BRPI0918897B1 - Composição imunogênica e seus usos - Google Patents

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Philip W. Hayes
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Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.
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Abstract

vacina contra o vírus do nilo ocidental. a presente invenção refere-se a composições imunogênicas contra o vírus do nilo ocidental. as composições imunogênicas, em modalidades alternativas, também incluem outros patógenos equinos. a composição do vírus do nilo ocidental da presente invenção prevê vantajosamente proteção contra cepas ou isolados do vírus do nilo ocidental dominante na américa do norte.

Description

Antecedentes
[001] O Vírus do Nilo Ocidental (("WNV") - "West Nile Virus') está na família Flavivirade. A infecção é geralmente contraída através de um vetor de mosquito transferida através da picada do inseto. O Oeste do Nilo infecta todos os tipos de animais e aves em todo o mundo. Este vírus foi primeiro detectado na região da América do Norte em 1999 com o primeiro diagnóstico ocorrendo em cavalos Canadenses. Atualmente, Vírus do Nilo Ocidental se tornou endêmico nos Estados Unidos afetando aves, humanos e animais de todos os tipos. Em 2002, mais de 14.700 casos confirmados dVírus do Nilo Ocidental foram relatados em 43 estados.
[002] A disseminação do WNV foi influenciada por vários fatores. Uma vez que o mosquito é o vetor para o vírus e perpetua WNV, as condições ecológicas que levam ao crescimento e desenvolvimento de populações de mosquito tiveram um impacto na disseminação do WNV. Existem várias táticas que têm sido utilizadas para controlar populações de mosquitos em um esforço para prevenir a disseminação de WNV. Essas táticas incluem o uso de pesticidas, repelentes, barreiras físicas prevenindo contato entre mosquitos e animais, eliminação de ambientes que perpetuam a procriação de mosquitos e o uso de imunizações. Sinais típicos de WNV incluem vários sintomas que afetam o sistema nervoso central. Sintomas de encefalite são frequentemente vistos e incluem viremia, lesões histopatológicas do sistema nervoso central, anorexia, depressão, febre, fraqueza, marcha anormal, paralisia dos membros traseiros, visão prejudicada, ataxia, perambulação, convulsões, incapacidade em engolir, coma e morte.
[003] Algumas vacinas para WNV foram introduzidas, as quais são indesejáveis por várias razões. Por exemplo, foi produzida uma vacina a partir dVírus do Nilo Ocidental vetorizada por canarypox. Outro conjunto de vacinas foi produzido a partir de uma proteína quimérica recombinante de Vírus do Nilo Ocidental, onde a vacina de proteína quimérica foi projetada através da fusão de uma versão modificada de flagelina bacteriana (STF2 Delta) ao domínio EIII da proteína envelope do WNV. Outra vacina incluía uma cepa do Oeste do Nilo da América do Norte inicial inativada que necessitava de um óleo metabolizado como um adjuvante. Finalmente, uma vacina quimérica atenuada, viva, foi produzida a partir de um clone infeccioso do vírus 17D da febre amarela onde a pré-membrana e as proteínas envelope foram substituídas pelos genes correspondentes de WN(4).
[004] Há vários problemas inerentes em vacinas descritas acima. As vacinas contendo organismos virais vivos têm o risco de infectar um animal com o vírus através da vacinação levando à doença e até mesmo morte. Vacinas de proteína quimérica, vacinas recombinantemente expressas e algumas vacinas de subunidade têm problemas de atividade imunológica e efeito limitados com relação ao número de proteínas incluídas na composição de vacina. A eficácia desses tipos de vacina é geralmente limitada e o risco de infecção pelo vírus ou reversão para vírus do tipo selvagem é prevalente. Ainda, alguns dos adjuvantes utilizados em vacinas comuns são compreendidos de óleos metabolizados que são removidos relativamente rapidamente do corpo e limitam a duração durante a qual o sistema imune do animal vacinado pode responder à composição imunogenicamente ativa. Outros adjuvantes podem causar reações alérgicas e efeitos desfavoráveis nos animais vacinados. Ainda, essas vacinas não incluem antígenos para estimulação da imunidade para outros patógenos além do WNV, de maneira que elas falham em proteger os animais contra várias doenças com conveniência e segurança. Também, todas as vacinas anteriores eram derivadas de um isolato inicial de WNV que não está mais presente no ambiente, e então não pode mais infectar animais e causar doença.
[005] Desta maneira, o que é necessário na técnica é uma vacina que seja segura para administração a animais de todas as idades, incluindo animais grávidos, que inclua adjuvantes adequados para auxiliar no efeito imunogênico e duração da vacina e que seja preparada a partir de isolatos contemporâneos ou dominantes de WNV que ainda estão presentes no ambiente natural e causam doença contra a qual tais vacinas dariam proteção. O que é necessário ainda é uma vacina que reduza a incidência e/ou severidade de até e incluindo a eliminação ou prevenção de sinais clínicos associados com a doença ou infecção pelVírus do Nilo Ocidental. Ainda, o que é necessário é uma vacina contra Vírus do Nilo Ocidental que inclua antígenos dVírus do Nilo Ocidental em combinação com antígenos de outros patógenos equinos, desta maneira provendo mais proteção através da redução da incidência de ou severidade de sinais clínicos de doença de ambos Vírus do Nilo Ocidental e o(s) outro(s) patógeno(s).
Sumário da Invenção
[006] A presente invenção supera os problemas inerentes à técnica anterior e provê um avanço distinto no estado da técnica. Mais particularmente, a presente invenção provê uma vacina ou composição imunogênica compreendendo um componente antigênico imuno- genicamente ativo compreendido de uma ou mais cepas ou isolatos de Vírus do Nilo Ocidental. Em algumas modalidades preferidas, a composição compreende ainda um adjuvante, preferivelmente um carbômero, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, Vírus do Nilo Ocidental está morto ou inativado. Esta composição induz uma resposta imunogênica em animais suscetíveis de contrair Vírus do Nilo Ocidental e provê uma vacina segura para animais de qualquer idade.
[007] A presente invenção provê ainda uma composição de vacina que é imunogenicamente ativa e que supera as limitações daquelas anteriormente descritas. A presente invenção provê uma vacina inativada, desta maneira provendo segurança única para os animais vacinados, incluindo fêmeas grávidas. Ainda, a composição imuno- gênica da presente invenção supera interferência de imunidade maternal passivamente adquirida e estimula a imunidade ativa em animais vacinados. Vantajosamente, a presente invenção provê uma composição imunogenicamente eficaz contendo muitos ou todos os componentes e proteínas antigênicas relevantes de WNV patogênico. A composição imunogênica da presente invenção é única pelo fato de incluir antígenos de isolatos contemporâneos ou isolatos epidemio- logicamente dominantes de WNV na composição, provendo respostas imunogênicas protetoras através da redução da incidência de e/ou severidade de sinais clínicos de infecção por WNV até e incluindo imunidade contra os isolatos mais prevalentes vistos em animais, incluindo cavalos, hoje. Em uma modalidade preferida, esses isolatos contemporâneos de WNV incluem aqueles isolatos que são parte dos isolatos dVírus do Nilo Ocidental da América do Norte ou isolatos dVírus do Nilo Ocidental Dominante na América do Norte. Para propósitos da presente invenção, WN02 é um exemplo representativo de uma cepa de WNV que pode ser referida como uma cepa ou isolato de Vírus do Nilo Ocidental Dominante na América do Norte. Especificamente, as cepas e isolatos Dominantes na América do Norte são aqueles tendo pelo menos 1 mudança de nucleotídeo resultando em uma mudança de aminoácido dos isolatos de WN99. A cepa NY99 (No. de Acesso GenBankAF196835) serve como uma cepa de referência para determinação de se uma cepa ou isolato é Dominante na América do Norte. Ainda, essas cepas ou isolatos podem ter uma ou mais mudanças de aminoácido silenciosas. Em uma modalidade preferida, a mudança de nucleotídeo resulta em uma mudança de aminoácido em uma proteína envelope da cepa ou isolato e, mais preferivelmente, a mudança de nucleotídeo resulta em uma mudança de aminoácido de valina para alanina. Preferivelmente, a mudança de aminoácido está associada com uma maior habilidade em replicar no hospedeiro intermediário, a saber, o mosquito. Mais preferivelmente, as cepas Dominantes na América do Norte incluem qualquer (e preferivelmente ambas) mutação U para C e uma mutação C para U nas posições 1442 e 2466 (em comparação com a cepa Norte-Americana, por exemplo, NY 99 e SEQ ID NO:23), respectivamente. Com mais preferência ainda, as cepas ou isolatos Dominantes na América do Norte incluem ainda uma mutação na sequência de nucleotídeo codificando a proteína E e a mutação C em U na posição 9352 na sequência codificando a proteína NS5 (novamente em comparação com a cepa da América do Norte, por Exemplo, NY 99 e SEQ ID NO:23). Essas mutações preferidas são mostradas no Exemplo 10 e em Phylogenetic Analysis of North American West Nile Virus Isolates, 2001-2004; Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype, C. Todd Davis e outros, Virology, 342, p. 252-265 (2005), cujos ensinamento e conteúdo são aqui incorporados a título de referência.
[008] A presente invenção provê também um método de fabricação da composição imunogênica da presente invenção. O método compreende geralmente as etapas de combinação de um antígeno do Oeste do Nilo e um excipiente ou veículo farmaceu- ticamente aceitável ou veterinário. Uma modalidade preferida compreende ainda a etapa de adição de um ou mais antígenos equinos adicionais. Em outra modalidade, o método compreende ainda a etapa de adição de um adjuvante adequado à composição.
[009] Em uma modalidade preferida, a presente invenção inclui antígenos de WNV e um adjuvante de óleo não metabolizável, preferivelmente óleo mineral, para prolongar a duração que o sistema imune do animal vacinado pode responder à composição imuno- genicamente ativa. O óleo não metabolizável é compreendido ser um óleo que, quando administrado com um antígeno, não metaboliza no corpo após administração. Um óleo não metabolizável preferido é óleo mineral. Em outras formas preferidas, ambos o adjuvante carbômero e óleo não metabolizável (preferivelmente óleo mineral) estão presentes em adição aos antígenos de WNV. O(s) adjuvante(s) pode(m) ser usado(s) em qualquer uma das composições descritas aqui.
[010] Em uma modalidade adicional, a composição da presente invenção contém antígenos de WNV, preferivelmente um WNV inativado ou morto de uma cepa dominante na América do Norte, e essencialmente nenhum óleo ou adjuvantes à base de óleo. Em tal modalidade, outros adjuvantes, preferivelmente carbômero, podem ser incluídos.
[011] Em outra modalidade, uma composição de vacina compreendida de antígenos de WNV em combinação com outros antígenos de patógenos microbianos equinos é provida a fim de conferir um escopo amplo de proteção ao animal. Em tais modalidades, os antígenos de WNV estão em qualquer forma conforme acima descrito.
[012] Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê uma composição de vacina compreendendo antígenos de WNV conforme acima descrito em combinação com uma ou mais quantidades imunologicamente eficazes de componentes antigênicos selecionados do grupo consistindo em Vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana (VEE), Encefalomielite Equina do Leste (EEE), Encefalomielite Equina do Oeste (WEE), Toxoide do Tétano (T), Vírus do herpes equino (EHV) incluindo tipos 1 e 4, Vírus da influenza equina (EIV), e combinações dos mesmos, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente tais modalidades vão incluir um adjuvante, preferivelmente carbômero, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Ainda, um óleo não metabolizável, preferivelmente óleo mineral, pode estar presente, no entanto, tal óleo não é requerido.
[013] As modalidades preferidas também incluem antígenos de WNV, conforme acima descrito, em combinação com: Encefalomielite Equina do Leste; Encefalomielite Equina do Oeste; Encefalomielite Equina Venezuelana; Toxoide do Tétano; Encefalomielite Equina do Leste e Encefalomielite Equina do Oeste; Encefalomielite Equina do Leste e Encefalomielite Equina Venezuelana; Encefalomielite Equina do Leste e Toxoide do Tétano; Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste e Encefalomielite Equina Venezuelana; Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste e Toxoide do Tétano; Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste, Encefalomielite Equina Venezuelana e Toxoide do Tétano; Encefalomielite Equina do Oeste e Encefalomielite Equina Venezuelana; Encefalomielite Equina do Oeste e Toxoide do Tétano; Encefalomielite Equina do Oeste, Encefalomielite Equina Venezuelana e Toxoide do Tétano; Encefalomielite Equina Venezuelana e Toxoide do Tétano; e Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina Venezuelana e Toxoide do Tétano. A combinação mais preferida dessas combinações especificadas incluem antígenos de WNV em combinação com antígenos ou componentes antigênicos de Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste, Encefalomielite Equina Venezuelana e Toxoide do Tétano. Em tal combinação especificada, um adjuvante ou combinação de adjuvantes pode ser usado, com carbômero, e mais preferivelmente ainda carbopol, sendo particularmente preferidos. Nas formas mais preferidas da combinação de WNV e Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste, Encefalomielite Equina Venezuelana e Toxoide do Tétano, nenhum óleo (metabolizável ou não metabolizável) está presente. A cepa NJO de Encefalomielite Equina do Leste, a cepa Fleming da cepa de Encefalomielite Equina do Oeste e a cepa TC-83 da cepa de Encefalomielite Equina Venezuelana são todas cepas representativas desses componentes de vacina.
[014] Modalidades preferidas adicionais da presente invenção podem ser feitas usando cada uma das vacinas de combinação especificadas listadas acima e adicionando antígenos de Herpesvírus Equino, preferivelmente tipo 1, tipo 4 (EHV1 e/ou EHV4) ou combinações dos mesmos.
[015] Variações adicionais de cada uma das vacinas de combinação especificadas listadas acima, incluindo aquelas que incluem EHV1 e/ou EHV4, podem ser feitas através da adição em antígenos do Vírus da influenza equina (EIV). Modalidades preferidas incorporando Vírus da influenza equino incluem: Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina e Toxoide do Tétano; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Toxoide do Tétano e Encefalomielite Equina do Leste; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Toxoide do Tétano, Encefalomielite Equina do Leste e Encefalomielite Equina do Oeste; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Toxoide do Tétano, Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste; e Encefalomielite Equina Venezuelana; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina e Encefalomielite Equina do Leste; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina e Encefalomielite Equina do Oeste; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina e Encefalomielite Equina Venezuelana; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina do Leste e Encefalomielite Equina do Oeste; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina do Leste e Encefalomielite Equina Venezuelana; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina do Oeste e Encefalomielite Equina Venezuelana;Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina do Oeste e Toxoide do Tétano; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana e Toxoide do Tétano; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Encefalomielite Equina do Oeste e Toxoide do Tétano; e Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Encefalomielite Equina do Leste e Toxoide do Tétano. Em cada modalidade especificada qualquer um ou mais cepas ou isolatos de Influenza Equina podem estar presentes. Cepas preferidas do Vírus da Influenza Equina incluem Influenza A/equine-2/Ohio/03, Influenza A/equine-2/New Market/2/93, Influenza A/equine-2/Kentucky/95 e combinações dos mesmos. Em todas as combinações listadas acima, é preferido usar pelo menos duas cepas de Influenza Equina e com mais preferência ainda usar pelo menos 3 cepas de Influenza Equina. Modalidades preferidas incorporando Vírus do Herpes Equino incluem: Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Toxoide do Tétano e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Toxoide do Tétano, Encefalomielite Equina do Leste e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Toxoide do Tétano, Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Toxoide do Tétano, Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste; Encefalomielite Equina Venezuelana e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina e Encefalomielite Equina do Leste; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina do Oeste e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina Venezuelana e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina do Oeste, Encefalomielite Equina Venezuelana e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina do Oeste, Toxoide do Tétano e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Toxoide do Tétano e Vírus do Herpes Equino; Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Encefalomielite Equina do Oeste, Toxoide do Tétano e Vírus do Herpes Equino; e Vírus do Nilo Ocidental, pelo menos uma cepa de Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Encefalomielite Equina do Leste, Toxoide do Tétano e Vírus do Herpes Equino. Em todas as combinações listadas acima, é preferido usar pelo menos duas cepas de Influenza Equina e com mais preferência ainda usar pelo menos 3 cepas de Influenza Equina. Ainda, em todas as combinações acima, a "pelo menos uma" cepa de Herpesvírus Equino é preferida ser selecionada do grupo consistindo em EHV-1 e EHV-4. Em algumas formas preferidas, EHV-1 e EHV-4 serão incluídos na composição imunogênica. Em outras formas preferidas, apenas EHV-1 será incluído. O componente WNV da combinação será preferivelmente uma cepa dominante na América do Norte inativada ou morta conforme aqui descrito.
[016] A composição de vacina pode ser administrada em qualquer dose imunogenicamente eficaz. Em uma modalidade preferida, a composição de vacina é administrada em uma dose única. Preferivelmente, a dose tem um volume total entre cerca de 0,5 ml e 2,5 ml, mais preferivelmente entre cerca de 0,6 ml e 2,0 ml, mais preferivelmente entre cerca de 0,7 ml e 1,75 ml, mais preferivelmente ainda entre cerca de 0,8 ml e 1,5 ml, mais preferivelmente ainda entre cerca de 0,9 ml e 1,25 ml, com uma dose única de 1,0 ml sendo a mais preferida.
[017] Em outra modalidade, a vacina é administrada com uma primeira dose sendo administrada antes da administração de uma segunda dose (reforço). Preferivelmente, a segunda dose é administrada pelo menos 15 dias após a primeira dose. Mais preferivelmente, a segunda dose é administrada entre 15 e 28 dias após a primeira dose. Mais preferivelmente ainda, a segunda dose é administrada pelo menos 17 dias após a primeira dose. Mais preferivelmente ainda, a segunda dose é administrada entre 17 e 25 dias após a primeira dose. Mais preferivelmente ainda, a segunda dose é administrada pelo menos 19 dias após a primeira dose. Mais preferivelmente ainda, a segunda dose é administrada entre 19 e 23 dias após a primeira dose. Mais preferivelmente a segunda dose é administrada pelo menos 21 dias após a primeira dose. Em uma modalidade preferida, ambas a primeira e a segunda dose da vacina estão na mesma quantidade. Preferivelmente, cada dose está nas quantidades preferidas especificadas acima, com uma dose de 1 ml das primeira e segunda doses sendo mais preferidas. Em adição ao regime de primeira e segunda doses, uma modalidade alternativa compreende doses subsequentes adicionais. Por exemplo, uma terceira, quarta ou quinta dose poderia ser administrada nessas modalidades. Preferivelmente, os regimes de terceira, quarta e quinta doses são administrados nas mesmas quantidades que a primeira dose, com a estrutura de tempo entre as doses sendo de acordo com o momento das primeira e segunda doses mencionadas acima.
[018] Em uma modalidade preferida adicional, em cada dose da composição da presente invenção, o antígeno de WNV compreende pelo menos 102,0TCID50/dose. Mais preferivelmente, o antígeno de WNV compreende entre cerca de 102.0TCID50/dose a 1010,0TCID50/dose. Mais preferivelmente ainda, o antígeno de ENV compreende pelo menos 102,5TCID50/dose. Mais preferivelmente ainda, o antígeno de WNV compreende entre cerca de 102,5TCID50/dose a cerca de 109,5TCID50/dose. Mais preferivelmente ainda, o antígeno de WNV compreende pelo menos 103,0TCID50/dose. Com mais preferência, o antígeno de WNV compreende entre cerca de 103,0TCID50/dose a cerca de 109,0TCID50/dose. Mais preferivelmente ainda, o antígeno de WNV compreende pelo menos 103,5TCID50/dose. Mais preferivelmente ainda, o antígeno de WNV compreende entre cerca de 103,5TCID50/dose a cerca de 109,0TCID50/dose. Mais preferivelmente, o antígeno de WNV compreende entre 107,0TCID50/dose e 109,0TCID50/dose. Os valores TCID50 de uma vacina de WNV inativada ou qualquer outra vacina inativada refere-se em geral ao teor de antígeno na vacina final que, no entanto, é equivalente ao teor de antígeno calculado para a composição de vacina antes da inativação de seu antígeno. Preferivelmente, a composição imunogênica da presente invenção estimula anticorpos de neutralização de soro para WNV em um título de 1:4 ou maior quando determinado em um ensaio de detecção disponível comercial ou usando os procedimentos conhecidos do versado na técnica com um exemplo representativo provido aqui. Em uma modalidade preferida, em cada dose de uma modalidade da presente invenção que compreende antígeno de equino adicional, a quantidade de Encefalomielite Equina do Leste ou Encefalomielite Equina Venezuelana em qualquer dose é preferivelmente pelo menos 105,5TCID50/dose. Mais preferivelmente ainda, a dose está entre cerca de 105,5TCID50/dose e 109,5TCID50/dose. Com mais preferência ainda, a dose é pelo menos 106,0TCID50/dose. Com mais preferência ainda, a dose está entre cerca de 106,0TCID50/dose e 109,0TCID50/dose. Mais preferivelmente, a dose é pelo menos 106,5TCID50/dose. Com mais preferência ainda, a dose está entre cerca de 106,5TCID50/dose e 109,5TCID50/dose. Mais preferivelmente, a dose é pelo menos 107,0TCID50/dose. Com mais preferência a dose está entre 106,7TCID50 e 109,2TCID50/dose.
[019] Preferivelmente, o antígeno de Encefalomielite Equina do Oeste, quando presente na composição da presente invenção, está em uma quantidade de pelo menos 106,2PFU/ml. Mais preferivelmente, a quantidade está entre 106,2PFU/ml e 1010,2PFU/ml. Mais preferivelmente ainda, a quantidade é pelo menos 106,7PFU/ml. Mais preferivelmente, a quantidade está entre 106,5PFU/ml e 109,7PFU/ml. Mais preferivelmente ainda, a quantidade é pelo menos 107,2PFU/ml. Mais preferivelmente, a quantidade está entre cerca de 107,2PFU/ml e 109,2PFU/ml. Mais preferivelmente ainda, a quantidade é pelo menos 107,7PFU/ml com entre 106,5PFU/dose e 109.0PFU/ml sendo mais preferido.
[020] Em outra modalidade preferida, a quantidade de Toxoide do tétano, se presente na composição da presente invenção, está em uma quantidade de pelo menos 3 CPU, mais preferivelmente entre cerca de 3 CPU e 20 CPU, mais preferivelmente ainda, pelo menos 4 CPU e, mais preferivelmente, pelo menos 5 CPU mas não mais do que 20 CPU.
[021] Em uma modalidade alternativa, onde uma ou mais cepas de Vírus da Influenza Equina estiverem presentes, a quantidade de Influenza Equina presente na composição está em uma quantidade de pelo menos 105,0TCID50/mL. Mais preferivelmente, a Influenza Equina está em uma quantidade entre cerca de 105,0 TCID50/mL a 109,0 TCID50/mL e, mais preferivelmente, pelo menos 106,0 TCID50/mL. Mais preferivelmente ainda, a quantidade está entre cerca de 106,0 TCID50/mL a 108,0 TCID50/mL e, mais preferivelmente ainda, a quantidade é pelo menos 106,5 TCID50/mL. Mais preferivelmente ainda, a quantidade está entre cerca de 106.5 TCID50/mL a 107,0 TCID50/mL, com a quantidade mais preferida sendo entre cerca de 106,7 TCID50/mL a 107,0.
[022] Em uma modalidade que compreende Vírus do Herpes Equino, a quantidade de Vírus do Herpes Equino em cada dose é pelo menos 106,0 TCID50/mL. Mais preferivelmente, Vírus do Herpes Equino está presente na composição em uma quantidade entre 106,0 TCID50/mL a 109,5 TCID50/mL e, mais preferivelmente, em uma quantidade de cerca de 107,0TCID50/mL. Mais preferivelmente ainda, Vírus do Herpes Equino está presente em uma quantidade entre 107,5 TCID50/mL a 109,0 TCID50/mL e, mais preferivelmente, em uma quantidade de cerca de 108,0 TCID50/mL. Mais preferivelmente ainda, o Vírus do Herpes Equino está presente em uma quantidade entre 108,0 TCID50/mL a 109,0 TCID50/mL e, mais preferivelmente, em uma quantidade de cerca de 108,50TCID50/mL.
[023] Em ainda outra modalidade preferida, uma composição de vacina compreendendo as cepas cronologicamente contemporâneas e epidemiologicamente prevalentes de WNV é provida. Tal composição vai geralmente aprimorar a eficácia da composição. Preferivelmente, tal cepa prevalente é isolada dos tecidos de um cavalo. Tal fonte é uma fonte preferida de WNV para preparação de vírus semente de vacina para uma composição imunológica para uma espécie para a qual uma vacina para WNV compreensivamente segura e eficaz é particularmente necessária, a saber, o cavalo. Ainda, a presente invenção descreve uma composição de vacina compreendendo uma cepa de passagem baixa inativada de WNV dos tecidos de um cavalo, desta maneira superando as limitações de vacinas anteriores com o repertório limitado inapropriado de antígenos de proteína encontrados ou em vacinas atenuadas de passagem alta, vacinas de subunidade ou outras composições produzidas através de tecnologia recombinante que expressa menos do que o complemento integral de proteínas. Esta cepa de WNV de passagem baixa inativada, isolada de tecidos de cavalo, supera as deficiências inerentes em vacinas anteriores e provê um número amplo de proteínas imunogênicas de maior relevância em virtude de serem produzidas a partir de uma cepa equina altamente virulenta de passagem baixa, desta maneira compreendendo uma composição imunogênica unicamente e compreensivamente eficaz, ainda segura, não antes disponível para vacinação do cavalo. Ainda, cepas cronologicamente contemporâneas e epidemiologicamente prevalentes preferidas de WNV são cepas de WNV dominante na América do Norte, conforme aqui definido.
[024] A presente invenção provê um escopo mais amplo de proteção do que composições imunogênicas ou de vacina tradicionais, uma vez que a presente invenção provê proteção contra uma faixa ampla de isolatos de um antígeno particular. O modelo de provocação usado para avaliar a eficácia da composição da presente invenção utilizou uma cepa de provocação heteróloga, evidenciando a capacidade da composição em prover proteção para isolatos e cepas fora da cepa particular ou isolato usado para vacinar o animal. Esta é uma característica única da presente invenção.
[025] A presente invenção provê ainda um método de redução da incidência e/ou severidade de sinais clínicos associados com a infecção dVírus do Nilo Ocidental em um animal, preferivelmente um cavalo, quando comparado com uma infecção do tipo selvagem. Tais métodos geralmente compreendem a etapa de administração de uma composição de vacina compreendendo um isolato morto ou inativado de Vírus do Nilo Ocidental, preferivelmente uma cepa WNV dominante na América do Norte, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades preferidas do presente pedido, um adjuvante é adicionado à composição, e em outras formas preferidas, nenhum adjuvante é provido. Em uma modalidade preferida alternativa, o método compreende administração de uma composição de vacina compreendendo um ou mais isolato(s) mortos ou inativados de Vírus do Nilo Ocidental em combinação com quantidades imunologicamente eficazes de componentes antigênicos de outros patógenos equinos. Preferivelmente esses isolatos são selecionados do grupo consistindo em antígeno da Encefalomielite Equina do Leste, antígeno da Encefalomielite Equina do Oeste, antígeno da Encefalomielite Equina Venezuelana, Toxoide do tétano e combinações dos mesmos, e mais preferivelmente sendo aquelas combinações descritas acima. Em outra modalidade preferida, a vacina da presente invenção é combinada com um adjuvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável adequado.
[026] A presente invenção provê redução da incidência e/ou severidade de sintomas clínicos associados com a infecção dVírus do Nilo Ocidental em um rebanho, quando comparado com infecção do tipo selvagem. Preferivelmente, a severidade e/ou incidência de sintomas clínicos em animais recebendo a composição imunogênica da presente invenção são reduzidas pelo menos 10% em comparação com animais que não recebem tal administração quando ambos os grupos (animais recebendo e animais não recebendo a composição) são provocados com ou expostos à infecção do tipo selvagem por WNV. Mais preferivelmente, a incidência ou severidade é reduzida pelo menos 20%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 30%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 40%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 50%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 60%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 70%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 80%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 90%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 95% e mais preferivelmente ainda pelo menos 100%, onde os animais que recebem a composição da presente invenção não exibem quaisquer sintomas clínicos. Preferivelmente, a cepa de WNV é uma cepa dominante na América do Norte de WNV. Vantajosamente, a presente invenção também provê proteção de cepas heterólogas (com relação à cepa usada na composição) de patógenos.
[027] A presente invenção provê ainda um método de estimulação de anticorpos de neutralização de soro ou soro de hemaglutinação para um patógeno selecionado do grupo consistindo em WNV, WEE, VEE, EEE, EHV, EIV e combinações dos mesmos através da administração de uma composição de acordo com a presente invenção descrita aqui. Preferivelmente, a composição da presente invenção estimula anticorpos de neutralização de soro para WNV em um título de 1:4 ou maior, desta maneira prevenindo ou reduzindo viremia de WNV.
[028] A composição imunogênica da presente invenção provê uma duração prolongada de imunidade contra todos os antígenos presentes na vacina. Preferivelmente, a duração de imunidade contra o Oeste do Nilo é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 2 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 3 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 4-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 6-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 7-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 8-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 9-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 10-24 meses e, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 12-24 meses.
[029] Preferivelmente, a duração de imunidade contra EIV é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 2 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 3 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 4-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 6-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 7-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 8-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 9-24 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 1024 meses e, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 12-24 meses.
[030] Preferivelmente, a duração de imunidade contra EHV é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 2 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 3 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 4-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 6-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 7-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 8-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 9-24 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 1024 meses e, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 12-24 meses.
[031] Preferivelmente, a duração de imunidade contra Encefalo- mielite Equina do Oeste é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 2 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 3 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 4-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 624 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 7-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 8-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 9-24 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 10-24 meses e, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 12-24 meses.
[032] Preferivelmente, a duração de imunidade contra Encefalomielite Equina do Leste é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 2 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 3 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 4-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 6-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 7-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 8-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 9-24 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 10-24 meses e, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 12-24 meses.
[033] Preferivelmente, a duração de imunidade contra Encefalomielite Equina Venezuelana é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 2 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 3 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 4-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 6-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 7-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 8-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 9-24 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 10-24 meses e, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 12-24 meses.
[034] Preferivelmente, a duração de imunidade contra Toxoide do tétano é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 2 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 3 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 4-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 6-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 7-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 8-24 meses, mais preferivelmente ainda, a duração de imunidade é pelo menos 9-24 meses, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 10-24 meses e, mais preferivelmente, a duração de imunidade é pelo menos 12-24 meses.
[035] Preferivelmente, a duração de imunidade de pelo menos 12 meses refere-se ainda a qualquer combinação de antígenos que forma a composição imunogênica da presente invenção.
[036] Em outra modalidade preferida compreendendo antígenos de EIV e/ou EHV, conforme acima descrito, a composição imunogênica melhora excreção de EIV ou EHV infeccioso para prevenir espalhamento do vírus para outros animais suscetíveis.
[037] Em ainda outra modalidade preferida, composições de acordo com a presente invenção descritas aqui superam a interferência de imunidade maternal passivamente adquirida e estimulam a imunidade ativa e uma redução na incidência de ou severidade de sinais clínicos de infecção por EIV em animais vacinados contra EIV.
[038] Em outra modalidade preferida da presente invenção, uma composição imunogênica compreendendo VEE, WEE, EEE, tétano, WNV, rinopneumonite equina e influenza equina, todos conforme aqui descrito, demonstra eficácia contra VEE, WEE, EEE, tétano, WNV, rinopneumonite equina e influenza equina após administração de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, tal composição incluirá ainda um adjuvante, preferivelmente óleo mineral e/ou um carbômero, e um veículo veterinário aceitável. Em formas preferidas, a composição será administrada em uma dose de 1 ml única.
[039] Cada uma das composições imunogênicas descritas aqui que incluem antígeno para WNV pode ser administrada conforme descrito de maneira que elas reduzam a incidência de ou diminuam a severidade de sintomas clínicos associados com Vírus do Nilo Ocidental.
[040] Cada uma das composições imunogênicas descritas aqui que incluem antígeno de EIV pode ser administrada conforme descrito de maneira que elas reduzam a incidência de ou diminuam a severidade de sintomas clínicos associados com Influenza Equina.
[041] A presente invenção também provê um método para redução da incidência de ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados com vírus do Herpes Equino compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima, que inclui um antígeno do vírus do Herpes Equino, a um animal.
[042] A presente invenção também provê um método para redução da incidência de sintomas clínicos associados com Vírus do Nilo Ocidental compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas que inclui antígeno dVírus do Nilo Ocidental, conforme aqui descrito, a um animal.
[043] A presente invenção também provê um método para redução da incidência de sintomas clínicos associados com Vírus da Influenza Equina compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima, que inclui um antígeno da Influenza Equina, a um animal.
[044] A presente invenção provê ainda um método para redução da incidência de sintomas clínicos associados com Vírus do Herpes Equino compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima, que inclui um antígeno do vírus do Herpes Equino, a um animal.
[045] A presente invenção também provê um método de redução da incidência de sintomas clínicos associados com Vírus da Influenza Equina compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima a um animal, onde a redução em sinais clínicos, comparado com animais não recebendo a composição imunogênica, é pelo menos uma redução de 10% em sinais clínicos.
[046] A presente invenção provê um método de redução da incidência de infecção em um rebanho compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima a um animal.
[047] A presente invenção provê um método de redução da incidência de infecção em um rebanho compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima a um animal, onde a redução de incidência de infecção, comparado com rebanhos não recebendo a composição imunogênica, é de a partir de cerca de 10% - 50% de redução.
[048] A presente invenção provê um método de redução da incidência e severidade de sintomas clínicos de EHV em um rebanho, onde os sintomas clínicos são selecionados do grupo consistindo em doença respiratória, aborto, complicações reprodutivas, doença neurológica, doença do sistema nervoso central e combinações dos mesmos.
[049] A presente invenção provê um método para redução da incidência de ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados com Vírus do Herpes Equino compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima, que inclui um antígeno do Vírus do Herpes Equino, a um animal.
[050] A presente invenção provê um método para redução da severidade de ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados com Influenza Equina em um rebanho compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima, que inclui um antígeno da Influenza Equina, a um animal.
[051] A presente invenção provê um método para redução da incidência de ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados com Vírus do Nilo Ocidental em um rebanho compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima, que inclui um antígeno dVírus do Nilo Ocidental, a um animal.
[052] A presente invenção provê um método para redução da incidência de ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados com Encefalomielite Equina do Leste em um rebanho compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima, que inclui um antígeno da Encefalomielite Equina do Leste, a um animal.
[053] A presente invenção provê ainda um método para redução da incidência de ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados com Encefalomielite Equina do Oeste em um rebanho compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima, que inclui um antígeno da Encefalomielite Equina do Oeste, a um animal.
[054] A presente invenção provê um método para redução da incidência de ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados com Encefalomielite Equina Venezuelana em um rebanho compreendendo a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas descritas acima, que inclui um antígeno da Encefalomielite Equina Venezuelana, a um animal.
[055] A presente invenção também provê um método de fabricação de qualquer uma das composições imunogênicas da presente invenção conforme descrito acima e aqui compreendendo as etapas de combinação de um antígeno dVírus do Nilo Ocidental com um excipiente ou veículo farmacêutico adequado. Em formas preferidas, este método compreende ainda a etapa de adição de um ou mais antígenos de equino. Um grupo preferido de antígenos de equino é selecionado do grupo consistindo em Encefalomielite Equina do Oeste, Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina Venezuelana, Toxoide do tétano, EHV, EIV e combinações dos mesmos. Em algumas formas preferidas, os métodos descritos aqui podem compreender ainda uma etapa de filtragem, onde o produto final está em uma forma purificada.
[056] "Adjuvantes", conforme aqui usado, podem incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas, por exemplo, Quil A, QS- 21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), óleo não metabolizável, óleos mineral e/ou de planta/vegetal e/ou animal, polímeros, carbômero, tensoativos, compostos orgânicos naturais, extratos de planta, carboidratos, colesterol, lipídeos, emulsão água-em-óleo, emulsão óleo- em-água, emulsão água-em-óleo-em-água. A emulsão pode ser baseada em particular em óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopeia Europeia); óleo de isoprenoide tal como esqualano ou esqualeno; óleo resultante da oligomerização de alcenos, em particular de isobuteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquila linear, mais particularmente óleos de planta, oleato de etila, di(caprilato/caprato) de propileno glicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerila ou dioleato de propileno glicol; ésteres de ácidos graxos ou álcoois ramificados, em particular ésteres do ácido isoesteárico. O óleo é usado em combinação com emulsificantes para formar a emulsão. Os emulsificantes são preferivelmente tensoativos não iônicos, em particular ésteres de sorbitano, de manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propileno glicol e de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico ou hidroxiesteárico, que são opcionalmente etoxilados, e blocos de copolímero de polioxipropileno- polioxietileno, em particular os produtos Pluronic, especialmente L121. Vide Hunter e outros, The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D.E.S.). John Wiley and Sons, N.Y., p. 51-94 (1995) e Todd e outros, Vaccine 15:564-570 (1997). Em uma modalidade preferida, o adjuvante está em uma concentração de cerca de 0,01 a 50%, preferivelmente em uma concentração de cerca de 2% a 30%, mais preferivelmente em uma concentração de cerca de 5% a 25%, mais preferivelmente ainda em uma concentração de cerca de 7% a 22% e mais preferivelmente em uma concentração de 10% a 20% em volume do produto final. Dos adjuvantes possíveis usados em combinação com a presente invenção, é preferido não usar um óleo metabolizável. Em uma modalidade preferida, o adjuvante é pelo menos um óleo não metabolizável, preferivelmente óleo mineral. Em uma modalidade preferida alternativa, a composição de vacina não contém essencialmente quaisquer adjuvantes à base de óleo. Em uma modalidade mais preferida, a composição de vacina contém ambos um óleo não metabolizável, preferivelmente óleo mineral, e carbômero como adjuvantes.
[057] Ainda, as composições imunogênica e de vacina da presente invenção podem incluir um ou mais veículos veterinários aceitáveis. Conforme aqui usado, um "veículo veterinário aceitável"inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes de estabilização, diluentes, conservantes, excipientes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, agentes de retardo de absorção e similar. Em algumas modalidades preferidas e especialmente aquelas que incluem composições imunogênicas liofilizadas, agentes de estabilização para uso na presente invenção incluem estabilizadores para liofilização ou secagem por congelamento.
[058] "Diluentes" podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e similar. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, dentre outros. Estabilizadores incluem albumina e sais alcalinos de ácido etilenodiaminotetra-acético, dentre outros.
[059] Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica da presente invenção é preparada compreendendo um conservante e um estabilizador; e, mais preferivelmente, a composição imunogênica da presente invenção é preparada compreendendo gentamicina, EDTA, Glicerol e combinações dos mesmos.
[060] Uma "composição imunogênica ou imunológica"refere-se a uma composição de matéria que compreende pelo menos um antígeno que elicita uma resposta imunológica no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo à composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica"inclui, mas não está limitada a, um ou mais dos efeitos que seguem: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas e/ou células T gama-delta, direcionadas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro vai mostrar uma resposta ou terapêutica ou protetora de maneira que resistência à nova infecção será aumentada e/ou a severidade clínica da doença reduzida. Tal proteção será demonstrada através de uma redução ou falta de sinais clínicos normalmente mostrados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou uma duração ou título bacteriano menor nos tecidos ou fluidos ou excreções do corpo do hospedeiro infectado.
[061] O termo "com necessidade de tal administração"ou "com necessidade de tal tratamento de administração"conforme aqui usado significa que a administração/tratamento é associado com o reforço ou melhora na saúde ou qualquer outro efeito medicinal positivo sobre a saúde dos animais que recebem a composição imunogênica de acordo com a presente invenção.
[062] O termo "Vírus do Nilo Ocidental" significa, mas não está limitado aos componentes do virion de WNV que são imunogênicos quando presentes em um animal e mais particularmente componentes de proteína, tais como proteínas envelope e não estruturais, do WNV que provocam respostas imunes humorais ou celulares quando presentes em um animal. Tais antígenos podem incluir DNA, subunidades de proteína, vírus vivo modificado e vírus morto ou inativado. Em formas preferidas da invenção, o antígeno ou antígenos de WNV compreendem cepas de WNV inativadas ou mortas, e ainda mais preferivelmente, dominantes na América do Norte.
[063] O termo "Vírus do Nilo Ocidental da América do Norte (cepas)" refere-se, mas não é limitado a, qualquer cepa ou isolato dVírus do Nilo Ocidental que foi encontrado no continente da América do Norte. Preferivelmente, uma cepa dVírus do Nilo Ocidental da América do Norte tem uma identidade de sequência para a cepa NY99 (No. de Acesso GenBank AF196835 ou sequência de referência NCBI NC_00942.1 (SEQ ID NO. 23) de pelo menos 97%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 98%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 98,5%, mais preferivelmente, pelo menos 99%, mais preferivelmente ainda, pelo menos 99,2% e, mais preferivelmente, de pelo menos 99,4%.
[064] "Identidade de Sequência"como é conhecido na técnica refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, a saber uma sequência de referência e uma dada sequência a ser comparada com a sequência de referência. Identidade de sequência é determinada comparando a dada sequência com a sequência de referência após as sequências terem sido otimamente alinhadas para produzir o grau mais alto de similaridade de sequência, conforme determinado através da combinação entre anéis de tais sequências. Quando sob tal alinhamento, identidade de sequência é averiguada em uma base posição-por-posição, por exemplo, as sequências são "idênticas"em uma posição particular se nesta posição os resíduos de nucleotídeo ou aminoácido forem idênticos. O número total de tais identidades de posição é então dividido pelo número total de nucleotídeos ou resíduos na sequência de referência para dar a identidade de sequência %. Identidade de sequência pode ser prontamente calculada através de métodos conhecidos incluindo, mas não limitado a, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nova York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nova Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov., M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova York (1991); e Carillo, H. e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cujos ensinamentos são aqui incorporados a título de referência. Métodos preferidos para determinar a identidade de sequência são planejados para resultar no maior número de combinação entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade de sequência são codificados em programas de computador publicamente disponíveis que determinam a identidade de sequência entre as sequências dadas. Exemplos de tais programas incluem, mas não estão limitados a, pacote de programa GCG (Devereux, J., e outros, Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S.F., e outros, J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). O programa BLASTX está publicamente disponível do NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. e outros, NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S.F. e outros, J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), cujos ensinamentos são aqui incorporados a título de referência). Esses programas alinham sequências otimamente usando pesos de lacuna- padrão a fim de produzir o nível mais alto de identidade de sequência entre as sequências dadas e as de referência. Como uma ilustração, por um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos, por exemplo, 85%, preferivelmente 90%, mais preferivelmente ainda 95% de "identidade de sequência"com uma sequência de nucleotídeo de referência, entende que a sequência de nucleotídeo do dado polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência exceto que a dada sequência de polinucleotídeo pode incluir até 15, preferivelmente até 10, mais preferivelmente ainda até 5, mutações por ponto para cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de referência. Em outras palavras, em um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 85%, preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95%, de identidade de sequência com relação à sequência de nucleotídeo de referência, até 15%, preferivelmente 10%, ainda mais preferivelmente 5%, dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos com outro nucleotídeo, ou vários nucleotídeos até 15%, preferivelmente 10%, ainda mais preferivelmente 5%, dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Essas mutações da sequência de referência podem acontecer nas posições terminais 5' ou 3' da sequência de nucleotídeo de referência ou em qualquer ponto entre essas posições terminais, interespaçadas ou individualmente entre nucleotídeos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Analogamente, por um polipeptídeo tendo uma dada sequência de aminoácido tendo pelo menos, por exemplo, 85%, preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95%, de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de referência, é pretendido que a dada sequência de aminoácido do polipeptídeo seja idêntica à sequência de referência exceto que a sequência de polipeptídeo dada pode incluir até 15, preferivelmente até 10, mais preferivelmente ainda até 5, alterações de aminoácido por cada 100 aminoácidos na sequência de aminoácido de referência. Em outras palavras, para obter uma dada sequência de polipeptídeo tendo pelo menos 85%, preferivelmente 90%, mais preferivelmente ainda 95%, de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de referência, até 15%, preferivelmente até 10%, ainda mais preferivelmente até 5%, dos resíduos de aminoácido na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos com outro aminoácido, ou vários aminoácidos até 15%, preferivelmente até 10%, mais preferivelmente até 5%, do número total de resíduos de aminoácido na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino ou carbóxi terminais da sequência de aminoácido de referência ou em qualquer outro ponto entre essas posições terminais, interespaçadas ou individualmente entre resíduos na sequência de referência ou no um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Preferivelmente, as posições de resíduo que não são idênticas diferem por substituições de aminoácido conservativas. No entanto, substituições conservativas não estão incluídas como uma combinação quando da determinação da identidade de sequência.
[065] O termo cepas e isolatos do "Vírus do Nilo Ocidental Dominante na América do Norte" refere-se àquelas cepas ou isolatos definidos tal como em Phylogenetic Analysis of North American West Nile Virus Isolates, 2001-2004; Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype, C. Todd Davis e outros, Virology, 342, p. 252-265 (2005), cujos ensinamentos e conteúdos são aqui incorporados a título de referência. Conforme aqui mencionado, as cepas ou isolatos de WNV Dominante da América do Norte têm pelo menos 1 mudança de nucleotídeo resultando em uma mudança de aminoácido dos isolatos de WN99. A cepa NY99 (No. de Acesso GenBank AF196835), um exemplo da qual é provido na SEQ ID NO: 23, serve como uma cepa de referência para determinação de se uma cepa ou isolato é Dominante na América do Norte. Em uma modalidade preferida, a mudança de nucleotídeo resulta em uma mudança de aminoácido em uma proteína envelope da cepa ou isolato e, mais preferivelmente, a mudança de nucleotídeo resulta em uma mudança de aminoácido de valina para alanina na posição 159 na proteína envelope crítica ou "E159". Preferivelmente, esta mudança de aminoácido está associada com uma habilidade maior em replicar no hospedeiro intermediário, a saber, o mosquito. Ainda, essas cepas ou isolatos podem ter uma ou mais mudanças de aminoácido silenciosas. Preferivelmente, as cepas Dominantes na América do Norte também incluem uma (e preferivelmente ambas) de uma mutação U para C e uma mutação C para U nas posições 1442 e 2466 (em comparação com a cepa da América do Norte, por exemplo, NY 99 e SEQ ID NO: 23), respectivamente. Mais preferivelmente ainda, as cepas ou isolatos Dominantes na América do Norte incluem ainda uma mutação na sequência de nucleotídeo codificando a proteína E e a mutação C em U na posição 9352 na sequência codificando a proteína NS5 (novamente em comparação com a cepa da América do Norte, por exemplo, NY 99 e SEQ ID NO: 23). Essas mutações preferidas são mostradas em detalhes para regiões específicas no Exemplo 10 e Figuras 10-17. Cepas de WNV Dominantes na América do Norte são listadas no presente pedido. Ainda, para propósitos da presente invenção, Dominante na América do Norte e WNO02 são usados intercomutavelmente.
[066] Para propósitos da presente invenção, Horse Origin 2005 cepa Equino da América do Norte E159, E159 (Horse Origin), NAEE159, Isolato 405330 do United States Department of Agriculture (USDA 2005) Horse Origin e cepa E159 são usados intercomutavelmente. Para propósitos da presente invenção, a cepa Donkey Origin 2004, Isolato 292206 do United States Department of Agriculture (USDA 2004) Donkey Origin, E159 (Donkey Origin) e North American Donkey E159 (NADE159) são usados intercomutavelmente. E159 indica que a mudança de aminoácido na proteína envelope de valina para alanina acontece na posição 159, conforme acima descrito.
[067] Cepas ou isolatos dVírus do Nilo Ocidental, para propósitos da presente invenção, não são limitadas a cepas dVírus do Nilo Ocidental de cavalo e equino, mas compreendem, embora não limitado às, cepas dVírus do Nilo Ocidental de origem de ave, origem de burro, origem de porco, origem humana, origem de mamífero e origem de equino.
[068] Para propósitos da presente invenção, os termos "cepa" e "isolato"têm o mesmo significado e são usados intercomutavelmente.
[069] Conforme aqui usado, "um veículo farmaceuticamente" ou "veterinário aceitável"ou "veículo farmacêutico"inclui qualquer um e todos os solventes, meios de crescimento, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes de estabilização, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes de retardo de absorção e similares.
[070] Uma "composição imunogênica ou imunológica"refere-se a uma composição de matéria que compreende pelo menos um antígeno que elicita uma resposta imunológica no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo para a composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica"inclui, mas não está limitada a, um ou mais dos efeitos que seguem: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas e/ou células T gama-delta e/ou anticorpos de neutralização de vírus direcionados especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro vai mostrar uma resposta imunológica terapêutica ou protetora de maneira que resistência à nova infecção será aumentada e/ou a severidade clínica da doença reduzida. Tal proteção será demonstrada ou por uma redução ou falta de sinais clínicos normalmente mostrados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou uma duração menor da doença clínica ou título de anticorpo viral maior nos tecidos ou fluidos ou excreções do corpo do hospedeiro infectado, ou viremia menor no sangue ou menos lesões espessas ou histopatológicas devido à infecção.
[071] Ainda, as composições imunogênica e de vacina da presente invenção podem incluir um ou mais veículos veterinários aceitáveis. Conforme aqui usado, "um veículo veterinário aceitável"inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, meios de cultura celular e constituintes de cultura celular, revestimentos, adjuvantes, agentes de estabilização, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes de retardo de adsorção e similar. "Diluentes" podem incluir água, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, etanol, glicerol e similar. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, dentre outros. Estabilizadores incluem albumina e sais alcalinos de ácido etilenodiaminotetra-acético, dentre outros.
[072] "Sinais clínicos" dVírus do Nilo Ocidental, para propósitos da presente invenção, incluem, mas não estão limitados a, sintomas ou lesões associados com encefalite, viremia, anorexia, depressão, febre, fraqueza, marcha anormal, paralisia dos membros posteriores, visão prejudicada, ataxia, perambulação, convulsões, incapacidade de engolir, coma, fraqueza posterior, paralisia, coordenação pobre, depressão e comportamento relacionado, tremores, convulsões, patinhamento dos membros, problemas neurológicos, morte e combinações dos mesmos. Os sinais clínicos exibidos por um animal infectado variam dependendo da severidade da infecção.
[073] "Sinais clínicos"do vírus do Herpes Equino, para propósitos da presente invenção, incluem, mas não estão limitados a, aborto, deficiências neurológicas, doença respiratória, deficiências e falência do sistema reprodutor e sintomas relacionados ao sistema nervoso central. Ainda, sintomas clínicos de EHV 1 incluem, mas não estão limitados ao, fenômeno de crias infectadas com EHV1, exibindo complicações respiratórias, passando o vírus para os membros mais velhos do rebanho que então exibem deficiências reprodutoras, incluindo aborto, e deficiências neurológicas, normalmente exibidas no sistema nervoso central.
[074] "Sinais Clínicos"de Encefalomielite Equina do Leste, Encefalomielite Equina do Oeste e Encefalomielite Equina Venezuelana para propósitos da presente invenção são aqueles sintomas normalmente conhecidos estar associados com encefalomielite, incluindo, mas não limitado a, febre, sinais nervosos tal como sensibilidade a som, períodos de excitamento, e falta de descanso, lesões cerebrais, entorpecimento, orelhas caídas, andar em círculo, marcha anormal, paralisia, perda de apetite, depressão, pressiona- mento da cabeça, falta de coordenação, incapacidade a longo prazo, dano cerebral, morte e combinações dos mesmos. "Segurança"conforme aqui usado refere-se à ausência de consequências adversas no animal vacinado seguindo vacinação, incluindo, mas não limitado a, reversão potencial do vírus da vacina para virulência e efeitos colaterais clinicamente significantes, tal como doença sistêmica persistente ou inflamação inaceitável no sítio de administração da vacina.
[075] "Redução da incidência e/ou severidade de sinais clínicos" ou "redução na incidência e/ou severidade de sintomas clínicos", conforme aqui referido, significa redução do número de animais infectados em um grupo, redução ou eliminação do número de animais exibindo sinais clínicos de infecção ou redução da severidade de quaisquer sinais clínicos que estejam presentes nos animais, em comparação com infecção do tipo selvagem. Por exemplo, nos presentes experimentos, tais sinais clínicos incluem viremia, febre, resposta de anticorpo e histopatologia. Preferivelmente, esses são reduzidos em animais que recebem a composição da presente invenção em pelo menos 10% em comparação com animais que não recebem a vacinação que podem ficar infectados. Mais preferivelmente, sinais clínicos são reduzidos em animais que recebem a composição da presente invenção em pelo menos 20%, mais preferivelmente em pelo menos 30%, mais preferivelmente ainda em pelo menos 40% e mais preferivelmente ainda em pelo menos 50%.
[076] "Duração de imunidade", conforme aqui usado, refere-se ao número mínimo de dias durante os quais um animal produz uma resposta imunogênica de maneira que o animal será relativamente imune de contrair um vírus e/ou benefício da redução de incidência e/ou severidade de sinais clínicos, conforme aqui descrito.
[077] Os termos "cepa" e "isolato", quando usados aqui, pretendem ser usados intercomutavelmente.
[078] Os termos "vacina" e "composição imunogênica", quando usados aqui, pretendem ser usados intercomutavelmente.
[079] Qualquer cepa(s) ou isolato(s) dVírus do Nilo Ocidental pode ser usado de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferida, o isolato é selecionado de um ou mais dos que seguem: New York (Northeastern North American) Isolate (WN-NY 99), Horse Origin, 1999, New York (Northeastern North American) Isolate (WN-NY 99), Crow Origin, 1999, United States Department of Agricultures Isolate 292206 (USDA 2004), Donkey Origin, do United States Department of Agriculture Isolate 405330(USDA 2005), Horse Origin, North American Isolate (WN-Texas-2002/2003), Southeast Texas Coastal Isolate 2002, Mexico (Tabasco) Isolate 2003, e combinações dos mesmos, e em uma modalidade mais preferida o isolato é selecionado de um ou mais do que segue: United States Department of Agricultures Isolate 292206 (USDA 2004), Donkey Origin, United States Department of Agriculture Isolate 405330 (USDA 2005), Horse Origin, North American Isolate (WN-Texas-2002/2003), Southeast Texas Coastal Isolate 2002, Mexico Isolate 2003 (Tabasco) e combinações dos mesmos. Em uma modalidade mais preferida, o isolato é United States Department of Agriculture Isolate 405330 (USDA 2005), Horse Origin sozinho ou em combinação com um ou mais isolatos conforme acima listado. Em uma modalidade adicionalmente preferida, aqueles isolatos que são parte dos isolatos dVírus do Nilo Ocidental da América do Norte estão incluídos. Em ainda outra modalidade preferida, os isolatos dVírus do Nilo Ocidental da América do Norte estão incluídos. Em adição àqueles listados acima, isolatos específicos incluem, mas não estão limitados a, WN02 e isolatos que têm pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 2 e ainda mais preferivelmente 3 mudanças de nucleotídeo resultando em pelo menos uma mudança de aminoácido dos isolatos de WNNY99 e mais preferidas são cepas com a mudança de aminoácido de valina para alanina na posição 159 da proteína envelope. As cepas Dominantes na América do Norte mais preferidas incluem, mas não estão limitadas a: NY2002Nassau, NY2002Clinton, NY2002Queens, GA20021, GA20022, TX20021, TX20022, IN2002, NY2003Albany, NY2003Suffolk, NY2003Chatauqua, CO20031, CO20032, TX2003, TX2003Harris4, TX2003Harris6, TX2003Harris7, TX2003Harris10, AZ2004 e TX2004Harris4, e combinações das mesmas. As cepas dVírus do Nilo Ocidental úteis na composição de vacina ou imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolato. Em uma modalidade preferida, a cepa dVírus do Nilo Ocidental Dominante na América do Norte usada é ou E-159 (Horse Origin) ou E-159 (Donkey Origin). Uma cepa representativa de tal cepa de WNV Dominante na América do Norte inclui a cepa Horse Origin 2005 depositada com a ATCC (No. de Acesso ATCC PTA-9409), localizada na 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, em 14 de agosto de 2008, sob as condições do Tratado de Budapeste. As cepas de Influenza Equina úteis na composição de vacina ou imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolato. Cepas representativas incluem Equi-2/Ohio/03, depositada como No. de Acesso ATCC PTA-9522, Equi-2/Kentucky/95, depositada como No. de Acesso ATCC PTA-9523 e Equi-2/New Market/2/93, depositada como No. de Acesso ATCC PTA- 9524. As cepas representativas de Nos. de Acesso ATCC PTA-9522, PTA-9523 e PTA-9524 foram cada uma depositadas com ATCC na 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 e 23 de setembro de 2008, sob a condições do Tratado de Budapeste.
[080] Cepas do Vírus do Herpes Equino ("EHV") úteis na composição de vacina ou imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolato. Cepas representativas incluem EHV Subtipo 1, depositada como No. de Acesso ATCC PTA-9525 e EHV Subtipo 4, depositada como No. de Acesso ATCC PTA-9526. Cepas representativas Nos. de Acesso ATCC PTA-9525 e PTA-9526 foram cada uma depositadas com ATCC em 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 em 23 de setembro de 2008, sob as condições do Tratado de Budapeste.
[081] Cepas de Encefalomielite Equina do Oeste úteis na composição de vacina ou imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolato. Uma cepa representativa inclui a Cepa Fleming, depositada com ATCC (No. de Acesso ATCC PTA-9140), localizada na 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 em 14 de agosto de 2008, sob as condições do Tratado de Budapeste.
[082] As cepas de Encefalomielite Equina Venezuelana úteis na composição de vacina ou imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolato. Uma cepa representativa inclui a cepa TC-83, depositada com a ATCC (No. de Acesso ATCC PTA-9411), localizada em 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, em 14 de agosto de 2008, sob as condições do Tratado de Budapeste.
[083] Cepas de Encefalomielite Equina do Leste úteis na composição de vacina ou imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolato. Uma cepa representativa inclui a cepa NJO, depositada com a ATCC (No. de Acesso ATCC PTA-9411), localizada em 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, em 14 de agosto de 2008, sob as condições do Tratado de Budapeste.
[084] Cepas do Toxoide do tétano úteis na composição de vacina ou imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolato. Uma cepa representativa é aquela de uma semente máster de Clostridium tetani do The Massachusetts Department of Public Health Institute of Laboratories in Boston, Massachusetts.
[085] A vacina da presente invenção é segura para administração em espécies suscetíveis a WNV, particularmente equinos, em qualquer idade e em qualquer estágio de reprodução, incluindo fêmeas grávidas. Em uma modalidade preferida, a presente invenção é segura para administração a crias de 12 meses de vida ou mais, mais preferivelmente, ela é segura para administração a crias de 10 meses de vida ou mais velhas, mais preferivelmente, ela é segura para administração a crias de 8 meses ou mais velhas, mais preferivelmente, ela é segura para administração a crias de 6 meses de vida ou mais, mais preferivelmente, ela é segura para administração a crias de 4 meses de vida ou mais velhas, mais preferivelmente, ela é segura para administração a crias de 2 meses ou mais velhas, mais preferivelmente, ela é segura para administração a crias de 1 mês ou mais velhas, mais preferivelmente ainda, ela é segura para administração a crias entre 1 dia e 1 mês de vida e, mais preferivelmente, ela é segura para administração a crias de 1 dia de vida ou mais velhas.
[086] A composição da presente invenção pode ser administrada de qualquer maneira convencional. Exemplos de métodos de administração incluem qualquer um que forneça acesso pelas células do sistema imune à composição imunogênica incluindo oral, transdermal/intradermal, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraocular, intraperitoneal, intrarretal, intravaginal, intranasal, intragás- trica, intratraqueal, intrapulmonar ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade preferida, a vacina é administrada parenteralmente, preferivelmente intranasalmente, subcutaneamente ou intramuscularmente e na modalidade mais preferida a vacina é administrada intramuscularmente.
Breve Descrição dos Desenhos
[087] A Figura 1 é uma representação gráfica de Classificações Clínicas Totais Médias; a figura 2 é uma representação gráfica da Excreção de Proporção; a figura 3 é uma representação gráfica da Classificação de Descarga Nasal; a figura 4 é uma representação gráfica de Excreção de Vírus de Proporção; a figura 5 é uma representação gráfica de Classificação de Conjuntivite; a figura 6 é uma representação gráfica de Títulos de Neutralização de soro; a figura 7 é uma representação gráfica de Proporção Positiva para EHV-1; a figura 8 é uma representação gráfica de Contagem de Célula Sanguínea Branca Média; a figura 9 é uma representação gráfica de Positivo para Proporção (piréxico); a figura 10 é um alinhamento de nucleotídeo da região HE de isolatos de WNV; a figura 11 é um alinhamento de nucleotídeo da região DE de isolatos de WNV; a figura 12 é um alinhamento de nucleotídeo da região D NS5 de isolatos de WNV; a figura 13 é um alinhamento de nucleotídeo da região H NS5 de isolatos de WNV; a figura 14 é um alinhamento de nucleotídeo da região H WN05 E NS5 de isolatos de WNV; a figura 15 é um alinhamento de nucleotídeo da região H WN05 de isolatos de WNV; a figura 16 é um alinhamento de nucleotídeo da região NS5 de isolatos de WNV; e a figura 17 é um alinhamento de nucleotídeo da região E de isolatos de WNV.
Descrição Detalhada Exemplos
[088] Os exemplos que seguem são mostrados abaixo para ilustrar modalidades específicas da presente invenção. Esses exemplos são apenas ilustrativos e são compreendidos não limitar o escopo dos princípios que baseiam a presente invenção.
Exemplo 1
[089] Este exemplo ilustra uma composição de vacina preferida de acordo com a presente invenção.
Materiais e Métodos
[090] Para preparação de estoque de célula de trabalho, o Master Cell Stock (MCS), consistindo em Vero Cell Line conhecida propagar Vírus do Nilo Ocidental, que foi testada quanto à pureza, identidade e cariologia, foi descongelado e usado para inocular uma faixa de recipientes de T25 até T150 cm2 ou garrafas rotatórias de 1050 cm2 ou biorreatores ou outros recipientes estéreis adequados. As células descongeladas foram suspensas em meio de crescimento em uma taxa de 0,0015 mL a 5,0 L por recipiente, dependendo do volume da coluna. As células foram então incubadas a 36-38° C por até sete dias. As culturas plantadas do estoque congelado foram novamente alimentadas com meio, se necessário, dentro de trinta e seis horas após plantio para remover DMSO residual. As culturas foram novamente alimentadas com meio, se necessário, durante o período de crescimento para remover restos excessivos, ou estimular o crescimento de culturas que não atingiram confluência, ou manter a viabilidade de culturas confluentes.
[091] As células foram passadas 1-20 vezes através de decantação do meio usado e então através da adição de 5-500 mL de Solução de Tripsina EDTA a 0,25%- a cada recipiente, dependendo do volume do recipiente. Os recipientes foram agitados suavemente até que as células soltaram da superfície. As células foram então removidas dos recipientes através do enxágue com meio de crescimento e agrupadas. Antes da inoculação, o meio de crescimento de célula foi decantado das Vero Working Cells que são pelo menos 55% confluentes. O meio de crescimento de vírus descrito foi adicionado a cada recipiente a 0,15 a 0,4 mL por cm2 de área de superfície. Uma Multiplicidade de Infecção (MOI) de 0,000001-0,0002 foi usada para infecção conforme determinado através da realização de uma contagem de célula de pelo menos dois recipientes representativos. Culturas de garrafa rotatória infectadas foram incubadas a 36-38° C por dois a cinco dias a 0,1-0,8 rpm.
[092] Durante o período de crescimento, as culturas foram checadas quanto a CPE típica microscopicamente e quanto à contaminação bruta macroscopicamente. Culturas inadequadas foram descartadas após esterilização. As culturas podem ser atenuadas usando técnicas-padrão ou podem ser usadas sem atenuação.
[093] Os micro-organismos foram então coletados para propósitos de produção. Fluidos de vírus foram coletados quando CPE atingiu 85% ou mais. Garrafas rotatórias foram serpenteadas para remover células soltas e fluidos e então agrupadas em garrafas de vidro, plástico ou PETG de 2-10 L estéreis, recipientes de polipropileno estéreis de 20 L ou recipientes de tanques de aço inoxidável de 2-500 L apropriados para clarificação.
[094] Em seguida, o produto foi preparado. Os fluidos clarificados foram inativados com Solução de Formaldeído, USP, 0,2% em volume, ou outro agente de inativação eficaz, transferido para um recipiente secundário e mantido a 20-25° C (temperatura ambiente) com agitação por quarenta e oito horas. Uma amostra de pelo menos 12 mL dos fluidos inativados foi obtida para teste de confirmação de inativação (descrito abaixo) antes da concentração. Após a inativação estar completa, material de lote inativado foi mantido a 2-7° C por até sessenta dias antes da concentração. Vários adjuvantes adequados podem ser adicionados à formulação de vacina, mais preferivelmente um óleo não metabolizável, preferivelmente óleo mineral, e/ou um carbômero. Etapas de processamento típicas podem ser empregadas tais como mistura, microfluidização e emulsificação do adjuvante e/ou dos antígenos de vírus coletados com outros ingredientes.
[095] O produto foi então padronizado. Volumes suficientes de lotes clarificados, inativados, concentrados (opcional) foram combinados para prover um título calculado de pelo menos 104,0 TCID50 por dose de cada cepa no produto final. Lotes múltiplos podem ser misturados para atingir as necessidades de título por dose.
[096] O produto foi então montado para a formulação final. Com base no volume serial final desejado, as quantidades de componentes antigênicos, adjuvante, estabilizador e diluente foram calculadas como segue: a. Vírus do Nilo Ocidental, Horse Origin 2005 (ATCC No.PTA-9409): mínimo 104,0 TCID50/dose. b. Adjuvante: a concentração de adjuvante total, preferivelmente um óleo não metabolizável, e mais preferivelmente um óleo mineral e/ou um carbômero, em uma série é pelo menos 10% em v/v e é adicionada no momento da formação da batelada/montagem da série. c. Diluente: um volume apropriado de solução salina tamponada com fosfato (PBS) é adicionado para trazer o volume final para o volume desejado. d. Formalina Adicional: um volume apropriado de Formalina a 37% é adicionado para manter um nível apropriado. e. Sulfato de Gentamicina.
[097] As quantidades necessárias de adjuvante e PBS foram combinadas em um recipiente estéril. O pH da mistura foi ajustado para aproximadamente 4,9-5,1 com NaOH a 10N ou HCl a 5N se necessário. Vírus do Nilo Ocidental clarificado, morto, concentrado, bem como Genta- micina e Formalina foram adicionados e o pH ajustado para 6,9 a 7,1. Isto foi misturado a 2-6° C por pelo menos 8 horas, não exceder 48 horas.
[098] A vacina foi dada através de injeção hipodérmica típica, com vacinações de reforço se desejado. Mais preferivelmente, a dose inicial e as doses de reforço foram de volume de 1 mL administradas intramuscularmente em intervalos de 21 dias. O regime de vacinação de dose inicial e de dose de reforço foi dado no volume de dose de 1 mL mais preferido a cavalos, outros equídeos, e outras espécies suscetíveis a WNV para reduzir a incidência de e/ou severidade de sinais clínicos de infecção por WNV, e preferivelmente para prevenir infecção por WNV bem como prevenir doença devido à infecção pelVírus do Nilo Ocidental por um período prolongado seguindo vacinação.
Resultados e Discussão
[099] A vacina foi dada através de várias vias parenterais, volumes de dose e regimes de dose apropriados a animais de estado imunológico variável para WNV, incluindo puros e aqueles com anticorpo passivo, e proveram duração longa de imunidade até e excedendo pelo menos 2 anos seguindo a vacinação. A vacina era segura para administração em espécies suscetíveis a WNV, particularmente equídeos, em qualquer idade e em qualquer estágio de reprodução, incluindo fêmeas grávidas.
Exemplo 2
[0100] A investigação foi realizada para obter uma avaliação eficaz de uma vacina para proteger cavalos da provocação com Vírus do Nilo Ocidental (WNV).
Materiais e Métodos
[0101] Um total de 30 cavalos foi aleatoriamente dividido em grupos de 15 cavalos cada um. Um total de 20 cavalos recebeu 2 doses de vacina em intervalos de 21 dias e 10 cavalos foram usados para controle. Cada grupo de cavalos, Bloco 1 e Bloco 2, continha 10 cavalos vacinados e 5 cavalos de controle. A vacina era uma combinação incluindo antígeno de WNV, especificamente uma Cepa Dominante da América do Norte de WNV inativado ou morto, Horse Origin 2005 (Depósito ATCC No. PTA-9409) bem como componentes antigênicos de Encefalomielite Equina Venezuelana, cepa TC-83 (Depósito ATCC No. PTA-9411), Encefalomielite Equina do Leste, cepa NJO (Depósito ATCC No. PTA-9412), Encefalomielite Equina do Oeste, Cepa Fleming (Depósito ATCC No. PTA-9410) e toxoide aproximadamente como segue: do tétano formulada Encefalomielite Equina do Leste TCID50/mL 106,7-109,2 Encefalomielite Equina do Oeste PFU/mL 106,7-109,2 Encefalomielite Equina Venezuelana Vírus do Nilo Ocidental 109,TCID50/mL 106,7-109,2TCID50/mL 107,0- Toxoide do Tétano 5-10 CPU/mL Adjuvante Diluente - contendo DMEM Gentamicina (30 μg/mL de volume de diluente) Formaldeído (0,1% em volume de diluente) 100-200 μl/mL q.s.
[0102] Todos os grupos foram provocados com inoculação intratecal de 1 ml de PBS contendo aproximadamente 105 pfu de uma cepa heteróloga de WNV (NY99, 4132, isolado de corvo). A provocação foi conduzida sob anestesia com cetamina-xilasina.
[0103] Os cavalos foram monitorados por um máximo de 14 dias, então humanamente eutanizados. Aqueles que desenvolveram doença severa antes de 14 dias foram eutanizados prematuramente.
[0104] Os dados que seguem foram coletados para avaliar a eficácia da vacina: • Avaliação clínica básica • Temperatura do corpo • Ensaio quanto à viremia • Histopatologia: duas seções de tronco cerebral foram avaliadas por um patologista veterinário certificado pela banca.
[0105] Soros coletados em dias apropriados foram avaliados quanto à caracterização de respostas sorológicas à provocação.
Resultados e Discussão
[0106] Viremia após provocação e títulos de neutralização de soro foram considerados as principais variáveis de resultado neste estudo. O primeiro bloco de cavalos que tinha sido vacinado era 100% protegido de viremia após provocação neste estudo. Em comparação, 4 dos 5 cavalos de controle demonstraram viremia por 4-5 dias pós-provocação e 1 de 5 cavalos de controle demonstraram viremia para 1 ponto de tempo. Ainda, títulos de neutralização de soro de cavalos vacinados foram estatisticamente significantemente maiores do que aqueles de cavalos de controle em cada ponto de tempo examinado após vacinação. Ainda, os dados estabeleceram que uma vacina de WNV que provê um título de neutralização de soro de 1:4 ou mais é eficaz na prevenção de viremia por WNV. Os títulos de soro e viremia após provocação para Bloco 1 são sumarizados na Tabela 1 abaixo: TABELA 1: Títulos de Soro e Viremia para o Bloco 1
Figure img0001
[0107] Viremia após provocação e títulos de neutralização de soro foram também considerados as variáveis de resultado principais no segundo bloco de cavalos neste estudo. No segundo bloco de cavalos apenas um cavalo do grupo vacinado mostrou quaisquer pontos de tempo de viremia durante o período de provocação. Este cavalo tinha 3 pontos de tempo separados em 3 manhãs (não aquelas mesmas noites) com leituras de valor mínimo de 5 (onde <5 é negativo). Todos os cavalos de controle no estudo (com a exceção de um cavalo que deixou o estudo prematuramente, mas mostrou histopatologia de WNV definitiva e foi excluído da avaliação) mostraram níveis altos de viremia para 1-8 pontos de tempo após provocação.
[0108] Uma vez que viremia é um pré-requisito antes do vírus poder cruzar a barreira sangue-cérebro para causar encefalite por WNV, viremia é bem justificada como o parâmetro principal para avaliação de proteção em um estudo experimental deste tipo.
[0109] Este estudo demonstrou que 2 doses da vacina de combinação experimental administradas a crias de 4 a 5 meses de vida estimularam confiavelmente e eficazmente títulos de neutralização de soro sorológicos protetores. Ainda, os dados confirmam que títulos SN pós-vacinação tão baixos quanto 1:4 resultantes da vacinação usando uma quantidade de antígeno efetivamente em batelada de Vírus do Nilo Ocidental nesta vacina de combinação experimental protegeram os cavalos vacinados de viremia, doença clínica e histopatologia após uma provocação intratecal severa com uma cepa heteróloga de Vírus do Nilo Ocidental.
[0110] Histopatologia também era diferente entre os dois grupos com a probabilidade de lesões em vacinados sendo 40% menos no Bloco 2 e 100% menos no Bloco 1 do que a probabilidade de lesões em animais controle provocados com Vírus do Nilo Ocidental virulento.
[0111] Ainda, um cavalo do Grupo de controle ficou com fraqueza nas patas traseiras no Dia 9 pós-provocação e piorou progressivamente até que ele não era mais capaz de ficar de pé. Histopatologia das pontes e medula deste cavalo mostrou encefalite severa e mielite consistente com patologia de WNV que foi mais prevalente do que sinais de doença de qualquer outro cavalo neste estudo.
[0112] Os cavalos de controle do Bloco 2 neste estudo mostraram 3 dias cada um de sinais clínicos com relação à infecção com Vírus do Nilo Ocidental. Outro cavalo controle teve um único ponto de tempo de fraqueza devido à doença. Outro cavalo controle não mostrou quaisquer pontos de tempo de sinais clínicos, embora ele tivesse múltiplos dias de viremia. Embora vários cavalos do Bloco 2 vacinados neste estudo tenham tido mudanças histopatológicas leves a moderadas em tecido como um resultado da provocação intratecal de WNV, apenas doença clínica muito leve (tremores de cabeça leves) foi notada para um vacinado em um dia do estudo comparado com múltiplos dias de doença clínica em 2 cavalos de controle e um único dia de doença clínica em um terceiro cavalo controle.
[0113] Os resultados demonstram que a vacina é eficaz e que uma reação imunogênica é induzida nos animais que foram administrados com a vacina. A eficácia da vacina foi evidenciada neste exemplo através da redução em viremia de WNV, através da estimulação de títulos de neutralização de soro altos para WNV e através da prevenção de sinais clínicos relacionados com WNV e histopatologia no cérebro e meninges. Devido ao fato desta vacina ser compreendida de constituintes únicos, incluindo um adjuvante não metabolizável de longa duração, ela foi formulada em um volume de dose baixo de 1 mL para prover um alto grau de segurança como um isolato de WNV de vírus inativado integral de passagem baixa altamente imunogênico de origem recente e prevalência epidemiológica alta e um WNV isolado dos tecidos de um cavalo infectado, ela provê segurança e eficácia mais compreensivas do que outras vacinas atualmente disponíveis. Ainda, ela tem o efeito de provisão de uma vacina segura quando administrada a animais.
Exemplo 3
[0114] Este exemplo ilustra a eficácia da composição imunogênica da presente invenção contra infecção por EHV-4.
Materiais e Métodos
[0115] Trinta e sete (37) cavalos, 4-5 meses de vida, foram usados neste estudo. Os cavalos foram aleatoriamente distribuídos para grupos ou vacinado ou controle através de um gerador de número aleatório e então vacinados. Vinte e quatro (24) cavalos serviram como vacinados e treze (13) cavalos de controle falso-vacinados. Todos os cavalos tinham títulos de neutralização de soro (SN) de EHV-4 baixos (< 1:14, média = 1:7) antes do início do estudo, indicativo de cavalos suscetíveis à infecção. A vacina usada era uma vacina experimental e tinha os componentes que seguem:
[0116] A vacina formulada final contém os ingredientes que seguem por dose de 1 mL:
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[0117] A vacina experimental foi administrada intramuscularmente em um volume de dose de 1 mL a cada um dos 24 cavalos no grupo vacinado. Treze cavalos no grupo de controle receberam uma dose de 1 mL de excipientes contendo DMEM com adjuvante (Lote 004) usados na vacina nônupla (Gentamicina e formaldeído), mas sem antígenos. Inoculação de provocação de vírus da cepa HRA005 EHV-4 virulento foi realizada 15 dias pós-vacinação de reforço.
[0118] Cada um dos cavalos vacinado e controle foi provocado com uma cepa EHV-4 de vírus (HRA005). O título do vírus de provocação diluído foi suficiente para provocar doença devido à infecção por EHV nos cavalos não vacinados.
[0119] Sedivet® (cloridrato de romifidina), um sedativo e analgésico, foi administrado intravenosamente a cada cavalo antes da provocação em uma dosagem de 50 μg/kg em peso do corpo. Cada cavalo foi então provocado com o vírus HRA005 cepa EHV-4. O vírus de provocação foi administrado intranasalmente como um aerossol produzido por um nebulizador em um Equino AeroMask (Trudell Medical International, Ontario, Canadá).
[0120] Temperaturas retais matutinas diárias foram registradas para cada um dos 37 cavalos vacinados e controle no Dia de Provocação e por 14 dias pós-provocação por meio de uma sonda termômetro eletrônica calibrada (GSA Eletronics). As temperaturas retais diárias foram registradas em graus Fahrenheit (oF).
CONTAGENS DE CÉLULA SANGUÍNEA COMPLETAS
[0121] Sangue venoso de cada um dos 37 cavalos vacinados e controle foi coletado diariamente no Dia da Provocação e durante 14 dias pós-provocação diretamente em um tubo de EDTA Dissódico Vacutainer para Contagens de Sangue Completas.
AVALIAÇÃO DE EXUDATO NASAL
[0122] Todas as observações de exudato nasal foram feitas antes da coleta de esfregaços nasofaringeais. No Dia da Provocação e durante 14 dias pós-provocação, as passagens nasais e focinho de cada um dos 37 cavalos vacinados e controle foram examinados e classificados usando a descrição de graduação e classificação listada abaixo.
[0123] Os graus de classificação de 0 a 6 foram dados com base na severidade da doença indicada por cada uma das classificações que seguem: TABELA 2: Classificações para Sintomas Clínicos
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MÉTODOS DE ISOLAMENTO VIRAL NASOFARINGEAL
[0124] Em cada dia de teste de observação cada passagem nasal de cada vacinado e controle foi amostrada profundamente por meio de esfregaços nasais. Na coleta, cada um dos dois esfregaços foi imediatamente posto em um tubo único contendo 4 mL de meio de transporte esfriado (Meio Essencial Mínimo da Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS a 2%, 2X Pen/Strep, 2X Gentamicina e 2X Anfotericina B).
[0125] Para isolamento de vírus, os tubos foram misturados, os esfregaços assepticamente removidos e o meio centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos para remover partículas. O meio foi filtrado em um filtro de seringa de 0,2 μ antes da inoculação em células de cultura de tecido. Um mL do meio de transporte clarificado foi usado para inocular uma monocamada de um dia de vida de 2 cm2 de células ED cultivadas em uma placa de cultura de tecido de 24 poços a partir da qual o meio de crescimento tinha sido assepticamente removido. Seguido inoculação, o inócuo foi deixado absorver na monocamada celular por uma hora a 37° C em uma incubadora umidificada contendo uma atmosfera de CO2 a 0,5%. Após o período de adsorção, mais 1 mL de meio realimentado (DMEM contendo soro bovino fetal 2-5% (FBS), L- glutamina 2 mM e 3X Gentamicina e 2X Anfotericina B) foi adicionado a cada poço. Seguindo adição de meio realimentado as placas foram então incubadas a 37° C em uma incubadora de CO2. Cada poço de cultura de tecido de teste e controle foi examinado microscopicamente por 7 dias quanto a sinais de efeito citopático (CPE) típico do vírus de provocação EHV-4. Os poços que eram negativos no final do período de observação de 7 dias foram subculturados em células frescas e observados por mais 7 dias.
PROCEDIMENTO DE TESTE DE NEUTRALIZAÇÃO DE SORO
[0126] Um teste de neutralização de soro de microtitulação-padrão foi empregado neste estudo. Todos os soros foram testados em placas de microtitulação de fundo plano estéreis usando 5 poços por diluição e uma série de diluição de 8 poços para cada um dos 5 poços de teste. Cada um dos 5 poços de teste continha 25 μl de diluição de soro misturados com 25 μl do vírus indicador e 150 μl de uma suspensão de célula ED recém-plantada contendo aproximadamente 5 x 104células. O vírus indicador de teste usado foi o EHV-4 HRA005 Lote 033106 SN Stock Virus. Em todos os testes os títulos de retrotitulação do vírus indicador variaram entre 68-149 TCID50/25 μl. Títulos de anticorpo de neutralização de soro são expressos como títulos Reed-Muench ID50.
[0127] Para realização do teste, diluições de duas vezes de cada soro de teste foram feitas em uma placa de microtitulação de fundo plano estéril usando cinco poços de réplica por soro de teste e uma série de diluição de 8 poços. As diluições foram feitas com um instrumento de pipetagem de canal único ou multicanal de volume ajustável usando pontas de microtitulação estéreis. O volume de soro adicionado a cada um de 5 poços da primeira fileira foi 50 μl. Todas os outros poços continham 25 μl de DMEM (nenhum FBS). Seguindo diluição serial a jusante da placa, 25 μl foram descartados da última fileira. 25 μl de uma diluição predeterminada do vírus indicador foram adicionados a cada poço de teste. As placas foram então misturadas e incubadas por uma hora a 37° C em CO2 5%. Na conclusão do período de incubação, 150 μl de uma suspensão contendo 5 x 104 ED células foram adicionados a cada poço de teste e controle de célula. As placas foram incubadas a 37° C em uma incubadora de CO2 por 5-7 dias, momento quando as placas foram microscopicamente examinadas quanto a CPE típico de EHV-4. No entanto, qualquer outro teste comercial disponível ou qualquer teste descrito na técnica anterior poderia ser usado para este propósito.
Resultados e Conclusão AVALIAÇÃO DE EXUDATO NASAL
[0128] O grupo de vacinação por interação de dia foi estatisticamente significante para as classificações de descarga nasal (P < 0,05, Tabela 1). Efeitos de grupo estatisticamente significantes foram vistos nos Dias 6-10 e Dia 14 pós-provocação (classificações nasais menores no grupo vacinado).
[0129] Quando as classificações diárias foram somadas durante o período pós-provocação, cavalos no grupo vacinado tinham classificações totais menores do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05, Tabela 1). A fração mitigada foi estimada ser 0,824 (ASE CI a 95%: 0,629, 1.000). TABELA 3: Classificação de Descarga Nasal
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[0130] O grupo de vacinação por interação de dia era estatisticamente significante para as classificações de conjuntivite. Efeitos de grupo estatisticamente significantes foram vistos nos Dias 6, 7, 9, 10, 13 e 14 pós-provocação (classificações menores no grupo vacinado nos 5 dos 6 dias, P < 0,05, figura 2).
ESTUDOS SOROLÓGICOS
[0131] Os títulos foram transformados para base logarítmica antes da análise estatística. O grupo de vacinação por interação de dia era estatisticamente significante para títulos SN. Efeitos de grupo estatisticamente significantes foram vistos no Dia 0 (pré-vacinação; títulos do grupo de controle > títulos do grupo vacinado), Dias 35 (o dia da provocação) e 7 e 14 dias pós-provocação (dias de estudo 42 e 49). Os cavalos no grupo vacinado tinham títulos maiores nos Dias 35, 42 e 49 do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05, Tabela 4). TABELA 4: Títulos
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CONTAGENS DE CÉLULA SANGUÍNEA BRANCA (WBC) E CONTAGENS DE LINFÓCITO
[0132] O grupo de vacinação por interação de dia foi estatisticamente significante para WBC e contagens de linfócito. Efeitos de grupo estatisticamente significantes foram vistos nos Dias 4-6 (WBC) e Dias 4 e 5 (linfócitos) pós-provocação. Cavalos no grupo vacinado foram protegidos de leucopenia devido à doença por EHV4 e tinham contagens de WBC e linfócito maiores do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05).
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
[0133] Neste estudo, sinais clínicos moderados e adequados de infecção por EHV-4 foram vistos após provocação. Significantemente menos sinais clínicos de exudato nasal foram vistos em cavalos vacinados nos Dias 6-10 e Dia 14 pós-provocação. As classificações de conjuntivite foram significantemente menores em cavalos vacinados nos Dias 7, 9, 10, 13 e 14 pós-provocação. Apesar da mostra adequada de sinais clínicos seguindo provocação, excreção de vírus em amostras de esfregaço nasal foi infrequente seguindo esta provocação com EHV-4. Esfregaços nasais foram examinados através de isolamento de vírus em cultura celular.
[0134] Efeitos de grupo significantes de WBCs e linfócitos foram vistos nos Dias 4-6 (WBC) e Dias 4-5 (linfócitos) com animais vacinados mostrando contagens de WBC e linfócito maiores do que cavalos de controle. Esses valores estabelecem que cavalos de controle realmente sucumbiram à imunossupressão causada pela infecção com Herpesvírus, e também demonstram que vacinação com uma cepa de proteção cruzada de EHV-1 permitiu que cavalos vacinados fossem mais refratários às propriedades imunossupressoras de infecção por Herpesvírus. Ainda, cavalos no grupo vacinado tinham títulos de neutralização de soro maiores nos Dias 35, 42 e 49 do que aqueles no grupo de controle.
[0135] Dados deste estudo confirmam que cavalos vacinados com uma vacina multicomponente contendo EHV-1 demonstram imunidade de proteção cruzada quando provocados com um organismo de provocação EHV-4 heterólogo.
Exemplo 4
[0136] Este exemplo é para ilustrar a eficácia da vacina de combinação da presente invenção bem como duração de imunidade.
Materiais e Métodos
[0137] O antígeno viral da influenza usado na vacina avaliada neste estudo foi produzido em células Madin Darby Canine Kidney (MDCK). Seguindo o crescimento, fluidos virais foram filtrados, inativados com formalina e concentrados. Os fluidos virais inativados foram testados quanto a vírus vivo residual após inativação. Quando do término do teste de vírus vivo residual satisfatório, os fluidos virais inativados foram então usados para formular uma vacina que também continha vírus da encefalomielite Venezuelana, cepa TC-83 (ATCC Acesso No. PTA-9411), do Leste, cepa NJO (ATCC Acesso No. PTA-9412) e do Oeste, cepa Fleming (ATTC Acesso No. PTA-9410), EHV-1 inativado (ATCC Acesso No. PTA-9525), vírus da influenza A/equine-2/Kentucky/95 inativado (ATCC Acesso No. PTA-9523) e influenza A/equine-2/NewMarket/2/93 (ATCC Acesso No. PTA-9524, Vírus do Nilo Ocidental inativado, Horse Origin 2005 (ATCC Acesso No. PTA-9409) e Toxoide do tétano.
[0138] A vacina foi formulada para especificações apropriadas para todos os antígenos incluídos no produto. Antígeno de Influenza A/equi- 2/Ohio/03 (Acesso ACTT No. PTA-9522) foi adicionado à vacina em um título de pré-ativação de 106,7 TCID50/mL.
[0139] A vacina formulada final contém os ingredientes que seguem por dose de 1 mL:
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[0140] Vinte e seis (26) cavalos, 4-5 meses de vida, foram usados neste estudo. Quinze cavalos serviram como vacinados e onze cavalos eram cavalos de controle falso-vacinados.
[0141] A vacina foi administrada intramuscularmente em um volume de dose de 1 mL a cada um dos 15 cavalos no grupo de vacina. Onze cavalos no grupo de controle receberam uma dose de 1 mL de excipientes contendo DMEM com adjuvante (Lote 004) usados na vacina nônupla (Gentamicina e formaldeído), mas sem antígenos. Inoculação de provocação de vírus da cepa A/equi-2/Ohio/03 de influenza virulento foi realizada 4 meses pós-vacinação de reforço.
[0142] Amostras de soro para avaliação sorológica foram coletadas de cavalos vacinados e controle antes do início da vacinação, em 21 dias após a primeira dose de vacinação (dia da vacinação de reforço), no dia da provocação e nos dias 7 e 14 pós-provocação. Temperatura do corpo, amostras de sangue integral e esfregaços nasais foram obtidos de cada cavalo no dia da provocação e diariamente durante o período de observação pós-provocação de 10 dias para um total de 11 dias de observação. Dados clínicos foram também registrados para cada cavalo durante o período de observação de 11 dias.
Provocação
[0143] A semente do vírus de provocação de Influenza A/equi- 2/Ohio/03 foi produzida em ovos. O vírus da provocação foi diluído na manhã da provocação a 1:20 com meio de cultura de tecido para atingir um título suficiente para causar influenza clínica nos cavalos provocados não vacinados.
[0144] Sedivet® (cloridrato de romifidina), um sedativo e analgésico, foi administrado intravenosamente a cada cavalo antes da provocação em uma dosagem de 50 μg/kg em peso do corpo. Cada cavalo foi então provocado com vírus da influenza A/equi-2/Ohio/03. O vírus de provocação foi administrado intranasalmente como um aerossol produzido por um nebulizador em um AeroMask Equino (Trudell Medical International, Ontario, Canadá) através do método que segue:
[0145] Quatro mililitros de vírus de provocação foram postos no copo do nebulizador no dispositivo AeroMask. Uma mangueira de pressão foi presa a partir de um compressor de ar na porta de entrada do nebulizador. O tubo de saída foi então inserido no AeroMask preso à cabeça do cavalo sendo provocado e pressão de ar foi aplicada à porta de entrada. Durante este tempo aproximadamente dois mililitros de fluido de vírus de provocação foram aerossolizados diretamente nas narinas do cavalo sendo provocado.
TEMPERATURA
[0146] Temperaturas retais diárias foram registradas para cada um dos 26 cavalos vacinados e controle no Dia de Provocação e por 10 dias pós-provocação por meio de uma sonda termômetro eletrônica, calibrada (GSA Eletronics). As temperaturas retais diárias foram registradas em graus Fahrenheit (oF).
CONTAGENS DE CÉLULA SANGUÍNEA BRANCA
[0147] Sangue venoso de cada um dos 26 cavalos vacinados e controle foi coletado diariamente no Dia de Provocação e por 10 dias pós-provocação diretamente em um tubo vacutainer de EDTA dissódico para contagens de WBC.
AVALIAÇÃO DE EXUDATO NASAL
[0148] Todas as observações de exudato nasal foram feitas antes da coleta de esfregaços nasofaringeais. No Dia de Provocação e por 10 dias pós-provocação, a passagem nasal e focinho de cada um dos 26 cavalos de controle e vacinados foram examinados e graduados usando uma descrição de graduação e classificação listada abaixo.
[0149] Os graus de classificação de 0 a 6 foram concedidos com base na severidade da doença indicada por cada uma das classificações que seguem: Tabela 5: Graus de Classificação
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TOSSE
[0150] Episódios de tosse em cada dia de observação foram contados para cada cavalo durante todo o período de observação, sendo os animais observados ou não pelo investigador naquele momento. Observadores outros que não o investigador registraram o número de episódios de tosse de cada cavalo individual durante o período de observação. Classificação de episódios de tosse foram contagens reais de episódios de tosse por cavalo.
CONJUNTIVITE
[0151] A conjuntivite foi avaliada diariamente no momento de avaliação de exudato nasal. As classificações de conjuntivite foram registradas como 0 = normal; 1 =conjuntivite leve a moderada e 2 = conjuntivite severa.
MÉTODOS DE ISOLAMENTO/HEMAGLUTINAÇÃO VIRAL NASOFARINGEAL
[0152] Em cada dia de teste de observação cada passagem nasal de cada vacinado e controle foi amostrada profundamente por meio de esfre- gaços estéreis. Quando da coleta, cada um dos dois esfregaços foi imediatamente posto em um tubo único contendo 4 mL de meio de transporte esfriado (Meio Essencial Mínimo da Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS a 2%, 2X Pen/Strep, 2X Gentamicina e 2X Anfotericina B).
[0153] Para isolamento de vírus, os tubos foram misturados, os esfregaços assepticamente removidos e o meio centrifugado a 1500 rpm por 10 a 15 minutos para remover partículas. O meio foi filtrado em um filtro de seringa de 0,2 μ antes da inoculação em células de cultura de tecido. Após filtragem, 4-6% de solução de sacarose a 85% foram adicionados a cada amostra para congelamento a -80° C a fim de que todas as amostras fossem testadas concomitantemente.
[0154] Todas as amostras foram testadas em placas de microtitulação de fundo plano estéreis usando cinco poços por diluição e uma série de diluição de 4 poços para cada um dos 5 poços de teste. Quando do descongelamento, 22 μL do meio de amostra clarificado foram usados para inocular uma monocamada de um dia de vida de células MDCK-S das quais o meio de crescimento tinha sido assepticamente removido e substituído com 200 μl de meio de crescimento de influenza (DMEM contendo 5-10 unidades de solução de estoque 10.000U de Tripsina Porcina, L-glutamina a 2 mM, 1X Pen-Strep e 1X Anfotericina B). As placas foram então incubadas a 35° C em uma incubadora de CO2 por 5-7 dias. Após o período de incubação de 5-7 dias, 50 μl de todos os poços das placas de titulação foram transferidos diretamente para uma placa de HA vinila de 96 poços marcada. Células de sangue vermelhas de galinha foram adicionadas a cada poço e deixadas sedimentar por 30-90 minutos em temperatura ambiente. Os poços foram lidos para aglutinação positiva como evidência da presença de Vírus da Influenza Equina. PROCEDIMENTO DE TESTE DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO (HI)
[0155] Amostras de soro foram preparadas pondo 0,15 ml de cada amostra em um tubo de teste e extraindo com 0,3 mL de Solução de Periodato de Sódio a 0,01M em temperatura ambiente por 15 minutos. Solução de Glicerol a 3% (0,125 mL) foi adicionada a cada tubo, misturada e incubada em temperatura ambiente por 15 minutos. Todas as amostras foram então inativadas com calor a 56° C por 30 minutos.
[0156] Uma solução a 0,5% de células sanguíneas vermelhas de galinha foi preparada em PBS (número de catálogo SAFC 59321C) e padronizada para uma densidade óptica de 0,5 a 550 nm.
[0157] Amostras de soro extraídas foram testadas em duplicata em placas de poliestireno de fundo em U usando um esquema de diluição de 2 vezes em PBS variando de 1:4 a 1:256, 25ul por poço. Vírus de estoque A/Equi2/Ohio03 da influenza (25 μL) foi adicionado à diluição de amostra de soro. As placas foram gentilmente tampadas para mistura e incubadas em temperatura ambiente por 30 minutos. Após incubação, células sanguíneas vermelhas de galinha foram adicionadas a cada poço e incubadas sem serem perturbadas em temperatura ambiente por 1 a 1,5 hora. Os resultados foram lidos através de observação das placas quanto à presença ou ausência de células sanguíneas vermelhas aglutinadas em cada poço. Título de anticorpo foi determinado como a diluição mais alta de soro na qual aglutinação não aconteceu.
Resultados e Conclusões
[0158] Quando agrupados em todos os pontos de tempo pós- provocação, os animais vacinados tinham classificações clínicas totais menores do que os animais de controle. Quando as classificações diárias totais foram somadas durante o período pós-provocação, os cavalos no grupo vacinado tinham classificações totais menores do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05). A fração mitigada foi estimada ser 0,6485 (ASE CI 95%: 0,3258, 0,9712). TABELA 6: Classificação Clínica Total
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1 O procedimento GLIMMIX não convergeria, então uma abordagem ANOVA foi usada para avaliar o efeito de vacinação com o tempo após provocação. Os resultados foram interpretados através de valores em negrito. TABELA 7: Fração mitigada – classificação clínica cumulativa total
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1Valor P do teste de soma de ranque de Wilcoxon 2Classificação de descarga nasal, classificação de conjuntivite e classificação de tosse foram somadas com dia e todos os pontos de tempo para cada animal então classificados para a estimativa da fração mitigada. 3Ranque médio
DESCARGA NASAL
[0159] O efeito principal de vacinação foi estatisticamente significante e reduziu a descarga nasal devido à provocação com influenza. Quando agrupados em todos os pontos de tempo pós- provocação, os animais vacinados tinham classificações de descarga nasal menores do que os animais de controle. TABELA 8: Classificação de Descarga Nasal
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1 O procedimento GLIMMIX não convergeria, então uma abordagem ANOVA foi usada para avaliar o efeito de vacinação com o tempo após provocação. Os resultados foram interpretados através de valores em negrito.
CONJUNTIVITE
[0160] Para conjuntivite, o efeito de vacinação principal foi estatisticamente significante. Quando agrupados em todos os pontos de tempo pós-provocação, os animais vacinados tinham conjuntivite reduzida devido à infecção por influenza conforme demonstrado por classificações de conjuntivite menores do que os animais de controle. TABELA 9: Classificação de Conjuntivite
Figure img0015
1 O procedimento GLIMMIX não convergeria, então uma abordagem ANOVA foi usada para avaliar o efeito de vacinação com o tempo após provocação. Os resultados foram interpretados através de valores em negrito.
TOSSE
[0161] A vacina também protegeu contra a tosse resultante de infecção por influenza equina. Os animais vacinados tinham classificações menores (P < 0,05) nos Dias 3, 5, 7, 8 e 9 pós-provocação do que os animais de controle. TABELA 10: Classificação de Tosse
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1 O procedimento GLIMMIX não convergeria, então uma abordagem ANOVA foi usada para avaliar o efeito de vacinação com o tempo após provocação. Os resultados foram interpretados através de valores em negrito.
Shedding Viral (Swabs Nasais)
[0162] A vacinação também reduziu a porcentagem de cavalos excretando o vírus (P < 0,05). A figura abaixo representa que a porcentagem de animais vacinados excretando o vírus era menor (P < 0,05) nos Dias 3, 4 e 5 pós-provocação do que os animais de controle. TABELA 11: Fração mitigada - dias de excreção de vírus
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1Valor P do teste de soma de ranque de Wilcoxon 2O número de dias de excreção viral foi calculado, então classificado para a estimativa da fração mitigada. Erros-padrão assimptóticos (ASE) foram usados para estimar os intervalos de segurança (CI) de 95%. 3O número médio de dias de resultados positivos foi obtido a partir do ensaio de isolamento de vírus.
TÍTULOS DE HI
[0163] A vacina foi também eficaz na elicitação de títulos de anticorpo de proteção para Vírus da Influenza Equina. Títulos maiores estatisticamente significantes nos cavalos vacinados foram vistos no Dia 36 (com relação à vacinação), Dias 154 (o dia da provocação), 159 e 164. Os cavalos no grupo vacinado tinham títulos maiores em cada um desses dias do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05).
CONTAGENS DE WBC E LINFÓCITO
[0164] A vacinação também protegeu cavalos da redução em contagens de célula sanguínea branca vista seguindo provocação com o vírus influenza (P < 0,05). Vacinação com a vacina de combinação proveu proteção estatisticamente significante que foi vista nos Dias 2 e 7 para contagens de WBC e Dias 2, 6, 7 e 8 pós-provocação. Cavalos no grupo vacinado tinham contagens de WBC e linfócito maiores do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05). Uma provocação de Duração de Imunidade de quatro meses foi realizada para demonstrar a eficácia das frações do vírus influenza de uma vacina multicomponente que incluía a vacina do Nilo Ocidental (Encefalomielite-Rinopneumonite- Influenza-Vacina do Nilo Ocidental, do Leste, do Oeste & Venezuelana, Vírus Morto, Toxoide do tétano) contendo 3 cepas do vírus A/equi-2 da influenza equina, Acesso ATCC Nos. PTA-9522, PTA-9523 e PTA- 9524, cada um deles é atualmente relevante na população equina das Américas, Europa e Ásia. Vinte e seis cavalos (15 vacinados e 11 de controle) foram vacinados duas vezes em intervalos de 3 semanas com uma dose de 1 mL de vacina ou foram falso-vacinados com componentes de meio com adjuvante da vacina sem antígeno viral. Quatro meses pós-vacinação de reforço, os cavalos foram provocados com um vírus Influenza A/equi2/Ohio30 Equine. O vírus virulento é a cepa de Influenza A/equi-2 equina atual recomendada para inclusão nas vacinas pela OIE e é atualmente reconhecido como a cepa mais pertinente envolvida em surtos nos Estados Unidos.
[0165] Resultados deste estudo de provocação de DOI de 4 meses mostram efeitos de proteção significantes da provocação através de vacinação com a vacina de teste, uma vacina do Nilo Ocidental de combinação com antígenos de gripe e outros equinos pertinentes. Importante, os cavalos vacinados mostraram sinais clínicos totais estatisticamente menores de vírus influenza (descarga nasal, conjuntivite e tosse, P=0,0055) com uma fração mitigada estimada ser 0,6485 (ASE CI 95%: 0,3258, 0,9712). Ainda, excreção viral foi estatisticamente menor em cavalos vacinados do que em cavalos de controle (P = 0,0004) com uma fração mitigada estimada ser 0,7939 (ASE CI 95%: 0,5343, 1.0000). Títulos de inibição de hemaglutinação foram significantemente maiores em cavalos vacinados do que cavalos de controle, e contagens de célula sanguínea branca e linfócito permaneceram significantemente maiores em cavalos vacinados em dias múltiplos do estudo com relação àquelas de cavalos de controle. Quaisquer diferenças em temperatura real foram determinadas entre os dois grupos.
[0166] Concluindo, os dados deste estudo demonstram que administração de 2 x 1 mL de doses intramusculares de vacina de combinação do Vírus do Nilo Ocidental administradas em um intervalo de 21 dias a potros de 4 a 5 meses de vida protegeu contra provocação virulenta com o vírus da Influenza Equina A/equi-2/Ohio03 e proveu uma duração de imunidade de pelo menos 4 meses para este produto.
Exemplo 5
[0167] Este exemplo ilustra a eficácia de uma composição imunogênica da presente invenção quando provocada com EHV-1 (Vírus do Herpes Equino Tipo 1).
Materiais e Métodos
[0168] O antígeno viral de EHV-1 usado na vacina avaliada neste estudo foi produzido em células Madin Darby Bovine Kidney (MDBK). Seguindo o crescimento, fluidos virais foram filtrados, BPL inativado e concentrado. Os fluidos virais inativados foram testados quanto ao vírus vivo residual após inativação. Quando do teste de vírus vivo residual satisfatório, os fluidos virais inativados foram então usados para formular uma vacina que também continha vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, cepa TC-83 (No de Acesso ATCC PTA-9411), Encefalomielite Equina do Leste, cepa NJO (No de Acesso ATCC PTA- 9412) e Encefalomielite Equina do Oeste, cepa Fleming (No de Acesso ATCC PTA-9410), vírus da influenza A/equine-2/Kentucky/95 inativado (No de Acesso ATCC PTA-9523), influenza A/equine-2/NewMarket/2/93 (No de Acesso ATCC PTA-9524) e influenza A/equine-2/Ohio/03 (No de Acesso ATCC PTA-9522), Vírus do Nilo Ocidental inativado (No de Acesso ATCC PTA-9409) e toxoide do tétano.
[0169] A vacina foi formulada para especificações mínimas para todos os antígenos incluídos no produto. Antígeno de EHV-1 foi adicionado à vacina em um título de pré-inativação de 107,0 TCID50/mL.
[0170] A vacina formulada final contém os ingredientes que seguem por dose de 1 mL:
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[0171] Quarenta (40) cavalos, de 4-5 meses de vida, foram usados neste estudo. Os cavalos foram aleatoriamente designados para grupos ou vacinados ou de controle, receberam microchip e então foram vacinados. Vinte cavalos serviram como vacinados e vinte cavalos foram cavalos de controle falso-vacinados. Todos os cavalos tinham títulos de soro neutralização de EHV-1 negativo a baixo (< 1:6) antes do início do estudo, indicativo de cavalos suscetíveis à infecção.
[0172] A vacina foi administrada intramuscularmente em um volume de dose de 1 mL a cada um dos 20 cavalos no grupo vacinado. Vinte cavalos no grupo de controle receberam uma dose de 1 mL de excipientes contendo DMEM com adjuvante (Lote 004) usado na vacina nônupla (Gentamicina e formaldeído), mas sem antígenos. Inoculação de provocação de vírus de cepa A183 de EHV-1 virulento foi realizada 15 dias pós-vacinação de reforço.
[0173] Amostras de soro para avaliação sorológica foram coletadas dos cavalos vacinados e de controle antes da vacinação inicial, em 21 dias após a primeira dose de vacinação (dia de vacinação de reforço), no dia da provocação e nos dias 7 e 14 pós-provocação. Temperatura do corpo, amostras de sangue integral e esfregaços nasais foram obtidos de cada cavalo no dia da provocação e diariamente durante o período de observação pós-provocação de 14 dias para um total de 15 dias de observação. Dados clínicos foram também registrados diariamente para cada cavalo para o período de observação de 15 dias.
PROCEDIMENTO DE PROVOCAÇÃO VÍRUS DE PROVOCAÇÃO
[0174] A semente de vírus de provocação original usada neste estudo de provocação foi a primeira passagem do vírus de semente original em células Dermais Equinas (ED). Este vírus de provocação foi coletado e congelado em um título de 106,2 TCID50/mL.
MÉTODO DE PROVOCAÇÃO INTRANASAL
[0175] Sedivet® (cloridrato de romifidina), um sedativo e analgésico, foi administrado intravenosamente a cada cavalo antes da provocação em uma dosagem de 50 μg/kg de peso do corpo. Cada cavalo foi então provocado com aproximadamente 106,5 TCID50 de cepa de EHV-1. O vírus de provocação foi administrado intranasalmente como um aerossol produzido por um nebulizador em um AeroMask Equino (Trudell Medical International, Ontario, Canadá) através do método que segue:
[0176] Uma mangueira de pressão foi fixada a partir de um compressor de ar na porta de entrada do nebulizador. O tubo de saída foi então inserido no AeroMask preso à cabeça do cavalo sendo provocado e aproximadamente 68,95 kPa (10 psi) de pressão de ar foi aplicado à porta de entrada por quatro minutos. Durante este tempo, aproximadamente dois mililitros de um fluido de vírus de provocação 106,2 TCID50/mL foram aerossolizados diretamente nas narinas do cavalo sendo provocado.
PARÂMETROS DE AVALIAÇÃO PRÉ- E PÓS-PROVOCAÇÃO TEMPERATURA
[0177] Temperaturas retais matutinas diárias foram registradas para cada um dos 40 cavalos vacinados e de controle no Dia de Provocação e durante 14 dias pós-provocação por meio de uma sonda termômetro eletrônica calibrada (GSA Eletronics). As temperaturas retais diárias foram registradas em graus Fahrenheit (oF).
CONTAGENS DE CÉLULA SANGUÍNEA BRANCA
[0178] Sangue venoso de cada um dos 40 cavalos vacinados e de controle foi coletado diariamente no Dia da Provocação e durante 14 dias pós-provocação diretamente em um tubo de EDTA Dissódico vacutainer para contagens de WBC.
AVALIAÇÃO DE EXUDATO NASAL
[0179] Todas as observações de exudato nasal foram feitas antes da coleta de esfregaços nasofaringeais. No Dia da Provocação e durante 14 dias pós-provocação, as passagens nasais e focinho de cada um dos 40 cavalos vacinados e de controle foram examinados e receberam um grau usando uma descrição de graduação e classificação listada abaixo.
[0180] Os graus de classificação de 0 a 6 foram designados com base na severidade da doença indicada por cada uma das classificações que seguem: (EN) essencialmente normal indica que o cavalo estava limpo e essencialmente livre de exudato nasal, classificação 0; (C-1) descarga serosa clara leve que pode ser frequentemente observada em ambos os cavalos doente e normal, classificação 1; (C-2) descarga serosa clara moderada é indicativo de um aumento definitivo em volume com relação àquele normalmente observado, classificação 2; (C-3) descarga serosa clara copiosa que é geralmente observada apenas em cavalos doentes, classificação 3; (VSM) descarga mucopurulenta muito leve indica que muco estava definitivamente presente em pequenas quantidades em uma ou ambas as narinas, classificação 1,5; (SM) Ligeiramente mucopurulenta é uma descarga facilmente observada em uma ou ambas as narinas, classificação 2; (MM) moderadamente mucopurulenta indica que descargas mucoides estavam presentes em grandes quantidades em ambas as narinas, classificação 4; e (HM) mucopurulenta forte indica que quantidades copiosas de descarga mucoide enchiam ambas as narinas, classificação 6.
MÉTODOS DE ISOLAMENTO VIRAL NASOFARINGEAL
[0181] Em cada dia de teste de observação, cada passagem nasal de cada vacinado e de controle foi amostrada profundamente por meio de esfregaços estéreis. Quando da coleta, cada um dos dois esfregaços foi imediatamente posto em um tubo único contendo 4 mL de meio de transporte esfriado (Meio Essencial Mínimo da Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS a 2%, 2X Pen/Strep, 2X Gentamicina e 2X Anfotericina B).
[0182] Para isolamento de vírus, os tubos foram misturados, os esfregaços assepticamente removidos e o meio centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos para remover partículas. Meio foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 μg antes da inoculação em células de cultura de tecido. Um mL do meio de transporte clarificado foi usado para inocular uma monocamada de um dia de vida de 2 cm2 de células ED cultivadas em uma placa de cultura de tecido de 24 poços da qual o meio de crescimento tinha sido assepticamente removido. Seguindo inoculação, o inóculo foi deixado adsorver na monocamada de célula por uma hora a 37° C em uma incubadora umidificada contendo uma atmosfera de CO2 5%. Após o período de absorção, mais 1 mL de meio realimentado (DMEM contendo soro bovino fetal 2-5% (FBS), L- glutamina 2 mM e 3X Gentamicina e 2X Anfotericina B) foi adicionado a cada poço. Seguindo adição de meio realimentado, as placas foram então incubadas a 37° C em uma incubadora de CO2. Cada poço de cultura de tecido de teste e de controle foi examinado microscopicamente por 7 dias quanto a sinais de efeito citopático (CPE) típicos do vírus de provocação EHV-1 A183. Os poços que eram negativos no final do período de observação de 7 dias foram subculturados em células frescas e observados por mais 7 dias.
ISOLAMENTO DE VÍRUS DA CAMADA LEUCO-PLAQUETÁRIA DE WBC
[0183] Sangue venoso de cada um dos 40 cavalos vacinados e de controle foi coletado no Dia de Provocação e diariamente por 14 dias pós-provocação através de vacutainer em um tubo de EDTA Dissódico. Após permitir sedimentação pela gravidade dos eritrócitos nos tubos de sangue anticoagulado de EDTA, as células de plasma e brancas do sangue foram pipetadas e postas em um tubo de tampa com trava de 5 mL estéril. A mistura de células de plasma e sanguínea branca foi centrifugada a 1500 RPM por 10-15 minutos para peletizar as células sanguíneas brancas. O pélete foi lavado duas vezes com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2X Pen/Strep, 2X Gentamicina e 2X Anfotericina B. As células foram então suspensas em 4 mL de DMEM suplementado com soro bovino fetal 2% (FBS) e 2X Pen/Strep, 2X Gentamicina e 2X Anfotericina B. Um mL de suspensão de camada leuco-plaquetária foi usado para inocular uma monocamada de um dia de vida de 2 cm2 de células ED cultivadas em uma placa de cultura de tecido de 24 poços a partir da qual o meio de crescimento tinha sido assepticamente removido. Seguindo inoculação, o inóculo foi deixado adsorver na monocamada de célula por uma hora a 37° C em uma incubadora umidificada contendo atmosfera de CO2 5%. Após o período de adsorção, mais 1 mL de meio realimentado (DMEM contendo soro bovino fetal 5-7% (FBS), L-glutamina 2 mM e 1X Gentamicina) foi adicionado a cada poço. Seguindo a adição de meios realimentados, as placas foram então incubadas a 37° C em uma incubadora de CO2. Os poços não puderam ser observados microscopicamente devido ao grande volume de células sanguíneas brancas sedimentadas na monocamada. Desta maneira, no final dos 7 dias, todos os poços foram subculturados em células ED frescas usando 0,5 ml da 1a passagem como inócuo. A subcultura foi observada por 7 dias para CPE típico de infecção por vírus de provocação.
PROCEDIMENTO DE TESTE DE NEUTRALIZAÇÃO DE SORO
[0184] Um teste de neutralização de soro de microtitulação padrão foi empregado neste estudo. Todos os soros foram testados em placas de microtitulação de fundo plano estéreis usando cinco poços por diluição e uma série de diluição de 8 poços para cada um dos 5 poços testados. Cada um dos 5 poços testados continha 25 μl de diluição de soro misturados com 25 μl do vírus indicador e 150 μl de uma suspensão de célula ED recém-plantada contendo aproximadamente 5 X 104células. O vírus indicador de teste usado foi a cepa A183 subtipo 1 EHV-1. Em todos os testes, os títulos de retrotitulação de vírus indicador variaram entre 109 e 263 TCID50/25 μl. Títulos de anticorpo de neutralização de soro são expressos como títulos ID50 Reed-Muench.
[0185] Para realização do teste, diluições duplas de cada soro de teste foram feitas em uma placa de microtitulação de fundo plano usando cinco poços de réplica por soro de teste e uma série de 8 diluições por poço. As diluições foram feitas com um instrumento de pipetagem de canal único ou multicanal usando pontas de microtitulação estéreis. O volume de soro adicionado a cada um dos 5 poços da primeira fileira foi 50 μl. Todos os outros poços continham 25 μl de DMEM (sem FBS). Seguindo diluição serial a jusante da placa, 25 μl foram descartados da última fileira. 25 μl de uma diluição predeterminada do vírus indicador foram adicionados a cada poço de teste. As placas foram então misturadas e incubadas por uma hora a 37° C em CO2 a 5%. Uma conclusão do período de incubação, 150 μl de uma suspensão contendo 5 x 104 ED células foram adicionados a cada poço de teste e de controle de célula. As placas foram incubadas a 37° C em uma incubadora de CO2 por 3 dias, momento quando as placas foram microscopicamente examinadas quanto a CPE típico de EHV-1. Alternativamente, qualquer ensaio convencional ou comercial pode ser usado ou aqueles versados na técnica seriam capazes de seguir a presente orientação.
Resultados e Conclusão
[0186] Classificações de descarga nasal, classificações de excreção nasal de EHV-1 e conjuntivite foram consideradas as variáveis de resultado principais. Todos os outros resultados foram considerados secundários. TABELA 12: Sumário da análise estatística (valores P)
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1 O procedimento GLIMMIX não convergeria, então uma abordagem ANOVA foi usada para avaliar o efeito de vacinação com o tempo após provocação. Os resultados são interpretados através dos valores em negrito.
AVALIAÇÃO DE EXUDATO NASAL
[0187] O grupo de vacinação por interação de dia foi estatística mente significante para as classificações de descarga nasal (P < 0,05). Efeitos de grupo estatisticamente significantes foram vistos nos Dias 4, 5 e nos dias 7-11 pós-provocação (classificações nasais menores no grupo vacinado, P < 0,05). Quando as classificações diárias foram somadas durante o período pós-provocação, cavalos no grupo vacinado tinham classificações totais menores do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05). A fração mitigada foi estimada ser 0,7250 (ASE CI 95%: 0,4886, 0,9614). TABELA 13: Fração mitigada - classificações de descarga nasal e conjuntivite, excreção de vírus nasal (ranques médios)
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1 Valor P do teste de soma de ranque de Wilcoxon 2 Classificações de descarga nasal e conjuntivite foram somadas em todos os pontos de tempo então graduadas quanto à estimativa da fração mitigada. O número de dias de excreção viral foi calculado, então graduado quanto à estimativa da fração mitigada. Erros-padrão assimptóticos (ASE) foram usados para estimular os intervalos de segurança (CI) de 95%. TABELA 14: Classificação de descarga nasal média (N = 20 cavalos por grupo)
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Figure img0023
1 O procedimento GLIMMIX não convergeria, então uma abordagem ANOVA foi usada para avaliar o efeito de vacinação com o tempo sobre a classificação de descarga nasal.
CONJUNTIVITE
[0188] O grupo de vacinação, por interação de dia, foi estatisticamente significante para as classificações de conjuntivite (P < 0,05). Efeitos de grupo estatisticamente significantes foram vistos nos Dias 5 e 6 e nos Dias 9-14 pós-provocação (classificações menores no grupo vacinado, P < 0,05). Quando as classificações diárias foram somadas durante o período pós-provocação, os cavalos no grupo vacinado tinham classificações totais menores do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05). A fração mitigada foi estimada ser 0,5300 (ASE CI 95%: 0,2463, 0,8137). TABELA 15: Classificação de conjuntivite média (N = 20 cavalos por grupo)
Figure img0024
1 O procedimento GLIMMIX não convergeria, então uma abordagem ANOVA foi usada para avaliar o efeito de vacinação com o tempo.
ISOLAMENTO DE VÍRUS A PARTIR DE ESFREGAÇOS NASOFARINGEAIS
[0189] O efeito principal do grupo de vacinação foi estatisticamente significante (menos animais excretando no grupo vacinado, P < 0,05). Quando o número de dias de excreção foi avaliado, os cavalos no grupo vacinado tinham menos dias de excreção de vírus do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05, Tabela 2). A fração mitigada foi estimada ser 0,4952 (ASE CI 95%: 0,1896, 0,7954). TABELA 16: Proporção de excreção de vírus (esfregaço nasal, N = 20 cavalos por grupo)
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CONTAGENS DE CÉLULA SANGUÍNEA BRANCA
[0190] O grupo de vacinação por interação de dia foi estatisticamente significante para contagens de WBC (P < 0,05, Tabela 1). Efeitos do grupo estatisticamente significantes foram vistos nos Dias 2 e 3 pós-provocação. Cavalos no grupo vacinado tinham contagens de WBC maiores do que aqueles no grupo de controle, indicando que a vacina prevenia os cavalos de sofrerem de leucopenia causada por infecção com EHV-1 (P < 0,05). TABELA 17: Contagens de WBC médias (N = 20 cavalos por grupo)
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1 Valores P de ANOVA
ESTUDOS SOROLÓGICOS
[0191] Os títulos foram log transformados antes da análise estatística. O grupo de vacinação por interação de dia foi estatisticamente significante para títulos SN (P < 0,05). Efeitos do grupo estatisticamente significantes foram vistos nos Dias 35 (o dia da provocacão) e 7 e 14 dias pós- provocação (dias de estudo 42 e 49). Cavalos no grupo vacinado tinham títulos maiores do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05). TABELA 18: Média geométrica - títulos de neutralização de soro (N = 20 cavalos por grupo)
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1 Valores P do ANOVA. Títulos de neutralização de soro foram log transformados (natural) antes da análise estatística.
Resultados e Discussão
[0192] Doença respiratória causada por vírus do herpes equino tipo 1 é geralmente uma doença epidêmica de cavalos desmamados e com um ano de idade puros que acontece no primeiro ano de vida, geralmente nos meses de outono e inverno. Sinais de infecção aguda incluem febre de até 41,11° C (106° F), viremia e leucopenia e/ou neuropenia. Descarga nasal é geralmente evidente durante períodos febris desta primeira exposição. Infecção natural por EHV-1 não resulta em imunidade permanente do trato respiratório. Na verdade, os cavalos podem ser reinfectados naturalmente a cada 3 a 6 meses durante a vida. Após a primeira experiência com este vírus, reinfecção resulta em produção de vírus, mas geralmente sem sinais clínicos de doença, resultando em animais veículos que agem como reservatórios naturais do vírus.
[0193] A vacina multicomponente contra vírus do herpes equino 1 descrita neste relatório foi mostrada ser eficaz na redução das manifestações respiratórias, sintomas clínicos e excreção de vírus a partir do exudato nasal de cavalos provocados com uma cepa heteróloga virulenta de Vírus do Herpes Equino tipo 1. Redução em excreção de vírus a partir da via respiratória é epidemiologicamente importante devido ao fato disto ser a via natural de exposição para animais puros bem como para reinfecção de parceiros de rebanho daqueles sofrendo uma infecção natural. Ela era também uma vacina segura sem quaisquer reações adversas, ou sistêmica ou no sítio de administração da vacina, observadas seguindo uso da vacina nos cavalos de estudo.
[0194] Neste estudo, grupo de vacinação por interação de dia mostrou significância estatística para as variáveis de resultado primário classificação de descarga nasal e conjuntivite. Efeitos do grupo estatisticamente significantes foram vistos no grupo vacinado para descarga nasal nos Dias 4, 5 e nos Dias 7-11 pós-provocação. Efeitos do grupo para conjuntivite foram também estatisticamente significantes nos Dias 5 e 6 e 9-14 com classificações menores no grupo vacinado (P < 0,05). Isto é epidemiologicamente significante porque o vírus EHV-1 é delicado e não sobrevive no ambiente imediatamente. Contato íntimo é importante para transmissão de doença através de secreções nasais contendo vírus EHV-1 virulento (Campbell e Studdert, 1983).
[0195] Importante, outra variável de resultado principal neste estudo, excreção de vírus em exudatos nasais, mostrou um efeito principal de vacinação como estatisticamente significante (P < 0,05). Cavalos no grupo vacinado também tinham estatisticamente menos dias de excreção de vírus do que aqueles no grupo de controle (P < 0,05).
[0196] Títulos de neutralização de soro foram estatisticamente significantes após vacinação e durante o período de provocação em cavalos vacinados versus controle (P < 0,05). Imunidade humoral e anticorpos mucosais podem ser importantes na determinação de se uma infecção por EHV-1 se torna um evento de infecção produtivo ou limitado (Kidd, Smith, Hannant e outros, 1994).
Exemplo 6
[0197] Este exemplo ilustra a eficácia e a duração de 6 meses de imunidade de uma composição imunogênica da presente invenção quando provocada com Vírus do Nilo Ocidental.
Materiais e Métodos
[0198] O antígeno viral de WNV usado na vacina avaliada neste estudo foi produzido em células E vero conforme descrito no Exemplo 1. Um total de 15 cavalos foi aleatoriamente dividido em grupos, um sendo um grupo de controle de 5 cavalos. O grupo vacinado de 10 cavalos recebeu 2 doses de vacina em células de intervalos de 21 dias. Quando do término do teste de vírus vivo residual satisfatório, os fluidos virais inativados foram então usados para formular uma vacina que também continha vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, cepa TC-83 (No de Acesso ATCC PTA-9411), Encefalomielite Equina do Leste, cepa NJO (No de Acesso ATCC PTA-9412) e Encefalomielite Equina do Oeste, cepa Fleming (No de Acesso ATCC PTA-9410), vírus da influenza A/equine-2/Kentucky/95 inativado (No de Acesso ATCC PTA-9523), influenza A/equine-2/NewMarket/2/93 (No de Acesso ATCC PTA-9524) e influenza A/equine-2/Ohio/03 (No de Acesso ATCC PTA- 9522), Vírus do Nilo Ocidental inativado (No de Acesso ATCC PTA- 9409) e toxoide do tétano. A vacina foi formulada para especificações mínimas para todos os antígenos incluídos no produto.
[0199] A vacina formulada final contém os ingredientes que seguem por dose de 1 mL:
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[0200] Quinze cavalos foram usados neste estudo. Os cavalos foram aleatoriamente designados para grupos ou de controle ou vacinados e então vacinados. Dez cavalos serviram como vacinados e cinco cavalos eram cavalos de controle falso-vacinados.
[0201] A vacina foi administrada intramuscularmente em um volume de dose de 1 mL a cada um dos cavalos no grupo vacinado. Cada controle recebeu uma dose de 1 mL de excipientes contendo DMEM com adjuvante usado na vacina nônupla (gentamicina e formaldeído), mas sem antígenos.
[0202] Todos os grupos foram provocados aproximadamente 6 meses seguindo vacinação com inoculação intratecal de 1 ml de PBS contendo aproximadamente 105 pfu de uma cepa heteróloga de WNV (NY99, 4132, isoladode corvo). A provocação foi conduzida sob anestesia com cetamina-xilazina.
[0203] Os cavalos foram monitorados por um máximo de 14 dias.
Resultados e Discussão
[0204] Viremia após provocação foi considerada a variável de resultado principal neste estudo. Os cavalos que tinham sido vacinados estavam 90% protegidos de viremia após provocação neste estudo. Em comparação, todos os 5 cavalos de controle demonstraram viremia por 3-5 dias pós-provocação.
[0205] Ainda, títulos de neutralização de soro de cavalos vacinados foram significantemente maiores do que aqueles de cavalos de controle após vacinação. Todos os cavalos vacinados desenvolveram títulos de neutralização de soro mensuráveis seguindo vacinação, enquanto nenhum dos controles mostrou qualquer título para WNV. Este estudo demonstrou que 2 doses da vacina de combinação experimental estimularam confiavelmente e eficazmente títulos de neutralização de soro sorológicos protetores.
[0206] Uma vez que viremia é um pré-requisito antes do vírus poder cruzar a barreira sangue-cérebro para causar encefalite por WNV, viremia é bem justificada como o parâmetro primário para avaliação de proteção em um estudo experimental deste tipo.
[0207] Os resultados demonstraram que uma reação imunogênica é induzida nos animais que foram administrados com a vacina, e que a vacina é eficaz na provisão de proteção por pelo menos 6 meses seguindo a vacinação. A eficácia da vacina foi evidenciada neste exemplo através da redução em viremia de WNV e através da estimulação de títulos de neutralização de soro altos para WNV. Devido ao fato desta vacina ser compreendida de constituintes únicos incluindo um adjuvante nãometabolizável de longa duração, é formulada em um volume de dose de 1 mL baixo para prover um grau alto de segurança como um isolado de WNV de vírus inativado integral de passagem baixa altamente imunogênico de origem recente e prevalência epidemiológica alta (uma cepa de WNV Dominante da América do Norte), e um WNV isolado dos tecidos de um cavalo infectado, ela provê segurança mais compreensiva e eficácia de longa duração de pelo menos 6 meses de duração do que outras vacinas atualmente disponíveis. Ainda, ela tem o efeito de provisão de uma vacina segura quando administrada a animais, e em particular a cavalos.
Exemplo 7
[0208] Este exemplo ilustra a eficácia de uma modalidade da composição imunogênica da presente invenção incluindo antígenos de encefalomielite com antígeno do toxoide do tétano.
Materiais e Métodos
[0209] Imunização/sorologia de animal hospedeiro e animal de laboratório foram avaliadas para demonstrar eficácia de antígenos de encefalomielite e da fração de antígeno do toxoide do tétano em uma Vacina do Vírus da Encefalomielite-Rinopneumonite-Influenza-Nilo Ocidental, incluindo Vírus do Leste, Oeste e Encefalomielite Venezuelana, Vírus Morto e Toxoide do Tétano. A eficácia e a falta de interferência em vacinas do vírus de encefalomielite equina e frações do toxoide do tétano podem ser inequivocadamente demonstradas através de teste da potência de animal de laboratório da vacina de combinação. Demonstração de resposta sorológica seguindo vacinação de cavalos é também indicativo de eficácia de vacina-toxoide. Desta maneira, ambas a potência de animal de laboratório e a sorologia de animal hospedeiro foram usadas neste estudo para confirmar a eficácia da vacina experimental. A vacina foi também avaliada quanto à segurança em animais incluindo cavalos.
[0210] Cavalos de 4-5 meses de vida, de éguas não vacinadas, foram vacinados com uma série eficaz de vacina de combinação de WNV contendo vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, cepa TC-83 (No de Acesso ATCC PTA-9411), Encefalomielite Equina do Leste, cepa NJO (No de Acesso ATCC PTA-9412) e Encefalomielite Equina do Oeste, cepa Fleming (No de Acesso ATCC. PTA-9410), Vírus do Nilo Ocidental (WNV), Cavalo Origem 2005 (No de Acesso ATCC. PTA-9409), Vírus do Herpes Equino Tipo 1 (No de Acesso ATCC. PTA-9525) (EHV-1), vírus da Influenza A/equine-2/Ohio/03 (No de Acesso ATCC pTA-9522), Influenza A/equine-2/Kentucky/95 (No de Acesso ATCC. PTA-9523), influenza A/equine-2/NewMarket/2/93 (No de Acesso ATCC. PTA-9524) e toxoide do tétano. Os cavalos foram vacinados no Dia 0 e no Dia 21 do estudo. Amostras de sangue foram coletadas no Dia 0, Dia 21 e Dia 35. Resultados sorológicos do Dia 0 e do Dia 35 são relatados aqui.
[0211] Ainda, a mesma vacina de combinação de WNV usada para vacinar cavalos foi testada quanto à potência em porquinhos-da-índia. Os dados apresentados neste relatório coletivamente e definitivamente estabelecem a eficácia de cada antígeno testado (EEE, VEE, WEE, tétano) neste estudo e também confirmam a segurança de uma vacina de combinação de WNV.
[0212] Lotes volumosos de vírus EEE, WEE e VEE e toxoide do tétano foram produzidos. Seguindo crescimento, fluidos virais foram filtrados, inativados com formalina e concentrados. Os fluidos virais inativados foram testados quanto a vírus vivo residual após inativação.
[0213] Fluidos virais e toxoides inativados descritos acima foram usados para formular uma vacina que também continha Vírus do Herpes Equino Tipo 1 inativado, Vírus da Influenza A/equine-2/Kentucky/95 inativado, influenza A/equine-2/NewMarket/2/93 e influenza A/equine- 2/Ohio/03.
[0214] A vacina foi formulada para especificações para todos os antígenos incluídos no produto.
[0215] A vacina formulada final continha os ingredientes que seguem por dose de 1 mL:
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[0216] Quarenta cavalos, de quatro a 5 meses de vida, foram usados neste estudo, Os cavalos permaneceram com suas mães no pasto durante o período de vacinação e foram desmamados de suas mães quando os soros 2 semanas pós-reforço foram coletados, Os cavalos foram designados para qualquer um dos dois grupos de tratamento aleatoriamente, conforme eles eram vacinados intramuscu-larmente (IM) com uma dose de 1,0 ml, A imunização primária foi seguida três semanas depois por uma vacinação de reforço IM de 1,0 ml, Vinte cavalos receberam a vacina, Vinte cavalos receberam placebo.
[0217] Porquinhos-da-índia foram também vacinados com a mesma vacina para WNV de combinação.
[0218] Os cavalos foram vacinados e amostras de soro coletadas usando o programa que segue: TABELA 9: Programa de Vacinação e Amostragem de Soro
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[0219] Porquinhos-da-índia foram vacinados e soro coletado usando o programa mostrado por 9 CFR, 113.207(b) e 113.114(c,).
[0220] Soros de cavalos neste estudo foram testados seguindo as orientações gerais. O ensaio foi modificado para determinar títulos através de teste em diluições de 1:2 e 1:10 para amostras do Dia 0 e em diluições 1:10 e 1:40 para amostras de soro 2 semanas pós-reforço. Os soros foram testados quanto a anticorpo para EEE, WEE e VEE e foram testados quanto ao anticorpo do Toxoide do tétano. Resultados e Discussão Avaliação Sorológica de Cavalo quanto a EEE, WEE e VEE
[0221] No Dia 0 do Estudo, nem todos os potros eram soronegativos para vírus da encefalomielite. Cinco dos potros vacinados tinham anticorpo maternal residual significante (>1:10) para vírus EEE. Ainda, dois dos potros vacinados tinham anticorpo maternal residual (>1:10) para vírus WEE. Apesar da existência e potencialmente interferir passivamente, anticorpo maternal, adquirido, no momento de administração da primeira dose da vacina de combinação de WNV, títulos para todas as três frações aumentaram substancialmente (>4 vezes em 80% de cavalos testados para EEE, >4 vezes em 90% de cavalos testados para WEE e >4 vezes em 100% de cavalos testados para VEE) seguindo vacinação, ainda permaneceu negativo ou baixo para os potros não vacinados. Dados de potro individuais são apresentados abaixo. Títulos Sorológicos Equinos de EEE, WEE e VEE. TABELA 20: Titulação de Neutralização por Redução de Placa
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Avaliação Sorológica de Porquinho-da-índia para EEE, WEE, VEE e Toxoide do tétano
[0222] Nove de dez porquinhos-da-índia vacinados com a vacina de combinação soroconverteram satisfatoriamente em (>1:40) para vírus EEE. Dez de dez porquinhos-da-índia tinham títulos satisfatórios para vírus VEE (>1:4) e dez de dez porquinhos-da-índia soroconverteram satisfatoriamente para vírus WEE (>1:40). Também um grupo de soro de 10 porquinhos-da-índia vacinados foi testado quanto a anticorpo do tétano e foi mostrado ser satisfatório com um valor de 4,3 unidades antitoxina/ml (AU/ml).
[0223] Testes de potência de porquinho-da-índia foram comple tados e constatados ser satisfatórios para todos os quatro antígenos incluindo toxoide do tétano, EEE, VEE e WEE.
[0224] A vacina foi também administrada a cavalos (20 vacinados e 20 de controle) através de imunização primária seguido por imunização de reforço 3 semanas depois. Quatorze dias pós-vacinação de reforço, os cavalos sofreram sangria e soro coletado para todo teste sorológico. Resposta equina a antígenos de encefalomielite foi testada utilizando 2 diluições (1:2 e 1:10 para amostras do Dia 0 e 1:10 e 1:40 para amostras do Dia 35) em placas de 24 poços para determinar títulos de anticorpo.
[0225] O teste de potência de porquinho-da-índia satisfatório estabelece conclusivamente a eficácia de 4 antígenos (VEE, EEE, WEE e toxoide do tétano) na vacina de combinação de Vírus do Nilo Ocidental como uma vacina-toxoide contendo 9 antígenos. Ainda, resultados de potência satisfatórios são substanciados e confirmados através de dados de sorologia de cavalo de animal hospedeiro onde cavalos vacinados demonstraram um aumento substancial em título para cada fração de vírus de encefalite seguindo vacinação. Ainda, a ausência de observação de quaisquer reações adversas em qualquer um dos cavalos ou porquinhos-da-índia vacinados confirma a segurança da vacina de combinação de WNV em animais.
Exemplo 8
[0226] Este exemplo ilustra que uma vacina ou composição imunogênica de acordo com a presente invenção tem uma duração de imunidade de pelo menos um ano,
Materiais e Métodos
[0227] Vacinação de animal hospedeiro e provocação pelo menos 1 ano pós-vacinação de reforço foram usados para confirmar duração de imunidade para fração do antígeno do Vírus do Nilo Ocidental em uma Vacina para Encefalomielite-Rinopneumonite-Influenza-Vírus do Nilo Ocidental, do Leste, do Oeste & Venezuelana, Vírus Morto, Toxoide do Tétano preparada a partir de isolado Dominante na América do Norte de WNV chamado E159 Equino Norte-Americano (NAEE159), TABELA 21: A vacina formulada final contém os ingredientes que seguem por dose de 1 mL:
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[0228] Trinta cavalos (20 vacinados e 10 de controle), 4-5 meses de vida, foram usados neste estudo. Os cavalos foram aleatoriamente designados para um de dois tratamentos e vacinados intramuscularmente (IM) com uma dose de 1,0 mL da vacina ou produto de controle designado. A imunização primária foi seguida três semanas depois por uma vacinação de reforço IM de 1,0 mL.
[0229] Os cavalos foram vacinados uma vez e então novamente cerca de 30 dias depois. Os cavalos foram aleatoriamente designados para grupos de vacina ou de controle. Vinte cavalos receberam o grupo de vacina recebendo a vacina para VEWT/WNV/EHV-1/Influenza. Dez cavalos receberam excipientes contendo DMEM com adjuvante usados na vacina (Gentamicina e formaldeído), mas sem antígenos. O adjuvante de óleo não metabolizável usado para todas as administrações era preferivelmente óleo mineral.
[0230] A inoculação de provocação do vírus de cepa NY99 de WNV heterólogo virulento foi realizada 380 dias pós-vacinação de reforço. O segundo coorte de cavalos foi provocado 408 dias pós-inoculação de reforço de uma maneira similar.
[0231] Amostras de soro para avaliação sorológica foram coletadas dos cavalos vacinados e de controle antes da vacinação inicial, 21 dias após a primeira dose de vacinação (dia de vacinação de reforço), pós- reforço mensal, no dia de provocação e 7 e 14 dias pós-provocação. A temperatura do corpo e amostras de soro foram obtidas de cada cavalo no dia de provocação, duas vezes por dia nos Dias 1 a 6 pós- provocação e diariamente nos Dias 7-10 e Dia 14 pós-provocação. Dados clínicos foram também registrados durante esses mesmos períodos de tempo para o período de observação.
[0232] O vírus de provocação heterólogo, chamado WNV NY99, foi originalmente isolado do cérebro de um corvo infectado (CDC, Ft, Collins, CO). No dia da provocação, o vírus de estoque foi descongelado em gelo e o vírus foi diluído para a concentração desejada em solução salina tamponada com fosfato imediatamente antes da inoculação de cavalos.
[0233] As temperaturas retais foram registradas para cada um dos cavalos de controle e vacinados no dia antes da provocação, dia da provocação e duas vezes por dia nos dias 1-14, então diariamente nos Dias 14-21 pós-provocação por meio de uma sonda termômetro eletrônica, calibrada, (GSA Eletronics). As temperaturas retais diárias foram registradas em graus Fahrenheit (oF).
[0234] Sangue venoso de cada um dos cavalos de controle e vacinados foi coletado no Dia da Provocação, duas vezes por dia nos Dias 1-6 e diariamente nos Dias 7-10 e Dia 14 pós-provocação através de Vacutainer em um tubo SST. Após centrifugação, soro foi separado em alíquotas e congelado imediatamente.
[0235] Células Vero foram cultivadas em placas de 6 poços para confluência. Para realizar o ensaio de placa, diluições de 10 vezes seriais de soro foram preparadas em placas de 96 poços em meio BA- 1 (sais de MEM contendo BSA 1%, 250 mg/mL de bicarbonato de sódio, 50 μl de gentamicina e 2,5 μg de anfotericina B/mL em Tris 50 mM, pH 7,6). Diluições de soro (0,1 mL) foram inoculadas em cada poço da placa de 6 poços e incubadas por 45-60 minutos com agitação a cada 15 minutos. Após o período de incubação, 2 mL de cobertura (2X de meio contendo MEM sem vermelho fenol preparado duas vezes a concentração normal e suplementado com FBS a 4%, penicilina 200 UI G/mL e 100 μg de estreptomicina/mL - aquecida para 45° C) foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas a 37° C.
[0236] Dois dias após inoculação, 2 mL de uma segunda cobertura contendo 2X agarose preparada misturando volumes iguais de 2X meio e 2X agarose foram adicionados a cada poço. As placas foram examinadas e números de placa registrados em cada poço nos dias 3, 4, e 5 seguindo inoculação. O título de vírus por mL de material original é calculado como o número de placas em um poço (ou média de poços múltiplos inoculados com a mesma diluição) vezes a diluição para o poço sendo contada multiplicada por 10.
[0237] Um teste de neutralização de soro por microtitulação-padrão foi empregado neste estudo. Todos os soros foram testados em placas de microtitulação de 96 poços de fundo plano estéreis usando cinco poços por diluição e uma série de diluição de 8 poços para cada um dos 5 poços testados. Cada dos 5 poços de teste continha 25 μL de diluição de soro misturados com 25 μL do vírus indicador e 150 μL de uma suspensão de célula Vero recém-plantada contendo aproximadamente 4 x 104 células. O vírus indicador de teste usado foi WNV NY99. Títulos de anticorpo de soro neutralização são expressos como títulos Ree-Muench ID50.
[0238] Para realização do teste, diluições de duas vezes de cada soro de teste foram feitas em uma placa de microtitulação de fundo plano usando 5 poços de réplica por soro de teste e uma série de diluição de 8 poços. As diluições foram feitas com um instrumento de pipetagem de canal único ou multicanal de volume ajustável usando pontas de microtitulação estéreis, O volume de soro adicionado a cada uma de 5 poços da primeira fileira foi 50 μL. Todos os outros poços continham 25 μL de DMEM (sem FBS). Seguindo diluição serial a jusante da placa, 25 μL foram descartados da última fileira. 25 μL de uma diluição predeterminada do vírus indicador foram adicionados a cada poço de teste. As placas foram então misturadas e incubadas por uma hora a 37° C em CO2 5%. Quando da conclusão do período de incubação, 150 μL de uma suspensão contendo 4 x 104 células Vero foram adicionados a cada poço de teste e controle de célula. As placas foram incubadas a 37° C em uma incubadora de CO2 por 5-7 dias, momento quando as placas foram microscopicamente examinadas quanto a CPE típico de WNV.
[0239] Histopatologia foi avaliada por um Patologista Veterinário Certificado pela Banca. O sistema de classificação usado para descrever defeitos nas pontes ou medula foi como segue:
[0240] Classificação: 0 = nenhuma lesão significante em seção 0,5 = nódulos gliais raros, pequenos, multifocais no parênquima 1 = encefalite leve, não supurativa. Isto é caracterizado por bainhas perivasculares multifocais suaves com células de linfócito e plasma e um neutrófilo raro e nódulos gliais multifocais espalhados compostos de células gliais com algumas células inflamatórias mononucleares. Ocasionalmente dentro deste grau, pode haver bainha perivascular e mais nódulos gliais espalhados moderados. 2 = encefalite não supurativa moderada caracterizada por bainhas perivasculares linfoplasmacíticas moderadas em torno de muitos vasos e acúmulo multifocal de nódulos gliais espalhados pelo parênquima. 3 = encefalite não supurativa severa caracterizada por bainha perivascular linfoplasmacítica severa e espessa com múltiplos nódulos gliais espalhados pelo parênquima.
Resultados e Discussão
[0241] Não houve quaisquer reações adversas à administração da vacina em nenhum ponto de tempo de dosagem. Todos os potros de 4 a 5 meses de vida recebendo a vacina experimental estavam livres de reações adversas ou sistêmicas ou de sítio de injeção no estudo. Isto confirma a excelente segurança da vacina da presente invenção contra antígeno de WNV Dominante da América do Norte contendo WNV preparado de NAEE159 isolado,
PROVOCAÇÃO DE CAVALO COM VÍRUS DO NILO OCIDENTAL HETERÓLOGO VIREMIA
[0242] Cada um dos 10 cavalos de controle (100%) era virêmico por pelo menos 1 dia pós-provocação, enquanto apenas 2 de 20 cavalos (10%) no grupo de vacina de WNV eram virêmicos.
SINAIS CLÍNICOS
[0243] Sete de dez cavalos (70%) no grupo de controle desenvol veram sinais de encefalomielite consistente com infecção pelo Vírus do Nilo Ocidental. Cada um desses animais era virêmico por pelo menos um dia durante o período de provocação. No grupo de vacina de WNV, 1 dos 20 cavalos (5%) desenvolveu sinais consistentes com infecção pelo Vírus do Nilo Ocidental. Notavelmente sinais clínicos progrediram para morte ou eutanásia em 70% dos controles e apenas 5% dos vacinados. Todas as mortalidades de controle foram virêmicas, confirmando encefalite fatal devido a WNV, enquanto apenas um dos animais vacinados que morreu era virêmico durante o período de provocação,
TÍTULOS DE NEUTRALIZAÇÃO DE SORO
[0244] Todos os cavalos vacinados responderam favoravelmente à vacina contra WNV através do desenvolvimento de níveis de proteção de anticorpo de neutralização de soro (SN) seguindo vacinação. Durante um ano seguindo a vacinação, 17 de 20 (85%) dos cavalos vacinados mantiveram títulos de SN de proteção. Em contraste, nenhum dos cavalos de controle desenvolveu títulos de SN altos antes da provocação de WNV virulento. Também, os cavalos vacinados mostraram um aumento anamnéstico em títulos de SN seguindo provocação com WNV virulento.
HISTOPATOLOGIA
[0245] Classificações de severidade foram providas para ambas a medula e as pontes. Também com relação a este parâmetro de eficácia, vacina contra WNV contendo antígeno de WNV Dominante na América do Norte preparado de NAEE159 isolado provou ser altamente eficaz. Dentre os cavalos de controle, 50% mostraram lesões severas de encefalite por WNV enquanto apenas 10% de vacinados foram similarmente afetados,
Discussão e Conclusões
[0246] A vacina contra WNV foi preparada a partir de um isolado viral (Equino Norte-Americano E159) obtido de um cavalo em 2005 durante a pandemia da América do Norte quando um genótipo de WNV dominante específico emergiu. Este genótipo é caracterizado por uma mudança de aminoácido de valina para alanina específica no 159° aminoácido na proteína envelope (E) do vírus (quando comparado com a sequência publicamente disponível para o isolado de WNV-NY99 tendo No. de Acesso ATCC AF196835), que tornou todos tais isolados mais robustos e prolíficos, desta maneira deslocando outros isolados de WNV, e tornando este genótipo dominante dentre os isolados de WNV causadores de doença na América do Norte. Devido ao fato de ser preparada a partir do genótipo dominante, a vacina usada neste estudo é indicativa de segurança e eficácia únicas que podem ser obtidas com vacina preparada a partir de todos os isolados Dominantes da América do Norte com este perfil de proteína E e prolificação resultante. Notavelmente, todas as vacinas contra WNV testadas anteriormente foram preparadas a partir de um isolado menos prolífico de genótipo e sequência de aminoácido de proteína E diferentes, a saber WNV NY99. Com base nesta diferença em sequência de ácido nucleico, sequência de aminoácido de proteína E, prolificação viral e habilidade única em causar uma pandemia, os isolados Dominantes na América do Norte são deslocados ou deslocaram NY99 do ambiente. Os genótipo e fenótipo únicos (prolificação) e, mais importante, a presença ambiental esmagadora de isolados de WNV Dominantes na América do Norte e a ausência de WNV NY99 são evidência grande da superioridade da vacina do Vírus do Nilo Ocidental Dominante da América do Norte. Tal superioridade é confirmada pela segurança e eficácia da vacina conforme demonstrado neste estudo de provocação usando vacina preparada a partir de isolado Dominante na América do Norte de North American Equine E159 (NAEE159) (No. de Acesso ATCC PTA-9409),
[0247] Neste estudo, cavalos de 4 a 5 meses de vida foram seguramente e eficazmente vacinados com uma vacina multicom- ponente para VEWT/WNV/EHV-1/Influenza Equina batelada em uma quantidade de antígeno apropriada com o componente WNV sendo antígeno de WNV Dominante na América do Norte preparado de isolado de NAEE159c (No de Acesso ATCC PTA-9409).
[0248] Cavalos de estudo foram intratecalmente provocados pelo menos 380 dias pós-vacinação de reforço com 105 PFU de uma cepa de Vírus do Nilo Ocidental heterólogo virulento. Os cavalos foram avaliados por 14 dias pós-provocação quanto a sinais clínicos (incluindo temperatura e mortalidade), viremia, títulos de neutralização de soro e classificações histopatológicas de seções das pontes e medula obtidas após eutanásia e necropsia.
[0249] Viremia após provocação e títulos de neutralização de soro eram variáveis-chave de resultado neste estudo que eram altamente indicativas de eficácia da vacina. Os cavalos que tinham sido vacinados mais de um ano antes com VEWT/WNV/EHV-1/Influenza Lote 916 foram 90% protegidos de viremia após provocação neste estudo. Em comparação, 100% de cavalos de controle demonstram viremia pós- provocação. Ainda, títulos de neutralização de soro de cavalos vacinados foram significantemente maiores do que aqueles de cavalos de controle em 14 dias pós-provocação e mostraram uma resposta anamnéstica típica de uma vacina eficaz seguindo provocação com WNV heterólogo, virulento,
[0250] Ainda, a vacina contendo antígeno de WNV Dominante na América do Norte preparada a partir de isolado de NAEE159 reduziu sinais clínicos e mortalidade resultantes de encefalomielite seguindo provocação heteróloga com WNV virulento. A eficácia da vacina pelo menos um ano seguindo a vacinação foi também confirmada através da redução em lesões típicas de infecção por WNV.
[0251] Este estudo demonstrou pela primeira vez que 2 doses da vacina de combinação experimental preparada em doses apropriadas de antígeno incluindo antígeno de WNV Dominante na América do Norte preparado a partir de isolado de NAEE159 administradas a potros de 4 a 5 meses de vida estimularam seguramente, confiavelmente e eficazmente títulos de soro neutralização sorológicos protetores que resultaram em duração de imunidade de pelo menos um ano com proteção contra viremia, sinais clínicos, mortalidade e lesões de encefalite após provocação heteróloga virulenta com Vírus do Nilo Ocidental.
Exemplo 9
[0252] Neste estudo, uma vacina de combinação foi preparada usando um isolado de WNV Dominante na América do Norte, North American Equine E159 (NAEE159) (No de Acesso ATCC, PTA-9409). As amostras de soro pós-segunda vacinação de 14 dias dos porquinhos-da-índia vacinados com esta Vacina de Encefalomielite- Rinopneumonite-Influenza-Vírus do Nilo Ocidental, do Leste, Oeste & Venezuelana, Vírus Morto, Toxoide do Tétano foram coletadas e testadas quanto à neutralização por redução de placa (PRN) de Vírus do Nilo Ocidental. Os soros dos porquinhos-da-índia vacinados foram testados quanto a anticorpo de neutralização para ambos o isolado Dominante na América do Norte de WNV e para isolado de WNV NY99. Notavelmente, a vacina mostrou atividade superior em estimulação de anticorpos de neutralização para WNV Dominante na América do Norte, oposto a WNV NY99. Esses dados apoiam a conclusão da eficácia superior de vacinas contra WNV preparadas a partir de isolados de WNV Dominantes na América do Norte conforme contrastado com vacinas menos eficazes anteriores preparadas a partir de ou baseadas no isolado de WNV NY99.
[0253] Ainda, uma vacina preparada a partir de um isolado adicional Dominante na América do Norte de WNV, North American Donkey E159 (NADE159) vai similarmente demonstrar, conforme acima descrito, a eficácia superior de tais vacinas com relação às vacinas baseadas em NY99. Desta maneira, dados de isolados Dominantes na América do Norte cultivados a partir de espécies de hospedeiro diferentes, se originando de locais únicos da América do Norte, e obtidos em momentos diferentes na América do Norte, vão confirmar a eficácia inesperada, mas superior, de isolados Dominantes na América do Norte de WNV para preparação de vacina.
[0254] Os dados do ensaio de neutralização por redução de placa também estabeleceram que uma vacina preparada a partir de um isolado de WNV Dominante na América do Norte que estimula um título de 1:12 ou maior em porquinhos-da-índia vacinados que provê 50% de redução de placa viral em pelo menos 90% de porquinhos- da-índia vacinados se relaciona à proteção da vacina contra provocação com WNV no cavalo e provê uma duração de imunidade de pelo menos um ano. Dados de vacinação/provocação do Vírus do Nilo Ocidental no cavalo em um nível de inclusão de antígeno de 107,69,0 TCID50 ou mais por dose se relacionavam com esses resultados de título de PRN de porquinho-da-índia e confirmaram a dose de imunização de WNV que provê duração de 1 ano ou mais de imunidade no cavalo. A dose correspondente em porquinhos-da-índia também estimula anticorpos de neutralização de soro para um título de pelo menos 1:12 contra WNV Dominante na América do Norte em porquinhos-da-índia.
[0255] Os dados apresentados neste relatório demonstram coletivamente a eficácia inesperada de vacinas preparadas a partir de isolados de WNV Dominantes na América do Norte, definem a correlação entre eficácia de vacina nos níveis de soro de anticorpo de neutralização de cavalo e porquinho-da-índia, confirmam que um título 1:12 ou maior em porquinhos-da-índia identifica uma vacina equina eficaz provendo pelo menos uma duração de imunidade de um ano e notavelmente demonstra a eficácia superior de vacinas preparadas a partir de WNV Dominante na América do Norte contrastado com WNV NY99.
Materiais e Métodos
[0256] A fim de demonstrar a eficácia do antígeno do Vírus do Nilo Ocidental, preparado usando isolado de WNV Dominante na América do Norte, North American Equine E159 (NAEE159) (ATTC Acesso No. PTA-9409), em uma vacina para Encefalomielite-Rinopneumonite- Influenza-Vírus do Nilo Ocidental, do Leste, Oeste e Venezuelana, Vírus Morto, Toxoide do Tétano e estabelecer uma dose eficaz mensurável em cavalos ou porquinhos-da-índia, estudos de vacinação/provocação de animal hospedeiro foram realizados em conjunto com estudos de vacinação/sorologia de porquinho-da-índia. Neste estudo, amostras de soro 14 dias pós-segunda vacinação de porquinhos-da-índia vacinados com vacina para Encefalomielite- Rinopneumonite-Influenza-Vírus do Nilo Ocidental, do Leste, Oeste e Venezuelana, Vírus Morto, Toxoide do Tétano foram coletadas e testadas. Ainda, um ensaio de neutralização por redução de placa foi desenvolvido para medir o título relacionado com proteção contra provocação no animal hospedeiro. Este título foi determinado ser 1:12 ou mais no porquinho-da-índia.
Formulações de Vacina Séries Experimentais (Vacina de Dose Protetora)
[0257] Séries experimentais foram formuladas para confirmar as especificações de antígeno protetoras para todos os antígenos na vacina. TABELA 22: As vacinas formuladas finais continham os ingredientes que seguem por dose de 1 mL:
Figure img0035
[0258] Série experimental 916 foi formulada para estudos de vacinação de animal hospedeiro. A série experimental 916 é uma vacina multicomponente contendo cepas 1 e 3 de VEWT-WNV-EHV-1 de vírus tipo A2 de influenza equina. A série experimental 916 é batelada em 107,69,2 TCID50/mL de antígeno do West Nile Virus Antigen North American Equine E159 (NAEE159). Ela é uma vacina de dose de 1 mL no cavalo,
[0259] Esta vacina foi também testada em porquinhos-da-índia no momento das vacinações dos animais para confirmar a eficácia de WNV e potência de animal de laboratório. Experimentos de diluição de soro de porquinhos-da-índia de quatro réplicas foram realizados para série experimental 916 para validar o critério de ensaio do porquinho-da-índia para esta vacina de duração de um ano de imunidade (DOI).
Série Experimental 507 (Série de Eficácia Comparativa)
[0260] Dados da Série Experimental 507 são incluídos no relatório para demonstrar que as séries formuladas com um isolado de antígeno de WNV Dominante na América do Norte mostram eficácia superior, medida como títulos de porquinho-da-índia, dos isolados de WNV Dominantes na América do Norte comparado com isolado de NY99 anterior.
Avaliação Sorológica de Porquinho-da-Índia
[0261] Os soros foram testados quanto a anticorpo de WNV como segue: 1) Cepa Indicadora do Vírus do Nilo Ocidental: North American Equine E159 (NAEE159) (No de Acesso ATCC. PTA-9409) & North American Donkey (NADE159) 2) Meio de crescimento para Células Vero em DMEM + FBS 5%, L-glutamina 2 mM e 30 μL de gentamicina 3) Diluente para Soro de Teste é DMEM mais 30 μg/mL de gentamicina 4) Diluente para solução de trabalho de vírus indicador é DMEM + soro de porquinho-da-índia normal 10% (específico para ensaio de WNV) Soros de teste de porquinho-da-índia são diluídos 1:12 7) Uso de 4 mL de cobertura ao invés de 3 mL (específico para ensaio de WNV) 6) 8) Os títulos foram calculados usando redução por placa de 50% 7) 9)Nove de dez porquinhos-da-índia vacinados devem ter um título de anticorpo de > 1:12 para demonstrar eficácia e porquinhos-da-índia negativos devem ser < 1:4 (mesmos critérios que ensaio de VEE em SAM). Resultados e Discussão Avaliação Sorológica para Vírus do Nilo Ocidental Réplica I de Porquinho-da-índia do Nilo Ocidental da Série Experimental 916 Neutralização por Redução de Placa Resultados Usando North American Equine E159 (NAEE159) como Vírus Indicador
[0262] O estudo foi iniciado e os porquinhos-da-índia sofreram sangria 25 dias depois. TABELA 23: Número de Placas/Diluição de Soro
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Valores de Controle de Vírus: 99, 70, 68, 88, 88, 77, 64 Placas Médias de Controle de Vírus: 79 Redução de 50% de Controle de Vírus: 39,5 TABELA 24: Réplica II de Porquinho-da-índia do Nilo Ocidental da Série Experimental 916 Neutralização por Redução de Placa Resultados Usando North American Equine E159 (NAEE159) como Vírus Indicador
[0263] Os porquinhos-da-índia sofreram sangria 35 dias após início do estudo. Número de Placas/Diluição de Soro
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Valores de Controle de Vírus: 99, 70, 68, 88, 88, 77, 64 Placas Médias de Controle de Vírus: 79 Redução de 50% de Controle de Vírus: 39,5 TABELA 25: Réplica III de Porquinho-da-índia do Nilo Ocidental da Série Experimental 916 Neutralização por Redução de Placa Resultados Usando North American Equine E159 (NAEE159) como Vírus Indicador
[0264] Os porquinhos-da-índia sofreram sangria 35 dias após o início. Número de Placas/Diluição de Soros
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Valores de Controle de Vírus: 51, 58, 61, 66, 78 Placas Médias de Controle de Vírus: 62 Redução de 50% de Controle de Vírus: 31 TABELA 26: Réplica IV de Porquinho-da-índia do Nilo Ocidental da Série Experimental 916 Neutralização por Redução de Placa Resultados Usando North American Equine E159 (NAEE159) como Vírus Indicador
[0265] Os porquinhos-da-índia sofreram sangria 30 dias após o início do estudo. Número de Placas/Diluição de Soros
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Valores de Controle de Vírus: 93, 53, 56, 92, 67, 44 Placas Médias de Controle de Vírus: 67,5 Redução de 50% de Controle de Vírus: 33,8
[0266] SÉRIE EXPERIMENTAL 507 (Demonstrando Eficácia Superior de Vacinas para North American Equine E159 (NAEE159) e que outras Vacinas Dominantes Na América do Norte, tal como North American Donkey E159 (NADE 159), vão prover eficácia superior para vacinas de NY99). Avaliação Sorológica de Porquinho-da-índia para Vírus do Nilo Ocidental TABELA 27: Resultados de Neutralização por Redução de Placa de Porquinho-da-índia de Nilo Ocidental de Série Experimental 507 usando Isolado de NY 1999 WNV como Vírus Indicador Número de Placas/Diluição de Soro
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Valores de Controle de Vírus: >24, >15, >14, >16, >18, >20 Placas Médias de Controle de Vírus: >17,8 Redução de 50% em Controle de Vírus: >8,9 TABELA 28: Resultados de Neutralização por Redução de Placa de Porquinho-da-índia de Nilo Ocidental da Série Experimental 507 usando North American Equine E159 (NAEE159) como Vírus Indicador Número de Placas/Diluição de Soro
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Valores de Controle de Vírus: 40, 38, 34, 35, 28, 23 Média de Controle de Vírus: 33 Redução de 50% em Controle de Vírus: 16,5
Discussão e Conclusões
[0267] Porquinhos-da-índia foram vacinados e sorotestados quanto ao anticorpo do Vírus do Nilo Ocidental. Este ensaio estabeleceu que um título de 1:2 em porquinhos-da-índia vacinados se relaciona à proteção em um estudo de vacinação/provocação de cavalo que provê uma duração de pelo menos um ano de imunidade para vacina contra WNV preparada usando um isolado de WNV Dominante na América do Norte, tal como North American Equine E159 (NAEE159),
[0268] Concomitantemente às vacinações de porquinhos-da-índia, vacina contra WNV preparada usando um isolado de WNV Dominante na América do Norte, North American Equine E159 (NAEE159), foi também administrada a cavalos (20 vacinados e 10 de controle) através de imunização primária seguido por imunização de reforço 3 semanas depois. Mais de um ano pós-vacinação reforço, os cavalos foram submetidos à provocação com o Vírus do Nilo Ocidental e foram protegidos quando comparado com controles não vacinados. Os cavalos vacinados foram protegidos de viremia, sinais clínicos, mortalidade e lesões por encefalite após provocação heteróloga virulenta com Vírus do Nilo Ocidental.
[0269] Ainda, os dados confirmaram a eficácia superior de vacinas contra WNV preparadas usando WNV Dominante da América do Norte, oposto às vacinas anteriormente desenvolvidas derivadas de WNV NY99. Os soros dos porquinhos-da-índia vacinados foram testados quanto a anticorpo de neutralização para ambos o isolado de WNV Dominante na América do Norte e para isolado de WNV NY99. Os títulos para isolado ocorrendo com frequência na América do Norte, a saber Dominante na América do Norte (NAEE159), foram consistentemente maiores em porquinhos-da-índia vacinados comparado com títulos para o isolado que não é mais relatado estar presente em nem causando doença em na América do Norte, WNV NY99. Desta maneira, a vacina mostrou atividade superior em estimulação de anticorpos de neutralização para WNV Dominante na América do Norte, oposto ao WNV NY99. Esses dados apoiam a conclusão da eficácia superior de vacinas para WNV preparadas a partir de isolados de WNV conforme contrastado com vacinas menos eficazes anteriores preparadas a partir de ou baseadas no isolado de WNVNY99.
Exemplo 10
[0270] Este Exemplo ilustra as diferenças genéticas entre as cepas de WNV da América do Norte e WNV Dominante da América do Norte, conforme usado na presente invenção, Materiais e Métodos
[0271] Áreas relevantes do genoma de isolados de WNV NY99 e WNV Dominante na América do Norte adequadas para preparação de uma vacina nova, superior, foram sequenciadas e comparadas para confirmar as diferenças genéticas chave. Exemplos de isolados Dominantes na América do Norte usados em preparação de vacina incluem North American Equine E159 (NAEE59) (No de Acesso ATCC. PTA-9409) e North American Donkey E159 (NADE159).
Resultados e Conclusões
[0272] A proteína envelope crítica (E) e a proteína Não estrutural 5 (NS5) foram sequenciadas nesses isolados de WNV usando técnicas de laboratório padrão para determinar as diferenças genéticas em sequência de nucleotídeo contrastado com WNV NY99. Notadamente, os isolados Dominantes na América do Norte, cujos exemplos específicos são North American Equine E159 (NAEE159) e North American Donkey E159 (NADE159), mostraram as mudanças que caracterizam os isolados de WNV Dominantes da América do Norte e os distingue de WNV NY99, a saber, a mutação U para C e a mutação C para U nas posições 142 e 2466, respectivamente, da sequência de nucleotídeo codificando a proteína E e a mutação C para U na posição 9352 na sequência codificando a proteína NS5. As figuras 10-17 mostram os alinhamentos de sequência de várias regiões de isolados. Os alinhamentos na região E são relativos a sequências de referência publicamente disponíveis para um isolado de NY99 (depositado no GenBank como AY590210) e um isolado dominante na América do Norte (isolado WN 02) depositado no GenBank como AY590223. Os alinhamentos na região NS5 são também com relação às sequências de referência publicamente disponíveis para um isolado de NY99 (depositado no GenBank como AY369442) e um isolado Dominante da América do Norte (isolado WN 02) depositado no GenBank como AY369440). Conforme mostrado por esses alinhamentos, os isolados de WNV Dominantes na América do Norte têm as mesmas mudanças de sequência com relação ao isolado de NY99 que aquelas definidas na definição para um isolado de WNV Dominante na América do Norte. Essas sequências são providas aqui como SEQ ID NOs. 1-22, o genoma de comprimento integral de um isolado de WN99 é provido como SEQ ID NO. 23 e a proteína codificada pelo genoma de comprimento integral de SEQ ID NO. 23 é provido como SEQ ID NO. 24,

Claims (10)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um Vírus do Nilo Ocidental morto ou inativado ou qualquer antígeno do mesmo, em que o dito isolado do Vírus do Nilo Ocidental compreende Horse Origin 2005, depositado com a ATCC sob o número de acesso PTA-9409, em que a dita composição imunogênica compreende ainda pelo menos um antígeno de uma ou mais cepas adicionais selecionadas do grupo consistindo em Vírus da Encefalomielite Equina do Leste, depositada com a ATCC sob o número de acesso PTA-9412, Vírus da Encefalomielite Equina do Oeste, depositada com a ATCC sob o número de acesso PTA-9410 e Vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, depositada com a ATCC sob o número de acesso PTA- 9411, Toxoide do Tétano e combinações dos mesmos, e em que a dita composição imunogênica compreende ainda excipientes ou veículo farmacêutico adequados, em que os ditos excipientes ou veículo farmacêutico é/são selecionados do grupo consistindo em um diluente, adjuvante, agente antimicrobiano, agente de inativação e combinações dos mesmos.
2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita composição imunogênica compreende pelo menos um antígeno ou uma cepa adicional do Vírus do Herpes Equino, em que o dito Vírus do Herpes Equino é selecionado do grupo consistindo em cepas depositadas com a ATCC sob o número de acesso PTA-9525 ou PTA-9526 e combinações dos mesmos.
3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita composição imunogênica compreende pelo menos um antígeno ou uma cepa adicional do Vírus da Influenza Equina, em que o dito Vírus da Influenza Equina é selecionado do grupo consistindo em Influenza/Equine -2/Ohio/03, Influenza/Equine- 2/KY/95, Influenza/Equine-2/New Market/2/93 e combinações dos mesmos, e depositadas com a ATCC sob No. de Acesso PTA-9522, PTA-9523 ou PTA-9524 e combinações dos mesmos.
4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que qualquer uma das cepas está presente em uma quantidade a partir de 102,0 TCID5o/mL - 1010,0TCID5o/mL por dose.
5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito adjuvante é selecionado do grupo consistindo em um polímero de ácido acrílico ou metacrílico, óleo não metabolizável e combinações dos mesmos.
6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a dita composição imunogênica é segura para uso em potros ou cavalos de 4 meses de vida ou mais velhos.
7. Uso de uma ou mais cepas do Vírus do Nilo Ocidental morto ou inativado ou qualquer antígeno do mesmo compreendendo Horse Origin 2005, depositado com a ATCC sob o número de acesso PTA-9409, caracterizado pelo fato de ser para preparação de uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para redução da incidência ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados a ou causados pelo Vírus do Nilo Ocidental em um animal ou um rebanho de animais com necessidade da mesma.
8. Uso de uma ou mais cepas do Vírus do Nilo Ocidental morto ou inativado ou qualquer antígeno do mesmo compreendendo Horse Origin 2005, depositado com a ATCC sob o número de acesso PTA-9409, caracterizado pelo fato de ser para preparação de uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para redução da incidência ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados a ou causados por um ou mais patógenos selecionados do grupo consistindo em Vírus do Nilo Ocidental, Vírus da Encefalomielite Equina do Leste, Vírus da Encefalomielite Equina do Oeste, Vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana e Clostridium tetani em um animal ou um rebanho de animais com necessidade da mesma.
9. Uso de uma ou mais cepas do Vírus do Nilo Ocidental morto ou inativado ou qualquer antígeno do mesmo compreendendo Horse Origin 2005, depositado com a ATCC sob o número de acesso PTA-9409, caracterizado pelo fato de ser para preparação de uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 6 para redução da incidência ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados a ou causados por um ou mais patógenos selecionados do grupo consistindo em: Vírus da Encefalomielite Equina do Leste, Vírus da Encefalomielite Equina do Oeste, Vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, Vírus do Herpes Equino e Clostridium tetani em um animal ou um rebanho de animais com necessidade da mesma.
10. Uso de uma ou mais cepas do Vírus do Nilo Ocidental morto ou inativado ou qualquer antígeno do mesmo compreendendo Horse Origin 2005, depositado com a ATCC sob o número de acesso PTA-9409, caracterizado pelo fato de ser para preparação de uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 6 para redução da incidência ou diminuição da severidade de sintomas clínicos associados a ou causados por um ou mais patógenos selecionados do grupo consistindo em: Vírus do Nilo Ocidental, Vírus da Encefalomielite Equina do Leste, Vírus da Encefalomielite Equina do Oeste, Vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, Vírus do Herpes Equino, Vírus da Influenza Equina e Clostridium tetani em um animal ou um rebanho de animais com necessidade da mesma.
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