JP2018527317A - ワクチン組成物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ジカウイルス抗原を免疫原性組成物中にジカ抗原とチクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルス抗原などの１又は２以上のアルボウイルス抗原との組合せで含むジカウイルス感染の予防及び治療のためのワクチン組成物、上に述べた病原体に対して哺乳動物において免疫応答を誘発するためのワクチンとしての使用のためのそのような組成物の調製方法及び産生の方法を提供する。

Description

本発明は、哺乳動物におけるジカウイルス感染の予防及び治療のためのジカウイルス抗原を含むワクチン組成物を開示する。本発明は、チクングニア及び／又は日本脳炎ウイルス抗原などの１又は２以上のアルボウイルス抗原と共にジカウイルス抗原を含む安定なワクチン組成物も開示する。本発明は、哺乳動物において上に述べた病原体それぞれへの免疫応答を同時に誘発するための、及びヒト対象を免疫化するために好適なこれらのワクチン組成物の調製、製剤化及び使用の方法にも関する。
現在、ジカウイルス感染に対する予防又は治療のために入手できるワクチンは世界にない。したがって、本出願において開示する本発明に関連する先行技術はない。しかし、本発明の背後にある背景及び目的の一般的理解のために、以降、下の段落で考察する。
本特許出願の発明者らは、ヤブカ属蚊（Aedes mosquitoes）、特にウイルスを伝播するネッタイシマカ（Aedes aegypti）が高度に蔓延している地域においてジカウイルスの流行可能性を予測している。ジカワクチンプロジェクトが早期に、２０１５年１２月にジカウイルス感染とギラン・バレー症候群との及び小頭症との因果関係が公知となる数カ月前に開始することに関心を持ったのは、ブラジルなどの国々において継続しているウイルス伝播を止めるため、及びジカウイルスの危険性がある国々におけるさらなる伝播を予防するためのワクチンを開発する準備ができている国が世界になく、またその時点で誰も処置を開始していなかったことによるものであった。ウイルス伝播が継続している地域へ及びそれらの地域からの外国旅行の増加は、ヤブカ属蚊、特にネッタイシマカが高度に蔓延している国々及びウイルス曝露されていない多くの無感作人口を有する国々での大流行が始まる大きな危険性をもたらしている。特徴的な高熱、斑状丘疹性皮疹及び関節痛を有する初期段階でのジカウイルス感染の臨床像は、チクングニア及びデングウイルス感染の初期発症症状に著しく類似しており、鑑別診断を特に困難にしている。
ジカウイルスワクチンプロジェクトは、ウイルス病態形成、遺伝的多様性、伝播、診断、防御に関する血清学的相関又はワクチンコンセプトを検査するための動物モデルについて利用可能な情報が僅かにすぎない、又は情報がなかった時期に開始された。ワクチンの観点から、その時点で公表されていた情報は、マウス脳においてウイルスを継代することに関連していたが、これはワクチン産生物のために好適でないため、ウイルスがインビトロで細胞基質において培養できるかどうか及び可能な場合、どの細胞基質が最も好適であるか、細胞への順応の機序、潜在的ウイルス力価並びにヒトへの投与のためにワクチン産生物を製造する実現可能性について情報がなかった。Bharat Biotech社は、ジカワクチンプロジェクトを２０１４年後半に始めるためのステップを開始し、この前記特許出願をもたらす実験作業をその後すぐに開始した。
アルボウイルス（節足動物媒介）感染は、蚊などの節足動物によって広げられるウイルスによって生じる。それらは、軽度の、無症候性感染から急性脳炎又は致死性である場合がある出血熱までの顕著なヒトの疾病を引き起こす。ヒトの疾病を生じる最も顕著なアルボウイルスは、３つのウイルスファミリー、トガウイルス科（Togaviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）及びブニヤウイルス科（Bunyaviridae）に属している。アルボウイルス感染は、発展途上国において蔓延しており、深刻な死亡率を特に高齢者において生じる。デング、チクングニア、ジカ、日本脳炎及びウエストナイルウイルスによって生じるアルボウイルス感染の一般的な特徴的特性は、とりわけ、ウイルス感染の急性期での発熱、頭痛、筋肉痛、腫脹を伴う関節痛及び斑状丘疹状皮疹である。関節痛は、チクングニア、デング及びジカウイルス発熱の特に特徴的な特性である。同時感染は、アルボウイルスがヤブカ属蚊によって伝播される例えばデング、チクングニア及びジカウイルスなどと同じ蚊ベクターを広く共有していることから、一般的である。日本脳炎ウイルス及びウエストナイルウイルスは、イエカ属（Culex）蚊によって主に伝播される。問題は、蚊ベクター制御プログラムが有効でなく、広く失敗に終わっている発展途上国において緊急である。問題は、疾患を生じるウイルスを確実に診断するために利用可能な確固たる診断法がないという事実によって悪化している。外国旅行がこれらの感染性因子の広範な伝播を促進しており、デング及びチクングニアなどのこれまで熱帯の国に閉じ込められていた疾患は、今や地理的に新たな地域及び温帯地域に広がっている。ジカウイルスは、過去２年間に６５を超える国に広がったと報告されている。これらの地域の数カ国で報告された、現地における集団発生は、蚊ベクターの局所集団によって維持されている。
ジカウイルス（ＺＩＫＶ、Zika virus）は、フラビウイルス科ファミリーに属する新興人獣共通感染症アルボウイルスである。デング及びチクングニアウイルスと同様にジカウイルスは、ヤブカ属蚊、さらに具体的にはＡ．フルシファー（A. furcifer）、Ａ．タイロリ（A. taylori）、Ａ．ルテオセファルス（A. luteocephalus）、Ａ．アフリカヌス（A. africanus）、ヒトスジシマカ（A.albopictus）及び主にネッタイシマカによっても伝播され得る。ポリネシアなどの近年流行が報告された国々への観光旅行は、ウイルス感染のブラジル、コロンビア、イタリア及び他の国々への地理的拡散を助けた。ウイルスの自発性の大流行は、局地的に確立されたヤブカ属蚊によって生じたことがイタリアで報告された。アジアではジカウイルス感染は、カンボジア、タイ、インドネシア、マレーシア及びバングラデシュにおいて散発的に発生する一方で、大流行はこれらの地域では報告されていない。
チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ、Chikungunya virus）は、トガウイルス科ファミリーのアルファウイルス（Alphavirus）である。ウイルスは、高熱、頭痛、筋肉痛、関節痛、関節の腫脹及び斑状丘疹性皮疹の急な発症によって特徴付けられる自然治癒する熱性感染を生じる。出血、劇症肝炎及び神経症状などの重篤な症状が、最近の流行では報告された。チクングニアウイルスは、ネッタイシマカ及びヒトスジシマカの両方の蚊によって伝播される。日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ、Japanese encephalitis virus）もフラビウイルス科ファミリーのフラビウイルスであり、主にイエカ属の蚊によって伝播される。ＪＥＶは、デング、黄熱ウイルス、ジカウイルス及びウエストナイルウイルスに関連する。ＪＥＶ感染は、ほとんどが無症候性であるが、一般に発熱を伴う倦怠感、頭痛及び他のインフルエンザ様症状を生じる。まれに臨床的感染は、発作、痙性麻痺、昏睡及び死亡を伴う脳炎に進行する。小児は特に感染しやすい。ＪＥＶが流行している国々では、大部分の成人は小児期の感染後に自然免疫を有している。小児期に感染に曝されなかった成人は、年齢を問わず感染しやすい。脳炎によって生じるＪＥＶでの致死率は、３０％に達する場合がある。神経学的合併症又は神経学的続発症は、脳炎を伴う症例において高い割合で生じる。地球規模で約３０億の人々が、ＪＥＶ感染の危険がある。ＪＥＶ感染の予防のためにいくつかのワクチンが良好に商品化されている。デングウイルス（ＤＥＮＶ、Dengue virus）は、フラビウイルス科ファミリーの一員である。アルボウイルス感染は、それらが現在地理的に広範囲に及び、世界の多数の地域で重要な公衆衛生の問題となっていることから、もはや地域特異的であるとは見なすことはできない。前述のアルボウイルス感染によって生じる疾病率が通常高いこと及び特に関節痛は、患者の身体的移動性に悪影響を与える。ジカウイルスは、妊娠中の感染でさらに深刻な先天性出生時奇形を生じ、ジカ関連ギラン・バレー症候群は、継続的に流行していることが確認されている。任意の他のウイルス感染と同様に、特異的な治療薬はない。予防的ワクチン接種は、ジカウイルス伝播を有効に遮断でき、ワクチンはジカウイルス疾患からの防御の最前線である。この点を考慮して、流行が継続している国々及び活発なジカウイルス伝播がまだ報告されていない国々の無感作の人々を保護するために、ジカウイルスのさらなる伝播を妨げるために効果的な戦略が開発された。アルボウイルス感染に対する混合ワクチンは、デング、チクングニア、ジカ、日本脳炎、ウエストナイル及び黄熱ウイルスによって生じる衰弱性疾病から脆弱な人々を保護するためのよい戦略である。ＪＥＶ、黄熱のためのワクチン及びデング血清型のためのものは商品化されており、ウエストナイル及びＣＨＩＫＶのためのものは臨床開発中である。ジカウイルス感染に対するワクチンはまだなく、本発明は最初の候補ジカワクチンの開発のための方法を開示する。
しかし、そのようなワクチンキットに含める抗原の選択は、いくつかの因子に依存している。デング血清型によって生じるウイルスの抗体依存性感染増強は、十分に調査され、公表されており、フラビウイルス抗体の交差反応性についても同様である。しかし明らかになっていないのは、ジカウイルスに冒された同じ集団において広まっているチクングニア抗体にそのような干渉又は交差反応性があるかどうかである。同様に日本脳炎ウイルスに対する抗体がジカウイルスに対する免疫を発達させるときに抗原の干渉を生じるかどうかは公知でなく、これを研究するというのは興味深い考えであった。提案された作業は、流行しているＪＥ及びＣＨＩＫＶ抗体によって候補ジカワクチンに対して生じる、すべての可能性がある免疫干渉への洞察も提供する。
本発明において候補ジカウイルスワクチンが開発され、ジカウイルス疾患に対して防御するための適切なレベルの免疫応答を誘発するように種々の製剤で効力について検査された。混合ワクチンとして同時投与又は配合された場合に日本脳炎ウイルスワクチン及びチクングニアウイルスワクチンによってジカ誘発免疫応答には顕著な抗原の干渉がなかったことから、製剤はそれぞれのウイルスに対する防御を付与できる高レベルの中和抗体を誘発することに有効であった。
本発明の１つの目的は、ジカウイルス感染の予防及び治療のために安定な免疫原性組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、Vero細胞におけるジカウイルスの順応及び増殖のための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、不活化ジカウイルスワクチンの調製及びジカウイルスバルク抗原の精製のための方法を提供することである。
本発明のさらに１つの目的は、ホルマリン、ベータプロピオラクトン及び過酸化水素での化学的手段によるジカウイルス不活化のための方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、熱、ガンマ照射及び紫外線などの物理的手段によるジカウイルス不活化のための方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、prMEタンパク質を含む組換えジカウイルス抗原の調製及び製剤化並びに動物において免疫原性について検査するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、さまざまなアジュバントを含むジカウイルス抗原の製剤化及び動物における製剤への免疫応答の概算のための方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、単一用量、２及び３用量のホルマリン及びＢＰＬ不活化ジカウイルスワクチンに対する動物における免疫応答の動態を提供することである。
本発明のさらに１つの目的は、ジカウイルス感染及びチクングニアウイルス感染の予防のための免疫原性組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、ジカウイルス感染、チクングニアウイルス感染及び日本脳炎ウイルス感染の予防のための免疫原性組成物を提供することである。
本発明は、ジカウイルス感染並びにチクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルスなどの他のアルボウイルスによって生じる感染の予防及び治療のための組成物及びワクチン製剤の製造方法を対象とする。
一態様では本発明は、ジカウイルス感染の予防及び治療のためのワクチン組成物であって、免疫原性組成物中にジカウイルス抗原を含み、好適なアジュバント及び賦形剤と共にチクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルス抗原などの１又は２以上のアルボウイルス抗原も含み得る、ワクチン組成物を対象とする。
別の態様では本発明は：
（ａ）ジカウイルス培養のための細胞基質としてVero細胞株を使用すること
（ｂ）１０Ｌの採取容量までジカウイルス培養を大規模化すること
（ｃ）ウイルス培養物を不活化すること
（ｄ）ウイルス培養物を精製すること
（ｅ）別の態様ではジカウイルスprMEタンパク質を組換えクローニング及び発現させること
を含む工程によってワクチン製剤を得る方法を対象とする。
本発明の一実施形態ではVero細胞株は、ジカウイルスの培養のための細胞基質として使用され、血清を使用する又は使用しない培養培地において増殖された。
本発明の別の実施形態ではジカウイルスは、高力価を得るためにVero細胞での反復する連続継代によって順応された。
本発明の別の実施形態ではジカウイルスは、C6/36ヒトスジシマカ細胞において継代され、力価を増加させるためのVero細胞での増殖が続いた。
本発明の別の実施形態では、ウイルス培養を大規模化するため及び大規模ウイルス培養物をさらに精製するための工程であって、採取容積が約８〜１０Ｌであった工程が開示される。ウイルス採取物は、種々の方法を使用して不活化された。次いでウイルスは精製された。
本発明の別の実施形態では不活化法は、ウイルス安定化剤及びアミノ酸存在又は非存在下でのホルマリン不活化、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ、Beta Propiolactone）不活化、熱不活化、ＵＶ不活化、ガンマ不活化の群から選択される。
本発明の好ましい実施形態ではアミノ酸は、群Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン及びＬ−アスパラギン酸及びＬ−グルタミン及びヒト血清アルブミンから個々に又は組み合わせて選択される。
本発明の別の好ましい実施形態では精製方法は、塩勾配でのセルファインサルフェート、DEAE-Sephadex CM-sephadexの使用による、Captocore-700、セファロースCL-4Bでのゲルろ過による、０．２Ｍ〜０．８Ｍリン酸の勾配でのセラミックヒドロキシアパタイトカラム、続くダイアフィルトレーション、及び２０〜６０％ショ糖勾配での超遠心分離から選択され、最も好ましくはCapto core700カラムによる。
本発明の別の実施形態は、組換えクローニングを対象とし、ジカウイルスprMEタンパク質の発現が提供される。組換えクローニング法は、大腸菌（E.coli）で増殖され、昆虫細胞で発現されるバキュロウイルスシャトルベクターへの、クローニングされた挿入物を含む発現カセットの部位特異的転位を利用する。
本発明の別の実施形態ではワクチン製剤が提供される。ワクチンは、ジカウイルス、チクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルスから選択される１又は２以上のアルボウイルス抗原から構成されてよい。
別の実施形態ではアジュバントは、アルミニウム塩、イヌリン、アルガムリン、イヌリンと水酸化アルミニウムとの合剤、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ、monophosphoryl lipid A)、レシキモイド、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ、muramyl dipeptide）、Ｎ−グリコリルジペプチド（ＧＭＤＰ、N-glycolyl dipeptide）、ポリＩＣ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、レシキモド、ＭＰＬを含む水酸化アルミニウム、任意の油中水乳剤、次の成分の１若しくは２以上を含有する任意の水中油乳剤：スクアレン若しくはそのアナログ若しくは任意の薬学的に許容される油、tween-80、ソルビタントリオレート、アルファ−トコフェロール、コレカルシフェロール若しくはその分子の任意のアナログ及び誘導体又はリン酸カルシウム又はアジュバントの任意の組合せ、の群から選択されてよい。
本発明の別の実施形態では製剤は、賦形剤及び保存剤を含む形で調製される。
本発明の別の実施形態ではワクチン製剤中の安定化剤は、ソルビトール、Ｌ−グリシン、マンニトール、Ｌ−グルタミン酸及びヒト血清アルブミンの個々又は組合せが種々の濃度で使用され、それらを研究するために使用された。
本発明の別の実施形態ではワクチン製剤の効力は、広範な用量にわたってウイルス血症からの完全防御を示すために動物モデルにおいて検査された。
本発明の別の実施形態では混合ワクチン製剤は、日本脳炎及びチクングニアウイルスに対する適切な防御を提供することにも有効であった。
本発明の別の実施形態では抗血清は、ウイルス血症に対して完全防御を提供するジカウイルス感染に対する受動免疫をウサギに付与する一方で、対照動物ではウイルス感作後６日間続くウイルス血症が検出された。
本発明の別の実施形態では候補不活化ジカウイルスワクチンは、単一用量、又は２用量以上のいずれかとして筋肉内経路によって投与されてよい。
本発明の別の実施形態では中和抗体力価についてのアッセイは、高レベルの中和抗体を誘発することが示されている本発明のワクチン製剤に対する抗体レベルを検査するために実施された。
本発明の別の実施形態では交差中和研究は、本発明の不活化ワクチン製剤が、任意のジカウイルス株に対して同等に防御的で強力であることを示した。
本発明の別の好ましい実施形態ではＢＰＬ不活化及びホルマリン不活化ジカワクチン製剤の両方への抗体力価は、抗原単独よりも水酸化アルミニウムを含む方が高かった。
本発明の別の実施形態では、抗体アビディティーアッセイによる本発明のワクチン製剤への抗体応答の性質は、高親和性抗体が追加用量で経時的に生じたことを示した。
したがって本発明は、ジカウイルス、チクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルスから選択される１又は２以上のアルボウイルス抗原を含む安定なワクチン組成物であって、前記抗原が、薬学的に許容される緩衝剤中にアジュバントを含む又は含まない形で製剤化されており、ワクチン組成物が、哺乳動物においてそれぞれのウイルスに対する防御免疫応答を誘発する、安定なワクチン組成物を提供する。組成物のジカウイルス抗原は、ジカウイルスの任意の遺伝子型／遺伝子型バリアント／株に対する治療、診断及び予防において有効であり、組成物は、ゲノムの任意領域においてアミノ酸レベルで約５０％〜１００％の間の任意の同一性を共有している任意の遺伝子型／遺伝子型バリアント／株／合成ジカウイルスに対して有効である。本発明の組成物は、任意の遺伝子型／遺伝子型バリアント／株／合成ジカウイルスのジカウイルス抗原を含み、任意の前述のジカウイルス型に対する抗体は、同種ウイルス又は、全ゲノムの任意の領域、特にエンベロープＥタンパク質において少なくとも５０％〜１００％アミノ酸同一性を共有している任意の異種ジカウイルス株を交差中和する。
組成物のジカウイルス、チクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルスの抗原は、不活化全ビリオン（ウイルス）抗原である。一方ジカウイルス抗原及びチクングニアウイルス抗原は、精製組換え抗原である。
本発明のジカウイルス抗原は、ウイルスをVero細胞に順応することによってVero細胞を細胞基質として使用して調製される。
本発明の組成物のジカウイルス抗原は：
ａ．超遠心分離；
ｂ．密度勾配遠心分離；
ｃ．膜ろ過を使用するウイルス採取物の清澄化、及びそれに続くカラムクロマトグラフィーによる精製；並びに
ｄ．１００ｋＤａ〜３００ｋＤａのカットオフを有する膜を使用するタンジェンシャルフローろ過であって、タンジェンシャルろ過が、ウイルス不活化の前又は後に実行される、タンジェンシャルフローろ過
から選択される１又は２以上の方法から得られた精製及び濃縮抗原である。
ここでカラムクロマトグラフィーによる精製は、ゲルろ過、混合モードレジンカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティマトリクスクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。カラムクロマトグラフィーは、ウイルス抗原の大部分をCapto core700など、最も好ましくはCapto core700のフロースルーに溶出し、ウイルス試料はCapto core700カラムで精製され、フロースルーに溶出される。
組成物のジカウイルスは、化学的不活化剤、物理的不活化剤及び照射剤の少なくとも１又は２以上によって不活化され、ジカウイルスの不活化はウイルスの精製の前又は後に実行される。例示的実施形態ではジカウイルスは、ホルマリン（ホルムアルデヒド）、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）及び過酸化水素から選択される化学的不活化剤によって不活化される。
好ましい一実施形態ではジカウイルスは、次の：
ａ．ホルマリン：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、８℃〜３７℃、好ましくは２５±３℃、少なくとも１〜７日間でのホルマリン処置
ｂ．ホルマリン：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、２℃〜８℃、少なくとも１０〜３０日間でのホルマリン処置；
ｃ．ベータプロピオラクトン（以下ＢＰＬ）：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、少なくとも２４〜４８時間、温度範囲８℃〜３０℃、好ましくは２５±３℃、４８時間でのベータプロピオラクトン；
ｄ．１：５００〜１：４０００まで（ＢＰＬ、：ウイルス、ｖ／ｖ）の範囲の任意の濃度、２℃〜８℃、少なくとも３〜７日間でのベータプロピオラクトン；
ｅ．前述のいずれかの条件でのＢＰＬとホルマリンとの組合せ、好ましくは１：３０００（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）、２４時間のＢＰＬ不活化、及びそれに続く１：３０００（ホルマリン：ウイルス、ｖ／ｖ）、２４〜４８時間、１５℃〜３０℃、好ましくは２５±３℃でのホルマリン不活化；
ｆ．０．１〜３％、好ましくは０．１〜１％の任意の濃度、２０〜３０℃の任意の温度、５分間〜１２０分間での過酸化水素
から選択される方法のいずれか１つによって不活化される。
一実施形態では照射剤によるジカウイルスの不活化は、６０Ｃｏ源からの２０ｋＧｙ（キロＧｒａｙ）〜３５ｋＧｙまで、好ましくは２５ｋＧｙ〜３０ｋＧｙの曝露によるガンマ照射による不活化を含む。
別の実施形態では照射剤によるジカウイルスの不活化は、２５４ｎｍへの３０〜６０分間曝露によるＵＶ照射による不活化を含む。
さらなる実施形態ではウイルスは、温度５０℃〜６５℃の間、３０分間〜２時間までの熱処置によって不活化される。
本発明において使用される緩衝剤は、緩衝剤の１つとして、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸クエン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）含有緩衝剤、コハク酸緩衝剤、グリシン又はヒスチジンを含有する緩衝剤を含む一覧から選択されてよく、リン酸緩衝剤はリン酸イオン濃度５ｍＭ〜２００ｍＭまで、６．５０〜ｐＨ９の任意のｐＨ、任意選択で塩化ナトリウムを５０〜２００ｍＭの濃度で含有するリン酸ナトリウム緩衝液である。緩衝剤は、ウイルス培養から精製された不活化ウイルスバルクの調製までのバイオプロセス全体を通じて液体組成物中でｐＨ６．５を超える、好ましくはｐＨ７．０を超えるｐＨを維持する。
一実施形態ではジカウイルスの不活化は、乳糖、ショ糖、トレハロース、マルトース、マンノース、イソ−マルトース、ラフィノース、スタキオース、ラクトビオース、ソルビトール、マンニトール、ラクトビオン酸、デキストラン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸及びヒト血清アルブミン又はそれらの組合せ、から選択される安定化剤の存在下で実行される。しかし好ましい一実施形態では安定化剤は：
ａ．２％ソルビトール及び１％ Ｌ−グリシン；
ｂ．１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；
ｃ．１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；
ｄ．１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グルタミン酸；並びに
ｅ．１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン、１％ヒト血清アルブミン．
から選択されてよい。
例示的実施形態ではジカウイルスの不活化は、任意の遺伝子型／株、生弱毒化ジカウイルス、非活化ウイルス、ウイルス様粒子、任意のジカウイルス抗原、特にＥタンパク質を任意の異種ウイルス骨格、ベクター化ワクチン中に保有するキメラウイルス粒子、及び任意のジカウイルスゲノムの配列を使用してインビトロ又はインビボで派生させた感染性合成ウイルス粒子の不活化を含む。
本発明の精製された組換えジカウイルスは、ジカウイルス感染の予防のために免疫応答を誘発するためのワクチン抗原としてエンベロープ（Ｅ、envelope）タンパク質、膜（Ｍ、membrane）タンパク質及び任意選択で非構造１（ＮＳ１、non-structural 1）タンパク質を含むジカウイルスの抗原を含み、ここでジカウイルスは、配列番号１及び配列番号２のヌクレオチド配列にそれぞれ対応する配列番号３及び配列番号４に開示の構造タンパク質配列を、遺伝子型又はそのバリアントによって生じるジカウイルス感染に対するワクチン抗原としての使用のために有する。組換えＤＮＡコンストラクトは、（ｉ）ベクター（ii）配列番号３及び配列番号４と少なくとも７０％アミノ酸同一性を共有している任意のジカウイルスタンパク質配列に適用できる、配列番号３、配列番号４のタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれコードしている配列番号１又は配列番号２に対応する少なくとも１つの核酸断片を含む。本発明の組成物は、組換えＤＮＡコンストラクトを含み、ここでベクターは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ、virus like particle）としての昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルスなどの真核宿主中にクローニングされている真核プラスミドベクターである。
ジカウイルスの組換えタンパク質は：
ａ．組換えプラスミドＤＮＡを昆虫細胞にトランスフェクトするステップ；
ｂ．細胞を採取するステップ及びそれから組換えタンパク質を単離するステップ；
ｃ．イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、混合モードレジンクロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、超遠心分離、密度勾配遠心分離及び塩での分画から選択される方法によってタンパク質を精製するステップ
を含む工程によって得られる。
ジカウイルスの構造抗原は、昆虫細胞におけるバキュロウイルス媒介発現を含む任意の原核又は真核発現系において発現される。
本発明のワクチン組成物は、中和抗体が最適には不活化ウイルス、生弱毒化ウイルス、非活化ウイルス、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子、ベクター化ワクチン中などの任意の異種ウイルス骨格においてジカウイルスＥタンパク質を提示するキメラウイルス粒子、及び任意のジカウイルスゲノムＲＮＡ配列から派生させた合成ウイルス粒子などにおいてエンベロープタンパク質に対して主として誘発される工程によって得られる。
本発明のワクチン組成物は、アジュバントをさらに含んでいてよく、アジュバントは、ａ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸リン酸を含むアルミニウム塩；ｂ）イヌリン；ｃ）イヌリンと水酸化アルミニウムとの合剤であるアルガムリン；ｄ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）；ｅ）レシキモド；ｆ）ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ｇ）Ｎ−グリコリルジペプチド（ＧＭＤＰ）；ｈ）ポリＩＣ；ｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ｊ）ＭＰＬを含む水酸化アルミニウム；ｋ）任意の油中水乳剤；ｌ）次の成分の１又は２以上を含有する任意の水中油乳剤：スクアレン又はそのアナログ又は任意の薬学的に許容される油、tween-80、ソルビタントリオレート、アルファ−トコフェロール、コレカルシフェロール及び水性緩衝剤、又はその分子の任意のアナログ及び誘導体 ｉ）ジカウイルス抗原と共に製剤化された場合にウイルスに対する免疫応答を誘発する前述のアジュバントの任意の２つ又は３つ以上の組合せ、からなる群から選択される。好ましい一実施形態では組成物は、ワクチン用量あたりアルミニウム０．１ｍｇ〜１．５ｍｇ、好ましくはワクチン用量あたりアルミニウム０．２５ｍｇ〜０．５ｍｇの範囲の濃度で水酸化アルミニウムを含む。
本発明の組成物のアジュバントは、哺乳動物に投与された場合に粘膜免疫及び全身性免疫を付与する。
ジカウイルス抗原を含むワクチン組成物は、哺乳動物において免疫応答を誘発するために単一用量又は２又は３用量以上としてのいずれかでアジュバントを含む又は含まない形で用量あたり０．１２５μｇ〜１００μｇの範囲の任意の用量で投与される。
一実施形態では本発明は、筋肉内、皮内、皮下、静脈内、経口、鼻腔内又は経皮経路を含む任意の経路によって請求項１に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、ヒトを含む哺乳動物において防御免疫応答を誘発する方法を提供する。
本発明の組成物は、プレフィルドシリンジを含む針及びシリンジ、マイクロニードルパッチ、無針パッチ、吸入並びに点鼻薬を含む任意の方法によって投与されてよい。
本発明は、ジカウイルス感染に対する免疫診断及び免疫治療剤の調製のためのジカウイルス抗体の組成物のインビトロ又はインビボ使用法も提供する。
一実施形態ではワクチン組成物は、それぞれのウイルスに対して哺乳動物において防御免疫応答を誘発するジカウイルス及び日本脳炎ウイルス抗原を混合ワクチン中に含み、ここでジカウイルス抗原及び日本脳炎ウイルス不活化抗原は、アジュバントを含む又はアジュバントを含まない薬学的に許容される製剤において各抗原５μｇ〜５０μｇの範囲の濃度で混合ワクチン中に存在する。
アジュバントは、
ａ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸リン酸を含むアルミニウム塩；ｂ）イヌリン；ｃ）イヌリンと水酸化アルミニウムとの合剤であるアルガムリン；ｄ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）；ｅ）レシキモド；ｆ）ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ｇ）Ｎ−グリコリルジペプチド（ＧＭＤＰ）；ｈ）ポリＩＣ；ｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ｊ）ＭＰＬを含む水酸化アルミニウム；ｋ）任意の油中水乳剤；ｌ）次の成分の１又は２以上を含有する任意の水中油乳剤：スクアレン若しくはそのアナログ若しくは任意の薬学的に許容される油、tween-80、ソルビタントリオレート、アルファ−トコフェロール、コレカルシフェロール及び水性緩衝剤、又はその分子の任意のアナログ及び誘導体ｉ）ジカウイルス抗原と共に製剤化された場合にウイルスに対する免疫応答を誘発する前述のアジュバントの任意の２つ又は３つ以上の組合せ、からなる群から選択されてよい。好ましい一実施形態ではアジュバントは、ワクチン用量あたり０．２５ｍｇ〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量を有する水酸化アルミニウムである。
別の実施形態ではワクチン組成物は、それぞれのウイルスに対して哺乳動物において防御免疫応答を誘発するジカウイルス及び日本脳炎ウイルス抗原を混合ワクチン中に含み、ここでジカウイルス抗原及びチクングニアウイルス抗原は、アジュバントを含む又はアジュバントを含まない薬学的に許容される製剤において各抗原５μｇ〜５０μｇの範囲の濃度で混合ワクチン中に存在する。
アジュバントは、
ａ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸リン酸を含むアルミニウム塩；ｂ）イヌリン；ｃ）イヌリンと水酸化アルミニウムとの合剤であるアルガムリン；ｄ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）；ｅ）レシキモド；ｆ）ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ｇ）Ｎ−グリコリルジペプチド（ＧＭＤＰ）；ｈ）ポリＩＣ；ｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ｊ）ＭＰＬを含む水酸化アルミニウム；ｋ）任意の油中水乳剤；ｌ）次の成分の１又は２以上を含有する任意の水中油乳剤：スクアレン又はそのアナログ又は任意の薬学的に許容される油、tween-80、ソルビタントリオレート、アルファ−トコフェロール、コレカルシフェロール及び水性緩衝剤、又はその分子の任意のアナログ及び誘導体ｉ）ジカウイルス抗原と共に製剤化された場合にウイルスに対する免疫応答を誘発する前述のアジュバントの任意の２又は３つ以上の組合せ、からなる群から選択されてよい。好ましい一実施形態ではアジュバントは、ワクチン用量あたり０．２５ｍｇ〜１．５ｍｇのアルミニウム含有量を有する水酸化アルミニウムである。
別の実施形態ではワクチン組成物は、それぞれのウイルスに対して哺乳動物において防御免疫応答を誘発するジカウイルス、チクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルス抗原を混合ワクチン中に含み、ここでジカウイルス、チクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルス抗原は、アジュバントを含む又はアジュバントを含まない薬学的に許容される製剤において各抗原５μｇ〜５０μｇの範囲の濃度で混合ワクチン中に存在する。
アジュバントは、
ａ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸リン酸を含むアルミニウム塩；ｂ）イヌリン；ｃ）イヌリンと水酸化アルミニウムとの合剤であるアルガムリン；ｄ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）；ｅ）レシキモド；ｆ）ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ｇ）Ｎ−グリコリルジペプチド（ＧＭＤＰ）；ｈ）ポリＩＣ；ｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ｊ）ＭＰＬを含む水酸化アルミニウム；ｋ）任意の油中水乳剤；ｌ）次の成分の１又は２以上を含有する任意の水中油乳剤：スクアレン若しくはそのアナログ若しくは任意の薬学的に許容される油、tween-80、ソルビタントリオレート、アルファ−トコフェロール、コレカルシフェロール及び水性緩衝剤、又はその分子の任意のアナログ及び誘導体ｉ）ジカウイルス抗原と共に製剤化された場合にウイルスに対する免疫応答を誘発する前述のアジュバントの任意の２又は３つ以上の組合せ、からなる群から選択されてよい。好ましくはアジュバントは、ワクチン用量あたり０．２５ｍｇ〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量での水酸化アルミニウムである。
本発明のワクチン組成物は、２−フェノキシエタノール保存剤を２．５〜５ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいてよい。
哺乳動物において単一用量又は２用量以上で投与された場合にワクチン組成物は、ジカウイルス、チクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルスを含む任意のアルボウイルス抗原に対してＴｈ１及びＴｈ２の両方の免疫応答を誘発し、ヒトへの投与のために好適である。
一実施形態では本発明は、ジカウイルス、チクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルスから選択される１又は２以上のアルボウイルス抗原を含むワクチン組成物の調製のための方法であって、ウイルス抗原の不活化、組換えタンパク質産生、構造抗原発現、精製及び濃縮の１又は２以上のステップを含み、ジカウイルスの前記精製及び濃縮が、
ａ．超遠心分離；
ｂ．密度勾配遠心分離；
ｃ．膜ろ過を使用するウイルス採取物の清澄化；
ｄ．カラムクロマトグラフィーによる精製；
ｅ．１００ｋＤａ〜３００ｋＤａのカットオフを有する膜を使用するタンジェンシャルフローろ過であって、タンジェンシャルろ過が、ウイルス不活化の前又は後に実行される、タンジェンシャルフローろ過
から選択される１又は２以上のステップを含む、方法を提供する。
カラムクロマトグラフィー法は、ゲルろ過、混合モードレジンカラムクロマトグラフィー、任意のイオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティマトリクスクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを含み、ウイルス抗原の大部分をCapto core700などのフロースルー中に、最も好ましくはCapto core700のフロースルー中に溶出し、ウイルス試料は、Capto core700カラムで精製され、フロースルー中に溶出される。
ジカウイルスは、化学的不活化剤、物理的不活化剤及び照射剤から選択される１又は２以上の不活化剤によって不活化される。
調製方法は、ウイルスの精製の前又は後に実施されてよいジカウイルスの不活化を含み、ジカウイルスはホルマリン（ホルムアルデヒド）、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）及び過酸化水素から選択される化学的不活化剤によって不活化される。
一実施形態では調製方法は、次の：
ａ．ホルマリン：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、８℃〜３７℃、好ましくは２５±３℃、少なくとも１〜７日間でのホルマリン処置
ｂ．ホルマリン：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、２℃〜８℃、少なくとも１０〜３０日間でのホルマリン処置；
ｃ．ベータプロピオラクトン（以下ＢＰＬ）：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、少なくとも２４〜４８時間、少なくとも温度範囲８℃〜３０℃、好ましくは２５±３℃、４８時間でのベータプロピオラクトン；
ｄ．１：５００〜１：４０００まで（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）の範囲の任意の濃度、２℃〜８℃、少なくとも３〜７日間でのベータプロピオラクトン；
ｅ．前述のいずれかの条件でのＢＰＬとホルマリンとの組合せ、好ましくは１：３０００（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）、２４時間のＢＰＬ不活化、及びそれに続く１：３０００（ホルマリン：ウイルス、ｖ／ｖ）、２４〜４８時間、１５℃〜３０℃、好ましくは２５±３℃でのホルマリン不活化；
ｆ．０．１〜３％、好ましくは０．１〜１％の任意の濃度、２０〜３０℃の任意の温度、５分間〜１２０分間での過酸化水素
から選択される方法のいずれか１つによって不活化されるジカウイルスバルクの不活化を含む。
調製方法の実施形態ではウイルスは、６０Ｃｏ源からの２０ｋＧｙ（キロＧｒａｙ）〜３５ｋＧｙまで、好ましくは２５ｋＧｙ〜３０ｋＧｙの曝露によるガンマ照射によって不活化される。
調製方法の別の実施形態ではジカウイルスは、２５４ｎｍへの３０〜６０分間曝露によるＵＶ照射によって不活化される。
調製方法の別の実施形態ではジカウイルスは、温度５０℃〜６５℃、３０分間〜２時間まで好ましくは６５℃、１時間の熱処置によって不活化される。
調製方法の一実施形態では不活化は、乳糖、ショ糖、トレハロース、マルトース、マンノース、イソ−マルトース、ラフィノース、スタキオース、ラクトビオース、ソルビトール、マンニトール、ラクトビオン酸、デキストラン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸及びヒト血清アルブミン又はそれらの組合せ、から選択される安定化剤の存在下で実施される。好ましい一実施形態では安定化剤は：
ａ．２％ソルビトール及び１％ Ｌ−グリシン；
ｂ．１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；
ｃ．１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；
ｄ．１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グルタミン酸；並びに
ｅ．１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン、１％ヒト血清アルブミン．
から選択される。
本明細書上に記載の不活化法は、任意の遺伝子型／株のジカウイルス、生弱毒化ジカウイルス、非活化ウイルス、ウイルス様粒子、任意のジカウイルス抗原、特にＥタンパク質を任意の異種ウイルス骨格、ベクター化ワクチン中に保有するキメラウイルス粒子、及び任意のジカウイルスゲノムの配列を使用してインビトロ又はインビボで派生させた感染性合成ウイルス粒子に適用できる。
一実施形態では本発明は：
ａ．組換えプラスミドＤＮＡを昆虫細胞にトランスフェクトするステップ；
ｂ．細胞を採取するステップ及びそれから組換えタンパク質を単離するステップ；
ｃ．イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、混合モードレジンクロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、超遠心分離、密度勾配遠心分離及び塩での分画を含む少なくとも１つの方法によってタンパク質を精製するステップ
を含む、組換えタンパク質を産生する方法を開示する。
別の実施形態では本発明は、昆虫細胞におけるバキュロウイルス媒介発現を含む任意の原核又は真核発現系である、発現系を含むジカウイルスの構造抗原の発現方法を開示する。
別の実施形態では本発明は、最適には不活化ウイルス、生弱毒化ウイルス、非活化ウイルス、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子、ベクター化ワクチン中などの任意の異種ウイルス骨格においてジカウイルスＥタンパク質を提示するキメラウイルス粒子、及び任意のジカウイルスゲノムＲＮＡ配列から派生させた合成ウイルス粒子などにおいてエンベロープタンパク質に対して主として誘発される中和抗体を含む方法を開示する。
本発明のワクチン組成物は、プライム−ブースト法で投与されてよく、ここでプライムは候補不活化ワクチンであり、ブーストは同じワクチン；又はＤＮＡワクチン、キメラジカウイルスワクチン、ウイルス様粒子、非活化ジカワクチン、生弱毒化ウイルスワクチン、組換えサブユニットワクチン、ベクター化ワクチン若しくは合成ジカウイルス由来の任意のワクチンなどの任意の他のワクチン；のいずれかであり、それらそれぞれにおける中和抗体は、ジカウイルスエンベロープタンパク質に対して誘発される。
銀染色によって検出された１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の精製ジカウイルスバルクを示す図である。エンベロープ（Ｅ）タンパク質及び膜（Ｍ）タンパク質が精製された抗原において検出された主なタンパク質である。 図２Ａ−１：１０００ｖ／ｖのホルマリン：ウイルス〜１：４０００ｖ／ｖのホルマリン：ウイルスまで範囲の濃度、２５±３℃でのホルマリンによるジカウイルスの不活化動態を示すグラフである。図２Ｂ−１：１０００〜１：３５００ｖ／ｖまでのＢＰＬ：ウイルスの範囲の濃度、２５±３℃でのベータプロピオラクトンによるジカウイルスの不活化動態。両方の不活化手順において、１％ソルビトール添加０．５％ Ｌ−グリシン（最終濃度）は、安定化剤として加えられ、不活化動態に影響を有さなかった。不活化試料はVero細胞においてインビトロで連続３回増幅され、３回継代の最後にＴＣＩＤ５０によってアッセイされた。 図３Ａ：配列番号１の約２．１ｋｂジカウイルスprME遺伝子を昆虫細胞での発現のためのpFastBacベクターでの初回クローニングのために遺伝子特異的プライマーによって増幅されたことを示す図である。図３Ｂ：Sf9細胞可溶化物は、標準的手順によってジカウサギポリクローナル抗血清を使用してprMEタンパク質の発現の検出のためにウエスタンによって探索されたところを示す図である。約５５ｋＤのエンベロープタンパク質は、主なバンドとして検出された。 さまざまなアジュバントを含むジカワクチン製剤によって誘発された中和抗体力価の概算量を示すグラフである。アジュバントは次のとおり略される：ｐＩＣ（ポリＩＣ）；Ｃ−コレカルシフェロール；ＭＰＬ（リピドＡ；モノホスホリル）；ＲＰ（レシキモイド＋ポリＩＣ）；ＲＭ（レシキモイド＋ＯＷＥＭ２）；Ｉ（イヌリン）；ＯＷＥＭ２（水中油乳剤２）；ＡＩ（水酸化アルミニウム＋イヌリン）；ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）；ＯＷＥＭ１（水中油乳剤１）。それぞれの対照群において顕著な抗体力価は検出できず、そのため図に記載されていない。すべての場合でジカワクチン抗原１０μｇ、２用量がＩＭ経路によるBalb/cマウスへの投与のために製剤化された。 図５Ａ：用量あたり０．１２５μｇ〜４０μｇまでの水酸化アルミニウムアジュバント化ホルマリン不活化ジカウイルスワクチンがＩＭ経路によってBalb/cマウスに２用量で投与された投与量決定試験でのＰＲＮＴ５０による中和抗体力価の概算を示す図である。図５Ｂ：ワクチン接種動物は、追加免疫の７日後にジカウイルス株１０ｅ５ＰＦＵ／動物で静脈内に感作され、ウイルス血症は２４時間ごとに７日間モニターされた（６日間についてグラフに示す）。すべての動物はウイルス血症からの完全防御を示した一方で、プラセボ対照を投与された動物は、６日目まで継続したウイルス血症を示した。感染性ウイルスは、ＴＣＩＤ５０によって血液試料中で概算された。 １μｇ〜４０μｇのＢＰＬ不活化、アルム吸着ジカウイルスワクチン投与後の４〜６週齢Balb/cマウスでのウイルス感作を示す図である。ワクチン投与群及びプラセボ群のすべての動物は、１０ｅ５ＰＦＵのジカウイルスMR766株で追加免疫の投与７日後に感作された。ウイルス血症はウイルス感作後２４時間ごとにモニターされ、血液中の感染性粒子の力価はＴＣＩＤ５０によって概算された。候補ジカワクチンは、すべての投与群でウイルス感作からの完全防御を付与した。 受動免疫処置がウイルス血症に対して完全防御を付与し、感染性ウイルスがジカウサギポリクローナル抗血清を腹腔内に受け、２４後に１０ｅ５ＰＦＵのジカウイルスで感作された動物においてＴＣＩＤ５０によって検出できなかったことを示すグラフである。感染性ウイルス粒子は、２４時間ごとに６日間モニターした場合に血液中でＴＣＩＤ５０によって検出できなかった一方で、等量のＰＢＳを受けた対照動物は同じ用量のウイルスで感作された場合に継続的なウイルス血症を６日間まで示した。 ワクチン接種マウス由来ホルマリン不活化アルム吸着ジカウイルスワクチン抗血清は、それぞれ１８１０５及び１８３２５のＰＲＮＴ５０力価と等効率で、同種MR766ジカウイルス株（図８Ｂ）を中和し、異種アジア遺伝子型FSS13025株（図８Ａ）を交差中和したことを示すグラフである。プラセボ（アルムのみ）からの値も並んでグラフに示されている。 実施例７に記載のとおり、４〜６週齢Balb/cマウスに投与されたホルマリン不活化ワクチンの（図９Ａ）単一用量（図９Ｂ）２用量（図９Ｃ）３用量での投与量決定試験から血清希釈度の逆数のｌｏｇ１０として表した抗体力価を示す図である。図９Ｄは、アルムを含まない１０μｇのワクチン抗原の単一、２及び３用量での抗体力価である。すべての値は、９５％ＣＩでの幾何平均抗体価として表されている。９Ａ〜９Ｄでは個々の動物データがプロットされている。ジカウイルス抗原は、アジュバントを伴わなくても免疫原性であった。他の用量範囲からのデータは、概算されたがグラフには含まれていない。 高親和性抗体が、１μｇまでの低用量のワクチン抗原でさえBalb/cマウスにおいてホルマリン不活化アルム吸着ジカウイルスワクチンの単一用量によって誘発され得たことを示す図である。抗体アビディティーは、アビディティー指数として表され、実施例１２に記載の方法によって概算された。 さまざまなアジュバントを含むジカワクチン製剤でワクチン接種されたマウスでのＴｈ１サイトカイン（図１１Ａ）ＩＦＮガンマ及び（図１１Ｂ）ＩＬ−２の概算量を示す図である。すべての場合で用量あたりワクチン抗原１０μｇであった。アジュバントは実施例５に記載のとおり次のとおり略される：ｐＩＣ（ポリＩＣ）；Ｃ−コレカルシフェロール；ＭＰＬ（リピドＡ；モノホスホリル）；ＲＰ（レシキモイド＋ポリＩＣ）；ＲＭ（レシキモイド＋ＯＷＥＭ２）；Ｉ（イヌリン）；ＯＷＥＭ２（水中油乳剤２）；ＡＩ（水酸化アルミニウム＋イヌリン）；ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）；ＯＷＥＭ１（水中油乳剤１）。オイルベースアジュバント及びポリＩＣは、検査した他のアジュバントと比較して強いＴｈ１応答を誘発した。 さまざまなアジュバントを含むジカワクチン製剤でワクチン接種されたマウスでのＴｈ２サイトカイン（図１２Ａ）ＩＬ−４、及び（図１２Ｂ）ＩＬ−１０の概算量を示す図である。すべての場合で用量あたりワクチン抗原１０μｇであった。アジュバントは実施例５に記載のとおり次のとおり略される：ｐＩＣ（ポリＩＣ）；Ｃ−コレカルシフェロール；ＭＰＬ（リピドＡ；モノホスホリル）；ＲＰ（レシキモイド＋ポリＩＣ）；ＲＭ（レシキモイド＋ＯＷＥＭ２）；Ｉ（イヌリン）；ＯＷＥＭ２（水中油乳剤２）；ＡＩ（水酸化アルミニウム＋イヌリン）；ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）；ＯＷＥＭ１（水中油乳剤１）。オイルベースアジュバント及びポリＩＣは、Ｔｈ１応答に加えて強いＴｈ２応答を誘発した。
本開示は、免疫原性組成物の製剤化に関する。具体的には本発明は、一価組成物において並びにチクングニア及び／又は日本脳炎ウイルスなどの他のアルボウイルスとの組合せにおけるジカウイルスのワクチン抗原の調製及び製剤化を開示する。具体的には本発明は、ジカウイルス感染の予防及び治療のための組成物を開示する。
本発明の一態様は、免疫応答を誘発するためのワクチンとしてのジカ抗原の調製、製剤化及び使用方法が、任意の遺伝子型、遺伝子型バリアント又はジカウイルスの任意の株に適用可能であることであり、ここでジカウイルスの一遺伝子型は異種株を効率的に交差中和する。ジカウイルスは、ウイルスのアジア、西アフリカ又は東アフリカ遺伝子型から選択されてよい。したがって本明細書における本発明に記載の方法は、任意の遺伝子型／株のジカウイルス、生弱毒化ジカウイルス、非活化ウイルス、ウイルス様粒子、任意のジカウイルス抗原、特にＥタンパク質及びＭタンパク質を任意の異種ウイルス骨格、ベクター化ワクチン中に保有するキメラウイルス粒子、及び任意のジカウイルスゲノムの配列を使用してインビトロ又はインビボで派生させた感染性合成ウイルス粒子に適用できる。キメラウイルスは、異種ウイルスの核酸及びジカウイルスの核酸を有する。
本明細書に開示の免疫原性組成物、具体的には免疫原性組成物の調製のために使用されるバルク抗原の文脈では、ジカワクチン抗原の調製、製剤化及び使用の方法は、ゲノムの任意の領域にわたって少なくとも５０％アミノ酸同一性から１００％アミノ酸同一性までを共有する任意の前述のジカウイルス型に適用され得る。本明細書に開示の疫原性組成物の文脈では、アフリカ遺伝子型のジカウイルスMR766株の配列（ゲノムヌクレオチド配列について配列番号５、及び完全ＯＲＦについて配列番号６）は、構造エンベロープタンパク質においてアジア遺伝子型株FSS13025と９６．５％を超えるアミノ酸同一性を共有し、その配列はヌクレオチド及びタンパク質配列についてそれぞれ配列番号７及び配列番号８に開示されている。MR766株のワクチン抗血清は、ホモタイプMR766株に相当する１００％の等しい力価でFSS13025株を中和する。同様に本明細書に開示の文脈では、ジカウイルスprME（配列番号３）抗血清はMR766株を効率的に交差中和し、すべてのジカウイルスが血清学的に類似していることを確認している。本明細書の開示の文脈では、ジカウイルス株のいずれか１つを使用して開発されたワクチン方法は、候補ワクチンとしての使用のための同種の及び任意の異種ジカウイルス株に適用できる。
培養でインビトロで増殖され得る細胞株は、ジカウイルス培養のための宿主として使用され得る。ジカウイルス株を増殖させるために、好ましくは、ウイルスの十分な増殖を可能にする許容細胞が選択される。例えば、MRC-5及びWI-38などの二倍体細胞株並びにVero、BHK-21、CHO細胞などの連続継代細胞株は使用され得る。例えばVero細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）、BHK-21（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０）、C6/C3（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６６０）などは使用され得る。好ましい実施形態では、本発明で使用される１つのそのような細胞株は、ワクチン産生のための宿主細胞としての使用のために検証されたVero細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）である。検証されたVero細胞株は、世界保健機関（ＷＨＯ）によって推奨されている生物製剤の産生のための細胞の使用についての必要要件に関するthe Requirements for Biological Substances No.50に適合しており、それによりこれらの細胞株をワクチン産生のために認定されたとして確認している（WHO Technical report Series, No. 878, pp 19-52, 1998)。
本発明の一態様ではジカウイルスのVero細胞への順応方法は、ウイルス力価を増加させる。Vero細胞で反復的に継代されたジカウイルスは、ウイルス力価が増加している。本明細書に開示のVero細胞でのウイルス増殖においては、最初にマウス脳又はヒトスジシマカC6/36細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６０）で継代され、次いでVero細胞に順応されたジカウイルスは、ワクチン産生物のために好適なウイルス力価が増加している。
上に述べる細胞株の細胞培養の維持のために、Vero細胞、具体的には、単層での静置培養、かん流培養、振とうフラスコ、回転チューブ／ボトル培養、マイクロキャリアを含む及び含まない懸濁培養、細胞工場及び細胞スタック、バイオリアクター及びディスポーザブルバイオリアクター、ウェーブバイオリアクターなどは、採用され得る。例えば種々の種類のマイクロキャリアは、商業的に入手できる。商業的に入手できる動物細胞培養デバイスは、高細胞密度に細胞の増殖を促進するために使用され得る。
本発明の及び本明細書で開示の一態様ではジカウイルスは、候補ワクチンとしての使用のために精製される。精製は、ウイルスの不活化の前又は後のいずれかでの物理的及び化学的方法の両方の組合せによって達成される。物理的方法は、これだけに限らないが次の技術：超遠心分離、密度勾配遠心分離、限外ろ過、ダイアフィルトレーション及び好適な分子カットオフサイズを有する半透膜を使用する濃縮のいずれかを含む。化学的手段を通じた精製は、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えばCapto core700（商標）などのゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトマトリクス、無機塩、一例は硫酸アンモニウムの加塩などの化学的又は生理化学的反応を通じた吸着／脱離の方法を用いる。
好ましい実施形態ではウイルスは、Capto core700（GE Healthcare Life Sciences社）カラムクロマトグラフィーで精製される。ウイルスの不活化は、Capto core700カラムでの精製前又は精製後のいずれかで達成される。Capto core700カラム前に採取されたウイルスは、さまざまなポアサイズを有する膜フィルター、好ましくは０．４５μＭ以上の低タンパク質結合膜を使用して清澄化され得る。好ましい実施形態ではウイルス採取物は、２つの異なるポアサイズ、例えば１．２μＭ、及びそれに続く０．４５μＭ又は０．８μＭ、及びそれに続く０．４５μＭの二重膜で清澄化され得る。清澄化されたウイルス採取物は、Capto core700カラムでの精製のために好適である。Capto core700での精製のために使用される緩衝液は、不純物のカラムへの結合を最大化し、ウイルスをフロースルー中に溶出するための最適ｐＨ及びイオン強度である。ウイルス試料は、ウイルス不活化の前又は後にダイアフィルトレーションによってさらに濃縮される。不活化後のウイルス試料のダイアフィルトレーションは、ウイルス不活化剤をバルク抗原から除去し、製剤化のために好適である。
本発明の一実施形態では、ワクチン抗原としての使用のための不活化された（死滅された）ジカウイルス。不活化は、ウイルスの精製の前又は後のいずれかに実行されてよい。好ましい実施形態ではジカウイルスの不活化は、ウイルスの精製後に実行される。
ジカウイルスは、熱、ガンマ照射、紫外線又は化学的手段によってのいずれかによって不活化され得る。本明細書に開示の好ましい実施形態ではジカウイルスは、化学的に不活化される。化学的不活化剤は、これだけに限らないが、ホルマリン、ベータプロピオラクトン、グルタルアルデヒド、Ｎ−アセチルエチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、ターシャリーエチレンイミン、アスコルビン酸、カプリル酸、ソラレン、非イオン性界面活性剤を含む界面活性剤などを含む一覧から選択され、ここで化学的不活化剤は、ウイルスを不活化するためにウイルス懸濁物に加えられる。
本発明の好ましい実施形態では選択された化学的不活化剤は、ホルマリン及び／又はベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）である。ホルマリンは、１：１０００〜１：４０００ｖ／ｖのホルマリン：ウイルスの範囲の任意の濃度で使用される。ベータプロピオラクトンは、１：１０００〜１：４０００ｖ／ｖのＢＰＬ：ウイルスの範囲の任意の濃度で使用される。温度及び不活化の継続時間は、免疫原性への有害作用を最小にしてウイルス不活化を完了させるために最適化される。これは、最少量の不活化剤でのより短い曝露継続時間で達成される。ウイルス不活化の文脈では本明細書の開示は、濃度、温度及びジカウイルスのホルマリン及びＢＰＬへの曝露時間を記載する。本発明の好ましい実施形態では不活化温度は２５±３℃、最も好ましくは２２℃、７日間である。２℃〜８℃のより低い温度では、ホルマリン曝露の継続時間は前述の濃度範囲での完全なウイルス不活化を達成するために７日間より長い。ホルマリンへのウイルス曝露の継続時間は、曝露温度を３７℃まで上昇させることによって４８時間未満に低減され得る。したがってジカウイルスの効果的なホルマリン不活化は、１：１０００ｖ／ｖホルマリン：ウイルス〜１：４０００ｖ／ｖホルマリン：ウイルスまでの範囲のホルマリンの任意の濃度で温度範囲２℃〜３７℃の範囲から任意の温度を選ぶことによって、及び２４時間から１０日間を超えて曝露時間を変更することによって、曝露の前述の濃度、時間及び温度で達成され得る。
本開示の一実施形態ではＢＰＬは、ジカウイルスのためのウイルス不活化剤として使用される。本発明の好ましい実施形態ではＢＰＬは、１：１０００ｖ／ｖ ＢＰＬ：ウイルス〜１：４０００ｖ／ｖ ＢＰＬ：ウイルスまでの範囲の濃度で使用される。２〜８℃の低温でのＢＰＬ曝露の継続時間は、前述の濃度範囲での完全なウイルス不活化を達成するために好ましくは３〜７日間である。ＢＰＬへのウイルス曝露の持続時間は、曝露温度を２５±３℃まで、又はさらに３７℃まで上昇させることによって４８時間以下に低減され得る。したがってジカウイルスの効果的なＢＰＬ不活化は、１：１０００ｖ／ｖ ＢＰＬ：ウイルス〜１：４０００ｖ／ｖ ＢＰＬ：ウイルスまでの範囲から任意のＢＰＬの濃度を選ぶことによって、２〜３７℃の範囲から温度を選ぶことによって及び２４時間から１０日間を超えて曝露時間を変更することによって、曝露の任意の前述の濃度、時間及び温度で達成され得る。
本明細書に開示の本発明の一実施形態は、任意の前述の条件での、好ましくは１：３０００ｖ／ｖのＢＰＬ：ウイルス、２４時間でのＢＰＬ不活化、及びそれに続く１：３０００ｖ／ｖホルマリン：ウイルス、２４〜４８時間、１５℃〜３０℃、好ましくは２５±３℃でのホルマリン不活化のＢＰＬとホルマリンとの組合せの使用である。ジカウイルス不活化のためのＢＰＬ及びホルマリン組合せの使用は、ホルマリンとＢＰＬとは異なる不活化機構であり、それらの組合せ使用はそれら全体の濃度及び両不活化剤への曝露を低減し、それにより低濃度のホルマリンの使用は、ウイルスエピトープの架橋結合を促進することによってウイルスバルクの安定性を促進する。本発明の別の実施形態では過酸化水素は、ジカウイルスを不活化するために０．１〜３％、好ましくは０．１〜１％の範囲の濃度、温度２０℃〜３０℃の任意の温度、５〜１２０分間で少なくとも使用される。
本発明の実施形態は、ジカウイルスに対する免疫応答を誘発するための候補ワクチン抗原としてジカウイルスのprME抗原の使用を開示する。開示は、prME又はＥタンパク質が、中和ジカ抗体が前記抗原に対するものとなるような形で発現されるワクチン設計の任意の方法に適用可能である。本発明の好ましい実施形態ではprMEタンパク質は、昆虫細胞においてバキュロウイルス媒介発現で組換えウイルス様粒子（ＶＬＰ）として発現される。当業者は、ＤＮＡワクチン、prMEタンパク質を含むウイルス様粒子、エンベロープ（Ｅ）抗原を含むワクチンサブユニット、生ベクター化ワクチン、異種核酸骨格上でジカprMEを使用するキメラワクチンなどの、標的ジカ抗原としてprMEタンパク質を使用するワクチン候補を設計するために上の開示を使用して追加的実施形態を導く、ここで上のすべての抗ジカ抗体は直接Ｅタンパク質に対してである
本発明で本明細書において、ジカウイルス感染の予防のための免疫応答を誘発するためのワクチン抗原としてエンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質及び任意選択で非構造１（ＮＳ１）タンパク質を含む精製された組換えジカウイルス抗原を含む免疫原性組成物が開示され。好ましい実施形態では、配列番号３及び配列番号４の構造タンパク質をそれぞれコードする配列番号１及び配列番号２の配列のprME遺伝子を有するジカウイルスの使用であり、発現及び精製されたprMEタンパク質は、ジカウイルス感染の予防のためのワクチン抗原として使用され得る。
好ましい実施形態ではジカウイルスprME遺伝子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などの原核又は真核発現系、好ましくは昆虫細胞におけるバキュロウイルス媒介発現においてprMEタンパク質を発現させるために使用され得る組換え遺伝子コンストラクトを生成するために使用される。本明細書に開示の方法は、前述の配列番号３及び配列番号４と少なくとも７０％アミノ酸同一性を共有する任意のジカウイルス株に適用可能である。
本開示の実施形態は、バイオプロセス全体を通じた薬学的に許容される緩衝剤の選択であり、緩衝剤は、緩衝剤の１つとして、これだけに限らないがリン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸クエン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）含有緩衝剤、コハク酸緩衝剤、グリシン又はヒスチジンを含有する緩衝剤の任意の１又は２以上からなる一覧から選択される。最も好ましい実施形態ではリン酸が緩衝剤使用され、リン酸緩衝剤は、濃度５ｍＭ〜２００ｍＭまでのリン酸イオン、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭリン酸緩衝液、最も好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭリン酸緩衝液で任意のｐＨ６．５０を超えてｐＨ９まで、好ましくはｐＨ６．８〜ｐＨ７．８のリン酸ナトリウム緩衝液であり、上流及び下流工程のために使用される。好ましい実施形態では、ｐＨ７．４±０．２の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液がジカウイルス抗原の精製された不活化ワクチンバルクの調製において使用され、濃度５０〜２００ｍＭで塩化ナトリウムを含有してよい。別の好ましい実施形態ではソルビトール及びＬ−グリシンは、それぞれ１％及び０．５％の最終濃度に添加されてよい。
本発明の実施形態は、ジカウイルス抗原を含む製剤に適合性であるアジュバントの選択も開示する。
一価ワクチンとしてジカウイルス並びにチクングニアウイルス及び日本脳炎ウイルスを混合ワクチン中に含む抗原性組成物は、免疫処置のために薬学的に許容される担体中に製剤化された。アジュバント（複数可）の使用は、製剤中に必要な抗原の量を低減できる。さらに、アジュバント化ワクチン製剤のために好適なアジュバント（複数可）は、これだけに限らないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又はアモルファスアルミニウム硫酸リン酸などのアルム；リン酸カルシウム；任意の多形性形態でのイヌリン、好ましくはガンマイヌリン；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸リン酸及びリン酸カルシウムなどの他の有機及び無機化合物との組合せでイヌリンを含有するアジュバント；リポソーム、キトサン並びに、デキストラン、デキストリン、デンプン、マンナン及びグルコマンナン、ガラクトマンナン、ベータグルカン、ヘパリン、セルロース、ヘミサルロース、ペクチン及びペクチネート、レクチンなどの複合体炭水化物並びに合成又は任意の供給源由来の任意の他の炭水化物、ポリラクチド及びポリラクチドコ−グリコリド（ＰＬＧ、poly lactide又はＰＬＧＡ、polylactide co-glycolides）などの任意の生分解性及び生体適合性ポリマー；これだけに限らないが例えばスクアレン又は水中油アジュバントを含むスクアレンアナログなどの水中油乳剤、植物油を含有している水中油乳剤を含む任意の乳剤；任意の油中水乳剤；他の脂溶性化合物と共に成分の１つとしてコレカルシフェロールと共に調製されたリポソーム；他の組成のリポソーム；ＲＩＢＩアジュバント系、これだけに限らないがＱＳ−２１、ＱｕｉｌＡ、トマチン、ＩＳＣＯＭ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどを含むサポニン、リポペプチド、糖ペプチド及びそれらのアナログ、レシキモイド、リポ多糖類、リピドＡ、ムラミルジペプチド又はそれらのアナログ及び任意のペプチドベースアジュバント、オリゴヌクレオチド、任意のＴＬＲリガンド及びそれらのアジュバントとしてのアナログ、任意のサイトカイン、ビタミン及び無毒性細菌性毒素、実際にワクチン製剤（複数可）に適合性である前述のすべてのアジュバントの任意のアナログ及び前述のアジュバント又はそれらのアナログの２つ又は３つ以上の組合せ、を含む一覧から選択され、免疫原性の増強について検査された。上に加えて、良好な免疫賦活活性を有する任意の他の有機及び無機物質は、アルボウイルス抗原の免疫原性を増強するために単一で又はアジュバント組合せのいずれかで、アジュバントとして使用されるために好適である。ワクチン製剤中のアジュバントの使用は、必要な抗原の量を低減できる。
本発明の好ましい実施形態では水酸化アルミニウムは、標的集団における使用についてのその安全性プロファイルにより、ホルマリン及びＢＰＬ両方の不活化ジカ抗原の投与量決定試験のため並びにジカ、ＣＨＩＫＶ及びＪＥＶワクチンのワクチン合剤において使用された。オイルベース乳剤及びポリＩＣは、アジュバントとして使用された場合にジカ抗原に良好な免疫賦活効果を与えた。本発明の一実施形態ではポリＩＣ及び両方の全身性粘膜免疫を与える他のアジュバントは、ジカウイルス感染によって生じる疾患に対する防御のために特に有利である。ポリＩＣ及びオイルベース乳剤及び本発明に開示のアジュバント組合せは、ワクチン接種後のＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの測定によって概算されたＴｈ１及びＴｈ２の両方の応答を誘発した。
本発明の一実施形態ではワクチン保存剤は、ワクチン製剤において使用される。好ましい実施形態は、用量あたり２．５〜５ｍｇの濃度での２−フェノキシエタノールである。
本明細書に開示の本発明の一態様は、これだけに限らないが次の：乳糖、ショ糖、トレハロース、マルトース、マンノース、イソ−マルトース、ラフィノース、スタキオース、ラクトビオース、ソルビトール、マンニトール、ラクトビオン酸、デキストラン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、ヒト血清アルブミン及びそれらの組合せ、の１又は２以上から選択される安定化剤の、任意の前述の方法によるジカウイルスの不活化の際に安定性を付与するために使用される好適な濃度での使用である。好ましい実施形態では安定化剤は、これだけに限らないが次の：２％ソルビトール及び１％ Ｌ−グリシン；１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グルタミン酸；１％ソルビトール、０．５％ Ｌ−グリシン、１％ヒト血清アルブミンの任意の組合せ、から選択される。好ましい実施形態では１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン並びに１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グリシンの組合せは好ましい組合せであり、最も好ましくは１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシンである。当業者は、上に開示に基づいてさらなる実施形態を認識する。
凍結乾燥製剤は、ワクチン産生物の調製のための１つの方法である。ジカウイルスワクチンの凍結乾燥調製物は、典型的には精製された不活化ジカウイルス、糖ポリオール、好ましくはソルビトール及びマンニトール、最も好ましくは、好ましくは二糖又はオリゴ糖であるガラス形成糖との組合せでのソルビトールを含有する。好ましい二糖は、これだけに限らないが次の：ショ糖、トレハロース、マルトース、マンノース、乳糖、ラフィノース、イソマルトース、スタキオースなどの一覧から選択され、本開示の好ましい実施形態は、５％ショ糖を含む１％ソルビトール、５％ショ糖を含む１％マンニトール並びに３％ショ糖及び２％トレハロース、１％ Ｌ−グリシン及び又は２％トレハロースを含む１％マンニトールの組合せである。当業者は、上の開示に基づいてさらなる実施形態を考案する。
凍結乾燥製剤は、注射用水に又は、投与のために、例えばヒト対象への注射可能な液体として薬学的に許容される水性緩衝液中に再懸濁されてよい。凍結乾燥製剤は、粘膜免疫を誘導するために好適である吸引可能な粉剤として使用されてもよい。追加的にジカウイルスの凍結乾燥製剤は、粘膜免疫を付与するアジュバントを、好ましくは、例えばポリＩＣなどの、ジカウイルスのために本発明において検査されたアジュバントの一覧から含んでいてよい。
本発明、強い免疫応答を誘発するためのジカウイルス抗原の最適な使用についての本明細書で提供する開示ではワクチン抗原は、用量あたり０．１０μｇ〜１００μｇまでで使用されてよく、ここで好ましい実施形態は、投与されるワクチン用量がＥＬＩＳＡ及びＰＲＮＴ５０などのアッセイによって測定できる抗体力価を誘発する用量あたり０．１２５μｇ〜４０μｇまでの任意の濃度である。ワクチンは、不活化ワクチン及びアジュバント化製剤の両方が良好な免疫応答を誘発することから、アジュバントを含む又は含まない形で投与されてよい。
本発明のさらに別の開示では、任意の開示された方法によって不活化された不活化ジカワクチン候補は、免疫応答を誘発するために単一用量又は２用量以上で投与されてよい。本発明において開示の方法は、ワクチン接種のための標的集団に合わせたワクチン用量濃度範囲及び投与回数の選択に柔軟性を付与する、用量あたり０．１２５μｇ〜４０μｇまでの用量範囲でのワクチンの各投与後の免疫応答の動態を提供する。
ワクチン投与の経路は、これだけに限らないが筋肉内、皮内、皮下、静脈内、経口、鼻腔内及び経皮経路から選択される任意の経路によってでよい。本発明の好ましい実施形態ではワクチン投与の好ましい経路は筋肉内（ＩＭ、intramuscular）経路である。
ワクチン製剤は、ガラスバイアルに存在してよく、針及びシリンジによって注射されてよく、プレフィルドシリンジ中に使用準備済みの体裁で存在してよく、又は電気穿孔法、マイクロニードルパッチ、無針パッチ、吸入によって又は点鼻薬によって投与されてよい。
本発明は、ジカウイルス、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）及び日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）を含む一覧から選択される１又は２以上のアルボウイルス抗原を含む製剤の調製及び使用のための方法を開示する。ワクチン合剤において使用される場合、ワクチンは混合ワクチン中に存在するそれぞれのウイルスに対する免疫応答を誘発できる。本発明の好ましい実施形態では、アジュバントを含まない又は好ましくは本発明において開示のアジュバントの一覧から選択されるアジュバント、好ましくはワクチン用量あたり０．２５ｍｇ〜１．５ｍｇのアルミニウム含有量を有する水酸化アルミニウムを含む薬学的に許容される製剤中にジカウイルス抗原及び日本脳炎ウイルス抗原が各抗原の濃度範囲５μｇ〜５０μｇで混合ワクチン中に存在するワクチン組成物が開示される。本発明のさらに別の好ましい実施形態では、アジュバントを含まない又は好ましくは本発明において開示のアジュバントの一覧から選択されるアジュバント、好ましくはワクチン用量あたり０．２５ｍｇ〜１．５ｍｇのアルミニウム含有量を有する水酸化アルミニウムを含む薬学的に許容される製剤中にチクングニア及びジカウイルス抗原を各抗原の濃度範囲５μｇ〜５０μｇで製剤中に含むワクチン組成物が開示される。
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、アジュバントを含まない又は好ましくは本発明において開示のアジュバントの一覧から選択されるアジュバント、好ましくはワクチン用量あたり０．２５ｍｇ〜１．５ｍｇのアルミニウム含有量を有する水酸化アルミニウムを含む薬学的に許容される製剤中にチクングニアウイルス抗原、ジカウイルス抗原及びＪＥＶウイルス抗原を各抗原の濃度範囲５μｇ〜５０μｇで製剤中に含むワクチン組成物が開示される。ワクチン合剤の使用は、免疫応答が製剤中の各抗原に対して誘発され、追加的抗原の存在によっていずれかの抗原に対する、抗原の干渉が観察されない限り、ワクチンの製造及び配給について注目すべき経済学的有利点を与える。ワクチン抗原は、単一製剤から投与されてよく、又は同時に若しくは同族抗原に対する免疫応答を誘発するための好適な時間間隔で分けて投与されてよい。
本発明は、抗体がジカウイルス感染の検出又は診断のために応用できるＥＬＩＳＡ又は任意の免疫診断的方法によるジカウイルスの検出のためのジカウイルス抗体の使用も開示する。
本発明は、ジカウイルス疾患の予防及び治療のためのジカウイルス抗体の使用も本明細書において開示する。
本発明において使用される略号：ＩＭ−筋肉内；ｍｃｇ−マイクログラム；ＴＣＩＤ５０〜５０％組織培養感染量；ＰＦＵ−プラーク形成単位
［実施例］
Vero細胞でのジカウイルス培養
Vero細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）をジカウイルスの培養のための細胞基質として使用した。BioReliance社, USAから得た広範に特徴付けられたVero細胞をパイロットスケール産生において使用した。Vero細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、fetal bovine serum）又は新生仔ウシ血清（ＮＢＣＳ、New Born Calf Serum）を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）;Sigma-Aldrich社 Catalog #D5523、製造者の説明書により使用した）又はＥＭＥＭ（イーグル基礎培地、Eagles Minimal Essential Medium）で単層の８０〜１００％コンフルエンスに達するまで３５℃〜３７℃でインキュベートして増殖させた。感染後、１％血清を含有する同じ培地を使用した、又は代替的にウイルスを無血清培地に順応させたVero細胞で培養した。ジカウイルスは、５％血清を含み、Ｈｅｐｅｓ緩衝液で中性ｐＨにした緩衝ＥＭＥＭからなる増殖培地中に調製したMRC-5細胞単層でも、増殖させ、３５℃〜３７℃、６〜８日間静置でインキュベートした。ジカウイルスをVero細胞中で日常的に培養した。ジカウイルスMR766株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８４）をVero細胞での直接接種によってVero細胞に順応させた。代替的にウイルスは、連続継代２回でC6/36ヒトスジシマカ細胞に順応され、これらの細胞由来の培養上清中のジカウイルスをVero細胞に感染させるために使用した。２５℃〜２８℃で培養されたC6/36細胞中のジカウイルスの連続継代は、１０ｅ８．０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ又は１０ｅ８．０ＰＦＵ／ｍＬより高いウイルス力価に増加させた。これによって、高力価を得るためのVero細胞での続く反復継代の必要性もなくなった。この方法によって順応されたウイルスは、高力価及び続く産生での高収量を達成するために有用である。C6/36細胞での培養後、ウイルスをVero細胞から２回、連続プラーク精製し、単一のウエルで単離されたプラークからのウイルスを増幅し、次世代配列決定（ＮＧＳ、Next Generation Sequencing）プラットフォームを使用して外来病原体（すべての周知のＲＮＡ及びＤＮＡウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマなど）を含まないことについて広範に特徴付けた。ウイルスゲノムＲＮＡをＮＧＳプラットフォームで配列分析しMR766株の完全なヌクレオチド配列を配列番号５に提供し、対応する推定アミノ酸配列を配列番号６に提供する。配列決定からは、細胞が哺乳動物細胞で広範に継代されていたなら失われるはずの、エンベロープタンパク質中のインタクトなグリコシル化部位が示された。ジカウイルスは、Vero細胞で細胞変性効果（ＣＰＥ、cytopathic effect）を産生し、最適感染効率（ＭｏＩ、Multiplicity of Infection）及び採取条件で、１０ｅ８．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ又は１０ｅ８．５ＰＦＵ／ｍＬを超えるウイルス力価を達成できた。
ジカウイルス精製
パイロットスケールでのジカウイルス培養のためにウイルス培養をＴ−１７５フラスコからＣＳ１（細胞スタック１）、ＣＳ１０（細胞スタック１０）及びＣＳ４０（細胞スタック４０）に体系的に大規模化した。標準化したＭｏＩのウイルスで同時に感染させた複数のＣＳ４０を、大規模産生に使用した。複数のＣＳ４０の使用は、所望の容量の産生への急速で直線的な大規模化を可能にする。各ＣＳ４０からの採取容量は、およそ８〜１０Ｌであった。ウイルスを４〜６日目又は９０％を超えるＣＰＥが達成された場合に採取した。代替的に温度３５℃〜３７℃、ｐＨ７．０以上、最適にはｐＨ７．４、溶存酸素４５〜７５ｐｐｍ、好ましくは６０ｒｐｍ及び撹拌２４０〜２８０ｒｐｍ、１Ｌ〜１００Ｌの培養物容量規模に最適化された最適に制御された流入及び流出の十分に標準化された条件下のディスポーザブルバイオリアクターを、細胞密度及びウイルス採取を増加させるために使用した。ウイルス採取物を精密ろ過又は１．２μＭ及び０．４５μＭのカットオフを有する二重フィルターを使用することによって清澄化した。次いで清澄化したウイルス採取物をリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中でCapto core700カラム（GE Healthcare Life Sciences社）に通した。フロースルー中のジカウイルス含有画分は、１００ｋＤａ又は３００ｋＤａいずれかのカットオフ膜を使用するダイアフィルトレーションによって濃縮してよい。濃縮ウイルス画分をウイルス不活化のために使用した。代替方法では清澄化ウイルス採取物を続くセクションに記載の方法によりＢＰＬ又はホルマリンのいずれかで不活化し、次いでカラムにロードした。ウイルスの純度を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。精製の前及び後のウイルスの不活化において収量又は純度に顕著な差異はなかった。ウイルスを塩勾配でのセルファインサルフェート、DEAE-Sephadex CM-sephadex及びセファロースCL-4B上のゲルろ過、０．２Ｍ〜０．８Ｍリン酸の勾配でのセラミックヒドロキシアパタイトカラム、続いてすべての場合において１００又は３００ｋＤａカットオフ膜を使用するダイアフィルトレーションを使用して精製した。ウイルス調製物の純度を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のウイルス試料の銀染色（図１を参照されたい）で調べた。前述の方法によるジカウイルスは、ワクチンバルク抗原としての使用のために好適な高純度に精製できた。ウイルスを、１００，０００ｘｇ、６〜８時間の遠心分離後にHitachi社製 HIMACultracentrifugeのP28Sローターを使用して２０〜６０％ショ糖勾配での超遠心分離によっても精製した。
ジカウイルス不活化
ジカウイルス試料をワクチン抗原としての使用のために種々の方法によって不活化した（死滅させた）。ホルマリン不活化を１：１０００（ホルマリン：ウイルス、ｖ／ｖ）〜１：４０００（ホルマリン：ウイルス、ｖ／ｖ）の範囲の種々の濃度、温度２５±５℃、さらに具体的には２２℃で検査し、ウイルス不活化の動態を２４時間ごと、１０日間までモニターし、日常的にはウイルス不活化は２５±３℃、好ましくは２２℃、７日間で実行した。ウイルス不活化は、１：１０００ｖ／ｖホルマリン：ウイルス〜１：３５００ｖ／ｖホルマリン：ウイルスまでのすべての濃度、前述の温度及び時間間隔で有効であった。ホルマリン：ウイルスの１：４０００ｖ／ｖの割合は、ウイルス不活化に３０〜３７℃までの高温で、３〜７日間有効であった。ホルマリン不活化は、ホルマリン対ウイルスの前述のすべての割合、２〜８℃の温度範囲で１０日間より長い時間間隔でインキュベートした場合に有効であった。したがってホルマリン不活化は、２℃〜３７℃の任意の温度、２４時間から１０日間を超える範囲の時間間隔でのウイルス不活化の柔軟性を、不活化のために使用される条件に応じて付与する。ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）でのジカウイルス不活化を種々の条件下で検査した。ジカウイルスはＢＰＬ濃度１：１０００（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）〜１：３５００（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）、温度２５±５℃、２４〜４８時間で完全に不活化された。ＢＰＬのさらに高い濃度又は３７℃までのさらに高い温度での完全な不活化は、２４時間以下で達成され、ウイルスの急速不活化のための方法として使用できる。ジカウイルスは、２〜８℃、３〜７日間でインキュベートした場合にＢＰＬの前述の濃度でも不活化できる。１：３５００（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）、２２〜２５℃、４８時間、及びそれに続く１：３０００〜１：４０００ｖ／ｖのホルマリン：ウイルスの低濃度のホルマリン、２４時間での処置でのＢＰＬ不活化の組合せは、ウイルスを不活化する及び安定化することの両方において有効であった。ＢＰＬ及びホルマリンの任意の濃度は、不活化が免疫原性に有害な影響を有することなく完了できる限り、ウイルスを不活化する及び安定化することの両方のために使用できた。不活化は、０．００５％〜３％までの最終濃度の過酸化水素、２０℃〜２５℃、期間２時間で検査した。さらに低い濃度の過酸化水素での数分間以内の短い曝露時間ではウイルスの免疫原性に有害な影響はなかったが、検査したより高い用量の濃度での長期間では有害であった。さまざまな期間及び用量濃度への曝露後の不活化ウイルス試料は、感染性ウイルス粒子について、もしあればＴＣＩＤ５０／ｍＬ、５分間から６時間まで、間隔５、１０、２０、３０及び６０分間並びに２、４及び６時間で力価測定した。さらに高い濃度ではウイルスは、数秒間以内に不活化された。各時点で反応は、急速に過酸化水素を加水分解する１０Ｕ／ｍＬのカタラーゼの添加によって停止した。不活化のための最適濃度は、ＴＣＩＤ５０／ｍＬによる感染性粒子の滴定及び続く免疫原性によって決定されたとおり最終０．０１％、継続時間６０分間以下であった。過酸化水素でのジカウイルス不活化は、試料中のウイルス粒子の濃度によりさまざまな濃度、さまざまな時点での曝露の継続時間の柔軟性を提供する。
精製したジカウイルス試料を温度５０℃〜６５℃で６０分間まで熱不活化した。ウイルスのＵＶ不活化を２５４ｎｍ、１２０分間までのＵＶ曝露で実行した。
ジカウイルスをHyderabadのGamma Agro Medical Processing Facilityで６０Ｃｏ源からの２０ｋＧｙ（キロＧｒａｙ）から３５ｋＧｙまでの曝露によるガンマ照射によって不活化した。上のすべての不活化方法を種々の濃度のショ糖、乳糖、トレハロース、マルトース、特にマンノースなどの糖などのウイルス安定化剤の存在及び非存在下で実行した。安定化効果を付与するために使用した糖アルコールは、ソルビトール及びマンニトールであった。検査したアミノ酸は、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン及びＬ−アスパラギン酸及びＬ−グルタミン並びに同様にヒト血清アルブミン並びに前述の安定化剤の１又は２以上の組合せから選択した。最も有効な安定化剤は、０．５％〜２％、好ましくは０．５％のＬ−グリシンとの組合せでの０．５％〜２％、好ましくは１．０％のソルビトールであった。組合せでのマンニトール及びＬ−グリシンは、マンニトール及びＬ−グリシンの単独よりも不活化の際にウイルス試料を安定化することに有効であった。
ワクチン抗原使用のためのすべての前述の方法によって不活化されたジカウイルス試料をVero細胞で３回連続で連続継代し、不活化期の最後にＴＣＩＤ５０によって感染性ウイルスについて検査することによって不活化の完全性について検査した。加えてインビトロでの３回連続継代後の不活化ウイルス試料を２日齢マウスの頭蓋内に注射し、死亡率及び発育異常について２１日間観察し、インビトロ及びインビボ検査で有害作用が示されなかった場合に完全に不活化されたと見なした。ホルマリン及びベータプロピオラクトン不活化ビリオンについて前述の範囲の濃度及び検査した種々の期間で感染性は観察されなかった。上に開示の方法の代表的な一例としてホルマリン及びＢＰＬによるジカウイルスの不活化動態を図２（図２Ａ及び図２Ｂ）に示す。
ジカウイルスprMEタンパク質の組換えクローニング及び発現
ジカウイルスの配列番号３のprMEタンパク質の翻訳領域（ＯＲＦ、Open Reading Frame）をコードしているヌクレオチド配列配列番号１の合成遺伝子をGenScript, NJ, USAで合成した。遺伝子を配列番号３のprMEタンパク質をコードする配列番号１の約２．１ｋｂ断片を得るために、下に列挙するプライマーでＰＣＲ増幅した。図３Ａを参照されたい。
ＦＶＦＰ：5’AACTGCTCGAGGAATTCGGATCCAAC 3’
ＦＶＲＰ：5’AATGGGCATGCCTGCAGGCGGCCGCTC 3’
ＰＣＲ増幅断片をEcoR1及びNot1制限酵素で消化し、pFastBacプラスミドベクター（Life Technologies社, Carlsbad, CA, USA）のEcoR1及びNot1部位、多角体プロモーターの制御下に、Bac to Bac Baculovirus expression system (“An efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high-level expression of recombinant proteins, Life Technologies, USA)の使用取扱説明書に記載の方法を使用してクローニングした。簡潔には方法は、大腸菌で増殖されるバキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）への、上に記載のクローニングされた挿入物を含む組換えpFastBacベクターなどの発現カセットの部位特異的遺伝子転位を利用する。多角体プロモーターの制御下にクローニングされた挿入物配列番号１又は配列番号２の内の１つを含有する組換えpFastBacベクターを、組換えバクミドの効率的な再生成を可能にし、遺伝子転位を促進するバキュロウイルスシャトルベクター（bMON14272）及びヘルパープラスミド（pMON7124）を含有している大腸菌Max Efficiency DH10Bac（商標）のコンピテント細胞に形質転換する。組換えバクミドは、アンピシリン、ゲンタマイシン及びカナマイシン含有プレート上でbluo-gal又はX-gal及びＩＰＴＧを使用する青色／白色選択によって選択した。遺伝子挿入物の存在についてＰＣＲによって確認した後の組換えバクミドを前述の使用取扱説明書に記載の標準的プロトコールによって単離した。約１μｇのバクミドＤＮＡを無血清昆虫細胞培地で増殖させたヨトウガ（Spodoptera frugiperda）Sf9昆虫細胞（Life Technologies社, Carlsbad, USA）においてリポフェクタミンでのトランスフェクションのために使用した。Ｐ１ウイルスストックのトランスフェクション、単離及び滴定のために使用した方法は、上に記載のBac to Bac Baculovirus expression systemの使用取扱説明書に記載のとおりある。Ｐ１ストックは、Sf9細胞での組換えprMEタンパク質の発現のための高力価Ｐ３ストックを得るために２回連続増幅した。配列番号３のprMEタンパク質の発現のための高力価バキュロウイルスストックをSf9細胞の２５ｍＬ懸濁培養物中で発現させ、５００ｍＬフラスコあたり１２５ｍＬまで体系的にさらに大規模化した。複数のフラスコからのバキュロウイルス感染細胞を感染７２時間後に採取し、プールし、１ｘＰＢＳ ｐＨ７．６で１回洗浄し、１０ｍＭリン酸を含有する５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ及び５ｍＭ ＥＤＴＡの細胞溶解緩衝液、ｐＨ７．６中に溶解した。細胞可溶化物を２０，０００ｒｐｍ、３０分間で細胞デブリを除去するために遠心分離し、上清を１０ｋＤａカットオフ膜を有するタンパク質濃縮器を使用して濃縮した。濃縮試料をあらかじめ平衡化した２０％〜６０％ショ糖勾配上に重ね、１００，０００ｘｇ、６〜８時間遠心分離した。組換え膜及びエンベロープタンパク質を含有する画分を単離し、ウサギＲ７６６ポリクローナル抗血清を使用してウエスタンブロットによって確認した（図３Ｂ）。精製された組換えタンパク質は、配列番号３のタンパク質をコードする遺伝子配列配列番号１を使用して発現させた最新のアジア遺伝子型のジカウイルスの配列のものである。組換えMEタンパク質は、ウエスタンブロットで及びＥＬＩＳＡでMR766抗体と交差反応し、下のセクションに記載のとおりBalb/cマウスでの検査のためにワクチン抗原として製剤化した。
ワクチン製剤
先行する実施例における前述のいずれかの方法のジカウイルスワクチン抗原をアジュバントと併せて又は併せずに実験動物において免疫原性について検査した。高い結合（９５％を超える）が４０ｍｃｇの高抗原用量で検査した場合でも用量あたり０．１ｍｇ〜１．５ｍｇのアルミニウム（水酸化アルミニウムとして提供される）の用量範囲で使用された、アジュバントとしての水酸化アルミニウム（Alhydrogel（登録商標）2%Brenntag）について観察された。結合は、マウスでの検査のために使用された先行するセクションで検討されたジカウイルス抗原並びにＣＨＩＫＶ及びＪＥ抗原を含むワクチン合剤のすべての濃度で完了した。水酸化アルミニウムへの結合は、３時間、室温で実行した。製剤のアリコートを５０００ｘｇ、５分間遠心分離し、上清を抗原ＥＬＩＳＡによって結合の完了について検査した。抗原の結合はＥＬＩＳＡによって上清においてそれが検出できなかったことから完了していた。アジュバント化製剤のための緩衝液は、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４０±０．２を含有し、１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシンを含有してよい１０ｍＭリン酸緩衝液であった。具体的な製剤のために使用される他の緩衝液を下に述べる。下に列挙したアジュバントを比較免疫原性について検査し、すべての場合について濃度はワクチンの用量あたりで示す。不活化ジカウイルス抗原を用量あたり１０μｇで検査した：
ａ）イヌリン（Orafti-HPX, Beneo社）を用量あたり０．５ｍｇで検査した；ガンマイヌリンを（Cooper PD, Steele EJ. The adjuvanticity of gamma inulin. Immunol Cell Biol. 1988, 66:345-52）に記載の方法によって調製した
ｂ）水酸化アルミニウム及びイヌリンの合剤、イヌリン及び水酸化アルミニウムの合剤、アルガムリンを１０：１（１０ｍｇ／ｍＬイヌリン：１ｍｇ／ｍＬアルミニウム、水酸化アルミニウムとして）の割合で調製し、用量あたり０．５ｍｇで検査した
ｃ）ムラミルジペプチド（Ｌ１８−ＭＤＰ）（tlrl-Imdp, Invivogen社）用量あたり１０μｇ
ｄ）用量あたり２５μｇでのＭＰＬ（サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）由来のリピドＡモノホスホリル、L-6895-1 MG, Sigma Aldrich社）
ｅ）用量あたり０．２５ｍｇアルミニウム（水酸化アルミニウムとして）及び２５μｇのＭＰＬの合剤
ｆ）９．７５ｍｇのスクアレン（S3626-100ML, Sigma Aldrich社）、１１．８６ｍｇのアルファ−トコフェロール（T3251-5G, Sigma Aldrich社）、４．５８ｍｇのTween-80（61771205001730, Merck社）を、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４±０．２中に含有する水中油乳剤（ＯＷＥＭ１）。
ｇ）９．７５ｍｇスクアレン、１．１７５ｍｇのtween-80、１．１７５ｍｇ Span-85（S7135-250ML, Sigma Aldrich社）を１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ７．０中に含有する水中油乳剤３（ＯＷＥＭ２）
ｈ）用量あたり２５μｇでのポリＩＣ（ポリイノシンポリシチジン酸、カリウム塩、カタログ番号P9582-5MG, Sigma Aldrich社）
ｉ）用量あたり０．７５ｍｇでのコレカルシフェロール（Arachitol, Abbot社）
ｊ）レシキモド（SML0196-10MG, Sigma Aldrich社）＋ポリＩＣ、各２５μｇ
ｋ）９．７５ｍｇスクアレン、１．１７５ｍｇのtween-80、１．１７５ｍｇ Ｓｐａｎ−８５（S7135-250ML, Sigma Aldrich社）を１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ７．０中に含有するレシキモド（２５μｇ）＋水中油乳剤２
ｌ）水酸化アルミニウムとして提供される用量あたりアルミニウム０．２５ｍｇ及び０．５ｍｇ
上のすべての製剤は、高レベルの中和抗体を誘発した、結果を図４に示す。さまざまな濃度での前述のアジュバントの個々の構成成分及びそれらの任意のアナログ、誘導体、側鎖置換体並びに上の任意の構成成分の任意の修飾物は、それらが免疫賦活効果を有する限り、無毒性ワクチンアジュバント構成成分として使用され得る。前述のセクションに記載した用量あたり各１０μｇの濃度でのホルマリン不活化及び組換えジカワクチン抗原を次の賦形剤：１％マンニトール及び０．５％グリシン、５％ショ糖及び１％トレハロース、５％ショ糖及び１％マルトース並びに２％マンニトール及び０．５％グリシンのいずれかと併せて凍結乾燥した。乾燥した凍結乾燥製剤は、水、通常の生理食塩水及び１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４±０．２を含む水溶液中に容易に復元され得る。製剤の安定性は、３７℃で、２週間検査された。塊（cake）の特徴に変化は観察されず、製剤の安定性を示している。水分含有量は１％未満であった。
安定化剤の効果
非アジュバント化ワクチン抗原としての使用のためのホルマリン不活化ワクチンバルクの安定性を次の濃度の安定化剤：ａ）２％ソルビトール及び１％ Ｌ−グリシン；ｂ）１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン、ｃ）１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；ｄ）１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グルタミン酸、ｅ）１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン、１％ヒト血清アルブミンで、安定性について検査した。安定性検査は、３７℃、２週間で行われ、抗原濃度は３７℃での曝露前又は後にＥＬＩＳＡによって検査した。１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシンを含む非アジュバント化製剤１μｇ及び１０μｇをBalb/cマウスにおいて免疫原性について続くセクションに検討のとおり検査した。
動物モデルでのワクチン製剤の効力検査
前述の方法によって不活化したジカワクチン抗原をBalb/cマウスにおいて容量１００μＬ（部位あたり５０μＬで２カ所に注射した）中に用量あたり０．１２５μｇ〜４０μｇまでの抗原で、用量あたりアルミニウム（水酸化アルミニウムとして）０．２５ｍｇを含む形で、０、１４、２８日目の筋肉内経路によって検査した。アルミニウム（水酸化アルミニウムとして提供された効果についての最初の検査は、アルム吸着ワクチンが非アジュバント化ワクチンよりも高い力価の中和抗体を与えたことを示した。アルムを含まない約１及び１０μｇの不活化ワクチン抗原は、ワクチン抗原に安定性を付与するために賦形剤として１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシンを含有した。血液をＰＲＮＴ５０による中和抗体力価、ＥＬＩＳＡによる総Ａｂ力価、Ａｂアビディティー及びサイトカインプロファイルの概算のために眼窩後方洞から１３、２１及び３５日目に採取した。各投薬後の採血及び検査は、ワクチン調製物の単一、２用量及び３用量の効力及び安全性についてのデータをもたらした。動物を３６日目に１０ｅ５ＰＦＵのジカウイルスで静脈内経路によってそれぞれ感作した。血液試料をホルマリン群について７日目まで２４時間間隔で、ＢＰＬ不活化群について４８時間及び９６時間の２点で５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０、50% Tissue Culture Infectious Dose）によってウイルス血症に対する防御をモニターし、あればウイルス力価をＴＣＩＤ５０／ｍＬとして表した。動物感作研究は、検査した１μｇ〜４０μｇの用量群においてウイルス血症からの完全防御を示した。それによりＢＰＬ及びホルマリン不活化ワクチン製剤をBalb/cマウスにおいてＩＭ経路によって用量あたり０．５μｇで、及び０．２５μｇ０．１２５μｇでさらに検査し、低希釈物でさえ免疫原性であることを見出した。アルムアジュバント化製剤について用量あたり０．２５ｍｇのアルミニウム（水酸化アルミニウムとして）をプラセボ対照として使用し、非アジュバント化製剤について、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン、ｐＨ７．４０を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液を媒体対照として使用した。すべてのホルマリン及びＢＰＬ不活化製剤は、図５Ａ、図５Ｂ及び図６に示すとおり高レベルの中和抗体を誘発し、ウイルス血症に対して防御した。抗原のみの製剤も高レベルの中和抗体を誘発し、ウイルス感作から防御した。昆虫細胞において発現された組換えprMEタンパク質をBalb/c（８匹）での用量あたり０．２５ｍｇアルミニウム（水酸化アルミニウムとして）を含む形で１０及び２０μｇの２つの用量で製剤化し、０及び２１日目に筋肉内注射し、中和抗体を誘発した、データを表１に示す。１０μｇの用量濃度で用量あたり０．２５ｍｇアルミニウム（水酸化アルミニウムとして）を含む形で製剤化されたガンマ照射及び過酸化水素不活化ジカウイルス抗原をBalb/cマウスに０及び２１日目にＩＭ経路によって注射し、ＰＲＮＴ５０による中和抗体の概算のために２８日目に血液を採取した。１０μｇのホルマリン不活化ウイルス抗原を実施例５に開示の各アジュバントと製剤化し、４〜６週齢Balb/cマウス（用量群あたり５匹）に筋肉内注射し、中和抗体及びサイトカインの概算のためにワクチン投与２１日後に血液を採取した。対照群は各アジュバントに含まれ、中和抗体（ＰＲＮＴ５０により≦１０）は検出できず、データは示さない。各群由来のプール血清を使用したさまざまなアジュバント化製剤のＰＲＮＴ５０による中和抗体力価を図４に示す。高レベルの中和抗体が前述のアジュバント化製剤によって誘発された。
アルボウイルス抗原の混合ワクチンを次の濃度で調製し、Balb/cマウスで検査した：ａ）三価ワクチン合剤中の１０μｇホルマリン不活化ジカウイルス抗原、２０μｇのＢＰＬ不活化チクングニアウイルス抗原及び６μｇのホルマリン不活化ＪＥ抗原、ｂ）１０μｇホルマリン不活化ジカウイルス抗原及び２０μｇのＢＰＬ不活化ＣＨＩＫＶウイルス抗原、ｃ）１０μｇのホルマリン不活化ジカウイルス抗原及び６μｇのＪＥウイルス抗原。上のすべてのワクチン合剤を用量あたり０．２５ｍｇアルミニウム（水酸化アルミニウムとして）でBalb/cマウス（各８匹）において、前述の抗原のいずれかだけを含む適切な対照及び等量のアルムを受けた対照動物と共に検査した。動物を初回免疫処置の１４及び２１日後に追加免役（boost）した。血液を最後の追加免疫注射の７日後に回収した。血清試料をジカ、ＣＨＩＫＶ及びＪＥＶについてＰＲＮＴ５０による中和抗体の概算のために使用した。すべての製剤において使用した緩衝液は、１５４ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２〜７．６であった。上に開示のすべての方法は、チクングニアウイルス、ジカウイルス及び日本脳炎ウイルスの任意の遺伝子型／遺伝子型バリアント／血清型及び株に適用可能である。結果について表１を参照されたい。

表1レジェンド: 用量あたり０．２５ｍｇのアルミニウムを含む形で製剤化されたジカウイルスの精製された組換えprME抗原並びに過酸化水素不活化及びガンマ照射ジカウイルス抗原は、Balb/cマウスにおいて中和抗体を誘発した。力価をLog10PRNT50値として表す。ワクチン合剤は、２つ又は３つ以上の抗原が単一の製剤中で投与された場合に中和抗体を誘発し、JE、ジカ及びCHIKVウイルスの間に顕著な抗原の干渉は観察されなかった。
受動免疫処置研究
中和抗体がジカウイルス感染に対する防御と関連する重要な免疫であるという概念の証明は、既知の力価のウサギポリクローナルジカ抗血清の１回の注射から実証された。ＰＢＳで１：１に希釈した約２００μＬの抗血清をBalb/cマウスに腹腔内注射し、８〜２４時間後に１０ｅ５ＰＦＵのジカウイルスで静脈内経路により１００μＬの容量で感作した。同じ数の対照動物は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を受け、ウイルス注射を検査動物と同様に受けた。ウイルス血症の検出のために血液を両群の動物においてウイルス感作２４、４８、７２、９６及び１４４時間後に回収した。受動免疫処置はウイルス血症に対して完全防御を提供し、感染性ウイルスはＴＣＩＤ５０によって検出できなかった。図７を参照されたい。ウイルス血症は、対照動物において観察され、ウイルス感作後６日間まで継続した。ジカ抗体は、ジカウイルス感染を回復、除去又は予防するための治療剤として使用できる。
中和抗体力価についてのアッセイ
さまざまな不活化剤で不活化され、さまざまなアジュバントを含む形で製剤化されたすべての一価のジカワクチンを含む、実施例７に記載のマウスにおける前述のワクチン検査由来の動物血清、投与量決定試験由来のワクチン抗血清並びに先のセクションに記載のＣＨＩＫＶ及びＪＥＶを含む混合ワクチンを中和抗体について標準的手順による５０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ５０、50% Plaque Reduction Neutralization Test）によってアッセイした。簡潔にはアッセイの前日に、６ウエルプレートにVero細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）１ウエルあたり２．５ｘ１０３個を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。等量の標準化ジカウイルス株（１０５ｐｆｕ／ｍＬ）を含有するＭＥＭ中の血清試料の４倍希釈物を加え、３７℃、５％ ＣＯ２で９０分間インキュベートした。細胞を１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸）で２回洗浄し、血清−ウイルス混合物の各希釈物０．３０ｍｌを対応するウエルに加え、９０分間、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。各アッセイを３回反復で実行した。細胞を１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１％Ｌ−グルタミンを含むＭＥＭ中の０．８５％メチルセルロース２ｍｌで覆った。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで４日間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、プラークを１０％ホルマリンで固定し、１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレッドで可視化した。対照ウイルス試料によって形成されたプラークの数を５０％低減させた最も高い希釈の血清をＰＲＮＴ５０力価として概算した。ワクチン合剤からの抗ＣＨＩＫＶ及び抗ＪＥ抗体もＰＲＮＴ５０を概算した。すべての前述のワクチン抗原は、図５及び６に記載のとおり高レベルの中和抗体を誘発した。
ジカウイルス交差中和研究
ホルマリン不活化ワクチン抗血清は、アフリカ遺伝子型の同種MR766ウイルス株及びアジア遺伝子型のFSS13025ジカウイルス株（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ Ｎｏ．ＪＮ８６０８８５）をMR766及びFS13025株に対してそれぞれ１８１０５及び１８３２５のＰＲＮＴ５０力価で等効率で交差中和した（研究ＢＳ−３０１８はIBT Bioservices社, Gaithersburg, MD, USAと契約した）。簡潔にはMR766及びFS13025ジカウイルス株の両方を無血清培地中約２５０ＰＦＵに希釈した。ワクチン抗血清及び対照血清（プラセボ）の両方を２倍希釈で系列希釈した。ウイルス試料を１：１で系列希釈血清試料と混合し、３７℃、２時間インキュベートした。２４ウエルプレートに播種したVero細胞を希釈物で１時間感染させ、０．８５％メチルセルロースを各ウエルに加え、３日間インキュベートした。細胞を固定し、プラークアッセイによって分析した。プレートをスキャンし、プラーク数を、４ＰＬカーブフィットを使用してＰＲＮＴ５０力価を計算するために使用した。それによりワクチン抗原の調製、製剤化及び検査方法は、一遺伝子型を有するワクチンが異種株を１００％交差中和することから、ジカウイルスの任意の遺伝子型にわたって完全に適用可能であり、このことは、ジカウイルスには血清型は存在せず、任意の株を使用したジカの不活化ワクチンが、任意の遺伝子型、遺伝子型バリアント又は実際のところ任意のジカウイルス株を使用して調製されたワクチンと同等に防御的及び強力であることも証明している。昆虫細胞においてprME（配列番号３のタンパク質）として発現された組換えタンパク質に対して生じた抗体がMR766ウイルスを高効率で交差中和する場合に、この事実はさらに実証された。配列番号３のタンパク質は、アジア遺伝子型のさらに最新の株であるアフリカ遺伝子型のジカウイルス株H/PF/013のprMEに由来する。配列番号６の完全なＯＲＦをコードしているヌクレオチド配列番号５の同種MR766株と、配列番号８の完全なＯＲＦをコードしている配列番号７の異種FSS13025とのワクチン抗血清の交差中和を図８Ａ及び図８Ｂに示す。
抗体ＥＬＩＳＡ
簡潔にはジカウイルス抗原をコーティング緩衝剤中の標準化された濃度で９６ウエルプレートに一晩、２〜８℃でコートした。プレート内容物を廃棄し、ウエルをブロッキング緩衝液でブロックし、ワクチン抗血清を系列希釈で加える前に十分に洗浄した。各ワクチン抗血清を３回反復でアッセイした。抗体希釈緩衝液中１：２５００に希釈した二次抗体（抗マウス−ＩｇＧ ＨＲＰＯコンジュゲート）を加える前にプレートを９０分間、３７℃でインキュベートした。各ウエルを洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ、ｐＨ７．４）で５回、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回、それぞれ３０秒間洗浄した。約１００μｌ／ウエルの新鮮調製基質溶液を加え、室温、１０分間、発色のためにインキュベートした。発色を５０μＬ／ウエルの停止溶液の添加によって停止させた。吸光度を４９２ｎｍで読み取り、結果を記録した。各アッセイについて、抗原ブランク、一次及び二次抗体ブランクを対照として含めた。抗体陽転カットオフ値＝曝露前平均力価＋（３ｘ標準偏差）。陽性に転換した試料の、曝露前レベルの力価に相当する力価を示す最終希釈物を同定した。陽性に転換した試料の最後から２番目の希釈の逆数を抗体最終力価と解釈した。ＢＰＬ不活化及びホルマリン不活化ジカワクチン製剤の両方への抗体力価は、抗原単独よりも水酸化アルミニウムを含んだ方が高かった。すべての用量（図９Ａ〜９Ｃ）でのホルマリン不活化ワクチンのワクチン製剤及びすべての用量のＢＰＬ不活化ワクチン（データ未記載）は、各用量のワクチン投与後に高レベルの抗体を誘発し、ジカウイルスに対する強い免疫応答を誘導するためにワクチンを単一用量として又は２つ又は３つ以上の用量で投与できることを確認した。
抗体アビディティー
ワクチンに対する抗体応答の性質を抗体アビディティーアッセイによって概算した。抗原抗体結合のアビディティーはＢ細胞での親和性成熟の程度である。より高い抗体アビディティーは、いくつかのワクチン研究において中和抗体と関連している。アビディティー指数の決定の前に、イソチオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）、０Ｍ〜６Ｍ濃度での滴定を０〜２．０Ｍで０．２５Ｍステップで実施した。一次抗血清の抗原コートプレートへの添加及びインキュベーション後に、プレートを段階的な濃度のＮａＳＣＮと１５分間、断続的に振とうしながらインキュベートし、通常のＥＬＩＳＡと同様に洗浄及び発色させた。各濃度で得られた光学密度をプロットした。最も高いＯＤ（Ａ）をプロットし、半数（Ａ／２）及び、Ａ／２でのＯＤ曲線の間の距離をＮａＳＣＮシフト値として測定した。ＮａＳＣＮシフトは、初回投与（prime dose）と比較して１回目の追加投与（booster dose）後の方が高く、２回目の追加免疫投与後は変化がない又は僅かに増加し続け、高親和性抗体が経時的に追加免疫注射で生じたことを示している。ＥＬＩＳＡ滴定における基準点は、カオトロピック剤ＮａＳＣＮを含む又は含まない形で処置された血清試料のＥＬＩＳＡにおける抗体濃度（吸光度によって測定される）の比であるアビディティー指数の（ＡＩ、avidity index）の計算を必要とした。１μｇのホルマリン不活化ジカワクチンの最低単一用量濃度でさえ、抗原への高親和性結合を有する抗体が検出され、低濃度のワクチン抗原でも、ワクチンは強力であることを示している（図１０を参照されたい）。
サイトカインプロファイリング
水酸化アルミニウムを含むさまざまなアジュバントを含む形で及び比較のために抗原のみの対照として製剤化された２用量のホルマリン不活化ジカ抗原の投与後に、Ｔｈ１及びＴｈ２両方のサイトカインをマウス血清中で概算した。Mouse ELISA kit - Th1 / Th2（カタログ番号88-7711-44, eBioscience社）をキット中に提供された標準物を使用して正確にキットプロトコールのとおりの方法によってＩＬ−２、ＩＦＮガンマ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の概算のために使用した。サイトカインの濃度はｐｇ／ｍＬで表す。Ｔｈ１サイトカインレベルについての結果は図１１Ａ及び図１１Ｂに示し、Ｔｈ２サイトカインは図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。
ウイルス力価の概算
上流及び下流バイオプロセス試料中の感染性ウイルス粒子の量、動物感作研究のためのジカウイルス力価をＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）アッセイによって測定した。このアッセイは、５０％の細胞において細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じるウイルス試料の希釈物を測定した。Vero細胞を９６ウエルマイクロプレートに播種し、５％ ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。細胞をウイルス試料の１０倍系列希釈で感染させ、５日間、５％ ＣＯ２、３３℃でのインキュベーションが続いた。細胞をＣＰＥについて視覚的に検査し、ＴＣＩＤ５０力価をReed LJ. Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. (1938) 27 (3): 493-497（参考文献）の方法により計算した。結果をｌｏｇ１０力価（１０ｘＴＣＩＤ５０単位／ｍＬ）として表す。代替的にプラークアッセイを使用し、力価をプラーク形成単位、ＰＦＵ／ｍＬとして表した。
（参考文献）
１．Cooper PD, Steele EJ. The adjuvanticity of gamma inulin. Immunol Cell Biol. 1988, 66:345-52.
２．Reed LJ. Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. (1938) 27 (3): 493-497

Claims (69)

  1. ジカウイルス、チクングニアウイルス、及び日本脳炎ウイルスから選択される１又は２以上のアルボウイルス抗原を含む安定なワクチン組成物であって、前記抗原が、薬学的に許容される緩衝剤中にアジュバントを含む又は含まない形で製剤化されており、前記ワクチン組成物が、哺乳動物において前記ウイルスのそれぞれに対する防御免疫応答を誘発する、前記ワクチン組成物。
  2. ジカウイルス抗原が、ジカウイルスの任意の遺伝子型／遺伝子型バリアント／株に対する治療、診断、及び予防において有効である、請求項１に記載のワクチン組成物。
  3. ゲノムの任意領域においてアミノ酸レベルで５０％〜１００％の間の任意の同一性を共有している任意の遺伝子型／遺伝子型バリアント／株／合成ジカウイルスに対して有効である、請求項２に記載のワクチン組成物。
  4. 任意の遺伝子型／遺伝子型バリアント／株／合成ジカウイルスのジカウイルス抗原を含む、請求項３に記載のワクチン組成物であって、任意の前述のジカウイルス型に対する抗体が、同種ウイルス又は、全ゲノムの任意の領域、特にエンベロープＥタンパク質において少なくとも５０％〜１００％アミノ酸同一性を共有している任意の異種ジカウイルス株を交差中和する、前記ワクチン組成物。
  5. ジカウイルス、チクングニアウイルス、及び日本脳炎ウイルスの抗原が、不活化全ビリオン（ウイルス）抗原である、請求項１に記載のワクチン組成物。
  6. ジカウイルス抗原及びチクングニアウイルス抗原が、精製された組換え抗原である、請求項１に記載のワクチン組成物。
  7. ジカウイルス抗原が、ウイルスをVero細胞に順応させることによってVero細胞を細胞基質として使用して調製される、請求項１に記載のワクチン組成物。
  8. ジカウイルス抗原が、
    ａ．超遠心分離；
    ｂ．密度勾配遠心分離；
    ｃ．膜ろ過を使用するウイルス採取物の清澄化、及びそれに続く、カラムクロマトグラフィーによる精製；並びに
    ｄ．１００ｋＤａ〜３００ｋＤａのカットオフを有する膜を使用するタンジェンシャルフローろ過であって、タンジェンシャルろ過が、ウイルス不活化の前又は後に実行される、タンジェンシャルフローろ過
    から選択される１又は２以上の方法から得られる精製及び濃縮された抗原である、請求項１に記載のワクチン組成物。
  9. カラムクロマトグラフィーによる精製が、ゲルろ過、混合モードレジンカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティマトリクスクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項８に記載のワクチン組成物。
  10. カラムクロマトグラフィーが、Capto core700などのフロースルー中に、最も好ましくはCapto core700のフロースルー中に、ウイルス抗原の大部分を溶出し、
    ウイルス試料が、Capto core700カラムで精製され、フロースルー中に溶出される、請求項９に記載のワクチン組成物。
  11. ジカウイルスが、化学的不活化薬剤、物理的不活化剤薬剤、及び照射剤の少なくとも１又は２以上によって不活化される、請求項５に記載のワクチン組成物。
  12. ジカウイルスの不活化が、ウイルスの精製の前又は後に実行される、請求項１１に記載のワクチン組成物。
  13. ジカウイルスが、ホルマリン（ホルムアルデヒド）、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）、及び過酸化水素から選択される化学的不活化剤によって不活化される、請求項１２に記載のワクチン組成物。
  14. ジカウイルスが、次の：
    ａ．ホルマリン：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、８℃〜３７℃、好ましくは２５±３℃、少なくとも１〜７日間でのホルマリン処置；
    ｂ．ホルマリン：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、２℃〜８℃、少なくとも１０〜３０日間でのホルマリン処置；
    ｃ．ベータプロピオラクトン（以下ＢＰＬ）：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、少なくとも２４〜４８時間、温度範囲８℃〜３０℃、好ましくは２５±３℃、４８時間でのベータプロピオラクトン；
    ｄ．１：５００〜１：４０００まで（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）の範囲の任意の濃度、２℃〜８℃、少なくとも３〜７日間でのベータプロピオラクトン；
    ｅ．前述のいずれかの条件でのＢＰＬとホルマリンとの組合せ、好ましくは１：３０００（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）、２４時間のＢＰＬ不活化、及びそれに続く１：３０００（ホルマリン：ウイルス、ｖ／ｖ）、２４〜４８時間、１５℃〜３０℃、好ましくは２５±３℃でのホルマリン不活化；
    ｆ．０．１〜３％、好ましくは０．１〜１％の任意の濃度、２０〜３０℃の任意の温度、５分間〜１２０分間での過酸化水素
    から選択される方法のいずれか１つによって不活化される、請求項１３に記載のワクチン組成物。
  15. 照射剤によるジカウイルスの不活化が、６０Ｃｏ源からの２０ｋＧｙ（キロＧｒａｙ）〜３５ｋＧｙまで、好ましくは２５ｋＧｙ〜３０ｋＧｙの曝露によるガンマ照射による不活化を含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
  16. 照射剤によるジカウイルスの不活化が、２５４ｎｍへの３０〜６０分間曝露によるＵＶ照射による不活化を含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
  17. ウイルスが、温度５０℃〜６５℃の間、３０分間から２時間までの熱処置によって不活化される、請求項１１に記載のワクチン組成物。
  18. 緩衝剤が、緩衝剤の１つとして、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸クエン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）含有緩衝剤、コハク酸緩衝剤、グリシン又はヒスチジンを含有する緩衝剤を含む一覧から選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。
  19. リン酸緩衝液が、リン酸イオン濃度５ｍＭ〜２００ｍＭまで、６．５０〜ｐＨ９の任意のｐＨ、任意選択で塩化ナトリウムを５０〜２００ｍＭの濃度で含有するリン酸ナトリウム緩衝液である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
  20. 緩衝剤が、ウイルス培養から、精製された不活化ウイルスバルクの調製までのバイオプロセス全体を通じて液体組成物中でｐＨ６．５を超える、好ましくはｐＨ７．０を超えるｐＨを維持する、請求項１に記載のワクチン組成物。
  21. ジカウイルスの不活化が、乳糖、ショ糖、トレハロース、マルトース、マンノース、イソ−マルトース、ラフィノース、スタキオース、ラクトビオース、ソルビトール、マンニトール、ラクトビオン酸、デキストラン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、及びヒト血清アルブミン又はそれらの組合せ、から選択される安定化剤の存在下で実行される、請求項１１に記載のワクチン組成物。
  22. 安定化剤が、
    ａ．２％ソルビトール及び１％ Ｌ−グリシン；
    ｂ．１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；
    ｃ．１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；
    ｄ．１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グルタミン酸；並びに
    ｅ．１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン、１％ヒト血清アルブミン
    から選択される、請求項２１に記載のワクチン組成物。
  23. ジカウイルスの不活化が、任意の遺伝子型／株、生弱毒化ジカウイルス、非活化ウイルス、ウイルス様粒子、任意のジカウイルス抗原、特にＥタンパク質を任意の異種ウイルス骨格、ベクター化ワクチン中に保有するキメラウイルス粒子、及び任意のジカウイルスゲノムの配列を使用してインビトロ又はインビボで派生させた感染性合成ウイルス粒子の不活化を含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
  24. 精製された組換えジカウイルスが、ジカウイルス感染の予防のために免疫応答を誘発するためのワクチン抗原として、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質と、任意選択で非構造１（ＮＳ１）タンパク質とを含むジカウイルスの抗原を含む、請求項６に記載のワクチン組成物。
  25. ジカウイルスが、配列番号１及び配列番号２のヌクレオチド配列にそれぞれ対応する配列番号３及び配列番号４に開示の構造タンパク質配列を、遺伝子型又はそのバリアントによって生じるジカウイルス感染に対するワクチン抗原としての使用のために有する、請求項２４に記載のワクチン組成物。
  26. 組換えＤＮＡコンストラクトが、（ｉ）ベクターと、（ii）配列番号３及び配列番号４と少なくとも７０％アミノ酸同一性を共有している任意のジカウイルスタンパク質配列に適用できる、配列番号３、配列番号４のタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれコードしている配列番号１又は配列番号２に対応する少なくとも１つの核酸断片とを含む、請求項６に記載のワクチン組成物。
  27. 組換えＤＮＡコンストラクトを含み、ベクターが、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）としての昆虫細胞における発現のために真核宿主中にクローニングされているバキュロウイルスなどの真核プラスミドベクターである、請求項２６に記載のワクチン組成物。
  28. ジカウイルスの組換えタンパク質が、
    ａ．組換えプラスミドＤＮＡを昆虫細胞にトランスフェクトするステップ；
    ｂ．前記細胞を採取するステップ及びそれから前記組換えタンパク質を単離するステップ；
    ｃ．イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、混合モードレジンクロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、超遠心分離、密度勾配遠心分離、及び塩での分画から選択される方法によって前記タンパク質を精製するステップ
    を含む工程によって得られる、請求項２４に記載のワクチン組成物。
  29. ジカウイルスの構造抗原が昆虫細胞におけるバキュロウイルス媒介発現を含む任意の原核又は真核発現系において発現される、請求項１に記載のワクチン組成物。
  30. 中和抗体が、最適には不活化ウイルス、生弱毒化ウイルス、非活化ウイルス、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子、ベクター化ワクチン中などの任意の異種ウイルス骨格においてジカウイルスＥタンパク質を提示するキメラウイルス粒子、及び任意のジカウイルスゲノムＲＮＡ配列から派生させた合成ウイルス粒子などにおいてエンベロープタンパク質に対して主として誘発される工程によって得られる、請求項１に記載のワクチン組成物。
  31. アジュバントをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
  32. アジュバントが、ａ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸リン酸を含むアルミニウム塩；ｂ）イヌリン；ｃ）イヌリンと水酸化アルミニウムとの合剤であるアルガムリン；ｄ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）；ｅ）レシキモド；ｆ）ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ｇ）Ｎ−グリコリルジペプチド（ＧＭＤＰ）；ｈ）ポリＩＣ；ｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ｊ）ＭＰＬを含む水酸化アルミニウム；ｋ）任意の油中水乳剤；ｌ）次の成分の１又は２以上を含有する任意の水中油乳剤：スクアレン又はそのアナログ又は任意の薬学的に許容される油、tween-80、ソルビタントリオレート、アルファ−トコフェロール、コレカルシフェロール及び水性緩衝剤、又はその分子の任意のアナログ及び誘導体ｉ）ジカウイルス抗原と共に製剤化された場合にウイルスに対する免疫応答を誘発する前述のアジュバントの任意の２つ又は３つ以上の組合せ、からなる群から選択される、請求項３１に記載のワクチン組成物。
  33. ワクチン用量あたりアルミニウム０．１ｍｇ〜１．５ｍｇ、好ましくはワクチン用量あたりアルミニウム０．２５ｍｇ〜０．５ｍｇの範囲の濃度で水酸化アルミニウムを含む、請求項３２に記載のワクチン組成物。
  34. 哺乳動物に投与された場合に、アジュバントが粘膜免疫及び全身性免疫を付与する、請求項３２に記載のワクチン組成物。
  35. ジカウイルス抗原を含む組成物が、哺乳動物において免疫応答を誘発するために単一用量又は２用量又は３用量以上としてのいずれかでアジュバントを含む又は含まない形で用量あたり０．１２５μｇ〜１００μｇの範囲の任意の用量で投与される、請求項１に記載のワクチン組成物。
  36. 筋肉内、皮内、皮下、静脈内、経口、鼻腔内又は経皮経路を含む任意の経路によって請求項１に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、ヒトを含む哺乳動物において防御免疫応答を誘発する方法。
  37. プレフィルドシリンジを含む針及びシリンジ、マイクロニードルパッチ、無針パッチ、吸入並びに点鼻薬を含む任意の方法によって請求項１に記載のワクチン組成物を投与する方法。
  38. ジカウイルス感染に対する免疫診断及び免疫治療剤の調製のための、請求項１に記載のジカウイルス抗体の組成物のインビトロ又はインビボ使用の方法。
  39. それぞれのウイルスに対して哺乳動物において防御免疫応答を誘発するジカウイルス及び日本脳炎ウイルス抗原を混合ワクチン中に含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
  40. ジカウイルス抗原及び日本脳炎ウイルス不活化抗原が、アジュバントを含む又はアジュバントを含まない薬学的に許容される製剤において各抗原５μｇ〜５０μｇの範囲の濃度で混合ワクチン中に存在する、請求項３９に記載のワクチン組成物。
  41. アジュバントが、ａ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸リン酸を含むアルミニウム塩；ｂ）イヌリン；ｃ）イヌリンと水酸化アルミニウムとの合剤であるアルガムリン；ｄ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）；ｅ）レシキモド；ｆ）ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ｇ）Ｎ−グリコリルジペプチド（ＧＭＤＰ）；ｈ）ポリＩＣ；ｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ｊ）ＭＰＬを含む水酸化アルミニウム；ｋ）任意の油中水乳剤；ｌ）次の成分の１又は２以上を含有する任意の水中油乳剤：スクアレン又はそのアナログ又は任意の薬学的に許容される油、tween-80、ソルビタントリオレート、アルファ−トコフェロール、コレカルシフェロール及び水性緩衝剤、又はその分子の任意のアナログ及び誘導体ｉ）ジカウイルス抗原と共に製剤化された場合にウイルスに対する免疫応答を誘発する前述のアジュバントの任意の２つ又は３つ以上の組合せ、からなる群から選択される、請求項４０に記載のワクチン組成物。
  42. アジュバントが、ワクチン用量あたり０．２５ｍｇ〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量を有する水酸化アルミニウムである、請求項４１に記載のワクチン組成物。
  43. それぞれのウイルスに対して哺乳動物において防御免疫応答を誘発するジカウイルス及びチクングニアウイルス抗原を混合ワクチン中に含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
  44. ジカウイルス抗原及びチクングニアウイルス抗原が、アジュバントを含む又はアジュバントを含まない薬学的に許容される製剤において各抗原５μｇ〜５０μｇの範囲の濃度で混合ワクチン中に存在する、請求項４３に記載のワクチン組成物。
  45. アジュバントが、ａ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸リン酸を含むアルミニウム塩；ｂ）イヌリン；ｃ）イヌリンと水酸化アルミニウムとの合剤であるアルガムリン；ｄ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）；ｅ）レシキモド；ｆ）ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ｇ）Ｎ−グリコリルジペプチド（ＧＭＤＰ）；ｈ）ポリＩＣ；ｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ｊ）ＭＰＬを含む水酸化アルミニウム；ｋ）任意の油中水乳剤；ｌ）次の成分の１又は２以上を含有する任意の水中油乳剤：スクアレン又はそのアナログ又は任意の薬学的に許容される油、tween-80、ソルビタントリオレート、アルファ−トコフェロール、コレカルシフェロール及び水性緩衝剤、又はその分子の任意のアナログ及び誘導体ｉ）ジカウイルス抗原と共に製剤化された場合にウイルスに対する免疫応答を誘発する前述のアジュバントの任意の２つ以上の組合せ、からなる群から選択される、請求項４４に記載のワクチン組成物。
  46. アジュバントが、ワクチン用量あたり０．２５ｍｇ〜１．５ｍｇのアルミニウム含有量の水酸化アルミニウムである、請求項４５に記載のワクチン組成物。
  47. それぞれのウイルスに対して哺乳動物において防御免疫応答を誘発するジカウイルス、チクングニアウイルス、及び日本脳炎ウイルス抗原を混合ワクチン中に含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
  48. ジカウイルス、チクングニアウイルス、及び日本脳炎ウイルス抗原が、アジュバントを含む又はアジュバントを含まない薬学的に許容される製剤において各抗原５μｇ〜５０μｇの範囲の濃度で混合ワクチン中に存在する、請求項４７に記載のワクチン組成物。
  49. アジュバントが、ａ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸リン酸を含むアルミニウム塩；ｂ）イヌリン；ｃ）イヌリンと水酸化アルミニウムとの合剤であるアルガムリン；ｄ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）；ｅ）レシキモド；ｆ）ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ｇ）Ｎ−グリコリルジペプチド（ＧＭＤＰ）；ｈ）ポリＩＣ；ｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ｊ）ＭＰＬを含む水酸化アルミニウム；ｋ）任意の油中水乳剤；ｌ）次の成分の１又は２以上を含有する任意の水中油乳剤：スクアレン又はそのアナログ又は任意の薬学的に許容される油、tween-80、ソルビタントリオレート、アルファ−トコフェロール、コレカルシフェロール及び水性緩衝剤、又はその分子の任意のアナログ及び誘導体ｉ）ジカウイルス抗原と共に製剤化された場合にウイルスに対する免疫応答を誘発する前述のアジュバントの任意の２つ又は３つ以上の組合せ、からなる群から選択される、請求項４８に記載のワクチン組成物。
  50. アジュバントが、ワクチン用量あたり０．２５ｍｇ〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量の水酸化アルミニウムである、請求項４９に記載のワクチン組成物。
  51. ２−フェノキシエタノール保存剤を２．５〜５ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいてよい、請求項１に記載のワクチン組成物。
  52. 哺乳動物において単一用量又は２用量又は３用量以上で投与された場合に、ジカウイルス、チクングニアウイルス、及び日本脳炎ウイルスを含む任意のアルボウイルス抗原に対してＴｈ１及びＴｈ２の両方の免疫応答を誘発し、ヒトへの投与のために好適である、請求項１に記載のワクチン組成物。
  53. ジカウイルス、チクングニアウイルス、及び日本脳炎ウイルスから選択される１又は２以上のアルボウイルス抗原を含むワクチン組成物の調製のための方法であって、ウイルス抗原の不活化、組換えタンパク質産生、構造抗原発現、精製、及び濃縮の１又は２以上のステップを含み、ジカウイルスの前記精製及び濃縮が、
    ａ．超遠心分離；
    ｂ．密度勾配遠心分離；
    ｃ．膜ろ過を使用するウイルス採取物の清澄化；
    ｄ．カラムクロマトグラフィーによる精製；
    ｅ．１００ｋＤａ〜３００ｋＤａのカットオフを有する膜を使用するタンジェンシャルフローろ過であって、タンジェンシャルろ過が、ウイルス不活化の前又は後に実行される、タンジェンシャルフローろ過
    から選択される１又は２以上のステップを含む、前記方法。
  54. カラムクロマトグラフィー法が、ゲルろ過、混合モードレジンカラムクロマトグラフィー、任意のイオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティマトリクスクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 精製が、ウイルス抗原の大部分をCapto core700などのフロースルー中に、最も好ましくはCapto core700のフロースルー中に溶出し、ウイルス試料がCapto core700カラムで精製され、フロースルー中に溶出されるカラムクロマトグラフィー的法による精製を含む、請求項５３に記載の方法。
  56. ジカウイルスが、化学的不活化剤、物理的不活化剤、及び照射剤から選択される１又は２以上の不活化剤によって不活化される、請求項５３に記載の方法。
  57. ジカウイルスの不活化が、ウイルスの精製の前又は後に実行される、請求項５３に記載の方法。
  58. ジカウイルスが、ホルマリン（ホルムアルデヒド）、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）、及び過酸化水素から選択される化学的不活化剤によって不活化される、請求項５７に記載の方法。
  59. ジカウイルスバルクが、次の：
    ａ．ホルマリン：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、８℃〜３７℃、好ましくは２５±３℃、少なくとも１〜７日間でのホルマリン処置；
    ｂ．ホルマリン：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、２℃〜８℃、少なくとも１０〜３０日間でのホルマリン処置；
    ｃ．ベータプロピオラクトン（以下ＢＰＬ）：ウイルスが、１：５００〜１：４０００ｖ／ｖまでの範囲の任意の濃度、少なくとも２４〜４８時間、少なくとも温度範囲８℃〜３０℃、好ましくは２５±３℃、４８時間でのベータプロピオラクトン；
    ｄ．１：５００から１：４０００まで（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）の範囲の任意の濃度、２℃〜８℃、少なくとも３〜７日間でのベータプロピオラクトン；
    ｅ．前述のいずれかの条件でのＢＰＬとホルマリンとの組合せ、好ましくは１：３０００（ＢＰＬ：ウイルス、ｖ／ｖ）、２４時間のＢＰＬ不活化、及びそれに続く１：３０００（ホルマリン：ウイルス、ｖ／ｖ）、２４〜４８時間、１５℃〜３０℃、好ましくは２５±３℃でのホルマリン不活化；
    ｆ．０．１〜３％、好ましくは０．１〜１％の任意の濃度、２０〜３０℃の任意の温度、５分間〜１２０分間での過酸化水素
    から選択される方法のいずれか１つによって不活化される、請求項５６に記載の方法。
  60. ウイルスが、６０Ｃｏ源からの２０ｋＧｙ（キロＧｒａｙ）〜３５ｋＧｙまで、好ましくは２５ｋＧｙ〜３０ｋＧｙの曝露によるガンマ照射によって不活化される、請求項５６に記載の方法。
  61. ジカウイルスが、２５４ｎｍ、３０〜６０分間のＵＶ照射への曝露によって不活化される、請求項５６に記載の方法。
  62. ジカウイルスが、温度５０℃〜６５℃、３０分間〜２時間まで、好ましくは６５℃で１時間の熱処置によって不活化される、請求項５６に記載の方法。
  63. 不活化が、乳糖、ショ糖、トレハロース、マルトース、マンノース、イソ−マルトース、ラフィノース、スタキオース、ラクトビオース、ソルビトール、マンニトール、ラクトビオン酸、デキストラン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸及びヒト血清アルブミン又はそれらの組合せ、から選択される安定化剤の存在下で実行される、請求項５６に記載の方法。
  64. 安定化剤が、
    ａ．２％ソルビトール及び１％ Ｌ−グリシン；
    ｂ．１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；
    ｃ．１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グリシン；
    ｄ．１％マンニトール及び０．５％ Ｌ−グルタミン酸；並びに
    ｅ．１％ソルビトール及び０．５％ Ｌ−グリシン、１％ヒト血清アルブミン
    から選択される、請求項６３に記載の方法。
  65. 不活化法が、任意の遺伝子型／株のジカウイルス、生弱毒化ジカウイルス、非活化ウイルス、ウイルス様粒子、任意のジカウイルス抗原、特にＥタンパク質を任意の異種ウイルス骨格、ベクター化ワクチン中に保有するキメラウイルス粒子、及び任意のジカウイルスゲノムの配列を使用してインビトロ又はインビボで派生させた感染性合成ウイルス粒子に適用できる、請求項５６に記載の方法。
  66. 組換えタンパク質を産生する方法が、
    ａ．組換えプラスミドＤＮＡを昆虫細胞にトランスフェクトするステップ；
    ｂ．前記細胞を採取するステップ及びそれから前記組換えタンパク質を単離するステップ；
    ｃ．イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、混合モードレジンクロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、超遠心分離、密度勾配遠心分離、及び塩での分画を含む少なくとも１つの方法によって前記タンパク質を精製するステップ
    を含む、請求項５３に記載の方法。
  67. 発現系を含むジカウイルスの構造抗原を発現させる方法が、昆虫細胞におけるバキュロウイルス媒介発現を含む任意の原核又は真核発現系である、請求項５３に記載の方法。
  68. 最適には不活化ウイルス、生弱毒化ウイルス、非活化ウイルス、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子、ベクター化ワクチン中などの任意の異種ウイルス骨格においてジカウイルスＥタンパク質を提示するキメラウイルス粒子、及び任意のジカウイルスゲノムＲＮＡ配列から派生させた合成ウイルス粒子などにおいてエンベロープタンパク質に対して主として誘発される中和抗体を含む、請求項５３に記載の方法。
  69. プライム−ブースト法で投与される、請求項１に記載のワクチン組成物であって、前記プライムが候補不活化ワクチンであり、前記ブーストが、同じワクチン；又はＤＮＡワクチン、キメラジカウイルスワクチン、ウイルス様粒子、非活化ジカワクチン、生弱毒化ウイルスワクチン、組換えサブユニットワクチン、ベクター化ワクチン若しくは合成ジカウイルス由来の任意のワクチンなどの任意の他のワクチン；のいずれかであり、それらそれぞれにおける中和抗体が、ジカウイルスエンベロープタンパク質に対して誘発されている、前記ワクチン組成物。
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