KR102563707B1 - T 세포 에피토프를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 - Google Patents

T 세포 에피토프를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T 세포 에피토프를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물에 관한 것으로, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 다수의 공통 면역을 유도할 수 있는 것으로 알려진 N 단백질, M 단백질 및 GP5 단백질의 일부 단편의 아미노산 서열을 포함하는, 돼지 T 세포에 의해 특이적으로 인식되는 펩타이드, 이를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 및/또는 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

Description

T 세포 에피토프를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 {Vaccine composition for preventing porcine reproductive and respiratory syndrome virus using T cell epitope}
본 발명은 T 세포 에피토프를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물에 관한 것으로, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 다수의 공통 면역을 유도할 수 있는 것으로 알려진 N 단백질, M 단백질 및 GP5 단백질의 일부 단편의 아미노산 서열을 포함하는, 돼지 T 세포에 의해 특이적으로 인식되는 펩타이드, 이를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 및/또는 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; PRRS)은 국내 양돈 산업에 가장 큰 피해를 주는 전염병에 해당한다. 돼지 생식기 호흡기 증후군은 임신한 암퇘지의 생식 불능, 유산이나 조산, 사산의 번식장애를 유발하며, 젖먹이 돼지와 비육돈에게 재채기, 발열 등의 호흡기 증상을 유발한다. 일반적으로 바이러스에 이환된 이후 세균 등의 2차 감염에 의해 심한 호흡기 증상을 야기하지만, 만성적으로 감염된 경우에는 특징적인 임상 증상 없이 증체량 감소 및 폐사율의 증가를 나타나게 된다.
이 바이러스 질환은 미국에서 1987년에 최초로 발견되었고, 이어서 유럽에서 발견되었으며, 1990년대 초에 아시아에서 동정 되었다. 지금까지, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 양돈국가에서 풍토병의 특징을 가지며 세계적으로 확산되어, 매년 막대한 경제적 손실을 일으켰다.
이 같은 질병의 중요성 때문에 돼지 생식기 호흡기 증후군의 원인체인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 발견한 이후 약 20년 동안 이 바이러스에 대한 예방법을 개발하기 위하여 많은 노력과 투자가 되었음에도 불구하고 아직까지 효과적인 백신이 개발되지 않은 실정이다. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방하기 위해 불활화 백신과 약독화 생백신 등 다양한 백신이 개발되었으나, 오직 감염성이 확보된 약독화 백신만이 만족스러운 수준의 방어 효과를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
그러나, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스가 유전적으로 매우 다양하게 존재하고, 다양한 바이러스들 간의 교차면역이 잘 되지 않기 때문에 하나의 백신으로 다양한 종류의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 종류를 방어하기에는 어려움이 많다. 또한, 현재 약독화 백신은 다른 동물 종의 세포 주에서 100~200 계대 이상의 연속 계대를 통해서만 생산이 가능하므로, 개발 기간이 길고 종종 이와 같이 약독화하여 백신으로 사용하는 바이러스도 병원성이 복귀하여 약독화 백신을 접종한 돼지에서 질병을 예방하지 않고 오히려 질병을 유발하는 경우도 있어 안전성의 보장이 어려운 실정이다.
한국공개특허 제10-2007-0064666호에는 '돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 돌연변이'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1152012호에서는 '돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 균주 및 조성물'이 개시되어 있으나, 특정 균주에 특화된 T 세포 면역결정기(T cell epitope)를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군을 예방할 수 있는 백신에 관하여는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 N 단백질, M 단백질 및 GP5 단백질의 일부 단편의 아미노산 서열을 포함하는, 돼지 T 세포에 의해 특이적으로 인식되는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 펩타이드를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 펩타이드를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 T 세포에 의해 특이적으로 인식되는 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 전술한 펩타이드를 1종 이상 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRRSV) 예방 백신 조성물 및/또는 돼지 생식기 호흡기 증후군 (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 돼지 T 세포의 인터페론-감마 (IFN-γ) 분비를 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 나노리포좀 (nanoliposome)에 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 북미형 균주일 수 있다.
본 발명의 PRRSV의 M 단백질, N 단백질 또는 GP5 단백질 유래 펩타이드는 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시킴으로써 PRRSV의 증식을 효과적으로 억제하므로, PRRSV 예방 백신 및/또는 PRRS 예방 또는 치료용 약물로서 유용하다. 특히, 항체의 면역결정기 (epitope)가 아닌, 선형 서열 (linear sequence)를 인식하는 T 세포 면역결정기 (T cell epitope)를 사용하므로, 보다 직접적인 효과를 유도할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 3종의 단백질들에서 특정 부위의 단편을 이용하므로, 경제적이며 대량 생산에 효과적이다.
도 1은 PRRSV 공격 접종 후 각 그룹 (T01: 8종의 펩타이드 나노리포좀 투여, T02: Ingelvac PRRS MLV 투여, T03: 양성 대조군, T04: 음성 대조군)의 돼지 혈청 내 바이러스 양을 cDNA 게놈 복제 (cDNA genomic copy) 양으로 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
상술한 바와 같이, PRRSV의 유전적 다양성과 바이러스 간의 교차 면역이 잘 일어나지 않는 특성으로 인해 PRRSV 예방 백신 개발에 어려움이 있고, 약독화 백신의 경우 바이러스의 병원성 복귀로 안전성이 보장되지 않아, 새로운 형태의 PRRSV 예방 백신 개발에 대한 요구가 지속되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 돼지의 면역 세포인 T 세포에 특이적으로 인식되는 PRRSV의 면역결정기 (epitope)를 이용하여 PRRSV 예방 백신을 개발하고자 하였으며, PRRSV의 구조 단백질인 N 단백질, M 단백질 또는 GP5 단백질의 특정 부위의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시킴으로써 PRRSV의 증식을 효과적으로 억제함을 확인하고, 상기 3종의 단백질들의 단편을 이용한 백신을 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용된 “약”은 일반적으로 특정 수치 또는 범주의 20% 이내를 의미하며, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 본 명세서에 제시된 수치는 달리 언급이 없으면 약을 포함하는 것으로 추정할 수 있다.
본 발명의 제1 측면은 PRRSV의 구조 단백질인 N 단백질, M 단백질 또는 GP5 단백질의 특정 부위의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 펩타이드는 돼지의 T 세포에 의해 특이적으로 인식되어 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 부위 (antigen moiety)로서 면역결정기 (epitope)로도 지칭된다. 본 발명에 따르면, 상기 항원 부위는 면역 반응을 활성화할 수 있는 병원종 (pathogenic species)의 단백질이며, 예를 들어 PRRSV ORF5, ORF6 또는 ORF7에 의해 코딩되는 GP5 단백질, N 단백질, M 단백질 또는 이들의 일부 단편을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 상기 8종의 펩타이드의 구체적인 아미노산 서열은 실시예 1의 표 1에 나타낸 바와 같다.
상기 8종의 펩타이드는 NCBI 데이터베이스에 공개된 PRRSV ORF5 (GenBank: JN315685) 및 ORF7 (GenBank: JN399072) 유전자 서열을 참고하거나, 직접 시퀀싱 작업을 통해 SNU090851 (Genbank no. JN315685)의 ORF6 유전자 서열을 확인하여, PRRSV 다수의 공통 면역을 유도할 수 있는 것으로 알려진 N 단백질, M 단백질 및 GP5 단백질의 일부 서열을 근거로 선정된 아미노사 서열을 포함한다.
이때, 직접 시퀀싱으로 확인된 ORF6의 유전자 서열을 다음과 같다: ATGGGGTCGTCCCTAGACAACTTTTGCCATGACAGCTCGGCACCGCAAAAGGTAGTCTTGGCGTTTTCCATCACTTATACGCCAATAATGATATATGCCCTGAAGGTTAGTCGCGGCCGGCTGCTAGGGCTTTTGCACCTTTTGATTTTTCTGAATTGTGCTTTTACTTTTGGGTACATGACATTCGTGCACTTTCAGAGTACAAATAGGGTCGCACTCACTATGGGAGCAGTAGTTGCACTCCTTTGGGGGGTGTACTCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACTTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTTGAGAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATTGCGGCGAGTGATAACCACGCATTCGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACAGTCAACGGCACGTTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCGGGGAGTGGTAAACCTCGTTAAGTATGCCAAATAA (서열번호 11)
본 발명의 펩타이드의 아미노산 서열은 면역원성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 보존적으로 치환될 수 있다.
본 발명에서 용어 "보존적 아미노산 치환"은 해당 위치에서 아미노산 잔기의 크기, 극성, 전하, 소수성 또는 친수성에 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않고 면역원성을 감소시키지 않도록 본래의 아미노산 잔기를 본래의 것이 아닌 잔기로 치환하는 것을 수반한다. 예를 들어, 이들은 하기 그룹 내에서의 치환일 수 있다: 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 폴리펩티드 서열에 대한 보존적 아미노산 변형 (및 코딩 뉴클레오티드의 상응하는 변형)은 모 폴리펩티드와 유사한 기능적 및 화학적 특징을 갖는 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
본 발명에서 용어 "결실"은 단백질 서열로부터 1개 이상의 아미노산 잔기의 제거이다.
본 발명에서 용어 "삽입"은 단백질 서열에서 1개 이상의 본래의 것이 아닌 아미노산 잔기의 부가이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 면역원성을 감소시키지 않는 수준에서 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
도 1에서 확인되는 바와 같이, PRRSV 공격 접종 후 각 그룹 (T01: 8종의 펩타이드 나노리포좀 투여, T02: Ingelvac PRRS MLV 투여, T03: 양성 대조군, T04: 음성 대조군)에서 공격 접종 바이러스의 혈청 항원 검사를 수행한 결과, 본 발명의 8종의 펩타이드가 투여된 그룹 T01의 개체들은 양성 대조군인 그룹 T03의 개체들에 비해 혈청 내 바이러스 양이 평균 107배 내지 108배 감소하였다. 또한, 상업 백신인 Ingelvac PRRS MLV이 투여된 그룹 T02의 개체들과 비교하더라도 혈청 내 바이러스 양이 약 106배 내지 107배 감소하여 PRRSV 증식 억제에 탁월한 효능을 나타냄을 확인하였다.
나아가, 상기 각 그룹의 폐 조직 병변 정도를 관찰한 결과, 표 5에 나타난 바와 같이 양성 대조군인 그룹 T03의 개체들은 중등-다발성 수준 이상의 간질성 폐렴을 나타낸 반면, 8종의 펩타이드 나노리포좀을 투여한 그룹 T01의 개체들은 유의적으로 낮은 병변 수치를 나타내어, 본 발명의 8종의 펩타이드 투여를 통해 PRRSV의 증식이 효과적으로 억제되었음을 확인하였다. PRRSV의 증식을 억제하는 주요한 세포성 면역 지표인 IFN-γ는 표 6에 나타난 바와 같이 그룹 T01 및 T02에서 공격 접종 당일과 공격 접종 이후 2 주차에 양성 및 음성 대조군인 그룹 T03 및 T04에 비해 월등히 증가하여, 본 발명의 8종의 펩타이드 투여를 통해 면역 반응이 효과적으로 유도되었음을 확인하였다.
이와 같이, 본 발명의 펩타이드는 T 세포에 특이적으로 인식되어 T 세포의 IFN-γ 분비를 현저히 증가시킴으로써 PRRSV의 증식을 효과적으로 억제하므로, PRRSV 예방 백신 및 PRRS 치료제로 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제2 측면은 전술한 8종의 펩타이드를 이용한 PRRSV 예방 백신 조성물 및/또는 PRRS 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물 및 약학 조성물은 PRRSV 발현 단백질, 바람직하게는 구조 단백질 중 극히 작은 절편의 펩타이드를 포함하며, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 면역원성을 감소시키지 않는 수준에서 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 및 약학 조성물에 있어서, 상기 펩타이드는 본 발명의 제1 측면에 따른 펩타이드에 대한 설명과 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 제1 측면에 따른 펩타이드는 세포 매개성 면역 반응을 유도하는데 유용하므로, 상기 펩타이드를 포함하는 백신 및 약학 조성물은 개체의 면역화 (immunization)에 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 및 약학 조성물에 있어서, 상기 펩타이드는 숙주의 "면역학적 반응"을 PRRSV에 대한 세포 및/또는 항체 매개의 면역 반응으로 유발한다. 따라서, 본 발명의 백신 및 약학 조성물은 PRRSV 감염 및 이와 관련된 임상 징후들에 대해 예방 면역을 부여할 수 있다.
본 발명에서 용어 "면역 반응"은 본 발명의 펩타이드와 이를 포함하는 백신 또는 약학 조성물을 투여받은 개체에게 투여된 바이러스 변이주 또는 백신에 대한 임의의 세포- 및/또는 항체-매개의 면역 반응을 의미한다. 보통, "면역 반응"은 다음과 같은 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: 본 발명의 백신 및 약학 조성물에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 γδ T 세포의 생산 또는 활성화. 숙주는 면역원성 조성물이나 백신을 투여 받지 않은 대조군에 비해 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질환의 임상 중증도가 감소되도록 치료적 또는 예방적 면역학적 반응을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 예방은 숙주 감염과 관련된 증상들의 결여 및 빈도 또는 중증도의 감소에 의해 증명될 것이다.
본 발명에서, 용어 "개체" 및/또는 "대상체"는 "돼지"를 의미하며, "돼지들", "새끼 돼지", "모돈" 및 "자돈"과 호환하여 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 및 약학 조성물에 있어서, 상기 펩타이드는 체내 투여 시 면역 유도 효과가 지속되는 시간을 증가시키기 위해 나노리포좀 (nanoliposome)에 포함된 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 및 약학 조성물에 있어서, 전술한 펩타이드를 함유하는 나노리포좀은 공지된 다양한 리포좀 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노리포좀은 지질-필름법으로 제조된다. 구체적으로, 양이온성 지질과 면역활성화 물질을 용매에 용해한 다음 용매를 증발시켜 얇은 막으로 건조시키고, 제조된 펩타이드를 적절한 농도로 희석한 액을 필름 막에 주입하고 온도를 높여 재수화시키는 방식으로 리포좀 구조를 형성 시킨다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노리포좀은 양이온성 지질에 의하여 제조될 수 있으며, 면역활성화 물질을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 양이온성 지질에 의해 음이온성인 세포막과의 정전기적 인력이 유도되어 항원 (예를 들어, T 세포 면역결정기) 및/또는 면역활성화 물질의 세포 내 전달 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 및 약학 조성물에 있어서, 상기 나노리포좀은 면역활성화 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 T 세포의 활성화 유도에 기여할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 양이온성 지질은 DC-콜레스테롤 (3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride), DDA (dimethyldioctadecylammonium), DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), DOTMA (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane), EPC (1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), MVL5 (N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide), DODAP (lipids 1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 면역활성화 물질은 인플라머좀 인듀서 (inflammasome inducer)일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 인플라머좀 인듀서는 TDB (α,α′-trehalose-6,6-dibehenate)일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 및 약학 조성물에 있어서, 상기 나노리포좀은 내부에 포함된 펩타이드가 T 세포에 효과적으로 전달될 수 있는 크기로 제조되며, 예를 들어, 원하는 직경 사이즈를 갖는 막을 통한 리포좀의 압출로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노리포좀은 400 nm 이하의 직경으로 제조된다.
본 발명의 백신 및 약학 조성물에 있어서, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 북미형 균주이다.
본 발명의 백신 및 약학 조성물은 전술한 펩타이드 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 및 아쥬반트 (adjuvant)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 이들은 활성 성분의 생물학적 유효성을 방해하지 않고, 화학적으로 불활성이며, 투여되는 개체에게 독성을 나타내지 않는다.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다.
상기 아쥬번트의 예로는 수산화알루미늄과 같은 광물겔, 리조레시틴과 같은 계면활성제, 사포닌이나 사포닌 유도체와 같은 글리코시드, 란티딘, Avridine, 카보폴(carbopol), 폴리포스파젠, DDA(dimethyldioctadecylammonium bromide), 퀼 에이(quil A), 암피겐, 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물 및 약학 조성물에는 약제학적 또는 수의학적으로 허용될 수 있는 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 예를 들어 EDTA염, 메티올레이트 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학 조성물"은 백신 조성물을 포함하는 의미로 해석되며, 바람직하게는 T-세포 백신을 의미한다.
본 발명에서 용어 “T-세포 백신”은 세포 매개성 면역 반응을 활성화시킴으로써 대상체 (subject)의 감염을 예방할 수 있는 백신을 의미한다. 상기 T-세포 백신의 결정적 역할은 세포독성 T-세포 (또한, 세포독성 T 림프구, CD8+T-세포, 및 CTL로 알려짐)와 기억 (memory) T-세포 (Tcm 및 Tem)이다.
본 발명의 백신 및 약학 조성물은 제약기술 분야 및 수의학 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 표준기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 조성물의 함량은 의학기술분야 및 수의학 기술분야의 당업자들이 투여 대상 개체의 연령, 성별, 체중, 종족 및 상태와 같은 인자 및 투여 경로를 고려하여 결정할 수 있다. 이 조성물은 단독으로 투여하거나 또는 다른 면역학적 항원 또는 백신 조성물 또는 치료제 조성물과 함께 투여하거나 후속투여를 할 수 있다.
본 발명의 백신 및 약학 조성물이 사용될 수 있는 제형의 예로는 구강, 비강, 항문, 질, 위 내 투여용의 현탁액, 시럽 등과 같은 액상 제제 및 피하, 내피, 근육 내, 또는 정맥 내 투여용의 멸균 현탁 또는 에멀션 제제를 포함할 수 있다. 또한 사용 전에 약제학적으로 허용 가능한 희석제에 재현탁되는 가용성 성분 또는 미립자의 고체 제제일 수 있다. 가용성 성분 또는 미립자는 코아세르베이션, 바이아세르베이션, 응고, 분무건조, 기포건조, 침전, 동결건조 등 약제학 분야 및 수의학 분야의 당업자에게 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 백신 및 약학 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량으로 본 발명의 펩타이드를 포함한다.
본 발명에서 용어 "유효량"은 대상체에게 요법 (예를 들어, 본 발명의 백신 또는 약학 조성물)을 투여하는 것과 관련하여 예방적 및/또는 치료적 효과(들)을 갖는 요법의 양을 지칭한다. 특정 일 구현예에서, "유효량"은 하기 효과 중 하나 이상의 효과를 달성하는데 충분한 요법의 양을 지칭한다: (i) 바이러스 감염 또는 그와 연관된 증상의 중증도를 감소시키거나 또는 개선시킴; (ii) 바이러스 감염 또는 그와 연관된 증상의 지속기간을 감소시킴; (iii) 바이러스 감염 또는 그와 연관된 증상의 진행을 예방함; (iv) 바이러스 감염 또는 그와 연관된 증상의 퇴행을 일으킴; (v) 바이러스 감염 또는 그와 연관된 증상의 발달 또는 개시를 예방함; (vi) 바이러스 감염 또는 그와 연관된 증상의 재발을 예방함; (vii) 박테리아 감염을 가진 대상체의 생존을 증가시킴; (viii) 대상체의 감염을 제거함; 및/또는 (ix) 대상체에서 박테리아 복제를 억제하거나 또는 감소시킴; 및/또는 (xiii) 또 다른 요법의 예방적 또는 치료적 효과(들)을 증강시키거나 또는 개선시킴.
예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 유효량은 0.01mg 이상 10mg 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 유효한 양은 조성물의 성분 및 투여 스케줄에 의존적일 수 있다.
본 발명의 백신 및 약학 조성물은 수의학적으로 허용되는 다양한 경로를 통해 돼지에 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구, 비경구, 피하, 근육내, 피내, 설하, 경피, 직장, 경점막, 흡입을 통한 표면적, 협측 투여를 통해, 또는 이의 조합으로 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 및 약학 조성물은 주사, 흡입 또는 이식을 통해 투여될 수 있고, 특히 주사로 투여되는 것이 바람직하다. 접종 또는 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라 1회 또는 여러 번, 또한 간헐적으로, 예컨대 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 다른 투여량으로 투여될 수 있다. 주사는 원하는 양으로 주사하거나 피하 혹은 비강에 분무하여 주입할 수 있다, 또는 대안적으로 연속 주입일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 백신 및 약학 조성물은 바람직하게 근육 주사로 투여될 수 있다. 투여경로에 따라 수의학 분야의 당업자들이 투여량을 결정할 수 있다. 예컨대, 모돈의 경우 약 2 ㎖를, 자돈의 경우 약 1 ㎖를 접종할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
PRRSV 백신 제조를 위한 펩타이드 서열 선정
공격 접종 바이러스 SNU090851 (Genbank no. JN315685)의 ORF5, ORF6 및 ORF7의 펩타이드 서열을 확인하였다. 상기 PRRSV 균주는 서울대학교 수의과대학에서 2000년대에 폐렴과 위축이 동반된 자돈에서 분리한 강병원성 북미형 균주이다. 해당 바이러스의 유전자 중 ORF5 (GenBank: JN315685) 및 ORF7 (GenBank: JN399072)은 각각 NCBI 데이터베이스에 공개된 서열을 참고하였고, ORF6은 직접 시퀀싱 작업을 통해 서열을 확인하여, PRRSV 다수의 공통 면역을 유도할 수 있는 것으로 알려진 N 단백질, M 단백질 및 GP5 단백질의 일부 서열을 근거로 PRRSV 백신용 펩타이드 서열을 선정하였다.
직접 시퀀싱으로 확인된 ORF6의 유전자 서열을 다음과 같다: ATGGGGTCGTCCCTAGACAACTTTTGCCATGACAGCTCGGCACCGCAAAAGGTAGTCTTGGCGTTTTCCATCACTTATACGCCAATAATGATATATGCCCTGAAGGTTAGTCGCGGCCGGCTGCTAGGGCTTTTGCACCTTTTGATTTTTCTGAATTGTGCTTTTACTTTTGGGTACATGACATTCGTGCACTTTCAGAGTACAAATAGGGTCGCACTCACTATGGGAGCAGTAGTTGCACTCCTTTGGGGGGTGTACTCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACTTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTTGAGAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATTGCGGCGAGTGATAACCACGCATTCGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACAGTCAACGGCACGTTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCGGGGAGTGGTAAACCTCGTTAAGTATGCCAAATAA (서열번호 11)
첫 번째로, ORF5의 전체 아미노산 201개 서열을 커버하는 30개의 펩타이드를 제작하였다. 각각의 펩타이드는 대략 8~10개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 서로 3~5개의 아미노산이 앞뒤로 겹쳐 지도록 구성하였다. 각 펩타이드의 서열은 합성 단계의 예상 순도 (Purity)에 따라 길이를 짧게 조정하거나 늘렸다. 이들 각 펩타이드는 이미 SNU090851 균주에 감염된 지 5주된 돼지의 혈액에서 얻은 말초혈액 단핵세포 (peripheral mononuclear cells) 5 × 105에 항원 자극을 위해 각 펩타이드를 100ng씩 첨가하여 ELISPOT으로 인터페론-감마 (IFN-gamma) 반응을 확인하였다. 106으로 환산 시 100 이상을 보인 펩타이드 1개 (GP5)를 선정하였다.
두 번째로, ORF6의 전체 아미노산 175개 서열을 커버하는 30개의 펩타이드를 제작하였다. 각각의 펩타이드는 대략 8~10개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 서로 3~5개의 아미노산이 앞뒤로 겹쳐 지도록 구성하였다. 각 펩타이드의 서열은 합성 단계의 예상 순도 (Purity)에 따라 길이를 짧게 조정하거나 늘렸다. 이들 각 펩타이드는 이미 SNU090851 균주에 감염된 지 5주된 돼지의 혈액에서 얻은 말초혈액 단핵세포 (peripheral mononuclear cells) 5 × 105개에 항원 자극을 위해 각 펩타이드를 100ng씩 첨가하여 ELISPOT으로 인터페론-감마 (IFN-gamma) 반응을 확인하였다. 106으로 환산 시 100 이상을 보인 펩타이드 4 (M1, M2, M3 및 M4)를 선정하였다.
마지막으로, ORF7의 전체 아미노산 124개 서열을 커버하는 30개의 펩타이드를 제작하였다. 각각의 펩타이드는 대략 8~10개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 서로 3~5개의 아미노산이 앞뒤로 겹쳐 지도록 구성하였다. 각 펩타이드의 서열은 합성 단계의 예상 순도 (Purity)에 따라 길이를 짧게 조정하거나 늘렸다. 이들 각 펩타이드는 이미 SNU090851 균주에 감염된 지 5주된 돼지의 혈액에서 얻은 말초혈액 단핵세포 (peripheral mononuclear cells) 5 × 105개에 항원 자극을 위해 각 펩타이드를 100ng씩 첨가하여 ELISPOT 으로 인터페론-감마 (IFN-gamma) 반응을 확인하였다. 106으로 환산 시 100 이상을 보인 펩타이드 3개(N1, N2 및 N3)를 선정하였다.
상기 과정을 통해 선정된 8종의 펩타이드의 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다.
이름 ORF 아미노산 서열 서열번호
M1 6 CHDSSAPQKVVLAFSITY 1
M2 6 ALKVSRGRLLGLLHL 2
M3 6 FGYMTFVHFQSTNRV 3
M4 6 KFITSRCRLCLLGRK 4
N1 7 VRLIRVTAS 5
N2 7 MLGKIIAQQ 6
N3 7 VRHHFTPSE 7
GP5 5 SHLQLIYNL 8
상기 펩타이드들은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 중화 항체의 면역결정기 (epitope) 또는 T 세포 면역결정기 (T cell epitope)로서, 높은 중화 항체를 유도하고 인터페론-감바(INF-γ) 등의 면역 반응을 돼지에서 특이적으로 유도할 수 있을 것으로 기대된다.
8종의 펩타이드의 제조
실시예 1에서 선정된 8종의 펩타이드는 COSMO Gene Tech (Seoul, Republic of Korea)에 의뢰하여 고체상 펩타이드 합성 (solid-phase peptide synthesis) 방법을 통하여 합성한 후 고성능액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 순도 (purity) 90% 이상 정제된 펩타이드를 제조하였다.
나노 사이즈 펩타이드 백신의 제조
백신은 지질-필름법 (lipid-film method)을 이용하여 다음과 같은 과정으로 제조되었다.
디메틸디오타데실암모늄 (DDA) 브로마이드 (Dimethyldioctadecylammonium bromide)와 α,α′-트레할로스 6,6′-디베헤네이트 (α,α′-trehalose 6,6′-dibehenate, TDB)를 최종 농도 1.25 : 0.5mg/mL가 되도록 배합하였다. 교반된 혼합물을 유리관에 분주한 뒤 질소 가스 (nitrogen gas)를 분사하여 유기용매로 들어가 있는 클로로포름 (chloroform)을 제거하였다. 진공상태의 유리관을 밤새도록 유지하여 최대한 얇은 막으로 완전히 건조시켰다.
실시예 2에서 제조된 8종의 펩타이드를 각각 1mg/mL의 농도로 PBS로 희석시킨 후 2mL를 미리 준비한 진공관의 지질 필름 (lipid film) 에 주입하였다. 약 40분간 57℃에 다시 재수화시켜 리포좀 (liposome)을 형성시켰다. 생성된 리포좀 부유물은 압출 (extrusion) 과정을 거쳐 400nm 여과 (filtering)를 통해 400nm 이하 직경의 사이즈를 갖는 리포좀을 생산하였다. 유체역학적 크기 (hydrodynamic size)와 제타 전위 (zeta potential)는 Zetasizer (Nano-ZS90, Malvern)를 이용하여 최종적으로 확인하였다.
교반된 리포좀은 냉장 보관하였으며 사용 전, 펩타이드별로 제작된 8개의 리포좀을 하나로 섞은 뒤 접종하였다.
공격 접종 실험을 통한 백신으로서의 효능 평가
4-1. 실험 설계
본 실시예에서는 실시예 3에서 제조한 백신의 효능을 검증하기 위해, PRRSV를 공격 접종하여 돼지에서의 PRRSV의 감염으로 인한 병변과 증상의 방어 가능성을 확인하고자 하였다.
공격 접종을 위한 PRRSV 균주는 서울대학교 수의과대학에서 2000년대에 폐렴과 위축이 동반된 자돈에서 분리한 강병원성 북미형 균주 SNUVR090851 (Genbank no. JN315685)을 사용하였다. ORF5를 기반으로 한 분류 체계상, 상기 PRRSV는 Lineage 1에 속한다. 상기 PRRSV 균주는 자돈의 폐에서 폐렴 유발이 확인된 것으로, 감염 이후 일시적인 고열과 간질성 폐렴 그리고 증체량 감소를 유도하는 것으로 알려져 있다.
백신 효능 평가를 위해, 공격 접종 실험을 하기 표 2와 같이 디자인하였다. 공격 접종 2주 후 모든 실험 돼지를 안락사시키고 부검하여 병변을 분석하였다.
그룹 접종 백신 투여량 (IM) 마리수
(두)		 일정
0주차 2주차 4주차
T01 펩타이드
나노리포좀		 0.5mg/각 펩타이드 8 접종 부스팅
(boosting)		 공격
T02 Ingelvac PRRS MLV
(상업 백신)		 2mL
(4x104 TCID50/mL)		 8 접종 - 공격
T03 PBS 8 접종 - 공격
T04 PBS 8 접종 - -
구체적으로, PRRSV에 항원-항체 반응 음성인 건강한 3주령 이유자돈을 각 그룹 당 8두씩 배정하여, 그룹 T01의 이근부에 8개의 펩타이드 나노리포좀을 하나로 합쳐 접종하였다. 펩타이드는 종류당 0.5mg이 돼지에 주입되었다. 동일한 방법으로 2주 후 부스팅 (boosting)하였다. 그룹 T02의 경우, 시중에서 유통중인 생독백신 (Ingelvac PRRS MLV)을 용법대로 접종하여 효능을 비교하였다. 그룹 T03과 T04는 각각 양성 대조군과 음성 대조군으로 설정하였다. 백신 접종일 (0주차)로부터 4주 후 7주령이 된 시점에 모든 그룹에 상기 공격 접종 바이러스를 비강 접종하였다. 공격 접종 바이러스 용량은 3mL (1×105 TCID50/mL)을 사용하였다. 공격 접종일로부터 2주 후 전두수에 대해 부검하였다.
4-2. 공격 접종 바이러스의 혈청 항원 검사
공격 접종일로부터 3, 7, 10, 14일에 각 그룹의 모든 개체의 목정맥에서 혈액을 3ml 채취하여 혈청을 분리하고 분리된 혈청에 포함되어있는 바이러스의 RNA를 Intron 사의 Viral gene-spin viral DNA/RNA extraction kit를 이용하여 추출하였다.
구체적으로, 채취한 혈청 150ul을 용해 버퍼 (lysis buffer) 250ul와 혼합하고 15초간 볼텍싱 (vortex) 하였으며, 10분간 실온에서 반응시키고 결합 버퍼 (binding buffer) 350ul를 혼합한 후 가볍게 볼텍싱 하였다. 총 750ul 혼합물 (mix)을 컬럼에 옮기고 1분간 13000 rpm으로 원심분리 한 후, 여과액을 버리고 워싱 버퍼 (washing buffer) A 500ul를 컬럼에 첨가하여 동일하게 1분간 13000rpm으로 원심 분리하였다. 다시 여과액을 버리고 워싱 버퍼 B 500ul를 컬럼에 첨가하여 동일하게 1분간 13000rpm으로 원심분리 하였다. 마지막 여과액을 버리고 다시 동일하게 원심분리 하여 모든 알코올 성분을 제거하였다. 용출 버퍼 (elution buffer) 30ul를 넣고 1분간 반응시킨 뒤 원심분리하여 최종적으로 RNA를 추출하였다.
최종적으로 추출한 RNA 2ul를 TOPscript RT DRY MIX kit를 사용하여 역전사시켜 cDNA를 합성하였다. 이미 건조상태로 준비된 키트의 튜브에 추출한 RNA 2ul와 DEPC DW 18ul를 혼합하여 50℃에서 1시간 배양 (incubation)한 후 95℃에서 10분간 배양하여 반응을 종결하였다.
다음으로, 실시간 방법 (Real-time method)을 이용하여 혈청 1ml 당 탐지된 합성한 cDNA 게놈 카피 (genomic copy)의 양을 측정하였다. SYBR green mix (Thermos fisher) 10ul에 DEPC DW 7.5ul와 PRRSV 특이적 프라이머 세트 10 pmol을 0.5ul 혼합한 혼합물에 상기에서 합성한 cDNA 2ul를 넣고 PCR 반응을 수행하였다. PRRSV 특이적 프라이머 세트의 서열 정보는 하기 표 3과 같다.
프라이머 이름 서열 (5’→3') 서열번호
PRRSV 특이적 정방향 프라이머 GAAGAAAAACCCGGAGAAGC 9
PRRSV 특이적 역방향 프라이머 CGTAGGCAAACTAAACTCCACAG 10
구체적으로, 95℃에서 30초, 60℃에서 1분간 신장 (elongation)시켜 DNA를 증폭하고, 추가적으로 해리 곡선 (dissociation curve)을 구하기 위한 반응을 수행하였다. 총 35 사이클 반응을 반복하였으며, 역치 값에 따라 샘플 별로 Ct 값을 산출하였고, 33 이상은 제외하였다. Ct값은 표준 곡선 (standard curve)에 대입하여 게놈 카피 (genomic copy)로 환산하여 표기하였다. 환산된 결과를 그룹 내 개체의 항원량 합계의 평균값을 계산하여 t-검정 (Student’s t-test)을 수행하였다.
도 1에서 확인되는 바와 같이, 공격 접종 7, 10, 14일 이후 백신군인 그룹 T01의 혈청 내 항원량이 양성 대조군인 그룹 T03에 비해 통계적으로 유의하게 감소되었다. 백신군 (T01)의 혈청 내 바이러스의 양은 양성 대조군 (T03)에 비해 평균 107배에서 108배 감소하였다. 음성 대조군인 그룹 T03에서는 어떠한 바이러스도 검출되지 않았다.
4-3. 폐 조직 병리학적 병변 스코어
각 그룹의 개체를 부검하여 폐장을 적출하고 포르말린에 고정한 후 포매 과정을 거쳐 H&E 염색을 실시하였다. 염색된 장기는 현미경으로 병변 정도를 관찰하였으며, 폐장에서 간질성 폐렴(interstitial pneumonia)의 정도는 하기 표 4를 기준으로 스코어링 하였다. 각 그룹간 병변을 기록하고 크루스칼-왈리스 검정 (Kruskal-Wallis test) 방법으로 통계 처리한 후 유의성이 있으면 맨-휘트니 검정 (Mann-Whitney test) 방법을 이용하여 유의성을 분석하였다.
레벨 등급
(점수)		 비고
정상(Normal) 0 폐포벽 (Alveolar wall)의 어떠한 비후 (thickness)도 관찰되지 않음
경증(Mild) 1 폐포벽의 두께와 폐포낭 (alveolar sac) 직경이 동일하거나 더 비후된 병소가 전체의 10% 미만
중등-다발성
(Moderate multifocal)		 2 폐포벽의 두께와 폐포낭 (alveolar sac)의 직경이 동일하거나 더 비후된 병소가 전체의 40% 미만
중등-미만성
(Moderate diffuse)		 3 폐포벽의 두께와 폐포낭 (alveolar sac)의 직경이 동일하거나 더 비후된 병소가 전체의 80% 미만
중증 (Severe) 4 폐포낭 (alveolar sac)의 존재가 확인되지 않음 또는 출혈을 동반함
그룹 별 분석 결과는 표 5에 나타내었다.
T01 T02 T03 T04
병변 등급(점수) 0.09375 2.953125 3.015625 0
표준편차 0.293785 0.652947 0.629744 0
분석 결과, 양성 대조군인 그룹 T03은 중등-다발성 수준 이상의 간질성 폐렴을 나타낸 반면, 백신군인 T01은 유의적으로 낮은 병변 수치를 보였다. 이는 백신이 돼지의 폐장에서 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 증식을 성공적으로 억제한 결과로 확인된다.
4-4. 백신 접종에 따른 인터페론 분비 변화
상기 실시예 4-2의 실험에서, 백신 접종 이후 일주일 단위로 돼지의 목 정맥에서 3ml의 혈액을 채취하여 피콜 (ficoll)을 이용해 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여, 상기 말초혈액 단핵세포 중 공격 접종한 PRRSV에 특이적인 IFN-γ를 분비하는 세포의 수를 측정하였다. 상기 IFN-γ는 바이러스의 증식을 억제하는 주요한 세포성 면역 지표이다. 세포 수 측정은 ELISPOT 판독 기계를 이용하였다.
하기 표 6에 접종 후 경과일 수에 따른 인터페론 감마 분비 세포의 수의 측정 결과를 나타내었다.
접종 후 경과일 수에 따른
INF-γ 분비 세포 수		 T01 T02 T03 T04
0일차 0 0 0 0
14일차 0 36 ± 26 0 0
28일차 (DPC0) 68 ± 39 51 ± 74 0 0
42일차 (DPC14) 82 ± 33 77 ± 41 0 0
표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 백신 접종 이후 시간이 경과함에 따라 백신군인 그룹 T01과 T02에서의 IFN-γ 분비 세포의 수가 증가하였으며, 공격 접종 당일과 공격 이후 2주차에 IFN-γ 분비 세포의 수가 통계적으로 유의미하게, 대조군에 비해 월등히 증가하였다. 이를 통해, 본 발명의 펩타이드를 함유한 나노리포좀 백신 조성물은 우수한 면역 효능을 나타냄을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Vaccine composition for preventing porcine reproductive and respiratory syndrome virus using T cell epitope <130> 1068179 <160> 11 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> M1 peptide (ORF6) <400> 1 Cys His Asp Ser Ser Ala Pro Gln Lys Val Val Leu Ala Phe Ser Ile 1 5 10 15 Thr Tyr <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> M2 (ORF6) <400> 2 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> M3 (ORF6) <400> 3 Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val His Phe Gln Ser Thr Asn Arg Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> M4 (ORF6) <400> 4 Lys Phe Ile Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N1 (ORF7) <400> 5 Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N2 (ORF7) <400> 6 Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln Gln 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N3 (ORF7) <400> 7 Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GP5 (ORF5) <400> 8 Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu 1 5 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRRSV specific forward primer <400> 9 gaagaaaaac ccggagaagc 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRRSV specific reverse primer <400> 10 cgtaggcaaa ctaaactcca cag 23 <210> 11 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ORF6 <400> 11 atggggtcgt ccctagacaa cttttgccat gacagctcgg caccgcaaaa ggtagtcttg 60 gcgttttcca tcacttatac gccaataatg atatatgccc tgaaggttag tcgcggccgg 120 ctgctagggc ttttgcacct tttgattttt ctgaattgtg cttttacttt tgggtacatg 180 acattcgtgc actttcagag tacaaatagg gtcgcactca ctatgggagc agtagttgca 240 ctcctttggg gggtgtactc agccatagaa acctggaaat tcatcacttc cagatgccgt 300 ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgttga gagtgccgca 360 ggctttcatc cgattgcggc gagtgataac cacgcattcg tcgtccggcg tcccggctcc 420 actacagtca acggcacgtt ggtgcccggg ttgaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaaa 480 gctgttaagc ggggagtggt aaacctcgtt aagtatgcca aataa 525

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
    서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 펩타이드는 나노리포좀 (nanoliposome)에 포함되는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 북미형 균주인, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물.
  6. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
    서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드는 나노리포좀 (nanoliposome)에 포함되는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 북미형 균주인, 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX358912B (es) * 2011-12-30 2018-09-07 United Biomedical Inc Vacuna de marcadores basados en péptidos sintéticos y sistema de diagnóstico para el control efectivo del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (prrs).

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110020233A1 (en) * 2005-11-29 2011-01-27 Iowa State University Research Foundation, Inc. Identification of protective antigenic determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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