV和PEDV的阴性对照。
图3是PEDV和PDCoV的单重菌液RT-PCR反应产物电泳结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL1000，泳道1、3分别代表PDCoV和PEDV的PCR结果，泳道2、4分别代表PDCoV和PEDV的阴性对照。
图4是PEDV和PDCoV的双重RT-RAA最佳反应温度优化电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～7分别代表35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃共8个温度梯度，泳道9为阴性对照。
图5是PEDV和PDCoV的双重RT-RAA最佳反应时间优化电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～8分别代表20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min共8个时间梯度，泳道9为阴性对照。
图6是PEDV和PDCoV的双重RT-RAA最佳引物比例确定电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～8分别代表PDCoV引物浓度和PEDV引物浓度的比例，0.5+0.5:1.0+1.0、0.5+0.5:1.5+1.5、1.0+1.0:0.5+0.5、1.0+1.0:1.0+1.0、1.0+1.0:1.5+1.5、1.5+1.5:0.5+0.5、1.5+1.5:1.0+1.0共7个浓度比例，泳道8为阴性对照。
图7是PEDV和PDCoV的双重RT-RAA敏感性分析结果图；其中，M为DNA MarkerDL1000，泳道1～9分别代表PEDV和PDCoV混合阳性重组质粒的10-1～10-9共9个模板稀释度，泳道10为阴性对照。
图8是PEDV和PDCoV的双重RT-RAA特异性分析结果图；其中，M为DNA MarkerDL1000，泳道1为PEDV和PDCoV的双重RT-RAA特异性，泳道2～3分别代表PDCoV和PEDV的单重RAA特异性，泳道4～9分别代表APPV、PCV3、PRRSV、SADS-CoV、SVV、TEGV共6种病毒RAA特异性，泳道10为阴性对照。
图9是PEDV和PDCoV的双重RT-RAA的临床检测结果图；其中，泳道M为DNA MarkerDL1000，泳道1～15分别代表15份粪便拭子样品，泳道16为阴性对照。
图10是PEDV和PDCoV的双重RT-RAA的临床检测结果验证图，其中，泳道M为DNAMarker DL1000，泳道1代表PDCoV的PCR结果，泳道3、4代表PEDV的PCR结果，泳道2、5分别代表PDCoV和PEDV的阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中：
塞尼卡谷病毒(SVV)HN16株(即塞内加谷病毒SVV HN16株)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)Ch-A株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/GDGZ/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)CN12株、猪蓝耳病病毒(PRRSV)YA株已在申请号为“CN201810510587.9”、申请名称为“检测塞尼卡谷病毒的RT-LAMP引物组、试剂盒及应用”的中国专利申请中公开；猪圆环病毒3型PCV3-China/GD2016病毒株已在申请号为“CN201710184557.9”、申请名称为“一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用”的中国专利申请中公开；
RNase Free ddH2O、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)均购自TAKARA生物科技有限公司，货号LMP204；Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNAExtraction Kit)购自杭州博日科技有限公司，产品编号：BSC52S1；RT-RAA核酸扩增试剂盒购自江苏奇天基因生物科技有限公司，产品编号：B00R00A。
实施例1
一、引物设计
参考与比对GenBank中PEDV的全基因序列(Accession:KY963963、Accession:KX981440、Accession:KR610994、Accession:KU297956、Accession:MG781192、Accession:KJ623926、Accession:KT941120、Accession:AF353511、Accession:KP890336、Accession:MF807952)和PDCoV的全基因序列(Accession:KY926512、Accession:MG837131、Accession:MG242026、Accession:KR131621、Accession:MF431743、Accession:KU665558、Accession:KX443143、Accession:KT266822、Accession:KY513725、Accession:KU984334)分别利用MegAlign软件进行序列比对，选取PDCoV和PEDV的保守区域设计引物，利用引物辅助设计软件Primer5根据确定的保守核甘酸序列设计出了8对PEDV的RAA检测引物，8对PDCoV的RAA检测引物，所述引物如下表所示：
表1 PEDV和PDCoV的检测引物
二、引物初筛
初步筛选结果见图1，其中，PDCoV引物中第4对引物(图1A泳道5)特异性最好，无二聚体和非特异性扩增。在此基础上，进一步筛选PEDV引物，其中，前7对PEDV引物中部分无条带，而可以特异性扩增的引物由于无法和已确定的PDCoV引物在凝胶电泳中区分，故舍弃，进一步设计第8对引物并检测，发现PEDV引物中第8对引物的特异性最好，无二聚体和非特异性扩增，并可以和PDCoV引物很好区分；且两个引物的长度差别能在凝胶电泳上易于区分，部分结果见图1。以下实施例均以PEDV引物中第8对引物和PDCoV引物中第4对引物作为扩增引物。
实施例2 pMD-19-T-PEDV和pMD-19-T-PDCoV阳性重组质粒的获取
(1)病毒基因组RNA提取
使用Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNA Extraction Kit)提取猪流行性腹泻病毒(PEDV，CH/GDGZ/2012株)和猪丁型冠状病毒(PDCoV，Ch-A株)的RNA，具体操作步骤按照试剂盒进行。
(2)模板RNA的反转录
构建20μL的RNA反转录反应体系，同时建立RNA反转录反应参数，具体反应体系为：5×M-MLV Buffer 4.0μL，dNTP Mixture 1.0μL，Random primer 1.0μL，RNase inhibitor0.5μL，待测样品RNA5.0μL，M-MLV 0.5μL，RNase Free ddH2O 8.0μL；然后42℃反应60min；72℃终止反应1min。以各病毒的总RNA为模板，配制反应体系，将其置于恒温水浴锅中按上述反应参数进行反转录反应，反转录反应结束后获得cDNA。
(3)PEDV和PDCoV的单重RT-PCR反应
以步骤(2)病毒模板RNA反转录反应的产物cDNA为模板，配制RT-PCR反应体系，然后进行单重RT-PCR扩增，其中，具体反应体系(25μL)为：cDNA2.0μL，正向引物F(工作浓度10μmol/L，反应浓度0.4μmol/L)1.0μL，反向引物R 1.0μL，dNTP Mixture 2.0μL，10×PCRBuffer(Mg2++plus)2.5μL，TaKaRa Taq 0.5μL，RNase Free ddH2O 16.0μL；RT-PCR反应参数为95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；扩增引物见表1。扩增结束后，制备质量体积比为1.2％的琼脂糖凝胶板，将PCR反应产物按编号依次加入到对应的凝胶板的胶孔中，凝胶板的边孔中加入DNA Marker。于110V恒定电压下电泳45min，电泳结束后用凝胶成像系统进行结果分析并拍照。
以反转录反应产物cDNA为模板，分别用PEDV和PDCoV的特异性引物进行RT-PCR反应。
(4)单重RT-PCR反应产物的回收
步骤(3)的单重RT-PCR产物进行质量体积比为1.2％的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统进行结果分析，将确定为阳性扩增的结果(图2)在紫外投射下切下含目的DNA的琼脂糖凝胶，将切下的胶块置于1.5mL的EP管内，利用胶回收试剂盒分别进行PEDV和PDCoV的单重RT-PCR反应产物的回收，具体操作步骤按照试剂盒进行。
(5)目的基因的克隆
将步骤(4)回收后的单重RT-PCR产物分别与载体pMD-19-T连接，其中，连接体系(10μL)为：Ligation Solution I 5μL，PCR回收产物4.5μL，pMD-19-T 0.5μL；连接参数为16℃反应3h；将连接产物转化进入感受态细胞DH5α中，具体方法为：
①从-80℃取感受态细胞DH5α，立即放在冰上5～10min自然融化；
②加入连接产物10ul轻轻吹打混匀，冰浴30min；
③42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回水中，静置2min；
④向其中加入500ul LB液体培养基轻轻混匀。然后固定到摇床的弹簧架上37℃，200～220r/min震荡45～60min；
⑤4℃离心机4000r/min，离心5min；
⑥吸取上清500μl弃去，将剩余液体吹打混匀。分点涂布到含氨苄的LB平板培养皿中，用酒精灯灼烧且冷却的玻璃涂布棒涂布均匀；
⑦在涂好的培养皿做好标记，先放置在37℃恒温培养箱中10～30min直到表面的液体都渗透到培养基里面后，在导致放入37℃恒温箱中过夜；
(6)目的基因阳性克隆的鉴定
从步骤(5)中的培养过夜的氨苄的LB平板培养皿上挑取单个菌落于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min振荡培养12～16h，获得克隆菌；
以克隆菌为模板，进行菌液PCR，其中，具体反应体系(25μL)为：菌液2.0μL，正向引物F 1.0μL，反向引物R 1.0μL，dNTP Mixture 2.0μL，10×PCR Buffer(Mg2++plus)2.5μL，TaKaRa Taq 0.5μL，RNase Free ddH2O 16.0μL；反应参数为95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；反应结束后按照步骤(3)进行琼脂糖凝电泳检测。对确定为含有阳性重组质粒的克隆菌进行质粒提取，具体操作步骤按照质粒提取试剂盒进行，得到阳性重组质粒pMD-19-T-PEDV和pMD-19-T-PDCoV。
以克隆菌为模板，分别用PEDV和PDCoV的特异性引物进行菌液PCR鉴定，鉴定结果见图3，其中，在226bp和321bp处出现目的条带的为阳性扩增，未出现目的条带的为阴性扩增。
实施例3 PEDV和PDCoV的双重RT-RAA反应体系的建立及优化
构建50μL初始双重RT-RAA反应体系(RT-RAA核酸扩增试剂盒，表2)和反应参数(表3)，依次对反应温度、反应时间、进行优化，得到的结果进行琼脂糖凝胶(质量体积比1.6％)电泳检测；
表2初始双重RT-RAA反应体系
初始双重RT-RAA反应参数：39℃反应35min。
(1)双重RT-RAA最佳反应温度的优化
根据试剂盒中重组酶的最适反应温度在35～42℃之间，故设置35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃共8个温度梯度对PEDV和PDCoV进行双重RT-RAA反应温度的优化，根据建立的双重RT-RAA反应体系(表2)和反应参数进行PCR反应，反应结束后采用质量体积比1.6％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：PEDV和PDCoV的双重RT-RAA最佳反应温度为38℃(图4)。
(2)最佳反应时间优化
设置20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min共8个时间梯度进行双重RT-RAA反应，双重RT-RAA反应体系如表2所示，同时根据已优化的的反应参数进行RAA扩增，反应结束后采用质量体积比1.6％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：PEDV和PDCoV的双重RT-RAA最佳反应时间为45min(图5)。
(3)最佳引物浓度比值优化
设定了7组引物组合比(表3)，双重RT-RAA反应体系其他成分的用量如表4所示，同时根据已优化的的反应参数(38℃反应45min)进行RAA扩增，反应结束后采用质量体积比1.6％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：PEDV和PDCoV的双重RT-RAA的最佳引物比例为2:3(图6)。
表3引物组合比例
表4双重RT-RAA反应体系
体系成分 含量(体积/μL)
基础缓冲液 25
混合引物 X(表3不同组合的混合引物)
模板cDNA 1.0
基础反应单元 1管
醋酸镁 2.5
补足RNase Free ddH2O 50
根据上述实验结果，最终确定优化的双重RT-RAA反应体系(50μL)如表5。优化后的反应参数：反应温度38℃，反应时间45min。
表5优化后的双重RT-RAA反应体系
实施例4双重RT-RAA的敏感性分析
利用质粒提取试剂盒提取实施例2制得的pMD-19-T-PEDV、和pMD-19-T-PDCoV阳性重组质粒，测定其浓度分别1.48×1010copies/μL、5.53×109，将两种种阳性重组质粒等比例混合，用RNase Free ddH2O连续10倍倍比稀释成9个稀释度，以各混合重组质粒的稀释度作为扩增模板，利用优化后的反应体系(表5)和反应参数，进行多种RT-RAA，反应结束后采用质量体积比1.6％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：双重RT-RAA检测方法对于PEDV和PDCoV的敏感性分别为1.48×103copies/μL、5.53×102copies/μL(图7)。
实施例5双重RT-PCR的特异性分析
利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取阳性SVV、PDCoV、PEDV、TGEV、SADS-CoV、PRRSV、APPV共7种病毒(塞尼卡谷病毒(SVV)HN16株、猪丁型冠状病毒(PDCoV)Ch-A株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/GDGZ/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)CN12株、猪蓝耳病病毒(PRRSV)YA株、非典型性猪瘟病毒(APPV)APPV/CN/HUANAN/201801株以及猪圆环病毒3型PCV3-China/GD2016病毒株的核酸，首先以SVV、PDCOV、PEDV、TGEV、SADS-CoV、PRRSV、APPV和PCV3的RNA为模板进行反转录以获取cDNA，然后以各病毒的cDNA和水为模板利用优化后的反应体系(表5)和反应参数进行双重RT-RAA扩增，反应结束后采用质量体积比1.6％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：PEDV和PDCoV的双重RT-RAA具有良好的特异性。(图8)。
实施例6双重RT-PCR的临床检测应用
利用PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测从发病猪场送检的15份粪便拭子，利用Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNA Extraction Kit)提取送检粪便拭子的核酸。以所提取的15份粪便拭子核酸为模板，首先利用提取的RNA为模板进行反转录以获取cDNA，然后利用优化后的反应体系(表5)和反应参数进行双重RT-RAA反应，反应结束后采用质量体积比1.6％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
经鉴定该送检样品中有2份粪便拭子为PEDV单纯感染，一份粪便拭子为PDCoV单纯感染，(图9)，经双重RT-RAA检测确定为阳性的样本进行单重RT-PCR验证(图10)，单重RT-PCR的结果和双重RT-PCR检测一致，两种检测方法的检测符合率为100％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组、试剂盒及应用
<130> 1
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物1 PEDV-F
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<213> Artificial
<220>
<223> 引物2 PEDV-R
<400> 4
actctgaaga ttaacgccat acatttgacg 30
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<223> 引物3 PEDV-R
<400> 6
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<220>
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<213> Artificial
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物3 PDCoV-R
<400> 22
taataactac atcaagctgc ccatcaacgt g 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物4 PDCoV-F
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cacgttgatg ggcagcttga tgtagttatt 30
<210> 24
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物4 PDCoV-R
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gactccaatc tgttccgtac ctatcatcac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物5 PDCoV-F
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tcgtaaaccc aaattcatcc tygtaaagtc 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物5 PDCoV-R
<400> 26
tggyctgaag gggctgctga ttaacacgta 30
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物6 PDCoV-F
<400> 27
ttcataccaa caacacagcc actccagac 29
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物6 PDCoV-R
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<213> Artificial
<220>
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<210> 30
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> 引物7 PDCoV-R
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<213> Artificial
<220>
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agacactgag aagacgggta tggctgatc 29
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物8 PDCoV-R
<400> 32
ttcttatcct tagttggttt ggtaggtggc 30

Claims (10)

1.一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组，其特征在于包含引物PEDV-F、PEDV-R和PDCoV-F、PDCoV-R，其核苷酸序列如下所示：
引物PEDV-F：5´- TCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGG-3´；
引物PEDV-R：5´- GTAGTGAGAAGCGCGTCAGTTTCAGGATTG -3´；
引物PDCoV-F：5´- CACGTTGATGGGCAGCTTGATGTAGTTATT -3´；
引物PDCoV-R：5´- GACTCCAATCTGTTCCGTACCTATCATCAC -3´。
2.权利要求1所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组在检测PEDV和PDCoV中的应用，其特征在于：
所述的应用不包括疾病治疗与诊断目的。
3.一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组。
4.根据权利要求3所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒，其特征在于还包含RNase Free ddH2O、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、Random primer、RNase inhibitor、M-MLV、5×M-MLV Buffer、基础缓冲液、基础反应单元、乙酸镁。
5.根据权利要求4所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒，其特征在于包含RNase Free ddH2O、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、Random primer、RNase inhibitor、M-MLV、5×M-MLV Buffer、基础缓冲液、基础反应单元、乙酸镁，浓度为10μmol/L的引物PEDV-F、浓度为10μmol/L的引物PEDV-R和浓度为10μmol/L的引物PDCoV-F、浓度为10μmol/L的引物PDCoV-R。
6.权利要求3~5任一项所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒在检测PEDV和PDCoV中的应用，其特征在于：
所述的应用不包括疾病治疗与诊断目的。
7.根据权利要求6所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒在检测PEDV和PDCoV中的应用，其特征在于包含如下步骤：
（1）以待测样品RNA为模板，以Random primer为扩增引物，配制反转录反应体系，进行样品RNA的反转录反应，得到cDNA；
（2）以步骤（1）制得的反转录反应产物cDNA为模板，以混合引物PEDV-F、PEDV-R和PDCoV-F、PDCoV-R为扩增引物，配制双重RT-RAA反应体系，进行双重RT-RAA反应；
（3）将步骤（2）制得的双重PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；结果判定方法为：226bp处出现目的条带的判定为PEDV阳性扩增，322bp处出现目的条带的判定为PDCoV阳性扩增；226bp处未出现目的条带的判定为PEDV阴性扩增，322bp处未出现目的条带的判定为PDCoV阴性扩增。
8.根据权利要求7所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒在检测PEDV和PDCoV中的应用，其特征在于：
步骤（1）中所述的反转录反应的反应体系为：
5×M- MLV Buffer 4.0μL；
dNTP Mixture 1.0μL；
Random primer 1.0μL；
RNase inhibitor 0.5μL；
待测样品RNA 5.0μL；
M-MLV 0.5μL；
RNase Free ddH2O 补足20μL；
步骤（1）中所述的反转录反应的反应参数如下所示:
42℃反应60min；72℃终止反应1min。
9.根据权利要求7所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒在检测PEDV和PDCoV中的应用，其特征在于：
步骤（2）中所述的双重RT-RAA反应的反应体系中，引物PEDV-F、PEDV-R和PDCoV-F、PDCoV-R的体积比为2:2:3:3。
10.根据权利要求7所述的PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测试剂盒在检测PEDV和PDCoV中的应用，其特征在于：
步骤（2）中所述的双重RT-RAA反应的参数如下所示：
38℃反应45min。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110656187B (zh) * 2019-10-28 2023-06-02 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 多重raa以及多重pcr检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒及检测方法
CN113322350B (zh) * 2021-05-06 2022-04-08 深圳海关动植物检验检疫技术中心 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒的试剂盒及应用
CN113930547B (zh) * 2021-10-25 2022-07-26 华南农业大学 猪流行性腹泻病毒n基因的rt-raa荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法
CN114959116B (zh) * 2022-05-30 2023-09-01 宁波大学 一种检测辣椒轻斑驳病毒和炭疽菌的引物组、试剂盒及方法
CN115323075B (zh) * 2022-06-30 2023-05-09 华南农业大学 一种检测鸡传染性支气管炎病毒及基因分型的rt-raa引物探针组、试剂盒及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105420412A (zh) * 2015-12-31 2016-03-23 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法
CN105483291A (zh) * 2015-12-31 2016-04-13 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物
CN106676197A (zh) * 2016-12-27 2017-05-17 河南农业大学 猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT‑PCR检测方法及其应用
CN107299156A (zh) * 2017-08-22 2017-10-27 河北省检验检疫科学技术研究院 检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光rt‑rpa试剂盒及方法
CN108715906A (zh) * 2018-06-04 2018-10-30 广西大学 五种猪肠道病毒多重rt-pcr快速检测试剂盒及其应用
CN109593889A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 广州动佰生物科技有限公司 基于实时荧光反转录重组酶介导链替换核酸扩增技术的猪德尔塔冠状病毒检测方法
CN109868331A (zh) * 2019-01-25 2019-06-11 长江大学 通用型猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒的双重巢式rt-pcr引物及检测方法与应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105420412A (zh) * 2015-12-31 2016-03-23 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法
CN105483291A (zh) * 2015-12-31 2016-04-13 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物
CN106676197A (zh) * 2016-12-27 2017-05-17 河南农业大学 猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT‑PCR检测方法及其应用
CN107299156A (zh) * 2017-08-22 2017-10-27 河北省检验检疫科学技术研究院 检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光rt‑rpa试剂盒及方法
CN108715906A (zh) * 2018-06-04 2018-10-30 广西大学 五种猪肠道病毒多重rt-pcr快速检测试剂盒及其应用
CN109593889A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 广州动佰生物科技有限公司 基于实时荧光反转录重组酶介导链替换核酸扩增技术的猪德尔塔冠状病毒检测方法
CN109868331A (zh) * 2019-01-25 2019-06-11 长江大学 通用型猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒的双重巢式rt-pcr引物及检测方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吕继洲 等.猪流行性腹泻病毒实时荧光RPA等温检测方法的建立.《中国畜牧兽医》.2017,第44卷(第12期), *

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