JP2003252791A - Ｓｉｒｓワクチンおよびｓｉｒｓ診断方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＳＩＲＳワクチンおよびＳＩＲＳ診断の方法。
【解決手段】ブタミステリー病(MSD，最近は「ブタ不育
呼吸器不全症候群」ＳＩＲＳと呼ばれている)を治療す
るためのワクチンおよび血清と、ワクチンを生成する方
法と、MSDを診断する方法と、MSDを擬態することができ
るウイルス剤と、MSDの診断および治療に有用なウイル
ス剤に対する抗体を含む。血清は、MSD治療に効果的な
ほ乳類抗体を含む。
呼吸器不全症候群」ＳＩＲＳと呼ばれている)を治療す
るためのワクチンおよび血清と、ワクチンを生成する方
法と、MSDを診断する方法と、MSDを擬態することができ
るウイルス剤と、MSDの診断および治療に有用なウイル
ス剤に対する抗体を含む。血清は、MSD治療に効果的な
ほ乳類抗体を含む。
Description
【０００１】
【従来の技術】1987年以降、養豚産業は未知の病気で、
しばしば「ブタミステリー病」（ＭＳＤ、最近は「ブタ
不育呼吸器不全症候群」（ＳＩＲＳ）と呼ばれている）
と呼ばれる壊滅的伝染病の被害にあっている。これは、
研究者らが病原を同定できなかったためである。ＭＳＤ
は、北アメリカおよび欧州の全域にわたって何十万もの
ブタに被害を与えてきた。ブタ１頭がＭＳＤに感染する
と、３乃至７日以内に群れ全体にＭＳＤが感染する場合
もある。1987年から1991年にかけて、養豚産業はＭＳＤ
が原因で何百万ドルもの利益を損失してしまった。最近
の調査から、ＭＳＤによって棚卸した雌ブタあたり 250
ドルから 500ドルの財務上の損失が生じたと推定されて
いる。
しばしば「ブタミステリー病」（ＭＳＤ、最近は「ブタ
不育呼吸器不全症候群」（ＳＩＲＳ）と呼ばれている）
と呼ばれる壊滅的伝染病の被害にあっている。これは、
研究者らが病原を同定できなかったためである。ＭＳＤ
は、北アメリカおよび欧州の全域にわたって何十万もの
ブタに被害を与えてきた。ブタ１頭がＭＳＤに感染する
と、３乃至７日以内に群れ全体にＭＳＤが感染する場合
もある。1987年から1991年にかけて、養豚産業はＭＳＤ
が原因で何百万ドルもの利益を損失してしまった。最近
の調査から、ＭＳＤによって棚卸した雌ブタあたり 250
ドルから 500ドルの財務上の損失が生じたと推定されて
いる。
【０００２】ＭＳＤは、ブタに複数の症状をもたらす。
ブタの飼育群におけるＭＳＤの最初の徴候は、一般に、
食欲不振および軽度の発熱である。さらに、この群のブ
タの特に、耳、乳頭、鼻ならびに頸および肩の前頭部の
皮膚に青みがかった変色が見られることがある。感染し
た皮膚の損傷は、非回復性になることがある。ただし、
ＭＳＤの関最も壊滅的な症状は、ブタの飼育群に生じる
生殖不全である。ＭＳＤによって、雌ブタは仔ブタを死
産したり、呼吸困難の標準より小さい虚弱な仔ブタを産
んだり、離乳前に死亡する仔ブタを産んだりする。ＭＳ
Ｄ起因のその他の生殖性の徴候には、早産、受胎率の低
下、複数の雌ブタにおける周期不全および同腹の仔ブタ
総数の減少などがある。生殖不全によるブタの損失数
は、年間のブタ生産量の約10乃至15％であると推定され
ている。
ブタの飼育群におけるＭＳＤの最初の徴候は、一般に、
食欲不振および軽度の発熱である。さらに、この群のブ
タの特に、耳、乳頭、鼻ならびに頸および肩の前頭部の
皮膚に青みがかった変色が見られることがある。感染し
た皮膚の損傷は、非回復性になることがある。ただし、
ＭＳＤの関最も壊滅的な症状は、ブタの飼育群に生じる
生殖不全である。ＭＳＤによって、雌ブタは仔ブタを死
産したり、呼吸困難の標準より小さい虚弱な仔ブタを産
んだり、離乳前に死亡する仔ブタを産んだりする。ＭＳ
Ｄ起因のその他の生殖性の徴候には、早産、受胎率の低
下、複数の雌ブタにおける周期不全および同腹の仔ブタ
総数の減少などがある。生殖不全によるブタの損失数
は、年間のブタ生産量の約10乃至15％であると推定され
ている。
【０００３】このため、研究は、ＭＳＤの病原を単離す
る方向に向けられてきた。この結果、多くの潜在的細菌
病原体が単離されている。ただし、潜在的細菌病原体の
型は、養豚場によってきまざまであった。ウイルス調査
には、蛍光抗体試験、電子顕微鏡検査、血清学的方法な
どがある。これらの方法によって、ＭＳＤの病原を追求
することはできなかった。その結果、ブタの集団治療に
使用することができるワクチンの開発に成功した者はい
ない。
る方向に向けられてきた。この結果、多くの潜在的細菌
病原体が単離されている。ただし、潜在的細菌病原体の
型は、養豚場によってきまざまであった。ウイルス調査
には、蛍光抗体試験、電子顕微鏡検査、血清学的方法な
どがある。これらの方法によって、ＭＳＤの病原を追求
することはできなかった。その結果、ブタの集団治療に
使用することができるワクチンの開発に成功した者はい
ない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、ブタの飼育群に投与した場合に、飼育集団中の
ＭＳＤの発現を低減することができる血清含有ワクチン
を提供することにある。本発明の別の目的は、ブタ母集
団をそのワクチンで治療し、そのブタ母集団からＭＳＤ
を根絶する方法を提供することにある。また、本発明の
別の目的は、ＭＳＤ診断方法を提供することにある。
目的は、ブタの飼育群に投与した場合に、飼育集団中の
ＭＳＤの発現を低減することができる血清含有ワクチン
を提供することにある。本発明の別の目的は、ブタ母集
団をそのワクチンで治療し、そのブタ母集団からＭＳＤ
を根絶する方法を提供することにある。また、本発明の
別の目的は、ＭＳＤ診断方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記のおよび別の目的
は、ブタにおけるＭＳＤの予防および治療するための血
清含有ワクチンならびにその診断方法に向けられた本発
明によって達成することができる。
は、ブタにおけるＭＳＤの予防および治療するための血
清含有ワクチンならびにその診断方法に向けられた本発
明によって達成することができる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のワクチンは、ブタにＭＳ
Ｄを感染させる病原菌由来である。病原菌は、ＭＳＤに
感染したブタの調整組織接種材料から得られ、肺組織か
ら得られることが好ましい。病原菌は、ブタ感染組織の
接種材料に感染したサル細胞系などのin vitroほ乳類細
胞培養生成物であることが好ましい。この接種材料は、
大きさが約1.0ミクロン以下の生物学的粒子であること
が好ましく、0.5ミクロン以下であることが好ましく0.2
ミクロン以下であることが最も好ましい。接種材料は、
一般的な抗体で中和することも好ましい。
Ｄを感染させる病原菌由来である。病原菌は、ＭＳＤに
感染したブタの調整組織接種材料から得られ、肺組織か
ら得られることが好ましい。病原菌は、ブタ感染組織の
接種材料に感染したサル細胞系などのin vitroほ乳類細
胞培養生成物であることが好ましい。この接種材料は、
大きさが約1.0ミクロン以下の生物学的粒子であること
が好ましく、0.5ミクロン以下であることが好ましく0.2
ミクロン以下であることが最も好ましい。接種材料は、
一般的な抗体で中和することも好ましい。
【０００７】本発明に従って、ノトバイオートの仔ブタ
および妊娠ブタに鼻腔内接種した場合、ＳＩＲＳ影響下
群の仔ブタから得られた組織ホモジネートは、ＳＩＲＳ
の呼吸性生殖性形態を複製した。ノトバイオートの仔ブ
タに、未濾過接種材料または濾過接種材料（0.45、0.22
または0.1μm）で同様に接種したところ食欲不振に陥
り、ＳＩＲＳ影響下の群れに見られる病変に類似した顕
微鏡的肺病変を発現した。同様の接種材料は、ＳＩＲＳ
影響下群に見られる生殖的効果と同一の効果も引き起こ
した。ウイルス因子を組織ホモジネートから検出した。
このウイルス因子によって、仔ブタおよび妊娠豚のＳＩ
ＲＳ類似の疾患が生じる。ウイルス因子は、現在まで分
類されていない。ただし、ウイルス因子は、選好性非血
球凝集外被ＲＮＡウイルスである。ＳＩＲＳを引き起こ
すウイルス因子は、1991年07月18日、メリーランド州ロ
ックビル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ATCC）、登録番号ATCC VR-2332で寄託されて
いる。
および妊娠ブタに鼻腔内接種した場合、ＳＩＲＳ影響下
群の仔ブタから得られた組織ホモジネートは、ＳＩＲＳ
の呼吸性生殖性形態を複製した。ノトバイオートの仔ブ
タに、未濾過接種材料または濾過接種材料（0.45、0.22
または0.1μm）で同様に接種したところ食欲不振に陥
り、ＳＩＲＳ影響下の群れに見られる病変に類似した顕
微鏡的肺病変を発現した。同様の接種材料は、ＳＩＲＳ
影響下群に見られる生殖的効果と同一の効果も引き起こ
した。ウイルス因子を組織ホモジネートから検出した。
このウイルス因子によって、仔ブタおよび妊娠豚のＳＩ
ＲＳ類似の疾患が生じる。ウイルス因子は、現在まで分
類されていない。ただし、ウイルス因子は、選好性非血
球凝集外被ＲＮＡウイルスである。ＳＩＲＳを引き起こ
すウイルス因子は、1991年07月18日、メリーランド州ロ
ックビル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ATCC）、登録番号ATCC VR-2332で寄託されて
いる。
【０００８】感染したブタの治療に用いる血清は、ほ乳
類抗体をＭＳＤ病変まで輸送する。これは、上述の病原
菌で前処理した（ブタであるか否かを問わず）ほ乳類血
漿から得られる。
類抗体をＭＳＤ病変まで輸送する。これは、上述の病原
菌で前処理した（ブタであるか否かを問わず）ほ乳類血
漿から得られる。
【０００９】選択的に、血清をハイブリドーマ法によっ
て生成したＭＳＤに対するモノクロナール抗体から調合
する。
て生成したＭＳＤに対するモノクロナール抗体から調合
する。
【００１０】ＭＳＤ診断方法は、ＭＳＤに対する免疫特
異抗体の使用に基づく。本方法は、肺生検試料の濾過ホ
モジネートまたは生検試料もしくは他の組織から得た同
様の（生検またはホモジネート）試料と免疫特異抗体と
を結合させる必要があり、この結合で形成された接合体
には既知の検出技術を利用する。接合体の定着または沈
殿と、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サザンブロット法、ノーザ
ンブロット法、ウエスタンブロット法などの検出技術を
用いることによって、ＭＳＤを診断できる。
異抗体の使用に基づく。本方法は、肺生検試料の濾過ホ
モジネートまたは生検試料もしくは他の組織から得た同
様の（生検またはホモジネート）試料と免疫特異抗体と
を結合させる必要があり、この結合で形成された接合体
には既知の検出技術を利用する。接合体の定着または沈
殿と、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サザンブロット法、ノーザ
ンブロット法、ウエスタンブロット法などの検出技術を
用いることによって、ＭＳＤを診断できる。
【００１１】本発明によれば、ＭＳＤに対して抗体を使
用する治療方法および診断方法には、上述の選好性非血
球凝集外被ＲＮＡウイルスに対するモノクロナール抗体
（IgGやIgM）が必要である。模範的な抗体には、SDOW12
とSDOWl7があり、各々登録番号HB 10996とHB 10997で19
92年 3月27日付けでアメリカン・タイプ・カルチャーに
寄託されている。
用する治療方法および診断方法には、上述の選好性非血
球凝集外被ＲＮＡウイルスに対するモノクロナール抗体
（IgGやIgM）が必要である。模範的な抗体には、SDOW12
とSDOWl7があり、各々登録番号HB 10996とHB 10997で19
92年 3月27日付けでアメリカン・タイプ・カルチャーに
寄託されている。
【００１２】発明の詳細な説明
ブタミステリー病（ＭＳＤ）の決定は困難であった。し
かし、本発明によって、ＭＳＤを引き起こす病原菌を単
離し成長させることができた。本文中に使用するように
「病原菌」は、ブタに対して不育症候群および呼吸器症
候群を生じさせることができるウイルスを言う。さらに
詳述すると、病原菌は、ブタに対して不育と呼吸器疾患
とを生じさせる能力がある選好性非血球凝集外被ＲＮＡ
ウイルスおよびその動物病理学的突然変異体である。病
原菌の単離は大発見である。この発見によって、ワクチ
ンの生産、感染したブタを治療するための抗体血清の生
産および診断方法の確立が可能になる。
かし、本発明によって、ＭＳＤを引き起こす病原菌を単
離し成長させることができた。本文中に使用するように
「病原菌」は、ブタに対して不育症候群および呼吸器症
候群を生じさせることができるウイルスを言う。さらに
詳述すると、病原菌は、ブタに対して不育と呼吸器疾患
とを生じさせる能力がある選好性非血球凝集外被ＲＮＡ
ウイルスおよびその動物病理学的突然変異体である。病
原菌の単離は大発見である。この発見によって、ワクチ
ンの生産、感染したブタを治療するための抗体血清の生
産および診断方法の確立が可能になる。
【００１３】ワクチンは、不活性のまたは弱毒化したＭ
ＳＤ病原菌から成り、ＭＳＤの特性的損傷を示すブタ感
染肺組織またはその他のブタ組織調整の接種材料由来で
ある。病原菌の機能的誘導体として、サブユニットワク
チン、ベクターワクチン、組換体ワクチン、合成ペプチ
ドワクチンなども、考えられる。ＭＳＤワクチンの開発
には、複数のステップを踏む方法を利用する。初めに、
ＭＳＤ病原菌を感染ブタ組織、好ましくは肺組織から分
離および単離することによって接種材料として得る。次
に、ＭＳＤ病原菌を既知のワクチン学的技法を使用して
処理し、抗ＭＳＤワクチンを生成する。
ＳＤ病原菌から成り、ＭＳＤの特性的損傷を示すブタ感
染肺組織またはその他のブタ組織調整の接種材料由来で
ある。病原菌の機能的誘導体として、サブユニットワク
チン、ベクターワクチン、組換体ワクチン、合成ペプチ
ドワクチンなども、考えられる。ＭＳＤワクチンの開発
には、複数のステップを踏む方法を利用する。初めに、
ＭＳＤ病原菌を感染ブタ組織、好ましくは肺組織から分
離および単離することによって接種材料として得る。次
に、ＭＳＤ病原菌を既知のワクチン学的技法を使用して
処理し、抗ＭＳＤワクチンを生成する。
【００１４】ＭＳＤ病原菌は、ＭＳＤによって呼吸が急
速なブタの肺組織から接種材料として単離することが好
ましい（胎児組織などのその他の組織を使用してウイル
スを回収することもできる）。このようなブタを殺処分
し、肺組織を摘出する。次に、摘出その肺組織を、肺胞
腔中にマクロファージ、変性細胞およびデブリの存在に
よって生じる肥大した肺胞間について調べる。これらの
特性は、ＭＳＤ病原菌の存在を示すものである。この種
の損傷を示す別のブタ組織を使用して、ＭＳＤ病原菌を
単離することもできる。
速なブタの肺組織から接種材料として単離することが好
ましい（胎児組織などのその他の組織を使用してウイル
スを回収することもできる）。このようなブタを殺処分
し、肺組織を摘出する。次に、摘出その肺組織を、肺胞
腔中にマクロファージ、変性細胞およびデブリの存在に
よって生じる肥大した肺胞間について調べる。これらの
特性は、ＭＳＤ病原菌の存在を示すものである。この種
の損傷を示す別のブタ組織を使用して、ＭＳＤ病原菌を
単離することもできる。
【００１５】続いて、（生理的塩類溶液、リンガー溶
液、ハンクス均衡塩類溶液、最小必須培地などの）薬学
的に耐用し得る水溶液で、肺組織またはその他のブタ組
織を均質化して、組織がホモジネートの容量に対して10
％の重量から成るようにする。ホモジネートを、細孔直
径が0.05乃至10ミクロンまでの、好ましくは0.45、0.2
および 0.1ミクロンの一連の濾過器にかけて、ＭＳＤ病
原菌を含む濾過ホモジネートを生成する。結果的に、濾
過ホモジネ−トは、約1.0ミクロン以下の、好ましくす
0.2− 0.1ミクロンの大きさの生物学的粒子を含む。ホ
モジネートをさらにフロインド不完全アジュバンドに混
合して、抗体産生をほ乳類への注射時に刺激することが
できる。この混合物をブタのＭＳＤ発現用接種材料また
はＭＳＤ病原菌のさらに進んだ研究用の接種材料として
使用することもできる。
液、ハンクス均衡塩類溶液、最小必須培地などの）薬学
的に耐用し得る水溶液で、肺組織またはその他のブタ組
織を均質化して、組織がホモジネートの容量に対して10
％の重量から成るようにする。ホモジネートを、細孔直
径が0.05乃至10ミクロンまでの、好ましくは0.45、0.2
および 0.1ミクロンの一連の濾過器にかけて、ＭＳＤ病
原菌を含む濾過ホモジネートを生成する。結果的に、濾
過ホモジネ−トは、約1.0ミクロン以下の、好ましくす
0.2− 0.1ミクロンの大きさの生物学的粒子を含む。ホ
モジネートをさらにフロインド不完全アジュバンドに混
合して、抗体産生をほ乳類への注射時に刺激することが
できる。この混合物をブタのＭＳＤ発現用接種材料また
はＭＳＤ病原菌のさらに進んだ研究用の接種材料として
使用することもできる。
【００１６】病原菌を含む濾過ホモジネートを得た後
に、ホルマリンやアセトアルデヒドなどを含むアルデヒ
ド試薬、クレゾールやフェノールなどを含む反応性酸性
アルコール、安息香酸やベンゼンスルホン酸などの酸、
ベータ−プロピオンラクトンやカプロラクトンなどのラ
クトン、カルボニルジイミダゾールなどの活性ラクタ
ム、カルボジイミド、カルボニルジヘテロ芳香族化合物
などの標準的化学的不活性化剤を含む濾過ホモジネート
を処理することによって、病原菌を不活性化または死滅
させることができる。紫外線照射やγ線などによる照射
を使用して病原菌を不活性化または死滅させることもで
きる。選択的には、この病原菌をブタ以外のほ乳動物ま
たは鳥の起点由来の細胞培養で反復成長させることによ
って弱毒化し、病原菌が毒性を有して繁殖する能力を失
わせることができる。細胞培養による弱毒化技術に関す
る詳細は、以下に述べる。
に、ホルマリンやアセトアルデヒドなどを含むアルデヒ
ド試薬、クレゾールやフェノールなどを含む反応性酸性
アルコール、安息香酸やベンゼンスルホン酸などの酸、
ベータ−プロピオンラクトンやカプロラクトンなどのラ
クトン、カルボニルジイミダゾールなどの活性ラクタ
ム、カルボジイミド、カルボニルジヘテロ芳香族化合物
などの標準的化学的不活性化剤を含む濾過ホモジネート
を処理することによって、病原菌を不活性化または死滅
させることができる。紫外線照射やγ線などによる照射
を使用して病原菌を不活性化または死滅させることもで
きる。選択的には、この病原菌をブタ以外のほ乳動物ま
たは鳥の起点由来の細胞培養で反復成長させることによ
って弱毒化し、病原菌が毒性を有して繁殖する能力を失
わせることができる。細胞培養による弱毒化技術に関す
る詳細は、以下に述べる。
【００１７】死滅または弱毒化した病原菌を、免疫応答
刺激用稀釈アジュバント溶液を添加することによって、
適切な力価まで稀釈する。力価測定は、ELISA、RIA、IF
Aなどの免疫学的試験または以下に述べる酵素基質検出
試験において、ＭＳＤ抗体を測定することによって、達
成することができる。
刺激用稀釈アジュバント溶液を添加することによって、
適切な力価まで稀釈する。力価測定は、ELISA、RIA、IF
Aなどの免疫学的試験または以下に述べる酵素基質検出
試験において、ＭＳＤ抗体を測定することによって、達
成することができる。
【００１８】病原菌の精製形態を生成するには、上述の
濾過ホモジネートを一連のin vitro細胞試料に接種する
こともできる。腎臓、肝臓、心臓などのほ乳類の器官細
胞と、脳細胞細胞、肺細胞、脾細胞、精巣細胞、鼻甲
介、自血球細胞および赤血球細胞ならびにリンパ節とに
よる細胞試料のほか、昆虫胚試料および鳥胚試料を使用
することができる。これらの細胞試料に適切な培地に
は、ウシ胎児血清およびウシ胎児寒天、浸出物物寒天、
脳−心臓浸出物の肉汁および寒天などほ乳類支持細胞成
長因子などを含む。ほ乳類細胞は、サル腎細胞であるこ
とが好ましく、アフリカ産ミドリザル腎胚細胞−−サル
腎細胞系（MA-104）−−であることが最も好ましい。
濾過ホモジネートを一連のin vitro細胞試料に接種する
こともできる。腎臓、肝臓、心臓などのほ乳類の器官細
胞と、脳細胞細胞、肺細胞、脾細胞、精巣細胞、鼻甲
介、自血球細胞および赤血球細胞ならびにリンパ節とに
よる細胞試料のほか、昆虫胚試料および鳥胚試料を使用
することができる。これらの細胞試料に適切な培地に
は、ウシ胎児血清およびウシ胎児寒天、浸出物物寒天、
脳−心臓浸出物の肉汁および寒天などほ乳類支持細胞成
長因子などを含む。ほ乳類細胞は、サル腎細胞であるこ
とが好ましく、アフリカ産ミドリザル腎胚細胞−−サル
腎細胞系（MA-104）−−であることが最も好ましい。
【００１９】濾過ホモジネートを細胞試料に接種し、培
養を増殖きせた後、培養細胞から成る個体凝集を細胞含
有の無菌培地に収集し再導入する。この系列の最終培養
由来の培養液は、毒性病原菌の精製形態を提供する。ま
た、一連の反復収集物を形成した後、培養を育成し、培
養液を収集しその液を異なる細胞種を培養するための接
種材料として使用することができる。この方法では、病
原菌を弱毒化して、異種培養由来の培養液によって弱毒
化病原菌の精製形態を提供する。
養を増殖きせた後、培養細胞から成る個体凝集を細胞含
有の無菌培地に収集し再導入する。この系列の最終培養
由来の培養液は、毒性病原菌の精製形態を提供する。ま
た、一連の反復収集物を形成した後、培養を育成し、培
養液を収集しその液を異なる細胞種を培養するための接
種材料として使用することができる。この方法では、病
原菌を弱毒化して、異種培養由来の培養液によって弱毒
化病原菌の精製形態を提供する。
【００２０】ポリクローナル抗体血清を、ほ乳類の免役
応答を引き起こす抗原物質として病原菌を使用すること
によって生成することができる。培養液または上述の方
法で調整した接種材料を、ウマ、ヤギ、マウス、ウサギ
などのブタ以外のほ乳動物に対して刺激アジュバントを
投与することができる。抗原刺激を反復した後、血液採
取した動物の血清に一般に認められる上述の疾患に特異
的な抗体に対して固着した抗体を使用して、血清の一部
を取り出して抗原精製をすることができる。さらに、生
理的塩類溶液と分子量約10,000のタンパク様化合物の収
集物とを含む糖ゲルカラムなどによるクロマトグラフィ
ーによって半精製した血清を処理し、治療に用いる精製
ポリクローナル血清を生成する。
応答を引き起こす抗原物質として病原菌を使用すること
によって生成することができる。培養液または上述の方
法で調整した接種材料を、ウマ、ヤギ、マウス、ウサギ
などのブタ以外のほ乳動物に対して刺激アジュバントを
投与することができる。抗原刺激を反復した後、血液採
取した動物の血清に一般に認められる上述の疾患に特異
的な抗体に対して固着した抗体を使用して、血清の一部
を取り出して抗原精製をすることができる。さらに、生
理的塩類溶液と分子量約10,000のタンパク様化合物の収
集物とを含む糖ゲルカラムなどによるクロマトグラフィ
ーによって半精製した血清を処理し、治療に用いる精製
ポリクローナル血清を生成する。
【００２１】モノクロナール抗体血清をハイブリドーマ
技術によって生成することができる。ＭＳＤ含有細胞培
養ライゼートまたは上述の勾配−精製ＭＳＤでマウス、
ブタ、ラット、ウサギまたはその他の適切な種を免疫化
した後、動物の脾臓を摘出し完全な細胞試料に変換する
ことができる。KohlerおよびMilsteinの方法（Kohler
ら、Nature，256, 459-97（1975））に従って、脾臓細
胞試料由来の免疫細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイ
ブリドーマを生成することができる。このハイブリドー
マを培養し、病原菌を輸送する培養液または接種材料に
対して培養液を試験することによって、ＭＳＤ病原菌に
対するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ培
養を単離することができる。このハイブリドーマをホス
ト種の腹膜に導入することによって、ハイブリドーマを
腹膜で増殖させることができる。腹水を収集することに
よって、病原菌に対するモノクロナール抗体を含む体液
を生成することができる。ハイブリドーマ細胞培養由来
の細胞培養上澄みを使用することもできる。モノクロナ
ール抗体をマウス誘導ハイブリッド細胞系によって生成
することが好ましく、この場合の抗体は、IgG型またはI
gM型の免疫グロブリンである。ＳＩＲＳの病原菌に対す
る模範的モノクロナール抗体は、SDOW12とSDOW17であ
る。本明細書の別の箇所で述べる使用方法の他に、本発
明によるモノクロナール抗体を、診断用組成物および治
療用組成物ならびに、受動免疫方法や抗イディオタイプ
ワクチン調整方法などの診断方法および治療方法を利用
することができる。
技術によって生成することができる。ＭＳＤ含有細胞培
養ライゼートまたは上述の勾配−精製ＭＳＤでマウス、
ブタ、ラット、ウサギまたはその他の適切な種を免疫化
した後、動物の脾臓を摘出し完全な細胞試料に変換する
ことができる。KohlerおよびMilsteinの方法（Kohler
ら、Nature，256, 459-97（1975））に従って、脾臓細
胞試料由来の免疫細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイ
ブリドーマを生成することができる。このハイブリドー
マを培養し、病原菌を輸送する培養液または接種材料に
対して培養液を試験することによって、ＭＳＤ病原菌に
対するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ培
養を単離することができる。このハイブリドーマをホス
ト種の腹膜に導入することによって、ハイブリドーマを
腹膜で増殖させることができる。腹水を収集することに
よって、病原菌に対するモノクロナール抗体を含む体液
を生成することができる。ハイブリドーマ細胞培養由来
の細胞培養上澄みを使用することもできる。モノクロナ
ール抗体をマウス誘導ハイブリッド細胞系によって生成
することが好ましく、この場合の抗体は、IgG型またはI
gM型の免疫グロブリンである。ＳＩＲＳの病原菌に対す
る模範的モノクロナール抗体は、SDOW12とSDOW17であ
る。本明細書の別の箇所で述べる使用方法の他に、本発
明によるモノクロナール抗体を、診断用組成物および治
療用組成物ならびに、受動免疫方法や抗イディオタイプ
ワクチン調整方法などの診断方法および治療方法を利用
することができる。
【００２２】本発明のワクチンは、ブタ母集団に見られ
るＭＳＤ感染を予防し治癒することができる。in vivo
において、効果的に予防および抗感染用に使用するため
に、ワクチンには死滅病原菌または弱毒化病原菌を含ん
でおり、単独でまたはブタと適合する薬学的担体と組み
合わせて投与することができる。このワクチンは、経
口、非経口、経鼻腔または経静脈的に誘導することがで
きる。ワクチン容量決定に関連する因子には、年齢、体
重および感染したブタの母体抗体レベルなどが含まれ
る。投与量は、1mlあたりの50％組織培養感染価で103−
107であり、容量で1ml乃至5mlで投与することが好まし
い。ワクチン投与は、約14−28日間で投与して、ブタが
ＭＳＤ感染に対して確実に免疫を発現させることが望ま
しい。
るＭＳＤ感染を予防し治癒することができる。in vivo
において、効果的に予防および抗感染用に使用するため
に、ワクチンには死滅病原菌または弱毒化病原菌を含ん
でおり、単独でまたはブタと適合する薬学的担体と組み
合わせて投与することができる。このワクチンは、経
口、非経口、経鼻腔または経静脈的に誘導することがで
きる。ワクチン容量決定に関連する因子には、年齢、体
重および感染したブタの母体抗体レベルなどが含まれ
る。投与量は、1mlあたりの50％組織培養感染価で103−
107であり、容量で1ml乃至5mlで投与することが好まし
い。ワクチン投与は、約14−28日間で投与して、ブタが
ＭＳＤ感染に対して確実に免疫を発現させることが望ま
しい。
【００２３】ＭＳＤワクチンは、様々な異なる投与形態
で投与することができる。死滅または弱毒化させたＭＳ
Ｄ病原菌を含む水性培地は、錠剤やカプセルなどの形態
をしたラクトース、デンプン、炭酸カルシウム、クエン
酸ナトリウムなどの薬学的に耐用し得る不活性賦形剤お
よび緩衝剤で乾燥させて組み合わせることができる。こ
れらの組み合わせは、粉末状にしたり、水溶液に懸濁し
たりして、この粉末および水溶液またはそのいずれかを
動物用飼料や動物用飲料水に添加しても良い。これらの
ＭＳＤワクチン粉末または溶液をさまざまな既知の薬剤
によって、適当な甘味や風味を与えて、ブタが経口でワ
クチンを摂取するように促進しても良い。
で投与することができる。死滅または弱毒化させたＭＳ
Ｄ病原菌を含む水性培地は、錠剤やカプセルなどの形態
をしたラクトース、デンプン、炭酸カルシウム、クエン
酸ナトリウムなどの薬学的に耐用し得る不活性賦形剤お
よび緩衝剤で乾燥させて組み合わせることができる。こ
れらの組み合わせは、粉末状にしたり、水溶液に懸濁し
たりして、この粉末および水溶液またはそのいずれかを
動物用飼料や動物用飲料水に添加しても良い。これらの
ＭＳＤワクチン粉末または溶液をさまざまな既知の薬剤
によって、適当な甘味や風味を与えて、ブタが経口でワ
クチンを摂取するように促進しても良い。
【００２４】非経口投与を行なうには、死滅または弱毒
化させたＭＳＤ病原菌を食塩水、水、プロピレングリコ
ール、などの当業者らには良く知られている薬学的に耐
用し得る担体と組み合わせることができる。この形態で
は、ワクチンを非経口的、経鼻腔的および経口的手段
で、獣医学関係の当業者には良く知られる方法によって
投与することができる。ＭＳＤワクチンは注射器によっ
て静脈投与することもできる。この場合、食塩水などの
薬学的に耐用し得る水性担体と組み合わせる。ＭＳＤワ
クチンの非経口的および静脈的製剤形態は、乳化剤およ
び懸濁剤またはそのいずれか一方であるが、薬学的に耐
用し得る稀釈剤を併用し、ＭＳＤワクチンの誘導および
投与量を制御することもできる。
化させたＭＳＤ病原菌を食塩水、水、プロピレングリコ
ール、などの当業者らには良く知られている薬学的に耐
用し得る担体と組み合わせることができる。この形態で
は、ワクチンを非経口的、経鼻腔的および経口的手段
で、獣医学関係の当業者には良く知られる方法によって
投与することができる。ＭＳＤワクチンは注射器によっ
て静脈投与することもできる。この場合、食塩水などの
薬学的に耐用し得る水性担体と組み合わせる。ＭＳＤワ
クチンの非経口的および静脈的製剤形態は、乳化剤およ
び懸濁剤またはそのいずれか一方であるが、薬学的に耐
用し得る稀釈剤を併用し、ＭＳＤワクチンの誘導および
投与量を制御することもできる。
【００２５】ＭＳＤ診断方法は、上述のポリクローナル
抗体血清またはモノクローナル抗体血清を用いて実行す
ることができる。抗体血清または生検組織ホモジネート
をポリスチレン表面またはタンパク質を固定する別のポ
リマー表面に接触させることによって固定することがで
きる。さらに、抗体血清および抗体ホモジネートの残り
を添加し、培養し、非固定材料を洗浄などによって除去
する。抗体血清用の標識種−特異抗体を加えて、標識の
存在および量を測定する。標識測定は、検定する組織に
ＭＳＤが存在することを示す。この方法の一般的な態様
には、酵素結合免疫吸着検定方法（ELISA）、ラジオイ
ムノアッセイ（RIA）、免疫蛍光検定（IFA）、ノーザン
ブロット免疫検定、サザンブロット免疫検定、ウエスタ
ンブロット免疫検定などがある。
抗体血清またはモノクローナル抗体血清を用いて実行す
ることができる。抗体血清または生検組織ホモジネート
をポリスチレン表面またはタンパク質を固定する別のポ
リマー表面に接触させることによって固定することがで
きる。さらに、抗体血清および抗体ホモジネートの残り
を添加し、培養し、非固定材料を洗浄などによって除去
する。抗体血清用の標識種−特異抗体を加えて、標識の
存在および量を測定する。標識測定は、検定する組織に
ＭＳＤが存在することを示す。この方法の一般的な態様
には、酵素結合免疫吸着検定方法（ELISA）、ラジオイ
ムノアッセイ（RIA）、免疫蛍光検定（IFA）、ノーザン
ブロット免疫検定、サザンブロット免疫検定、ウエスタ
ンブロット免疫検定などがある。
【００２６】
【実施例】以下の例は、本発明の特異的態様をさらに説
明するものである。ただし、以下の例は、上述の開示に
おいて十分に特徴づけられた本発明の範囲を限定するも
のではない 。
明するものである。ただし、以下の例は、上述の開示に
おいて十分に特徴づけられた本発明の範囲を限定するも
のではない 。
【００２７】例 １
ＭＳＤ病原菌は、接種材料の処理後、ノトバイオートブ
タに接種して、ＭＳＤ病原菌に病原性が残存するかどう
かを測定し、物理化学的特性（大きき、脂質溶剤に対す
る感受性およびプロテアーゼ感受性）を測定することに
よって特徴付けることができる。
タに接種して、ＭＳＤ病原菌に病原性が残存するかどう
かを測定し、物理化学的特性（大きき、脂質溶剤に対す
る感受性およびプロテアーゼ感受性）を測定することに
よって特徴付けることができる。
【００２８】Ａ．材料 ノトバイオートブタ
。 ノトバイオートブタに対する誘
導方法および維持方法はBenifieldら、Am. J. Vet. Re
s., 49，330−36（1988）およびCollinsら、Am.J. Vet.
Res., 50，824−35（1989）に記載されている。雌ブタ
をＭＳＤを含む生殖上の問題がない群れから得ることが
できる。死産およびミイラ化した胎児またはそのいずれ
か一方を伴う同腹子は使用してはならない。
導方法および維持方法はBenifieldら、Am. J. Vet. Re
s., 49，330−36（1988）およびCollinsら、Am.J. Vet.
Res., 50，824−35（1989）に記載されている。雌ブタ
をＭＳＤを含む生殖上の問題がない群れから得ることが
できる。死産およびミイラ化した胎児またはそのいずれ
か一方を伴う同腹子は使用してはならない。
【００２９】ＭＳＤ接種材料（MN90-SD76-GP2、本文で
はMNSD90 76LまたはMSND90 76-Pを言う）。 気管、肺、
鼻甲介、扁桃、肝臓、脳、脾臓をＭＳＤに自然感染した
ミネソタ州の１群中養育中のブタから得ることができる
（Collins et al., Minnesota Swine Conference for V
eterinarians, Abstract, 254−55（1990））。これら
の組織ホモジネート（MN 89−35477）を、抗体を用いず
にハンクの塩類溶液で調整し、 0.5mlを経鼻腔によりNe
bulizer ガラス（Ted Pella Co., Redding, CA）を使用
して、日齢３日のノトバイオートブタに接種することが
できる。接種した仔ブタは、自然感染のブタに観察され
るのと同様の臨床的徴候および電子顕微鏡的損傷を発現
する場合がある。これらのノトバイオートブタから得た
肺、肝臓、腎臓、脾臓および脳を、初回接種後８日後収
集し、プールして別のホモジネートを調整することがで
きる。その後、第２回目に得られたホモジネートを、ノ
トバイオート豚にもう一度接種することができる。ま
た、ＭＳＤは肺組織から理想的に増殖させることができ
るので、肺組織を分離ホモジネートとして調整できる場
合以外は、同様組織を収集し均質化しても良い。肺ホモ
ジネートは、ノトバイオートブタの初回接種材料（MN 8
9−35477）の第２の連続継代に相当する（Collinsら、7
1st Meeting of the Conference of Research Workers
in Animal Disease, Abastract No．2（1990））。２種
の濾液を0.20μmフィルター（Gelman Sciences, Ann Ar
bor, MI）および0.10μmフィルター（Millipore Corp.,
Bedford, MA）を用いて調整することができる。これら
の濾液を区分して、-70℃で保管することができる。す
べての濾液は、細菌を有さず、ウイルスは、逆染色調整
法を使用しても直接電子顕微鏡検査では観察されないこ
とが望ましい。
はMNSD90 76LまたはMSND90 76-Pを言う）。 気管、肺、
鼻甲介、扁桃、肝臓、脳、脾臓をＭＳＤに自然感染した
ミネソタ州の１群中養育中のブタから得ることができる
（Collins et al., Minnesota Swine Conference for V
eterinarians, Abstract, 254−55（1990））。これら
の組織ホモジネート（MN 89−35477）を、抗体を用いず
にハンクの塩類溶液で調整し、 0.5mlを経鼻腔によりNe
bulizer ガラス（Ted Pella Co., Redding, CA）を使用
して、日齢３日のノトバイオートブタに接種することが
できる。接種した仔ブタは、自然感染のブタに観察され
るのと同様の臨床的徴候および電子顕微鏡的損傷を発現
する場合がある。これらのノトバイオートブタから得た
肺、肝臓、腎臓、脾臓および脳を、初回接種後８日後収
集し、プールして別のホモジネートを調整することがで
きる。その後、第２回目に得られたホモジネートを、ノ
トバイオート豚にもう一度接種することができる。ま
た、ＭＳＤは肺組織から理想的に増殖させることができ
るので、肺組織を分離ホモジネートとして調整できる場
合以外は、同様組織を収集し均質化しても良い。肺ホモ
ジネートは、ノトバイオートブタの初回接種材料（MN 8
9−35477）の第２の連続継代に相当する（Collinsら、7
1st Meeting of the Conference of Research Workers
in Animal Disease, Abastract No．2（1990））。２種
の濾液を0.20μmフィルター（Gelman Sciences, Ann Ar
bor, MI）および0.10μmフィルター（Millipore Corp.,
Bedford, MA）を用いて調整することができる。これら
の濾液を区分して、-70℃で保管することができる。す
べての濾液は、細菌を有さず、ウイルスは、逆染色調整
法を使用しても直接電子顕微鏡検査では観察されないこ
とが望ましい。
【００３０】対照接種材料。 擬似感染ノトバイオート
ブタ２例から調整した肺組織ホモジネートを対照ブタの
接種材料として使用することができる。この対照接種材
料をＭＳＤ接種材料に関して述べたように、0.20および
0.10μmの濾液として調整することができる。
ブタ２例から調整した肺組織ホモジネートを対照ブタの
接種材料として使用することができる。この対照接種材
料をＭＳＤ接種材料に関して述べたように、0.20および
0.10μmの濾液として調整することができる。
【００３１】剖検方法および組織病理学。 Collinsら、
71st Meeting of the Conference of Research Workers
in Animal Disease, Abstract No.2（1990）で先述し
たように、初回接種７日後、ブタを安楽死させる。組織
を収集し、中性緩衝ホルマリンで固定し、Collinsら、A
n. J. Vet. Res., 50，827−35（1989）で述べたように
光学的顕微鏡試験で処理することができる。標本を、鼻
甲介、扁桃、気管、脳、胸線、肺（根尖葉、噴門側葉、
隔膜側葉）、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、胃、十二指腸、
空腸、回腸、上行結腸、下行結腸、血液、隔膜リンパ結
節から収集することができる。これらの組織を処理し、
光学顕微鏡を使用して、リンパ単核脳炎、間質性肺炎、
リンパプラスマ細胞性鼻炎、タンパ単核心筋炎または門
脈性肝炎が存在するか否かを測定する。病変は、ＭＳＤ
接種群から得た自然感染ブタに常時認められる（Collin
s ら、Minnesota Swine Conference for Veterinarian
s,Abstract, 254−55（1990））。糞含有物を収集し、
先述のRitchieらによる、Arch. Gesante. Virus-forcsh
e, 23, 292-98（1968）のように、ウイルス粒子を試験
しても良い。血液を免疫検定および免疫組織用に収集
し、例3に述べるように細菌用に培養することができ
る。
71st Meeting of the Conference of Research Workers
in Animal Disease, Abstract No.2（1990）で先述し
たように、初回接種７日後、ブタを安楽死させる。組織
を収集し、中性緩衝ホルマリンで固定し、Collinsら、A
n. J. Vet. Res., 50，827−35（1989）で述べたように
光学的顕微鏡試験で処理することができる。標本を、鼻
甲介、扁桃、気管、脳、胸線、肺（根尖葉、噴門側葉、
隔膜側葉）、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、胃、十二指腸、
空腸、回腸、上行結腸、下行結腸、血液、隔膜リンパ結
節から収集することができる。これらの組織を処理し、
光学顕微鏡を使用して、リンパ単核脳炎、間質性肺炎、
リンパプラスマ細胞性鼻炎、タンパ単核心筋炎または門
脈性肝炎が存在するか否かを測定する。病変は、ＭＳＤ
接種群から得た自然感染ブタに常時認められる（Collin
s ら、Minnesota Swine Conference for Veterinarian
s,Abstract, 254−55（1990））。糞含有物を収集し、
先述のRitchieらによる、Arch. Gesante. Virus-forcsh
e, 23, 292-98（1968）のように、ウイルス粒子を試験
しても良い。血液を免疫検定および免疫組織用に収集
し、例3に述べるように細菌用に培養することができ
る。
【００３２】Ｂ．病原菌の単離
ＳＩＲＳ感染群中の感染仔ブタから得た肺組織および脳
−脾−肝−腎結合組織を個々に均質化した。10％の組織
ホモジネートを用いた。個々のホモジネートを１ml当た
り約 100μgでゲンタマイシンを含む最小必須培養液
（ＭＥＭ）と混合した。両試料を約25分間約4000×ｇで
遠心分離にかけた。上澄みを抽出して、0.45ミクロンの
フィルターに通した。組織ホモジネートおよび肺ホモジ
ネートを混合させ、この混合材料を使用してきまざまな
組織培養細胞系を感染させた。
−脾−肝−腎結合組織を個々に均質化した。10％の組織
ホモジネートを用いた。個々のホモジネートを１ml当た
り約 100μgでゲンタマイシンを含む最小必須培養液
（ＭＥＭ）と混合した。両試料を約25分間約4000×ｇで
遠心分離にかけた。上澄みを抽出して、0.45ミクロンの
フィルターに通した。組織ホモジネートおよび肺ホモジ
ネートを混合させ、この混合材料を使用してきまざまな
組織培養細胞系を感染させた。
【００３３】１．in vitro試験。 75 cm2プラスチック
ボトルを使用して２つの実験を行なった。試験番号１で
は、混合材料を以下に記載した細胞系各々の完全細胞シ
ーツを含むボトル２本に接種した。さらに、各細胞系を
含む１ボトルに約 2.5mgのトリプシンを添加した。残り
の条件はすべて、細胞系を含む各ボトルに関して同一で
あった。血清は、培地に添加しなかった。接種材料は 1
mlだった。すべてのボトルを約34℃で７日間保管した。
結果は、７日目の最後に記録した。凍結し解凍した後、
試料を同細胞系における第２の継代用に取り出す。残り
の材料は、凍結し約 -60℃で保管した。
ボトルを使用して２つの実験を行なった。試験番号１で
は、混合材料を以下に記載した細胞系各々の完全細胞シ
ーツを含むボトル２本に接種した。さらに、各細胞系を
含む１ボトルに約 2.5mgのトリプシンを添加した。残り
の条件はすべて、細胞系を含む各ボトルに関して同一で
あった。血清は、培地に添加しなかった。接種材料は 1
mlだった。すべてのボトルを約34℃で７日間保管した。
結果は、７日目の最後に記録した。凍結し解凍した後、
試料を同細胞系における第２の継代用に取り出す。残り
の材料は、凍結し約 -60℃で保管した。
【００３４】試験番号２においては、混合材料を、試験
番号１で使用したものと同様の細胞を含む１ボトルに接
種した。ただし、細胞シーツは、接種時には 20-40％し
か融合していなかった。培地は約10％のウシ胎児血清を
含んでいた。さらに、接種材料は 1mlであり、培養を約
７日間約34℃で培養した。試験番号１および試験番号２
の結果を以下にまとめた。 使用細胞系 試験番号１ 試験番号２ ウシ鼻甲介（BT） − − ネコ腎臓（CRFK） − − サル（Vero）腎臓 − − サル（Vero）肺 − − イヌ腎臓（MDCK） − − ブタ（PK2a）腎臓 − − ミンク肺 − − ケナガイタチ肺 − − ウシ肺 − − 水牛肺 − − ウシ腎臓（MDBK） − − ブタ精巣（ST） − − サル腎臓（MA-104） − ＋ ヒト直腸腫瘍（HRT-18） − NT ヒト肺 NT − ＋＝ CPE効果 −＝ CPE効果なし NT＝未試験
番号１で使用したものと同様の細胞を含む１ボトルに接
種した。ただし、細胞シーツは、接種時には 20-40％し
か融合していなかった。培地は約10％のウシ胎児血清を
含んでいた。さらに、接種材料は 1mlであり、培養を約
７日間約34℃で培養した。試験番号１および試験番号２
の結果を以下にまとめた。 使用細胞系 試験番号１ 試験番号２ ウシ鼻甲介（BT） − − ネコ腎臓（CRFK） − − サル（Vero）腎臓 − − サル（Vero）肺 − − イヌ腎臓（MDCK） − − ブタ（PK2a）腎臓 − − ミンク肺 − − ケナガイタチ肺 − − ウシ肺 − − 水牛肺 − − ウシ腎臓（MDBK） − − ブタ精巣（ST） − − サル腎臓（MA-104） − ＋ ヒト直腸腫瘍（HRT-18） − NT ヒト肺 NT − ＋＝ CPE効果 −＝ CPE効果なし NT＝未試験
【００３５】細胞変性効果は、評価した細胞系を問わず
試験番号１においては認められなかった。ただし、試験
番号２においては、MA-104細胞の小凝集が肥大し、ボト
ルの縁周辺の単層で「ウィーク・ホール」を形成し始め
た。液体をボトルから分離し、MA−104細胞（これも 20
-40％の細胞シーツである）を含む新たなボトルに継代
した後、もう一度継代した。細胞変性効果は、継代を重
ねる度に大きくなった。上述の方法を、完全細胞シーツ
を使用して、MA-104細胞系に対して繰り返した。その後
の試験は、ウイルス剤は、37℃でも繁殖することを示し
た。血清の存在は、ウイルス剤の初回単離に役立てられ
る。MA-104細胞系におけるウイルス剤のその後の継代に
よって、血清を含まないＣＰＥを生じさせることができ
る。さらに、より際立ったＰＥ効果をMA-104細胞系用の
増殖培地に血清を用いることで認めることができる。
試験番号１においては認められなかった。ただし、試験
番号２においては、MA-104細胞の小凝集が肥大し、ボト
ルの縁周辺の単層で「ウィーク・ホール」を形成し始め
た。液体をボトルから分離し、MA−104細胞（これも 20
-40％の細胞シーツである）を含む新たなボトルに継代
した後、もう一度継代した。細胞変性効果は、継代を重
ねる度に大きくなった。上述の方法を、完全細胞シーツ
を使用して、MA-104細胞系に対して繰り返した。その後
の試験は、ウイルス剤は、37℃でも繁殖することを示し
た。血清の存在は、ウイルス剤の初回単離に役立てられ
る。MA-104細胞系におけるウイルス剤のその後の継代に
よって、血清を含まないＣＰＥを生じさせることができ
る。さらに、より際立ったＰＥ効果をMA-104細胞系用の
増殖培地に血清を用いることで認めることができる。
【００３６】ウイルス剤をMA-104細胞系で８回継代した
ところ、３日間後の５回目以降の継代では、ＣＰＥは良
好だった。得られた力価は対数で約 5-1/2であった（ 1
05． 5）。ウイスル剤は、さらにサル細胞系でも増殖す
ることができる。
ところ、３日間後の５回目以降の継代では、ＣＰＥは良
好だった。得られた力価は対数で約 5-1/2であった（ 1
05． 5）。ウイスル剤は、さらにサル細胞系でも増殖す
ることができる。
【００３７】２． in vivo試験。 別の継代収集物を使
用して日齢３日のノトバイオート仔ブタに接種した。両
仔ブタとも経鼻腔で、一方は 1mlであり、もう一方は 2
mlで暴露した。仔ブタを７日間観察し、安楽死させた。
用して日齢３日のノトバイオート仔ブタに接種した。両
仔ブタとも経鼻腔で、一方は 1mlであり、もう一方は 2
mlで暴露した。仔ブタを７日間観察し、安楽死させた。
【００３８】組織試料を病理組織学的試験用とウイルス
剤の回収用に収集した。病理組織学的報告からは、感染
仔ブタの肺病変は、ＳＩＲＳにかかったことが判明して
いる仔ブタ由来の肺組織病変と一致することが確認され
た。組織試料は前述のように処理され、ウシ胎児血清を
含むMA-104細胞系を 20-40％含む単層と 100％含む単層
上で培養した。ウイルス剤を再び回収した。
剤の回収用に収集した。病理組織学的報告からは、感染
仔ブタの肺病変は、ＳＩＲＳにかかったことが判明して
いる仔ブタ由来の肺組織病変と一致することが確認され
た。組織試料は前述のように処理され、ウシ胎児血清を
含むMA-104細胞系を 20-40％含む単層と 100％含む単層
上で培養した。ウイルス剤を再び回収した。
【００３９】別の継代収集物を雌ブタに接種し、疾患の
繁殖効果を複製し確認することができることが証明する
ために使用した。経産雌ブタ２例に、妊娠93日目に経鼻
腔で接種を行なった。この雌ブタは、それぞれ妊娠 112
日目および 114日に50％死産で同腹子の仔ブタを出産し
た（死産／生産比は、8/13と6/14）。死産仔ブタ７例
は、一部ミイラ化しており、生産仔ブタは弱く、強健に
育成することはできなかった。このウイルス剤を死産仔
ブタの組織から回収した。
繁殖効果を複製し確認することができることが証明する
ために使用した。経産雌ブタ２例に、妊娠93日目に経鼻
腔で接種を行なった。この雌ブタは、それぞれ妊娠 112
日目および 114日に50％死産で同腹子の仔ブタを出産し
た（死産／生産比は、8/13と6/14）。死産仔ブタ７例
は、一部ミイラ化しており、生産仔ブタは弱く、強健に
育成することはできなかった。このウイルス剤を死産仔
ブタの組織から回収した。
【００４０】ウイルス剤をＳＩＲＳとわかっている３群
から回収した。ATCC VR-2332剤に対する抗体力価は、こ
れらの同じ群で確認された。
から回収した。ATCC VR-2332剤に対する抗体力価は、こ
れらの同じ群で確認された。
【００４１】臨床的徴候に違い、すなわち、ヨーロッパ
産のブタにおける耳、尾、乳房のの皮膚チアノーゼが若
干あるが、北アメリカにおける疾患およびヨーロッパに
おける疾患は、同一のウイルスすなわちATCC寄託の VR-
2332によって例証されるように選好性非血球凝集外皮Ｒ
ＮＡウイルスによって引き起こされるというのが、一般
の意見である。
産のブタにおける耳、尾、乳房のの皮膚チアノーゼが若
干あるが、北アメリカにおける疾患およびヨーロッパに
おける疾患は、同一のウイルスすなわちATCC寄託の VR-
2332によって例証されるように選好性非血球凝集外皮Ｒ
ＮＡウイルスによって引き起こされるというのが、一般
の意見である。
【００４２】例１Ａ−その他の病原菌特性 Ａ．材料および方法 １．細胞
。 ネコ科Crandellの腎臓（CRFK）およびサル
腎臓（MA-104）の細胞を適切な細胞培養フラスコ内で37
℃で育成した。CRFK細胞およびMA-104細胞は、 （JRH B
iosciences，Lenexa，KSより人手可能な）10％のγ線照
射ウシ胎児血清（ FBS）と１％のペニシリン−ストレプ
トマイシンと 2.5μg/mlのアムホテリシンＢとを補足し
た（Gibco Laboratories，Grand lsland，NYより人手可
能な）イーグル最小必須培地（ MEM）で増殖させた。MA
-104細胞を10％の FBSと50μg/mlのゲンタマイシンで補
足同様の培地で増殖させた。 FBSおよび細胞は、先述の
Mayerら、Vet. Microbiol., 16, 303-314 （1988）、Sm
ithiesら、Proc. Annu.Meet. U.S. Animal Health Asso
c., 73, 539-550 （1969） および Vickersら、J. Vet.
Diagm Invest.，2，300-302（1990）による方法で、ウ
シウイルス性下痢性ウイルスがないことが確認された。
腎臓（MA-104）の細胞を適切な細胞培養フラスコ内で37
℃で育成した。CRFK細胞およびMA-104細胞は、 （JRH B
iosciences，Lenexa，KSより人手可能な）10％のγ線照
射ウシ胎児血清（ FBS）と１％のペニシリン−ストレプ
トマイシンと 2.5μg/mlのアムホテリシンＢとを補足し
た（Gibco Laboratories，Grand lsland，NYより人手可
能な）イーグル最小必須培地（ MEM）で増殖させた。MA
-104細胞を10％の FBSと50μg/mlのゲンタマイシンで補
足同様の培地で増殖させた。 FBSおよび細胞は、先述の
Mayerら、Vet. Microbiol., 16, 303-314 （1988）、Sm
ithiesら、Proc. Annu.Meet. U.S. Animal Health Asso
c., 73, 539-550 （1969） および Vickersら、J. Vet.
Diagm Invest.，2，300-302（1990）による方法で、ウ
シウイルス性下痢性ウイルスがないことが確認された。
【００４３】２． VR-2332単離体ソース（SIRSウイル
ス）。 本例のＳＩＲＳウイルスのソースおよび単離体
は、以下記載の通りである。この試験に使用したウイル
スは、 105乃至 106TCID50/ml の力価のMA-104細胞を５
乃至７回継代したものに乗せた。
ス）。 本例のＳＩＲＳウイルスのソースおよび単離体
は、以下記載の通りである。この試験に使用したウイル
スは、 105乃至 106TCID50/ml の力価のMA-104細胞を５
乃至７回継代したものに乗せた。
【００４４】ノトバイオートブタ。閉鎖子宮切開で得た
ノトバイオートブタを、先述のMiniatas O.P.ら、Can.
J. Comp. Med., 42，428-437（1978）のようにフレキン
ブルフィルムアイソレータで覆わせたステンレス鋼タブ
に保管した。このアイソレータは、周囲温度30℃で保管
され、ブタに１日３回商用ミルク代用品を推奨量摂取さ
せた。実験接種前および剖検時に、糞スワブを収集し、
好気雰囲気および嫌気雰囲気中で、ヒツジ血液寒天、te
rgital-seven寒天、ブリリアントグリーン寒天上に接種
した。剖検時に収集した糞も、上述のRichieら、Arch.
Gesante. Virus-Forscheに述べられたように、陰性造影
電子顕微鏡検査によって、ウイルスに対する試験を行な
った。
ノトバイオートブタを、先述のMiniatas O.P.ら、Can.
J. Comp. Med., 42，428-437（1978）のようにフレキン
ブルフィルムアイソレータで覆わせたステンレス鋼タブ
に保管した。このアイソレータは、周囲温度30℃で保管
され、ブタに１日３回商用ミルク代用品を推奨量摂取さ
せた。実験接種前および剖検時に、糞スワブを収集し、
好気雰囲気および嫌気雰囲気中で、ヒツジ血液寒天、te
rgital-seven寒天、ブリリアントグリーン寒天上に接種
した。剖検時に収集した糞も、上述のRichieら、Arch.
Gesante. Virus-Forscheに述べられたように、陰性造影
電子顕微鏡検査によって、ウイルスに対する試験を行な
った。
【００４５】接種材料ソース。 West Central Mnndesot
aの分娩から仕上げまでの 160頭の雌ブタの１群が典型
的なＭＳＤ症候を有するＭＳＤを発症した。生存雌ブ
タ、生存新生仔ブタおよび死産ブタ胎児をMinnesota Ve
terinary Diagnostic LAboratoryに提供し、全身培検、
組織病理学的調査および規定の微生物調査を含む試験を
行なった。接種材料を臨床的疾患新生仔ブタ由来の複数
の組織を用いて実験するために調整した。さらに詳しく
述べると、感染した群れから動物間で流行中に日齢７乃
至10日の生存仔ブタおよび死亡仔ブタを各２例ずつ剖検
し、試料を診断試験用に収集した。生存仔ブタは、剖検
前に安楽死用液を静注し安楽死させた。各ブタからプー
ルした脳、肺および扁桃から成る10％ホモジネート（MN
89-35477）を、 100IUペニシリンと 100μg/mlストレプ
トマイシンと 5μg/mlアムホテリシンBとを含むハンク
スの平衡塩類溶液（HBSS）を使用して調整した。
aの分娩から仕上げまでの 160頭の雌ブタの１群が典型
的なＭＳＤ症候を有するＭＳＤを発症した。生存雌ブ
タ、生存新生仔ブタおよび死産ブタ胎児をMinnesota Ve
terinary Diagnostic LAboratoryに提供し、全身培検、
組織病理学的調査および規定の微生物調査を含む試験を
行なった。接種材料を臨床的疾患新生仔ブタ由来の複数
の組織を用いて実験するために調整した。さらに詳しく
述べると、感染した群れから動物間で流行中に日齢７乃
至10日の生存仔ブタおよび死亡仔ブタを各２例ずつ剖検
し、試料を診断試験用に収集した。生存仔ブタは、剖検
前に安楽死用液を静注し安楽死させた。各ブタからプー
ルした脳、肺および扁桃から成る10％ホモジネート（MN
89-35477）を、 100IUペニシリンと 100μg/mlストレプ
トマイシンと 5μg/mlアムホテリシンBとを含むハンク
スの平衡塩類溶液（HBSS）を使用して調整した。
【００４６】実験的媒介。 一連のノトバイオートブタ1
4例に、日齢３日目にプールした組織ホモジネートで抗
原刺激を行なった。各仔ブタは、経鼻腔で、ブタの外鼻
孔前に置いたNebulizer ガラスに取り付けたゴムバルブ
を使用して、抗原刺激を受けた。最初、ノトバイオート
仔ブタ２例に濾過していない接種材料をそれぞれ 0.5ml
接種し、疾患の臨床的徴候を監視し、暴露後７日後に感
電（PE）させて安楽死させた。前述のノトバイオート仔
ブタからプールした肺の10％ホモジネート（MNSD-1）
を、１例に 0.5mlの未濾過ホモジネートを投与し、別の
１例に0.45μm濾液を投与し、残り１例には0.22 μmの
濾液を投与したノトバイオート仔ブタ３例各々を0.5ml
のホモジネートで暴露して、盲目的継代を行なった。仔
ブタは、PEによって８日後安楽死させ、組織を組織学的
試験用、その後のノトバイオートブタ継代用およびウイ
ルス単離用に収集した。
4例に、日齢３日目にプールした組織ホモジネートで抗
原刺激を行なった。各仔ブタは、経鼻腔で、ブタの外鼻
孔前に置いたNebulizer ガラスに取り付けたゴムバルブ
を使用して、抗原刺激を受けた。最初、ノトバイオート
仔ブタ２例に濾過していない接種材料をそれぞれ 0.5ml
接種し、疾患の臨床的徴候を監視し、暴露後７日後に感
電（PE）させて安楽死させた。前述のノトバイオート仔
ブタからプールした肺の10％ホモジネート（MNSD-1）
を、１例に 0.5mlの未濾過ホモジネートを投与し、別の
１例に0.45μm濾液を投与し、残り１例には0.22 μmの
濾液を投与したノトバイオート仔ブタ３例各々を0.5ml
のホモジネートで暴露して、盲目的継代を行なった。仔
ブタは、PEによって８日後安楽死させ、組織を組織学的
試験用、その後のノトバイオートブタ継代用およびウイ
ルス単離用に収集した。
【００４７】MNSD-1濾液0.45μm を接種した仔ブタの肺
（ MNSD9076-L） と脳、肝臓および腎臓（ MNSD90 76-
P）の複合材料とから成る25％の懸濁液を、カナマイシ
ン、ストレプトマイシン、バンコマイシンをそれぞれ
0.5 mg/ml含むリン酸緩衝塩類溶液を使用して調整し
た。ノトバイオート仔ブタ６例に肺ホモジネート MNSD9
0 76-Lを、４例に0.45μmlの濾液を、２例に 0.1μmlの
濾液を投与した。未感染対照ノトバイオート仔ブタ３例
については、１例にHBSSに含有の未感染コブタ組織ホモ
ジネート0.45 μmを接種し、残り２例にはHBSSのみを接
種した。
（ MNSD9076-L） と脳、肝臓および腎臓（ MNSD90 76-
P）の複合材料とから成る25％の懸濁液を、カナマイシ
ン、ストレプトマイシン、バンコマイシンをそれぞれ
0.5 mg/ml含むリン酸緩衝塩類溶液を使用して調整し
た。ノトバイオート仔ブタ６例に肺ホモジネート MNSD9
0 76-Lを、４例に0.45μmlの濾液を、２例に 0.1μmlの
濾液を投与した。未感染対照ノトバイオート仔ブタ３例
については、１例にHBSSに含有の未感染コブタ組織ホモ
ジネート0.45 μmを接種し、残り２例にはHBSSのみを接
種した。
【００４８】ウイルス単離。 組織ホモジネート（MNSD
90 76-Lおよび MNSD90 76-P）を20分間 4℃で1500 gで
遠心分離した。上澄みを10μg/mlのゲンタマイシンを含
む最小必須培地（ＭＥＭ）で稀釈し、Vortexミキサーを
使用して完全に混合し、30分間4℃で4500gで再び遠心分
離にかけた。上澄みを収集し0.45μmフィルターで濾過
した。肺ホモジネートおよび組織プールホモジネートか
ら得た濾液を混合し、連続的継代細胞系MA-104に接種し
た。ウイルス単離を10％ウシ胎児血清（FBS）含有の50m
lＭＥＭ（pH7.5）を含むMA-104細胞の20-40％密集単層
を伴う 75cm2フラスコで行なった。細胞培養は、7日間3
4℃で保持した。細胞変性効果（ＣＰＥ）が7日以内に観
察されない場合は、培養を凍結し、融解し、MA-104細胞
に接種し、上述のように培養した。
90 76-Lおよび MNSD90 76-P）を20分間 4℃で1500 gで
遠心分離した。上澄みを10μg/mlのゲンタマイシンを含
む最小必須培地（ＭＥＭ）で稀釈し、Vortexミキサーを
使用して完全に混合し、30分間4℃で4500gで再び遠心分
離にかけた。上澄みを収集し0.45μmフィルターで濾過
した。肺ホモジネートおよび組織プールホモジネートか
ら得た濾液を混合し、連続的継代細胞系MA-104に接種し
た。ウイルス単離を10％ウシ胎児血清（FBS）含有の50m
lＭＥＭ（pH7.5）を含むMA-104細胞の20-40％密集単層
を伴う 75cm2フラスコで行なった。細胞培養は、7日間3
4℃で保持した。細胞変性効果（ＣＰＥ）が7日以内に観
察されない場合は、培養を凍結し、融解し、MA-104細胞
に接種し、上述のように培養した。
【００４９】ウイルス滴定。 ウイルス滴定を96ウェル
型平底マイクロタイタ板で行なった。ウイルスの10回連
続稀釈液を2％FBSを含むＭＥＭで調整した。3日後、細
胞育成培地をマイクロタイタ板から排除し、200μlのウ
イルス稀釈液を５つのウェル各々に入れて、プレートを
5％C02雰囲気中37℃で培養した。3日後、ＣＰＥがない
ウェル中の培地を２％ＦＢＳ（pH7.5）で補足したＭＥ
Ｍと取換えて、最終判定を培養5日目に行なった。力価
は、ReedらのAm. J. Hyg., 27, 493-497（1938）の方法
によって算出された。
型平底マイクロタイタ板で行なった。ウイルスの10回連
続稀釈液を2％FBSを含むＭＥＭで調整した。3日後、細
胞育成培地をマイクロタイタ板から排除し、200μlのウ
イルス稀釈液を５つのウェル各々に入れて、プレートを
5％C02雰囲気中37℃で培養した。3日後、ＣＰＥがない
ウェル中の培地を２％ＦＢＳ（pH7.5）で補足したＭＥ
Ｍと取換えて、最終判定を培養5日目に行なった。力価
は、ReedらのAm. J. Hyg., 27, 493-497（1938）の方法
によって算出された。
【００５０】３．その他のウイルス。 Department of
Microbiology, University of South Dakota School of
Medicine, Vermillion, SDのRoger Koment博士から得
た弱毒化ポリオウイルスをMA-104細胞上で 108 TCID50/
mlの力価まで増殖し、National Veteronary Services L
aboratory, Ames, IAより得られた仮性狂犬病ウイルス
のショープ菌株をCRFK細胞上で成長させて、力価105−7
TCID50mlになるまで育成した。これらのウイルスを、試
験においてＲＮＡおよびＤＮＡのウイルス対照として使
用し、ＳＩＲＳウイルスのVR2332分離体の核酸型を決定
した。
Microbiology, University of South Dakota School of
Medicine, Vermillion, SDのRoger Koment博士から得
た弱毒化ポリオウイルスをMA-104細胞上で 108 TCID50/
mlの力価まで増殖し、National Veteronary Services L
aboratory, Ames, IAより得られた仮性狂犬病ウイルス
のショープ菌株をCRFK細胞上で成長させて、力価105−7
TCID50mlになるまで育成した。これらのウイルスを、試
験においてＲＮＡおよびＤＮＡのウイルス対照として使
用し、ＳＩＲＳウイルスのVR2332分離体の核酸型を決定
した。
【００５１】４． VR−2332単離体に対する抗血清の調
整。 5回目の継代のSIRSウイルスの VR 2332単離体
（力価106 TCID50/ml）を0.25％ホルマリンで不活性化
し、フロインドの不完全アジュバントで１対１に混合
し、ウサギにこの懸濁液2mlを２週間間隔て６週間皮下
注射した。最後の注入２週間後に調整した抗血清は、１
対512の中和力価を有した。
整。 5回目の継代のSIRSウイルスの VR 2332単離体
（力価106 TCID50/ml）を0.25％ホルマリンで不活性化
し、フロインドの不完全アジュバントで１対１に混合
し、ウサギにこの懸濁液2mlを２週間間隔て６週間皮下
注射した。最後の注入２週間後に調整した抗血清は、１
対512の中和力価を有した。
【００５２】５．ウイルス中和化試験（ＶＮＴ）。 MA-
104細胞をＶＮＴ用の平底の96ウェル型マイクロタイタ
板に接種した。血清（100μl）それぞれの２回連続稀釈
液をＭＥＭ稀釈液で調整し、100-300 TCID50/100μlを
含む同容量（100μl）単離体 VR-2332と混合した。各混
合液を37℃で１時間培養し、200μlの血清ウイルス混合
物それぞれを３重ウェルに添加する。マイクロタイタ板
をさらに３日間37℃で培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）
について光学的顕微鏡で調査し、終点力価は、ＣＰＥを
中和化した最高の血清稀釈液の逆数として表わされた。
以下のポリクローナル抗血清は、別段の記載がない場
合、 VR-2332単離体に関して記載されたように調整し、
ＶＮＴに使用した。換言すれば、伝染性胃腸炎のミラー
株、ブタロタウイルスセロタイプ４（Gottfried）、ブ
タロタウイルスセロタイプ５（ＯＳＵ）、ブタレオウイ
ルスセロタイプ１、National VeterinaryServices Labo
ratory, Ames. IAより人手可能なブタエンテロウイルス
セロタイプ１乃至８、アメリカン・タイプ・カルチャー
Rockville，MDより人手可能なブタパルボウイルスに対
するモノクロナール抗体、Department of clinical and
Population Sciences，University of Minnesota St．
Paul MNのW. Christtanson博士より人手可能な脳心筋
炎ウイルス、 National Veterinary Services Laborato
ry，Ames IAより入手可能な仮性狂犬病ウイルス、東部
脳炎ウイルス、西部脳炎ウイルスおよびベネズエラ脳炎
ウイルス、Nayer らの Vet．Microbiol., 16,303-314
（1988）に記載のBVDVに対するD89モノクロナール抗
体、National Veterinary Services Laboratory, Ame
s., IAより入手可能なウマ動脈炎ウイルス、風疹ならび
にDepartment of Microbiology，University of South
Dakota Schoolof Medicine Vermillion, SDのW. Cafrun
y博士より入手可能な乳酸脱水酵素である。
104細胞をＶＮＴ用の平底の96ウェル型マイクロタイタ
板に接種した。血清（100μl）それぞれの２回連続稀釈
液をＭＥＭ稀釈液で調整し、100-300 TCID50/100μlを
含む同容量（100μl）単離体 VR-2332と混合した。各混
合液を37℃で１時間培養し、200μlの血清ウイルス混合
物それぞれを３重ウェルに添加する。マイクロタイタ板
をさらに３日間37℃で培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）
について光学的顕微鏡で調査し、終点力価は、ＣＰＥを
中和化した最高の血清稀釈液の逆数として表わされた。
以下のポリクローナル抗血清は、別段の記載がない場
合、 VR-2332単離体に関して記載されたように調整し、
ＶＮＴに使用した。換言すれば、伝染性胃腸炎のミラー
株、ブタロタウイルスセロタイプ４（Gottfried）、ブ
タロタウイルスセロタイプ５（ＯＳＵ）、ブタレオウイ
ルスセロタイプ１、National VeterinaryServices Labo
ratory, Ames. IAより人手可能なブタエンテロウイルス
セロタイプ１乃至８、アメリカン・タイプ・カルチャー
Rockville，MDより人手可能なブタパルボウイルスに対
するモノクロナール抗体、Department of clinical and
Population Sciences，University of Minnesota St．
Paul MNのW. Christtanson博士より人手可能な脳心筋
炎ウイルス、 National Veterinary Services Laborato
ry，Ames IAより入手可能な仮性狂犬病ウイルス、東部
脳炎ウイルス、西部脳炎ウイルスおよびベネズエラ脳炎
ウイルス、Nayer らの Vet．Microbiol., 16,303-314
（1988）に記載のBVDVに対するD89モノクロナール抗
体、National Veterinary Services Laboratory, Ame
s., IAより入手可能なウマ動脈炎ウイルス、風疹ならび
にDepartment of Microbiology，University of South
Dakota Schoolof Medicine Vermillion, SDのW. Cafrun
y博士より入手可能な乳酸脱水酵素である。
【００５３】６．直接電子顕微鏡法（ＤＥＭ）。 セシ
ウムクロライド勾配画分を、BenfieldらのJ. Clin. Mic
roblol., 16，186-190（1982）、Horzinek, Non-arthro
pod-borne Togaviruses” （Acad. Press, London, 198
1）、RichieらのArch. Gesante. Virus-forshe. に先述
したように、ウイルス粒子に対してDEMによって試験
し、75kV電圧で電子顕微鏡（Hitachi HU12A， 日立、東
京、日本）で検査した。
ウムクロライド勾配画分を、BenfieldらのJ. Clin. Mic
roblol., 16，186-190（1982）、Horzinek, Non-arthro
pod-borne Togaviruses” （Acad. Press, London, 198
1）、RichieらのArch. Gesante. Virus-forshe. に先述
したように、ウイルス粒子に対してDEMによって試験
し、75kV電圧で電子顕微鏡（Hitachi HU12A， 日立、東
京、日本）で検査した。
【００５４】７．免疫電子顕微鏡（ＩＥＭ）。 免疫−
金標識化を、ヤギの抗ウサギIgG金コロイド粒子（5nm）
を使用して行なった。簡潔に述べれば、ウイルスを４℃
で30分間、40,000×gで濃縮した。ペレットを50μlの再
懸濁で、25μlをパラフィルム１枚の上に置いた。コロ
ジオン炭素被覆グリッドをウイルス滴に15分間浮かべ
て、25μlのウサギ抗ＳＩＲＳ血清に２分間置いた。グ
リッドを0.1％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−トリ
ス緩衝液を２回交換して各５分間洗浄し、金標識化抗ウ
サギ−IgG１滴に15分間浮かべた。各２分間ずつＢＳＡ
−トリス緩衝液で６回洗浄し、２回上流水で洗浄した
後、ネガティブ染色し、上述のようにＤＥＭに対して試
験した。
金標識化を、ヤギの抗ウサギIgG金コロイド粒子（5nm）
を使用して行なった。簡潔に述べれば、ウイルスを４℃
で30分間、40,000×gで濃縮した。ペレットを50μlの再
懸濁で、25μlをパラフィルム１枚の上に置いた。コロ
ジオン炭素被覆グリッドをウイルス滴に15分間浮かべ
て、25μlのウサギ抗ＳＩＲＳ血清に２分間置いた。グ
リッドを0.1％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−トリ
ス緩衝液を２回交換して各５分間洗浄し、金標識化抗ウ
サギ−IgG１滴に15分間浮かべた。各２分間ずつＢＳＡ
−トリス緩衝液で６回洗浄し、２回上流水で洗浄した
後、ネガティブ染色し、上述のようにＤＥＭに対して試
験した。
【００５５】８．血液凝集反応（ＨＡＴ）。 ヒツジ、
ヤギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、ヒト「Ｏ」型、カモおよびニワトリの赤血球を血液
凝集させるVR-2332単離体能力を標準的方法を使用して
測定した。 VR-2332単離体の第５乃至第７継代の２回稀
釈液をＵ底マイクロタイタ板のリン酸緩衝塩類溶液（pH
7.2-7.4）で調整した。上述の標本それぞれから洗浄赤
血球の１％懸濁液を等容量、ウイルス稀釈液に添加し
て、４℃、22℃または37℃で培養し、（ウイルス非含有
の）赤血球対照をウェルの底のボタンに沈殿した１−２
時間後に判定した。
ヤギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、ヒト「Ｏ」型、カモおよびニワトリの赤血球を血液
凝集させるVR-2332単離体能力を標準的方法を使用して
測定した。 VR-2332単離体の第５乃至第７継代の２回稀
釈液をＵ底マイクロタイタ板のリン酸緩衝塩類溶液（pH
7.2-7.4）で調整した。上述の標本それぞれから洗浄赤
血球の１％懸濁液を等容量、ウイルス稀釈液に添加し
て、４℃、22℃または37℃で培養し、（ウイルス非含有
の）赤血球対照をウェルの底のボタンに沈殿した１−２
時間後に判定した。
【００５６】９．免疫蛍光検査（ＩｍＦ）。 単離体 V
R-2332感染および非感染のMA-104細胞の間接または直接
ImF染色を、ＶＮＴで試験したポリクロナール抗体また
はモノクロナール抗体を使用して行なった。National V
eterinary Services Laboratory, Ames, IA （ A型、 H
1N1）から入手可能なブタインフルエンザおよびNationa
l Veterinary Services Laboratory, Ames, IAも使用し
た。先述のBenfieldらのJ. Clin. Microbiol. に記載さ
れているように、細胞単層のスクラップを無菌接種ルー
プＩｍＦ染色を用いた72時間PIで除去する。陽性対照ス
ライドを雌ブタ由来の回復期抗血清またはＳＩＲＳウイ
ルスのVR-2332単離体に対するモノクロナール抗体（本
文では、SDOW12またはSDOW17）の何れかで染色する。
R-2332感染および非感染のMA-104細胞の間接または直接
ImF染色を、ＶＮＴで試験したポリクロナール抗体また
はモノクロナール抗体を使用して行なった。National V
eterinary Services Laboratory, Ames, IA （ A型、 H
1N1）から入手可能なブタインフルエンザおよびNationa
l Veterinary Services Laboratory, Ames, IAも使用し
た。先述のBenfieldらのJ. Clin. Microbiol. に記載さ
れているように、細胞単層のスクラップを無菌接種ルー
プＩｍＦ染色を用いた72時間PIで除去する。陽性対照ス
ライドを雌ブタ由来の回復期抗血清またはＳＩＲＳウイ
ルスのVR-2332単離体に対するモノクロナール抗体（本
文では、SDOW12またはSDOW17）の何れかで染色する。
【００５７】１０．VR−2332の大きさ評価のための濾過
試験。 浄化−感染細胞培養上澄みを0.45μm （Shleic
her and Scnell, Keene, NH）、0.20μm （Millipore P
roducts Div., Bedford MA）および0.05μm（Millipore
Products Div., Bedford,MA）の各フィルターで濾過し
た。濾過の前後の感染力価をマイクロタイター検定およ
びCottral, Manual of Standardized Methodes for Vet
erinary Microbiology, pp.81-82（Cornell Univ. Pres
s, Ithaca, NY, 1978）で先述した方法を使用して測定
した。感染力価において、100倍の減少は有意と見なさ
れた。
試験。 浄化−感染細胞培養上澄みを0.45μm （Shleic
her and Scnell, Keene, NH）、0.20μm （Millipore P
roducts Div., Bedford MA）および0.05μm（Millipore
Products Div., Bedford,MA）の各フィルターで濾過し
た。濾過の前後の感染力価をマイクロタイター検定およ
びCottral, Manual of Standardized Methodes for Vet
erinary Microbiology, pp.81-82（Cornell Univ. Pres
s, Ithaca, NY, 1978）で先述した方法を使用して測定
した。感染力価において、100倍の減少は有意と見なさ
れた。
【００５８】１１． VR-2332単離体の勾配精製。
浄化培養上澄みから得たＳＩＲＳウイルスのVR−2332単
離体をＴＮＣ緩衝液（10mMトリス、100mMNaclおよび 2m
MCaCl、pH 7.8）中の 2mlの20、30、40、50および65％
ショ糖（wt／vol）を含む非連続ショ糖勾配を介して、2
00,000×g、４℃16時間で遠心分離（Beckman SW 41 Ti
rotor）によって濃縮した。培養上澄みも1,1,2-トリク
ロロトリフルオロエタン（Sigma Chemical Co., St Lou
is, MO）で抽出し、１時間４℃、100,00×gで超遠心分
離にかけて、ショ糖勾配に関して述べたように、セシウ
ムクロライド密度勾配（1.20g/ml）で精製した。何れか
の勾配から得た画分を上部から収集し、屈折計を使用し
て屈折率を測定し、選択画分を上述のウイルス滴定用ハ
ンクの均衡塩類溶液で稀釈した。
離体をＴＮＣ緩衝液（10mMトリス、100mMNaclおよび 2m
MCaCl、pH 7.8）中の 2mlの20、30、40、50および65％
ショ糖（wt／vol）を含む非連続ショ糖勾配を介して、2
00,000×g、４℃16時間で遠心分離（Beckman SW 41 Ti
rotor）によって濃縮した。培養上澄みも1,1,2-トリク
ロロトリフルオロエタン（Sigma Chemical Co., St Lou
is, MO）で抽出し、１時間４℃、100,00×gで超遠心分
離にかけて、ショ糖勾配に関して述べたように、セシウ
ムクロライド密度勾配（1.20g/ml）で精製した。何れか
の勾配から得た画分を上部から収集し、屈折計を使用し
て屈折率を測定し、選択画分を上述のウイルス滴定用ハ
ンクの均衡塩類溶液で稀釈した。
【００５９】１２．クロロホルムおよびフルオロカーボ
ン培養。 等量のＳＩＲＳウイルス（VR−2332）およびクロロホル
ムを周囲室温で30分間定期的に混合し、500×g、４℃で
15分間遠心分離した。同様に、等量の1,1,2-トリクロロ
トリフルオロエタンおよびＳＩＲＳウイルスを５分間渦
状撹拌し、クロロホルム処理ウイルスに関して述べたよ
うに遠心分離した。遠心分離後、各処理試料の水性相を
収集し、稀釈し、マイクロタイター検定を使用して、残
りのウイルス感染力を測定した。非処理ウイルスと比較
し、処理ウイルスの力価が 100倍減少していることは有
意であると見なされた。
ン培養。 等量のＳＩＲＳウイルス（VR−2332）およびクロロホル
ムを周囲室温で30分間定期的に混合し、500×g、４℃で
15分間遠心分離した。同様に、等量の1,1,2-トリクロロ
トリフルオロエタンおよびＳＩＲＳウイルスを５分間渦
状撹拌し、クロロホルム処理ウイルスに関して述べたよ
うに遠心分離した。遠心分離後、各処理試料の水性相を
収集し、稀釈し、マイクロタイター検定を使用して、残
りのウイルス感染力を測定した。非処理ウイルスと比較
し、処理ウイルスの力価が 100倍減少していることは有
意であると見なされた。
【００６０】１３． VR−2332単離体に対するDNAウイル
ス阻害剤の効果。 5-ブロモ-2-デオキンウリジン（BUD
R） およびマイトマイシンの配合物は、ＤＮＡウイルス
複製阻害座として知られているが、レトロウイルス科を
除き、ＲＮＡウイルスを阻害することはない（Easternb
rook, Virology, 19, 509−520）および Reichら、Pro
c. Natl. Acad. Sci., 47, 1212-1217（1961））。仮性
狂犬病およびポリオウイルスを本実験では既知のＤＮＡ
ウイルス対照およびポリオウイルス対照として使用し
た。細胞（CRFKまたはMA-104）を96ウェル型ミクロタイ
ター板に接種し、複製のウェルを仮性狂犬病ウイルス、
ポリオウイルスまたはＳＩＲＳウイルス各々の100μlの
10倍稀釈液で接種した。37℃の１時間吸収期後、未吸収
ウイルスを含む培地を取り出し、ＭＥＭ（未処理ウイル
ス対照）、40もしくは150μg/mlのBUDRで補足したＭＥ
Ｍまたは２、10もしくは20μg/mlのマイトマイシンＣを
含むＭＥＭと取換えた。マイクロタイター板をさらに４
日間37℃で培養し、ＣＰＥに対して光学的顕微鏡法で調
査をして、ウイルスカ価を上述のCottralの文献（197
8）による方法で計測した。非処理対照と比較したウイ
ルス感染力価の1000倍の減少は、有意であると見なされ
た。
ス阻害剤の効果。 5-ブロモ-2-デオキンウリジン（BUD
R） およびマイトマイシンの配合物は、ＤＮＡウイルス
複製阻害座として知られているが、レトロウイルス科を
除き、ＲＮＡウイルスを阻害することはない（Easternb
rook, Virology, 19, 509−520）および Reichら、Pro
c. Natl. Acad. Sci., 47, 1212-1217（1961））。仮性
狂犬病およびポリオウイルスを本実験では既知のＤＮＡ
ウイルス対照およびポリオウイルス対照として使用し
た。細胞（CRFKまたはMA-104）を96ウェル型ミクロタイ
ター板に接種し、複製のウェルを仮性狂犬病ウイルス、
ポリオウイルスまたはＳＩＲＳウイルス各々の100μlの
10倍稀釈液で接種した。37℃の１時間吸収期後、未吸収
ウイルスを含む培地を取り出し、ＭＥＭ（未処理ウイル
ス対照）、40もしくは150μg/mlのBUDRで補足したＭＥ
Ｍまたは２、10もしくは20μg/mlのマイトマイシンＣを
含むＭＥＭと取換えた。マイクロタイター板をさらに４
日間37℃で培養し、ＣＰＥに対して光学的顕微鏡法で調
査をして、ウイルスカ価を上述のCottralの文献（197
8）による方法で計測した。非処理対照と比較したウイ
ルス感染力価の1000倍の減少は、有意であると見なされ
た。
【００６１】１４． ＳＩＲＳウイルスの温度安定性。
ＭＥＭ中の２mlのアリコートを4度または水槽中で37
度および56℃で少なくとも５日間培養した。３つの異な
る温度で各管から得たアリコートを15、30、60および 1
20分目に収集し、12乃至120時間までは12時間間隔で収
集した。ウイルス試料をＭＥＭで10倍稀釈し、ウイルス
カ価は上述のようになった。
ＭＥＭ中の２mlのアリコートを4度または水槽中で37
度および56℃で少なくとも５日間培養した。３つの異な
る温度で各管から得たアリコートを15、30、60および 1
20分目に収集し、12乃至120時間までは12時間間隔で収
集した。ウイルス試料をＭＥＭで10倍稀釈し、ウイルス
カ価は上述のようになった。
【００６２】Ｂ．結果。１．MA-104細胞に対するVR−2332単離体の細胞変性効
果 。 ＣＰＥは小型の細胞球状凝集として発現し、この
凝集は未感染単層残物上方に上昇すると考えられた（図
１Ｂ）。球状凝集数は増加し、細胞の多くは核凝縮を起
こし、２乃至４日PI以内に単層から剥離した。５乃至６
日PIまでに、ＣＰＥは100％の単層において明らかとな
った。感染力価は、ウイルスの連続継代５度目および７
度目には、各々105乃至107TcID50/1mlと同様であった。
末接種のMA-104細胞では、ＣＰＥは観察されなかった
（図１Ａ）。蛍光は非接種MA-104細胞では観察されなか
った。図２Ｂは強烈な拡散蛍光が（ＳＩＲＳのVR-2332
単離体に対して調整した）ブタ回復期血清、ウサギ抗血
清またはモノクローナル抗体のいずれかで染色した接種
MA-104細胞の細胞質に認められることを示す。
果 。 ＣＰＥは小型の細胞球状凝集として発現し、この
凝集は未感染単層残物上方に上昇すると考えられた（図
１Ｂ）。球状凝集数は増加し、細胞の多くは核凝縮を起
こし、２乃至４日PI以内に単層から剥離した。５乃至６
日PIまでに、ＣＰＥは100％の単層において明らかとな
った。感染力価は、ウイルスの連続継代５度目および７
度目には、各々105乃至107TcID50/1mlと同様であった。
末接種のMA-104細胞では、ＣＰＥは観察されなかった
（図１Ａ）。蛍光は非接種MA-104細胞では観察されなか
った。図２Ｂは強烈な拡散蛍光が（ＳＩＲＳのVR-2332
単離体に対して調整した）ブタ回復期血清、ウサギ抗血
清またはモノクローナル抗体のいずれかで染色した接種
MA-104細胞の細胞質に認められることを示す。
【００６３】２． ＳＩＲＳウイルス（VR-2332単離体）
の感染力に対する脂質溶剤の効果。 クロロホルムによ
るウイルスの前処理は、感染力を相殺した（105から101
TCID50/1mlまで減少）。従って、フルオロカーボン処理
には有意な効果はなかった。
の感染力に対する脂質溶剤の効果。 クロロホルムによ
るウイルスの前処理は、感染力を相殺した（105から101
TCID50/1mlまで減少）。従って、フルオロカーボン処理
には有意な効果はなかった。
【００６４】３．血球凝集。 ウイルスは、培養温度と
は無関係に異なる11種から得られた赤血球を凝集させな
かった。
は無関係に異なる11種から得られた赤血球を凝集させな
かった。
【００６５】４．濾過によるＳＩＲＳウイルスの大きさ
評価。 ウイルス力価は、0.45、0.20および0.10μmフ
ィルターによる濾過後も変化しなかった。ただし、感染
力価葉、0.05μm （50nm）による継代後には、105-102T
CID50/1mlまで）1000倍減少した。
評価。 ウイルス力価は、0.45、0.20および0.10μmフ
ィルターによる濾過後も変化しなかった。ただし、感染
力価葉、0.05μm （50nm）による継代後には、105-102T
CID50/1mlまで）1000倍減少した。
【００６６】５． ＳＩＲＳウイルス複製に対するＤＮ
Ａ阻害剤の効果。 仮性狂犬病ＤＮＡウイルスだけは、
BUDRまたはマイトマイシンＣによって感染力が減少し
た。ポリオウイルス（ＲＮＡ）対照およびVR-2332単離
体の複製は、影響を受けず、ＳＩＲＳウイルスのゲノム
が恐らくＲＮＡであることが示された（表１および
２）。
Ａ阻害剤の効果。 仮性狂犬病ＤＮＡウイルスだけは、
BUDRまたはマイトマイシンＣによって感染力が減少し
た。ポリオウイルス（ＲＮＡ）対照およびVR-2332単離
体の複製は、影響を受けず、ＳＩＲＳウイルスのゲノム
が恐らくＲＮＡであることが示された（表１および
２）。
【００６７】６．ウイルス精製。 ウイルス帯はショ糖
勾配では検出されなかった。ウイルス力価のピーク（10
4TCID50/ml）は、1.18−1.23g/mlの浮遊密度を有する画
分から発見された。このピークウイルス懸濁液の感染力
価（107TCID50/ml） の1000分の１以下であった。セシ
ウムクロライド勾配によって、単一の僅かなタンパク光
帯が1.18−1.19g/mlの浮遊密度で生じた。ピークウイル
ス感染力は、1.3×106TCID50/1mlであるが、これはショ
糖勾配から得られるピーク感染力寄りも130倍高く、こ
の可視帯に一致した（図３）。
勾配では検出されなかった。ウイルス力価のピーク（10
4TCID50/ml）は、1.18−1.23g/mlの浮遊密度を有する画
分から発見された。このピークウイルス懸濁液の感染力
価（107TCID50/ml） の1000分の１以下であった。セシ
ウムクロライド勾配によって、単一の僅かなタンパク光
帯が1.18−1.19g/mlの浮遊密度で生じた。ピークウイル
ス感染力は、1.3×106TCID50/1mlであるが、これはショ
糖勾配から得られるピーク感染力寄りも130倍高く、こ
の可視帯に一致した（図３）。
【００６８】７．精製ＳＩＲＳウイルス粒子のＤＥＭ。
相似形態であるが主に球状ビリオンがCsCl画分中のＤ
ＥＭによって認められた（1.18−1.19g/ml）。ビリオン
は、直径48−80nm（平均25粒子＝62nm）であり、薄膜ま
たは外皮に囲まれた完全な電子半透明または中空（電子
密集中心）粒子から成っていた（図４Ａ）。［長さ約５
nmの短い突起を有する直径40−45nmのイソサヘドラルヌ
クレオチドカピドが観察された。］これらの粒子は、直
径25−35nmの核を含んでいた（図４Ｂ）。ウサギ高度免
疫抗血清と金標識化抗−ウサギIgGとを１次および２次
抗体として使用した場合には、ビリオンを免疫−金標識
化した（図４Ｂ）。VR−2332単離体に対するウサギ高度
免疫血清の非存在下では、ビリオンを金標識化しなかっ
た。
相似形態であるが主に球状ビリオンがCsCl画分中のＤ
ＥＭによって認められた（1.18−1.19g/ml）。ビリオン
は、直径48−80nm（平均25粒子＝62nm）であり、薄膜ま
たは外皮に囲まれた完全な電子半透明または中空（電子
密集中心）粒子から成っていた（図４Ａ）。［長さ約５
nmの短い突起を有する直径40−45nmのイソサヘドラルヌ
クレオチドカピドが観察された。］これらの粒子は、直
径25−35nmの核を含んでいた（図４Ｂ）。ウサギ高度免
疫抗血清と金標識化抗−ウサギIgGとを１次および２次
抗体として使用した場合には、ビリオンを免疫−金標識
化した（図４Ｂ）。VR−2332単離体に対するウサギ高度
免疫血清の非存在下では、ビリオンを金標識化しなかっ
た。
【００６９】８．他のウイルスから得た抗血清に対する
ＳＩＲＳウイルスの抗原関係。 既知のブタウイルスときまざまなトガウイルスは、感染
MA-104細胞中のＳＩＲＳウイルス抗原と中和化したり、
反応したりしなかった。回復期のブタ抗血清および高度
免疫ウサギ血清は、各々1：256と1：512の中和化抗体力
価を有していた。
ＳＩＲＳウイルスの抗原関係。 既知のブタウイルスときまざまなトガウイルスは、感染
MA-104細胞中のＳＩＲＳウイルス抗原と中和化したり、
反応したりしなかった。回復期のブタ抗血清および高度
免疫ウサギ血清は、各々1：256と1：512の中和化抗体力
価を有していた。
【００７０】９. ＳＩＲＳウイルスの感染力に対する温
度効果。 MA-104細胞に対するウイルス感染力は、12時
間37℃の培養後50％減少し、37℃の48時間培養および56
℃の45分間培養後完全に不活性化した（図５）。感染力
は（デー夕を示さないが）４℃の１か月培養または４か
月の-70℃培養後は変化しなかった。ＳＩＲＳウイルス
に感染しハンクスの均衡塩類溶液で均質化したノトバイ
ォートブタから回収した肺組織は、少なくとも18か月間
ブタに対する感染力を維持する。結果は、 VR−2332単
離体は選好性非血球凝集外皮ＲＮＡウイルスであり、未
知の属の非節足動物偏狭性トガウイルスに仮説的に分類
することができる。
度効果。 MA-104細胞に対するウイルス感染力は、12時
間37℃の培養後50％減少し、37℃の48時間培養および56
℃の45分間培養後完全に不活性化した（図５）。感染力
は（デー夕を示さないが）４℃の１か月培養または４か
月の-70℃培養後は変化しなかった。ＳＩＲＳウイルス
に感染しハンクスの均衡塩類溶液で均質化したノトバイ
ォートブタから回収した肺組織は、少なくとも18か月間
ブタに対する感染力を維持する。結果は、 VR−2332単
離体は選好性非血球凝集外皮ＲＮＡウイルスであり、未
知の属の非節足動物偏狭性トガウイルスに仮説的に分類
することができる。
【００７１】ＳＩＲＳウイルスのＲＮＡゲノムの存在
葉、ＤＮＡおよびあるＲＮＡウイルス系統群の複製を阻
害しその他のＲＮＡウイルスの複製を阻害しないことが
知られる5-ブロモ-2-デオキンウリジンおよびマイトマ
イシンＣの存在下で継続的に複製するこのウイルスの能
力によって確認された（Easterbrook, 上述（1962）、R
eich ら、上述（1961）。ＲＮＡウイルスとしてのＳＩ
Ｒウイルスの暫定的な著者らの分類は、このウイルスが
ImFによって検出されるウイルスの存在によって示され
る細胞の細胞質で複製する観察結果に一致する。
葉、ＤＮＡおよびあるＲＮＡウイルス系統群の複製を阻
害しその他のＲＮＡウイルスの複製を阻害しないことが
知られる5-ブロモ-2-デオキンウリジンおよびマイトマ
イシンＣの存在下で継続的に複製するこのウイルスの能
力によって確認された（Easterbrook, 上述（1962）、R
eich ら、上述（1961）。ＲＮＡウイルスとしてのＳＩ
Ｒウイルスの暫定的な著者らの分類は、このウイルスが
ImFによって検出されるウイルスの存在によって示され
る細胞の細胞質で複製する観察結果に一致する。
【００７２】ＳＩＲＳウイルスの VR-2332単離体は熱に
不安定であるが、４℃および -70℃では比較的長期間安
定である。37℃でのこのウイルスの熱不安定性は、ウイ
ルスの増殖に対しては実用的であり、このことから37℃
以下の温度での増殖によってウイルスの収率が高くなる
ことが示唆される。短期間のウイルス単離体に対する診
断試料の保存には、冷蔵で十分であり、それ以外の場合
には、試料を数ヶ月以上冷凍することができる。
不安定であるが、４℃および -70℃では比較的長期間安
定である。37℃でのこのウイルスの熱不安定性は、ウイ
ルスの増殖に対しては実用的であり、このことから37℃
以下の温度での増殖によってウイルスの収率が高くなる
ことが示唆される。短期間のウイルス単離体に対する診
断試料の保存には、冷蔵で十分であり、それ以外の場合
には、試料を数ヶ月以上冷凍することができる。
【００７３】例２
例１における実験から測定されたように、ＭＳＤ病原菌
を含む接種材料の最も純粋な形態を使用してＭＳＤ病原
菌を妊娠ブタに伝達し、病徴の複数形態を複製すること
ができる。
を含む接種材料の最も純粋な形態を使用してＭＳＤ病原
菌を妊娠ブタに伝達し、病徴の複数形態を複製すること
ができる。
【００７４】考察。 最近、（当分野においてＭＳＤの
顕著な臨床的徴候である）一過性食欲不振および早期分
娩は、ノトバイオートブタに呼吸器系疾患による病変を
生じさせる同一のＭＳＤ接種材料を接種した雌ブタ２例
中２例に生じた。また、29例中15例（52％）のブタは死
産で、残り14例は衰弱し、十分に乳飲することができな
かった。肉眼的病変または顕微鏡的病変は、死産ブタに
は観察されなかったが、微生物剤を検出する胎盤処理お
よび単離処理が現在進歩している。従って、以下の試験
はＭＳＤの複数形態が経鼻腔で雌ブタに伝達されうるか
否かと、胎児生存度の干渉は胎児ではなく母系組織の複
製から生じるのか否かを述べた実験である。
顕著な臨床的徴候である）一過性食欲不振および早期分
娩は、ノトバイオートブタに呼吸器系疾患による病変を
生じさせる同一のＭＳＤ接種材料を接種した雌ブタ２例
中２例に生じた。また、29例中15例（52％）のブタは死
産で、残り14例は衰弱し、十分に乳飲することができな
かった。肉眼的病変または顕微鏡的病変は、死産ブタに
は観察されなかったが、微生物剤を検出する胎盤処理お
よび単離処理が現在進歩している。従って、以下の試験
はＭＳＤの複数形態が経鼻腔で雌ブタに伝達されうるか
否かと、胎児生存度の干渉は胎児ではなく母系組織の複
製から生じるのか否かを述べた実験である。
【００７５】例１の実験から、どのように接種材料を処
理（フィルターの大きさ、組織培養の抽出およびプロテ
アーゼ診断またはそのいずれか一方）するかに関する情
報が提供され、接種材料（すなわちウイルス剤）に対す
るＭＳＤ因子の最も純粋な形態が提供される。ＭＳＤ因
子には若いブタに対する呼吸器形態とブタ成体の複数形
態とがあるので、症候群の後者の形態を複製し、さらに
病原菌がＭＳＤの理論上の原因であることを証明しなけ
ればならない 。
理（フィルターの大きさ、組織培養の抽出およびプロテ
アーゼ診断またはそのいずれか一方）するかに関する情
報が提供され、接種材料（すなわちウイルス剤）に対す
るＭＳＤ因子の最も純粋な形態が提供される。ＭＳＤ因
子には若いブタに対する呼吸器形態とブタ成体の複数形
態とがあるので、症候群の後者の形態を複製し、さらに
病原菌がＭＳＤの理論上の原因であることを証明しなけ
ればならない 。
【００７６】ＭＳＤ病原菌を接種したブタに流産を実験
的に誘導することは可能であるので、妊娠93日目のブタ
を実験動物として使用する。雌ブタは、生殖上の問題が
なく、ＭＳＤにかかっていない商用群から購入すれば良
い。この群の完全な免疫学的記録をコンピュータ処理す
ると、妊娠期間、同腹子の大きさ、死産児数の平均を比
較研究に利用することができる。３例の雌ブタから成る
グループそれぞれに妊娠93日目に0.20μmlの濾液（陽性
対照）、病原性であるが、例１の結果によって示される
修飾接種材料、接種材料の0.20μm の濾液（陰性対照）
または例１の実験結果より示されるように修飾した対照
接種材料の何れかを経鼻腔で接種することができる。各
グループのブタを個別隔離室に収容し、出産するまでの
間毎日調査を行なう。温度および（食欲不振や、咳、ク
シャミ、浅息呼吸、呼吸数の増加などの呼吸器系統の問
題など）臨症的徴候を毎日記録する。ブタのサンプリン
グは、血清学上分娩前後の血液試料に限定される。実際
の分娩日を記録し、死産児、ミイラ化した胎児、生産
「衰弱」ブタおよび生産「正常ブタ」を決定する。胎児
に例１に述べたように肉眼的病変および顕微鏡的病変に
ついて調べ、例３で述べるように、胎児組織を微生物学
的方法で処理する。胎児血清によってガンマグロブリン
および PPVならびにEMCVの存在について調査することも
できる（ Joeら、In Proceedings of the Mystery Swin
e Disease Comittee Meeting, 62-66（1990）、Kimら、
J. Vet. Diagn. Invest., 1, 101-4（1990））。生産し
たブタを１週間観察し、罹患率および死亡率を記録し、
ブタを安楽死させた後、胎児について述べたように、光
学顕微鏡検査および微生物学的検査用に組織を収集し
た。
的に誘導することは可能であるので、妊娠93日目のブタ
を実験動物として使用する。雌ブタは、生殖上の問題が
なく、ＭＳＤにかかっていない商用群から購入すれば良
い。この群の完全な免疫学的記録をコンピュータ処理す
ると、妊娠期間、同腹子の大きさ、死産児数の平均を比
較研究に利用することができる。３例の雌ブタから成る
グループそれぞれに妊娠93日目に0.20μmlの濾液（陽性
対照）、病原性であるが、例１の結果によって示される
修飾接種材料、接種材料の0.20μm の濾液（陰性対照）
または例１の実験結果より示されるように修飾した対照
接種材料の何れかを経鼻腔で接種することができる。各
グループのブタを個別隔離室に収容し、出産するまでの
間毎日調査を行なう。温度および（食欲不振や、咳、ク
シャミ、浅息呼吸、呼吸数の増加などの呼吸器系統の問
題など）臨症的徴候を毎日記録する。ブタのサンプリン
グは、血清学上分娩前後の血液試料に限定される。実際
の分娩日を記録し、死産児、ミイラ化した胎児、生産
「衰弱」ブタおよび生産「正常ブタ」を決定する。胎児
に例１に述べたように肉眼的病変および顕微鏡的病変に
ついて調べ、例３で述べるように、胎児組織を微生物学
的方法で処理する。胎児血清によってガンマグロブリン
および PPVならびにEMCVの存在について調査することも
できる（ Joeら、In Proceedings of the Mystery Swin
e Disease Comittee Meeting, 62-66（1990）、Kimら、
J. Vet. Diagn. Invest., 1, 101-4（1990））。生産し
たブタを１週間観察し、罹患率および死亡率を記録し、
ブタを安楽死させた後、胎児について述べたように、光
学顕微鏡検査および微生物学的検査用に組織を収集し
た。
【００７７】ＭＳＤ接種材料から成る0.2μmの濾液およ
び修飾した濾液は、ブタに対して病原性があり、食欲不
振や、時には微熱、各同腹子の多数が死産か衰弱してい
る早期分娩を誘導する。これは、接種材料がＭＳＤ因子
を含む証拠である。対照接種材料を接種した雌ブタは、
予定日近くに分娩したが、この群の利用可能な疫学的デ
ータベースから分かるように、元の群の標準範囲内の同
腹子を出産している。死産ブタの病変は認められず、生
存衰弱ブタにおいては生後１週間以内の致死率が高いこ
とがわかった。
び修飾した濾液は、ブタに対して病原性があり、食欲不
振や、時には微熱、各同腹子の多数が死産か衰弱してい
る早期分娩を誘導する。これは、接種材料がＭＳＤ因子
を含む証拠である。対照接種材料を接種した雌ブタは、
予定日近くに分娩したが、この群の利用可能な疫学的デ
ータベースから分かるように、元の群の標準範囲内の同
腹子を出産している。死産ブタの病変は認められず、生
存衰弱ブタにおいては生後１週間以内の致死率が高いこ
とがわかった。
【００７８】例 3
ＭＳＤ接種材料で接種し、接種後さまざまな時期に安楽
死させたノトバイオート仔ブタから収集した組織試料を
使用して、ＭＳＤの病原菌を単離同定し、病変の連続的
発達を測定し、ＭＳＤ因子が免疫抑制的であることを確
認する。
死させたノトバイオート仔ブタから収集した組織試料を
使用して、ＭＳＤの病原菌を単離同定し、病変の連続的
発達を測定し、ＭＳＤ因子が免疫抑制的であることを確
認する。
【００７９】凍結組織および接種細胞培養に対する免疫
蛍光検査法。 凍結組織および細胞スクラップに対する
免疫蛍光検査をBenfieldら、J. Clin. Microbiol., 16,
186-190（1982）およびBenfieldら、Am. J. Ver. Re
s.， 49, 330-36（1988）に先述したような方法で実行
する。凍結組織および細胞スクラップを PPV、EMCV（頭
字語については例４参照）およびＭＳＤ因子についてス
クリーニングを行なった。 PPVおよびEMCVに対する接合
体は、South Dakota Animal Disease Research and Dia
gnostic Laboratoryで入手できる。ノトバイオートブタ
における高度免疫血清をＭＳＤ接種材料の最も純粋な形
態から調整する。ブタ２例を経鼻腔接種し、初回接種２
週間後および４週間後にフロインドの不完全アジュバン
ト中の接種材料を皮下経由で追加抗原刺激する。血清を
最後の追加抗原刺激２週間後にこのブタから収集する。
対照血清も、対照接種材料とＭＳＤ接種材料に関して述
べた同一の免疫化プロトコルを用いてノトバイオートブ
タ２例について調整する。これらの血清を一次抗体とし
て使用し、フルオレセインイソシオチアン酸塩で接合し
たヤギまたはウサギの抗ブタ免疫グロブリンを二次抗体
として使用し、凍結組織片および細胞培養中のＭＳＤ抗
原を検出することができる。
蛍光検査法。 凍結組織および細胞スクラップに対する
免疫蛍光検査をBenfieldら、J. Clin. Microbiol., 16,
186-190（1982）およびBenfieldら、Am. J. Ver. Re
s.， 49, 330-36（1988）に先述したような方法で実行
する。凍結組織および細胞スクラップを PPV、EMCV（頭
字語については例４参照）およびＭＳＤ因子についてス
クリーニングを行なった。 PPVおよびEMCVに対する接合
体は、South Dakota Animal Disease Research and Dia
gnostic Laboratoryで入手できる。ノトバイオートブタ
における高度免疫血清をＭＳＤ接種材料の最も純粋な形
態から調整する。ブタ２例を経鼻腔接種し、初回接種２
週間後および４週間後にフロインドの不完全アジュバン
ト中の接種材料を皮下経由で追加抗原刺激する。血清を
最後の追加抗原刺激２週間後にこのブタから収集する。
対照血清も、対照接種材料とＭＳＤ接種材料に関して述
べた同一の免疫化プロトコルを用いてノトバイオートブ
タ２例について調整する。これらの血清を一次抗体とし
て使用し、フルオレセインイソシオチアン酸塩で接合し
たヤギまたはウサギの抗ブタ免疫グロブリンを二次抗体
として使用し、凍結組織片および細胞培養中のＭＳＤ抗
原を検出することができる。
【００８０】血清学的検査。 対照ブタまたは接種ブタ
から収集した血清について、 PPVおよび SIV（血球凝集
阻害）、レプトスピラ（微細凝集）、ならびにEMCV（ウ
イルス中和化）に対する抗体が存在するか否かを検査す
る（頭字語については例４参照）。以前の結果は、他の
一般の微生物学的因子に対する血清学的検査には陰性で
あったことが示されている （Collins ら、71st Meetin
g of the Conference of Research Workers in Animal
Disease，Abstract No.2（1990））。
から収集した血清について、 PPVおよび SIV（血球凝集
阻害）、レプトスピラ（微細凝集）、ならびにEMCV（ウ
イルス中和化）に対する抗体が存在するか否かを検査す
る（頭字語については例４参照）。以前の結果は、他の
一般の微生物学的因子に対する血清学的検査には陰性で
あったことが示されている （Collins ら、71st Meetin
g of the Conference of Research Workers in Animal
Disease，Abstract No.2（1990））。
【００８１】免疫学的検査。 組織および血液をＭＳＤ
接種ブタおよび対照ブタから収集し、免疫学的状態を測
定する。ブタ白血球をPescovitz ら、J. immuno1., 13
4，37-44（1985）によって示されるように、Histopaque
1077にかけて、単回不連続勾配浮遊法によって末梢血
から単離する。リンパ結節、脾臓および胸腺から得た細
胞を、生成細胞懸濁液の組織および収集物を適度にミン
スすることによって、単細胞に分解する（Hurleyら、Ca
ncer Res. 47, 3729−35（1987）） 。
接種ブタおよび対照ブタから収集し、免疫学的状態を測
定する。ブタ白血球をPescovitz ら、J. immuno1., 13
4，37-44（1985）によって示されるように、Histopaque
1077にかけて、単回不連続勾配浮遊法によって末梢血
から単離する。リンパ結節、脾臓および胸腺から得た細
胞を、生成細胞懸濁液の組織および収集物を適度にミン
スすることによって、単細胞に分解する（Hurleyら、Ca
ncer Res. 47, 3729−35（1987）） 。
【００８２】ブタ白血球表現型をアメリカン・タイプ・
カルチャーコレクションおよびJoanLunney（USDA Belts
ville，MD）経由で入手できるモノクローナルパネルを
使用して決定することができる。これらには、Ｔ細胞、
pCD2（MSA4；Hammerbergら、Ver. Immunol. Immunopath
ol., 11, 107-21（1986）、ヘルパー／クラスII MHC依
存Ｔ細胞、 pCD4（74-12-; Lunneyら 、 Ver. Immnuno
l. Immunopathol.,17, 135-144（1987））細胞傷害性−
サプレッサー／クラスＩ MHC依存Ｔ細胞、pCD8（74-2-1
1; Ｉbid）、マクロファージおよび顆粒細胞（74-22-15
A: Ｉbid）、ヒトＤＲｗと等価のブタMHC クラスII抗原
（MSA3; Hammerbergら、Vet. Immunol . Immunopathol.,
11, 107-21 （1986）ならびにＤＱｗ（ TH21A）および
その他VRMD、Pullman、WA; Davisら、Hybridoam Techon
ology in Agricalture and Veterinary Research. Rowm
an and Allanheld, 121-50（1984））などがある。ブタ
免疫グロブリンに対するイソタイプ−特異モノクローナ
ル抗体も利用可能であり（ Paulら、J. Vet. Res., 50,
471-79（1989））、末梢血、リンパ結節およびパイエ
ル板から得た白血球を間接蛍光染色するために２度に分
けて最小飽和濃度で使用することができる（Vet. Immun
ol. Immunopathol., 25, 177-93（1990））。２色検査
を実行するためには、ビオチン（Pierce kit #21333）
抗体で標識化した後、rPE-標識化アビジンで細胞を染色
すれば良い。細胞をフローサイトメトリーまたは２色解
析蛍光顕微鏡（ PTI FSCANシステム）で解析する。フロ
ーサイメトリー時の 488nmレーザー光線での相互検出ま
たは二重蛍光顕微鏡法の使用を容易に行なうことができ
る。細胞性蛍光強度および陽性細胞の百分率も測定す
る。
カルチャーコレクションおよびJoanLunney（USDA Belts
ville，MD）経由で入手できるモノクローナルパネルを
使用して決定することができる。これらには、Ｔ細胞、
pCD2（MSA4；Hammerbergら、Ver. Immunol. Immunopath
ol., 11, 107-21（1986）、ヘルパー／クラスII MHC依
存Ｔ細胞、 pCD4（74-12-; Lunneyら 、 Ver. Immnuno
l. Immunopathol.,17, 135-144（1987））細胞傷害性−
サプレッサー／クラスＩ MHC依存Ｔ細胞、pCD8（74-2-1
1; Ｉbid）、マクロファージおよび顆粒細胞（74-22-15
A: Ｉbid）、ヒトＤＲｗと等価のブタMHC クラスII抗原
（MSA3; Hammerbergら、Vet. Immunol . Immunopathol.,
11, 107-21 （1986）ならびにＤＱｗ（ TH21A）および
その他VRMD、Pullman、WA; Davisら、Hybridoam Techon
ology in Agricalture and Veterinary Research. Rowm
an and Allanheld, 121-50（1984））などがある。ブタ
免疫グロブリンに対するイソタイプ−特異モノクローナ
ル抗体も利用可能であり（ Paulら、J. Vet. Res., 50,
471-79（1989））、末梢血、リンパ結節およびパイエ
ル板から得た白血球を間接蛍光染色するために２度に分
けて最小飽和濃度で使用することができる（Vet. Immun
ol. Immunopathol., 25, 177-93（1990））。２色検査
を実行するためには、ビオチン（Pierce kit #21333）
抗体で標識化した後、rPE-標識化アビジンで細胞を染色
すれば良い。細胞をフローサイトメトリーまたは２色解
析蛍光顕微鏡（ PTI FSCANシステム）で解析する。フロ
ーサイメトリー時の 488nmレーザー光線での相互検出ま
たは二重蛍光顕微鏡法の使用を容易に行なうことができ
る。細胞性蛍光強度および陽性細胞の百分率も測定す
る。
【００８３】コンカナバリンＡ、アメリカヤマゴボウマ
イトジェン（ PWM）および植物性血球凝集素（ PHA）を
用いるレクチン有糸分裂法などのin vitro機能検査法を
Hammerbergら、Am. J. Vet. Res., 50, 868-74（1989）
に記載のように実行する。リゾチームに対する抗原特異
in vitroＴ細胞反応を、それらの技術実行後にモデル化
することができる。Ｂ細胞増殖検査を大腸菌およびネズ
ミチフス菌 LPSまたは抗免疫グロブリンによって、Symo
nsら、Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 54, 67-77
（1977）において報告されているように行なうことが
できる。PWMを用いて誘導されるin vitro抗体生成は、H
ammerbergら、Am. J. Ver. Res., 50, 668-74 （1989）
に述べられているように達成され定量される。大腸菌 L
PSに対する48時間暴露後のＩ1-1のマクロファージ生成
をマウス胸腺細胞検査で測定することができる（Mize
l，Immunological Rev., 63, 51-72（1982））。PHA-刺
激リンパ球によるＩ1-2の生成を、Stottら、Vet. Immun
ol. Immunopathol., 13, 31-38（1986））に記載のよう
に測定することができる。イソタイプ−特異抗リゾチー
ムELISA をブタ免疫グロブリンイソタイプに対するモノ
クローナル抗体を用いて行なうことができる（Paulら、
Am. J. Vet. Res., 50,471-79（1989））。
イトジェン（ PWM）および植物性血球凝集素（ PHA）を
用いるレクチン有糸分裂法などのin vitro機能検査法を
Hammerbergら、Am. J. Vet. Res., 50, 868-74（1989）
に記載のように実行する。リゾチームに対する抗原特異
in vitroＴ細胞反応を、それらの技術実行後にモデル化
することができる。Ｂ細胞増殖検査を大腸菌およびネズ
ミチフス菌 LPSまたは抗免疫グロブリンによって、Symo
nsら、Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 54, 67-77
（1977）において報告されているように行なうことが
できる。PWMを用いて誘導されるin vitro抗体生成は、H
ammerbergら、Am. J. Ver. Res., 50, 668-74 （1989）
に述べられているように達成され定量される。大腸菌 L
PSに対する48時間暴露後のＩ1-1のマクロファージ生成
をマウス胸腺細胞検査で測定することができる（Mize
l，Immunological Rev., 63, 51-72（1982））。PHA-刺
激リンパ球によるＩ1-2の生成を、Stottら、Vet. Immun
ol. Immunopathol., 13, 31-38（1986））に記載のよう
に測定することができる。イソタイプ−特異抗リゾチー
ムELISA をブタ免疫グロブリンイソタイプに対するモノ
クローナル抗体を用いて行なうことができる（Paulら、
Am. J. Vet. Res., 50,471-79（1989））。
【００８４】in vivo抗体生成を評価するためには、Ｍ
ＳＤ感染の仔ブタ３例および対照接種材料接種３例に対
し、ヒツジ赤血球の２％懸濁液およびウシ血清アルブミ
ンの10μg/ml溶液を別々の部位に、初回接種５、７、1
0、14および24日後に注入すれば良い。初回接種24日後
にブタを安楽死させて、例１に述べたように組織病理学
用に収集し、血液を収集し、抗体検査をする。全抗体濃
度および各抗原に対する特異IgGおよびIgM反応を抗原特
異放射免疫拡散法またはElISAで測定する。抗原−特異
プラーク検査を脾細胞に対して実行し、感染ブタおよび
対照ブタのＢ細胞クローンの頻度を評価する（Kappler,
J. Immunol., 112, 1271−85 1974））。
ＳＤ感染の仔ブタ３例および対照接種材料接種３例に対
し、ヒツジ赤血球の２％懸濁液およびウシ血清アルブミ
ンの10μg/ml溶液を別々の部位に、初回接種５、７、1
0、14および24日後に注入すれば良い。初回接種24日後
にブタを安楽死させて、例１に述べたように組織病理学
用に収集し、血液を収集し、抗体検査をする。全抗体濃
度および各抗原に対する特異IgGおよびIgM反応を抗原特
異放射免疫拡散法またはElISAで測定する。抗原−特異
プラーク検査を脾細胞に対して実行し、感染ブタおよび
対照ブタのＢ細胞クローンの頻度を評価する（Kappler,
J. Immunol., 112, 1271−85 1974））。
【００８５】例 4 目的
。 本実験の目的は、ＭＳＤ単離体に対するノトバ
イオートブタの高度免疫抗血清を調整し、診断試薬とし
て使用して、ＭＳＤの抗原特性を特徴化することにあ
る。
イオートブタの高度免疫抗血清を調整し、診断試薬とし
て使用して、ＭＳＤの抗原特性を特徴化することにあ
る。
【００８６】背景。 ミネソタ大学協力のサウスダコタ
州立大学におけるノトバイオートブタの先行研究によ
り、現場症例MN-8935477より得たプール組織ホモジネー
トがノトバイオートブタの肺病変を誘導したことが示さ
れた。これらのブタ由来のプール組織ホモジネートは、
その後、日齢３日のノトバイオートブタの臨床的疾患お
よび呼吸器系統病変の特性を生じさせるために使用され
ている（Co1lins ら、71st Meeting of Research Worke
rs in American Diseases., Abstract No.2（1990））
およびCollinsら、 Minnesota Swine Conference for V
eterinaians，Abstract，245-55（1990））。肺ホモジ
ネートおよび組織ホモジネートをノトバイオートブタ
（90×75）の初回接種材料の第２継代から調整し、第２
の接種材料を生成した。第２の接種材料を接種材料およ
び抗原として、この実験の高度免疫血清を生成するため
に使用することができる。
州立大学におけるノトバイオートブタの先行研究によ
り、現場症例MN-8935477より得たプール組織ホモジネー
トがノトバイオートブタの肺病変を誘導したことが示さ
れた。これらのブタ由来のプール組織ホモジネートは、
その後、日齢３日のノトバイオートブタの臨床的疾患お
よび呼吸器系統病変の特性を生じさせるために使用され
ている（Co1lins ら、71st Meeting of Research Worke
rs in American Diseases., Abstract No.2（1990））
およびCollinsら、 Minnesota Swine Conference for V
eterinaians，Abstract，245-55（1990））。肺ホモジ
ネートおよび組織ホモジネートをノトバイオートブタ
（90×75）の初回接種材料の第２継代から調整し、第２
の接種材料を生成した。第２の接種材料を接種材料およ
び抗原として、この実験の高度免疫血清を生成するため
に使用することができる。
【００８７】目的を達成するための方法。ノトバイオートブタ
。ノトバイオートブタを先述のBene
fieldら、Am. J. Ve t. Res., 49，330-36（1988）およ
びCollinsら、Am. J. Res., 50 827-835（1989）に記載
のように誘導し維持することができる。
fieldら、Am. J. Ve t. Res., 49，330-36（1988）およ
びCollinsら、Am. J. Res., 50 827-835（1989）に記載
のように誘導し維持することができる。
【００８８】高度免疫血清接種。 高度免疫血清を上述
のようにノトバイオートブタ１例に初回接種することに
よって調整することができる。その後、ブタには1mlの
第の接種材料および1mlのフロインドの不完全アジュバ
ントを含む追加抗原を初回接種14および21日後に投与す
る（HarlowおよびLanne, 1988）。このブタは、最終接
種後14日以後に安楽死させることが望ましい。血清を回
収し、適切なアリコートに調整し、-20℃で凍結するこ
とが望ましい。
のようにノトバイオートブタ１例に初回接種することに
よって調整することができる。その後、ブタには1mlの
第の接種材料および1mlのフロインドの不完全アジュバ
ントを含む追加抗原を初回接種14および21日後に投与す
る（HarlowおよびLanne, 1988）。このブタは、最終接
種後14日以後に安楽死させることが望ましい。血清を回
収し、適切なアリコートに調整し、-20℃で凍結するこ
とが望ましい。
【００８９】血清学的検査。 大半の診断研究所で一般
に行なうように、高度免疫血清についてブタ共通の病原
体に対する抗体があるか試験をする。この血清をヘモフ
ィルス、ブルセラ、レプトスピラ（６血液型亜型）、仮
性狂犬病ウイルス（PRV）、パルボウイルス（PPV）、脳
心筋炎ウイルス（EMC）およびブタインフルエンザウイ
ルス（ＳＩ）に対する抗体について検査することができ
る。
に行なうように、高度免疫血清についてブタ共通の病原
体に対する抗体があるか試験をする。この血清をヘモフ
ィルス、ブルセラ、レプトスピラ（６血液型亜型）、仮
性狂犬病ウイルス（PRV）、パルボウイルス（PPV）、脳
心筋炎ウイルス（EMC）およびブタインフルエンザウイ
ルス（ＳＩ）に対する抗体について検査することができ
る。
【００９０】結果。 抗血清調整用のブタは、ブタ #4B
（実験番号 90x238）であった。このブタは1990年11月
1日に接種し、1990年11月29日殺処分するまで毎日臨床
的徴候について観察した。臨床的徴候は、表１にまとめ
た。残念ながら、ブタの連続変性条件は、1990年11月13
日の僅か１回の追加免疫後に安楽死させることであっ
た。初回追加免疫16日後の1990年11月29日にブタを安楽
死させた。
（実験番号 90x238）であった。このブタは1990年11月
1日に接種し、1990年11月29日殺処分するまで毎日臨床
的徴候について観察した。臨床的徴候は、表１にまとめ
た。残念ながら、ブタの連続変性条件は、1990年11月13
日の僅か１回の追加免疫後に安楽死させることであっ
た。初回追加免疫16日後の1990年11月29日にブタを安楽
死させた。
【００９１】血清学的結果は、16,384の力価を有するPP
V以外の上述の因子はすべて陰性だった（表２参照）。
このブタの滴定前の血清は処理しなかった。
V以外の上述の因子はすべて陰性だった（表２参照）。
このブタの滴定前の血清は処理しなかった。
【００９２】肺、心臓、脳、腎臓、結腸、小腸、鼻甲
介、脾臓、胃および気管をブタ剖検時に収集した。これ
らの試料を評価し、ブタ由来の肺がＭＳＤの現場症例を
伴って典型的にみられるその重篤な肺炎に関する病変を
有することがわかった。
介、脾臓、胃および気管をブタ剖検時に収集した。これ
らの試料を評価し、ブタ由来の肺がＭＳＤの現場症例を
伴って典型的にみられるその重篤な肺炎に関する病変を
有することがわかった。
【００９３】この実験結果は、病原菌は、ＭＳＤの自然
症例に典型的に見られる臨床的疾患および病変を誘導す
るので、病原菌が第２の接種材料に存在するとする初期
の試験を確証するものである。
症例に典型的に見られる臨床的疾患および病変を誘導す
るので、病原菌が第２の接種材料に存在するとする初期
の試験を確証するものである。
【００９４】
【表１】日付
接種仔ブタの観察（90x238）
10/29 外科処置
11/1 午後 5時、Nebulizerを用いて上述の接種材料
0.5mlを経鼻腔でブタに接種する。
11/2 観察せず。
11/3 当ブタは、対照のブタの2倍量のボウル入りミ
ルクを飲んだ。ブタが十分に食べているのか、
病原菌が食欲不振の原因であるかどうかは確信
できない。糞は正常。
11/4 多少動きが鈍くなったかもしれないが、機敏で
健康である。ミルクを1/2残した。糞は柔らか
く茶色である。
11/5 午前 9時：健康、機敏、ミルクの大半を飲む。
糞はムコイド様、茶色。
午後 4時：健康、機敏、ミルクの大半を
飲む。糞はムコイド様、茶色。
11/6 午前 9時：健康、機敏、ミルクの1/2を残す。
糞はムコイド様、茶色。
午後 6時：健康、機敏、ミルクの1/2を
残す。糞は下痢、茶黄色（2）。
11/7 年前 9時：健康、機敏、ミルクの大半を飲む。
糞は、薄茶色、ムコイド様（2）。
午後 3時：健康、機敏、ミルクの大半を
飲む。糞は薄茶色、ムコイド様。
11/8 午後 2時：機敏だが、対照ほどミルクを飲まな
ず、対照よりも緩慢、糞は黄色。
11/9 午前 8時：機敏、対照ほど活発にミルクを飲ま
ない。糞は糊状。
午後 5時：午前 8時と同様。
11/10 年後 6時：機敏、強健、鼻を飼料皿に活発に擦
りつける。糞は茶色で緩い。対照のようには食
べない。
11/11 午後6時：機敏、強健、飼料皿に活発に鼻をこ
すりつける。糞は糊状。対照ほどは食べない。
ミルクは飼料皿に残る。対照は午後6時30分ま
でに食べ終わる。
11/12 午前9時：機敏だが対照ほどは活発でない。5
分後に対照は食べ終わったが、このブタはボウ
ルの少なくとも2／3のミルクを残していた。鼻
を若干擦りつけた。
11/13 年後4時：ネブライザおよび試料IFA（1ml）
を用いて90x75lgおよびプールを接種する。機
敏だが：対照ほど活発ではなく、飼料皿にミル
クの1／2を残す。対照は残さずにミルクを飲ん
だ。鼻を擦ることはない。糞は糊状。
11/15 午後7時：機敏だが対照ほど活発ではなく、ま
だゆっくりと食べている。毛皮は荒い。対照と
同様に体重は増えている。
11/16- さほど変化はない。機敏だが、じっとして活動
11/24 は鈍くなっている。
午後1時（11／24） ：呼吸は速く、毛皮は荒い
ように思われる。対照のような体重増加は見ら
れない。
11/29 安楽死させる。H.I.用に血液を収集する。扁桃
を含み、組織病理学用に通常回数収集する。血
液をリンパ球有糸分裂誘発検査用に収集する。
肉眼的病変は認められない。鼻甲介移植片の培
養開始。
【００９５】
【表２】接種ブタの抗体試験
１．ブタインフルエンザ − 陰性
２．ブタ脳心筋炎 − 陰性
３．ブタAPP − 陰性
４．ブタPRV − 陰性
５．ブタPPV − 陰性
６．ブタブルセラ − 陰性
７．ブタレプトスピラ − 陰性
８．ブタEPI − 陰性
【００９６】例４A―モノクローナル抗体調整 マウス免疫化
。 ハイブリドーマ融合の８日前、BALB/C
AnNマウスにフロインドの完全アジュバント（ＣＦＡ）
に抗原を含む１：１の懸濁液をIP接種した。使用する抗
原の量は、抗原の免疫原性および毒性によって異なる。
１マウス当たり、最大0.3mlのＣＦＡを使用する。融合
１週間前は、塩類溶液に含めた抗原でマウスをIP免疫す
る。融合２日前は、マウスＩＶを塩類溶液に含めた抗原
を接種する。
AnNマウスにフロインドの完全アジュバント（ＣＦＡ）
に抗原を含む１：１の懸濁液をIP接種した。使用する抗
原の量は、抗原の免疫原性および毒性によって異なる。
１マウス当たり、最大0.3mlのＣＦＡを使用する。融合
１週間前は、塩類溶液に含めた抗原でマウスをIP免疫す
る。融合２日前は、マウスＩＶを塩類溶液に含めた抗原
を接種する。
【００９７】骨髄腫細胞。 10％のウシ胎児血清を含む
ダルベッコの調整イーグル培地上で、マウス骨髄腫細胞
（P3.NS-1-Ag4-1（ATCC TIB 18））を維持する。約107-
10 8個の細胞を、模範的なマウスの１脾臓から得られた
Ｂ細胞に融合する。ハイブリドーマ融合直前に、50mlの
遠心分離管に対数期培養から骨髄腫細胞を収集し、５分
間の200×ｇ遠心分離によってペレット細胞を収集す
る。上澄みを抽出し、細胞を２度無血清DMEMで洗浄し、
上述のように遠心分離にかける。（107-108個の細胞を
含む）ペレットを1mlの無血清DMEMで再懸濁する。
ダルベッコの調整イーグル培地上で、マウス骨髄腫細胞
（P3.NS-1-Ag4-1（ATCC TIB 18））を維持する。約107-
10 8個の細胞を、模範的なマウスの１脾臓から得られた
Ｂ細胞に融合する。ハイブリドーマ融合直前に、50mlの
遠心分離管に対数期培養から骨髄腫細胞を収集し、５分
間の200×ｇ遠心分離によってペレット細胞を収集す
る。上澄みを抽出し、細胞を２度無血清DMEMで洗浄し、
上述のように遠心分離にかける。（107-108個の細胞を
含む）ペレットを1mlの無血清DMEMで再懸濁する。
【００９８】脾臓リンパ球の単離。 頸部脱臼によって
マウスを安楽死させ、７分間70％のエタノールに浸漬す
る。無菌処理によって脾臓を摘出し、 5mlの低温無血清
DMEMを含む無菌ペトリ皿に移す。メスを使用し、長軸に
沿って脾臓を切れ目を入れ、脾臓の縦方向にそって徐々
に解体して、脾細胞を培地に放出する。ピペットを使用
して遊離細胞および培地を15mlの遠心分離管に移すが、
脾臓ケーシングは残す。管の組織デブリを５分間放置
し、単細胞懸濁液を新たな管に移す。細胞を５分間200
×gで遠心分離し、上澄みを捨て、ペレットを低温無血
清DＭＥＭで洗浄する。細胞を1mlの無血清DMEMで再懸濁
し、融合するまで氷上で保管する。
マウスを安楽死させ、７分間70％のエタノールに浸漬す
る。無菌処理によって脾臓を摘出し、 5mlの低温無血清
DMEMを含む無菌ペトリ皿に移す。メスを使用し、長軸に
沿って脾臓を切れ目を入れ、脾臓の縦方向にそって徐々
に解体して、脾細胞を培地に放出する。ピペットを使用
して遊離細胞および培地を15mlの遠心分離管に移すが、
脾臓ケーシングは残す。管の組織デブリを５分間放置
し、単細胞懸濁液を新たな管に移す。細胞を５分間200
×gで遠心分離し、上澄みを捨て、ペレットを低温無血
清DＭＥＭで洗浄する。細胞を1mlの無血清DMEMで再懸濁
し、融合するまで氷上で保管する。
【００９９】融合。 脾細胞を骨髄腫細胞を含む遠心分
離管に添加し、５分間500×g遠心分離する。上澄みをす
べて除去し、管の側面を軽く叩くことによって細胞ペレ
ットを解す。すべての試薬および細胞を37℃に維持し、
1m150％のポリエチレングリコール溶液（PEG 4000, Gi
bco, Grand lsland, NY）を滴状で穏やかに混ぜながら
１分間かけて添加する。37℃で１分間混合物を放置す
る。 1mlの中温無血清DMEMを穏やかに混ぜながら滴状に
１分間かけて添加する。最後20mlの無血清DMEMを４分間
滴状添加して、すぐに200×gで５分間細胞を遠心分離に
かける。上澄みを除去し、20％のウシ胎児血清、0.2単
位/mlのインシュリン、0.5mMのピルビン酸ナトリウム、
1mMのオキザロ酢酸、 2mMのL-グルタミン、非必須アミ
ノ酸および10％のNCTC-109リンパ球培地を含む47mlのDM
EMで細胞を再懸濁する。 1ml容量の細胞再懸濁を24-ウ
ェル型平底組織培養板２枚のウェルに添加する。骨髄腫
細胞の対照ウェルを含ませ、板を37℃および10％C02（S
DMEM）で培養する。
離管に添加し、５分間500×g遠心分離する。上澄みをす
べて除去し、管の側面を軽く叩くことによって細胞ペレ
ットを解す。すべての試薬および細胞を37℃に維持し、
1m150％のポリエチレングリコール溶液（PEG 4000, Gi
bco, Grand lsland, NY）を滴状で穏やかに混ぜながら
１分間かけて添加する。37℃で１分間混合物を放置す
る。 1mlの中温無血清DMEMを穏やかに混ぜながら滴状に
１分間かけて添加する。最後20mlの無血清DMEMを４分間
滴状添加して、すぐに200×gで５分間細胞を遠心分離に
かける。上澄みを除去し、20％のウシ胎児血清、0.2単
位/mlのインシュリン、0.5mMのピルビン酸ナトリウム、
1mMのオキザロ酢酸、 2mMのL-グルタミン、非必須アミ
ノ酸および10％のNCTC-109リンパ球培地を含む47mlのDM
EMで細胞を再懸濁する。 1ml容量の細胞再懸濁を24-ウ
ェル型平底組織培養板２枚のウェルに添加する。骨髄腫
細胞の対照ウェルを含ませ、板を37℃および10％C02（S
DMEM）で培養する。
【０１００】１晩培養した後、各ウェルから0.5mlの培
地を細胞層を動揺させずに取り出す。1×10-4Mのヒポキ
サンチン、4×10-7Mのアミノプテリンおよび1.6×10-5M
のチミジン（ＨＡＴ）を、各ウェルに添加し、37℃およ
び10％C02で培養を続ける。２−３週間週に3回、 1mlの
使用培地を1mlの新鮮なDMEM+HATを継続して取り替え
る。有意なクローン増殖が見られた場合、ELISA、間接F
Aまたはその他の適切な検定システムで特異抗体がウェ
ルに存在するか否かを検査する。
地を細胞層を動揺させずに取り出す。1×10-4Mのヒポキ
サンチン、4×10-7Mのアミノプテリンおよび1.6×10-5M
のチミジン（ＨＡＴ）を、各ウェルに添加し、37℃およ
び10％C02で培養を続ける。２−３週間週に3回、 1mlの
使用培地を1mlの新鮮なDMEM+HATを継続して取り替え
る。有意なクローン増殖が見られた場合、ELISA、間接F
Aまたはその他の適切な検定システムで特異抗体がウェ
ルに存在するか否かを検査する。
【０１０１】クローニング。 特異抗体に対して陽性試
験を行なう一次ウェルを、サブクローニングして直ちに
安定した細胞系を得て、その他のクローンによる過剰増
殖を避けることが望ましい。選択した一次ウェル細胞を
再懸濁して、トリパンブルー染色法および血球計数器で
細胞数を計測する。細胞を稀釈し、SEMEM+HT中約 2細胞
/mlの最終濃度を得る。非接種マウスから得た標準脾細
胞を 100ml培地当たり50μlの濃縮細胞を添加すること
によって支持細胞層として用いる。
験を行なう一次ウェルを、サブクローニングして直ちに
安定した細胞系を得て、その他のクローンによる過剰増
殖を避けることが望ましい。選択した一次ウェル細胞を
再懸濁して、トリパンブルー染色法および血球計数器で
細胞数を計測する。細胞を稀釈し、SEMEM+HT中約 2細胞
/mlの最終濃度を得る。非接種マウスから得た標準脾細
胞を 100ml培地当たり50μlの濃縮細胞を添加すること
によって支持細胞層として用いる。
【０１０２】250μlの細胞懸濁液を 96-ウェル型板の各
ウェルに添加し、 37℃10％C02 で培養する。 クローン
は、２−３週間後には肉眼視できることが望ましく、単
クローンを含むウェルから得た上澄みは、有意な増殖が
認められた場合に検査する。特異抗体に対する陽性試験
を行なうウェルでクローニング処理を繰り返す。選択ク
ローンを組織培養フラスコに徐々に拡大し、さらに特徴
化し凍結保存する。
ウェルに添加し、 37℃10％C02 で培養する。 クローン
は、２−３週間後には肉眼視できることが望ましく、単
クローンを含むウェルから得た上澄みは、有意な増殖が
認められた場合に検査する。特異抗体に対する陽性試験
を行なうウェルでクローニング処理を繰り返す。選択ク
ローンを組織培養フラスコに徐々に拡大し、さらに特徴
化し凍結保存する。
【０１０３】腹水生成。 ハイブリドーマ細胞接種の２
週間前、BALB/c AnNマウスに0.5mlのプリスタンのIP投
与で初回抗原刺激を行なう。ハイブリドーマ細胞を収集
し、ハンクスの均衡塩類溶液で１回洗浄する。HBSSで細
胞を再懸濁し、初回抗原刺激を受けたマウスに 104-106
の生存可能細胞を接種する。腹水生成が明らかである場
合（通常は、接種１−２週間後）、鼠径部に16 G 1-1/
2”ニードルを腹側挿入して抽出する。ニードルのハブ
を遠心分離管上で固定し、腹水を管に排出する。腹水液
を200×gで遠心分離し、0.2nmのフィルターで濾過し、
凍結保管する。
週間前、BALB/c AnNマウスに0.5mlのプリスタンのIP投
与で初回抗原刺激を行なう。ハイブリドーマ細胞を収集
し、ハンクスの均衡塩類溶液で１回洗浄する。HBSSで細
胞を再懸濁し、初回抗原刺激を受けたマウスに 104-106
の生存可能細胞を接種する。腹水生成が明らかである場
合（通常は、接種１−２週間後）、鼠径部に16 G 1-1/
2”ニードルを腹側挿入して抽出する。ニードルのハブ
を遠心分離管上で固定し、腹水を管に排出する。腹水液
を200×gで遠心分離し、0.2nmのフィルターで濾過し、
凍結保管する。
【０１０４】例４−ＳＩＲＳモノクローナル抗体 （SDOW12およびSDOW17）
ＳＩＲＳウイルスに対するモノ
クローナル抗体SDOW12（ATCC No. HB 10996）およびSD
OW17 （ATCC No. HB 10997）を上述の標準モノクローナ
ル抗体生成プロトコルを用いて調整した。マウス免疫化
に使用した抗原をBoehringer lngelheimAnimal Health
（BIAH）から得たMA-104で育成した６回継代のＳＩＲＳ
ウイルス（VR-2332）であった。各免疫化には、マウス
に力価106TCID50/100μlを含む0.3mlの勾配生成ウイル
スを接種した。
クローナル抗体SDOW12（ATCC No. HB 10996）およびSD
OW17 （ATCC No. HB 10997）を上述の標準モノクローナ
ル抗体生成プロトコルを用いて調整した。マウス免疫化
に使用した抗原をBoehringer lngelheimAnimal Health
（BIAH）から得たMA-104で育成した６回継代のＳＩＲＳ
ウイルス（VR-2332）であった。各免疫化には、マウス
に力価106TCID50/100μlを含む0.3mlの勾配生成ウイル
スを接種した。
【０１０５】間接蛍光抗体（IFA）検査を用いて、ハイ
ブリドーマ一次ウェルおよびクローンウェル中の特異抗
体を検出した。 96−ウェル型組織培養板におけるアセ
トン固定ウイルス感染および非感染の細胞単層をIFAに
用いた。これらのハイブリドーマ由来の細胞培養上澄み
および腹水液によって、ＳＩＲＳ感染細胞中に明るい頼
粒細胞質蛍光が生じた。
ブリドーマ一次ウェルおよびクローンウェル中の特異抗
体を検出した。 96−ウェル型組織培養板におけるアセ
トン固定ウイルス感染および非感染の細胞単層をIFAに
用いた。これらのハイブリドーマ由来の細胞培養上澄み
および腹水液によって、ＳＩＲＳ感染細胞中に明るい頼
粒細胞質蛍光が生じた。
【０１０６】これらのモノクローナル抗体の予備的特性
化には、免疫グロブリンイソタイピングやＳＩＲＳウイ
ルスタンパク質の放射性免疫沈殿解析などがある。モノ
クローナル抗体SDOW12およびSDOW17は、lgG1イソタイプ
である。両抗体は、15kDのウイルスタンパク質に放射性
免疫沈殿解析時に結合した。
化には、免疫グロブリンイソタイピングやＳＩＲＳウイ
ルスタンパク質の放射性免疫沈殿解析などがある。モノ
クローナル抗体SDOW12およびSDOW17は、lgG1イソタイプ
である。両抗体は、15kDのウイルスタンパク質に放射性
免疫沈殿解析時に結合した。
【０１０７】例５
３つの予備試験について説明する。ノトバイオートブタ
試験は、現場材料を使用して、ノトバイオートブタにお
ける症候群の呼吸器系成分に感染し、それを誘発するこ
とができることを示すために意図された。一般の離乳ブ
タを使用する第２の試験は、ノトバイオートブタに見ら
れる呼吸器疾患が一般のブタに再生されうるか否かを判
定するために意図された。最後に、妊娠ブタ試験は、症
候群の再生不全成分を実験的に複製できるか否かを判定
するために意図された。
試験は、現場材料を使用して、ノトバイオートブタにお
ける症候群の呼吸器系成分に感染し、それを誘発するこ
とができることを示すために意図された。一般の離乳ブ
タを使用する第２の試験は、ノトバイオートブタに見ら
れる呼吸器疾患が一般のブタに再生されうるか否かを判
定するために意図された。最後に、妊娠ブタ試験は、症
候群の再生不全成分を実験的に複製できるか否かを判定
するために意図された。
【０１０８】材料および方法 現場症例
。 例１Ａの接種材料ソースを参照。ノトバイオートブタ試験
。 子宮摘出誘導のノトバイ
オート仔ブタ６例に日齢３日目に現場接種材料（きまざ
なまな組織を含む10％ホモジネート）を接種した。濾過
（0.22 μm）および非濾過の接種材料を使用した。対照
仔ブタ２例には培地のみ接種した。臨床的徴候を毎日監
視し高度免疫血清生成に保持するブタ１例を除いて、接
種後８日目に安楽死させた。ウイルス単離および組織学
的検査に用いる組織を剖検時に血清とともに収集し、血
清をレプトスピラ、クラミジア、エぺリスロゾーン、ア
ウジェスキー病ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋
炎ウイルス、血球凝集性脳炎ウイルス、ブタインフルエ
ンザウイルス、ウシＲＳウイルス、犬ジステンパーウイ
ルス、ウシ性下痢ウイルスおよびブタコレラに対する抗
体について、血清のスクリーニングを行なった。初回接
種材料は、ノトバイオート仔ブタを連続的に３回継代す
るために初代細胞系に接種した。さらに、直接免疫電子
顕微鏡検査を行なった。
オート仔ブタ６例に日齢３日目に現場接種材料（きまざ
なまな組織を含む10％ホモジネート）を接種した。濾過
（0.22 μm）および非濾過の接種材料を使用した。対照
仔ブタ２例には培地のみ接種した。臨床的徴候を毎日監
視し高度免疫血清生成に保持するブタ１例を除いて、接
種後８日目に安楽死させた。ウイルス単離および組織学
的検査に用いる組織を剖検時に血清とともに収集し、血
清をレプトスピラ、クラミジア、エぺリスロゾーン、ア
ウジェスキー病ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋
炎ウイルス、血球凝集性脳炎ウイルス、ブタインフルエ
ンザウイルス、ウシＲＳウイルス、犬ジステンパーウイ
ルス、ウシ性下痢ウイルスおよびブタコレラに対する抗
体について、血清のスクリーニングを行なった。初回接
種材料は、ノトバイオート仔ブタを連続的に３回継代す
るために初代細胞系に接種した。さらに、直接免疫電子
顕微鏡検査を行なった。
【０１０９】通常飼育ブタ試験。 ＭＳＤ病歴のない
農場から入手した通常飼育の日齢28日の離乳ブタ３例
に、感染ノトバイオート仔ブタ由来の10％肺ホモジネー
トを経鼻腔接種した。陰性ノトバイオートブタからの肺
ホモジネートを対照用の接種材料として用いた。仔ブタ
の臨床的徴候について毎日監視し、接種８日後に剖検し
た。血清／組織を上述の方法で処理した。
農場から入手した通常飼育の日齢28日の離乳ブタ３例
に、感染ノトバイオート仔ブタ由来の10％肺ホモジネー
トを経鼻腔接種した。陰性ノトバイオートブタからの肺
ホモジネートを対照用の接種材料として用いた。仔ブタ
の臨床的徴候について毎日監視し、接種８日後に剖検し
た。血清／組織を上述の方法で処理した。
【０１１０】妊娠ブタ試験。 ＭＳＤのない農場から得
た過去の出産日がわかっている経産雌ブタ８例を本試験
に使用した。予定分娩日の３週間前、雌ブタ６例に感染
ノトバイオート肺ホモジネートを経鼻腔で接種し、２例
には陰性肺ホモジネートを接種した。毎日、臨床的徴候
を監視した。雌ブタには自然分娩させ、可能であれば、
分娩に立ち会い、生産ブタから乳飲前の血清を収集し
た。雌ブタおよび生産ブタを分娩後間もなく安楽死さ
せ、組織病理学用およびウイルス単離用に収集した。血
清または胸部液も収集した。
た過去の出産日がわかっている経産雌ブタ８例を本試験
に使用した。予定分娩日の３週間前、雌ブタ６例に感染
ノトバイオート肺ホモジネートを経鼻腔で接種し、２例
には陰性肺ホモジネートを接種した。毎日、臨床的徴候
を監視した。雌ブタには自然分娩させ、可能であれば、
分娩に立ち会い、生産ブタから乳飲前の血清を収集し
た。雌ブタおよび生産ブタを分娩後間もなく安楽死さ
せ、組織病理学用およびウイルス単離用に収集した。血
清または胸部液も収集した。
【０１１１】結果 現場試験
。 肉眼的病変は剖検時には見られなかった。
養生ブタの顕微鏡的試験から、壊死性間質性肺炎および
リンパ球単核脳炎があきらかになった。胎児には病変が
なかったが、雌ブタには軽度の脳炎があった。顕微鏡的
試験では決定的な結果は出なかった。
養生ブタの顕微鏡的試験から、壊死性間質性肺炎および
リンパ球単核脳炎があきらかになった。胎児には病変が
なかったが、雌ブタには軽度の脳炎があった。顕微鏡的
試験では決定的な結果は出なかった。
【０１１２】ノトバイオート試験。 接種後、仔ブタの
食欲は減退し、毛皮が荒くなった。対照動物は正常を維
持した。顕微鏡的病変が濾過または非濾過の材料を接種
した当該のブタに認められた。病変は現場症例に類似
し、壊死性間質性肺炎（ 6/6［仔ブタ６例中６例］）、
リンパ球形質細胞性鼻炎（4/6）、リンパ球単核脳炎（2
/6）および心筋炎（1/6）を含んでいた。病因学的因子
は、接種前後の血清学的検査によっても接種材料／組織
試験によっても同定されなかった。
食欲は減退し、毛皮が荒くなった。対照動物は正常を維
持した。顕微鏡的病変が濾過または非濾過の材料を接種
した当該のブタに認められた。病変は現場症例に類似
し、壊死性間質性肺炎（ 6/6［仔ブタ６例中６例］）、
リンパ球形質細胞性鼻炎（4/6）、リンパ球単核脳炎（2
/6）および心筋炎（1/6）を含んでいた。病因学的因子
は、接種前後の血清学的検査によっても接種材料／組織
試験によっても同定されなかった。
【０１１３】通常飼育離乳ブタ試験。 臨床的には、当
該のブタが接種２日後に鈍くなり食欲不振となった。こ
れらのブタは、温度を十分に提供していてさえも、身震
いをしているように感じられた。１例の体温は、接種６
日後に上昇していた（41.5℃）。間質性肺炎、脳炎およ
び心筋炎は、当該のブタには認められたが、対照には認
められなかった。
該のブタが接種２日後に鈍くなり食欲不振となった。こ
れらのブタは、温度を十分に提供していてさえも、身震
いをしているように感じられた。１例の体温は、接種６
日後に上昇していた（41.5℃）。間質性肺炎、脳炎およ
び心筋炎は、当該のブタには認められたが、対照には認
められなかった。
【０１１４】妊娠ブタ試験。 臨床的には、２例に限っ
ては、が接種後３または５日後、若干の体温上昇があっ
た（ 1.5℃）。ただし、食欲減退は、 4/6の雌ブタにつ
いて接種４または５日後に認められた。３例は最大７日
早く分娩し、３例は予定通り分娩した。感染雌ブタの胎
児の50％以上が死産であったが、対照は正常な同腹子を
産んだ。実験室的所見は、決定的ではなく、特異因子は
同定されず、病変は現在まで認められていない。
ては、が接種後３または５日後、若干の体温上昇があっ
た（ 1.5℃）。ただし、食欲減退は、 4/6の雌ブタにつ
いて接種４または５日後に認められた。３例は最大７日
早く分娩し、３例は予定通り分娩した。感染雌ブタの胎
児の50％以上が死産であったが、対照は正常な同腹子を
産んだ。実験室的所見は、決定的ではなく、特異因子は
同定されず、病変は現在まで認められていない。
【０１１５】原因的微生物は同定されなかったが、所見
からＭＳＤは、（１農場からの現場組織を使用して）実
験的にノトバイオートブタおよび通常飼育ブタに伝達さ
れ得ることが示唆された。ＭＳＤに対する呼吸器系形態
および生殖的形態は、再生された。当該因子は、伝染性
で0.22μmにおいて濾過性があると思われるほか、外見
上選好性である。
からＭＳＤは、（１農場からの現場組織を使用して）実
験的にノトバイオートブタおよび通常飼育ブタに伝達さ
れ得ることが示唆された。ＭＳＤに対する呼吸器系形態
および生殖的形態は、再生された。当該因子は、伝染性
で0.22μmにおいて濾過性があると思われるほか、外見
上選好性である。
【０１１６】考察
米国だけではなく世界中でＭＳＤは重要で新種の疾患で
ある。調整した環境において疾患を研究するには、ノト
バイオートブタには、ＭＳＤの臨床的徴候を経験してい
る農場から得た組織ホモジネートを用いて日齢３日目に
経鼻腔接種した。壊死性間質性肺炎を含む現場症例に類
似しているが、リンパ球形質細胞性鼻炎、リンパ球単核
脳炎または心筋炎にはあまり類似性が少ない顕微鏡的病
変は、実験動物には見られたが対照には見られなかっ
た。ノトバイオートブタから得た肺ホモジネートを使用
した場合、通常飼育の生後４週目の離乳ブタは同様の病
変を引き起こした。経産の妊娠ブタにも分娩日の３週間
前にノトバイオートの肺ホモジネートを接種した。臨床
的には、これらの雌ブタはある期間食欲不振になり、最
大７日間前までに分娩した。50％以上の胎児は死産また
は初期の段階でミイラ化しているかのいずれかだった。
これらの所見は、病減菌に関する病気を単離し、実験的
に現場組織を用いてノトバイオートブタに伝達させるこ
とができ、ノトバイオートのブタから通常飼育のブタま
たは妊娠ブタに伝達させることができる。本研究は、疾
患の呼吸器的形態および生殖的形態のモデルを提供する
ので、ＭＳＤの発生病理および診断方法をさらに調査す
ることができる。
ある。調整した環境において疾患を研究するには、ノト
バイオートブタには、ＭＳＤの臨床的徴候を経験してい
る農場から得た組織ホモジネートを用いて日齢３日目に
経鼻腔接種した。壊死性間質性肺炎を含む現場症例に類
似しているが、リンパ球形質細胞性鼻炎、リンパ球単核
脳炎または心筋炎にはあまり類似性が少ない顕微鏡的病
変は、実験動物には見られたが対照には見られなかっ
た。ノトバイオートブタから得た肺ホモジネートを使用
した場合、通常飼育の生後４週目の離乳ブタは同様の病
変を引き起こした。経産の妊娠ブタにも分娩日の３週間
前にノトバイオートの肺ホモジネートを接種した。臨床
的には、これらの雌ブタはある期間食欲不振になり、最
大７日間前までに分娩した。50％以上の胎児は死産また
は初期の段階でミイラ化しているかのいずれかだった。
これらの所見は、病減菌に関する病気を単離し、実験的
に現場組織を用いてノトバイオートブタに伝達させるこ
とができ、ノトバイオートのブタから通常飼育のブタま
たは妊娠ブタに伝達させることができる。本研究は、疾
患の呼吸器的形態および生殖的形態のモデルを提供する
ので、ＭＳＤの発生病理および診断方法をさらに調査す
ることができる。
【図１】 図１は、ＳＩＲＳウイルスVR-2332によって
観察される細胞変性効果を示す。図１Ａは、非感染未染
色細胞単層である。図１Ｂは、小型顆粒状成熟変性細胞
に感染した単層であり、該ＳＩＲＳウイルスの6回目の
継代を伴う接種3日後に観察された。
観察される細胞変性効果を示す。図１Ａは、非感染未染
色細胞単層である。図１Ｂは、小型顆粒状成熟変性細胞
に感染した単層であり、該ＳＩＲＳウイルスの6回目の
継代を伴う接種3日後に観察された。
【図２】 図２は、ＳＩＲＳウイルス感染MA−104細胞
の直接免疫蛍光染色を示す。図２Ａは、非感染細胞単層
である。図２Ｂは、強度で、しばしば接種後3日後観察
される顆粒状細胞質蛍光を有する感染細胞である。
の直接免疫蛍光染色を示す。図２Ａは、非感染細胞単層
である。図２Ｂは、強度で、しばしば接種後3日後観察
される顆粒状細胞質蛍光を有する感染細胞である。
【図３】 図３は、CsCl密度勾配にかけて精製したＳＩ
ＲＳウイルスの密度勾配プロフィルである。ウイルスの
感染力は1.18-1.19g/mlで最大になる。
ＲＳウイルスの密度勾配プロフィルである。ウイルスの
感染力は1.18-1.19g/mlで最大になる。
【図４】 図４は、密度1.18-1.19g/mlのCsCl勾配画分
に観察きれるウイルス粒子の電子顕微鏡写真を示す。図
４Ａは、これら４粒子が直径 60-65nmの球形であること
を示す。２粒子は、「中空」であり、高電子密度核であ
ることを示し（矢印）、残り２粒子は完全である。棒線
の長さは100nmである。図４Ｂは、ウサギ高度免疫血清
および金粒子で標識化した抗ウサギIgGを用いたＳＩＲ
Ｓウイルスの免疫−金電子顕微鏡検査の結果を示す。こ
のビリオン内に直径約25−30nmの核粒子が存在すること
に注目されたい。棒線の長さは、50nmである。
に観察きれるウイルス粒子の電子顕微鏡写真を示す。図
４Ａは、これら４粒子が直径 60-65nmの球形であること
を示す。２粒子は、「中空」であり、高電子密度核であ
ることを示し（矢印）、残り２粒子は完全である。棒線
の長さは100nmである。図４Ｂは、ウサギ高度免疫血清
および金粒子で標識化した抗ウサギIgGを用いたＳＩＲ
Ｓウイルスの免疫−金電子顕微鏡検査の結果を示す。こ
のビリオン内に直径約25−30nmの核粒子が存在すること
に注目されたい。棒線の長さは、50nmである。
【図５】 図５は、ＳＩＲＳウイルスの4℃（黒三
角）、37℃（黒丸）、56℃（白丸）における温度安定性
を示す。
角）、37℃（黒丸）、56℃（白丸）における温度安定性
を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１１月２２日（２００２．１１．
２２）
２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/00
37/04 37/04
Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ０７Ｋ 16/10
Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00
7/02 7/02
Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ
33/577 33/577 Ｂ
// Ａ６１Ｋ 39/23 Ａ６１Ｋ 39/23
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08
(71)出願人 502371004
サウス・ダコタ・ステイト・ユニバーシテ
ィ
アメリカ合衆国 57007 サウス・ダコタ、
ブルッキングス、アドミニストレーショ
ン・ビルディング
(71)出願人 593142743
リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシテ
ィ・オブ・ミネソタ
Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ
アメリカ合衆国55455ミネソタ州ミネアポ
リス、チャーチ・ストリート・サウス・イ
ースト100番 モリル・ホール
(72)発明者 コリンズ、ジェームズ・エドワード
アメリカ合衆国 55110 ミネソタ、ホワ
イト・ベア・レイク、リヴェリア・ドライ
ブ・サウス 2658
(72)発明者 ベンフィールド、デイヴィド・アレン
アメリカ合衆国 57006 サウス・ダコタ、
ブルッキングズ、ツウェルフス・ストリー
ト・サウス 1509
(72)発明者 クラデック、ダニー・ダブリュ
アメリカ合衆国 64505 ミズーリ、セン
ト・ジョセフ、エヴァーグリーン・テラス
19
(72)発明者 ハリス、ルイス・エル
アメリカ合衆国 64505 ミズーリ、セン
ト・ジョセフ、タングルウッド・ドライブ
402
(72)発明者 ゴーシカ、デイヴィド・イー
アメリカ合衆国 64506 ミズーリ、セン
ト・ジョセフ、エレファント・トレイル
2408
Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 DA04
4B065 AA95X BA14 BA16 CA45
4C085 AA03 AA14 BA75 CC08 CC23
DD01 EE01
4C087 AA01 BB35 BB55 BC83 DA15
NA01 ZA59 ZA66 ZB09
4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA01
DA76 EA31 FA72
Claims (37)
- 【請求項１】 ブタミステリー病の予防に使用するため
に適したワクチンにおいて、 薬学的担体と組み合わせた、ブタミステリー病感染組織
由来の不活性化または弱毒化した病原菌を有することを
特徴とするワクチン。 - 【請求項２】 前記病原菌をブタミステリー病感染のブ
タ肺組織を含む濾過ホモジネートから成る接種材料から
得ることを特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチ
ン。 - 【請求項３】 ホモジネートが、血友病、プルセラ症、
レプトスピラ症、パルボウイルス症、仮性狂犬病、脳心
筋炎、エンテロウイルス症、ブタインフルエンザおよび
その組み合わせからなるグループから選択したブタの疾
患に対する血清を用いて中和化することによって精製さ
れていることを特徴とする請求の範囲第２項記載のワク
チン。 - 【請求項４】 病原菌が、ブタ不育および呼吸器系症候
群疾患を有することが知られているブタ肺組織から単離
した病原菌で一次的または継続的に処理したin vitro培
養の鳥類、昆虫またはほ乳類の器官細胞を含む細胞培地
から得られることを特徴とする請求の範囲第１項記載の
ワクチン。 - 【請求項５】 濾過ホモジネートが1.0ミクロン以下の
大きさの生物学的粒子を含むことを特徴とする請求の範
囲第２項記載のワクチン。 - 【請求項６】 大きさが5ミクロン以下であることを特
徴とする請求の範囲第５項記載のワクチン。 - 【請求項７】 病原菌がウイルスであることを特徴とす
る請求の範囲第1項記載のワクチン。 - 【請求項８】 前記ウイルスが選好性非血球凝集外皮Ｒ
ＮＡウイルスであることを特徴とする請求の範囲第7項
記載のワクチン。 - 【請求項９】 病原菌がブタ不育および呼吸器系症候群
ウイルスATCC VR-2332とその動物発生病理的変異株とか
ら成る生物学的に純粋な培養であることを特徴とする請
求の範囲第１項記載のワクチン。 - 【請求項１０】 ウイルスが勾配または連続細胞培養に
よって精製されていることを特徴とする請求の範囲第７
項記載のワクチン。 - 【請求項１１】 ブタミステリー病感染のブタを治療す
るのに適した血清であり、ブタミステリー病感染のブタ
由来の病原菌を接種したほ乳類の半精製血清を含むこと
を特徴とする血清。 - 【請求項１２】 病原菌がブタミステリー病に感染した
ブタ肺組織の濾過ホモジネートから成る接種材料から得
られることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の血
清。 - 【請求項１３】 病原菌がブタミステリー病に感染した
肺組織から得た接種材料で処理したin vitro培養の鳥
類、昆虫またはほ乳類の器官細胞を含む細胞培地から得
られることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の血
清。 - 【請求項１４】 前記培養ほ乳類器官細胞がサル細胞系
であることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の血
清。 - 【請求項１５】 ブタのブタミステリー病の診断方法に
おいて、 ブタから肺組織試料を得て、 試料の液体ホモジネートを生成し、 液体ホモジネートを容器に添加し、ウイルス材料を固定
し、固定混合物を生成させ、 ブタミステリー病に対する非ブタほ乳類抗体血清を固定
混合物に添加し、複合体を生成させ、 標識化抗種抗体を添加し、複合体を検出することを特徴
とするブタミステリー病の診断方法。 - 【請求項１６】 非ブタほ乳類抗体がモノクローナル抗
体であることを特徴とする請求の範囲第１５項記載のブ
タミステリー病の診断方法。 - 【請求項１７】 標識化抗種抗体が放射性または呈色酵
素標識を輸送することを特徴とする請求の範囲第１５抗
記載のブタミステリー病の診断方法。 - 【請求項１８】 前記モノクローナル抗体がSDOW12また
はSDOW17であることを特徴とする請求の範囲第１６項記
載のブタミステリー病の診断方法。 - 【請求項１９】 ブタのブタミステリー病診断方法にお
いて、ブタから得たブタミステリー病病原菌組織試料を
有している疑いがある試料の液体ホモジネートを生成
し、 ブタミステリー病ウイルスに対して免疫特異である免疫
反応性抗体を液体ホモジネートに添加し、 抗体一抗原複合体の沈殿の存在を検出することを特徴と
するブタミステリー病の診断方法。 - 【請求項２０】 前記抗体がSDOW12であることを特徴と
する請求の範囲第１９項記載のブタミステリー病の診断
方法。 - 【請求項２１】 前記抗体がSDOW17であることを特徴と
する請求の範囲第１９項記載のブタミステリー病の診断
方法。 - 【請求項２２】 不活性または弱毒化したＭＳＤ病原菌
を含むＭＳＤワクチンを生成するワクチン生成方法にお
いて、 肥大肺胞問、変性細胞および肺胞間中のデブリを有する
ブタ肺組織を同定し、 薬学的に耐用し得る水溶液でブタ組織を同質化し、混合
物を生成し、 一連のフィルターで混合物を濾過し、ＭＳＤ病原菌を含
む濾過ホモジネートを生成し、濾過ホモジネート中のＭ
ＳＤ病原菌を不活性化または弱毒化してＭＳＤワクチン
を生成することを特徴とするワクチンに生成方法。 - 【請求項２３】 ホモジネートを濾過し、約1.0ミクロ
ン以下の粒子を含有させることを特徴とする請求の範囲
第22項記載のワクチン生成方法。 - 【請求項２４】 ホモジネートを濾過し、約0.5ミクロ
ン以下の粒子を含有させることを特徴とする請求の範囲
第22項記載のワクチン生成方法。 - 【請求項２５】 ホモジネートを濾過し、約0.1ミクロ
ン以下の粒子を含有させることを特徴とする請求の範囲
第22項記載のワクチン生成方法。 - 【請求項２６】 選好性非血球凝集外皮ＲＮＡウイルス
の生物学的に純粋な培養において、前記培養がその発生
病理的変異株すべてを伴い、ブタにおけるブタ不育およ
び呼吸器系疾患に影響を与えることができることを特徴
とする培養。 - 【請求項２７】 ネズミ誘導ハイブリッド細胞系によっ
て生成されるモノクローナル抗体において、前記抗体が
ブタに対してブタ不育および呼吸基疾患を生じさせる選
好性非血球凝集ＲＮＡウイルスの抗原決定基の少なくと
も１つと特異的に結合することができるモノクローナル
抗体。 - 【請求項２８】 前記抗体がIgGまたはIgM型の免疫グロ
プリン分子であることを特徴とする請求の範囲第２７項
記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項２９】 SDOW12であることを特徴とする請求の
範囲第２７項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３０】 SDOW17であることを特徴とする請求の
範囲第２７項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３１】 ブタ不育および呼吸器系症候群ウイル
スすなわちATCC VR-2332の生物学的に純粋な培養におい
て、前記培養が、その発生病理的変異株すべてを伴い、
ブタに対してブタ不育および呼吸器系疾患に作用するこ
とができることを特徴とする培養。 - 【請求項３２】 修飾された生きたブタ不育および呼吸
器系症候群ウイルスすなわちATCC VR-2332と、ウイルス
がブタに対して非発生病理的になるように修飾された薬
学的に耐用し得る担体と、を含むことを特徴とするワク
チン組成物。 - 【請求項３３】 死滅または不活性のブタ不育および呼
吸器症候群すなわちATCCVR-2332および薬学的に耐用し
得る担体を含むことを特徴とするワクチン組成物。 - 【請求項３４】 請求の範囲第３２項に記載したワクチ
ン組成物をブタに投与することを特徴とするブタ不育お
よび呼吸器症候群に対するブタの免疫化方法。 - 【請求項３５】 請求の範囲第３３項に記載したワクチ
ン組成物をブタに投与することを特徴とするブタ不育お
よび呼吸器症候群に対するブタの免疫化方法。 - 【請求項３６】 ブタ不育および呼吸器系症候群ウイル
スすなわちATCC VR-2332の増殖単離方法において、適切
な増殖培地中の血清存在下でサル細胞の完全または部分
的シーツにウイルスを接種し、ＣＰＥが認められるまで
の間、約34℃乃至37℃で接種細胞シーツを培養すること
を特徴とする増殖単離方法。 - 【請求項３７】 サル細胞系がMA-104であることを特徴
とする請求の範囲第３６項記載の増殖単離方法。
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