KR20110069024A - 웨스트 나일 바이러스 백신 - Google Patents

웨스트 나일 바이러스 백신 Download PDF

Info

Publication number
KR20110069024A
KR20110069024A KR1020117006827A KR20117006827A KR20110069024A KR 20110069024 A KR20110069024 A KR 20110069024A KR 1020117006827 A KR1020117006827 A KR 1020117006827A KR 20117006827 A KR20117006827 A KR 20117006827A KR 20110069024 A KR20110069024 A KR 20110069024A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
immunogenic composition
leu
gly
val
Prior art date
Application number
KR1020117006827A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101813017B1 (ko
Inventor
크리스티나 제이. 헤네시
필립 더블유. 헤이스
Original Assignee
베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 filed Critical 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드
Publication of KR20110069024A publication Critical patent/KR20110069024A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101813017B1 publication Critical patent/KR101813017B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/193—Equine encephalomyelitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은 웨스트 나일 바이러스에 대한 면역원성 조성물을 제공한다. 대안적 양태에서, 면역원성 조성물은 또한 다른 말 병원체를 포함한다. 본 발명의 웨스트 나일 바이러스 조성물은 바람직하게는 북미 주요 웨스트 나일 바이러스 균주 또는 분리주에 대한 방어를 제공한다.

Description

웨스트 나일 바이러스 백신{West Nile Virus vaccine}
웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus; WNV)는 플라비비리데(Flavivirade) 과에 속한다. 감염은 일반적으로 곤충에 물려 옮은 모기 벡터를 통해 걸린다. 웨스트 나일은 지구 상의 모든 종류의 동물과 새를 감염시킨다. 이 바이러스는 1999년에 북미 지역에서 처음 발견되었고, 최초 진단은 캐나다산 말에서 이루어졌다. 현재, 웨스트 나일 바이러스는 미국에서 새, 사람 및 모든 종류의 동물에 영향을 미치는 전염병이 되었다. 2002년에는 웨스트 나일 바이러스의 확인된 증례 14,700건 이상이 43개 주에서 보고되었다.
WNV의 전파는 여러 인자들에 의해 영향을 받는다. 모기는 바이러스의 벡터이고 WNV를 영속시키기 때문에, 모기의 증식과 발달에 이바지하는 생태 조건이 WNV의 전파에 영향을 주었다. WNV의 전파를 차단하기 위한 노력으로 모기 집단을 방제하는데 이용한 여러 가지 수법이 있다. 이러한 수법으로는 살충제, 방충제, 모기와 동물 사이의 접촉을 차단하는 물리적 장벽, 모기의 번식을 영속시키는 환경 제거 및 면역화 이용을 포함한다. WNV의 일반적인 징후로는 중추신경계에 영향을 미치는 다양한 증상들이 포함된다. 뇌염 증상이 종종 관찰되고, 그 예로는 바이러스혈증, 중추신경계의 조직병리학적 병변, 식욕감퇴, 우울, 열병, 쇠약, 걸음걸이 이상, 뒷다리 마비, 시력 손상, 운동실조, 목적 없는 방랑, 경련, 삼키지 못함, 혼수 및 사망을 포함한다.
WNV에 대하여 유도된 몇몇 백신이 소개되었으나, 여러 가지 이유로 인해 바람직하지 않다. 예를 들어, 한 백신은 카나리폭스-벡터화된 웨스트 나일 바이러스로부터 생산되었다. 다른 백신 세트는 세균의 플라젤린의 변형 버전(STF2 델타)을 WNV 엔벨로프 단백질의 EIII 도메인에 융합시켜 디자인한 웨스트 나일 바이러스의 재조합 키메라 단백질로부터 생산되었다. 또 다른 백신은 보강제로서 대사성 오일을 필요로 하는 불활성화된 초기 북미 웨스트 나일(North American West Nile) 균주를 포함한다. 마지막으로, 전구 막과 엔벨로프 단백질이 WN(4)의 대응 유전자에 의해 교체된 황열 17D 바이러스의 감염성 클론으로부터 약독화된 생 키메라 백신이 생산되었다.
전술한 백신들에는 고유의 여러 가지 문제가 있다. 생 바이러스 유기체를 함유하는 백신은 백신접종을 통해 동물을 바이러스로 감염시켜 병과 심지어 사망을 야기할 위험이 있다. 키메라성 단백질 백신, 재조합 발현 백신 및 일부 서브유닛 백신은 백신 조성물에 포함된 단백질의 수와 관련된, 제한된 면역학적 활성 및 효과에 대한 문제가 있다. 이러한 종류의 백신 효능은 보통 제한적이며, 바이러스에 의한 감염의 위험이나 야생형 바이러스로의 복귀가 일반적이다. 또한, 일반 백신에 이용되는 일부 보강제는 체내에서 비교적 빠르게 제거되는 대사성 오일로 구성되고 백신접종된 동물의 면역계가 면역원성 활성 조성물에 반응할 수 있는 기간을 제한한다. 다른 보강제는 백신접종된 동물에서 알레르기 반응 및 바람직하지 않은 효과를 유발할 수 있다. 또한, 이러한 백신들은 WNV 외에 다른 병원체에 대한 면역성을 자극하는 항원을 포함하지 않아서, 편리하고 안전하게 여러 질환에 대하여 동물을 보호하지 못한다. 또한, 종래의 모든 백신들은, 환경에 더 이상 존재하지 않아서 더 이상 동물을 감염시켜 질환을 유발할 수 없는 WNV의 초기 분리주에서 유래되었다.
따라서, 당업계에 필요한 것은 임신 동물을 비롯한 모든 연령의 동물에게 투여하기에 안전하고 백신의 면역원성 효과 및 기간에 도움을 주는데 적합한 보강제를 포함하며, 자연 환경에 존재하여 이러한 백신이 예방 역할을 할 수 있는 질환을 유발하는 WNV의 현재 분리주 또는 주요 분리주로부터 제조된 백신이다. 또한, 당업계에 필요한 것은 웨스트 나일 바이러스에 의한 질환 또는 감염과 관련된 임상 징후들의 제거 또는 예방 등 발생률 및/또는 중증도를 감소시키는 백신이다. 또한, 당업계에 필요한 것은 웨스트 나일 바이러스 항원을 다른 말 병원체 유래의 항원과 함께 포함하여 웨스트 나일 바이러스와 다른 병원체(들)에 의한 질환의 임상 징후의 발생률 또는 중증도를 감소시키는 백신이다.
본 발명은 종래 기술 고유의 문제를 극복하고 당해 기술 상태의 분명한 진보를 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 웨스트 나일 바이러스의 하나 이상의 균주 또는 분리주로 구성된 면역원성 활성 항원 성분을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직한 일부 양태에서, 조성물은 추가로 보강제, 바람직하게는 카르보머(carbomer)와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 웨스트 나일 바이러스 항원은 사멸 또는 불활성화된 것이 바람직하다. 이 조성물은 웨스트 나일 바이러스 병에 민감한 동물에서 면역원성 반응을 유도하고 모든 연령의 동물에게 안전한 백신을 제공한다.
또한, 본 발명은 면역원성 활성이고 전술한 백신의 단점을 극복한 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 불활성화된 백신을 제공하여 백신접종 동물, 예컨대 임신 어미에게 고유의 안전성을 제공한다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물은 수동 획득한 모체 면역으로 인한 간섭을 극복하고 백신접종된 동물의 능동 면역을 자극한다. 유리하게, 본 발명은 병원성 WNV의 많은 또는 모든 관련 항원 성분과 단백질을 함유하는 광범위 유효 면역원성 활성 조성물을 제공한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 조성물에 WNV의 동시대적 분리주 또는 유행병학적 주요 분리주의 항원을 포함하여, 최소 WNV 감염의 임상 징후의 발생률 및/또는 중증도를 감소시키고 오늘날 동물, 예컨대 말에서 관찰되는 가장 우세한 분리주에 대한 면역을 포함하는 방어 면역원성 반응을 제공한다는 점에서 독특하다. 바람직한 양태에서, WNV의 동시대적 분리주는 북미 웨스트 나일 바이러스 분리주 또는 북미 주요 웨스트 나일 바이러스 분리주의 일부인 분리주를 포함한다. 본 발명의 목적 상, WN02는 북미 주요 웨스트 나일 바이러스 균주 또는 분리주라 부를 수 있는 WNV 균주의 대표적인 예이다. 구체적으로, 북미 주요 균주 및 분리주는 WN99 분리주로부터 아미노산 변화를 초래하는 적어도 1개의 뉴클레오타이드 변화를 보유한 것이다. 균주 NY99(GenBank 등록번호 AF196835)는 균주 또는 분리주가 북미 주요 균주 또는 분리주인지를 측정하기 위한 참조 균주로서 작용한다. 또한, 이 균주들 또는 분리주는 하나 이상의 사일런트(silent) 아미노산 변화를 보유할 수 있다. 바람직한 양태에서, 뉴클레오타이드 변화는 균주 또는 분리주의 엔벨로프 단백질에 아미노산 변화를 초래하고, 뉴클레오타이드 변화는 발린에서 알라닌으로의 아미노산 변화를 초래하는 것이 더욱 바람직하다. 이 아미노산 변화는 중간 숙주, 즉 모기에서의 더 큰 복제능과 관련된 것이 바람직하다. 북미 주요 균주는 위치 1442 및 2466(북미 균주, 예컨대 NY 99 및 서열번호 23과 비교해서)에 각각 U에서 C로의 돌연변이 및 C에서 U로의 돌연변이 중 어느 하나(바람직하게는 둘 모두)를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 더 더욱 바람직하게는, 북미 주요 균주 또는 분리주는 E 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에의 돌연변이 및 NS5 단백질을 암호화하는 서열의 위치 9352에의 C에서 U로의 돌연변이를 추가로 포함한다(역시 북미 균주, 예컨대 NY 99 및 서열번호 23과 비교해서). 이러한 바람직한 돌연변이는 실시예 10 및 문헌[Phylogenetic Analysis of North American West Nile Virus Isolates, 2001-2004: Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype, C. Todd Davis, et al., Virology 342, p 252-265(2005), 이 문헌의 교시와 내용은 본 발명에 참고인용된다]에 제시되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 웨스트 나일 바이러스 항원과 부형제 또는 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체를 배합하는 단계를 포함한다. 바람직한 양태는 또한 하나 이상의 추가 말 항원을 첨가하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 이 방법은 추가로 조성물에 적당한 보강제를 첨가하는 단계를 포함한다.
바람직한 한 양태에서, 본 발명은 백신접종된 동물의 면역계가 면역원성 활성 조성물에 반응할 수 있는 기간을 연장하기 위해 WNV 항원과 비대사성 오일 보강제를 포함한다. 비대사성 오일은 항원과 함께 투여했을 때 투여 후 체내에서 대사되지 않는 오일인 것으로 이해한다. 바람직한 비대사성 오일은 광유이다. 다른 바람직한 형태에서, 카르보머 보강제와 비대사성 오일(바람직하게는 광유)이 함께 WNV 항원 외에 존재한다. 보강제(들)는 본 명세서에 기술된 모든 조성물에 이용될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명의 조성물은 북미 주요 균주 유래의 WNV 항원, 바람직하게는 불활성화 또는 사멸 WNV, 및 본질적으로 무 오일 보강제 또는 오일계 보강제를 함유한다. 이러한 양태에는 다른 보강제, 바람직하게는 카르보머가 포함될 수도 있다.
다른 양태에서, 말의 미생물 병원체 유래의 다른 항원들과 함께 WNV 항원으로 구성된 백신 조성물은 동물에게 광범위한 방어 범위를 부여하기 위해 제공된다. 이러한 양태에서, WNV 항원은 전술한 임의의 형태이다.
바람직한 한 양태에서, 본 발명은 베네수엘라 말 뇌척수염(VEE), 동부 말 뇌척수염(EEE), 서부 말 뇌척수염(WEE), 파상풍 톡소이드(T), 말 헤르페스 바이러스(EHV), 예컨대 타입 1 및 4, 말 인플루엔자 바이러스(EIV) 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 항원 성분의 면역학적 유효량과 함께 전술한 WNV 항원을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 이러한 양태는 보강제, 바람직하게는 카르보머 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 비대사성 오일, 바람직하게는 광유가 존재할 수 있으나, 이러한 오일이 필요한 것은 아니다.
바람직한 양태는 또한 전술한 WNV 항원을 동부 말 뇌척수염(Eastern Equine Encephalomyelitis); 서부 말 뇌척수염(Western Equine Encephalomyelitis); 베네수엘라 말 뇌척수염(Venezuelan Equine Encephalomyelitis); 파상풍 톡소이드(Tetanus Toxoid); 동부 말 뇌척수염과 서부 말 뇌척수염; 동부 말 뇌척수염과 베네수엘라 말 뇌척수염; 동부 말 뇌척수염과 파상풍 톡소이드; 동부 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염 및 베네수엘라 말 뇌척수염; 동부 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드; 동부 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염, 베네수엘라 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드; 서부 말 뇌척수염 및 베네수엘라 말 뇌척수염; 서부 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드; 서부 말 뇌척수염, 베네수엘라 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드; 베네수엘라 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드; 및 동부 말 뇌척수염, 베네수엘라 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드와 함께 포함한다. 상기 구체적 조합물 중 가장 바람직한 조합물은 WNV 항원을 동부 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염, 베네수엘라 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드의 항원 또는 항원 성분과 함께 포함한다. 이러한 각 구체적 조합물에서, 보강제 또는 보강제 조합물은 카르보머, 더 더욱 바람직하게는 특히 바람직한 카르보폴과 함께 사용될 수 있다. 가장 바람직한 배합 형태인 WNV, 동부 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염, 베네수엘라 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드 조합물에는 오일(대사성 또는 비대사성)이 존재하지 않는다. 동부 말 뇌척수염의 NJO 균주, 서부 말 뇌척수염 균주 중 Fleming 균주 및 베네수엘라 말 뇌척수염 균주 중 TC-83 균주는 모두 이 백신 성분의 대표적인 균주이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 전술한 구체적 배합 백신을 각각 사용하고 말 헤르페스바이러스(Equine Herpesvirus), 바람직하게는 타입 1, 타입 4(EHV1 및/또는 EHV4) 또는 이들의 조합물 유래의 항원을 첨가하여 제조할 수 있다.
전술한 구체적 배합 백신 각각의 추가 변형, 예컨대 EHV1 및/또는 EHV4를 포함하는 것은 말 인플루엔자 바이러스(Equine Influenza Virus; EIV) 유래의 항원을 첨가하여 제조할 수 있다. 말 인플루엔자 바이러스가 첨가되는 바람직한 양태로는, 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주 및 파상풍 톡소이드; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 파상풍 톡소이드 및 동부 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 파상풍 톡소이드, 동부 말 뇌척수염 및 서부 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 파상풍 톡소이드, 동부 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염; 및 베네수엘라 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 및 동부 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주 및 서부 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 동부 말 뇌척수염 및 서부 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 동부 말 뇌척수염 및 베네수엘라 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 동부 말 뇌척수염 및 베네수엘라 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 서부 말 뇌척수염 및 베네수엘라 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 서부 인플루엔자 바이러스, 및 파상풍 톡소이드; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 베네수엘라 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 베네수엘라 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드; 및 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 베네수엘라 말 뇌척수염, 동부 말 뇌척수염 및 파상풍 톡소이드를 포함한다. 각 구체적 양태에는 말 인플루엔자의 임의의 하나 이상의 균주 또는 분리주가 존재할 수 있다. 말 인플루엔자 바이러스의 바람직한 균주로는 인플루엔자 A/말-2/Ohio/03, 인플루엔자 A/말-2/New Market/2/93, 인플루엔자 A/말-2/Kentucky/95 및 이들의 조합물이 포함된다. 전술한 모든 조합물에는, 적어도 2가지 말 인플루엔자 균주를 사용하는 것이 바람직하고, 적어도 3가지 말 인플루엔자 균주를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 말 헤르페스 바이러스를 포함하는 바람직한 양태는, 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 파상풍 톡소이드, 동부 말 뇌척수염 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 파상풍 톡소이드, 동부 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염 및 말 헤르페스 바이러스; 베네수엘라 말 뇌척수염 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 및 동부 말 뇌척수염; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 서부 말 뇌척수염 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 베네수엘라 말 뇌척수염 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 동부 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 동부 말 뇌척수염, 베네수엘라 말 뇌척수염 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 서부 말 뇌척수염, 베네수엘라 말 뇌척수염 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 서부 인플루엔자 바이러스, 파상풍 톡소이드 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 베네수엘라 말 뇌척수염, 파상풍 톡소이드 및 말 헤르페스 바이러스; 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 베네수엘라 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염, 파상풍 톡소이드 및 말 헤르페스 바이러스; 및 웨스트 나일 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 한 균주, 베네수엘라 말 뇌척수염, 동부 말 뇌척수염, 파상풍 톡소이드 및 말 헤르페스 바이러스를 포함한다. 전술한 모든 조합물에는 적어도 2종의 말 인플루엔자 균주를 사용하는 것이 바람직하고, 적어도 3종의 말 인플루엔자 균주를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 전술한 모든 조합물에서, 말 헤르페스 바이러스의 "적어도 한" 균주는 EHV-1 및 EHV-4로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 일부 바람직한 형태에서, 두 균주, EHV-1 및 EHV-4는 면역원성 조성물에 포함될 것이다. 다른 바람직한 형태에는 EHV-1만이 포함될 것이다. 조합물의 WNV 성분은 본 명세서에 기술된 불활성화 또는 사멸 북미 주요 균주인 것이 바람직하다.
백신 조성물은 임의의 면역원성 유효 용량으로 투여될 수 있다. 바람직한 양태에서, 백신 조성물은 단일 용량으로 투여된다. 이 용량은 총 용적이 약 0.5ml 내지 2.5ml 사이인 것이 바람직하고, 약 0.6ml 내지 2.0ml 사이인 것이 더욱 바람직하며, 약 0.7ml 내지 1.75ml 사이인 것이 더 더욱 바람직하고, 약 0.8ml 내지 1.5ml 사이인 것이 더 더욱 바람직하며, 약 0.9ml 내지 1.25ml 사이인 것이 더 더욱 바람직하고, 1.0ml 단일 용량이 가장 바람직하다.
다른 양태에서, 백신은 제1 용량 투여 후 제2(추가) 용량 투여로 투여한다. 제2 용량은 제1 용량 후 적어도 15일 후에 투여하는 것이 바람직하다. 제2 용량은 제1 용량 후 15 내지 28일 사이에 투여하는 것이 더욱 바람직하다. 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 17일 후에 투여하는 것이 더 더욱 바람직하다. 제2 용량은 제1 용량 후 17 내지 25일 사이에 투여하는 것이 더 더욱 바람직하다. 제2 용량은 제1 용량 후 적어도 19일 이후에 투여하는 것이 더 더욱 바람직하다. 제2 용량은 제1 용량 이후 19일 내지 23일 사이에 투여하는 것이 더 더욱 바람직하다. 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 21일 후에 투여하는 것이 가장 바람직하다. 바람직한 양태에서, 백신의 제1 용량과 제2 용량은 동량이다. 각 용량은 전술한 바람직한 양인 것이 바람직하고, 제1 용량과 제2 용량이 1ml 용량인 것이 가장 바람직하다. 제1 및 제2 용량 요법 외에, 대안적 양태는 추가 후속 용량을 포함한다. 예를 들어, 당해 양태에 따르면, 제3, 제4 또는 제5 용량이 투여될 수 있다. 제3, 제4 및 제5 용량 요법은 제1 용량과 동량으로 투여되고, 용량 사이의 시간틀은 앞에서 언급한 제1 용량과 제2 용량 사이의 시간과 일치하는 것이 바람직하다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물의 각 용량에서, WNV 항원은 적어도 102.0TCID50/용량을 포함한다. 더욱 바람직하게는, WNV 항원은 약 102.0TCID50/용량 내지 1010.0TCID50/용량 사이를 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, WNV 항원은 적어도 102.5TCID50/용량을 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, WNV 항원은 약 102.5TCID50/용량 내지 약 109.5TCID50/용량을 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, WNV 항원은 적어도 103.0TCID50/용량을 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, WNV 항원은 약 103.0TCID50/용량 내지 약 109.0TCID50/용량을 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, WNV 항원은 적어도 103.5TCID50/용량을 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, WNV 항원은 약 103.5TCID50/용량 내지 약 109.0TCID50/용량을 포함한다. 가장 바람직하게는, WNV 항원은 약 107.0TCID50/용량 내지 약 109.0TCID50/용량을 포함한다. 불활성화된 WNV 백신 또는 임의의 다른 불활성화된 백신의 TCID50 값은 일반적으로 최종 백신에 존재하는 항원 함량을 의미하지만, 항원을 불활성화하기 전에 백신 조성물에 대해 계산된 항원 함량과 동등하다. 본 발명의 면역원성 조성물은 본원에 제공된 대표 실시예와 함께 당업자에게 공지된 절차를 이용하거나 상업적으로 이용가능한 검출 분석으로 측정했을 때 1:4 이상의 역가로 WNV에 대한 혈청 중화 항체를 자극하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에 따르면, 추가 말 항원을 포함하는 본 발명의 양태의 각 용량에서, 임의의 용량에 존재하는 동부 말 뇌척수염 또는 베네수엘라 말 뇌척수염의 양은 적어도 105.5 TCID50/용량인 것이 바람직하다. 더 더욱 바람직하게는, 용량은 약 105.5TCID50/용량 내지 109.5TCID50/용량 사이이다. 더 더욱 바람직하게는, 용량은 적어도 106.0TCID50/용량이다. 더 더욱 바람직하게는, 용량은 약 106.0TCID50/용량 내지 109.0TCID50/용량 사이이다. 더 더욱 바람직하게는, 용량은 적어도 106.5TCID50/용량이다. 더 더욱 바람직하게는, 용량은 약 106.5TCID50/용량과 109.5TCID50/용량 사이이다. 더 더욱 바람직하게는 용량은 적어도 107.0TCID50/용량이다. 가장 바람직하게는, 용량은 106.7TCID50/용량 내지 109.2TCID50/용량 사이이다.
본 발명의 조성물에 존재할 때 서부 말 뇌척수염 항원은 적어도 106.2PFU/ml의 양인 것이 바람직하다. 더 더욱 바람직하게는, 그 양은 106.2PFU/ml와 1010.2PFU/ml 사이이다. 더 더욱 바람직하게는, 그 양은 적어도 106.7PFU/ml이다. 더 더욱 바람직하게는, 그 양은 106.5PFU/ml와 109.7PFU/ml 사이이다. 더 더욱 바람직하게는, 그 양은 적어도 107.2PFU/ml이다. 더 더욱 바람직하게는, 그 양은 약 107.2PFU/ml와 109.2PFU/ml 사이이다. 더 더욱 바람직하게는, 그 양은 적어도 107.7PFU/ml이고, 106.5PFU/ml와 109.0PFU/ml 사이가 가장 바람직하다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물에 존재하는 경우 파상풍 톡소이드의 양은 적어도 3 CPU, 더욱 바람직하게는 약 3 CPU와 20 CPU 사이, 더 더욱 바람직하게는 적어도 4 CPU, 가장 바람직하게는 적어도 5 CPU이지만, 20 CPU 이하인 양이다.
대안적 양태에서, 하나 이상의 말 인플루엔자 바이러스 균주가 존재하는 경우, 조성물에 존재하는 말 인플루엔자의 양은 적어도 105.0TCID50/ml이다. 더욱 바람직하게는, 말 인플루엔자는 약 105.0TCID50/ml 내지 109.0TCID50/ml 사이의 양, 더욱 바람직하게는 적어도 106.0TCID50/ml이다. 더 더욱 바람직하게는, 그 양은 약 106.0TCID50/ml 내지 108.0TCID50/ml 사이, 더욱 바람직하게는 적어도 106.5TCID50/ml이다. 더 더욱 바람직하게는, 그 양은 약 106.5TCID50/ml와 107.0TCID50/ml 사이이고, 가장 바람직한 양은 약 106.7TCID50/ml와 107.0TCID50/ml 사이이다.
말 헤르페스 바이러스를 함유하는 양태에서, 각 용량에 존재하는 말 헤르페스 바이러스의 양은 적어도 106.0TCID50/ml이다. 더욱 바람직하게는, 말 헤르페스 바이러스는 조성물에 106.0TCID50/ml와 109.5TCID50/ml 사이의 양으로 존재하고, 더욱 바람직하게는 약 107.0TCID50/ml의 양으로 존재한다. 더 더욱 바람직하게는, 말 헤르페스 바이러스는 107.5TCID50/ml와 109.0TCID50/ml 사이의 양으로 존재하고, 더욱 바람직하게는 약 108.0TCID50/ml의 양으로 존재한다. 더 더욱 바람직하게는, 말 헤르페스 바이러스는 108.0TCID50/ml와 109.0TCID50/ml 사이의 양으로 존재하고, 약 108.50TCID50/ml의 양이 가장 바람직하다.
또 다른 바람직한 양태에 따르면, WNV의 연대기상 동시대적 및 유행병상 우세 균주를 포함하는 백신 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 일반적으로 조성물의 효능을 향상시킬 것이다. 이러한 우세 균주는 말의 조직에서 분리하는 것이 바람직하다. 이러한 근원은 포괄적으로 안전하고 효과적인 WNV 백신이 특히 필요한 종, 즉 말에 대한 면역학적 조성물을 위한 백신 종균 바이러스를 제조하는데 바람직한 WNV의 근원이다. 또한, 본 발명은 말 조직에서 유래되는 불활성화된 저 계대(low passage) WNV 균주를 포함하여, 단백질의 전체 보체보다 적게 발현하는 고 계대(high passage) 약독화 백신, 서브유닛 백신 또는 재조합 기술에 의해 생산된 다른 조성물에서 발견되는 단백질 항원의 부적절한 제한된 레퍼토리를 보유한 종래 백신의 한계를 극복하는 백신 조성물을 개시한다. 말 조직에서 분리된 이러한 불활성화된 저 계대 WNV 균주는 종래 백신에 고유한 결점을 극복하고 저 계대의 고 독성 말 균주로부터 생산됨으로 인해, 종래 말의 백신접종에 이용할 수 없었던 유일무이하게 포괄적으로 효과적이지만 안전한 면역원성 조성물을 구성하는, 대부분 관련성이 있는 광범위한 수의 면역원성 단백질을 제공한다. 또한, 바람직한 연대기상 동시대적이고 유행병적으로 우세한 WNV 균주는 본원에 정의된 바와 같은 북미 주요 WNV 균주이다.
본 발명은 특정 항원의 광범위한 분리주에 대한 방어를 제공하므로, 종래 면역원성 또는 백신 조성물보다 광범위한 방어 범위를 제공한다. 본 발명의 조성물의 효능을 평가하기 위해 사용한 항원공격 모델로는 이종의 항원공격 균주를 이용하여, 동물의 백신접종에 사용한 특정 균주 또는 분리주 외의 균주 및 분리주에 대하여 방어를 제공하는 조성물의 능력을 증명했다. 이것은 본 발명의 고유한 특징이다.
또한, 본 발명은 동물, 바람직하게는 말의 웨스트 나일 바이러스 감염과 관련된 임상 징후의 발생률 및/또는 중증도를 야생형 감염에 비해 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 일반적으로 사멸 또는 불활성화된 웨스트 나일 바이러스 분물, 바람직하게는 북미 주요 WNV 균주와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 출원의 일부 바람직한 양태에 따르면, 보강제가 조성물에 첨가되고, 다른 바람직한 형태에서는 보강제가 제공되지 않는다. 다른 바람직한 양태에 따르면, 본 방법은 웨스트 나일 바이러스의 하나 이상의 사멸 또는 불활성화된 분리주(들)와 함께 다른 말 병원체 유래의 항원 성분의 면역학적 유효량을 포함하는 백신 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 분리주는 동부 말 뇌척수염 항원, 서부 말 뇌척수염 항원 베네수엘라 말 뇌척수염 항원, 파상풍 톡소이드 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하고, 전술한 조합물인 것이 더욱 바람직하다. 다른 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 백신은 적당한 보강제, 희석제 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된다.
본 발명은 무리 중에서 웨스트 나일 바이러스 감염과 관련된 임상 증상들의 발생률 및/또는 중증도를 야생형 감염에 비해 감소시키는 것을 제공한다. 본 발명의 면역원성 조성물을 투여받은 동물이 나타내는 임상 증상들의 중증도 및/또는 발생률은, 두 그룹(조성물을 투여받는 동물과 조성물을 투여받지 않는 동물)이 항원공격을 받거나 WNV에 의한 야생형 감염에 노출되었을 때, 그러한 투여를 받지 않는 동물에 비해 적어도 10% 감소되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 발생률 또는 중증도는 적어도 20%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 본 발명의 조성물을 투여받는 동물이 임상 증상을 전혀 나타내지 않는 것인, 적어도 100% 감소되는 것이다. WNV 균주는 북미 주요 WNV 균주인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 유리하게 병원체의 이종 균주(조성물에 사용된 균주 대비)에 대한 방어를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 조성물을 투여하여 WNV, WEE, VEE, EEE, EHV, EIV 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 병원체에 대한 혈청 중화 항체 또는 혈청 혈구응집 항체를 자극하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 1:4 이상의 역가로 WNV에 대한 혈청 중화 항체를 자극하여 WNV 바이러스혈증을 예방하거나 감소시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역원성 조성물은 백신에 존재하는 모든 항원에 대하여 장기적 면역성을 제공한다. 웨스트 나일에 대한 면역 지속기간은 적어도 1개월인 것이 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 2개월인 것이 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 3개월인 것 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 4 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 6 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 7 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 8 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 9 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 10 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 12 내지 24개월인 것이 가장 바람직하다.
EIV에 대한 면역 지속기간은 적어도 1개월인 것이 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 2개월인 것이 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 3개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 4 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 6 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 7 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 8 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 9 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 10 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 12 내지 24개월인 것이 가장 바람직하다.
EHV에 대한 면역 지속기간은 적어도 1개월인 것이 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 2개월인 것이 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 3개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 4 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 6 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 7 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 8 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 9 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 10 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 12 내지 24개월인 것이 가장 바람직하다.
서부 말 뇌척수염에 대한 면역 지속기간은 적어도 1개월인 것이 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 2개월인 것이 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 3개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 4 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 6 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 7 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 8 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 9 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 10 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 12 내지 24개월인 것이 가장 바람직하다.
동부 말 뇌척수염에 대한 면역 지속기간은 적어도 1개월인 것이 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 2개월인 것이 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 3개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 4 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 6 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 7 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 8 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 9 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 10 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 12 내지 24개월인 것이 가장 바람직하다.
베네수엘라 말 뇌척수염에 대한 면역 지속기간은 적어도 1개월인 것이 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 2개월인 것이 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 3개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 4 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 6 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 7 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 8 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 9 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 10 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 12 내지 24개월인 것이 가장 바람직하다.
파상풍 톡소이드에 대한 면역 지속기간은 적어도 1개월인 것이 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 2개월인 것이 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 3개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 4 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 6 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 7 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 8 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 9 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하고, 면역 지속기간은 적어도 10 내지 24개월인 것이 더 더욱 바람직하며, 면역 지속기간은 적어도 12 내지 24개월인 것이 가장 바람직하다.
또한, 적어도 12개월의 면역 지속기간은 본 발명의 면역원성 조성물을 형성하는 임의의 항원 조합물에 관한 것이다.
전술한 EIV 및/또는 EHV 항원을 포함하는 다른 바람직한 양태에서, 면역원성 조성물은 다른 민감성 동물에 대한 바이러스의 전파를 차단하기 위해 감염성 EIV 또는 EHV의 방출(shedding)을 개선한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본원에 기술된 본 발명에 따른 조성물은 수동 획득성 모성 면역성에 의한 간섭을 극복하고 능동 면역과 EIV에 대한 백신접종 동물의 EIV 감염의 임상 징후의 발생률 또는 중증도 감소를 자극한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 본 명세서에 모두 기술된 바와 같은 VEE, WEE, EEE, 파상풍, WNV, 말 비강폐렴 및 말 인플루엔자를 포함하는 면역원성 조성물은 본 발명에 따라 투여 후에 VEE, WEE, EEE, 파상풍, WNV, 말 비강폐렴 및 말 인플루엔자에 대한 효능을 나타낸다. 이러한 조성물은 추가로 보강제, 바람직하게는 광유 및/또는 카르보머, 및 수의학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 형태에서, 이 조성물은 1ml 단일 용량으로 투여될 것이다.
WNV 항원을 포함하는, 본원에 기술된 각 면역원성 조성물은 웨스트 나일 바이러스와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 그 임상 증상의 중증도를 경감시키도록 기술된 바와 같이 투여할 수 있다.
EIV 항원을 포함하는, 본원에 기술된 각 면역원성 조성물은 말 인플루엔자와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 그 임상 증상의 중증도를 경감시키도록 기술된 바와 같이 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 말 헤르페스 바이러스 항원을 포함하는, 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 말 헤르페스 바이러스와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 그 임상 증상의 중증도를 경감시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 웨스트 나일 바이러스 항원을 포함하는 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단게를 포함하여, 웨스트 나일 바이러스와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 말 인플루엔자 항원을 포함하는, 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 말 인플루엔자 바이러스와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 말 헤르페스 바이러스 항원을 포함하는 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 말 헤르페스 바이러스와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여 말 인플루엔자 바이러스와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키는 방법으로, 이 임상 증상의 감소가 면역원성 조성물을 투여하지 않은 동물에 비해, 임상 증상의 적어도 10% 감소인 방법을 제공한다.
본 발명은 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 무리의 감염 발생률을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 무리의 감염 발생률을 감소시키는 방법으로, 감염 발생률의 감소가 면역원성 조성물을 투여하지 않은 무리에 비해 약 10% 내지 50% 감소인 방법을 제공한다.
본 발명은 무리 중의 EHV의 임상 증상의 발생률 및 중증도를 감소시키는 방법으로, 임상 증상이 호흡기 질환, 유산, 번식 합병증, 신경학적 질환, 중추신경계 질환 및 이의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법을 제공한다.
본 발명은 말 헤르페스 바이러스 항원을 포함하는, 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 말 헤르페스 바이러스와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 말 인플루엔자 항원을 포함하는, 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 무리 중의 말 인플루엔자와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 웨스트 나일 바이러스 항원을 포함하는, 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 무리 중의 웨스트 나일 바이러스와 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 동부 말 뇌척수염 항원을 포함하는, 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 무리 중의 동부 말 뇌척수염과 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 서부 말 뇌척수염 항원을 포함하는, 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 무리 중의 서부 말 뇌척수염과 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 베네수엘라 말 뇌척수염 항원을 포함하는, 전술한 어느 한 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 무리 중의 베네수엘라 말 뇌척수염과 관련된 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 웨스트 나일 바이러스 항원을 적당한 부형제 또는 약제학적 담체와 배합하는 단계를 포함하여, 전술하고 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 어느 한 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직한 형태에서, 이 방법은 추가로 하나 이상의 말 항원을 첨가하는 단계를 포함한다. 말 항원의 바람직한 그룹은 서부 말 뇌척수염, 동부 말 뇌척수염, 베네수엘라 말 뇌척수염, 파상풍 톡소이드, EHV, EIV 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 바람직한 형태에서, 본원에 기술된 방법은 추가로 여과 단계를 포함할 수 있고, 여기서 최종 산물은 정제 형태이다.
본 명세서에 사용된 "보강제"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 예컨대 Quil A, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 비대사성 오일, 광유 및/또는 식물/식물성 오일 및/또는 동물 오일, 중합체, 카르보머, 계면활성제, 천연 유기 화합물, 식물 추출물, 탄수화물, 콜레스테롤, 지질, 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 수중유중수 에멀젼을 포함할 수 있다. 에멀젼은 특히 경량 액체 파라핀 오일(유럽 약전 형태); 이소프레노이드 오일, 예컨대 스쿠알란 또는 스쿠알렌; 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 산출되는 오일; 선형 알킬 기를 함유하는 산 또는 알콜의 에스테르, 더 구체적으로 식물 오일, 에틸 올레이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기반으로 할 수 있다. 오일은 유화제와 함께 사용되어 에멀젼을 형성한다. 유화제는 비이온성 계면활성제, 구체적으로 소르비탄, 만나이드(예, 안하이드로만니톨 올레이트), 글리콜, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜과 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르류(경우에 따라 에톡시화됨), 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 구체적으로 Pluronic 제품, 특히 L121이 바람직하다[Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed. Stewart-Tull, D.E.S.). John Wiley and Sons, NY, pp 51-94(1995) 및 Todd et al., Vaccine 15: 564-570(1997)]. 바람직한 양태에서, 보강제는 최종 산물의 용적 기준으로 약 0.01 내지 50% 농도, 바람직하게는 약 2% 내지 30% 농도, 더욱 바람직하게는 약 5% 내지 25% 농도, 더 더욱 바람직하게는 약 7% 내지 22% 농도, 가장 바람직하게는 10% 내지 20% 농도이다. 본 발명과 함께 사용된 가능한 보강제 중에는, 대사성 오일을 사용하지 않는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 보강제는 적어도 비대사성 오일, 바람직하게는 광유이다. 다른 바람직한 양태에서, 백신 조성물은 오일-기반 보강제를 본질적으로 함유하지 않는다. 가장 바람직한 양태에서, 백신 조성물은 비-대사성 오일, 바람직하게는 광유와 카르보머를 보강제로서 함유한다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물 및 백신 조성물은 하나 이상의 수의학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된, "수의학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 부형제, 항균제 및 항진균제, 항미생물제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함한다. 일부 바람직한 양태, 및 특히 동결건조된 면역원성 조성물을 포함하는 양태에서, 본 발명에 사용되는 안정제는 동결건조 또는 냉동-건조용 안정제를 포함한다.
"희석제"는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장제는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 보존제 및 안정제를 포함하는 조성물로 제조되고; 더욱 바람직하게는 본 발명의 면역원성 조성물은 젠타마이신, EDTA, 글리세롤 및 이들의 조합물을 포함하는 조성물로 제조된다.
"면역원성 또는 면역학적 조성물"은 당해 조성물 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응인 숙주의 면역학적 반응을 도출하는 적어도 하나의 항원을 포함하는 당해의 조성물을 의미한다. 보통, "면역학적 반응"은 당해의 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 감마-델타 T 세포의 생산 또는 활성화와 같은 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질환의 임상 중증도가 감소하도록 치료적 또는 방어적 면역학적 반응을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 방어는 감염된 숙주에 의해 보통 나타나는 임상 징후의 감소 또는 결여, 더 빠른 회복 시간 및/또는 감염 숙주의 조직, 체액 또는 분비물에서 검출되는 세균 역가의 저하된 기간에 의해 입증될 것이다.
본 명세서에 사용된 "그러한 투여를 필요로 하는" 또는 "그러한 투여 치료를 필요로 하는"이란 용어는 투여/치료가 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 투여받은 동물의 건강에 개선 또는 향상과 관련이 있거나, 상기 동물의 건강에 미치는 임의의 다른 의학적 양성 효과와 관련이 있다는 것을 의미한다.
"웨스트 나일 바이러스"란 용어는 동물에 존재할 때 면역원성인 WNV 비리온의 성분, 및 가장 구체적으로 동물에 존재할 때 체액 면역반응 또는 세포 면역반응을 자극하는 WNV의 단백질 성분, 예컨대 엔벨로프 및 비구조 단백질을 의미하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 항원은 DNA, 단백질 서브유닛, 변형 생 바이러스 및 사멸 또는 불활성화된 바이러스를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 형태에서, WNV 항원 또는 항원들은 불활성화 또는 사멸 WNV 균주, 더욱 더 바람직하게는 북미 주요 WNV 균주를 포함한다.
"북미 웨스트 나일 바이러스(균주)"란 용어는 북미 대륙에서 발견된 임의의 웨스트 나일 바이러스 균주 또는 분리주의 의미하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 북미 웨스트 나일 바이러스 균주는 NY99 군주(GenBank 등록번호 AF196835 또는 NCBI 참조서열 NC_00942.1(서열번호 23))와 서열 동일성이 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 98.5%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 99.2%, 가장 바람직하게는 적어도 99.4%이다.
당업계에 공지된 바와 같은 "서열 동일성"은 2 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열, 즉 참조 서열과 이 참조 서열과 비교되는 주어진 서열 간에 관계를 의미한다. 서열 동일성은 상기 서열들의 줄 간에 정합으로 측정했을 때, 최고의 서열 유사성이 나타나도록 최적으로 정렬한 후 주어진 서열과 참조 서열을 비교하여 결정한다. 이러한 정렬 후, 서열 동일성은 위치-위치 기준(position-by-position basis)으로 확인하고, 예컨대 서열들이 특정 위치에서 "동일"하다는 것은 그 위치에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 동일한 경우이다. 이러한 위치 동일성의 총 수는 그 후 참조 서열에 존재하는 뉴클레오타이드 또는 잔기의 총 수로 나누면 서열 동일성 %가 수득된다. 서열 동일성은 공지된 방법으로 쉽게 계산할 수 있으며, 그 예로는 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), 이 문헌들의 교시는 본원에 참고인용된다]에 기술되어 있는 것이 포함되지만, 이들에만 국한되는 것은 아니다. 서열 동일성을 측정하는 바람직한 방법은 검사되는 서열들 간에 최대 정합을 제공하도록 설계한다. 서열 동일성을 측정하는 방법은 주어진 서열들 간에 서열 동일성을 측정하는 공시된 컴퓨터 프로그램으로 코딩되어 있다. 이러한 프로그램의 예로는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990))를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 출처(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), 이들의 교시는 본원에 참고인용되고 있다)에 공시되어 있다. 이 프로그램들은 주어진 서열과 참조 서열 간에 최고의 서열 동일성을 나타내기 위해 디폴트 갭 가중치(default gap weight)를 이용하여 서열들을 최적으로 정렬한다. 한 예시로서, 참조 뉴클레오타이드 서열과 "서열 동일성"이 적어도, 예컨대 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%인 뉴클레오타이드 서열을 보유한 폴리뉴클레오타이드란, 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열이, 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조 뉴클레오타이드 서열의 각 100개 뉴클레오타이드 당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것 외에는 참조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 환언하면, 참조 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 동일성이 있는 뉴클레오타이드 서열을 보유한 폴리뉴클레오타이드에서, 참조 서열에 있는 뉴클레오타이드의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더 더욱 바람직하게는 5% 이하가 결실되거나, 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있고, 또는 참조 서열에 있는 총 뉴클레오타이드의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하의 다수의 뉴클레오타이드가 참조 서열에 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 돌연변이는 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 나타나거나, 또는 두 말단 위치 사이에 임의의 위치에서, 참조 서열 중의 뉴클레오타이드 간에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 근접 그룹으로 산재하여 나타날 수 있다. 이와 유사하게, 주어진 아미노산 서열이 참조 아미노산 서열과 적어도, 예컨대 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 서열 동일성이 있는 폴리펩타이드란, 폴리펩타이드의 주어진 아미노산 서열이 참조 아미노산 서열의 각 100개 아미노산 당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있는 것 외에는 참조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 환언하면, 참조 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 서열 동일성이 있는 주어진 폴리펩타이드 서열을 수득하기 위해, 참조 서열에 있는 아미노산 잔기의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더 더욱 바람직하게는 5% 이하가 결실되거나, 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 또는 참조 서열에 있는 총 아미노산 잔기 수의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하의 다수의 아미노산이 참조 서열에 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 돌연변이는 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 나타나거나, 또는 두 말단 위치 사이에 임의의 위치에서, 참조 서열 중의 잔기들 간에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 근접 그룹으로 산재하여 나타날 수 있다. 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의해 상이한 것이 바람직하다. 하지만, 보존적 치환은 서열 동일성 측정 시 정합으로서 포함되지 않는다.
"북미 주요 웨스트 나일 바이러스" 균주 및 분리주란 용어는 문헌[Phylogenetic Analysis of North American West Nile Virus Isolates , 2001-2004: Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype, C. Todd Davis, et al., Virology 342, p.252-265(2005), 이의 교시와 내용은 본원에 참고인용된 것이다]에서와 같이 정의된 균주 또는 분리주를 의미한다. 본원에 명시된 것처럼, 북미 주요 WNV 균주 또는 분리주는 WN99 분리주와 하나의 아미노산 변화를 산출하는 적어도 1개의 뉴클레오타이드 변화를 보유한다. 균주 NY99(GenBank 등록번호 AF196835)(한 예가 서열번호 23에 제시되어 있다)는 균주 또는 분리주가 북미 주요 균주인지를 측정하는 참조 균주로 작용한다. 바람직한 양태에서, 뉴클레오타이드 변화는 균주 또는 분리주의 엔벨로프 단백질의 아미노산 변화를 초래하고, 더욱 바람직하게는, 뉴클레오타이드 변화는 중요한 엔벨로프 단백의 위치 159에서 발린의 알라닌으로의 아미노산 변화 또는 "E159"를 초래한다. 이러한 아미노산 변화는 중간 숙주, 즉 모기에서의 복제능 증가와 관련이 있는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 균주 또는 분리주는 하나 이상의 사일런트 아미노산 변화를 보유할 수 있다. 바람직하게는, 북미 주요 균주는 위치 1442 및 2466(북미 균주, 예컨대 NY 99 및 서열번호 23과 비교 시)에서 U에서 C로의 돌연변이와 C에서 U로의 돌연변이를 (바람직하게는 둘 다) 포함한다. 더욱 바람직하게는, 북미 주요 균주 또는 분리주는 추가로 E 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이 및 NS5 단백질을 암호화하는 서열의 위치 9352에서 C에서 U로의 돌연변이를 포함한다(또 다시 북미 균주, 예컨대 NY 99 및 서열번호 23과 비교 시). 이러한 바람직한 돌연변이는 실시예 10 및 도 10 내지 17에 특정 영역에 대해 상세하게 나타내고 있다. 대표적인 북미 주요 WNV 균주는 본 명세서에 열거된다. 또한, 본 발명의 목적 상, 북미 주요 균주와 WN02는 호환 사용된다.
본 발명의 목적 상, Horse Origin 2005 균주 북미 말 E159, E159(Horse Origin), NAEE159, 미국 농무부 분리주(United States Department of Agriculture Isolate) 405330(USDA 2005) Horse Origin, 및 E159 균주는 호환 사용된다. 본 발명의 목적 상, Donkey Origin 2004 균주, 미국 농무부 분리주 292206(USDA 2004) Donkey Origin, E159(Donkey Origin) 및 북미 당나귀 E159(NADE159)는 호환 사용된다. E159는 전술한 바와 같이 발린에서 알라닌으로의 엔벨로프 단백질의 아미노산 변화가 위치 159에서 일어난 것을 나타낸다.
웨스트 나일 바이러스 균주 또는 분리주는 본 발명의 목적 상, 말 및 말 웨스트 나일 바이러스 균주에 국한되지 않고, 새 기원, 당나귀 기원, 돼지 기원, 사람 기원, 포유동물 기원 및 말 기원의 웨스트 나일 바이러스 균주를 포괄하며, 여기에도 국한되지 않는다.
본 발명의 목적 상, "균주" 및 "분리주"란 용어는 동일한 의미로서, 호환 사용된다.
본 발명에 사용된 "약제학적으로" 또는 "수의학적으로 허용되는 담체" 또는 "약제학적 담체"는 임의의 모든 용매, 성장 매질, 분산 매질, 코팅제, 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함한다.
"면역원성 또는 면역학적 조성물"은 당해 조성물 또는 백신에 대한 세포-매개 및/또는 항체-매개의 면역 반응인 숙주의 면역학적 반응을 도출하는 적어도 하나의 항원을 포함하는 당해의 조성물을 의미한다. 보통, "면역학적 반응"은 당해의 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 감마-델타 T 세포의 생산 또는 활성화와 같은 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질환의 임상 중증도가 감소하도록 치료적 또는 방어적 면역학적 반응을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 방어는 감염된 숙주에 의해 보통 나타나는 임상 징후의 감소 또는 결여, 더 빠른 회복 시간 및/또는 감염 숙주의 조직, 체액 또는 분비물에서 검출되는 임상 질환의 기간 단축 또는 바이러스 항체 역가의 증가, 또는 혈액 중의 바이러스혈증 경감, 또는 감염으로 인한 육안적 또는 조직병리학적 병변의 경감에 의해 입증될 것이다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물 및 백신 조성물은 하나 이상의 수의학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "수의학적으로 허용되는 담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 세포 배양 배지 및 세포 배양 성분, 코팅제, 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함한다. "희석제"는 물, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장제는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함한다.
본 발명의 목적 상, 웨스트 나일 바이러스의 "임상 징후"로는 뇌염, 바이러스혈증, 식욕감퇴, 우울, 열병, 쇠약, 걸음걸이 이상, 뒷다리 마비, 시력 손상, 운동실조, 목적 없는 방랑, 경련, 삼키지 못함, 혼수, 후부 쇠약, 마비, 조화 불량, 우울 및 관련 행동, 진전, 경련, 사지의 패들링(paddling), 신경학적 문제, 중추신경계의 팽창, 사망 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 감염된 동물이 나타내는 임상 징후는 감염 중증도에 따라 달라진다.
본 발명의 목적 상, 말 헤스페스 바이러스의 "임상 징후"로는, 유산, 신경학적 결함, 호흡기 질환, 생식계 결함 및 손상, 및 중추신경계 관련 증상들을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, EHV1의 임상 증상으로는, EHV1 감염된 망아지가 나타내는 호흡기 합병증, 무리 중의 늙은 구성원으로의 바이러스의 전파로 나타내는 유산을 비롯한 생식기 결함, 및 보통 중추신경계에서 나타나는 신경학적 결함을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 목적 상, 동부 말 뇌척수염, 서부 말 뇌척수염 및 베네수엘라 말 뇌척수염의 "임상 징후"는 보통 뇌척수염과 관련이 있는 것으로 알려진 증상, 예컨대 열병, 신경과민 징후들, 예컨대 소리에 대한 과민, 흥분 기간 및 부산함, 뇌 병변, 졸음, 처진 귀, 빙글빙글 돌기, 걸음걸이 이상, 마비, 식욕상실, 우울, 머리 압박, 조화 부족, 장기간 장애, 뇌손상, 사망 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 "안전성"은 백신 바이러스의 독성으로의 잠재적 복귀 및 백신 투여 부위에 허용하기 어려운 염증 또는 지속적인 전신 병과 같은 임상적으로 유의적인 부작용을 이에 국한됨이 없이 포함하는 백신접종 후 백신접종한 동물의 역효과의 부재를 의미한다.
본 명세서에서 언급된 바와 같은 "임상 징후의 발생률 및/또는 중증도의 감소" 또는 "임상 증상의 발생률 및/또는 중증도의 감소"는 야생형 감염과 비교하여, 그룹 내 감염 동물의 수의 감소, 감염의 임상 징후를 나타내는 동물 수의 감소 또는 소멸, 또는 동물에 존재하는 임의의 임상 징후들의 중증도 경감을 의미한다. 예를 들어, 본원의 실험에서, 이러한 임상 징후로는 바이러스혈증, 열병, 항체 반응 및 조직병리학을 포함했다. 이것은 본 발명의 조성물을 투여받은 동물에서, 감염되기 시작할 수 있는 백신접종을 받지 않은 동물에 비해 적어도 10% 감소하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 임상 징후는 본 발명의 조성물을 투여받은 동물에서 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 50% 감소하는 것이 좋다.
본 명세서에 사용된 "면역 지속기간"은 동물이 바이러스 감염으로부터 비교적 면역성이고/이거나 본 명세서에 기술된 바와 같은 임상 징후들의 발생률 및/또는 중증도의 감소로부터 혜택을 볼 정도로 면역원성 반응을 생산하는 최소 일수를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "균주" 및 "분리주"란 용어는 호환 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "백신" 및 "면역원성 조성물"은 호환 사용될 수 있다.
임의의 웨스트 나일 바이러스 균주(들) 또는 분리주(들)는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 분리주는 New York(북동 북미) 분리주(WN-NY99), Horse Origin, 1999, New York(북동 북미) 분리주(WN-NY 99), Crow Origin, 1999, 미국 농무부 분리주 292206(USDA 2004), Donkey Origin, 미국 농무부 분리주 405330(USDA 2005), Horse Origin, 북미 분리주(WN-Texas-2002/2003), 남동 텍사스 해안가 분리주 2002, Mexico(Tabasco) 분리주 2003 및 이들의 조합물 중 하나 이상으로부터 선택되는 것이며, 및 더욱 바람직한 양태에서 분리주는 미국 농무부 분리주 292206(USDA 2004), Donkey Origin, 미국 농무부 분리주 405330(USDA 2005), Horse Origin, 북미 분리주(WN-Texas-2002/2003), 남동 텍사스 해안가 분리주 2002, Mexico(Tabasco) 분리주 2003 및 이들의 조합물 중 하나 이상으로부터 선택된다. 가장 바람직한 양태에서, 분리주는 미국 농무부 405330(USDA 2005), Horse Origin 단독이거나 또는 전술한 하나 이상의 분리주와의 조합물인 것이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 북미 웨스트 나일 바이러스 분리주의 일부인 분리주가 포함된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 북미 주요 웨스트 나일 바이러스 분리주가 포함된다. 전술한 것 외에도, 구체적인 분리주로는, WN02 및 WN NY99 분리주로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 초래하는 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 더 더욱 바람직하게는 적어도 3개의 뉴클레오타이드 변화를 보유하는 분리주를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니고, 가장 바람직한 것은 엔벨로프 단백질의 위치 159에서 발린으로부터 알라닌으로의 아미노산 변화를 보유한 균주이다. 가장 바람직한 북미 주요 균주로는 NY2002Nassau, NY2002Clinton, NY2002Queens, GA20021, GA20022, TX20021, TX20022, IN2002, NY2003Albany, NY2003Suffolk, NY2003Chatauqua, CO20031, CO20032, TX2003, TX2003Harris4, TX2003Harris6, TX2003Harris7, TX2003Harris10, AZ2004 및 TX2004Harris4, 및 이들의 조합물을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물에 유용한 웨스트 나일 바이러스의 균주는 임의의 균주 또는 분리주일 수 있다. 바람직한 양태에서, 사용된 북미 주요 웨스트 나일 바이러스 균주는 E-159(Horse Origin) 또는 E-159(Donkey Origin)이다. 이러한 북미 주요 WNV 균주의 대표 균주로는 부다페스트 조약 하에 2008년 8월 14일에 ATCC(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 기탁된 Horse Origin 2005 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9409)를 포함한다. 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물에 유용한 말 인플루엔자 균주는 임의의 균주 또는 분리주일 수 있다. 대표적인 균주로는 Equi-2/Ohio/03(ATCC 수탁번호 PTA-9522), Equi-2/Kentucky/95(ATCC 수탁번호 PTA-9523), 및 Equi-2/New Market/2/93(ATCC 수탁번호 PTA-9524)를 포함한다. 대표적인 균주 ATCC 수탁번호 PTA-9522, PTA-9523 및 PTA-9524는 부다페스트 조약에 따라 2008년 9월 23일에 ATCC(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 각각 기탁되었다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물에 유용한 말 헤르페스 바이러스("EHV") 균주는 임의의 균주 또는 분리주일 수 있다. 대표적인 균주로는 EHV 서브타입 1(ATCC 수탁번호 PTA-9525) 및 EHV 서브타입 4(ATCC 수탁번호 PTA-9526)를 포함한다. 대표적인 균주 ATCC 수탁번호 PTA-9525 및 PTA-9526은 각각 부다페스트 조약에 따라 2008년 9월 23일에 ATCC(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 기탁되었다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물에 유용한 서부 말 뇌척수염 균주는 임의의 균주 또는 분리주일 수 있다. 대표적인 균주로는 부다페스트 조약에 따라 2008년 8월 14일에 ATCC(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 ATCC 수탁번호 PTA-9410으로 기탁된 Fleming 균주가 포함된다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물에 유용한 베네수엘라 말 뇌척수염 균주는 임의의 균주 또는 분리주일 수 있다. 대표적인 균주로는 부다페스트 조약에 따라 2008년 8월 14일에 ATCC(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 ATCC 수탁번호 PTA-9411로 기탁된 TC-83 균주가 포함된다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물에 유용한 동부 말 뇌척수염 균주는 임의의 균주 또는 분리주일 수 있다. 대표적인 균주로는 부다페스트 조약에 따라 2008년 8월 14일에 ATCC(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 ATCC 수탁번호 PTA-9412로 기탁된 NJO 균주가 포함된다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물에 유용한 파상풍 톡소이드 균주는 임의의 균주 또는 분리주일 수 있다. 대표적인 균주는 매사추세츠주 보스턴에 소재하는 The Massachusetts Department of Public Health Institute of Laboratories에서 입수한 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani) 원종균(master seed)으로부터 채취한 것이다.
본 발명의 백신은 임신 어미를 비롯한 임의의 연령 및 임의의 생식 단계의 WNV 민감 종, 특히 말과(equidae)에게 투여하기에 안전하다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 12월령 이상의 망아지에게 투여하기에 안전하고, 더욱 바람직하게는 10월령 이상의 망아지에게 투여하기에 안전하며, 더욱 바람직하게는 8월령 이상의 망아지에게 투여하기에 안전하고, 더욱 바람직하게는 6월령 이상의 망아지에게 투여하기에 안전하며, 더욱 바람직하게는 4월령 이상의 망아지에게 투여하기에 안전하고, 더욱 바람직하게는 2월령 이상의 망아지에게 투여하기에 안전하며, 더욱 바람직하게는 1월령 이상의 망아지에게 투여하기에 안전하고, 더 더욱 바람직하게는 1일령 내지 1월령 사이의 망아지에게 투여하기에 안전하고, 가장 바람직하게는 1일령 이상의 망아지에게 투여하기에 안전하다.
본 발명의 조성물은 임의의 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 투여 방법의 예로는 면역원성 조성물에 면역계 세포의 접근을 허용하는 임의의 방법, 예컨대 경구, 경피/피내, 정맥내, 피하, 근육내, 안구내, 복강내, 직장내, 질내, 비내, 위내, 기관내, 폐내 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 바람직한 양태에서, 백신은 비경구, 바람직하게는 비내, 피하, 또는 근육내 투여하며, 가장 바람직한 양태에서, 백신은 근육내 투여한다.
도 1은 평균 총 임상 점수를 그래프로 도시한 것이다;
도 2는 방출 비율을 그래프로 도시한 것이다;
도 3은 콧물 점수를 그래프로 도시한 것이다;
도 4는 바이러스 방출 비율을 그래프로 도시한 것이다;
도 5는 결막염 점수를 그래프로 도시한 것이다;
도 6은 혈청 중화 역가를 그래프로 도시한 것이다;
도 7은 EHV-1에 대한 양성 비율을 그래프로 도시한 것이다;
도 8은 평균 백혈구 계수를 그래프로 도시한 것이다;
도 9는 양성 비율(발열)을 그래프로 도시한 것이다.
도 10은 WNV 분리주의 HE 영역에 대한 뉴클레오타이드 정렬이다;
도 11은 WNV 분리주의 DE 영역에 대한 뉴클레오타이드 정렬이다;
도 12는 WNV 분리주의 D NS5 영역에 대한 뉴클레오타이드 정렬이다;
도 13은 WNV 분리주의 H NS5 영역에 대한 뉴클레오타이드 정렬이다;
도 14는 WNV 분리주의 H WN05 E NS5 영역에 대한 뉴클레오타이드 정렬이다;
도 15는 WNV 분리주의 H WN05 영역에 대한 뉴클레오타이드 정렬이다;
도 16은 WNV 분리주의 NS5 영역에 대한 뉴클레오타이드 정렬이다;
도 17은 WNV 분리주의 E 영역에 대한 뉴클레오타이드 정렬이다.
실시예
이하 실시예는 본 발명의 구체적 양태를 예시하는 것이다. 이러한 실시예는 단지 예시용이며 본 발명의 범위 또는 기본 원리를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명에 따른 바람직한 백신 조성물을 예시한다.
재료 및 방법
작업 세포 스톡을 제조하기 위해, 순도, 동일성 및 핵형에 대해 검사된, 웨스트 나일 바이러스를 전파시키는 것으로 알려진 베로(Vero) 세포주로 구성된 마스터 세포 스톡(MCS)을 해동하여 T25 내지 최고 T150㎠ 용기 또는 1050㎠ 회전병 또는 생물반응기 또는 다른 적당한 멸균 용기에 접종하는데 사용했다. 해동한 세포는 용기 용적에 따라 용기당 0.0015 ml 내지 5.0L의 비율로 증식 배지에 현탁시켰다. 그 다음, 세포를 최고 7일까지 36 내지 38℃에서 항온배양했다. 동결 스톡으로부터 파종된 배양물에는 필요하면 잔류 DMSO를 없애기 위해 파종 후 36시간 이내에 배지를 재공급했다. 배양물은 증식 기간 동안 과량의 파편을 제거하거나, 융합성에 도달하지 않은 배양물의 증식을 자극하거나, 또는 융합성 배양물의 생육능을 유지하기 위해 필요한 경우 배지를 재공급했다.
세포는 소모된 배지를 버린 후 용기 용적에 따라 각 용기에 0.25% 트립신-EDTA, 용액 5 내지 500 ml를 첨가하여 1 내지 20회 계대배양했다. 용기는 세포가 표면에서 벗겨질 때까지 천천히 교반했다. 그 다음, 증식 배지로 세정하여 용기로부터 세포를 분리하여 함께 모았다. 접종 전에, 세포 증식 배지는 융합성이 적어도 55%인 베로 작업 세포로부터 제거했다. 전술한 바이러스 증식 배지를 1㎠ 표면적 당 0.15 내지 0.4ml씩 각 용기에 첨가했다. 적어도 2개의 대표 용기를 세포 계수하여 측정한 바와 같이 감염다중도(MOI)는 0.000001 내지 0.0002로 하여 감염에 사용했다. 감염된 회전병 배양물은 0.1 내지 0.8 rpm에서 2 내지 5일 동안 36 내지 38℃에서 배양했다.
증식 기간 동안 배양물은 전형적인 CPE에 대해 현미경으로 점검하고 전체 오염에 대해 육안으로 점검했다. 부적합한 배양물은 멸균 후 버렸다. 배양물은 표준 기술로 약독화하거나 또는 약독화 없이 사용할 수 있다.
그 후, 미생물은 생산 목적을 위해 수거했다. 바이러스액은 CPE가 85% 이상 도달했을 때 수거했다. 회전병은 느슨한 세포를 제거하기 위하여 회전시키고, 액을 정화에 적당한 멸균 2 내지 20L 유리, 플라스틱 또는 PETG 병, 20L 멸균 폴리프로필렌 용기 또는 2 내지 500L 멸균 스테인리스 스틸 탱크 용기에 모았다.
다음으로, 산물을 제조했다. 정화된 액은 포름알데하이드 용액 USP 0.2 용적%, 또는 다른 유효 불활성화제로 불활성화시키고, 제2 용기로 옮긴 뒤, 48시간 동안 교반하면서 20 내지 25℃(실온)에 유지시켰다. 불활성화된 액은 적어도 12ml 샘플을 취하여 농축하기 전에 불활성화 확인 검사(이하 기술됨)를 수행했다. 불활성화가 완료된 후, 불활성화된 분획(lot) 물질은 농축 전 최고 60일 동안 2 내지 7℃에서 보관했다. 백신 제형에는 다수의 적당한 보강제를 첨가할 수 있으며, 가장 바람직한 것은 비대사성 오일, 바람직하게는 광유 및/또는 카르보머이다. 보강제 및/또는 수거한 바이러스 항원과 함께 다른 성분의 혼합, 블렌딩, 미세유체화(microfluidization) 및 유화와 같은 일반적인 가공처리 단계를 이용할 수 있다.
그 다음, 산물은 표준화했다. 충분한 용적의 정화, 불활성화, 농축(경우에 따라)된 분획을 최종 산물에 존재하는 각 균주의 계산 역가가 용량당 적어도 104.0TCID50이 되도록 배합했다. 용량당 역가 요구를 달성하기 위해 다수의 분획을 블렌딩할 수도 있다.
산물은 그 다음 최종 제형에 집합시켰다. 원하는 최종 연속 용적을 기준으로, 항원 성분, 보강제, 안정제 및 희석제의 양은 다음과 같이 계산했다:
a. 웨스트 나일 바이러스, Horse Origin 2005(ATCC PTA-9409): 최소 104.0TCID50/용량
b. 보강제: 연속물에 총 보강제, 바람직하게는 비대사성 오일, 더욱 바람직하게는 광유 및/또는 카르보머의 농도는 적어도 10 v/v%이고 연속 회분식배양/집합 시기에 첨가한다.
c. 희석제: 최종 용적을 바람직한 용적으로 만들기 위해 적당한 용적의 인산염완충 식염수(PBS)를 첨가한다.
d. 추가 포르말린: 적당한 수준을 유지하기 위해 37% 포르말린의 적당한 용적을 첨가한다.
e. 젠타마이신 설페이트
필요한 양의 보강제와 PBS를 멸균 용기에서 배합했다. 이 혼합물의 pH는 필요하다면 10N NaOH 또는 5N HCl로 약 4.9 내지 5.1로 조정했다. 정화, 사멸, 농축된 웨스트 나일 바이러스, 뿐만 아니라 젠타마이신 및 포르말린을 첨가하고, pH를 6.9 내지 7.1로 조정했다. 이것을 2 내지 6℃에서 적어도 8시간 동안, 48시간은 넘지 않게 혼합했다.
백신은 통상의 피하 주사로 투여했고, 필요하다면 추가 백신접종도 실시했다. 초기 용량과 추가 용량은 21일 간격으로 근육내 투여한 1ml 용량인 것이 가장 바람직하다. 초기 용량 및 추가 용량의 백신접종 요법은 WNV 감염의 발생률 및/또는 임상 징후의 중증도를 감소시키고, 바람직하게는 WNV에 의한 감염을 예방하고, 또한 백신접종 후 장기간 동안 웨스트 나일 바이러스 감염으로 인한 질환을 예방하기 위해, 가장 바람직한 1ml 용량 용적으로 말, 다른 말과, 및 다른 WNV 민감 종에게 투여했다.
결과 및 고찰
백신은 순수 및 수동 항체를 보유한 동물을 비롯하여 WNV에 대한 다양한 면역학적 상태의 동물에게 다양한 적당한 비경구 경로, 용량 용적 및 용량 요법으로 투여했고, 백신접종 후 2년 이상의 긴 면역 지속기간을 제공했다. 백신은 임의의 연령과 임의의 생식 단계인 WNV 민감 종, 특히 말과, 예컨대 임신 어미에게 투여하기에 안전했다.
실시예 2
본 연구는 웨스트 나일 바이러스(WNV)로의 항원공격으로부터 말을 방어하는 백신의 효능을 평가하기 위해 수행했다.
재료 및 방법
총 30마리의 말을 각각 15마리씩의 그룹으로 무작위로 나누었다. 총 20마리의 말에게 21일 간격으로 2회 용량의 백신을 투여하고, 10마리의 말은 대조군으로 사용했다. 각 그룹의 말, 블록 1과 블록 2에는 각각 10마리의 백신접종군 말과 5마리의 대조군 말이 포함되었다. 백신은 WNV 항원, 구체적으로 불활성화 또는 사멸된 북미 주요 WNV 균주, Horse Origin 2005(ATCC 수탁번호 PTA-9409)뿐 아니라, 대략 다음과 같이 제형화된 베네수엘라 말 뇌척수염, TC-83 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9411), 동부 말 뇌척수염 NJO 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9412), 서부 말 뇌척수염 Fleming 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9410) 및 파상풍 톡소이드의 항원성 성분을 포함하는 조합물이다:
동부 말 뇌척수염 106.7-109.2TCID50/ml
서부 말 뇌척수염 106.7-109.2PFU/ml
베네수엘라 말 뇌척수염 106.7-109.2TCID50/ml
웨스트 나일 바이러스 107.0-109TCID50/ml
파상풍 톡소이드 5-10 CPU/ml
보강제 100-200 ㎕/ml
희석제 - DMEM 함유 q.s.
젠타마이신(30 ㎍/ml 희석제 용적)
포름알데하이드(희석제 용적의 0.1%)
모든 그룹에게 WNV의 이종 균주(NY99, 4132, 까마귀 분리주) 약 105 pfu를 함유하는 PBS 1ml를 척수강내 접종하여 항원공격했다. 항원공격은 케타민-자일라진 마취 하에 수행했다.
말은 최대 14일 동안 모니터한 후, 인도적으로 안락사시켰다. 14일 전에 심한 질환이 발생한 말은 조기에 안락사시켰다.
백신의 효과를 평가하기 위해 다음과 같은 데이터를 수집했다:
· 기본 임상 평가
· 체온
· 바이러스혈증 분석
· 조직병리학: 뇌간의 두 구역을 수의병리학자 전문의가 평가했다.
적당한 날에 수집한 혈청은 항원공격에 대한 혈청반응의 특성을 규명하기 위해 평가했다.
결과 및 고찰
항원공격 후 바이러스혈증 및 혈청 중화 역가는 본 연구의 1차 결과 변수로 고려되었다. 백신접종한 제1 블록의 말은 본 연구에서 항원공격 후에 바이러스혈증으로부터 100% 방어되었다. 이에 비해, 5마리의 대조군 말 중 4마리는 항원공격 후 4 내지 5일 동안 바이러스혈증을 나타냈고, 5마리 대조군 말 중 1마리는 1 시점에 바이러스혈증을 나타냈다. 또한, 백신접종한 말의 혈청 중화 역가는 백신접종 후 조사한 각 시점에서 대조군 말보다 통계상 유의적으로 높았다. 또한, 본 데이터는 1:4 이상의 혈청 중화 역가를 제공하는 WNV 백신이 WNV 바이러스혈증을 방어하는데 효과적이라는 것을 증명한다. 블록 1의 항원공격후 바이러스혈증 및 혈청 역가는 이하 표 1에 정리했다:
Figure pct00001
항원공격 후 바이러스혈증 및 혈청 중화 역가는 또한 본 연구의 제2 블록의 말에서도 1차 결과 변수로 고려되었다. 제2 블록의 말에서는 한 백신접종 그룹의 말만이 항원공격 기간 동안 모든 시점에서 바이러스혈증을 나타냈다. 이 말은 3번의 아침(같은 저녁은 아님)에 3번의 다른 시점에서 최소 판독값 5를 나타냈다(여기서, <5는 음성이다). 본 연구에서 모든 대조군 말(단, 일찍 본 연구를 마쳤지만 결정적인 WNV 조직병리학을 나타내 평가에서 제외된 한 말은 제외한다)은 항원공격 후 1 내지 8 시점에서 높은 수준의 바이러스혈증을 나타냈다.
바이러스혈증은 WNV 뇌염을 유발하기 위해 바이러스가 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있기 전의 선행조건이므로, 바이러스혈증은 이러한 종류의 실험 연구에서 방어를 평가하는 1차 파라미터로서 충분한 근거가 된다.
본 연구는 4 내지 5월령의 망아지에게 투여한 실험용 복합 백신의 2회 용량이 방어적 혈청학적 혈청 중화 역가를 효과적으로 믿을만하게 자극했다는 것을 보여주었다. 또한, 데이터는 본 실험용 복합 백신에서 유효 회분적 항원량의 웨스트 나일 바이러스를 이용한 백신접종으로부터 산출되는 1:4 정도의 낮은 백신접종후 SN 역가가, 웨스트 나일 바이러스의 이종 균주로 심한 척수내 항원공격 후에 바이러스혈증, 임상 질환 및 조직병리학으로부터 백신접종된 말을 방어했다는 것을 확인시켜준다.
또한, 조직병리학은 독성 웨스트 나일 바이러스로 항원공격을 받은 대조군 동물에서의 병변의 가능성보다 블록 1에서는 100% 적고, 블록 2에서는 40% 적은 백신접종군에서의 병변 가능성을 나타내어 두 그룹이 서로 달랐다.
또한, 대조군 말은 항원공격 후 9일째 뒷다리가 약해지기 시작하여 점점 심각해져 더 이상 서있을 수 없게 되었다. 이 말의 뇌교와 연수의 조직병리학은 WNV 병리 상태와 일치하는 심한 뇌염과 척수염을 나타냈고, 이것은 본 연구의 어느 다른 말의 질환의 징후보다 훨씬 우세했다.
제2 블록의 2마리 대조군 말은 본 연구에서 웨스트 나일 바이러스 감염에 관련된 임상 징후를 각각 3일째 나타냈다. 다른 한 대조군 말은 질병으로 인한 쇠약의 한 시점을 나타냈다. 다른 대조군은 어떤 시점에서도 임상 징후를 나타내지 않았으나, 수일 후 바이러스혈증을 나타냈다. 본 연구에서 백신접종된 블록 2 말은 여러 마리가 WNV의 척수강내 항원공격의 결과로서 조직에 경미하거나 중간 정도의 조직병리학적 변화를 나타냈지만, 한 백신접종 군에서는 2마리 대조군 말에서의 임상 질환의 여러 일 및 제3 대조군 말에서의 임상 질환의 하루와 비교했을 때, 한 연구일에 매우 경미한 임상 질환(경미한 머리 진전)만이 주목되었다.
이 결과들은 당해 백신이 효과적이고 백신이 투여된 동물에서 면역원성 반응이 유도된다는 것을 입증했다. 백신의 유효성은 본 실시예에서 WNV 바이러스혈증의 감소, WNV에 대한 고 혈청 중화 역가의 자극 및 뇌와 뇌막에서 WNV 관련 임상 징후 및 조직병리학의 예방에 의해 입증되었다. 이 백신은 장기 지속적인 비대사성 보강제를 포함하는 독특한 구성성분을 포함하기 때문에, 소량의 1ml 용량 용적으로 제형화하여, 최근 기원이고 유행병학적 우세성이 높은 고 면역원성 저 계대 전체 불활성화된 바이러스 WNV 분리주 및 감염된 말의 조직에서 분리된 WNV로서 고도의 안전성을 제공했고, 이것은 시중에서 입수할 수 있는 다른 백신보다 더욱 포괄적인 안전성과 유효성을 제공한다. 또한, 동물에게 투여했을 때 안전한 백신을 제공하는 효과가 있다.
실시예 3
본 실시예는 EHV-4에 의한 감염에 대하여 본 발명의 면역원성 조성물의 효능을 예시한 것이다.
재료 및 방법
4 내지 5월령의 37마리의 말을 본 연구에 사용했다. 말은 난수발생기(random number generator)로 백신접종군 또는 대조군으로 무작위로 할당한 뒤, 백신접종했다. 24마리 말은 백신접종군으로 작용했고, 13마리 말은 거짓-백신접종된 대조군 말로 사용했다. 모든 말은 감염에 민감한 말을 시사하는, 연구 개시 전에 낮은(≤1:14, 평균 = 1:7) EHV-4 혈청 중화(SN) 역가를 나타냈다. 사용된 백신은 실험용 백신으로, 다음과 같은 성분을 보유했다:
최종 제형화된 백신은 용량 1ml당 다음과 같은 성분을 함유한다:
EHV-1(PTA-9525) 107.0-9.0TCID50/ml
인플루엔자 A2/Ohio/03(PTA-9522) 106.0-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/KY/95(PTA-9523) 106.0-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/NewMarket/2/93(PTA-9524) 106.0-9.5TCID50/ml
파상풍 톡소이드 5-10 CPU
동부 말 뇌척수염(ATCC 수탁번호 PTA-9412) 106.7-9.2TCID50/ml
서부 말 뇌척수염(ATCC 수탁번호 PTA-9410) 106.7-9.2PFU/ml
베네수엘라 말 뇌척수염(ATCC 수탁번호 PTA-9411) 106.7-9.2TCID50/ml
웨스트 나일 바이러스, Horse Origin 2005
(ATCC 수탁번호 PTA-9409) 107.0-9.0TCID50/ml
보강제 100-200㎕
글리세롤 100-200㎕
EDTA 240mM 용액 10-20㎕
희석제 - DMEM 함유 q.s.
젠타마이신(희석제 용적 ml당 30㎍)
포름알데하이드(희석제 용적의 0.1-0.2%)
실험용 백신은 백신접종 그룹의 24마리 말 각각에게 1ml 용량 용적으로 근육내 투여했다. 대조군의 13마리 말에게는 항원없이 9-웨이(way) 백신에 사용된 부형제(젠타마이신 및 포름알데하이드)를 함유하는 보강된 DMEM(Lot 004)을 1ml 용량으로 투여했다. 독성 EHV-4 HRA005 균주 바이러스의 항원공격 접종은 추가 백신접종 후 15일째 수행했다.
백신접종군 말과 대조군 말은 각각 EHV-4 바이러스 균주(HRA005)로 항원공격했다. 희석된 항원공격 바이러스의 역가는 비-백신접종된 말에서 EHV 감염이 나타나므로, 질병을 유발하기에 충분했다.
진정제이자 진통제인 Sedivet®(로미피딘 염산염)은 체중 kg당 50㎍의 투약량으로 항원공격 전에 각 말에게 정맥내 투여했다. 각 말에게 그 다음 EHV-4 균주 HRA005 바이러스로 항원공격했다. 항원공격 바이러스는 말의 에어로마스크(AeroMask)(Trudell Medical International, Ontario, Canada) 내로 분무기에 의해 생산된 에어로졸로서 비내 투여했다.
항원공격일과 항원공격 후 14일 동안 37마리의 백신접종군 말과 대조군 말마다 보정된 전자식 온도계(GSA Electronics) 프로브를 이용하여 매일 아침 직장 온도를 기록했다. 직장 온도는 매일 화씨(℉)로 기록했다.
전혈액 세포 계수
37마리의 백신접종군 말 및 대조군 말로부터 항원공격일과 항원공격 후 14일 동안 매일 전혈액 계수를 위해 Vacutainer Disodium EDTA 관 내로 정맥 혈액을 수집했다.
비강 삼출물 평가
모든 비강 삼출물 평가는 비인강 면봉의 수집 전에 실시했다. 항원공격일 및 항원공격 후 14일 동안, 37마리의 백신접종군 말 및 대조군 말 각각의 비강 및 주둥이를 조사하여 이하에 기술된 등급화 및 평점에 대한 설명을 이용하여 등급을 매겼다.
0 내지 6의 평점 등급은 다음 각 분류에 표시된 바와 같이 질병의 중증도를 기준으로 평가했다:
임상 증상들에 대한 평점
평점 증상 설명 평점 시트 약칭
0 '본질적으로 정상'은 말이 깨끗하고 비강 삼출물이 본질적으로 없다는 것을 나타낸다. EN
1 질병이 있는 말과 정상 말에서 흔히 관찰할 수 있는 약간 투명한 묽은 콧물 C-1
2 보통 투명한 묽은 콧물은 일반적으로 관찰되는 것보다 용적의 분명한 증가를 나타낸다. C-2
3 질병에 걸린 말에서만 일반적으로 관찰되는 엄청난 묽은 투명 콧물 C-3
1.5 콧구멍 한쪽 또는 양쪽에서 점액이 분명하게 소량으로 존재한다는 것을 시사하는 매우 약간의 점액농즙성 콧물 VSM
2 콧구멍 한쪽 또는 양쪽에서 쉽게 관찰되는 콧물인 경미한 점액 농즙 SM
4 콧구멍 양쪽에서 점액성 콧물이 다량으로 존재하는 것을 시사하는 중간 점액 농즙 MM
6 콧구멍 양쪽에 엄청난 양의 점액성 콧물이 채워져 있음을 시사하는 심각한 점액 농즙 HM
비인강 바이러스 분리 방법
각 관찰 검사일에 각 백신접종군 및 대조군의 비강에서 멸균 면봉을 이용해 깊이 샘플링했다. 수집 후, 2개의 면봉 각각을 즉시 4ml의 냉각된 수송 매질(2% FBS, 2X Pen/Strep, 2X 젠타마이신, 및 2X 암포테리신 B가 보충된 둘베코 최소 필수 배지(DMEM))을 함유하는 단일 관에 넣었다.
바이러스 분리를 위해, 관을 혼합하고, 면봉을 무균 제거한 다음, 배지를 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 입자를 분리했다. 배지는 조직 배양 세포에 접종하기 전에 0.2μ 주사기 필터를 통해 여과했다. 정화된 수송 배지 1ml를 이용하여, 증식 배지를 무균 제거한 24웰 조직 배양판에서 증식된 1일된 ED 세포 2㎠ 단층에 접종했다. 접종 후, 5% CO2 대기를 함유하는 가습 항온배양기에서 37℃ 하에 1시간 동안 접종물을 세포 단층에 흡착시켰다. 흡착 기간 후, 재공급 배지(2-5% 소태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 3X 젠타마이신 및 2X 암포테리신 B를 함유하는 DMEM) 추가 1ml를 각 웰에 첨가했다. 재공급 배지를 첨가한 후, 평판을 CO2 항온배양기에서 37℃ 하에 항온배양했다. 각 검사군 및 대조군 조직 배양 웰은 EHV-4 항원공격 바이러스의 전형적인 세포변성 효과(CPE)의 징후에 대해 7일 동안 현미경으로 검사했다. 관찰 기간의 마지막 7일째 음성인 웰은 새로운 세포에 계대배양하고 추가 7일 동안 관찰했다.
혈청 중화 검사 절차
본 연구에는 표준 미세역가 혈청 중화 검사를 이용했다. 모든 혈청은 희석물당 5웰 및 5개의 검사 웰 각각에 8웰 희석 일련물을 이용하여 바닥이 편평한 멸균 미세역가 평판에 검사했다. 5개의 검사 웰 각각은 약 5 X 104 세포를 함유하는 새로 접종한 ED 세포 현탁액 150㎕ 및 지시 바이러스 25㎕와 혼합된 혈청 희석물 25㎕를 함유했다. 사용된 검사 지시 바이러스는 EHV-4 HRA005 Lot 033106 SN 스톡 바이러스였다. 모든 검사에서, 지시 바이러스 역적정 역가는 68-149 TCID50/25㎕ 사이였다. 혈청 중화 항체 역가는 Reed-Muench ID50 역가로 나타냈다.
검사를 수행하기 위해, 각 검사 혈청의 2배 희석물은 검사 혈청당 5개의 복제 웰 및 8웰 희석 연속물을 이용하여 바닥이 편평한 멸균 미세역가 평판에서 제조했다. 희석물은 멸균 미세역가 팁을 이용하는 용적 조정이 가능한 일채널 또는 다채널 피펫팅 기구로 제조했다. 5웰 각각의 제1 열에 첨가된 혈청 용적은 50㎕였다. 다른 모든 웰은 DMEM(FBS 무첨가) 25㎕를 함유했다. 평판 아래로 연속 희석 후, 마지막 열에서는 25㎕를 버렸다. 각 검사 웰에 소정의 희석률의 지시 바이러스 25㎕를 첨가했다. 그 다음, 평판을 혼합하고 5% CO2 하에 37℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 항온배양 기간 말에, 5 x 104 ED 세포를 함유하는 현탁액 150㎕를 각 검사 및 세포 대조군 웰에 첨가했다. 평판은 CO2 항온배양기에서 37℃ 하에 5 내지 7일 동안 항온배양하고, 이 후 EHV-4에 전형적인 CPE에 대해 평판을 현미경으로 조사했다. 하지만, 이 목적을 위해 종래 기술에 기술된 모든 검사 또는 다른 모든 공인된 검사를 이용할 수도 있다.
결과 및 결론
비강 삼출물 평가
상호작용 일별 백신접종군은 콧물 점수 면에서 통계적으로 유의적이었다(P<0.05, 표 1). 통계적으로 유의적인 군의 효과는 항원공격 후 6일 내지 10일과 14일째 관찰되었다(백신접종군에서 낮은 콧물 점수).
매일의 점수를 항원공격 후 기간 동안 합산했을 때, 백신접종군의 말의 점수는 대조군 말보다 총점이 더 낮았다(P<0.05, 표 1). 완화 분율(mitigated fraction)은 0.824로 추정되었다(95% ASE CI: 0.629, 1.000).
콧물 점수
대조군 백신접종군 P값 완화 분율
(95% ASE CI)
누적 콧물 점수 28.9 13.6 <0.0001 0.824 (0.629, 1.000)
결막염
상호작용 일별 백신접종군은 결막염 점수에 대해 통계적으로 유의적이었다. 통계적으로 유의적인 군의 효과는 항원공격 후 6일, 7일, 9일, 10일, 13일 및 14일에 관찰되었다(백신접종군은 6일 중 5일에서 점수가 낮았다, P<0.05, 도 2).
혈청학적 연구
역가는 통계분석 전에 log 변환했다. 상호작용 일별 백신접종군은 SN 역가 면에서 통계적으로 유의적이었다. 통계적으로 유의적인 군의 효과는 0일(백신접종 전; 대조군 역가 > 백신접종군 역가), 35일(항원공격일) 및 항원공격 후 7일과 14일(연구 42일 및 49일)에 관찰했다. 백신접종군의 말은 대조군의 말보다 35일, 42일 및 49일에 더 높은 역가를 나타냈다(P<0.05, 표 4).
Figure pct00002
백혈구 계수( WBC ) 및 림프구 계수
상호작용 일별 백신접종군은 WBC 및 림프구 계수 면에서 통계적으로 유의적이었다. 통계적으로 유의적은 군의 효과는 항원공격 후 4일 내지 6일(WBC) 및 4일과 5일(림프구)에서 관찰되었다. 백신접종군의 말은 EHV4 질병으로 인한 백혈구감소증으로부터 보호되었고 대조군보다 높은 WBC 및 림프구 계수를 나타냈다(P<0.05).
고찰 및 결론
본 연구에서, EHV-4 감염의 중간 정도의 적당한 임상 징후는 항원공격 후에 관찰되었다. 비강 삼출물의 임상 징후는 항원공격 후 6일 내지 10일과 14일째 백신접종된 말에서 훨씬 적게 관찰되었다. 결막염 점수는 항원공격 후 7일, 9일, 10일, 13일 및 14일에 백신접종된 말에서 훨씬 적었다. 항원공격 후 임상 징후가 적당히 보임에도 불구하고, 비강 면봉 샘플에서 바이러스 방출은 EHV-4 항원공격 후 드물었다. 비강 면봉은 세포 배양에서 바이러스 분리로 조사했다.
WBC 및 림프구에 대한 유의적인 군의 효과는 WBC 및 림프구 계수가 대조군 말보다 높게 나타나는 백신접종군 동물에서 4일 내지 6일(WBC) 및 4일과 5일(림프구)에 관찰되었다. 이 값들은 대조군 말은 헤르페스바이러스 감염으로 초래되는 면역억제로 병들어 사망한다는 것을 보여주고, 또한 EHV-1의 교차-방어 균주로의 백신접종은 백신접종된 말이 헤르페스바이러스 감염의 면역억제성에 더욱 굴절성이게 한다는 것을 입증한다. 또한, 백신접종 군의 말들은 대조군의 말들보다 35일, 42일 및 49일에 더 높은 혈청 중화 역가를 나타냈다.
본 연구의 데이터는 EHV-1을 함유하는 다성분 백신으로 백신접종된 말이 이종의 EHV-4 항원공격 유기체에 의한 항원공격을 받았을 때 교차-방어 면역을 나타낸다는 것을 확인시켜준다.
실시예 4
본 실시예는 본 발명의 복합 백신의 효능 및 면역 지속기간을 예증하기 위한 것이다.
재료 및 방법
본 연구에서 평가되는 백신에 사용된 인플루엔자 바이러스 항원은 MDCK(Madin Darby Canine Kidney) 세포에서 생산했다. 증식 후, 바이러스액은 여과하고, 포르말린 불활성화처리한 후 농축했다. 불활성화된 바이러스액은 불활성화 후 남아있는 생 바이러스에 대해 검사했다. 만족스러운 잔류 생 바이러스 검사를 끝내고, 불활성화된 바이러스액을 이용하여, 불활성화된 베네수엘라 TC-83 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9411), 동부, NJO 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9412) 및 서부, Fleming 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9410), 말 뇌척수염 바이러스, 불활성화된 EHV-1(ATCC 수탁번호 PTA-9525), 불활성화된 인플루엔자 A/말-2/Kentucky/95(ATCC 수탁번호 PTA-9523) 및 인플루엔자 A/말-2/NewMarket/2/93(ATCC 수탁번호 PTA-9524) 바이러스, 불활성화된 웨스트 나일 바이러스, Horse Origin 2005(ATCC 수탁번호 PTA-9409) 및 파상풍 톡소이드를 추가로 함유하는 백신을 제형화했다.
백신은 제품에 포함된 모든 항원마다 적당한 사양에 맞게 제형화했다. 인플루엔자 A/말-2/Ohio/03(ATCC 수탁번호 PTA-9522) 항원은 106.7 TCID50/ml의 불활성화전 역가로 백신에 첨가했다.
최종 제형화된 백신은 1ml 용량당 다음과 같은 성분을 함유한다:
EHV-1 107.0-9.0TCID50/ml
인플루엔자 A2/Ohio/03 106.7-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/KY/95 106.7-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/NewMarket/2/93 106.7-9.5TCID50/ml
파상풍 톡소이드 5-10 CPU
동부 말 뇌척수염 106.7-9.2TCID50/ml
서부 말 뇌척수염 106.7-9.2PFU/ml
베네수엘라 말 뇌척수염 106.7-9.2TCID50/ml
웨스트 나일 바이러스 107.0-9.0TCID50/ml
보강제(바람직하게는 광유) 100-200㎕
글리세롤 100-200㎕
EDTA 240mM 용액 10-20㎕
희석제 - DMEM 함유 q.s.
젠타마이신(30 ㎍/ml 희석제 용적)
포름알데하이드(희석제 용적의 0.1-0.2%)
4 내지 5월령의 26마리의 말을 본 연구에 사용했다. 15마리의 말은 백신접종군으로 사용하고 11마리의 말은 거짓-백신접종된 대조군 말로 사용했다.
백신은 백신접종군인 15마리 말 각각에게 1ml 용량으로 근육내 투여했다. 대조군인 11마리 말에게는 항원없이 9-웨이(way) 백신에 사용된 부형제(젠타마이신 및 포름알데하이드)를 함유하는 보강된 DMEM(Lot 004)을 1ml 용량으로 투여했다. 독성 인플루엔자 A/말-2/Ohio/03 균주 바이러스의 항원공격 접종은 추가 백신접종 후 4개월째 수행했다.
혈청학적 평가를 위한 혈청 샘플은 1차 백신접종 전, 1차 용량의 백신접종 후 21일째(추가 백신접종일), 항원공격일, 및 항원공격 후 7일과 14일째 백신접종군 말 및 대조군 말로부터 수집했다. 항원공격일과 항원공격 후 10일간의 관찰 기간 동안 매일, 총 11일의 관찰일 동안 각 말로부터 체온, 전 혈액 샘플 및 비강 면봉을 수득했다. 또한, 11일의 관찰 기간 동안 각 말마다 임상 데이터도 매일 기록했다.
항원공격
항원공격 바이러스 종균인 인플루엔자 A/말-2/Ohio/03은 난(卵)에서 생산했다. 항원공격 바이러스는 백신접종되지 않은 항원공격된 말에서의 임상 인플루엔자를 유발하기에 충분한 역가에 영향을 미치도록 항원공격일 아침에 조직배양 배지로 1:20으로 희석했다.
진정제이자 진통제인 Sedivet®(로미피딘 염산염)은 체중 kg당 50㎍의 투약량으로 항원공격 전에 각 말에게 정맥내 투여했다. 각 말에게 그 다음 인플루엔자 A/말-2/Ohio/03 바이러스로 항원공격했다. 항원공격 바이러스는 다음과 같은 방법으로 말의 에어로마스크(AeroMask)(Trudell Medical International, Ontario, Canada) 내로 분무기에 의해 생산된 에어로졸로서 비내 투여했다:
항원공격 바이러스 4ml를 에어로마스크 장치 내의 분무기 컵에 넣었다. 공기 압축기로부터 분무기의 유입구까지 압력 호스를 장착했다. 그 다음, 배출구 관을 항원공격되는 말의 머리에 부착된 에어로마스크 내로 삽입하고 유입구에 공기 압력을 가했다. 이 시간 동안 약 2ml의 항원공격 바이러스 액이 항원공격되는 말의 콧구멍 내로 직접 분무되었다.
온도
항원공격일과 항원공격 후 10일 동안 26마리의 백신접종군 말과 대조군 말마다 보정된 전자식 온도계(GSA Electronics) 프로브를 이용하여 매일 직장 온도를 기록했다. 직장 온도는 매일 화씨(℉)로 기록했다.
백혈구 계수
26마리의 백신접종군 말 및 대조군 말로부터 항원공격일과 항원공격 후 10일 동안 매일 WBC 계수를 위해 Vacutainer Disodium EDTA 관 내로 정맥 혈액을 수집했다.
비강 삼출물 평가
모든 비강 삼출물 관찰은 비인강 면봉의 수집 전에 실시했다. 항원공격일 및 항원공격 후 10일 동안, 26마리의 백신접종군 말 및 대조군 말 각각의 비강 및 주둥이를 조사하여 이하에 기술된 등급화 및 평점에 대한 설명을 이용하여 등급을 매겼다.
0 내지 6의 평점 등급은 다음 각 분류에 표시된 바와 같이 질병의 중증도를 기준으로 평가했다:
평점 등급
평점 증상 설명 평점 시트 약칭
0 '본질적으로 정상'은 말이 깨끗하고 비강 삼출물이 본질적으로 없다는 것을 나타낸다. EN
1 질병이 있는 말과 정상 말에서 흔히 관찰할 수 있는 약간 투명한 묽은 콧물 C-1
2 보통 투명한 묽은 콧물은 일반적으로 관찰되는 것보다 용적의 분명한 증가를 나타낸다. C-2
3 질병에 걸린 말에서만 일반적으로 관찰되는 엄청난 묽은 투명 콧물 C-3
1.5 콧구멍 한쪽 또는 양쪽에서 점액이 분명하게 소량으로 존재한다는 것을 시사하는 매우 약간의 점액농즙성 콧물 VSM
2 콧구멍 한쪽 또는 양쪽에서 쉽게 관찰되는 콧물인 경미한 점액 농즙 SM
4 콧구멍 양쪽에서 점액성 콧물이 다량으로 존재하는 것을 시사하는 중간 점액 농즙 MM
6 콧구멍 양쪽에 엄청난 양의 점액성 콧물이 채워져 있음을 시사하는 심각한 점액 농즙 HM
기침
각 관찰일에서의 기침 증상은 연구자가 각 동물을 조사하는 시기 여부에 관계없이 관찰 전 기간 동안 각 말마다 계수했다. 연구자 외의 관찰자는 관찰 기간 동안 각 말의 기침 증상의 횟수를 기록했다. 기침 증상의 평점은 말마다 기침 증상의 실제 횟수이다.
결막염
결막염은 비강 삼출물 평가 시에 매일 평가했다. 결막염 점수는 0 = 정상; 1 = 경미하거나 보통 결막염, 2 = 심한 결막염으로 기록했다.
비인강 바이러스 분리 방법/혈구응집( HA ) 방법
각 관찰 검사일에 각 백신접종군 및 대조군의 비강에서 멸균 면봉을 이용해 깊이 샘플링했다. 수집 후, 2개의 면봉 각각을 즉시 4ml의 냉각된 수송 매질(2% FBS, 2X Pen/Strep, 2X 젠타마이신, 및 2X 암포테리신 B가 보충된 둘베코 최소 필수 배지(DMEM))을 함유하는 단일 관에 넣었다.
바이러스 분리를 위해, 관을 혼합하고, 면봉을 무균 제거한 다음, 배지를 1500 rpm에서 10 내지 15분 동안 원심분리하여 입자를 분리했다. 배지는 조직 배양 세포에 접종하기 전에 0.2μ 주사기 필터를 통해 여과했다. 여과 후, 각 샘플에 4 내지 6%의 멸균 85% 수크로오스 용액을 첨가하여 모든 샘플을 동시에 검사하기 위해 -80℃에서 동결했다.
모든 샘플은 희석당 5개의 웰을 이용하고 5개의 검사 웰 각각에 대해 4개의 웰 희석 연속물을 이용하여 멸균된 바닥이 편평한 미세역가 평판에서 검사했다. 해동 후, 정화된 샘플 배지 22㎕를 이용하여, 증식 배지를 무균 제거하고 인플루엔자 증식 배지(10,000U 스톡 용액 돼지 트립신 5 내지 10 유닛/ml, 2mM L-글루타민, 1X Pen-Strep 및 1X 암포테리신 B를 함유하는 DMEM) 200 ㎕로 교체한 MDCK-S 세포의 1일 단층에 접종했다. 평판은 그 다음 CO2 항온배양기에서 35℃ 하에 5 내지 7일 동안 항온배양했다. 5 내지 7일의 항온배양 기간 후, 적정 평판의 모든 웰로부터 50㎕를 표지 부착된 96웰 비닐 HA 평판에 직접 옮겨 담았다. 병아리 적혈구를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30 내지 90분 동안 침전시켰다. 웰은 말 인플루엔자 바이러스의 존재를 증명하는 양성 응집에 대해 판독했다.
혈구응집 저해( HI ) 검사 절차
혈청 샘플은 각 샘플 0.15ml를 시험관에 분주하고 실온에서 15분 동안 0.01M 과요오드산나트륨 용액 0.3ml로 추출하여 제조했다. 글리세롤 용액 3%(0.125ml)를각 시험관에 첨가하고, 혼합한 뒤, 실온에서 15분 동안 항온배양했다. 모든 샘플은 그 다음 56℃에서 30분 동안 열불활성화시켰다.
병아리 적혈구 0.5% 용액을 PBS(SAFC 카탈로그 번호 59321C)에 제조하고 550nm에서 0.5의 광학밀도로 표준화했다.
추출된 혈청 샘플은 웰당 25㎕씩, 1:4부터 1:256까지 PBS로 2배 희석 방식으로 U형 폴리스티렌 평판에서 2반복으로 검사했다. 혈청 샘플 희석물에 인플루엔자 A/Equi2/Ohio03 스톡 바이러스(25㎕)를 첨가했다. 평판은 혼합하기 위해 부드럽게 두드리고, 실온에서 30분 동안 항온배양했다. 항온배양 후, 병아리 적혈구를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1 내지 1.5시간 동안 정치 항온배양했다. 결과는 각 웰에서 응집된 적혈구의 존재 또는 부재에 대해 평판을 관찰하여 판독했다. 항체 역가는 응집이 일어나지 않은 최고 혈청 희석물로 측정했다.
결과 및 결론
항원공격 후 모든 시점마다 수집한 백신접종된 동물의 총 임상 점수는 대조군 동물보다 낮았다. 항원공격 후 기간 동안 총 1일 점수를 합산했을 때, 백신접종군의 말은 대조군의 말보다 총 점수가 낮았다(P<0.05). 완화 분율은 0.6485인 것으로 추정되었다(95% ASE CI: 0.3258, 0.9712).
총 임상 점수
결과 변수 백신접종군 일 상호작용 일별 군
총 임상 점수1 <0.0001 <0.0001 0.1321
1 GLIMMIX 절차는 통합적이지 않아서 ANOVA 접근법을 이용하여 항원공격 후 경시적인 백신접종 효과를 평가했다. 결과는 진한 글씨의 값을 통해 해석되었다.
완화 분율 - 총 누적 임상 점수
대조군 백신접종군 P값1 완화 분율2
(95% ASE CI)
총 누적 임상 점수2 18.363 9.93 0.0055 0.6485
(0.3258, 0.9712)
1 윌콕슨 순위 합계 검사의 P값
2 콧물 점수, 결막염 점수 및 기침 점수를 각 동물마다 매일 모든 시점마다 합산한 뒤, 완화 분율의 평가치에 대해 등급을 매겼다.
3 평균 순위
콧물
백신접종의 주요 효과는 통계적으로 유의적이었고 인플루엔자 항원공격으로 인한 콧물을 감소시켰다. 항원공격 후 모든 시점마다 수집 시, 백신접종군 동물의 콧물 점수는 대조군 동물보다 낮았다.
콧물 점수
결과 변수 백신접종군 일 상호작용 일별 군
콧물 점수1 0.0012 <0.0001 0.4627
1GLIMMIX 절차는 통합적이지 않아서 ANOVA 접근법을 이용하여 항원공격 후 경시적인 백신접종 효과를 평가했다. 결과는 진한 글씨의 값을 통해 해석되었다.
결막염
결막염에 대해 백신접종의 주요 효과는 통계적으로 유의적인 값이었다. 항원공격 후 모든 시점마다 수집 시, 백신접종군 동물은 대조군 동물보다 낮은 결막염 점수로 입증되듯이 인플루엔자 감염으로 인한 결막염의 감소를 나타냈다.
결막염 점수
결과 변수 백신접종군 일 상호작용 일별 군
결막염 점수1 0.0187 0.0001 0.2498
1GLIMMIX 절차는 통합적이지 않아서 ANOVA 접근법을 이용하여 항원공격 후 경시적인 백신접종 효과를 평가했다. 결과는 진한 글씨의 값을 통해 해석되었다.
기침
또한, 백신은 말 인플루엔자 감염으로부터 초래되는 기침에 대해 방어적이었다. 백신접종군 동물은 대조군 동물보다 항원공격 후 3일, 5일, 7일, 8일 및 9일째 낮은 점수(<0.05)를 나타냈다.
기침 점수
결과 변수 백신접종군 일 상호작용 일별 군
기침 점수1 0.0004 0.0009 0.0275
1GLIMMIX 절차는 통합적이지 않아서 ANOVA 접근법을 이용하여 항원공격 후 경시적인 백신접종 효과를 평가했다. 결과는 진한 글씨의 값을 통해 해석되었다.
바이러스 방출( 비강 면봉 )
또한, 백신접종은 말 방출 바이러스 백분율을 감소시켰다(P<0.05). 이하 도면은 백신접종군 동물의 방출 바이러스가 대조군 동물보다 항원공격 후 3일, 4일 5일째 더 낮은 것을 나타낸다(P<0.05).
완화 분율 - 일별 바이러스 방출
대조군 백신접종군 P값1 완화 분율2
(95% ASE CI)
일별 바이러스 양성2 ,3 23 0 0.0004 0.7937
(0.5343, 1.0000)
1 윌콕슨 순위 합계 검사의 P값
2 바이러스 방출의 일 수를 계산한 뒤, 완화 분율의 평가치에 대해 등급을 매겼다. 95% 신뢰구간(CI) 평가에 점근적 표준 오차(ASE)를 이용했다.
3 양성 결과 평균 일 수는 바이러스 분리 분석으로부터 수득했다.
HI 역가
또한, 백신은 말 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 항체 역가를 유도해내는데 효과적이었다. 백신접종된 말에서 통계상 유의적으로 높은 역가는 36일(백신접종 대비), 154일(항원공격일), 159일 및 164일에 관찰되었다. 이러한 날들에 각각 백신접종 군의 말은 대조군의 말보다 높은 역가를 나타냈다(P<0.05).
WBC 및 림프구 계수
또한, 백신접종은 인플루엔자 바이러스 항원공격 후 관찰되는 백혈구 수의 감소로부터 말을 방어했다(P<0.05). 복합 백신으로의 백신접종은 WBC 계수 면에서 2일과 7일, 및 항원공격 후 2일, 6일, 7일 및 8일에 관찰되는 통계상 유의적인 방어를 제공했다. 백신접종 군의 말은 대조군의 말보다 높은 WBC 및 림프구 계수를 나타냈다(P<0.05). 4개월 면역 지속기간 항원공격(four month Duration of Immunity challenge)을 수행하여, 현재 미국, 유럽 및 아시아의 말 집단에서 각각 관련이 있는, ATCC 수탁번호 PTA-9522, PTA-9523 및 PTA-9524인 3가지 말 인플루엔자 A/말-2 바이러스 균주를 함유하는 웨스트 나일 바이러스 백신(뇌척수염-비강폐렴-인플루엔자-웨스트 나일 바이러스 백신, 동부, 서부 및 베네수엘라, 사멸 바이러스, 파상풍 톡소이드)을 포함한 다성분 백신의 인플루엔자 바이러스 분율의 효능을 입증했다. 26마리 말(15마리는 백신접종군 및 11마리는 대조군)은 1ml 용량의 백신으로 3주 간격으로 2회 백신접종하거나 또는 바이러스 항원 없이 백신의 보강제 첨가 배지 성분으로 거짓 백신접종했다. 4개월 추가 백신접종 후, 독성 생 말 인플루엔자 A/말-2/Ohio03 바이러스로 말을 항원공격했다. 이 독성 바이러스는 OIE에 의해 백신에 첨가하도록 권장된 현행 말 인플루엔자 A/말-2 균주이고, 미국 내의 발발에 관여하는 가장 관계있는 균주로 현재 인식되고 있다.
이러한 4개월 DOI 항원공격 연구의 결과는 검사 백신, 플루 및 다른 관계있는 말 항원으로의 백신접종에 의해 항원공격으로부터 유의적인 방어 효과를 보여준다. 중요한 것은, 백신접종된 말은 인플루엔자 바이러스의 총 임상 징후(콧물, 결막염 및 기침, P=0.0055)가 통계적으로 낮게 나타나, 완화 분율은 0.6485(95% ASE CI: 0.3258, 0.9712)인 것으로 평가되었다. 또한, 바이러스 방출은 대조군 말보다 백신접종된 말에서 통계적으로 낮아서(P=0.0004), 완화 분율은 0.7939(95% ASE CI: 0.5343, 1.0000)인 것으로 평가되었다. 혈구응집 억제 역가는 대조군 말보다 백신접종된 말에서 유의적으로 높았고, 백혈구 및 림프구 계수는 대조군말보다 백신접종된 말에서 여러 연구 일마다 유의적으로 높게 유지되었다. 직장 온도는 두 군 간에 차이가 없는 것으로 측정되었다.
결론적으로, 본 연구의 데이터는 4 내지 5월령의 망아지에게 21일 간격으로 투여한 웨스트 나일 바이러스 복합 백신의 2 x 1ml 근육내 용량의 투여가 말 인플루엔자 A/말-2/Ohio03 바이러스를 이용한 독성 항원공격에 대해 방어적이고 이 산물에 대해 적어도 4개월의 면역기간을 제공했다는 것을 입증한다.
실시예 5
본 실시예는 EHV-1(말 헤르페스 바이러스 타입 1)로 항원공격했을 때 본 발명의 면역원성 조성물의 효능을 예증한다.
재료 및 방법
본 연구에서 평가되는 백신에 사용된 EHV-1 바이러스 항원은 MDBK(Madin Darby Bovine Kidney) 세포에서 생산했다. 증식 후, 바이러스액은 여과하고, BPL 불활성화처리한 후 농축했다. 불활성화된 바이러스액은 불활성화 후 남아있는 생 바이러스에 대해 검사했다. 만족스러운 잔류 생 바이러스 검사를 끝내고, 불활성화된 바이러스액을 이용하여, 불활성화된 베네수엘라 말 뇌척수염, TC-83 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9411), 동부 말 뇌척수염, NJO 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9412) 및 서부 말 뇌척수염, Fleming 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9410) 바이러스, 불활성화된 인플루엔자 A/말-2/Kentucky/95(ATCC 수탁번호 PTA-9523), 인플루엔자 A/말-2/NewMarket/2/93(ATCC 수탁번호 PTA-9524) 및 인플루엔자 A/말-2/Ohio/03(ATCC 수탁번호 PTA-9522) 바이러스, 불활성화된 웨스트 나일 바이러스(ATCC 수탁번호 PTA-9409) 및 파상풍 톡소이드를 추가로 함유하는 백신을 제형화했다.
백신은 제품에 포함된 모든 항원마다 최소한의 사양에 맞게 제형화했다. EHV-1 항원은 107.0 TCID50/ml의 불활성화전 역가로 백신에 첨가했다.
최종 제형화된 백신은 1ml 용량당 다음과 같은 성분을 함유한다:
EHV-1 107.0-9.0TCID50/ml
인플루엔자 A2/Ohio/03 106.7-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/KY/95 106.7-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/NewMarket/2/93 106.7-9.5TCID50/ml
파상풍 톡소이드 5-10 CPU
동부 말 뇌척수염 106.7-9.2TCID50/ml
서부 말 뇌척수염 106.7-9.2PFU/ml
베네수엘라 말 뇌척수염 106.7-9.2TCID50/ml
웨스트 나일 바이러스 107.0-9.0TCID50/ml
보강제(바람직하게는 광유) 100-200㎕
글리세롤 100-200㎕
EDTA 240mM 용액 10-20㎕
희석제 - DMEM 함유 q.s.
젠타마이신(30 ㎍/ml 희석제 용적)
포름알데하이드(희석제 용적의 0.1-0.2%)
4 내지 5월령의 40마리의 말을 본 연구에 사용했다. 말은 백신접종군 또는 대조군으로 무작위로 할당하고, 마이크로칩을 달고, 그 후 백신접종했다. 20마리의 말은 백신접종군으로 사용하고 20마리의 말은 거짓-백신접종된 대조군 말로 사용했다. 모든 말은 연구 개시 전에, 감염에 민감한 말을 시사하는 음성 내지 낮은(< 1:6) EHV-1 혈청 중화(SN) 역가를 나타냈다.
백신은 백신접종군인 20마리 말 각각에게 1ml 용량으로 근육내 투여했다. 대조군인 20마리 말에게는 항원없이 9-웨이(way) 백신에 사용된 부형제(젠타마이신 및 포름알데하이드)를 함유하는 보강된 DMEM(Lot 004)을 1ml 용량으로 투여했다. 독성 EHV-1 A183 균주 바이러스의 항원공격 접종은 추가 백신접종 후 15일째 수행했다.
혈청학적 평가를 위한 혈청 샘플은 1차 백신접종 전, 1차 용량의 백신접종 후 21일째(추가 백신접종일), 항원공격일, 및 항원공격 후 7일과 14일째에 백신접종군 말 및 대조군 말로부터 수집했다. 항원공격일과 항원공격 후 14일간의 관찰 기간 동안 매일, 총 15일의 관찰일 동안 각 말로부터 체온, 전 혈액 샘플 및 비강 면봉을 수득했다. 또한, 15일의 관찰 기간 동안 각 말마다 임상 데이터도 매일 기록했다.
항원공격 절차
항원공격 바이러스
본 항원공격 연구에 사용된 본래의 항원공격 바이러스 종균은 종균 바이러스의 말 피부(ED) 세포에서의 1차 계대물이다. 이 항원공격 바이러스를 수거하여 106.2TCID50/ml의 역가로 동결시켰다.
비내 항원공격 방법
진정제이자 진통제인 Sedivet®(로미피딘 염산염)은 체중 kg당 50㎍의 투약량으로 항원공격 전에 각 말에게 정맥내 투여했다. 각 말에게 그 다음 약 106.5 TCID50의 EHV-1 균주로 항원공격했다. 이 항원공격 바이러스는 다음과 같은 방법으로 말의 에어로마스크(AeroMask)(Trudell Medical International, Ontario, Canada) 내로 분무기에 의해 생성된 에어로졸로서 비내 투여했다:
공기 압축기로부터 분무기의 유입구까지 압력 호스를 장착했다. 그 다음, 배출구 관을 항원공격되는 말의 머리에 부착된 에어로마스크 내로 삽입하고 유입구에 4분 동안 약 10 psi의 공기 압력을 가했다. 이 시간 동안 약 2ml의 106.2TCID50/ml의 항원공격 바이러스 액은 항원공격되는 말의 콧구멍 내로 직접 분무되었다.
항원공격 전 및 후의 평가 파라미터
온도
항원공격일과 항원공격 후 14일 동안 40마리의 백신접종군 말과 대조군 말마다 보정된 전자식 온도계(GSA Electronics) 프로브를 이용하여 매일 직장 온도를 기록했다. 직장 온도는 매일 화씨(℉)로 기록했다.
백혈구 계수
40마리의 백신접종군 말 및 대조군 말로부터 항원공격일과 항원공격 후 14일 동안 매일 WBC 계수를 위해 Vacutainer Disodium EDTA 관 내로 정맥 혈액을 수집했다.
비강 삼출물 평가
모든 비강 삼출물 관찰은 비인강 면봉의 수집 전에 실시했다. 항원공격일 및 항원공격 후 14일 동안, 40마리의 백신접종군 말 및 대조군 말 각각의 비강 및 주둥이를 조사하여 이하에 기술된 등급화 및 평점에 대한 설명을 이용하여 등급을 매겼다.
0 내지 6의 평점 등급은 다음 각 분류에 표시된 바와 같이 질병의 중증도를 기준으로 평가했다:
(EN) '본질적으로 정상'은 말이 깨끗하고 비강 삼출물이 본질적으로 없다는 것을 나타낸다. 점수 0;
(C-1) 질병이 있는 말과 정상 말에서 흔히 관찰할 수 있는 약간 투명한 묽은 콧물, 점수 1:
(C-2) 보통 투명한 묽은 콧물은 일반적으로 관찰되는 것보다 용적의 분명한 증가를 나타낸다, 점수 2;
(C-3) 질병에 걸린 말에서만 일반적으로 관찰되는 엄청난 묽은 투명 콧물, 점수 3;
(VSM) 콧구멍 한쪽 또는 양쪽에서 점액이 분명하게 소량으로 존재한다는 것을 시사하는 매우 약간의 점액농즙성 콧물, 점수 1.5;
(SM) 콧구멍 한쪽 또는 양쪽에서 쉽게 관찰되는 콧물인 경미한 점액 농즙, 점수 2;
(MM) 콧구멍 양쪽에서 점액성 콧물이 다량으로 존재하는 것을 시사하는 중간 점액 농즙, 점수 4; 및
(HM) 콧구멍 양쪽에 엄청난 양의 점액성 콧물이 채워져 있음을 시사하는 심각한 점액 농즙, 점수 6.
비인강 바이러스 분리 방법
각 관찰 검사일에 각 백신접종군 및 대조군의 비강에서 멸균 면봉을 이용해 깊이 샘플링했다. 수집 후, 2개의 면봉 각각을 즉시 4ml의 냉각된 수송 매질(2% FBS, 2X Pen/Strep, 2X 젠타마이신, 및 2X 암포테리신 B가 보충된 둘베코 최소 필수 배지(DMEM))을 함유하는 단일 관에 넣었다.
바이러스 분리를 위해, 관을 혼합하고, 면봉을 무균 분리한 뒤, 배지는 입자 제거를 위해 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리했다. 배지는 조직 배양 세포에 접종하기 전에 0.2μ 주사기 필터를 통해 여과했다. 정화된 수송 배지 1ml를 이용하여, 증식 배지를 무균 제거한 24웰 조직 배양판에서 증식된 1일된 ED 세포 2㎠ 단층에 접종했다. 접종 후, 5% CO2 대기를 함유하는 가습 항온배양기에서 37℃ 하에 1시간 동안 접종물을 세포 단층에 흡착시켰다. 흡착 기간 후, 재공급 배지(2-5% 소태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 3X 젠타마이신 및 2X 암포테리신 B를 함유하는 DMEM) 추가 1ml를 각 웰에 첨가했다. 재공급 배지를 첨가한 후, 평판을 CO2 항온배양기에서 37℃ 하에 항온배양했다. 각 검사군 및 대조군 조직 배양 웰은 EHV-1 A183 항원공격 바이러스의 전형적인 세포변성 효과(CPE)의 징후에 대해 7일 동안 현미경으로 검사했다. 관찰 기간의 마지막 7일째 음성인 웰은 새로운 세포에 계대배양하고 추가 7일 동안 관찰했다.
WBC 백혈구 연층 바이러스 분리
40마리의 백신접종군 말 및 대조군 말로부터 항원공격일과 항원공격 후 14일 동안 매일 Vacutainer Disodium EDTA 관 내로 정맥 혈액을 수집했다. EDTA 응고방지된 혈액의 관에서 적혈구를 중력 침강시킨 후, 혈장과 백혈구를 피펫으로 취하여 멸균 5ml 스냅-캡 관에 담았다. 혈장과 백혈구 혼합물을 1500 RPM에서 10 내지 15분 동안 원심분리하여 백혈구를 펠릿화했다. 펠릿은 2X Pen/Strep, 2X 젠타마이신 및 2X 암포테리신 B를 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) 3ml로 2회 세척했다. 그 다음, 세포는 2% 소 태아 혈청(FBS) 및 2X Pen/Strep, 2X 젠타마이신 및 2X 암포테리신 B가 보충된 DMEM 4ml에 현탁시켰다. 1ml의 백혈구 연층 현탁액을 이용하여, 증식 배지를 무균 제거한 24웰 조직 배양판에서 증식된 1일된 ED 세포 2㎠ 단층에 접종했다. 접종 후, 5% CO2 대기를 함유하는 가습 항온배양기에서 37℃ 하에 1시간 동안 접종물을 세포 단층에 흡착시켰다. 흡착 기간 후, 재공급 배지(5-7% 소태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 1X 젠타마이신을 함유하는 DMEM) 추가 1ml를 각 웰에 첨가했다. 재공급 배지를 첨가한 후, 평판을 CO2 항온배양기에서 37℃ 하에 항온배양했다. 대량의 백혈구가 단층에 응집되어 있어, 웰은 현미경으로 관찰할 수 없었다. 따라서, 마지막 7일째, 모든 웰을 1차 계대배양물 0.5ml를 접종물로 이용하여 새로운 ED 세포에 계대배양했다. 계대배양물은 항원공격 바이러스 감염에 전형적인 CPE에 대해 7일 동안 관찰했다.
혈청 중화 검사 절차
본 연구에는 표준 미세역가 혈청 중화 검사를 이용했다. 모든 혈청은 희석물당 5웰 및 5개의 검사 웰 각각에 8웰 희석 일련물을 이용하여 바닥이 편평한 멸균 미세역가 평판에서 검사했다. 5개의 검사 웰 각각은 약 5 X 104 세포를 함유하는 새로 접종한 ED 세포 현탁액 150㎕ 및 지시 바이러스 25㎕와 혼합된 혈청 희석물 25㎕를 함유했다. 사용된 검사 지시 바이러스는 EHV-1 아형 1 균주 A183이었다. 모든 검사에서, 지시 바이러스 역적정 역가는 109 내지 263 TCID50/25㎕ 사이였다. 혈청 중화 항체 역가는 Reed-Muench ID50 역가로 나타냈다.
검사를 수행하기 위해, 각 검사 혈청의 2배 희석물은 검사 혈청당 5개의 복제 웰 및 8웰 희석 연속물을 이용하여 바닥이 편평한 멸균 미세역가 평판에서 제조했다. 희석물은 멸균 미세역가 팁을 이용하는 용적 조정이 가능한 일채널 또는 다채널 피펫팅 기구로 제조했다. 5웰 각각의 제1 열에 첨가된 혈청 용적은 50㎕였다. 다른 모든 웰은 DMEM(FBS 무첨가) 25㎕를 함유했다. 평판 아래로 연속 희석 후, 마지막 열에서는 25㎕를 버렸다. 각 검사 웰에 소정의 희석률의 지시 바이러스 25㎕를 첨가했다. 그 다음, 평판을 혼합하고 5% CO2 하에 37℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 항온배양 기간 말에, 5 x 104 ED 세포를 함유하는 현탁액 150㎕를 각 검사 및 세포 대조군 웰에 첨가했다. 평판은 CO2 항온배양기에서 37℃ 하에 3일 동안 항온배양하고, 이 후 EHV-1에 전형적인 CPE에 대해 평판을 현미경으로 조사했다. 대안적으로, 모든 종래 분석법 또는 공인된 분석법을 이용할 수도 있고, 또는 당업자는 본 명세서의 안내를 따를 수 있다.
결과 및 결론
콧물 점수, EHV-1의 비강 방출 및 결막염 점수는 1차 결과 변수로 고찰했다. 모든 다른 결과들은 2차적으로 고찰했다.
Figure pct00003
1GLIMMIX 절차는 통합적이지 않아서 ANOVA 접근법을 이용하여 항원공격 후 경시적인 백신접종 효과를 평가했다. 결과는 진한 글씨의 값을 통해 해석되었다.
비강 삼출물 평가
상호작용 일별 백신접종군은 콧물 점수 면에서 통계적으로 유의적이었다(P<0.05). 통계적으로 유의적인 군의 효과는 4일, 5일과 항원공격 후 7 내지 11일째 관찰되었다(백신접종군의 낮은 콧물 점수, P<0.05). 매일의 점수를 항원공격 후 기간 동안 합산했을 때, 백신접종군의 말의 점수는 대조군 말보다 총점이 더 낮았다(P<0.05). 완화 분율은 0.7250으로 추정되었다(95% ASE CI: 0.4886, 0.9614).
Figure pct00004
1 윌콕슨 순위 합계 검사의 P값
2 콧물 및 결막염 점수는 모든 시점을 따라 합산한 뒤, 완화 분율의 평가치에 대해 순위를 매겼다. 바이러스 방출의 일 수를 계산한 뒤, 완화 분율의 평가치에 대해 순위를 매겼다. 95% 신뢰구간(CI) 평가에 점근적 표준 오차(ASE)를 이용했다.
Figure pct00005
1GLIMMIX 절차는 통합적이지 않아서 ANOVA 접근법을 이용하여 항원공격 후 경시적인 백신접종 효과를 평가했다.
결막염
상호작용 일별 백신접종군은 결막염 점수에 대해 통계적 유의성을 나타냈다(P<0.05). 통계적으로 유의적인 군의 효과는 5일과 6일 및 항원공격 후 9일에서 14일째 관찰되었다(백신접종군의 낮은 점수, P<0.05). 매일의 점수를 항원공격 후 기간 동안 합산했을 때, 백신접종군의 말의 점수는 대조군 말보다 총점이 더 낮았다(P<0.05). 완화 분율은 0.5300으로 추정되었다(95% ASE CI: 0.2463, 0.8137).
Figure pct00006
1GLIMMIX 절차는 통합적이지 않아서 ANOVA 접근법을 이용하여 항원공격 후 경시적인 백신접종 효과를 평가했다.
비인강 면봉으로부터 바이러스 분리
백신접종군의 주요 효과는 통계적 유의성이 있었다(백신접종군에서 방출성 동물의 수가 적었다, P<0.05). 일별 방출 수는 평가했을 때, 백신접종군의 말은 대조군의 말보다 적은 일별 바이러스 방출을 나타냈다(P<0.05, 표 2). 완화 분율은 0.4925로 평가되었다(95% ASE CI: 0.1896, 0.7954).
Figure pct00007
백혈구 계수
상호작용 일별 백신접종군은 WBC 계수에 있어서 통계적 유의성을 나타냈다(P<0.05, 표 1). 통계적 유의성인 군의 효과는 항원공격 후 2일과 3일에 관찰되었다. 백신접종군의 말은 대조군의 말보다 높은 WBC 계수를 나타냈고, 이는 백신이 EHV 1 감염으로 유발되는 백혈구감소증으로부터 말을 예방했음을 시사한다(P<0.05).
Figure pct00008
1 ANOVA로부터의 P값
혈청학적 연구
역가는 통계 분석 전에 log 변환했다. 상호작용 일별 백신접종군은 SN 역가면에서 통계적 유의성을 나타냈다(P<0.05). 통계적 유의성 군의 효과는 35일(항원공격일) 및 항원공격 후 7일과 14일(연구일 42 및 49일)에 관찰되었다. 백신접종군의 말은 대조군의 말보다 높은 역가를 나타냈다(P<0.05).
Figure pct00009
1 ANOVA의 P값. 혈청 중화 역가는 통계 분석전에 log(자연) 변환했다.
결과 및 고찰
말 헤르페스 타입 1에 의해 유발된 호흡기 질환은 일반적으로 생애 첫해에 보통 가을과 겨울에 일어나는, 순수 이유기 1년 된 말의 유행성 질병이다. 급성 감염의 징후로는 106℉까지의 열, 바이러스혈증 및 백혈구감소중 및/또는 호중구감소증을 포함한다. 이러한 최초 노출의 열병 기간 동안 보통 콧물은 분명히 나타난다. EHV-1에 의한 자연 감염은 기도의 영구 면역성을 초래하지 않는다. 실제로, 말은 사는 동안 3 내지 6개월마다 자연적으로 재감염될 수 있다. 이 바이러스를 1차 경험한 후, 재감염은 바이러스 생산을 초래하지만, 보통 질병의 임상 징후 없이 바이러스의 자연 보균자로 작용하는 보균 동물이 된다.
본 명세서에 기술된 말 헤르페스바이러스-1 다성분 백신은 호흡기 징후, 임상 증상 및 말 헤르페스바이러스 타입 1의 독성 이종 균주로 항원공격된 말의 비강 삼출물로부터의 바이러스 방출을 감소시키는데 효능적인 것으로 관찰되었다. 호흡기 경로로부터 바이러스 방출 감소는 이것이 무경험(naive) 동물에 대한 노출 뿐만 아니라 자연 감염을 경험한 동물로부터 무리 동물의 재감염에 대한 노출의 자연 경로이기 때문에 유행병학적으로 중요하다. 또한, 연구 말에 백신 사용 후 관찰되는 백신 투여 부위에서 또는 전신에서 부작용이 없는 안전한 백신이다.
본 연구에서, 상호작용 일별 백신접종군은 1차 결과 변수인 콧물 및 결막염 면에서 통계적 유의성을 나타냈다. 통계적 유의성이 있는 군의 효과는 4일, 5일과 항원공격 후 7일 내지 11일째 백신접종군의 콧물에서 관찰되었다. 또한, 결막염에 대한 군의 효과는 5일, 6일과 9 내지 14일에 백신접종군의 점수가 낮은 통계적 유의성을 나타냈다(P<0.05). 이것은 EHV-1 바이러스가 복잡하고 환경에서 쉽게 생존하지 못하기 때문에 유행병학적으로 유의적인 것이다. 밀접한 접촉은 독성 EHV-1 바이러스를 함유하는 비강 분비물을 통한 질환의 전염에 중요하다(Campbell and Studdert, 1983).
중요한 것은, 본 연구의 다른 1차 결과 변수인 비강 삼출물 중의 바이러스 방출은 통계학상 유의적인 것으로(P<0.05) 백신접종의 주요 효과를 나타냈다. 또한, 백신접종군의 말들은 대조군의 말들보다 바이러스 방출 일수가 통계학적으로 더 적었다(P<0.05).
혈청 중화 역가는 백신접종 후 및 백신접종군 말 대 대조군 말의 항원공격 기간 동안 통계적으로 유의적이었다(P<0.05). EHV-1 감염이 생산성 감염이 될지 또는 제한적 감염 증례가 될지를 결정하는데 있어서 체액 면역과 점막 항체가 중요할 수 있다(Kidd, Smith, Hannant, et al., 1994).
실시예 6
본 실시예는 웨스트 나일 바이러스로 항원공격했을 때 본 발명의 면역원성 조성물의 효능 및 6개월의 면역 지속기간을 예시한 것이다.
재료 및 방법
본 연구에서 평가한 백신에 사용된 WNV 바이러스 항원은 실시예 1에 기술된 바와 같이 E 베로 세포에서 생산했다. 총 15마리의 말을 무작위로 군으로 나누고, 한 군은 5마리 말의 대조군이다. 10마리 말의 백신접종군에게는 21일 간격의 세포에 2회 용량의 항원을 투여했다. 만족할만한 잔류 생 바이러스 검사를 마친 후, 불활성화된 바이러스액을 이용하여 불활성화된 베네수엘라 말 뇌척수염, TC-83 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9411), 동부 말 뇌척수염, NJO 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9412) 및 서부 말 뇌척수염, Fleming 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9410) 바이러스, 불활성화된 인플루엔자 A/말-2/Kentucky/95(ATCC 수탁번호 PTA-9523), 인플루엔자 A/말-2/NewMarket/2/93(ATCC 수탁번호 PTA-9524) 및 인플루엔자 A/말-2/Ohio/03(ATCC 수탁번호 PTA-9522) 바이러스, 불활성화된 웨스트 나일 바이러스(ATCC 수탁번호 9409) 및 파상풍 톡소이드도 함유하는 백신을 제형화했다. 백신은 제품에 포함된 모든 항원들의 최소 사양으로 제형화했다.
최종 제형화된 백신은 1ml 용량 당 다음과 같은 성분을 함유한다:
EHV-1 107.0-9.0TCID50/ml
인플루엔자 A2/Ohio/03 106.7-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/KY/95 106.7-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/NewMarket/2/93 106.7-9.5TCID50/ml
파상풍 톡소이드 5-10 CPU
동부 말 뇌척수염 106.7-9.2TCID50/ml
서부 말 뇌척수염 106.7-9.2PFU/ml
베네수엘라 말 뇌척수염 106.7-9.2TCID50/ml
웨스트 나일 바이러스 107.0-9.0TCID50/ml
보강제(바람직하게는 광유) 100-200㎕
글리세롤 100-200㎕
EDTA 240mM 용액 10-20㎕
희석제 - DMEM 함유 q.s.
젠타마이신(희석제 용적 ml당 30㎍)
포름알데하이드(희석제 용적의 0.1-0.2%)
본 연구에는 15마리의 말을 이용했다. 말은 백신접종군 또는 대조군으로 무작위로 배정한 뒤, 백신접종했다. 말 10마리는 백신접종군으로 이용했고, 말 5마리는 거짓-백신접종된 대조군 말로 이용했다.
백신은 백신접종군의 각 말에게 1ml 용량 용적으로 근육내 투여했다. 각 대조군에게는 항원 없이 9-웨이 백신에 사용된 부형제(젠타마이신 및 포름알데하이드)를 함유하는 보강된 DMEM을 1ml 용량으로 투여했다.
모든 군은 WNV 이종 균주(NY99, 4132, 까마귀 분리주)를 약 105 pfu 함유하는 1ml PBS를 기관내 접종으로 백신접종한 후 약 6개월 후 항원공격했다. 항원공격은 케타민-자일라진 마취하에 수행했다.
말은 최대 14일 동안 모니터했다.
결과 및 고찰
항원공격 후 바이러스혈증은 본 연구의 1차 결과 변수로 고찰했다. 백신접종된 말은 본 연구에서 항원공격 후 바이러스혈증으로부터 90% 방어되었다. 이와 비교하여, 5마리 대조군 말 모두는 항원공격 후 3 내지 5일 동안 바이러스혈증을 나타냈다.
또한, 백신접종된 말의 혈청 중화 역가는 백신접종 후 대조군 말보다 훨씬 높았다. 백신접종된 말은 전부 백신접종 후 측정가능한 혈청 중화 역가를 발생시킨 반면, 대조군은 전부 WNV에 대한 어떠한 역가도 나타내지 않았다. 본 연구는 실험용 복합 백신 2회 용량이 방어적 혈청학적 혈청 중화 역가를 믿을만하고 효과적으로 자극했다는 것을 입증했다.
바이러스혈증은 WNV 뇌염을 유발하기 위해 바이러스가 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있기 전의 선행조건이므로, 바이러스혈증은 이러한 종류의 실험 연구에서 방어를 평가하는 1차 파라미터로서 충분한 근거가 된다.
결과들은 백신을 투여한 동물에서 면역원성 반응이 유도되고, 백신이 백신접종 후 적어도 6개월 동안 방어를 제공하는데 효과적이라는 것을 입증했다. 백신의 효과는 본 실시예에서 WNV 바이러스혈증의 감소 및 WNV에 대한 높은 혈청 중화 역가의 자극에 의해 증명되었다. 이 백신은 장기 지속형 비-대사성 보강제를 비롯한 독특한 구성성분을 포함하고 있고 높은 유행병학적 우세성이 있는 최근 기원의 고면역원성 저 계대 전체 불활성화된 바이러스 WNV 분리주(북미 주요 WNV 균주) 및 감염된 말의 조직에서 분리된 WNV로서 고도의 안전성을 제공하는 낮은 1ml 용량 용적으로 제형화되기 때문에, 현재 이용가능한 다른 백신보다 적어도 6개월 기간 동안 장기 지속적인 효과와 더욱 포괄적인 안전성을 제공한다. 또한, 동물, 특히 말에게 투여했을 때 안전한 백신을 제공하는 효과가 있다.
실시예 7
본 실시예는 파상풍 톡소이드 항원과 함께 뇌척수염 항원들을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물의 한 양태의 효능을 예시한다.
재료 및 방법
숙주 동물 및 실험용 동물 면역화/혈청학은 동부, 서부 및 베네수엘라 뇌척수염, 사멸 바이러스 및 파상풍 톡소이드를 포함하는 뇌척수염-비강폐렴-인플루엔자-웨스트 나일 바이러스 백신 중의 뇌척수염 항원들과 파상풍 톡소이드 항원 분획의 효능을 입증하기 위해 평가했다. 말 뇌염 바이러스 백신과 파상풍 톡소이드 분획에 미치는 방해 결여 및 효능은 복합 백신의 실험용 동물 효능 검사에 의해 분명하게 증명될 수 있다. 또한, 말의 백신접종 후 혈청 반응의 증거는 백신-톡소이드 효능을 시사한다. 따라서, 실험용 동물 효능과 숙주 동물 혈청학 모두 본 연구에 사용하여 실험용 백신의 효능을 확인했다. 또한, 백신은 말을 비롯한 동물에서 안전성에 대해 평가했다.
백신접종되지 않은 암말에서 태어난 4 내지 5월령의 말에게 불활성화된 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스, TC-83 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9411), 동부 말 뇌척수염 바이러스, NJO 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9412), 서부 말 뇌척수염 바이러스, Fleming 균주(ATCC 수탁번호 PTA-9410), 웨스트 나일 바이러스(WNV), Horse Origin 2005(ATCC 수탁번호 PTA-9409), 말 헤르페스바이러스 타입 1(ATCC 수탁번호 PTA-9525)(EHV-1), 인플루엔자 A/말-2/Ohio/03(ATCC 수탁번호 PTA-9522), 인플루엔자 A/말-2/Kentucky/95(ATCC 수탁번호 PTA-9523), 인플루엔자 A/말-2/NewMarket/2/93(ATCC 수탁번호 PTA-9524) 및 파상풍 톡소이드를 함유하는 WNV 복합 백신의 효능 연속물로 백신접종했다. 말은 본 연구의 0일째 및 21일째 백신접종을 받았다. 혈액 샘플은 0일, 21일 및 35일에 수집했다. 0일과 35일째 혈청 결과를 본원에 기록했다.
또한, 말을 백신접종하는데 사용한 것과 같은 WNV 복합 백신을 기니 피그에서도 효능 검사했다. 본 명세서에 제시된 데이터들은 본 연구에서 검사된 각 항원(EEE, VEEE, WEE, 파상풍)의 효능을 집합적이며 결정적으로 증명하며, 또한 WNV 복합 백신의 안전성을 확인시켜준다.
EEE, WEE 및 VEE 바이러스 및 파상풍 톡소이드의 대량 분획을 생산했다. 성장 후, 바이러스액을 여과하고 포르말린 불활성화시킨 후 농축했다. 불활성화된 바이러스 액을 불활성화 후 잔류 생 바이러스에 대해 검사했다.
전술한 불활성화된 바이러스 및 톡소이드 액을 이용하여, 불활성화된 말 헤르페스바이러스 타입 1, 불활성화된 인플루엔자 A/말-2/Kentucky/95, 인플루엔자 A/말-2/NewMarket/2/93 및 인플루엔자 A/말-2/Ohio/03 바이러스를 추가로 함유하는 백신을 제형화했다.
백신은 제품에 포함된 모든 항원들에 대한 사양대로 제형화했다.
최종 제형화된 백신은 다음과 같은 성분을 용량 1ml당 함유했다:
EHV-1 107.0-9.0TCID50/ml
인플루엔자 A2/Ohio/03 106.7-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/KY/95 106.7-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/NewMarket/2/93 106.7-9.5TCID50/ml
파상풍 톡소이드 5-10 CPU
동부 말 뇌척수염 106.7-9.2TCID50/ml
서부 말 뇌척수염 106.7-9.2PFU/ml
베네수엘라 말 뇌척수염 106.7-9.2TCID50/ml
웨스트 나일 바이러스 107.0-9.0TCID50/ml
보강제(바람직하게는 광유) 100-200㎕
글리세롤 100-200㎕
EDTA 240mM 용액 10-20㎕
희석제 - DMEM 함유 q.s.
젠타마이신(희석제 용적 ml당 30㎍)
포름알데하이드(희석제 용적의 0.1-0.2%)
본 연구에는 4 내지 5월령의 40마리의 말을 이용했다. 말은 백신접종 기간 동안 목장에서 어미와 함께 남기고 추가접종 2주 후 혈청을 수집할 때 어미로부터 떼어놓았다. 말에게 1.0ml 용량으로 근육내(IM) 백신접종할 때 무작위로 2가지 처리 군 중 하나로 분류했다. 1차 면역화 후 3주 후에 1.0ml IM 추가 백신접종을 수행했다. 말 20마리에게는 백신을 투여했다. 다른 20마리에게는 위약을 투여했다.
또한, 동일한 복합 WNV 백신을 이용하여 기니 피그도 백신접종했다.
말은 백신접종 후 다음과 같은 스케줄에 따라 혈청 샘플을 수집했다:
백신접종 및 혈청 샘플링 스케줄
검사일 활동
0 백신접종전 혈액을 수집하고 1차 백신접종을 실시한다.
21 혈액을 수집하고 추가 백신접종을 실시한다.
35 최종 혈청학을 위해 혈액을 수집한다.
기니 피그도 백신접종하고 9CFR, 113.207(b) 및 113.114(c)에 개략된 스케줄을 이용하여 혈청을 수집했다.
본 연구에서 말의 혈청은 일반적인 가이드라인에 따라 검사했다. 당해 분석은 0일 샘플에 대해서는 1:2 및 1:10 희석률로 검사하고 추가접종 2주후 혈청 샘플에 대해서는 1:10 및 1:40 희석률로 검사하여 역가를 측정하도록 변형시켰다. 혈청은 EEE, WEE 및 VEE 항체에 대해 검사하고 파상풍 톡소이드 항체에 대해 검사했다.
결과 및 고찰
EEE, WEE 및 VEE에 대한 말 혈청학적 평가
연구 0일째, 모든 망아지가 뇌척수염 바이러스에 혈청-음성인 것은 아니었다. 백신접종된 망아지 5마리는 EEE 바이러스에 대해 유의적인(>1:10) 잔류 모계 항체를 보유했다. 또한, 백신접종된 망아지 2마리는 WEE 바이러스에 대해 잔류 모계 항체(>1:10)를 보유했다. WNV 복합 백신의 1차 용량을 투여 시, 기존의 잠재적 방해성 수동 획득 모계 항체에도 불구하고, 백신접종 후 3 분획 모두의 역가는 실질적으로 증가한 반면(EEE에 대해 검사한 말의 80%에서 >4배, WEE에 대해 검사한 말의 90%에서 >4배, VEE에 대해 검사한 말의 100%에서 >4배), 백신접종하지 않은 망아지에서는 음성이거나 역가가 낮았다. 각 망아지의 데이터는 이하에 제시한다.
EEE, WEE 및 VEE 말 혈청학적 역가
Figure pct00010
EEE, WEE, VEE 및 파상풍 톡소이드의 기니 피그 혈청학적 평가
복합 백신을 백신접종한 기니 피그 10마리 중 9마리는 EEE 바이러스에 대해 ≥1:40에서 만족스럽게 혈청전환했다. 기니 피그 10마리 중 10마리는 VEE 바이러스에 대해 만족스러운 역가를 나타냈고(≥1:4), 기니 피그 10마리 중 10마리는 WEE 바이러스에 대해 만족스럽게 혈청전환했다(≥1:40). 또한, 백신접종한 기니 피그 10마리의 혈청 수집물을 파상풍 항체에 대해 검사했고, 4.3 항-독소 유닛/ml(AU/ml)의 값으로 만족스러운 것으로 나타났다.
기니 피그 효능 검사를 완료했고, 파상풍 톡소이드, EEE, VEE 및 WEE를 포함하는 4가지 항원 모두에 대해 만족스러운 것으로 확인되었다.
또한, 백신은 1차 면역화와 3주 후 추가 면역화를 통해 말에게 투여했다(20마리는 백신접종군, 20마리는 대조군). 추가 백신접종 14일 후, 말의 혈액을 채혈하여 모든 혈청학적 검사를 위해 혈청을 수집했다. 뇌척수염 항원에 대한 말의 반응은 항체 역가를 측정하기 위한 24웰 평판에서 2가지 희석물(0일 샘플에 대해서는 1:2 및 1:10, 35일 샘플에 대해서는 1:10 및 1:40)을 이용하여 검사했다.
만족스러운 기니 피그 효능 검사는 9-항원 함유 백신-톡소이드로서 웨스트 나일 바이러스 복합 백신에서 4가지 항원(VEE, EEE, WEE 및 파상풍 톡소이드)의 효능을 분명하게 증명한다. 또한, 만족스러운 효능 결과는 백신접종된 말이 백신접종 후 각 뇌염 바이러스 분획에 대한 실질적인 역가 상승을 입증한 숙주 동물 말 혈청학 데이터에 의해 실체화되고 확인되었다. 또한, 어떤 백신접종된 말이나 기니 피그에서도 부작용이 전혀 관찰되지 않은 것은 동물에서 WNV 복합 백신의 안전성을 확인시켜준다.
실시예 8
본 실시예는 본 발명에 따른 백신 또는 면역원성 조성물이 적어도 1년의 면역 지속기간을 나타낸다는 것을 예시한다.
재료 및 방법
숙주 동물 백신접종 및 추가 백신접종 후 적어도 1년째 항원공격은 북미 말 E159(NAEE159)라고 지칭된 WNV의 북미 주요 분리주로부터 제조한 뇌척수염-비강폐렴-인플루엔자-웨스트 나일 바이러스 백신, 동부, 서부 및 베네수엘라 사멸 바이러스, 파상풍 톡소이드 중의 웨스트 나일 바이러스 항원 분획에 대한 면역 지속기간을 확인하는데 사용했다.
최종 제형화된 백신은 다음과 같은 성분을 용량 1ml당 함유한다:
성분 1ml 용량
동부 말 뇌척수염 107.5-9.2TCID50/ml
서부 말 뇌척수염 108.2-9.2PFU/ml
베네수엘라 말 뇌척수염 107.7-9.2TCID50/ml
웨스트 나일 바이러스 (NAEE159로부터 제조된 북미 주요균) 108.0-9.2TCID50/ml
EHV-1 107.0-9.0TCID50/ml
인플루엔자 A2/Ohio/2003 107.3-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/Kentucky/95 107.3-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/NewMarket/2/93 107.3-9.5TCID50/ml
파상풍 톡소이드 5-10 CPU
비-대사성 오일 보강제 100-200㎕
희석제 - DMEM 함유 q.s.
젠타마이신 희석제 용적 ml당 30㎍
포름알데하이드 희석제 용적의 0.1%
4 내지 5월령의 30마리 말(20마리 백신접종군과 10마리 대조군)을 본 연구에 사용했다. 말은 두 처리군 중 하나로 무작위로 나누고, 지정된 백신 또는 대조군 제품 1.0ml 용량을 근육내(IM) 접종했다. 1차 면역화 후 3주 후에 1.0ml IM 추가 백신접종을 수행했다.
말은 즉시 백신접종하고 약 30일 후에 다시 백신접종했다. 말은 백신군 또는 대조군으로 무작위로 나누었다. 20마리 말에게는 VEWT/WNV/EHV-1/인플루엔자 백신을 투여하여 백신군으로 이용했다. 10마리 말에게는 항원 없이 백신에 사용된 부형제(젠타마이신 및 포름알데하이드)를 함유하는 보강 DMEM을 투여했다. 모든 투여에 사용한 비-대사성 오일 보강제는 광유인 것이 바람직하다.
독성 이종 WNV NY99 균주 바이러스의 항원공격 접종은 추가 백신접종 후 380일째 수행했다. 제2 말 코호트에게는 추가 접종 후 408일째 유사한 방식으로 항원공격했다.
혈청학적 평가를 위한 혈청 샘플은 1차 백신접종 전, 1차 용량의 백신접종 후 21일째(추가 백신접종일), 추가접종 후 매달, 항원공격일, 및 항원공격 후 7일과 14일째, 백신접종군 말 및 대조군 말로부터 수집했다. 체온과 혈청 샘플은 항원공격일, 항원공격 후 1일에서 6일까지 매일 2회씩, 항원공격 후 7-10일과 14일에 매일 수득했다. 또한, 임상 데이터는 15일 관찰 기간 동안 동일한 시간에 기록했다.
WNV NY99라 지칭된 이종 항원공격 바이러스는 본래 감염된 까마귀(CDC, Ft. Collins, CO)의 뇌에서 분리되었다. 항원공격일에, 스톡 바이러스를 얼음 상에서 해동하고, 바이러스를 말에게 접종하기 직전에 인산염 완충 식염수에 원하는 농도로 희석했다.
직장 온도는 항원공격 전일, 항원공격 일 및 항원공격 후 1일-14일에 1일 2회, 그 다음 14일-21일에 매일 백신접종군 말 및 대조군 말 각각에 대해, 보정된 전자식 온도계(GSA Electronics) 프로브를 이용하여 기록했다. 매일 직장 온도는 화씨(℉)로 기록했다.
백신접종군 말 및 대조군 말 각각의 정맥 혈액은 항원공격 일, 항원공격 후 1-6일에는 1일 2회, 7-10일에는 매일, 그리고 14일에 Vacutainer SST 관 내에 수집했다. 원심분리 후, 혈청을 분취하고 즉시 동결했다.
Vero 세포는 6웰 평판에서 융합성일 때까지 성장시켰다. 플라크 분석을 수행하기 위해, 혈청의 연속 10배 희석물을 96웰 평판에서 BA-1 배지(1% BSA, 250 mg/L 중탄산나트륨, 50 ㎕ 젠타마이신 및 2.5 ㎍ 암포테리신 B/ml를 50mM Tris, pH 7.6에 함유하는 MEM 염)에 제조했다. 혈청 희석물(1.0ml)을 6웰 평판의 각 웰에 접종하고 15분마다 진탕시키면서 45 내지 60분 동안 항온배양했다. 항온배양 후, 각 웰에 2ml의 중층(정상 농도의 2배로 제조한 페놀 레드 없는 MEM을 함유하고 4% FBS, 200 IU 페니실린 G/ml 및 100 ㎍ 스트렙토마이신/ml이 보충된 2X 배지 - 45℃로 가온됨)을 첨가했다. 평판을 37℃에서 항온배양했다.
접종 2일 후, 2X 배지와 2X 아가로스의 동량을 혼합하여 제조한 2X 아가로스를 함유하는 제2 중층 2ml를 각 웰에 첨가했다. 평판을 조사하고 접종 후 3일, 4일 및 5일째 각 웰의 플라크 수를 기록했다. 본래 물질 ml당 바이러스 역가는 웰에 존재하는 플라크 수(또는 동일한 희석율로 접종된 다중 웰의 평균치)와 계수되는 웰의 희석율을 곱하고 10을 곱하여 계산한다.
본 연구에는 표준 미세역가 혈청 중화 검사를 이용했다. 모든 혈청은 멸균한 평면 바닥의 96웰 미세역가 평판에서 희석율당 5웰과 5개의 검사 웰 각각마다 8개 웰 희석 연속물을 이용하여 검사했다. 5개 검사 웰 각각은 지시 바이러스 25㎕와 혼합된 혈청 희석물 25㎕ 및 약 4 x 104 세포를 함유하는 갓 접종된 베로 세포 현탁액 150㎕를 함유했다. 사용된 검사 지시 바이러스는 WNV NY99였다. 혈청 중화 항체 역가는 Reed-Muench ID50 역가로 나타냈다.
검사를 수행하기 위해, 각 검사 혈청의 2배 희석물은 검사 혈청 당 5개의 복제 웰과 8개 웰 희석 연속물을 이용하여 멸균한 평면 바닥의 미세역가 평판에서 제조했다. 희석물은 멸균 미세역가 팁을 이용하는 용적 조정가능한 일채널 또는 다채널 피펫팅 기구로 제조했다. 첫째 열의 5개 웰 각각에 첨가된 혈청의 용적은 50㎕였다. 다른 모든 웰에는 DMEM 25㎕(FBS 무함유)를 함유했다. 평판 아래로 연속 희석한 후, 마지막 열에서는 25㎕를 버렸다. 지시 바이러스의 소정의 희석물 25㎕를 각 검사 웰에 첨가했다. 그 다음, 평판을 혼합하고 5% CO2 중에서 37℃ 하에 항온배양했다. 항온배양 기간이 끝난 후, 4 x 104 Vero 세포를 함유하는 현탁액 150㎕를 각 검사 웰 및 세포 대조 웰에 첨가했다. 평판은 CO2 항온배양기에서 37℃ 하에 5 내지 7일 동안 항온배양하고, 이 때 평판은 WNV에 전형적인 CPE에 대해 현미경으로 조사했다.
조직병리 상태는 위원회 공인된 수의병리학자가 평가했다. 뇌교 또는 연수의 결함을 기술하는데 사용된 평점 시스템은 다음과 같다:
평점:
0 = 구획 내에 유의적인 병변이 없다.
0.5 = 실질 전반에 분산된 드물고 작은 다발성 신경교 소절.
1 = 경미한 비화농성 뇌염. 이것은 림프구 및 형질 세포와 함께 경미한 다발성 혈관주위 세포침윤 및 몇몇 단핵 염증 세포와 함께 신경교 세포로 구성된 드문 호중구 및 분산된 다발성 신경교 소절을 특징으로 한다. 때때로, 이 등급에는 최소 혈관주위 세포침윤 및 더욱 중간 정도의 분산된 신경교 소절이 있을 수 있다.
2 = 많은 혈관 주위의 중간 정도의 림프형질세포성 혈관주위 세포침윤 및 실질을 통해 분산된 신경교 소절의 다발성 축적을 특징으로 하는 중간 정도의 비화농성 뇌염
3 = 실질을 통한 다수의 분산된 신경교 소절과 함께 심한 림프형질세포성 혈관주위 세포침윤을 특징으로 하는 심한 비화농성 뇌염
결과 및 고찰
용량투여 시점에서 백신 투여에 대한 부작용은 없었다. 실험용 백신을 투여받은 4 내지 5월령의 망아지 모두 본 연구에서 전신 또는 주사 부위 부작용은 없었다. 이것은 분리주 NAEE159로부터 제조된 북미 주요 WNV 항원을 함유하는 WNV에 대한 본 발명의 백신의 우수한 안전성을 확인시켜준다.
이종 웨스트 나일 바이러스를 이용한 말 항원공격
바이러스혈증
10마리의 대조용 말은 각각(100%) 항원공격 후 적어도 1일 동안 바이러스혈증을 나타낸 반면, WNV 백신 군에 속하는 20마리 말 중 2마리(10%)만이 바이러스혈증을 나타냈다.
임상 징후
대조군에 속하는 10마리 말 중 7마리(70%)는 웨스트 나일 바이러스 감염과 일치하는 뇌척수염의 징후를 나타냈다. 이 동물들 각각은 항원공격 기간 중에 적어도 1일 동안 바이러스혈증을 나타냈다. WNV 백신군에서는 20마리 말 중 1마리(5%)만이 웨스트 나일 바이러스 감염과 일치하는 징후를 나타냈다. 특히, 대조군은 70%에서, 백신접종군은 5%에서만 임상 징후가 사망 또는 안락사로 진행되었다. 모든 대조군의 사망률은 바이러스혈증이어서, WNV로 인한 치명적 뇌염을 확인시켜 주었고, 이에 반해 사망한 백신접종군 동물 2마리 중 1마리만이 항원공격 기간 동안 바이러스혈증이었다.
혈청 중화 역가
백신접종한 말은 모두 백신접종 후 방어 수준의 혈청 중화(SN) 항체를 발생시켜 WNV 백신에 유리하게 반응했다. 백신접종 후 1년 이상, 백신접종된 말은 20마리 중 17마리(85%)가 방어적 SN 역가를 유지했다. 이에 반해, 대조용 말은 독성 WNV 항원공격 전에 상승 SN 역가를 나타내는 말은 없었다. 또한, 백신접종된 말은 모두 독성 WNV 항원공격 후 SN 역가의 기왕성 상승을 나타냈다.
조직병리학
중증도 점수는 연수 및 뇌교 모두에서 제공되었다. 또한, 이 효능 파라미터에 관해서는, 분리주 NAEE159로부터 제조된 북미 주요 WNV 항원을 함유하는 WNV 백신이 매우 효과적인 것으로 증명되었다. 대조군 말 중에서는 50%가 WNV 뇌염의 심한 병변을 나타낸 반면, 백신접종된 말에서는 10%만이 유사한 병변을 나타냈다.
고찰 및 결론
WNV 백신은 특정 주요 WNV 유전자형이 발생했을 때 북미 유행병 중인 2005년에 말에서 수득한 바이러스 분리주(북미 말 E159)로부터 제조했다. 이 유전자형은 바이러스의 엔벨로프(E) 단백질에서 159번째 아미노산을 특정하게 발린에서 알라닌으로 아미노산 변화시키는 것을 특징으로 하고(ATCC 수탁번호 AF196835인 WNV-NY99 분리주를 공개적으로 이용가능한 서열과 비교했을 때), 이것은 모든 상기 분리주를 더욱 강건하고 증식성으로 만들어 다른 WNV 분리주를 대체하며, 이 유전자형을 북미의 질병 유발성 WNV 분리주 중에서 주요 형으로 만들었다. 이러한 주요 유전자형으로부터 제조되었기 때문에, 본 연구에 사용된 백신은 이러한 E 단백질 프로필과 그 결과 수득되는 증식성을 가진 상기 모든 북미 주요 분리주로부터 제조된 백신에 의해 달성될 수 있는 특별한 안전성과 효능을 나타낸다. 특히, 종래 검사된 모든 WNV 백신은 다른 유전자형과 E 단백질 아미노산 서열을 가진 덜 증식성인 분리주, 즉 WNV NY99로부터 제조되었다. 이러한 핵산 서열, E 단백질 아미노산 서열, 바이러스 증식성 및 유행병을 유발하는 특별한 능력의 차이를 기반으로 하여, 북미 주요 분리주는 환경에서 NY99를 대체하고 있거나 대체해왔다. 특별한 유전자형 및 표현형(증식성), 및 가장 중요한 것으로 북미 주요 WNV 분리주의 압도적 환경 존재 및 WNV NY99의 부재는 북미 주요 웨스트 나일 바이러스 백신의 우수성에 대한 설득력있는 증거이다. 이러한 우수성은 북미 주요 분리주 북미 말 E159(NAEE159)(ATCC 수탁번호 PTA-9409)로부터 제조된 백신을 이용한 항원공격 연구에서 입증된 바와 같이 백신의 효능 및 안전성에 의해 확인된다.
본 연구에서는 4 내지 5월령의 말에게, WNV 성분이 분리주 NAEE159c(ATCC 수탁번호 PTA-9409)로부터 제조된 북미 주요 WNV 항원인, 적당한 항원량으로 배취화된 다성분 VEWT/WNV/EHV-1/말 인플루엔자 백신으로 안전하고 효과적으로 백신접종했다.
연구 말은 독성 이종 웨스트 나일 바이러스 균주 105 PFU를 이용하여 추가 백신접종 후 적어도 380일째 기관내 항원공격을 가했다. 말은 항원공격 후 14일 동안 임상 징후(체온 및 사망률 등), 바이러스혈증, 혈청 중화 역가, 및 안락사 및 부검 후 채취한 연수 및 뇌교의 절편으로부터 조직병리학 점수에 대해 평가했다.
항원공격 후 바이러스혈증 및 혈청 중화 역가는 백신 효능을 강하게 시사하는 본 연구의 주요 결과 변수였다. VEWT/WNV/EHV-1/인플루엔자 로트 916으로 1년보다 훨씬 전에 백신접종을 받은 말은 본 연구의 항원공격 후 바이러스혈증으로부터 90% 방어되었다. 이에 반해, 대조군 말은 100%가 항원공격 후 바이러스혈증을 나타냈다. 또한, 백신접종된 말의 혈청 중화 역가는 항원공격 후 14일째 대조군 말보다 훨씬 높았고, 이종 독성 WNV 항원공격 후 효과적인 백신의 전형적인 기억 반응을 나타냈다.
또한, 분리주 NAEE159로부터 제조된 북미 주요 WNV 항원을 함유하는 백신은 독성 WNV으로 이종 항원공격 후 뇌척수염으로부터 초래되는 임상 징후 및 사망률을 감소시켰다. 또한, 백신접종 후 적어도 1년 동안 백신 효능이 WNV 감염에 전형적인 병변의 감소에 의해 확인되었다.
본 연구는 분리주 NAEE159로부터 제조된 북미 주요 WNV 항원을 포함하는 적당한 용량의 항원으로 제조된 실험용 복합 백신의 2회 용량이 4 내지 5월령의 망아지에게 투여되었을 때, 웨스트 나일 바이러스로 독성 이종 항원공격 후 바이러스혈증, 임상 징후, 사망률 및 뇌염 병변으로부터 적어도 1년 동안 방어하는 면역 지속기간을 산출하는 방어 혈청학적 혈청 중화 역가를 안전하고 믿을만하게 효과적으로 자극한다는 것을 최초로 입증했다.
실시예 9
본 연구에서, 복합 백신은 WNV의 북미 주요 분리주인 북미 말 E159(NAEE159)(ATCC 수탁번호 PTA-9409)를 이용하여 제조했다. 이 뇌척수염-비강폐렴-인플루엔자-웨스트 나일 바이러스 백신, 동부, 서부 및 베네수엘라, 사멸 바이러스, 파상풍 톡소이드로 백신접종된 기니 피그로부터 채취한 2차 백신접종 14일 후 혈청 샘플을 모아서 웨스트 나일 바이러스 플라크 감소 중화(PRN)에 대해 검사했다. 백신접종된 기니 피그의 혈청을 북미 주요 WNV 분리주 및 WNV 분리주 NY99에 대한 중화 항체에 대해 검사했다. 주목할만하게, 이 백신은 NY99 WNV과 대조적으로 북미 주요 WNV에 대한 중화 항체를 자극하는 데 있어서 우수한 활성을 나타냈다. 이러한 데이터는 종래 NY99 WNV 분리주로부터 제조되거나 이를 기반으로 하는 덜 효과적인 백신과 대조적으로, 북미 주요 WNV 분리주로부터 제조된 WNV 백신이 우수한 효능이 있다는 결론을 지지해준다.
또한, 북미 주요 WNV 분리주, 북미 당나귀 E159(NADE159)로부터 제조된 백신 역시 전술한 바와 같이, 종래 NY99 기반 백신에 비해 이 백신의 우수한 효능을 나타낼 것이다. 따라서, 북미 특정 위치 기원이고 북미에서 여러 시기에 수득한, 다른 숙주 종으로부터 배양된 다수의 북미 주요 분리주 유래의 데이터는 백신 제조에 있어서 북미 주요 WNV 분리주의 예상치않은 놀라운 효능을 확인시켜 줄 것이다.
또한, 플라크 감소 중화 분석의 데이터는 북미 주요 WNV 분리주로부터 제조된 백신이 적어도 90%의 백신접종된 기니 피그에서 50% 바이러스 플라크 감소를 제공하고 말에서 WNV 항원공격에 대한 백신 방어에 상관성이 있으며, 적어도 1년의 면역 지속기간을 제공한다는 것을 입증해주었다. 말의 웨스트 나일 바이러스 백신접종/항원공격 데이터는 용량당 항원 포함 수준 107.6-9.0 TCID50 이상에서 상기 기니 피그 PRN 역가 결과와 상관성이 있었고, 말에게 1년 이상의 면역 지속기간을 제공하는 WNV 면역화 용량을 확인시켜 주었다. 또한, 이러한 기니 피그에서의 해당 용량은 기니 피그에서 북미 주요 WNV에 대한 적어도 1:12의 역가로 혈청 중화 항체를 자극한다.
본 명세서에 제공된 데이터는 총체적으로 WNV의 북미 주요 분리주로부터 제조된 백신의 예상치못한 효능을 증명하고, 중화 항체의 말 및 기니 피그 혈청 수준에서 백신 효능 간에 상관성을 명확히 해주며, 기니 피그에서 1:12 이상의 역가가 적어도 1년 이상의 면역 지속기간을 제공하는 효과적인 말 백신임을 증명해주고, 특히 NY99 WNV에 비해 북미 주요 WNV로부터 제조된 백신의 우수한 효능을 입증해준다.
재료 및 방법
뇌척수염-비강폐렴-인플루엔자-웨스트 나일 바이러스 백신, 동부, 서부 및 베네수엘라 사멸 바이러스, 파상풍 톡소이드에서 북미 주요 WNV 분리주, 북미 말 E159(NAEE159)(ATCC 수탁번호 PTA-9409)을 이용하여 제조한 웨스트 나일 바이러스 항원의 효능을 입증하고, 말 또는 기니 피그에서 측정할 수 있는 유효 용량을 확인하기 위해, 숙주 동물 백신접종/항원공격 연구를 기니 피그 백신접종/혈청학 연구와 함께 수행했다. 본 연구에서, 뇌척수염-비강폐렴-인플루엔자-웨스트 나일 바이러스 백신, 동부, 서부 및 베네수엘라, 사멸 바이러스, 파상풍 톡소이드로 백신접종된 기니 피그 유래의 2차 백신접종 14일 후 혈청 샘플을 모아서 검사했다. 또한, 숙주 동물에서 항원공격에 대한 방어와 상관성이 있는 역가를 측정하기 위해 플라크 감소 중화 분석도 수행했다. 이 역가는 기니 피그에서 1:12 이상인 것으로 측정되었다.
백신 제형
실험 연속물 (방어 용량 백신)
실험 연속물은 백신 중의 모든 항원에 대한 방어 항원 사양을 확인하기 위해 제형화했다.
최종 제형화된 백신은 용량 1ml당 다음과 같은 성분을 함유했다:
성분 1ml 용량
동부 말 뇌척수염 107.5-9.2TCID50/ml
서부 말 뇌척수염 108.2-9.2PFU/ml
베네수엘라 말 뇌척수염 107.7-9.2TCID50/ml
웨스트 나일 바이러스 (NAEE159로부터 제조된 북미 주요균) 107.3-9.2TCID50/ml
EHV-1 107.0-9.0TCID50/ml
인플루엔자 A2/Ohio/2003 107.3-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/Kentucky/95 107.3-9.5TCID50/ml
인플루엔자 A2/NewMarket/2/93 107.3-9.5TCID50/ml
파상풍 톡소이드 5-10 CPU
비-대사성 오일 보강제 100-200㎕
희석제 - DMEM 함유 q.s.
젠타마이신 희석제 용적 ml당 30㎍
포름알데하이드 희석제 용적의 0.1%
실험 연속물 916은 숙주 동물 백신접종 연구를 위해 제형화했다. 실험 연속물 916은 VEWT-WNV-EHV-1 및 3가지 말 인플루엔자 바이러스 A2 바이러스 균주를 함유하는 다성분 백신이다. 실험 연속물 916은 웨스트 나일 바이러스 항원 북미 말 E159(NAEE159) 107.6-9.2 TCID50/ml로 배취화했다. 이것이 말의 1ml 용량 백신이다.
이 백신은 또한 숙주 동물 백신접종시에 기니 피그에서도 검사하여 WNV 효능 및 실험용 동물 효능을 확인했다. 4반복 기니 피그 혈청 희석 실험은 실험 연속물 916에 대해 수행하여 1년 면역 지속기간(DOI) 백신에 대한 기니 피그 분석 기준을 정당화시켜 주었다.
실험 연속물 507(비교용 효능 연속물 )
본 명세서에 포함된 실험 연속물 507로부터의 데이터는 WNV 항원의 북미 주요 분리주로 제형화된 연속물이 종래 NY99 분리주에 비해 상관성이 있는 북미 주요 WNV 분리주의 우수한 효능을 기니 피그 역가로 측정하여 보여준다는 것을 입증한다.
기니 피그 혈청학적 평가
혈청은 다음과 같이 WNV 항체에 대해 검사했다:
1) 웨스트 나일 바이러스 지시 균주: 북미 말 E159(NAEE159)(ATCC 수탁번호 PTA-9409) 및 북미 당나귀 E159(NADE159)
2) Vero 세포에 대한 성장배지는 DEME + 5% FBS, 2mM L-글루타민 및 30 ㎍/ml 젠타마이신이다.
3) 검사 혈청을 위한 희석제는 DMEM + 30 ㎍/ml 젠타마이신이다.
4) 지시 바이러스 작업 용액을 위한 희석제는 DMEM + 10% 정상 기니 피그 혈청(WNV 분석에 특이적)이다.
5) 기니 피그 검사 혈청은 1:12로 희석했다.
7) 3ml 대신 4ml 중층을 사용한다(WNV 분석에 특이적).
8) 역가는 50% 플라스 감소로 계산한다.
9) 백신접종한 기니 피그 10마리 중 9마리는 효능을 증명하기 위해 항체 역가가 ≥1:12이어야 하고, 음성 기니 피그는 <1:4이어야 한다(SAM에서 VEE 분석과 같은 기준).
결과 및 고찰
웨스트 나일 바이러스의 혈청학적 평가
지시 바이러스로서 북미 말 E159(NAEE159)를 이용한 실험 연속물 916 복제물 I 웨스트 나일 기니 피그 플라크 감소 중화 결과
본 연구를 개시하고 25일 후에 기니 피그로부터 채혈했다.
Figure pct00011
[표 24] 지시 바이러스로서 북미 말 159(NAEE159)를 이용한 실험 연속물 916 복제물 II 웨스트 나일 기니 피그 플라크 감소 중화 결과
본 연구의 개시 후 35일째 기니 피그로부터 채혈했다.
Figure pct00012
[표 25] 지시 바이러스로서 북미 말 159(NAEE159)를 이용한 실험 연속물 916 복제물 III 웨스트 나일 기니 피그 플라크 감소 중화 결과
본 연구의 개시 후 35일째 기니 피그로부터 채혈했다.
Figure pct00013
[표 26] 지시 바이러스로서 북미 말 159(NAEE159)를 이용한 실험 연속물 916 복제물 IV 웨스트 나일 기니 피그 플라크 감소 중화 결과
본 연구의 개시 후 30일째 기니 피그로부터 채혈했다.
Figure pct00014
실험 연속물 507(북미 말 E159(NAEE159)의 우수한 효능을 입증함, 다른 북미 주요 백신, 예컨대 북미 당나귀 E159(NADE159)도 NY99 백신보다 우수한 효능을 제공할 것이다).
웨스트 나일 바이러스에 대한 기니 피그 혈청학적 평가
[표 27] 지시 바이러스로서 WNV NY1999 분리주를 이용한 실험 연속물 507 웨스트 나일 기니 피그 플라크 감소 중화 결과
Figure pct00015
[표 28] 지시 바이러스로서 북미 말 E159(NAEE159)를 이용한 실험 연속물 507 웨스트 나일 기니 피그 플라크 감소 중화 결과
Figure pct00016
고찰 및 결론
기니 피그에게 백신접종하고 혈청을 웨스트 나일 바이러스 항체에 대해 검사했다. 본 분석은 백신접종된 기니 피그에서 1:12의 역가가 북미 주요 WNV 분리주, 예컨대 북미 말 E159(NAEE159)를 이용하여 제조한 WNV 백신에서 적어도 1년의 면역 지속기간을 제공하는 말 백신접종/항원공격 연구에서의 방어와 상관성이 있다는 것을 입증해주었다.
기니 피그 백신접종과 병행하여, 북미 WNV 분리주, 북미 말 E159(NAEE159)를 이용하여 제조한 WNV 백신도 1차 면역화에 이어 3주후 추가 면역화를 통해 말(20마리 백신접종군 및 10마리 대조군)에게 투여했다. 추가 백신접종 후 1년 동안 말을 독성 웨스트 나일 바이러스 항원공격으로 처리했고, 미-백신접종군과 비교했을 때 방어성을 나타냈다. 백신접종된 말은 웨스트 나일 바이러스로 독성 이종 항원공격을 받은 후 바이러스혈증, 임상 징후, 사망률 및 뇌염 병변으로부터 방어되었다.
또한, 본 데이터는 WNV NY99 유래의 종래 개발된 백신과 반대로, 북미 주요 WNV를 이용하여 제조한 WNV 백신의 우수한 효능을 입증해준다. 백신접종된 기니 피그 유래의 혈청을 북미 주요 WNV 분리주 및 WNV NY99 분리주 모두에 대한 중화 항체에 대해 검사했다. 북미에서 흔히 발견되는 분리주, 소위 북미 주요(NAEE159) 분리주에 대한 역가는 북미에 더 이상 존재하는 것으로 보고되지 않고 북미에서 질환을 유발하는 것으로 보고되지 않은 분리주인 WNV NY99에 대한 역가와 비교했을 때 백신접종된 기니 피그에서 일관성 있게 더 높았다. 따라서, 이 백신은 NY99 WNV와 대조적으로 북미 주요 WNV에 대한 중화 항체를 자극하는데 있어서 우수한 활성을 보여주었다. 이 데이터는 북미 주요 WNV 분리주로부터 제조된 WNV 백신이 종래 덜 효과적인 NY99 WNV 분리주로부터 제조되거나 이를 기반으로 하는 백신에 비해 효능이 우수하다는 결론을 지지한다.
실시예 10
본 실시예는 본 발명에 사용된 북미 WNV 균주 및 북미 주요 WNV 균주 간의 유전자 차이를 예시한다.
재료 및 방법
WNV NY99 분리주와 신규의 우수한 백신을 제조하기에 적합한 북미 주요 WNV 분리주의 게놈 관련 부위를 서열분석하고 주요 유전자 차이를 비교 확인했다. 백신 제조에 사용된 북미 주요 분리주의 예로는 북미 말 E159(NAEE159)(ATCC 수탁번호 PTA-9409) 및 북미 당나귀 E159(NADE159)를 포함한다.
결과 및 고찰
이러한 WNV 분리주에서 주요 엔벨로프 (E) 단백질 및 비-구조성 5(NS5) 단백질을 표준 실험실 기술로 서열분석하여, WNV NY99와 대조적인 뉴클레오타이드 서열의 유전자 차이를 측정했다. 주목할만하게, 북미 말 E159(NAEE159) 및 북미 당나귀 E159(NADE159)를 구체예로 하는 북미 주요 분리주는, 북미 주요 WNV 분리주를 특징적으로 나타내고 NY99 WNV와 구별되는 변화, 즉 E 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 위치 1442 및 2466에서 각각 U에서 C로의 돌연변이 및 C에서 U로의 돌연변이와 NS5 단백질을 암호화하는 서열에서 위치 9352에서 C에서 U로의 돌연변이를 나타냈다. 도 10 내지 17은 다양한 분리주 영역의 서열 정렬을 도시한 것이다. E 영역의 정렬은 GenBank에 AY590223으로 기탁된 북미 주요 분리주(WN 02 분리주) 및 공개적으로 입수가능한 NY 99 분리주(GenBank에 AY590210으로 기탁됨)의 참조 서열에 상대적이다. NS5 영역의 정렬은 GenBank에 AY369440으로 기탁된 북미 주요 분리주(WN 02 분리주) 및 공개적으로 입수가능한 NY 99 분리주(GenBank에 AY369442로 기탁됨)의 참조 서열에 상대적이다. 이러한 정렬에서 밝혀지듯이, 북미 주요 WNV 분리주는 북미 주요 WNV 분리주의 정의에서 규정된 바와 같이 NY99 분리주에 상대적인 동일한 서열 변화를 보유한다. 이러한 서열은 서열번호 1 내지 22에 제시했고, WN99 분리주의 전체 길이 게놈은 서열번호 23에 제시했으며, 서열번호 23의 전체 길이 게놈에 의해 암호화된 단백질은 서열번호 24에 제시했다.
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-9409 20080814 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-9410 20080814 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-9411 20080814 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-9412 20080814 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-9522 20080923 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-9523 20080923 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-9524 20080923 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-9525 20080923 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-9526 20080923
<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. <120> West Nile Virus vaccine <130> 054870-130750 <150> US 61/093,081 <151> 2008-08-29 <150> US 61/117,086 <151> 2008-11-21 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 608 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 1 cggggggaat gtcacacttg catttacaac atgatgggaa agagagagaa aaaacccgga 60 gaattcggaa aggccaaggg aagcagagcc atttggttca tgtggctcgg agctcgcttt 120 ctggagttcg aggctctggg ttttctcaat gaagaccact ggcttggaag aaagaactca 180 ggaggaggtg tcgagggctt gggcctccaa aaactgggtt acatcctgcg tgaagttggc 240 acccggcctg ggggcaagat ctatgctgat gacacagctg gctgggacac ccgcatcacg 300 agagctgact tggaaaatga agctaaggtg cttgagctgc ttgatgggga acatcggcgt 360 cttgccaggg ccatcattga gctcacctat cgtcacaaag ttgtgaaagt gatgcgcccg 420 gctgctgatg gaagaaccgt catggatgtt atctccagag aagatcagag ggggagtgga 480 caagttgtca cctacgccct aaacactttc accaacctgg ccgtccagct ggtgaggatg 540 atggaagggg aaggagtgat tggcccagat gatgtggaga aactcacaaa agggaaagga 600 cccaaagt 608 <210> 2 <211> 608 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 2 cggggggaat gtcacacttg catttacaac atgatgggaa agagagagaa aaaacccgga 60 gagttcggaa aggccaaggg aagcagagcc atttggttca tgtggctcgg agctcgcttt 120 ctggagttcg aggctctggg ttttctcaat gaagaccact ggcttggaag aaagaactca 180 ggaggaggtg tcgagggctt gggcctccaa aaactgggtt acatcctgcg tgaagttggc 240 acccggcctg ggggcaagat ctatgctgat gacacagctg gctgggacac ccgcatcacg 300 agtgctgact tggaaaatga agctaaggtg cttgagttgc ttgatgggga acatcggcgt 360 cttgccaggg ccatcattga gctcacctat cgtcacaaag ttgtgaaagt gatgcgcccg 420 gctgctgatg gaagaaccgt catggatgtt atctccagag aagatcagag ggggagtgga 480 caagttgtca cctacgccct aaacactttc accaacctgg ccgtccagct ggtgaggatg 540 atggaagggg aaggagtgat tggcccagat gatgtggaga aactcacaaa agggaaagga 600 cccaaagt 608 <210> 3 <211> 909 <212> DNA <213> West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 gcaatgcagc tttgggtgcc atgtttgaag agcagaatca atggaggagc gccaganaag 60 cagttgaaga tccaaaattt tgggagatgg tggatgagga gcgcgaggca catctgcggg 120 gggaatgtca cacttgcatt tacaacatga tgggaaagag agagaaaaaa cccggagagt 180 tcggaaaggc taagggaagc agagccattt ggttcatgtg gctcggagct cgctttctgg 240 agttcgaggc tctgggtttt ctcaatgaag accactggct tggaagaaag aactcaggag 300 gaggtgtcga gggcttgggc ctccaaaaac tgggttacat cctgcgtgaa gttggcaccc 360 gacctggggg caagatctat gctgatgaca cagccggctg ggacacccgc atcacgagag 420 ctgacttgga aaatgaagct aaggtgcttg agttgcttga tggggaacat cggcgtcttg 480 ccagggccat cattgagctc acctatcgtc acaaagttgt gaaagtgatg cgcccggctg 540 ctgatggaag aaccgtcatg gatgttatct ccagagaaga tcagaggggg agtggacaag 600 ttgtcaccta cgccctaaac actttcacca acctggccgt ccagctggtg aggatgatgg 660 aaggggaagg agtgattggc ccagatgatg tggagaaact cacaaaaggg aaaggaccca 720 aagtcaggac ctggctgttt gagaatgggg aagaaagact cagccgcatg gctgtcagtg 780 gagatgactg tgtggtaaag cccctggacg atcgctttgc cacctcgctc cacttcctca 840 atgctatgtc aaaggttcgc aaagacatcc aagagtggaa accgtcaact ggatggtatg 900 attggcagc 909 <210> 4 <211> 975 <212> DNA <213> West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (813)..(813) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (881)..(882) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 tcncggattc cncgcacgag atgtattggg tgagtcgagc ttcaggcaat gtggtacatt 60 cagtgaatat gaccagccag gtgctcctag gaagaatgga aaaaaggacc tggaagggac 120 cccaatacga ggaagatgta aacttgggaa gtggaaccag ggcggtggga aaacccctgc 180 tcaactcaga caccagtaaa atcaagaaca ggattgaacg actcaggcgt gagtacagtt 240 cgacgtggca ccacgatgag aaccacccat atagaacctg gaactatcac ggcagttatg 300 atgtgaagcc cacaggctcc gccagttcgc tggttaatgg agtggtcagg ctcctctcaa 360 aaccatggga caccatcacg aatgttacca ccatggccat gactgacact actcccttcg 420 ggcagcagcg agtgttcaaa gagaaggtgg acacgaaagc tcctgaaccg ccagaaggag 480 tgaagtacgt gctcaacgag accaccaact ggttgtgggc gtttttggcc agagaaaaac 540 gtcccagaat gtgctctcga gaggaattca taagaaaggt caacagcaat gcagctttgg 600 gtgccatgtt tgaagagcag aatcaatgga ggagcgccag agaagcagtt gaagatccaa 660 aattttggga gatggtggat gaggagcgcg aggcacatct gcggggggaa tgtcacactt 720 gcatttacaa catgatggga aagagagaga aaaaacccgg agagttcgga aaggctaagg 780 gaagcagagc catttggttc atgtggctcg ganctcgctt tctggagttc gaggctctgg 840 gttttctcaa tgaagaccac tggcttggaa gaaagaactc nngaggaggt gtcgagggct 900 tgggcctcca aaaactgggt tacatcctgc gtgaagttgg cacccgacct gggggcaaga 960 tctatgctga tgaca 975 <210> 5 <211> 957 <212> DNA <213> West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (83)..(83) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (130)..(130) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 aatggagngg tcaggctcct ctcaaaaccc ntgggacacc atcacgaatg ntaccaccat 60 ggccatgact gacactactc ccnttcgggc agcagcgagt gttcaaagag aaggtggaca 120 cgaaagctcn tgaaccgcca gaaggagtga agtacgtgct caacgagacc accaactggt 180 tgtgggcgtt tttggccaga gaaaaacgtc ccagaatgtg ctctcgagag gaattcataa 240 gaaaggtcaa cagcaatgca gctttgggtg ccatgtttga agagcagaat caatggagga 300 gcgccagaga agcagttgaa gatccaaaat tttgggagat ggtggatgag gagcgcgagg 360 cacatctgcg gggggaatgt cacacttgca tttacaacat gatgggaaag agagagaaaa 420 aacccggaga gttcggaaag gctaagggaa gcagagccat ttggttcatg tggctcggag 480 ctcgctttct ggagttcgag gctctgggtt ttctcaatga agaccactgg cttggaagaa 540 agaactcagg aggaggtgtc gagggcttgg gcctccaaaa actgggttac atcctgcgtg 600 aagttggcac ccgacctggg ggcaagatct atgctgatga cacagccggc tgggacaccc 660 gcatcacgag agctgacttg gaaaatgaag ctaaggtgct tgagttgctt gatggggaac 720 atcggcgtct tgccagggcc atcattgagc tcacctatcg tcacaaagtt gtgaaagtga 780 tgcgcccggc tgctgatgga agaaccgtca tggatgttat ctccagagaa gatcagaggg 840 ggagtggaca agttgtcacc tacgccctaa acactttcac caacctggcc gtccagctgg 900 tgaggatgat ggaaggggaa ggagtgattg gcccagatga tgtggagaaa ctcacaa 957 <210> 6 <211> 961 <212> DNA <213> West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (62)..(63) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> n is a, c, g, or t <400> 6 gggaccccaa tacgaggaag atgtaaactn gggaagtgga nccagggcgg tgggaaaacc 60 cnngctcaac tcagacacca gtaaaatcaa gaacaggatt gaacgantca ggcgtgagta 120 cagttcgacg tggcaccacg atgagaacca cccatataga acctggaact atcacggcag 180 ttatgatgtg aagcccacag gctccgccag ttcgctggtt aatggagtgg tcaggctcct 240 ctcaaaacca tgggacacca tcacgaatgt taccaccatg gccatgactg acactactcc 300 cttcgggcag cagcgagtgt tcaaagagaa ggtggacacg aaagctcctg aaccgccaga 360 aggagtgaag tacgtgctca acgagaccac caactggttg tgggcgtttt tggccagaga 420 aaaacgtccc agaatgtgct ctcgagagga attcataaga aaggtcaaca gcaatgcagc 480 tttgggtgcc atgtttgaag agcagaatca atggaggagc gccagagaag cagttgaaga 540 tccaaaattt tgggagatgg tggatgagga gcgcgaggca catctgcggg gggaatgtca 600 cacttgcatt tacaacatga tgggaaagag agagaaaaaa cccggagagt tcggaaaggc 660 taagggaagc agagccattt ggttcatgtg gctcggagct cgctttctgg agttcgaggc 720 tctgggtttt ctcaatgaag accactggct tggaagaaag aactcaggag gaggtgtcga 780 gggcttgggc ctccaaaaac tgggttacat cctgcgtgaa gttggcaccc gacctggggg 840 caagatctat gctgatgaca cagccggctg ggacacccgc atcacgagag ctgacttgga 900 aaatgaagct aaggtgcttg agttgcttga tggggaacat cggcgtcttg ccagggccat 960 c 961 <210> 7 <211> 1503 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 7 ttcaactgcc ttggaatgag caacagagac ttcttggaag gagtgtctgg agcaacatgg 60 gtggatttgg ttctcgaagg cgacagctgc gtgactatca tgtctaagga caagcctacc 120 atcgatgtga agatgatgaa tatggaggcg gccaacctgg cagaggtccg cagttattgc 180 tatttggcta ccgtcagcga tctctccacc aaagctgcgt gcccgaccat gggagaagct 240 cacaatgaca aacgtgctga cccagctttt gtgtgcagac aaggagtggt ggacaggggc 300 tggggcaacg gctgcggact atttggcaaa ggaagcattg acacatgcgc caaatttgcc 360 tgctctacca aggcaatagg aagaaccatc ttgaaagaga atatcaagta cgaagtggcc 420 atttttgtcc atggaccaac tactgtggag tcgcacggaa actactccac acaggttgga 480 gccactcagg cagggagatt cagcatcact cctgcggcgc cttcacacac actaaagctt 540 ggagaatatg gagaggtgac agtggactgt gaaccacggt cagggattga caccaatgca 600 tactacgtga tgactgttgg aacaaagacg ttcttggtcc atcgtgagtg gttcatggac 660 ctcaacctcc cttggagcag tgctggaagt actgtgtgga ggaacagaga gacgttaatg 720 gagtttgagg aaccacacgc cacgaagcag tctgtgatag cattgggctc acaagaggga 780 gctctgcagc aagctttggc tggagccatt cctgtggaat tttcaagcaa cactgtcaag 840 ttgacgtcgg gtcatttgaa gtgtagagtg aagatggaaa aattgcagtt gaagggaaca 900 acctatggcg tctgttcaaa ggctttcaag tttcttggga ctcccgcaga cacaggtcac 960 ggcactgtgg tgttggaatt gcagtacact ggcacggatg gaccttgcaa agttcctatc 1020 tcgtcagtgg cttcattgaa cgacctaacg ccagtgggca gattggtcac tgtcaaccct 1080 tttgtttcag tggccacggc caacgctaag gtcctgattg aattggaacc accctttgga 1140 gactcataca tagtggtggg cagaggagaa caacagatca atcaccattg gcacaagtct 1200 ggaagcagca ttggcaaagc ctttacaacc accctcaaag gagcgcagag actagccgct 1260 ctaggagaca cagcttggga ctttggatca gttggagggg tgttcacctc agttgggaag 1320 gctgtccatc aagtgttcgg aggagcattc cgctcactgt tcggaggcat gtcctggata 1380 acgcaaggat tgctgggggc tctcctgttg tggatgggca tcaatgctcg tgataggtcc 1440 atagctctca cgtttctcgc agttggagga gttctgctct tcctctccgt gaacgtgcac 1500 gct 1503 <210> 8 <211> 1503 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 8 ttcaactgcc ttggaatgag caacagagac ttcttggaag gagtgtctgg agcaacatgg 60 gtggatttgg ttctcgaagg cgacagctgc gtgactatca tgtctaagga caagcctacc 120 atcgatgtga agatgatgaa tatggaggcg gccaacctgg cagaggtccg cagttattgc 180 tatttggcta ccgtcagcga tctctccacc aaagctgcgt gcccgaccat gggagaagct 240 cacaatgaca aacgtgctga cccagctttt gtgtgcagac aaggagtggt ggacaggggc 300 tggggcaacg gctgcggact atttggcaaa ggaagcattg acacatgcgc caaatttgcc 360 tgctctacca aggcaatagg aagaaccatc ttgaaagaga atatcaagta cgaagtggcc 420 atttttgtcc atggaccaac tactgtggag tcgcacggaa actattccac acaggctgga 480 gccactcagg cagggagatt cagcatcact cctgcggcgc cttcatacac actaaagctt 540 ggagaatatg gagaggtgac agtggactgt gaaccacggt cagggattga caccaatgca 600 tactacgtga tgactgttgg aacaaagacg ttcttggtcc atcgtgagtg gttcatggac 660 ctcaacctcc cttggagcag tgctggaagt actgtgtgga ggaacagaga gacgttaatg 720 gagtttgagg aaccacacgc cacgaagcag tctgtgatag cattgggctc acaagaggga 780 gctctgcatc aagctttggc tggagccatt cctgtggaat tttcaagcaa cactgtcaag 840 ttgacgtcgg gtcatttgaa gtgtagagtg aagatggaaa aattgcagtt gaagggaaca 900 acctatggcg tctgttcaaa ggctttcaag tttcttggga ctcccgcaga cacaggtcac 960 ggcactgtgg tgttggaatt gcagtacact ggcacggatg gaccttgcaa agttcctatc 1020 tcgtcagtgg cttcattgaa cgacctaacg ccagtgggca gattggtcac tgtcaaccct 1080 tttgtttcag tggccacggc caacgctaag gtcctgattg aattggaacc accctttgga 1140 gactcataca tagtggtggg cagaggagaa caacagatca atcaccattg gcacaagtct 1200 ggaagtagca ttggcaaagc ctttacaacc accctcaaag gagcgcagag actagccgct 1260 ctaggagaca cagcttggga ctttggatca gttggagggg tgttcacctc agttgggaag 1320 gctgtccatc aagtgttcgg aggagcattc cgctcactgt tcggaggcat gtcctggata 1380 acgcaaggat tgctgggggc tctcctgttg tggatgggca tcaatgctcg tgataggtcc 1440 atagctctca cgtttctcgc agttggagga gttctgctct tcctctccgt gaacgtgcat 1500 gct 1503 <210> 9 <211> 1376 <212> DNA <213> West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (1358)..(1358) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 gatgtggaga gaatatggag gcggccaacc tggcagaggt ccgcagttat tgctatttgg 60 ctaccgtcag cgatctctcc accaaagctg cgtgcccgac catgggagaa gctcacaatg 120 acaaacgtgc tgacccagct tttgtgtgca gacaaggagt ggtggacagg ggctggggca 180 acggctgcgg actatttggc aaaggaagca ttgacacatg cgccaaattt gcctgctcta 240 ccaaggcaat aggaagaacc atcttgaaag agaatatcaa gtacgaagtg gccatttttg 300 tccatggacc aactactgtg gagtcgcacg gaaactactc cacacaggtt ggagccactc 360 aggcagggag attcagcatc actcctgcgg cgccttcata cacactaaag cttggagaat 420 atggagaggt gacagtggac tgtgaaccac ggtcagggat tgacaccaat gcatactatg 480 tgatgactgt tggaacaaag acgttcttgg tccatcgtga gtggttcatg gacctcaacc 540 tcccttggag cagtgctgga agtactgtgt ggaggaacag agagacgtta atggagtttg 600 aggaaccaca cgccacgaag cagtctgtga tagcattggg ctcacaagag ggagctctgc 660 atcaagcttt ggctggagcc attcctgtgg aattttcaag caacactgtc aagttgacgt 720 cgggtcattt gaagtgtaga gtgaagatgg aaaaattgca gttgaaggga acaacctatg 780 gcgtctgttc aaaggctttc aagtttcttg ggactcccgc agacacaggt cacggcactg 840 tggtgttgga attgcagtac actggcacgg atggaccttg caaagttcct atctcgtcag 900 tggcttcatt gaacgaccta acgccagtgg gcagattggt cactgtcaac ccttttgttt 960 cagtggccac ggccaacgct aaggtcctga ttgaattgga accacccttt ggagactcat 1020 acatagtggt gggcagagga gaacaacaga tcaatcacca ttggcacaag tctggaagca 1080 gcattggcaa agcctttaca accaccctca aaggagcgca gagactagcc gctctaggag 1140 acacagcttg ggactttgga tcagttggag gggtgttcac ctcagttggg aaggctgtcc 1200 atcaagtgtt cggaggagca ttccgctcac tgttcggagg catgtcctgg ataacgcaag 1260 gattgctggg ggctctcctg ttgtggatgg gcatcaatgc tcgtgatagg tccatagctc 1320 tcacgtttct cgcagttgga ggagttctgc tcttcctntc cgtgaacgtg cacgct 1376 <210> 10 <211> 1376 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 10 gatgtggaga gaatatggag gcggccaacc tggcagaggt ccgcagttat tgctatttgg 60 ctaccgtcag cgatctctcc accaaagctg cgtgcccgac catgggagaa gctcacaatg 120 acaaacgtgc tgacccagct tttgtgtgca gacaaggagt ggtggacagg ggctggggca 180 acggctgcgg actatttggc aaaggaagca ttgacacatg cgccaaattt gcctgctcta 240 ccaaggcaat aggaagaacc atcttgaaag agaatatcaa gtacgaagtg gccatttttg 300 tccatggacc aactactgtg gagtcgcacg gaaactactc cacacaggct ggagccactc 360 aggcagggag attcagcatc actcctgcgg cgccttcata cacactaaag cttggagaat 420 atggagaggt gacagtggac tgtgaaccac ggtcagggat tgacaccaat gcatactacg 480 tgatgactgt tggaacaaag acgttcttgg tccatcgtga gtggttcatg gacctcaacc 540 tcccttggag cagtgctgga agtactgtgt ggaggaacag agagacgtta atggagtttg 600 aggaaccaca cgccacgaag cagtctgtga tagcattggg ctcacaagag ggagctctgc 660 atcaagcttt ggctggagcc attcctgtgg aattttcaag caacactgtc aagttgacgt 720 cgggtcattt gaagtgtaga gtgaagatgg aaaaattgca gttgaaggga acaacctatg 780 gcgtctgttc aaaggctttc aagtttcttg ggactcccgc agacacaggt cacggcactg 840 tggtgttgga attgcagtac actggcacgg atggaccttg caaagttcct atctcgtcag 900 tggcttcatt gaacgaccta acgccagtgg gcagattggt cactgtcaac ccttttgttt 960 cagtggccac ggccaacgct aaggtcctga ttgaattgga accacccttt ggagactcat 1020 acatagtggt gggcagagga gaacaacaga tcaatcacca ttggcacaag tctggaagca 1080 gcattggcaa agcctttaca accaccctca aaggagcgca gagactagcc gctctaggag 1140 acacagcttg ggactttgga tcagttggag gggtgttcac ctcagttggg aaggctgtcc 1200 atcaagtgtt cggaggagca ttccgctcac tgttcggagg catgtcctgg ataacgcaag 1260 gattgctggg ggctctcctg ttgtggatgg gcatcaatgc tcgtgatagg tccatagctc 1320 tcacgtttct cgcagttgga ggagttctgc tcttcctctc cgtgaacgtg catgct 1376 <210> 11 <211> 1376 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 11 gatgtggaga gaatatggag gcggccaacc tggcagaggt ccgcagttat tgctatttgg 60 ctaccgtcag cgatctctcc accaaagctg cgtgcccgac catgggagaa gctcacaatg 120 acaaacgtgc tgacccagct tttgtgtgca gacaaggagt ggtggacagg ggctggggca 180 acggctgcgg actatttggc aaaggaagca ttgacacatg cgccaaattt gcctgctcta 240 ccaaggcaat aggaagaacc atcttgaaag agaatatcaa gtacgaagtg gccatttttg 300 tccatggacc aactactgtg gagtcgcacg gaaactactc cacacaggct ggagccactc 360 aggcagggag attcagcatc actcctgcgg cgccttcata cacactaaag cttggagaat 420 atggagaggt gacagtggac tgtgaaccac ggtcagggat tgacaccaat gcatactacg 480 tgatgactgt tggaacaaag acgttcttgg tccatcgtga gtggttcatg gacctcaacc 540 tcccttggag cagtgctgga agtactgtgt ggaggaacag agagacgtta atggagtttg 600 aggaaccaca cgccacgaag cagtctgtga tagcattggg ctcacaagag ggagctctgc 660 atcaagcttt ggctggagcc attcctgtgg aattttcaag caacactgtc aagttgacgt 720 cgggtcattt gaagtgtaga gtgaagatgg aaaaattgca gttgaaggga acaacctatg 780 gcgtctgttc aaaggctttc aagtttcttg ggactcccgc agacacaggt cacggcactg 840 tggtgttgga attgcagtac actggcacgg atggaccttg caaagttcct atctcgtcag 900 tggcttcatt gaacgatcta acgccagtgg gcagattggt cactgtcaac ccttttgttt 960 cagtggccac ggccaacgct aaggtcctga ttgaattgga accacccttt ggagactcat 1020 acatagtggt gggcagagga gaacaacaga tcaatcacca ttggcacaag tctggaagca 1080 gcattggcaa agcctttaca accaccctca aaggagcgca gagactagcc gctctaggag 1140 acacagcttg ggactttgga tcagttggag gggtgttcac ctcagttggg aaggctgtcc 1200 atcaagtgtt cggaggagca ttccgcacac tgttcggagg catgtcctgg ataacgcaag 1260 gattgctggg ggctctcctg ttgtggatgg gcatcaatgc tcgtgatagg tccatagctc 1320 tcacgtttct cgcagttgga ggagttctgc tcttcctctc cgtgaacgtg catgct 1376 <210> 12 <211> 608 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 12 cggggggaat gtcacacttg catttacaac atgatgggaa agagagagaa aaaacccgga 60 gaattcggaa aggccaaggg aagcagagcc atttggttca tgtggctcgg agctcgcttt 120 ctggagttcg aggctctggg ttttctcaat gaagaccact ggcttggaag aaagaactca 180 ggaggaggtg tcgagggctt gggcctccaa aaactgggtt acatcctgcg tgaagttggc 240 acccggcctg ggggcaagat ctatgctgat gacacagctg gctgggacac ccgcatcacg 300 agagctgact tggaaaatga agctaaggtg cttgagctgc ttgatgggga acatcggcgt 360 cttgccaggg ccatcattga gctcacctat cgtcacaaag ttgtgaaagt gatgcgcccg 420 gctgctgatg gaagaaccgt catggatgtt atctccagag aagatcagag ggggagtgga 480 caagttgtca cctacgccct aaacactttc accaacctgg ccgtccagct ggtgaggatg 540 atggaagggg aaggagtgat tggcccagat gatgtggaga aactcacaaa agggaaagga 600 cccaaagt 608 <210> 13 <211> 608 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 13 cggggggaat gtcacacttg catttacaac atgatgggaa agagagagaa aaaacccgga 60 gagttcggaa aggccaaggg aagcagagcc atttggttca tgtggctcgg agctcgcttt 120 ctggagttcg aggctctggg ttttctcaat gaagaccact ggcttggaag aaagaactca 180 ggaggaggtg tcgagggctt gggcctccaa aaactgggtt acatcctgcg tgaagttggc 240 acccggcctg ggggcaagat ctatgctgat gacacagctg gctgggacac ccgcatcacg 300 agtgctgact tggaaaatga agctaaggtg cttgagttgc ttgatgggga acatcggcgt 360 cttgccaggg ccatcattga gctcacctat cgtcacaaag ttgtgaaagt gatgcgcccg 420 gctgctgatg gaagaaccgt catggatgtt atctccagag aagatcagag ggggagtgga 480 caagttgtca cctacgccct aaacactttc accaacctgg ccgtccagct ggtgaggatg 540 atggaagggg aaggagtgat tggcccagat gatgtggaga aactcacaaa agggaaagga 600 cccaaagt 608 <210> 14 <211> 981 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 14 ggaactatcc ggagtatgat gtgaagctcg ctgtcaatga gtgtcaggct cttcaaaacc 60 tgggacccat ccgaaccgcc atgactgcac tactcccttc gggcagcagc gagtgttcaa 120 agagaaggtg gacacgaaag ctcgaaccgc cagaaggagt gaagtacgtg ctcaacgaga 180 ccaccaactg gttgtgggcg tttttggcca gagaaaaacg tcccagaatg tgctctcgag 240 agatagaaag gtcaacagca atgcagcttt gggtgccatg tttgaagagc agaatcaatg 300 gaggagcgcc agagaagcag ttgaagatcc aaaattttgg gagatggtgg atgaggagcg 360 cgaggcacat ctgcgggggg aatgtcacac ttgcatttac aacatgatgg gaaagagaga 420 gaaaaaaccc ggagagttcg gaaaggccaa gggaagcaga gccatttggt tcatgtggct 480 cggagctcgc tttctggagt tcgaggctct gggttttctc aatgaagatc actggcttgg 540 aagaaagaac tcaggaggag gtgtcgaggg cttgggcctc caaaaactgg gttacatcct 600 gcgtgaagtt ggcacccggc ctgggggcaa gatctatgct gatgacacag ctggctggga 660 cacccgcatc acgagagctg acttggaaaa tgaagctaag gtgcttgagc tgcttgatgg 720 ggaacatcgg cgtcttgcca gggccatcat tgagctcacc tatcgtcaca aagttgtgaa 780 agtgatgcgc ccggctgctg atggaagaac cgtcatggat gttatctcca gagaagatca 840 gagggggagt ggacaagttg tcacctacgc cctaaacact ttcaccaacc tggccgtcca 900 gctggtgagg atgatggaag gggaaggagt gattggccca gatgatgtgg agaaactcac 960 aaaagggaaa ggacccaaag t 981 <210> 15 <211> 974 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 15 ttcgctgtca atggagtgtc aggctcctct caaaaccatg ggacaccatc acgaatccac 60 catggccatg actgacacta ctcccttcgg gcagcagcga gtgttcaaag agaaggtgga 120 cacgaaagct gaaccgccag aaggagtgaa gtacgtgctc aacgagacca ccaactggtt 180 gtgggcgttt ttggccagag aaaaacgtcc cagaatgtgc tctcgagagg aattcataga 240 aaggtcaaca gcaatgcagc tttgggtgcc atgtttgaag agcagaatca atggaggagc 300 gccagagaag cagttgaaga tccaaaattt tgggagatgg tggatgagga gcgcgaggca 360 catctgcggg gggaatgtca cacttgcatt tacaacatga tgggaaagag agagaaaaaa 420 cccggagagt tcggaaaggc caagggaagc agagccattt ggttcatgtg gctcggagct 480 cgctttctgg agttcgaggc tctgggtttt ctcaatgaag accactggct tggaagaaag 540 aactcaggag gaggtgtcga gggcttgggc ctccaaaaac tgggttacat cctgcgtgaa 600 gttggcaccc ggcctggggg caagatctat gctgatgaca cagctggctg ggacacccgc 660 atcacgagag ctgacttgga aaatgaagct aaggtgcttg agttgcttga tggggaacat 720 cggcgtcttg ccagggccat cattgagctc acctatcgtc acaaagttgt gaaagtgatg 780 cgcccggctg ctgatggaag aaccgtcatg gatgttatct ccagagaaga tcagaggggg 840 agtggacaag ttgtcaccta cgccctaaac actttcacca acctggccgt ccagctggtg 900 aggatgatgg aaggggaagg agtgattggc ccagatgatg tggagaaact cacaaaaggg 960 aaaggaccca aagt 974 <210> 16 <211> 970 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 16 aatggagggt caggctcctc tcaaaacctg ggacaccatc acgaatgtac caccatggcc 60 atgactgaca ctactccctt cgggcagcag cgagtgttca aagagaaggt ggacacgaaa 120 gctctgaacc gccagaagga gtgaagtacg tgctcaacga gaccaccaac tggttgtggg 180 cgtttttggc cagagaaaaa cgtcccagaa tgtgctctcg agaggaattc ataagaaagg 240 tcaacagcaa tgcagctttg ggtgccatgt ttgaagagca gaatcaatgg aggagcgcca 300 gagaagcagt tgaagatcca aaattttggg agatggtgga tgaggagcgc gaggcacatc 360 tgcgggggga atgtcacact tgcatttaca acatgatggg aaagagagag aaaaaacccg 420 gagagttcgg aaaggctaag ggaagcagag ccatttggtt catgtggctc ggagctcgct 480 ttctggagtt cgaggctctg ggttttctca atgaagacca ctggcttgga agaaagaact 540 caggaggagg tgtcgagggc ttgggcctcc aaaaactggg ttacatcctg cgtgaagttg 600 gcacccgacc tgggggcaag atctatgctg atgacacagc cggctgggac acccgcatca 660 cgagagctga cttggaaaat gaagctaagg tgcttgagtt gcttgatggg gaacatcggc 720 gtcttgccag ggccatcatt gagctcacct atcgtcacaa agttgtgaaa gtgatgcgcc 780 cggctgctga tggaagaacc gtcatggatg ttatctccag agaagatcag agggggagtg 840 gacaagttgt cacctacgcc ctaaacactt tcaccaacct ggccgtccag ctggtgagga 900 tgatggaagg ggaaggagtg attggcccag atgatgtgga gaaactcaca aaagggaaag 960 gacccaaagt 970 <210> 17 <211> 1503 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 17 ttcaactgcc ttggaatgag caacagagac ttcttggaag gagtgtctgg agcaacatgg 60 gtggatttgg ttctcgaagg cgacagctgc gtgactatca tgtctaagga caagcctacc 120 atcgatgtga agatgatgaa tatggaggcg gccaacctgg cagaggtccg cagttattgc 180 tatttggcta ccgtcagcga tctctccacc aaagctgcgt gcccgaccat gggagaagct 240 cacaatgaca aacgtgctga cccagctttt gtgtgcagac aaggagtggt ggacaggggc 300 tggggcaacg gctgcggact atttggcaaa ggaagcattg acacatgcgc caaatttgcc 360 tgctctacca aggcaatagg aagaaccatc ttgaaagaga atatcaagta cgaagtggcc 420 atttttgtcc atggaccaac tactgtggag tcgcacggaa actactccac acaggttgga 480 gccactcagg cagggagatt cagcatcact cctgcggcgc cttcacacac actaaagctt 540 ggagaatatg gagaggtgac agtggactgt gaaccacggt cagggattga caccaatgca 600 tactacgtga tgactgttgg aacaaagacg ttcttggtcc atcgtgagtg gttcatggac 660 ctcaacctcc cttggagcag tgctggaagt actgtgtgga ggaacagaga gacgttaatg 720 gagtttgagg aaccacacgc cacgaagcag tctgtgatag cattgggctc acaagaggga 780 gctctgcagc aagctttggc tggagccatt cctgtggaat tttcaagcaa cactgtcaag 840 ttgacgtcgg gtcatttgaa gtgtagagtg aagatggaaa aattgcagtt gaagggaaca 900 acctatggcg tctgttcaaa ggctttcaag tttcttggga ctcccgcaga cacaggtcac 960 ggcactgtgg tgttggaatt gcagtacact ggcacggatg gaccttgcaa agttcctatc 1020 tcgtcagtgg cttcattgaa cgacctaacg ccagtgggca gattggtcac tgtcaaccct 1080 tttgtttcag tggccacggc caacgctaag gtcctgattg aattggaacc accctttgga 1140 gactcataca tagtggtggg cagaggagaa caacagatca atcaccattg gcacaagtct 1200 ggaagcagca ttggcaaagc ctttacaacc accctcaaag gagcgcagag actagccgct 1260 ctaggagaca cagcttggga ctttggatca gttggagggg tgttcacctc agttgggaag 1320 gctgtccatc aagtgttcgg aggagcattc cgctcactgt tcggaggcat gtcctggata 1380 acgcaaggat tgctgggggc tctcctgttg tggatgggca tcaatgctcg tgataggtcc 1440 atagctctca cgtttctcgc agttggagga gttctgctct tcctctccgt gaacgtgcac 1500 gct 1503 <210> 18 <211> 1503 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 18 ttcaactgcc ttggaatgag caacagagac ttcttggaag gagtgtctgg agcaacatgg 60 gtggatttgg ttctcgaagg cgacagctgc gtgactatca tgtctaagga caagcctacc 120 atcgatgtga agatgatgaa tatggaggcg gccaacctgg cagaggtccg cagttattgc 180 tatttggcta ccgtcagcga tctctccacc aaagctgcgt gcccgaccat gggagaagct 240 cacaatgaca aacgtgctga cccagctttt gtgtgcagac aaggagtggt ggacaggggc 300 tggggcaacg gctgcggact atttggcaaa ggaagcattg acacatgcgc caaatttgcc 360 tgctctacca aggcaatagg aagaaccatc ttgaaagaga atatcaagta cgaagtggcc 420 atttttgtcc atggaccaac tactgtggag tcgcacggaa actattccac acaggctgga 480 gccactcagg cagggagatt cagcatcact cctgcggcgc cttcatacac actaaagctt 540 ggagaatatg gagaggtgac agtggactgt gaaccacggt cagggattga caccaatgca 600 tactacgtga tgactgttgg aacaaagacg ttcttggtcc atcgtgagtg gttcatggac 660 ctcaacctcc cttggagcag tgctggaagt actgtgtgga ggaacagaga gacgttaatg 720 gagtttgagg aaccacacgc cacgaagcag tctgtgatag cattgggctc acaagaggga 780 gctctgcatc aagctttggc tggagccatt cctgtggaat tttcaagcaa cactgtcaag 840 ttgacgtcgg gtcatttgaa gtgtagagtg aagatggaaa aattgcagtt gaagggaaca 900 acctatggcg tctgttcaaa ggctttcaag tttcttggga ctcccgcaga cacaggtcac 960 ggcactgtgg tgttggaatt gcagtacact ggcacggatg gaccttgcaa agttcctatc 1020 tcgtcagtgg cttcattgaa cgacctaacg ccagtgggca gattggtcac tgtcaaccct 1080 tttgtttcag tggccacggc caacgctaag gtcctgattg aattggaacc accctttgga 1140 gactcataca tagtggtggg cagaggagaa caacagatca atcaccattg gcacaagtct 1200 ggaagtagca ttggcaaagc ctttacaacc accctcaaag gagcgcagag actagccgct 1260 ctaggagaca cagcttggga ctttggatca gttggagggg tgttcacctc agttgggaag 1320 gctgtccatc aagtgttcgg aggagcattc cgctcactgt tcggaggcat gtcctggata 1380 acgcaaggat tgctgggggc tctcctgttg tggatgggca tcaatgctcg tgataggtcc 1440 atagctctca cgtttctcgc agttggagga gttctgctct tcctctccgt gaacgtgcat 1500 gct 1503 <210> 19 <211> 968 <212> DNA <213> West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (941)..(942) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 gatgtgngan gangaatatg gaggcggcca acctggcaga ggtccgcagt tattgctatt 60 tggctaccgt cagcgatctc tccaccaaag ctgcgtgccc gaccatggga gaagctcaca 120 atgacaaacg tgctgaccca gcttttgtgt gcagacaagg agtggtggac aggggctggg 180 gcaacggctg cggactattt ggcaaaggaa gcattgacac atgcgccaaa tttgcctgct 240 ctaccaaggc aataggaaga accatcttga aagagaatat caagtacgaa gtggccattt 300 ttgtccatgg accaactact gtggagtcgc acggaaacta ctccacacag gctggagcca 360 ctcaggcagg gagattcagc atcactcctg cggcgccttc atacacacta aagcttggag 420 aatatggaga ggtgacagtg gactgtgaac cacggtcagg gattgacacc aatgcatact 480 acgtgatgac tgttggaaca aagacgttct tggtccatcg tgagtggttc atggacctca 540 acctcccttg gagcagtgct ggaagtactg tgtggaggaa cagagagacg ttaatggagt 600 ttgaggaacc acacgccacg aagcagtctg tgatagcatt gggctcacaa gagggagctc 660 tgcatcaagc tttggctgga gccattcctg tggaattttc aagcaacact gtcaagttga 720 cgtcgggtca tttgaagtgt agagtgaaga tggaaaaatt gcagttgaag ggaacaacct 780 atggcgtctg ttcaaaggct ttcaagtttc ttgggactcc cgcagacaca ggtcacggca 840 ctgtggtgtt ggaattgcag tacactggca cggatggacc ttgcaaagtt cctatctcgt 900 cagtggcttc attgaacgat ctaacgccag tgggcagatt nntcactgtc aacccttttg 960 tttcagtg 968 <210> 20 <211> 979 <212> DNA <213> West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (974)..(974) <223> n is a, c, g, or t <400> 20 cttnanagan atcaagtacg aagtggccat ttttgtccat ggaccaacta ctgtggagtc 60 gcacggaaac tactccacac aggctggagc cactcaggca gggagattca gcatcactcc 120 tgcggcgcct tcatacacac taaagcttgg agaatatgga gaggtgacag tggactgtga 180 accacggtca gggattgaca ccaatgcata ctacgtgatg actgttggaa caaagacgtt 240 cttggtccat cgtgagtggt tcatggacct caacctccct tggagcagtg ctggaagtac 300 tgtgtggagg aacagagaga cgttaatgga gtttgaggaa ccacacgcca cgaagcagtc 360 tgtgatagca ttgggctcac aagagggagc tctgcatcaa gctttggctg gagccattcc 420 tgtggaattt tcaagcaaca ctgtcaagtt gacgtcgggt catttgaagt gtagagtgaa 480 gatggaaaaa ttgcagttga agggaacaac ctatggcgtc tgttcaaagg ctttcaagtt 540 tcttgggact cccgcagaca caggtcacgg cactgtggtg ttggaattgc agtacactgg 600 cacggatgga ccttgcaaag ttcctatctc gtcagtggct tcattgaacg atctaacgcc 660 agtgggcaga ttggtcactg tcaacccttt tgtttcagtg gccacggcca acgctaaggt 720 cctgattgaa ttggaaccac cctttggaga ctcatacata gtggtgggca gaggagaaca 780 acagatcaat caccattggc acaagtctgg aagcagcatt ggcaaagcct ttacaaccac 840 cctcaaagga gcgcagagac tagccgctct aggagacaca gcttgggact ttggatcagt 900 tggaggggtg ttcacctcag ttgggaaggc tgtccatcaa gtgttcggag gagcattccg 960 cacactgttc ggangcatg 979 <210> 21 <211> 1004 <212> DNA <213> West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a, c, g, or t <400> 21 agantatgga gngnngncag tggactgtga anccncggtc agggattgac accaatgcat 60 actacgtgat gactgttgga acaaagacgt tcttggtcca tcgtgagtgg ttcatggacc 120 tcaacctccc ttggagcagt gctggaagta ctgtgtggag gaacagagag acgttaatgg 180 agtttgagga accacacgcc acgaagcagt ctgtgatagc attgggctca caagagggag 240 ctctgcatca agctttggct ggagccattc ctgtggaatt ttcaagcaac actgtcaagt 300 tgacgtcggg tcatttgaag tgtagagtga agatggaaaa attgcagttg aagggaacaa 360 cctatggcgt ctgttcaaag gctttcaagt ttcttgggac tcccgcagac acaggtcacg 420 gcactgtggt gttggaattg cagtacactg gcacggatgg accttgcaaa gttcctatct 480 cgtcagtggc ttcattgaac gatctaacgc cagtgggcag attggtcact gtcaaccctt 540 ttgtttcagt ggccacggcc aacgctaagg tcctgattga attggaacca ccctttggag 600 actcatacat agtggtgggc agaggagaac aacagatcaa tcaccattgg cacaagtctg 660 gaagcagcat tggcaaagcc tttacaacca ccctcaaagg agcgcagaga ctagccgctc 720 taggagacac agcttgggac tttggatcag ttggaggggt gttcacctca gttgggaagg 780 ctgtccatca agtgttcgga ggagcattcc gcacactgtt cggaggcatg tcctggataa 840 cgcaaggatt gctgggggct ctcctgttgt ggatgggcat caatgctcgt gataggtcca 900 tagctctcac gtttctcgca gttggaggag ttctgctctt cctctccgtg aacgtgcatg 960 ctgacactgg gtgtgccata gacatcagcc ggcaagagct gaga 1004 <210> 22 <211> 1006 <212> DNA <213> West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (996)..(996) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1004)..(1004) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 agcagtgctg gaagtactgt gtggaggnaa cagagagacg ttaatggagt ttgaggaacc 60 acacgccacg aagcagtctg tgatagcatt gggctcacaa gagggagctc tgcatcaagc 120 tttggctgga gccattcctg tggaattttc aagcaacact gtcaagttga cgtcgggtca 180 tttgaagtgt agagtgaaga tggaaaaatt gcagttgaag ggaacaacct atggcgtctg 240 ttcaaaggct ttcaagtttc ttgggactcc cgcagacaca ggtcacggca ctgtggtgtt 300 ggaattgcag tacactggca cggatggacc ttgcaaagtt cctatctcgt cagtggcttc 360 attgaacgat ctaacgccag tgggcagatt ggtcactgtc aacccttttg tttcagtggc 420 cacggccaac gctaaggtcc tgattgaatt ggaaccaccc tttggagact catacatagt 480 ggtgggcaga ggagaacaac agatcaatca ccattggcac aagtctggaa gcagcattgg 540 caaagccttt acaaccaccc tcaaaggagc gcagagacta gccgctctag gagacacagc 600 ttgggacttt ggatcagttg gaggggtgtt cacctcagtt gggaaggctg tccatcaagt 660 gttcggagga gcattccgca cactgttcgg aggcatgtcc tggataacgc aaggattgct 720 gggggctctc ctgttgtgga tgggcatcaa tgctcgtgat aggtccatag ctctcacgtt 780 tctcgcagtt ggaggagttc tgctcttcct ctccgtgaac gtgcatgctg acactgggtg 840 tgccatagac atcagccggc aagagctgag atgtggaagt ggagtgttca tacacaatga 900 tgtggaggct tggatggacc ggtacaagta ttaccctgaa acgccacaag gcctagccaa 960 gatcattcag aaagctcata aggaaggagt gtgcgntcta cganca 1006 <210> 23 <211> 11029 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 23 agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60 acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120 ggcaagagcc gggctgtcaa tatgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180 ggactgaaga gggctatgtt gagcctgatc gacggcaagg ggccaatacg atttgtgttg 240 gctctcttgg cgttcttcag gttcacagca attgctccga cccgagcagt gctggatcga 300 tggagaggtg tgaacaaaca aacagcgatg aaacaccttc tgagttttaa gaaggaacta 360 gggaccttga ccagtgctat caatcggcgg agctcaaaac aaaagaaaag aggaggaaag 420 accggaattg cagtcatgat tggcctgatc gccagcgtag gagcagttac cctctctaac 480 ttccaaggga aggtgatgat gacggtaaat gctactgacg tcacagatgt catcacgatt 540 ccaacagctg ctggaaagaa cctatgcatt gtcagagcaa tggatgtggg atacatgtgc 600 gatgatacta tcacttatga atgcccagta ctgtcggctg gtaatgatcc agaagacatc 660 gactgttggt gcacaaagtc agcagtctac gtcaggtatg gaagatgcac caagacacgc 720 cactcaagac gcagtcggag gtcactgaca gtgcagacac acggagaaag cactctagcg 780 aacaagaagg gggcttggat ggacagcacc aaggccacaa ggtatttggt aaaaacagaa 840 tcatggatct tgaggaaccc tggatatgcc ctggtggcag ccgtcattgg ttggatgctt 900 gggagcaaca ccatgcagag agttgtgttt gtcgtgctat tgcttttggt ggccccagct 960 tacagcttca actgccttgg aatgagcaac agagacttct tggaaggagt gtctggagca 1020 acatgggtgg atttggttct cgaaggcgac agctgcgtga ctatcatgtc taaggacaag 1080 cctaccatcg atgtgaagat gatgaatatg gaggcggcca acctggcaga ggtccgcagt 1140 tattgctatt tggctaccgt cagcgatctc tccaccaaag ctgcgtgccc gaccatggga 1200 gaagctcaca atgacaaacg tgctgaccca gcttttgtgt gcagacaagg agtggtggac 1260 aggggctggg gcaacggctg cggactattt ggcaaaggaa gcattgacac atgcgccaaa 1320 tttgcctgct ctaccaaggc aataggaaga accatcttga aagagaatat caagtacgaa 1380 gtggccattt ttgtccatgg accaactact gtggagtcgc acggaaacta ctccacacag 1440 gttggagcca ctcaggcagg gagactcagc atcactcctg cggcgccttc atacacacta 1500 aagcttggag aatatggaga ggtgacagtg gactgtgaac cacggtcagg gattgacacc 1560 aatgcatact acgtgatgac tgttggaaca aagacgttct tggtccatcg tgagtggttc 1620 atggacctca acctcccttg gagcagtgct ggaagtactg tgtggaggaa cagagagacg 1680 ttaatggagt ttgaggaacc acacgccacg aagcagtctg tgatagcatt gggctcacaa 1740 gagggagctc tgcatcaagc tttggctgga gccattcctg tggaattttc aagcaacact 1800 gtcaagttga cgtcgggtca tttgaagtgt agagtgaaga tggaaaaatt gcagttgaag 1860 ggaacaacct atggcgtctg ttcaaaggct ttcaagtttc ttgggactcc cgcagacaca 1920 ggtcacggca ctgtggtgtt ggaattgcag tacactggca cggatggacc ttgcaaagtt 1980 cctatctcgt cagtggcttc attgaacgac ctaacgccag tgggcagatt ggtcactgtc 2040 aacccttttg tttcagtggc cacggccaac gctaaggtcc tgattgaatt ggaaccaccc 2100 tttggagact catacatagt ggtgggcaga ggagaacaac agatcaatca ccattggcac 2160 aagtctggaa gcagcattgg caaagccttt acaaccaccc tcaaaggagc gcagagacta 2220 gccgctctag gagacacagc ttgggacttt ggatcagttg gaggggtgtt cacctcagtt 2280 gggaaggctg tccatcaagt gttcggagga gcattccgct cactgttcgg aggcatgtcc 2340 tggataacgc aaggattgct gggggctctc ctgttgtgga tgggcatcaa tgctcgtgat 2400 aggtccatag ctctcacgtt tctcgcagtt ggaggagttc tgctcttcct ctccgtgaac 2460 gtgcacgctg acactgggtg tgccatagac atcagccggc aagagctgag atgtggaagt 2520 ggagtgttca tacacaatga tgtggaggct tggatggacc ggtacaagta ttaccctgaa 2580 acgccacaag gcctagccaa gatcattcag aaagctcata aggaaggagt gtgcggtcta 2640 cgatcagttt ccagactgga gcatcaaatg tgggaagcag tgaaggacga gctgaacact 2700 cttttgaagg agaatggtgt ggaccttagt gtcgtggttg agaaacagga gggaatgtac 2760 aagtcagcac ctaaacgcct caccgccacc acggaaaaat tggaaattgg ctggaaggcc 2820 tggggaaaga gtattttatt tgcaccagaa ctcgccaaca acacctttgt ggttgatggt 2880 ccggagacca aggaatgtcc gactcagaat cgcgcttgga atagcttaga agtggaggat 2940 tttggatttg gtctcaccag cactcggatg ttcctgaagg tcagagagag caacacaact 3000 gaatgtgact cgaagatcat tggaacggct gtcaagaaca acttggcgat ccacagtgac 3060 ctgtcctatt ggattgaaag caggctcaat gatacgtgga agcttgaaag ggcagttctg 3120 ggtgaagtca aatcatgtac gtggcctgag acgcatacct tgtggggcga tggaatcctt 3180 gagagtgact tgataatacc agtcacactg gcgggaccac gaagcaatca caatcggaga 3240 cctgggtaca agacacaaaa ccagggccca tgggacgaag gccgggtaga gattgacttc 3300 gattactgcc caggaactac ggtcaccctg agtgagagct gcggacaccg tggacctgcc 3360 actcgcacca ccacagagag cggaaagttg ataacagatt ggtgctgcag gagctgcacc 3420 ttaccaccac tgcgctacca aactgacagc ggctgttggt atggtatgga gatcagacca 3480 cagagacatg atgaaaagac cctcgtgcag tcacaagtga atgcttataa tgctgatatg 3540 attgaccctt ttcagttggg ccttctggtc gtgttcttgg ccacccagga ggtccttcgc 3600 aagaggtgga cagccaagat cagcatgcca gctatactga ttgctctgct agtcctggtg 3660 tttgggggca ttacttacac tgatgtgtta cgctatgtca tcttggtggg ggcagctttc 3720 gcagaatcta attcgggagg agacgtggta cacttggcgc tcatggcgac cttcaagata 3780 caaccagtgt ttatggtggc atcgtttctc aaagcgagat ggaccaacca ggagaacatt 3840 ttgttgatgt tggcggctgt tttctttcaa atggcttatc acgatgcccg ccaaattctg 3900 ctctgggaga tccctgatgt gttgaattca ctggcggtag cttggatgat actgagagcc 3960 ataacattca caacgacatc aaacgtggtt gttccgctgc tagccctgct aacacccggg 4020 ctgagatgct tgaatctgga tgtgtacagg atactgctgt tgatggtcgg aataggcagc 4080 ttgatcaggg agaagaggag tgcagccgca aaaaagaaag gagcaagtct gctatgcttg 4140 gctctagcct caacaggact tttcaacccc atgatccttg ctgctggact gattgcatgt 4200 gatcccaacc gtaaacgcgg atggcccgca actgaagtga tgacagctgt cggcctaatg 4260 tttgccatcg tcggagggct ggcagagctt gacattgact ccatggccat tccaatgact 4320 atcgcggggc tcatgtttgc tgctttcgtg atttctggga aatcaacaga tatgtggatt 4380 gagagaacgg cggacatttc ctgggaaagt gatgcagaaa ttacaggctc gagcgaaaga 4440 gttgatgtgc ggcttgatga tgatggaaac ttccagctca tgaatgatcc aggagcacct 4500 tggaagatat ggatgctcag aatggtctgt ctcgcgatta gtgcgtacac cccctgggca 4560 atcttgccct cagtagttgg attttggata actctccaat acacaaagag aggaggcgtg 4620 ttgtgggaca ctccctcacc aaaggagtac aaaaaggggg acacgaccac cggcgtctac 4680 aggatcatga ctcgtgggct gctcggcagt tatcaagcag gagcgggcgt gatggttgaa 4740 ggtgttttcc acaccctttg gcatacaaca aaaggagccg ctttgatgag cggagagggc 4800 cgcctggacc catactgggg cagtgtcaag gaggatcgac tttgttacgg aggaccctgg 4860 aaattgcagc acaagtggaa cgggcaggat gaggtgcaga tgattgtggt ggaacctggc 4920 aagaacgtta agaacgtcca gacgaaacca ggggtgttca aaacacctga aggagaaatc 4980 ggggccgtga ctttggactt ccccactgga acatcaggct caccaatagt ggacaaaaac 5040 ggtgatgtga ttgggcttta tggcaatgga gtcataatgc ccaacggctc atacataagc 5100 gcgatagtgc agggtgaaag gatggatgag ccaatcccag ccggattcga acctgagatg 5160 ctgaggaaaa aacagatcac tgtactggat ctccatcccg gcgccggtaa aacaaggagg 5220 attctgccac agatcatcaa agaggccata aacagaagac tgagaacagc cgtgctagcg 5280 ccaaccaggg ttgtggctgc tgagatggct gaagcactga gaggactgcc catccggtac 5340 cagacatccg cagtgcccag agaacataat ggaaatgaga ttgttgatgt catgtgtcat 5400 gctaccctca cccacaggct gatgtctcct cacagggtgc cgaactacaa cctgttcgtg 5460 atggatgagg ctcatttcac cgacccagct agcattgcag caagaggtta catttccaca 5520 aaggtcgagc taggggaggc ggcggcaata ttcatgacag ccaccccacc aggcacttca 5580 gatccattcc cagagtccaa ttcaccaatt tccgacttac agactgagat cccggatcga 5640 gcttggaact ctggatacga atggatcaca gaatacaccg ggaagacggt ttggtttgtg 5700 cctagtgtca agatggggaa tgagattgcc ctttgcctac aacgtgctgg aaagaaagta 5760 gtccaattga acagaaagtc gtacgagacg gagtacccaa aatgtaagaa cgatgattgg 5820 gactttgtta tcacaacaga catatctgaa atgggggcta acttcaaggc gagcagggtg 5880 attgacagcc ggaagagtgt gaaaccaacc atcataacag aaggagaagg gagagtgatc 5940 ctgggagaac catctgcagt gacagcagct agtgccgccc agagacgtgg acgtatcggt 6000 agaaatccgt cgcaagttgg tgatgagtac tgttatgggg ggcacacgaa tgaagacgac 6060 tcgaacttcg cccattggac tgaggcacga atcatgctgg acaacatcaa catgccaaac 6120 ggactgatcg ctcaattcta ccaaccagag cgtgagaagg tatataccat ggatggggaa 6180 taccggctca gaggagaaga gagaaaaaac tttctggaac tgttgaggac tgcagatctg 6240 ccagtttggc tggcttacaa ggttgcagcg gctggagtgt cataccacga ccggaggtgg 6300 tgctttgatg gtcctaggac aaacacaatt ttagaagaca acaacgaagt ggaagtcatc 6360 acgaagcttg gtgaaaggaa gattctgagg ccgcgctgga ttgatgccag ggtgtactcg 6420 gatcaccagg cactaaaggc gttcaaggac ttcgcctcgg gaaaacgttc tcagataggg 6480 ctcattgagg ttctgggaaa gatgcctgag cacttcatgg ggaagacatg ggaagcactt 6540 gacaccatgt acgttgtggc cactgcagag aaaggaggaa gagctcacag aatggccctg 6600 gaggaactgc cagatgctct tcagacaatt gccttgattg ccttattgag tgtgatgacc 6660 atgggagtat tcttcctcct catgcagcgg aagggcattg gaaagatagg tttgggaggc 6720 gctgtcttgg gagtcgcgac ctttttctgt tggatggctg aagttccagg aacgaagatc 6780 gccggaatgt tgctgctctc ccttctcttg atgattgtgc taattcctga gccagagaag 6840 caacgttcgc agacagacaa ccagctagcc gtgttcctga tttgtgtcat gacccttgtg 6900 agcgcagtgg cagccaacga gatgggttgg ctagataaga ccaagagtga cataagcagt 6960 ttgtttgggc aaagaattga ggtcaaggag aatttcagca tgggagagtt tcttctggac 7020 ttgaggccgg caacagcctg gtcactgtac gctgtgacaa cagcggtcct cactccactg 7080 ctaaagcatt tgatcacgtc agattacatc aacacctcat tgacctcaat aaacgttcag 7140 gcaagtgcac tattcacact cgcgcgaggc ttccccttcg tcgatgttgg agtgtcggct 7200 ctcctgctag cagccggatg ctggggacaa gtcaccctca ccgttacggt aacagcggca 7260 acactccttt tttgccacta tgcctacatg gttcccggtt ggcaagctga ggcaatgcgc 7320 tcagcccagc ggcggacagc ggccggaatc atgaagaacg ctgtagtgga tggcatcgtg 7380 gccacggacg tcccagaatt agagcgcacc acacccatca tgcagaagaa agttggacag 7440 atcatgctga tcttggtgtc tctagctgca gtagtagtga acccgtctgt gaagacagta 7500 cgagaagccg gaattttgat cacggccgca gcggtgacgc tttgggagaa tggagcaagc 7560 tctgtttgga acgcaacaac tgccatcgga ctctgccaca tcatgcgtgg gggttggttg 7620 tcatgtctat ccataacatg gacactcata aagaacatgg aaaaaccagg actaaaaaga 7680 ggtggggcaa aaggacgcac cttgggagag gtttggaaag aaagactcaa ccagatgaca 7740 aaagaagagt tcactaggta ccgcaaagag gccatcatcg aagtcgatcg ctcagcggca 7800 aaacacgcca ggaaagaagg caatgtcact ggagggcatc cagtctctag gggcacagca 7860 aaactgagat ggctggtcga acggaggttt ctcgaaccgg tcggaaaagt gattgacctt 7920 ggatgtggaa gaggcggttg gtgttactat atggcaaccc aaaaaagagt ccaagaagtc 7980 agagggtaca caaagggcgg tcccggacat gaagagcccc aactagtgca aagttatgga 8040 tggaacattg tcaccatgaa gagtggagtg gatgtgttct acagaccttc tgagtgttgt 8100 gacaccctcc tttgtgacat cggagagtcc tcgtcaagtg ctgaggttga agagcatagg 8160 acgattcggg tccttgaaat ggttgaggac tggctgcacc gagggccaag ggaattttgc 8220 gtgaaggtgc tctgtcccta catgccgaaa gtcatagaga agatggagct gctccaacgc 8280 cggtatgggg ggggactggt cagaaaccca ctctcacgga attccacgca cgagatgtat 8340 tgggtgagtc gagcttcagg caatgtggta cattcagtga atatgaccag ccaggtgctc 8400 ctaggaagaa tggaaaaaag gacctggaag ggaccccaat acgaggaaga tgtaaacttg 8460 ggaagtggaa ccagggcggt gggaaaaccc ctgctcaact cagacaccag taaaatcaag 8520 aacaggattg aacgactcag gcgtgagtac agttcgacgt ggcaccacga tgagaaccac 8580 ccatatagaa cctggaacta tcacggcagt tatgatgtga agcccacagg ctccgccagt 8640 tcgctggtca atggagtggt caggctcctc tcaaaaccat gggacaccat cacgaatgtt 8700 accaccatgg ccatgactga cactactccc ttcgggcagc agcgagtgtt caaagagaag 8760 gtggacacga aagctcctga accgccagaa ggagtgaagt acgtgctcaa cgagaccacc 8820 aactggttgt gggcgttttt ggccagagaa aaacgtccca gaatgtgctc tcgagaggaa 8880 ttcataagaa aggtcaacag caatgcagct ttgggtgcca tgtttgaaga gcagaatcaa 8940 tggaggagcg ccagagaagc agttgaagat ccaaaatttt gggagatggt ggatgaggag 9000 cgcgaggcac atctgcgggg ggaatgtcac acttgcattt acaacatgat gggaaagaga 9060 gagaaaaaac ccggagagtt cggaaaggcc aagggaagca gagccatttg gttcatgtgg 9120 ctcggagctc gctttctgga gttcgaggct ctgggttttc tcaatgaaga ccactggctt 9180 ggaagaaaga actcaggagg aggtgtcgag ggcttgggcc tccaaaaact gggttacatc 9240 ctgcgtgaag ttggcacccg gcctgggggc aagatctatg ctgatgacac agctggctgg 9300 gacacccgca tcacgagagc tgacttggaa aatgaagcta aggtgcttga gctgcttgat 9360 ggggaacatc ggcgtcttgc cagggccatc attgagctca cctatcgtca caaagttgtg 9420 aaagtgatgc gcccggctgc tgatggaaga accgtcatgg atgttatctc cagagaagat 9480 cagaggggga gtggacaagt tgtcacctac gccctaaaca ctttcaccaa cctggccgtc 9540 cagctggtga ggatgatgga aggggaagga gtgattggcc cagatgatgt ggagaaactc 9600 acaaaaggga aaggacccaa agtcaggacc tggctgtttg agaatgggga agaaagactc 9660 agccgcatgg ctgtcagtgg agatgactgt gtggtaaagc ccctggacga tcgctttgcc 9720 acctcgctcc acttcctcaa tgctatgtca aaggttcgca aagacatcca agagtggaaa 9780 ccgtcaactg gatggtatga ttggcagcag gttccatttt gctcaaacca tttcactgaa 9840 ttgatcatga aagatggaag aacactggtg gttccatgcc gaggacagga tgaattggta 9900 ggcagagctc gcatatctcc aggggccgga tggaacgtcc gcgacactgc ttgtctggct 9960 aagtcttatg cccagatgtg gctgcttctg tacttccaca gaagagacct gcggctcatg 10020 gccaacgcca tttgctccgc tgtccctgtg aattgggtcc ctaccggaag aaccacgtgg 10080 tccatccatg caggaggaga gtggatgaca acagaggaca tgttggaggt ctggaaccgt 10140 gtttggatag aggagaatga atggatggaa gacaaaaccc cagtggagaa atggagtgac 10200 gtcccatatt caggaaaacg agaggacatc tggtgtggca gcctgattgg cacaagagcc 10260 cgagccacgt gggcagaaaa catccaggtg gctatcaacc aagtcagagc aatcatcgga 10320 gatgagaagt atgtggacta catgagttca ctaaagagat atgaagacac aactttggtt 10380 gaggacacag tactgtagat atttaatcaa ttgtaaatag acaatataag tatgcataaa 10440 agtgtagttt tatagtagta tttagtggtg ttagtgtaaa tagttaagaa aattttgagg 10500 agaaagtcag gccgggaagt tcccgccacc ggaagttgag tagacggtgc tgcctgcgac 10560 tcaaccccag gaggactggg tgaacaaagc cgcgaagtga tccatgtaag ccctcagaac 10620 cgtctcggaa ggaggacccc acatgttgta acttcaaagc ccaatgtcag accacgctac 10680 ggcgtgctac tctgcggaga gtgcagtctg cgatagtgcc ccaggaggac tgggttaaca 10740 aaggcaaacc aacgccccac gcggccctag ccccggtaat ggtgttaacc agggcgaaag 10800 gactagaggt tagaggagac cccgcggttt aaagtgcacg gcccagcctg gctgaagctg 10860 taggtcaggg gaaggactag aggttagtgg agaccccgtg ccacaaaaca ccacaacaaa 10920 acagcatatt gacacctggg atagactagg agatcttctg ctctgcacaa ccagccacac 10980 ggcacagtgc gccgacaatg gtggctggtg gtgcgagaac acaggatct 11029 <210> 24 <211> 3433 <212> PRT <213> West Nile virus <400> 24 Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Asn Met 1 5 10 15 Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu Ile Gly Leu Lys Arg 20 25 30 Ala Met Leu Ser Leu Ile Asp Gly Lys Gly Pro Ile Arg Phe Val Leu 35 40 45 Ala Leu Leu Ala Phe Phe Arg Phe Thr Ala Ile Ala Pro Thr Arg Ala 50 55 60 Val Leu Asp Arg Trp Arg Gly Val Asn Lys Gln Thr Ala Met Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Ser Phe Lys Lys Glu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Ala Ile Asn 85 90 95 Arg Arg Ser Ser Lys Gln Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Ile Ala 100 105 110 Val Met Ile Gly Leu Ile Ala Ser Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn 115 120 125 Phe Gln Gly Lys Val Met Met Thr Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Asp 130 135 140 Val Ile Thr Ile Pro Thr Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg 145 150 155 160 Ala Met Asp Val Gly Tyr Met Cys Asp Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys 165 170 175 Pro Val Leu Ser Ala Gly Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys 180 185 190 Thr Lys Ser Ala Val Tyr Val Arg Tyr Gly Arg Cys Thr Lys Thr Arg 195 200 205 His Ser Arg Arg Ser Arg Arg Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu 210 215 220 Ser Thr Leu Ala Asn Lys Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala 225 230 235 240 Thr Arg Tyr Leu Val Lys Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly 245 250 255 Tyr Ala Leu Val Ala Ala Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr 260 265 270 Met Gln Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala 275 280 285 Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly 290 295 300 Val Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys 305 310 315 320 Val Thr Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met 325 330 335 Asn Met Glu Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu 340 345 350 Ala Thr Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly 355 360 365 Glu Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln 370 375 380 Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys 385 390 395 400 Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile 405 410 415 Gly Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe 420 425 430 Val His Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln 435 440 445 Val Gly Ala Thr Gln Ala Gly Arg Leu Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro 450 455 460 Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys 465 470 475 480 Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val 485 490 495 Gly Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn 500 505 510 Leu Pro Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr 515 520 525 Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala 530 535 540 Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile 545 550 555 560 Pro Val Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu 565 570 575 Lys Cys Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr 580 585 590 Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr 595 600 605 Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly 610 615 620 Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr 625 630 635 640 Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr 645 650 655 Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser 660 665 670 Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His 675 680 685 Lys Ser Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly 690 695 700 Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser 705 710 715 720 Val Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe 725 730 735 Gly Gly Ala Phe Arg Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln 740 745 750 Gly Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp 755 760 765 Arg Ser Ile Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe 770 775 780 Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Ser 785 790 795 800 Arg Gln Glu Leu Arg Cys Gly Ser Gly Val Phe Ile His Asn Asp Val 805 810 815 Glu Ala Trp Met Asp Arg Tyr Lys Tyr Tyr Pro Glu Thr Pro Gln Gly 820 825 830 Leu Ala Lys Ile Ile Gln Lys Ala His Lys Glu Gly Val Cys Gly Leu 835 840 845 Arg Ser Val Ser Arg Leu Glu His Gln Met Trp Glu Ala Val Lys Asp 850 855 860 Glu Leu Asn Thr Leu Leu Lys Glu Asn Gly Val Asp Leu Ser Val Val 865 870 875 880 Val Glu Lys Gln Glu Gly Met Tyr Lys Ser Ala Pro Lys Arg Leu Thr 885 890 895 Ala Thr Thr Glu Lys Leu Glu Ile Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser 900 905 910 Ile Leu Phe Ala Pro Glu Leu Ala Asn Asn Thr Phe Val Val Asp Gly 915 920 925 Pro Glu Thr Lys Glu Cys Pro Thr Gln Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu 930 935 940 Glu Val Glu Asp Phe Gly Phe Gly Leu Thr Ser Thr Arg Met Phe Leu 945 950 955 960 Lys Val Arg Glu Ser Asn Thr Thr Glu Cys Asp Ser Lys Ile Ile Gly 965 970 975 Thr Ala Val Lys Asn Asn Leu Ala Ile His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp 980 985 990 Ile Glu Ser Arg Leu Asn Asp Thr Trp Lys Leu Glu Arg Ala Val Leu 995 1000 1005 Gly Glu Val Lys Ser Cys Thr Trp Pro Glu Thr His Thr Leu Trp 1010 1015 1020 Gly Asp Gly Ile Leu Glu Ser Asp Leu Ile Ile Pro Val Thr Leu 1025 1030 1035 Ala Gly Pro Arg Ser Asn His Asn Arg Arg Pro Gly Tyr Lys Thr 1040 1045 1050 Gln Asn Gln Gly Pro Trp Asp Glu Gly Arg Val Glu Ile Asp Phe 1055 1060 1065 Asp Tyr Cys Pro Gly Thr Thr Val Thr Leu Ser Glu Ser Cys Gly 1070 1075 1080 His Arg Gly Pro Ala Thr Arg Thr Thr Thr Glu Ser Gly Lys Leu 1085 1090 1095 Ile Thr Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg 1100 1105 1110 Tyr Gln Thr Asp Ser Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro 1115 1120 1125 Gln Arg His Asp Glu Lys Thr Leu Val Gln Ser Gln Val Asn Ala 1130 1135 1140 Tyr Asn Ala Asp Met Ile Asp Pro Phe Gln Leu Gly Leu Leu Val 1145 1150 1155 Val Phe Leu Ala Thr Gln Glu Val Leu Arg Lys Arg Trp Thr Ala 1160 1165 1170 Lys Ile Ser Met Pro Ala Ile Leu Ile Ala Leu Leu Val Leu Val 1175 1180 1185 Phe Gly Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Val Leu Arg Tyr Val Ile Leu 1190 1195 1200 Val Gly Ala Ala Phe Ala Glu Ser Asn Ser Gly Gly Asp Val Val 1205 1210 1215 His Leu Ala Leu Met Ala Thr Phe Lys Ile Gln Pro Val Phe Met 1220 1225 1230 Val Ala Ser Phe Leu Lys Ala Arg Trp Thr Asn Gln Glu Asn Ile 1235 1240 1245 Leu Leu Met Leu Ala Ala Val Phe Phe Gln Met Ala Tyr His Asp 1250 1255 1260 Ala Arg Gln Ile Leu Leu Trp Glu Ile Pro Asp Val Leu Asn Ser 1265 1270 1275 Leu Ala Val Ala Trp Met Ile Leu Arg Ala Ile Thr Phe Thr Thr 1280 1285 1290 Thr Ser Asn Val Val Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Thr Pro Gly 1295 1300 1305 Leu Arg Cys Leu Asn Leu Asp Val Tyr Arg Ile Leu Leu Leu Met 1310 1315 1320 Val Gly Ile Gly Ser Leu Ile Arg Glu Lys Arg Ser Ala Ala Ala 1325 1330 1335 Lys Lys Lys Gly Ala Ser Leu Leu Cys Leu Ala Leu Ala Ser Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Phe Asn Pro Met Ile Leu Ala Ala Gly Leu Ile Ala Cys 1355 1360 1365 Asp Pro Asn Arg Lys Arg Gly Trp Pro Ala Thr Glu Val Met Thr 1370 1375 1380 Ala Val Gly Leu Met Phe Ala Ile Val Gly Gly Leu Ala Glu Leu 1385 1390 1395 Asp Ile Asp Ser Met Ala Ile Pro Met Thr Ile Ala Gly Leu Met 1400 1405 1410 Phe Ala Ala Phe Val Ile Ser Gly Lys Ser Thr Asp Met Trp Ile 1415 1420 1425 Glu Arg Thr Ala Asp Ile Ser Trp Glu Ser Asp Ala Glu Ile Thr 1430 1435 1440 Gly Ser Ser Glu Arg Val Asp Val Arg Leu Asp Asp Asp Gly Asn 1445 1450 1455 Phe Gln Leu Met Asn Asp Pro Gly Ala Pro Trp Lys Ile Trp Met 1460 1465 1470 Leu Arg Met Val Cys Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Thr Pro Trp Ala 1475 1480 1485 Ile Leu Pro Ser Val Val Gly Phe Trp Ile Thr Leu Gln Tyr Thr 1490 1495 1500 Lys Arg Gly Gly Val Leu Trp Asp Thr Pro Ser Pro Lys Glu Tyr 1505 1510 1515 Lys Lys Gly Asp Thr Thr Thr Gly Val Tyr Arg Ile Met Thr Arg 1520 1525 1530 Gly Leu Leu Gly Ser Tyr Gln Ala Gly Ala Gly Val Met Val Glu 1535 1540 1545 Gly Val Phe His Thr Leu Trp His Thr Thr Lys Gly Ala Ala Leu 1550 1555 1560 Met Ser Gly Glu Gly Arg Leu Asp Pro Tyr Trp Gly Ser Val Lys 1565 1570 1575 Glu Asp Arg Leu Cys Tyr Gly Gly Pro Trp Lys Leu Gln His Lys 1580 1585 1590 Trp Asn Gly Gln Asp Glu Val Gln Met Ile Val Val Glu Pro Gly 1595 1600 1605 Lys Asn Val Lys Asn Val Gln Thr Lys Pro Gly Val Phe Lys Thr 1610 1615 1620 Pro Glu Gly Glu Ile Gly Ala Val Thr Leu Asp Phe Pro Thr Gly 1625 1630 1635 Thr Ser Gly Ser Pro Ile Val Asp Lys Asn Gly Asp Val Ile Gly 1640 1645 1650 Leu Tyr Gly Asn Gly Val Ile Met Pro Asn Gly Ser Tyr Ile Ser 1655 1660 1665 Ala Ile Val Gln Gly Glu Arg Met Asp Glu Pro Ile Pro Ala Gly 1670 1675 1680 Phe Glu Pro Glu Met Leu Arg Lys Lys Gln Ile Thr Val Leu Asp 1685 1690 1695 Leu His Pro Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg Ile Leu Pro Gln Ile 1700 1705 1710 Ile Lys Glu Ala Ile Asn Arg Arg Leu Arg Thr Ala Val Leu Ala 1715 1720 1725 Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met Ala Glu Ala Leu Arg Gly 1730 1735 1740 Leu Pro Ile Arg Tyr Gln Thr Ser Ala Val Pro Arg Glu His Asn 1745 1750 1755 Gly Asn Glu Ile Val Asp Val Met Cys His Ala Thr Leu Thr His 1760 1765 1770 Arg Leu Met Ser Pro His Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Phe Val 1775 1780 1785 Met Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg 1790 1795 1800 Gly Tyr Ile Ser Thr Lys Val Glu Leu Gly Glu Ala Ala Ala Ile 1805 1810 1815 Phe Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Ser Asp Pro Phe Pro Glu 1820 1825 1830 Ser Asn Ser Pro Ile Ser Asp Leu Gln Thr Glu Ile Pro Asp Arg 1835 1840 1845 Ala Trp Asn Ser Gly Tyr Glu Trp Ile Thr Glu Tyr Thr Gly Lys 1850 1855 1860 Thr Val Trp Phe Val Pro Ser Val Lys Met Gly Asn Glu Ile Ala 1865 1870 1875 Leu Cys Leu Gln Arg Ala Gly Lys Lys Val Val Gln Leu Asn Arg 1880 1885 1890 Lys Ser Tyr Glu Thr Glu Tyr Pro Lys Cys Lys Asn Asp Asp Trp 1895 1900 1905 Asp Phe Val Ile Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe 1910 1915 1920 Lys Ala Ser Arg Val Ile Asp Ser Arg Lys Ser Val Lys Pro Thr 1925 1930 1935 Ile Ile Thr Glu Gly Glu Gly Arg Val Ile Leu Gly Glu Pro Ser 1940 1945 1950 Ala Val Thr Ala Ala Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly 1955 1960 1965 Arg Asn Pro Ser Gln Val Gly Asp Glu Tyr Cys Tyr Gly Gly His 1970 1975 1980 Thr Asn Glu Asp Asp Ser Asn Phe Ala His Trp Thr Glu Ala Arg 1985 1990 1995 Ile Met Leu Asp Asn Ile Asn Met Pro Asn Gly Leu Ile Ala Gln 2000 2005 2010 Phe Tyr Gln Pro Glu Arg Glu Lys Val Tyr Thr Met Asp Gly Glu 2015 2020 2025 Tyr Arg Leu Arg Gly Glu Glu Arg Lys Asn Phe Leu Glu Leu Leu 2030 2035 2040 Arg Thr Ala Asp Leu Pro Val Trp Leu Ala Tyr Lys Val Ala Ala 2045 2050 2055 Ala Gly Val Ser Tyr His Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Pro 2060 2065 2070 Arg Thr Asn Thr Ile Leu Glu Asp Asn Asn Glu Val Glu Val Ile 2075 2080 2085 Thr Lys Leu Gly Glu Arg Lys Ile Leu Arg Pro Arg Trp Ile Asp 2090 2095 2100 Ala Arg Val Tyr Ser Asp His Gln Ala Leu Lys Ala Phe Lys Asp 2105 2110 2115 Phe Ala Ser Gly Lys Arg Ser Gln Ile Gly Leu Ile Glu Val Leu 2120 2125 2130 Gly Lys Met Pro Glu His Phe Met Gly Lys Thr Trp Glu Ala Leu 2135 2140 2145 Asp Thr Met Tyr Val Val Ala Thr Ala Glu Lys Gly Gly Arg Ala 2150 2155 2160 His Arg Met Ala Leu Glu Glu Leu Pro Asp Ala Leu Gln Thr Ile 2165 2170 2175 Ala Leu Ile Ala Leu Leu Ser Val Met Thr Met Gly Val Phe Phe 2180 2185 2190 Leu Leu Met Gln Arg Lys Gly Ile Gly Lys Ile Gly Leu Gly Gly 2195 2200 2205 Ala Val Leu Gly Val Ala Thr Phe Phe Cys Trp Met Ala Glu Val 2210 2215 2220 Pro Gly Thr Lys Ile Ala Gly Met Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu 2225 2230 2235 Met Ile Val Leu Ile Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Ser Gln Thr 2240 2245 2250 Asp Asn Gln Leu Ala Val Phe Leu Ile Cys Val Met Thr Leu Val 2255 2260 2265 Ser Ala Val Ala Ala Asn Glu Met Gly Trp Leu Asp Lys Thr Lys 2270 2275 2280 Ser Asp Ile Ser Ser Leu Phe Gly Gln Arg Ile Glu Val Lys Glu 2285 2290 2295 Asn Phe Ser Met Gly Glu Phe Leu Leu Asp Leu Arg Pro Ala Thr 2300 2305 2310 Ala Trp Ser Leu Tyr Ala Val Thr Thr Ala Val Leu Thr Pro Leu 2315 2320 2325 Leu Lys His Leu Ile Thr Ser Asp Tyr Ile Asn Thr Ser Leu Thr 2330 2335 2340 Ser Ile Asn Val Gln Ala Ser Ala Leu Phe Thr Leu Ala Arg Gly 2345 2350 2355 Phe Pro Phe Val Asp Val Gly Val Ser Ala Leu Leu Leu Ala Ala 2360 2365 2370 Gly Cys Trp Gly Gln Val Thr Leu Thr Val Thr Val Thr Ala Ala 2375 2380 2385 Thr Leu Leu Phe Cys His Tyr Ala Tyr Met Val Pro Gly Trp Gln 2390 2395 2400 Ala Glu Ala Met Arg Ser Ala Gln Arg Arg Thr Ala Ala Gly Ile 2405 2410 2415 Met Lys Asn Ala Val Val Asp Gly Ile Val Ala Thr Asp Val Pro 2420 2425 2430 Glu Leu Glu Arg Thr Thr Pro Ile Met Gln Lys Lys Val Gly Gln 2435 2440 2445 Ile Met Leu Ile Leu Val Ser Leu Ala Ala Val Val Val Asn Pro 2450 2455 2460 Ser Val Lys Thr Val Arg Glu Ala Gly Ile Leu Ile Thr Ala Ala 2465 2470 2475 Ala Val Thr Leu Trp Glu Asn Gly Ala Ser Ser Val Trp Asn Ala 2480 2485 2490 Thr Thr Ala Ile Gly Leu Cys His Ile Met Arg Gly Gly Trp Leu 2495 2500 2505 Ser Cys Leu Ser Ile Thr Trp Thr Leu Ile Lys Asn Met Glu Lys 2510 2515 2520 Pro Gly Leu Lys Arg Gly Gly Ala Lys Gly Arg Thr Leu Gly Glu 2525 2530 2535 Val Trp Lys Glu Arg Leu Asn Gln Met Thr Lys Glu Glu Phe Thr 2540 2545 2550 Arg Tyr Arg Lys Glu Ala Ile Ile Glu Val Asp Arg Ser Ala Ala 2555 2560 2565 Lys His Ala Arg Lys Glu Gly Asn Val Thr Gly Gly His Pro Val 2570 2575 2580 Ser Arg Gly Thr Ala Lys Leu Arg Trp Leu Val Glu Arg Arg Phe 2585 2590 2595 Leu Glu Pro Val Gly Lys Val Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly 2600 2605 2610 Gly Trp Cys Tyr Tyr Met Ala Thr Gln Lys Arg Val Gln Glu Val 2615 2620 2625 Arg Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Pro Gly His Glu Glu Pro Gln Leu 2630 2635 2640 Val Gln Ser Tyr Gly Trp Asn Ile Val Thr Met Lys Ser Gly Val 2645 2650 2655 Asp Val Phe Tyr Arg Pro Ser Glu Cys Cys Asp Thr Leu Leu Cys 2660 2665 2670 Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Val Glu Glu His Arg 2675 2680 2685 Thr Ile Arg Val Leu Glu Met Val Glu Asp Trp Leu His Arg Gly 2690 2695 2700 Pro Arg Glu Phe Cys Val Lys Val Leu Cys Pro Tyr Met Pro Lys 2705 2710 2715 Val Ile Glu Lys Met Glu Leu Leu Gln Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 2720 2725 2730 Leu Val Arg Asn Pro Leu Ser Arg Asn Ser Thr His Glu Met Tyr 2735 2740 2745 Trp Val Ser Arg Ala Ser Gly Asn Val Val His Ser Val Asn Met 2750 2755 2760 Thr Ser Gln Val Leu Leu Gly Arg Met Glu Lys Arg Thr Trp Lys 2765 2770 2775 Gly Pro Gln Tyr Glu Glu Asp Val Asn Leu Gly Ser Gly Thr Arg 2780 2785 2790 Ala Val Gly Lys Pro Leu Leu Asn Ser Asp Thr Ser Lys Ile Lys 2795 2800 2805 Asn Arg Ile Glu Arg Leu Arg Arg Glu Tyr Ser Ser Thr Trp His 2810 2815 2820 His Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Asn Tyr His Gly Ser 2825 2830 2835 Tyr Asp Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ser Ser Leu Val Asn Gly 2840 2845 2850 Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp Asp Thr Ile Thr Asn Val 2855 2860 2865 Thr Thr Met Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg 2870 2875 2880 Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Lys Ala Pro Glu Pro Pro Glu 2885 2890 2895 Gly Val Lys Tyr Val Leu Asn Glu Thr Thr Asn Trp Leu Trp Ala 2900 2905 2910 Phe Leu Ala Arg Glu Lys Arg Pro Arg Met Cys Ser Arg Glu Glu 2915 2920 2925 Phe Ile Arg Lys Val Asn Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Met Phe 2930 2935 2940 Glu Glu Gln Asn Gln Trp Arg Ser Ala Arg Glu Ala Val Glu Asp 2945 2950 2955 Pro Lys Phe Trp Glu Met Val Asp Glu Glu Arg Glu Ala His Leu 2960 2965 2970 Arg Gly Glu Cys His Thr Cys Ile Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg 2975 2980 2985 Glu Lys Lys Pro Gly Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala 2990 2995 3000 Ile Trp Phe Met Trp Leu Gly Ala Arg Phe Leu Glu Phe Glu Ala 3005 3010 3015 Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp Leu Gly Arg Lys Asn Ser 3020 3025 3030 Gly Gly Gly Val Glu Gly Leu Gly Leu Gln Lys Leu Gly Tyr Ile 3035 3040 3045 Leu Arg Glu Val Gly Thr Arg Pro Gly Gly Lys Ile Tyr Ala Asp 3050 3055 3060 Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile Thr Arg Ala Asp Leu Glu 3065 3070 3075 Asn Glu Ala Lys Val Leu Glu Leu Leu Asp Gly Glu His Arg Arg 3080 3085 3090 Leu Ala Arg Ala Ile Ile Glu Leu Thr Tyr Arg His Lys Val Val 3095 3100 3105 Lys Val Met Arg Pro Ala Ala Asp Gly Arg Thr Val Met Asp Val 3110 3115 3120 Ile Ser Arg Glu Asp Gln Arg Gly Ser Gly Gln Val Val Thr Tyr 3125 3130 3135 Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu Ala Val Gln Leu Val Arg Met 3140 3145 3150 Met Glu Gly Glu Gly Val Ile Gly Pro Asp Asp Val Glu Lys Leu 3155 3160 3165 Thr Lys Gly Lys Gly Pro Lys Val Arg Thr Trp Leu Phe Glu Asn 3170 3175 3180 Gly Glu Glu Arg Leu Ser Arg Met Ala Val Ser Gly Asp Asp Cys 3185 3190 3195 Val Val Lys Pro Leu Asp Asp Arg Phe Ala Thr Ser Leu His Phe 3200 3205 3210 Leu Asn Ala Met Ser Lys Val Arg Lys Asp Ile Gln Glu Trp Lys 3215 3220 3225 Pro Ser Thr Gly Trp Tyr Asp Trp Gln Gln Val Pro Phe Cys Ser 3230 3235 3240 Asn His Phe Thr Glu Leu Ile Met Lys Asp Gly Arg Thr Leu Val 3245 3250 3255 Val Pro Cys Arg Gly Gln Asp Glu Leu Val Gly Arg Ala Arg Ile 3260 3265 3270 Ser Pro Gly Ala Gly Trp Asn Val Arg Asp Thr Ala Cys Leu Ala 3275 3280 3285 Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Leu Leu Leu Tyr Phe His Arg Arg 3290 3295 3300 Asp Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ala Val Pro Val 3305 3310 3315 Asn Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Ala Gly 3320 3325 3330 Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Glu Val Trp Asn Arg 3335 3340 3345 Val Trp Ile Glu Glu Asn Glu Trp Met Glu Asp Lys Thr Pro Val 3350 3355 3360 Glu Lys Trp Ser Asp Val Pro Tyr Ser Gly Lys Arg Glu Asp Ile 3365 3370 3375 Trp Cys Gly Ser Leu Ile Gly Thr Arg Ala Arg Ala Thr Trp Ala 3380 3385 3390 Glu Asn Ile Gln Val Ala Ile Asn Gln Val Arg Ala Ile Ile Gly 3395 3400 3405 Asp Glu Lys Tyr Val Asp Tyr Met Ser Ser Leu Lys Arg Tyr Glu 3410 3415 3420 Asp Thr Thr Leu Val Glu Asp Thr Val Leu 3425 3430

Claims (35)

  1. 사멸 또는 불활성화된 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus)의 하나 이상의 균주 또는 이의 임의의 항원을 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 동부 말 뇌척수염 바이러스(Eastern Equine Encephalomyelitis Virus), 서부 말 뇌척수염 바이러스(Western Equine Encephalomyelitis Virus) 및 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스(Venezuelan Equine Encephalomyelitis Virus), 파상풍 톡소이드(Tetanus Toxoid) 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 추가 균주의 적어도 하나의 항원을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 동부 말 뇌척수염 바이러스, 서부 말 뇌척수염 바이러스 및 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스, 파상풍 톡소이드 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가 균주를 포함하는, 면역원성 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 동부 말 뇌척수염 바이러스, 서부 말 뇌척수염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스 및 파상풍 톡소이드 중 하나 이상의 균주를 포함하는, 면역원성 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 말 헤르페스 바이러스(Equine Herpes Virus)의 적어도 하나의 항원 또는 하나의 추가 균주를 포함하는, 면역원성 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 말 헤르페스 바이러스의 적어도 하나의 추가 균주를 포함하는, 면역원성 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 말 인플루엔자 바이러스(Equine Influenza Virus)의 적어도 하나의 항원 또는 하나의 추가 균주를 포함하는, 면역원성 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 말 인플루엔자 바이러스의 적어도 하나의 추가 균주를 포함하는, 면역원성 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 동부 말 뇌척수염 바이러스, 서부 말 뇌척수염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 말 헤르페스 바이러스 및 파상풍 톡소이드 중 하나 이상의 균주를 포함하는, 면역원성 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 웨스트 나일 바이러스가 북미 분리주(North American Isolate)인, 면역원성 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 웨스트 나일 바이러스가 북미 주요 분리주(North American Dominant Isolate)인, 면역원성 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 웨스트 나일 바이러스가 ATCC에 수탁번호 PTA-9409로 기탁된 Horse Origin 2005; 미국 농무부(United States Department of Agriculture)에 수탁번호 405330으로 기탁된 분리주 NAEE159; NY2002Nassau; NY2002Clinton; NY2002Queens; GA20021; GA20022; TX20021; TX20022; IN2002; NY2003Albany; NY2003Suffolk; NY2003Chatauqua; CO20031; CO20032; TX2003; TX2003Harris4; TX2003Harris6; TX2003Harris7; TX2003Harris10; AZ2004; TX2004Harris4; 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 균주 중 하나인, 면역원성 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서부 말 뇌척수염 바이러스가 ATCC에 수탁번호 PTA-9410으로 기탁된 균주인, 면역원성 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스가 ATCC에 수탁번호 PTA-9411로 기탁된 균주인, 면역원성 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동부 말 뇌척수염 바이러스가 ATCC에 수탁번호 PTA-9412로 기탁된 균주인, 면역원성 조성물.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말 헤르페스 바이러스가 ATCC에 수탁번호 PTA-9525 또는 PTA-9526으로 기탁된 균주 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 면역원성 조성물.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자/말-2/Ohio/03, 인플루엔자/말-2/KY/95, 인플루엔자/말-2/New Market/2/93 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 면역원성 조성물.
  18. 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자/말-2/Ohio/03, 인플루엔자/말-2/KY/95 및 인플루엔자/말-2/New Market/2/93인, 면역원성 조성물.
  19. 제7항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말 인플루엔자 바이러스가 ATCC에 수탁번호 PTA-9522, PTA-9523 또는 PTA-9524로 기탁된 균주 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 면역원성 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주들 중 임의의 균주가 용량당 약 102.0 TCID50/ml 내지 1010.0 TCID50/ml의 양으로 존재하는, 면역원성 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 적당한 부형제 또는 약제학적 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 적당한 부형제 또는 약제학적 담체가 희석제, 보강제, 항미생물제, 불활성화제 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 면역원성 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 보강제가 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 비-대사성 오일 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 면역원성 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 말에게 투여되는, 면역원성 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 1회 이상의 용량으로 투여되는, 면역원성 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물의 1회 용량이 0.5ml 내지 2.5ml로 제형화되는, 면역원성 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 1회 용량의 투여 후 적어도 12개월의 면역 지속기간을 제공하는, 면역원성 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 4월령 이상의 망아지 또는 말에 사용하기에 안전한, 면역원성 조성물.
  29. 동물이나 동물 무리에서 웨스트 나일 바이러스와 관련되거나 이에 의해 유발되는 임상 증상의 중증도를 경감시키거나 발생률을 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 동물에게 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 동물이나 동물 무리에서 웨스트 나일 바이러스, 동부 말 뇌척수염 바이러스, 서부 말 뇌척수염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스 및 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 병원체와 관련되거나 이에 의해 유발되는 임상 증상의 중증도를 경감시키거나 발생률을 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 동물에게 제2항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 동물이나 동물 무리에서 동부 말 뇌척수염 바이러스, 서부 말 뇌척수염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스, 말 헤르페스 바이러스 및 클로스트리디움 테타니로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 병원체와 관련되거나 이에 의해 유발되는 임상 증상의 중증도를 경감시키거나 발생률을 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 동물에게 제5항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 동물이나 동물 무리에서 웨스트 나일 바이러스, 동부 말 뇌척수염 바이러스, 서부 말 뇌척수염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스, 말 헤르페스 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스 및 클로스트리디움 테타니로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 병원체와 관련되거나 이에 의해 유발되는 임상 증상의 중증도를 경감시키거나 발생률을 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 동물에게 제7항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 무리에서 상기 병원체들 중 하나 이상에 의해 유발되는 임상 증상의 발생률이, 상기 면역원성 조성물을 투여받지 않는 무리에 비해 약 10% 내지 50% 감소되는, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물의 적어도 1회 용량의 투여가 상기 병원체들 중 하나 이상에 대해 적어도 12개월의 면역 지속기간을 제공하는, 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 말인, 방법.
KR1020117006827A 2008-08-29 2009-08-31 웨스트 나일 바이러스 백신 KR101813017B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9308108P 2008-08-29 2008-08-29
US61/093,081 2008-08-29
US11708608P 2008-11-21 2008-11-21
US61/117,086 2008-11-21
PCT/US2009/055564 WO2010025469A1 (en) 2008-08-29 2009-08-31 West nile virus vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110069024A true KR20110069024A (ko) 2011-06-22
KR101813017B1 KR101813017B1 (ko) 2017-12-28

Family

ID=41280460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117006827A KR101813017B1 (ko) 2008-08-29 2009-08-31 웨스트 나일 바이러스 백신

Country Status (14)

Country Link
US (3) US8821889B2 (ko)
EP (1) EP2334327B1 (ko)
JP (2) JP5713454B2 (ko)
KR (1) KR101813017B1 (ko)
CN (1) CN102348466B (ko)
AU (1) AU2009287449B2 (ko)
BR (1) BRPI0918897B1 (ko)
CA (1) CA2735164C (ko)
CL (2) CL2011000445A1 (ko)
CO (1) CO6331444A2 (ko)
MX (1) MX2011002071A (ko)
NZ (2) NZ603854A (ko)
SG (1) SG193821A1 (ko)
WO (1) WO2010025469A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG193821A1 (en) * 2008-08-29 2013-10-30 Boehringer Ingelheim Vetmed West nile virus vaccine
BR112013023354B1 (pt) 2011-03-14 2022-02-15 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Composição imunogênica compreendendo cepas de vírus da rinite equina a (erav) e seu método de produção
WO2013000876A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Intervet International B.V. An aqueous composition comprising a biological antigen and an acrylic acid polymer
EP3322441A4 (en) * 2015-07-16 2018-12-19 Bharat Biotech International Limited Vaccine compositions
WO2018176075A1 (en) * 2017-03-27 2018-10-04 The University Of Queensland Chimeric insect-specific flaviviruses

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2702373B1 (fr) 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.
US7227011B2 (en) 1998-06-04 2007-06-05 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US7425437B2 (en) 1999-11-26 2008-09-16 Crucell Holland B.V. Vaccines against West Nile Virus
EA200601591A1 (ru) 2000-05-26 2007-02-27 Айденикс (Кайман) Лимитед Применение рибонуклеозидных соединений для лечения флавивирусных и пестивирусных инфекций
ES2331058T3 (es) 2001-02-28 2009-12-21 Intervet International Bv Emulsiones de agua en aceite inyectables.
EP1372711A4 (en) 2001-03-12 2005-06-01 Univ Yale COMPOSITIONS AND METHODS OF WEST NIL VIRUS POLYPEPTIDES
FR2823222B1 (fr) 2001-04-06 2004-02-06 Merial Sas Vaccin contre le virus de la fievre du nil
US20030104008A1 (en) 2001-04-06 2003-06-05 Loosmore Sheena May Recombinant vaccine against west nile virus
PL212212B1 (pl) * 2001-07-27 2012-08-31 Wyeth Corp Kompozycja szczepionki przeciwko zakażeniu wirusem Zachodniego Nilu, kompozycja końskiej szczepionki, szczepionka wirusa Zachodniego Nilu oraz zastosowania
RU2313367C2 (ru) 2001-10-19 2007-12-27 Экэмбис, Инк. Способы профилактики и лечения инфекции, вызываемой флавивирусами у животных
DE60330708D1 (de) 2002-11-15 2010-02-04 Sanofi Pasteur Biologics Co Impfstoff gegen das west-nile-virus
CA2432738A1 (en) 2003-02-26 2004-08-26 Philippe Despres New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications
JP2007068401A (ja) 2003-08-07 2007-03-22 Chemo Sero Therapeut Res Inst 西ナイルウイルスワクチン
WO2005024427A2 (en) 2003-09-09 2005-03-17 Idexx Laboratories, Inc. Detection of west nile virus infection and vaccination
US7459163B2 (en) 2004-02-25 2008-12-02 University Of Kansas Infectious DNA as a vaccine against west nile and other flaviviruses
CA2572921C (en) 2004-07-09 2017-01-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Replication-competent and propagation-defective venezuelan equine encephalitis (vee) viral adjuvants
US7482017B2 (en) 2004-09-09 2009-01-27 Research Development Foundation Flavivirus variants having phenotypic variation and immunogenic compositions thereof
EP1645283A1 (en) 2004-10-08 2006-04-12 Chiron Behring GmbH & Co. KG Combination vaccine
CA2591665C (en) 2004-12-20 2015-05-05 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof
EP1896069B1 (en) * 2005-06-24 2013-03-13 Intervet International BV Inactivated chimeric vaccines and related methods of use
US7601502B2 (en) 2005-11-01 2009-10-13 Intervet International B.V. Prime boost vaccine for the protection of equines against equine influenza
US7455842B2 (en) 2005-12-05 2008-11-25 University Of Kansas Chimeric West Nile viruses and uses thereof
SG193821A1 (en) * 2008-08-29 2013-10-30 Boehringer Ingelheim Vetmed West nile virus vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0918897B1 (pt) 2021-06-15
CO6331444A2 (es) 2011-10-20
AU2009287449B2 (en) 2015-04-30
US20170049877A1 (en) 2017-02-23
JP2012501350A (ja) 2012-01-19
WO2010025469A1 (en) 2010-03-04
KR101813017B1 (ko) 2017-12-28
NZ591188A (en) 2012-12-21
SG193821A1 (en) 2013-10-30
BRPI0918897A2 (pt) 2015-12-01
NZ603854A (en) 2015-03-27
CA2735164A1 (en) 2010-03-04
CL2015001803A1 (es) 2015-10-16
AU2009287449A1 (en) 2010-03-04
JP2015028058A (ja) 2015-02-12
US9517259B2 (en) 2016-12-13
US20110159033A1 (en) 2011-06-30
US8821889B2 (en) 2014-09-02
EP2334327B1 (en) 2016-01-06
CA2735164C (en) 2021-08-31
CL2011000445A1 (es) 2011-07-08
US20140328877A1 (en) 2014-11-06
MX2011002071A (es) 2011-04-05
CN102348466A (zh) 2012-02-08
US9962435B2 (en) 2018-05-08
EP2334327A1 (en) 2011-06-22
JP5713454B2 (ja) 2015-05-07
CN102348466B (zh) 2014-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Van Oirschot et al. Marker vaccines, virus protein-specific antibody assays and the control of Aujeszky's disease
AU2006300927B2 (en) Vaccines and methods to treat canine influenza
US9962435B2 (en) West Nile Virus vaccine
US11065328B2 (en) Vaccine against infectious bronchitis virus
AU2009279528A1 (en) Infectious bronchitis vaccines derived from IB-QX-like strains
AU2016203333B2 (en) Infectious bronchitis vaccines derived from IB-QX-like strains
US11696947B2 (en) H52 IBV vaccine with heterologous spike protein
Aston Effects of vaccination schedule and ambient ammonia on the immune response to vaccination and protection against homologous challenge in chickens
AU2013260726A1 (en) Infectious bronchitis vaccines derived from IB-QX-like strains

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant