JP2019533993A - ジカウイルスに対する新規ワクチンとジカウイルスに対する使用に向けたｄｎａ抗体構築物との組み合わせ - Google Patents

ジカウイルスに対する新規ワクチンとジカウイルスに対する使用に向けたｄｎａ抗体構築物との組み合わせ Download PDF

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Abstract

ジカウイルス抗原に対する抗体、及びその機能性断片をコードする組換え核酸配列を含む、組成物が本明細書に開示される。本発明はまた、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発する第１の組成物と、抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む第２の組成物との組み合わせを含む組成物にも関する。一部の事例では、該核酸分子は、抗ＺＩＫＶ−エンベロープ（抗ＺＩＫＶ Ｅ）タンパク質抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月１９日に出願された米国仮出願第６２／３９６，７５０号、及び２０１６年１１月３日に出願された米国仮出願第６２／４１７，０９３号に対する優先権への権利を有し、同文献の各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本発明は、ジカウイルス抗原に対する抗体、及びその機能性断片をコードする組換え核酸配列に関する。本発明はまた、ジカワクチンと、１つ以上の合成抗体、及びその機能性断片をインビボで産出するための組換え核酸配列を含む組成物との組み合わせにも関する。本発明の組成物は、免疫応答の改善された誘導方法、ならびにジカウイルスに対する個体の改善された予防的及び／または治療的免疫誘導方法を提供する。
ジカ疾患は、ジカウイルスの感染によって引き起こされ、感染した蚊に刺されることによりヒトに伝染するか、またはヒト間で性行為により伝染する可能性がある。ジカ感染症は、いくつかの先天性欠損に関連付けられている。現在、複数の疾患の治療用の治療的抗体が承認されている。残念ながら、精製抗体の製造及び送達は法外な費用がかかる。さらに、抗体療法は、毎週から毎月再投与しなければならず、これは患者のジカの発症を予防するまたはその危険性を低減するために有効な治療を保証する際に困難な考慮事項である。
故に、当該技術分野において、ジカ感染症を予防する及び／または治療する改善された治療薬に対する必要性がある。本発明はこの必要性を満たす。
課題を解決する手段
本発明の一態様は、ジカウイルス抗原に対する抗体、及びその機能性断片をコードする組換え核酸配列を含む、組成物を提供する。
本発明の一態様は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発する組成物と、抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物との組み合わせを提供する。本組成物は、それを必要とする対象に投与して、合成抗体のインビボ発現及び形成を促進することができる。一実施形態では、該核酸分子は、抗ＺＩＫＶ−エンベロープ（抗ＺＩＫＶ Ｅ）タンパク質抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明の一態様は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発するポリペプチドを発現することが可能な、核酸構築物を提供する。該核酸構築物は、コーディングヌクレオチド配列及び該コーディングヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターからなる。該コーディングヌクレオチド配列は、膜前駆体エンベロープ（ｐｒｅ−ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｅｎｖｅｌｏｐｅ）（ｐｒＭ＋ＥｎｖまたはｐｒＭＥ）を含むコンセンサスジカ抗原を含む、ポリペプチド発現する。該プロモーターは、哺乳動物における該ポリペプチドの発現を調節する。
本発明の別の態様は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を生み出すことが可能である核酸分子を提供する。一実施形態では、該核酸分子は、哺乳動物においてコンセンサスジカ抗原を発現することが可能な核酸配列と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。一実施形態では、該核酸分子は、コンセンサスジカ抗原をコードするコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一実施形態では、コンセンサスジカ抗原は、コンセンサスｐｒＭＥからなる。
本発明の別の態様は、哺乳動物におけるジカウイルスに対する免疫応答の誘発方法を提供し、該方法は、哺乳動物の組織に、哺乳動物の細胞内でジカウイルスのコンセンサス抗原を発現して哺乳動物において免疫応答を誘発することが可能な核酸配列を含む核酸分子を送達することと、その組織の細胞にエレクトロポレーションを行って、該核酸分子の細胞への侵入を可能にすることとを含む。
本発明は、１つ以上の合成抗体をコードする核酸分子を対象とし、該核酸分子は、ａ）抗ＺＩＫＶエンベロープ（Ｅ）タンパク質合成抗体をコードするヌクレオチド配列、及びｂ）抗ＺＩＫＶエンベロープ（Ｅ）合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
一実施形態では、該核酸分子は、切断ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該核酸分子は、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、及び配列番号２２のうちの１つ以上に対して少なくとも９０％相同な１つ以上の配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該核酸分子は、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、及び配列番号２２のうちの１つ以上に対して少なくとも９０％相同な１つ以上の配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該核酸分子は、可変重鎖領域と、ＩＲＥＳエレメントと、可変軽鎖領域とを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＩＲＥＳエレメントは、ウイルスＩＲＥＳまたは真核生物ＩＲＥＳのうちの一方である。
一実施形態では、該核酸分子は、
ａ）核酸配列の長さ全体にわたって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、及び配列番号２２からなる群から選択される配列をコードする核酸配列に対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該ヌクレオチド配列は、リーダー配列をコードする。一実施形態では、該核酸分子は発現ベクターを含む。
本発明は、本明細書に記載の核酸分子のうちのいずれかを含む組成物をさらに提供する。
一実施形態では、該組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。
本発明はさらに、対象における疾患の予防方法または治療方法に関し、本方法は、対象に、本明細書に記載の核酸分子または組成物を投与することを含む。
一実施形態では、該疾患は、ジカウイルス感染症である。
一実施形態では、本方法は、抗生物質製剤を対象に投与することをさらに含む。一実施形態では、抗生物質は、該核酸分子または組成物の投与から１０日未満後に投与される。
一実施形態では、本方法は、抗生物質製剤を対象に投与することをさらに含む。一実施形態では、抗生物質は、該核酸分子または組成物の投与から１０日未満後に投与される。
ＺＩＫＶ−Ｅタンパク質の構造を図示する。
ジカｄＭＡＢの開発及び特徴付けのためのワークフローを図示する。
ＺＩＫＶ−Ｅｎｖ特異的モノクローナル抗体に対する結合ＥＬＩＳＡを図示する。
ＺＶ Ｅｎｖ及びＺＶ ｍＡＢのウェスタンブロットを図示する。２μｇのｒＺＶエンベロープタンパク質をロードし、ＺＶモノクローナル抗体に１：２５０希釈率を使用した。
ジカｍＡｂのＶＨ及びＶＬのアライメントを図示する。
ジカｍＡｂのＶＨ及びＶＬのアライメント及び同一性ならびにＲＭＳＤマトリックスを図示する。
ｍＡｂモデルの重ね合わせを図示する。
モデルのＣＤＲ領域の比較を図示する。
ｍＡＢである１Ｃ２Ａ６、８Ｄ１０Ｆ４、及び８Ａ９Ｆ９のＶＨ及びＶＬのアライメントを図示する。
１Ｃ２Ａ６のＦｖのモデルを図示する。
８Ｄ１０Ｆ４、１Ｃ２Ａ６、８Ａ９Ｆ９、３Ｆ１２Ｅ９、及び１Ｄ４Ｇ７に関するＦｖの生物物理学的特徴の概要を図示する。
ジカウイルス粒子、ジカＲＮＡゲノム、及びその翻訳された遺伝子の図解を表示する。
ジカ抗原をコードする挿入物（発現カセット）の箇所の部位を示す、ジカワクチンに関するプラスミドマップを表示する。
種々のジカ抗原設計の線状構造を示す図面を表示する。
ジカ抗原−リーダー配列＋ｐｒＭＥの注釈付きアミノ酸配列を表示する。
単離株間の遺伝的距離を示す、種々のジカウイルス株間の遺伝的関係を表示する。
遺伝子系統樹を表示する、種々のジカウイルス株間の遺伝的関係を表示する。
ジカ−ｐｒＭ＋Ｅｎｖをコードする挿入物（発現カセット）の箇所の部位を示す、ジカワクチンに関するプラスミドマップを表示する。
発現カセットの存在を示すゲル電気泳動画像を表示する。
図２０Ａ及び２０Ｂは、ジカ−エンベロープタンパク質を示すウェスタンブロットゲルを表示する。図２０Ａは細胞溶解物中の抗血清への非特異的結合を示す。図２０Ｂは、細胞溶解物中の抗汎フラビウイルスへの特異的結合を示す。
図２１Ａは、ジカ−エンベロープタンパク質の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表示する。図２１Ｂは、ジカ−エンベロープタンパク質の精製を示すウェスタンブロットゲルを表示する。
個々のマウスの、ｐｒｅ−Ｍ＋エンベロープ抗原を網羅するペプチドプールに対するＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した、スパイク特異的ＣＤ８ Ｔリンパ球応答を示す棒グラフを表示する。３回目の免疫誘導から１週間後の各群における平均応答。
群平均の、ｐｒｅ−Ｍ＋エンベロープ抗原を網羅するペプチドプールに対するＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した、スパイク特異的ＣＤ８ Ｔリンパ球応答を示す棒グラフを表示する。３回目の免疫誘導から１週間後の各群における平均応答。
図２４Ａ及び２４Ｂは、マウスのジカｐｒＭ＋Ｅｎｖワクチン接種がジカ−エンベロープ抗原に反応する陽性抗体応答を誘発することを示す、試料の結合ＥＬＩＳＡを表すグラフを表示する。
図２５Ａ及び２５Ｂは、ＺＣ−ｐｒＭＥ免疫原がジカ−エンベロープ抗原に特異的に反応するかなりの抗体応答を誘発することを示すグラフを表示する。ＺｐＭＥ血清の交差反応性はデング１、２、３、及び４抗原Ｅｎｖに対して陰性であった一方で、ジカＥｎｖに対しては強力な結合を示した。
図２６Ａ〜２６Ｅは、ＺＣ−ｐｒＭＥワクチンで産出された血清がデング１〜４組換えＥｎｖに交差反応しないことを示す分析を示す。分析は、同様に抗ＣＨＩＫＶワクチンで誘導した血清がジカＥｎｖに結合しないことを裏付ける。
図２８Ａ〜図２８Ｃを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンでのワクチン接種後のマウスにおける細胞性免疫応答の特徴付けを実証する実験結果を図示する。図２８Ａは、脾細胞におけるＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を図示する。Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５／群）を２５μｇのｐＶａｘ１ワクチンまたはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンのいずれかで３回、筋肉内投与により免疫誘導し、続いてインビボエレクトロポレーションを行った。細胞性免疫応答誘導の指標としてのＩＦＮ−γ産出をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。３回目の免疫誘導から７日後に採取した脾細胞を、全ｐｒＭ及びエンベロープタンパク質に及ぶ６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果を積み上げ棒グラフで示す。データは、脾細胞１００万個当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、このうち値が各群（ｎ＝４）における平均応答±標準誤差を表す。図２８Ｂは、３回目の免疫誘導から１週間後にマトリックスペプチドプールでの刺激によって決定したＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的ＩＦＮ−γ応答のエピトープ組成を図示する。値は各群（ｎ＝４）における平均応答±標準誤差を表す。実験は独立して少なくとも３回行い、同様の結果が得られた。図２８Ｃは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥでの免疫誘導が、ＺＩＫＶペプチドによって刺激したときにより高い数のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞を誘導することを図示する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンでの最後の免疫誘導から１週間後、脾細胞をプールＺＩＫＶペプチド（５μＭ）の存在下でまたは組織培養基のみで培養した。ＺＩＫＶペプチド特異的ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞の頻度を蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイによって測定した。単関数ゲート（Ｓｉｎｇｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇａｔｅｓ）を陰性対照（未刺激）試料に基づいて設定し、試料にわたって一貫して配置した。総計ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の百分率が示される。これらのデータは、２つの独立した免疫誘導実験を表すものである。
図２９Ａ〜図２９Ｄを含み、ｐＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ（ＭＲ７６６）及びｐＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ（ブラジル）免疫誘導マウスから採集した脾細胞によるＩＦＮ−γ産生ならびに同マウスから採集した血清中の抗体レベルのプロファイルを図示する。６週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスを材料及び方法に記載されるように免疫誘導した。血清及び脾細胞を３回目の免疫誘導から１週間後に採集し、ＺＩＫＶ特異的ｐｒＭＥペプチドとともにインキュベートし、細胞１００万個当たりのＩＦＮ−γ ＳＦＵの数をＥＬＩＳＰＯＴによってアッセイした。図２９Ａは、ＭＲ７６６免疫誘導マウスから採集した血清のＥＬＩＳｐｏｔ分析を図示する。図２９Ｂは、ブラジル免疫誘導マウスから採集した血清のＥＬＩＳｐｏｔ分析を図示する。血清中の抗ＺＩＫＶ Ｅｎｖ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって測定した（Ｃ及びＤ）。図２９Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定したＭＲ７６６免疫誘導マウスにおける血清中の抗ＺＩＫＶ Ｅｎｖ抗体レベルを図示する。図２９Ｄは、ＥＬＩＳＡによって測定したブラジル免疫誘導マウスにおける血清中の抗ＺＩＫＶ Ｅｎｖ抗体レベルを図示する。
図３０Ａ〜図３０Ｅを含み、抗ＺＩＫＶ抗体応答がＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドワクチン接種によって誘導されることを実証する実験結果を図示する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドまたはｐＶａｘ１で、２週間間隔で３回、筋肉内投与により免疫誘導した。免疫誘導後の異なる時点における動物由来の血清を種々の希釈率で用いてエンベロープ抗原への結合を分析した。ＥＬＩＳＡプレートをワクチンに一致した組換えＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質でコーティングした。図３０Ａは、２回の独立した実験のうちの一方からの結果が提示されることを図示する。２回目の実験において同様の結果が得られた。図３０Ｂは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫原に応答して産生された抗ＺＩＫＶの終末点力価における差異を各追加免疫後の免疫誘導動物由来の血清中で分析したことを図示する。図３０Ｃは、ＺＩＫＶ−エンベロープ抗原発現のウェスタンブロット分析を図示する。示されるようにｐＶａｘ１またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導マウス由来の血清を用いて、種々の濃度での組換えＺＩＫＶ−Ｅｎｖタンパク質を１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、ウェスタンブロット分析によって分析した。ＺＩＫＶ−Ｅｎｖタンパク質の発現が矢印で示される。図２０Ｄは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥまたはｐＶａｘ１免疫誘導マウス由来の血清でのインキュベーション後、ＺＩＫＶ−ＭＲ７６６で感染させたか、または擬似感染させたＶｅｒｏ細胞の免疫蛍光測定分析を図示する。図３０Ｅは、ｐＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導マウス由来の試料をプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイによって、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染能を中和する能力について試験したことを図示する。ＰＲＮＴ５０は、投入ウイルスの５０％を阻害し得る血清希釈係数と定義された。括弧内の値がＰＲＮＴ５０を示す。対照プラスミドｐＺＩＫＶ−カプシド及びｐＶａｘ１血清を陰性対照として使用した。
図３１Ａ〜図３１Ｅを含み、ＮＨＰのＺＩＫＶ＝ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ特異的細胞性免疫応答の誘導を実証する実験結果を図示する。図３１Ａは、アカゲザルを２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドで、０週目及び４週目に２つの部位の各々に１ｍｇを投与する皮内投与（ＩＤ）により免疫誘導し、免疫誘導の直後に皮内エレクトロポレーションを行ったことを図示する。ＰＢＭＣを免疫誘導前及び６週目に単離し、これを使用してＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行って、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥペプチドでの刺激に応答したＩＦＮ−γ分泌細胞を検出した。ワクチン接種群について、全ｐｒＭＥタンパク質を包含する６つのペプチドプールに対する、ＰＢＭＣ１００万個当たり得られたＩＦＮ−γ産生細胞の数がｙ軸上に示される。値は各群（ｎ＝５）における平均応答±標準誤差を表す。図３１Ｂは、ＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体応答検出を図示する。抗ＺＩＫＶ ＩｇＧ抗体を免疫誘導前及び６週目にＥＬＩＳＡによって測定した。図３１Ｃは、１回目及び２回目の免疫誘導後の抗ＺＩＫＶ−エンベロープ抗体についての終末点ＥＬＩＳＡ力価が示されることを図示する。図３１Ｄは、６週目のサルのプール血清を使用したウェスタンブロット分析が組換えエンベロープタンパク質への結合を実証したことを図示する。図３１Ｅは、ＺＩＫＶ ＭＲ７６６を用いて１０ＰＦＵで感染させたＶｅｒｏ細胞の免疫蛍光測定分析を図示する。細胞を感染から２４時間後に６週目のサルの１：１００のプール血清でプロービングし、次いで二次抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８で検出した。
図３２Ａ〜図３２Ｃを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫誘導したアカゲザル由来の血清のプラーク減少中和活性を実証する実験結果を図示する。アカゲザルを材料及び方法に記載されるように免疫誘導した。図３２Ａは、個々のサル由来の免疫誘導前及び６週目の免疫血清をプラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイによって、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染能を中和する能力について試験したことを図示する。ＰＲＮＴ５０は、投入ウイルスの５０％を阻害し得る血清希釈係数と定義された。ＩＣ５０計算値が各サルについて列挙される。図２１Ｂ及び２１Ｃは、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、及びＵ８７ＭＧ細胞におけるＺＩＫＶ ＭＲ７６６及びＰＲ２０９の細胞変性効果を図示する。図３２Ｂは、Ｖｅｒｏ細胞を疑似感染させたか、またはＭＲ７６６もしくはＰＲ２０９ウイルスで感染させたことを図示する。図３２Ｃは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで免疫誘導した（６週目）ＮＨＰのプール血清の存在下で、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧ細胞を疑似、または０．００１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでのＭＲ７６６で感染させたことを図示する。免疫誘導ＮＨＰ血清を使用して、合胞体形成（ＣＰＥ）及びｐｒＭＥタンパク質発現の誘導を感染から４８時間後に間接免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）によって分析した。対物４倍で写真を撮影した。
図３３Ａ〜図３３Ｃを含み、Ｉ型インターフェロンα、β受容体が欠如したマウスにおけるｐＺＩＫＶ ｐｒＭＥから単離した脾臓細胞によるＩＦＮ−γ及び抗体産生のプロファイルを実証する実験結果を図示する。図３３Ａは、ＩＦＮα、β受容体ノックアウトマウス（４〜６匹）を２５μｇのｐＺＩＫＶ−ｐｒＭＥまたはｐＶａｘ１プラスミドで、２週間間隔で３回、筋肉内投与により免疫誘導したことを図示する。脾細胞を最後の免疫誘導から２週間後に採集し、ｐｒＭＥペプチドとともにインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。図３３Ｂは、免疫誘導動物におけるＺＩＫＶ Ｅｎｖタンパク質に特異的な血清抗体を免疫誘導から種々の日数後にＥＬＩＳＡによって測定したことを図示する。図３３Ｃは、免疫誘導から０、１、２、３、４及び５週間後の終末点力価を図示する。
図３４Ａ〜図３４Ｆを含み、Ｉ型インターフェロンα、β受容体が欠如した免疫誘導マウスについてのジカウイルス感染後の生存データを実証する実験結果を図示する。ジカ感染後のＩＦＮ−α／β受容体ノックアウトマウスの生存率。図３４Ａは、マウスを１回免疫誘導し、２週間後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９で攻撃したことを図示する。図３４Ｂは、マウスを２週間間隔で２回免疫誘導し、２回目の免疫誘導から７日後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９で攻撃したことを図示する。図３４Ｃは、マウスを２週間間隔で２回免疫誘導し、２回目の免疫誘導から７日後に２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ ＰＲ２０９で攻撃したことを図示する。２回の別個の実験からのデータを使用して生存曲線を構築した。図３４Ｄは、２回免疫誘導した動物の体重変化が図示されることを図示する。データは、実験１回につき１群当たり１０〜１５匹のマウスを用いた２回の独立した実験からの結果を反映する。図３４Ｅは、図３４Ｂにおける動物の臨床スコアを図示する。図３４Ｆは、図３４Ｃにおける動物の臨床スコアを図示する。臨床スコアの表記は以下の通りである：１−疾患なし、２−運動性低下、３−円背姿勢及び運動性低下、４−後肢における指背歩行（部分麻痺）、５−片方の後肢の麻痺、ならびに６−両方の後肢の麻痺。
図３５Ａ〜図３５Ｅを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサスＤＮＡワクチンの構築を実証する実験結果を図示する。図３５Ａは、ｒＭＥのｐＶａｘ１哺乳類発現ベクターへのクローニングを示す、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンの模式図を図示する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス配列のためにコンセンサス設計戦略を採用した。ｐｒＭＥ構築物のコドン最適化した合成遺伝子に合成ＩｇＥリーダー配列を含めた。最適化遺伝子構築物をＣＭＶプロモーターの制御下で修飾ｐＶａｘ１ベクターのＢａｍＨ１及びＸｈｏ１部位に挿入した。図３５Ｂは、ＺＩＫＶ−Ｅタンパク質のモデル建築物が、関連する可能性のあるエピトープ領域とのワクチン標的の重複を実証することを図示する。ワクチン設計目的で行ったいくつかの変化が（中央左寄りにある挿入図の破線内に位置を定める）ドメインＩＩ及びＩＩＩに位置を定める。これらの領域におけるワクチン特異的残基変化は、Ｅ（エンベロープ）タンパク質二量体（各鎖はそれぞれ薄緑色及び濃緑色）のリボン骨格図上に紫色のＣＰＫ形式で示される。規定のＥＤＥに対応する領域は青緑色で示され、融合ループは青色で示される。１５０ループの表面上に露出するようにモデル化された、ワクチンＥタンパク質の残基Ｉｌｅ１５６（Ｔ１５６Ｉ）は、いくつかの他のＺＩＫＶ株ならびに複数のデングウイルス株におけるＮ結合型グリコシル化モチーフＮＸＳ／Ｔの一部である。図３５Ｃは、ウェスタンブロット分析を使用した２９３Ｔ細胞におけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現分析を図示する。２９３Ｔ細胞をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトし、汎フラビウイルス免疫誘導血清を用いてワクチン構築物の発現について細胞溶解物及び上清を分析した。タンパク質分子量マーカー（ｋＤａ）、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥでトランスフェクトした細胞からの細胞溶解物及び上清ならびにｒＺＩＫＶ−Ｅ陽性対照を示されるようにロードした。図３５Ｄは、ウェスタンブロット分析を使用した２９３Ｔ細胞におけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現分析を図示する。２９３Ｔ細胞をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトし、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導血清を用いてワクチン構築物の発現について細胞溶解物及び上清を分析した。タンパク質分子量マーカー（ｋＤａ）、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥでトランスフェクトした細胞からの細胞溶解物及び上清ならびにｒＺＩＫＶ−Ｅ陽性対照を示されるようにロードした。図３５Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質発現についての免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）分析を図示する。細胞を５μｇのＺＩＫＶｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導マウス由来の血清（１：１００）の添加により免疫蛍光標識を行い、続いて検出用に二次抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８抗体を添加した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ及びｐＶａｘ１免疫誘導マウス由来の血清による染色が示される。ＤＡＰＩパネルは細胞核の対照染色を示す。重ね合わせパネルは、抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８及びＤＡＰＩ染色パターンの組み合わせである。ＤＡＰＩ、すなわち４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、すなわちジカウイルスの前駆体膜及びエンベロープ。
図３６Ａ〜図３６Ｄを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンでのワクチン接種後のマウスにおける細胞性免疫応答の特徴付けを実証する実験結果を図示する。図３６Ａは、本研究で使用したワクチン免疫誘導及び免疫分析のタイムラインを図示する。図３６Ｂは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導に応答した脾細胞におけるＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を図示する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）を２５μｇのｐＶａｘ１ワクチンまたはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンのいずれかで３回、筋肉内投与により免疫誘導し、続いてエレクトロポレーションを行った。細胞性免疫応答の誘導の指標としてのＩＦＮ−γ産出をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。３回目の免疫誘導から１週間後に採取した脾細胞を、全ｐｒＭ及びエンベロープタンパク質に及ぶ６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果を積み上げ棒グラフで示す。データは、脾細胞１００万個当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、このうち値が各々における平均応答±標準誤差を表す。図３６Ｃは、３回目の免疫誘導から１週間後にマトリックスペプチドプールでの刺激によって決定したＺＩＫＶｐｒＭＥ特異的ＩＦＮ−γ応答のエピトープ組成を図示する。値は各群における平均応答±標準誤差を表す。実験は独立して少なくとも３回行い、同様の結果が得られた。図３６Ｄは、Ｔ細胞応答のフローサイトメトリー分析を図示する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥでの免疫誘導は、ＺＩＫＶペプチドによって刺激したときにより高い数のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞を誘導する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンでの最後の免疫誘導から１週間後、脾細胞をプールＺＩＫＶペプチド（５μＭ）の存在下でまたはＲ１０のみで培養した。ＺＩＫＶペプチド特異的ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞の頻度をフローサイトメトリーによって測定した。単関数ゲートを陰性対照（未刺激）試料に基づいて設定し、試料にわたって一貫して配置した。総計ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の百分率が示される。これらのデータは、２つの独立した免疫誘導実験を表すものである。ＩＦＮ、すなわちインターフェロン；ＴＮＦ、すなわち腫瘍壊死因子；ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、すなわちジカウイルスの前駆体膜及びエンベロープ。
図３７Ａ〜図３７Ｅを含み、抗ＺＩＫＶ抗体応答がＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種によって誘導されることを実証する実験結果を図示する。図３７Ａは、免疫誘導マウスにおける結合抗体産生（ＯＤ４５０値によって測定）を測定するＥＬＩＳＡ分析を図示する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４）を２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドまたはｐＶａｘ１で、２週間間隔で３回、筋肉内投与により免疫誘導した。免疫誘導後の異なる時点（２１、３５及び５０日目）における動物由来の血清を種々の希釈率で用いてｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を分析した。示されるデータは、少なくとも３回の別個の実験を表すものである。図３７Ｂは、終末点結合力価分析を図示する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫原に応答して産生された抗ＺＩＫＶ終末点力価における差異を、各追加免疫後に免疫誘導動物由来の血清中で分析した。図３７Ｃは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導によって誘導されたｒＺＩＫＶ−Ｅ特異的抗体のウェスタンブロット分析を図示する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導マウス（３５日目）由来のプール血清を用いて、ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質を１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、ウェスタンブロット分析によって分析した。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合が矢印で示される。図３７Ｄは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導によって誘導されたＺＩＫＶ特異的抗体の免疫蛍光測定分析を図示する。ＺＩＫＶ−ＭＲ７６６で感染させたか、または擬似感染させたＶｅｒｏ細胞を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導マウス（３５日目）由来のプール血清で染色し、続いて検出用に抗マウス−ＡＦ４８８二次抗体で染色した。図３７Ｅは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導によって誘導された中和抗体のプラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイ分析を図示する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導マウス由来の血清試料を、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染能を中和する能力について試験した。ＰＲＮＴ５０は、投入ウイルスの５０％を阻害し得る血清希釈係数と定義された。括弧内の値がＰＲＮＴ５０を示す。対照ＺＩＫＶ−Ｃａｐ（ＺＩＫＶカプシドタンパク質を発現するＤＮＡワクチン）及びｐＶａｘ１血清を陰性対照として使用した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、すなわちジカウイルスの前駆体膜及びエンベロープ。
図３８Ａ〜図３８Ｅを含み、非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種後のＺＩＫＶ特異的細胞性免疫応答の誘導を実証する実験結果を図示する。図３８Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導に応答した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を図示する。アカゲザルを２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドで、０週目及び４週目に２つの部位の各々に１ｍｇを投与する皮内投与により免疫誘導し、免疫誘導の直後に皮内エレクトロポレーションを行った。「材料及び方法」の節に記載されるように、ＰＢＭＣを免疫誘導前及び６週目に単離し、これを使用してＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥペプチドでの刺激に応答したＩＦＮ−γ分泌細胞を検出した。全ｐｒＭＥタンパク質を包含する６つのペプチドプールに対する、ＰＢＭＣ１００万個当たり得られたＩＦＮ−γ産生細胞の数が示される。値は各群（ｎ＝５）における平均応答±標準誤差を表す。図３８Ｂは、ＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体応答検出を図示する。抗ＺＩＫＶ ＩｇＧ抗体を免疫誘導前及び６週目にＥＬＩＳＡによって測定した。図３８Ｃは、１回目及び２回目の免疫誘導後の抗ＺＩＫＶ−エンベロープ抗体についての終末点ＥＬＩＳＡ力価が示されることを図示する。図３８Ｄは、６週目のアカゲザル免疫血清を使用したウェスタンブロット分析が組換えエンベロープタンパク質への結合を実証したことを図示する。図３８Ｅは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫誘導したアカゲザル由来の血清ＰＲＮＴ活性を図示する。個々のサル由来の免疫誘導前及び６週目の免疫血清をプラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイによって、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染能を中和する能力について試験した。ＰＲＮＴ５０は、投入ウイルスの５０％を阻害し得る血清希釈係数と定義された。（ＰＲＮＴ５０）計算値が各サルについて列挙される。ＩＦＮ、すなわちインターフェロン；ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、すなわちジカウイルスの前駆体膜及びエンベロープ。
図３９Ａ〜図３９Ｆを含み、Ｉ型インターフェロンα、β受容体が欠如した免疫誘導マウスについてのＺＩＫＶ感染後の生存データを実証する実験結果を図示する。図３９Ａは、ＺＩＫＶ感染後のＩＦＮＡＲ−／−マウスの生存率を図示する。マウスを２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンで、２週間間隔で２回免疫誘導し、１×１０６個のプラーク形成単位での２回目の免疫誘導から１週間後にＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスで攻撃した。図３９Ｂは、ＺＩＫＶ感染後のＩＦＮＡＲ−／−マウスの生存率を図示する。マウスを２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンで、２週間間隔で２回免疫誘導し、２×１０６個のプラーク形成単位での２回目の免疫誘導から１週間後にＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスで攻撃した。図３９Ｃは、１×１０６個のプラーク形成単位で免疫誘導した動物の体重変化を図示する。図３９Ｄは、２×１０６個のプラーク形成単位で免疫誘導した動物の体重変化を図示する。図３９Ｅは、１×１０６個のプラーク形成単位で免疫誘導した動物の臨床スコアを図示する。図３９Ｆは、２×１０６個のプラーク形成単位で免疫誘導した動物の臨床スコアを図示する。臨床スコアの表記は以下の通りである：１：疾患なし、２：運動性低下、３：円背姿勢及び運動性低下、４：後肢における指背歩行（部分麻痺）、５：片方の後肢の麻痺、ならびに６：両方の後肢の麻痺。データは、実験１回につき１群当たり１０匹のマウスを用いた２回の独立した実験からの結果を反映する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、すなわちジカウイルスの前駆体膜及びエンベロープ。
図４０Ａ〜図４０ｄを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンでの単回の免疫誘導が、Ｉ型インターフェロンα、β受容体が欠如したマウスにおいてＺＩＫＶ攻撃に対する保護を提供したことを実証する実験結果を図示する。マウスを１回免疫誘導し、単回の免疫誘導から２週間後、２×１０６個のＺＩＫＶ−ＰＲ２０９のプラーク形成単位で攻撃した。生存曲線は、実験１回につき１群当たり１０匹のマウスを図示する。図４０Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンがマウスの脳においてジカ誘導性の神経学的異常を予防したことを実証する。図４０Ｂは、ｐＶａｘ１及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種群由来の脳切片を攻撃から７〜８日後に採集し、組織学的検査用にＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）で染色したことを図示する。代表的な未保護のｐＶａｘ１対照動物から採取した切片は病変を示す。（ｉ）：大脳皮質の神経網内の核断片（挿入図はより高倍率を示し、矢印が核断片を強調する）、（ｉｉ）：皮質内の血管の血管周囲性単核細胞浸潤、リンパ球浸潤及び変性細胞、（ｉｉｉ）：血管周囲性単核細胞浸潤、細胞変性及び大脳皮質内の核断片、ならびに（ｉｖ）：海馬内の変性ニューロン（矢印）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種マウス由来の正常組織の例は、正常範囲内であるように見えた（ｖ及びｖｉ）。図４０Ｃは、ワクチン接種及び示される感染後日数でのウイルス攻撃後のマウス由来の血漿試料中のＺＩＫＶ ＲＮＡのレベルを図示する。結果は、血漿１ミリリットル当たりのゲノム当量として示される。図４０Ｄは、脳組織中のＺＩＫＶ−ＲＮＡのレベルを感染後２８日目に分析したことを図示する。結果は、組織１グラム当たりのゲノム当量として示される。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、すなわちジカウイルスの前駆体膜及びエンベロープ。
図４１Ａ及び図４１Ｂを含み、ＺＩＫＶ攻撃後に抗ＺＩＫＶ免疫血清を受動的に移入した後の、Ｉ型インターフェロンα、β受容体が欠如したマウスの保護を実証する実験結果を図示する。抗ジカウイルスＩｇＧについて力価測定した、ＮＨＰ抗ＺＩＫＶ免疫プール血清を、ジカウイルス（マウス１匹当たり１０６個のプラーク形成単位）での皮下投与による攻撃から１日後に、マウスに腹腔内投与（１５０μｌ／マウス）した。対照としては、正常サル血清及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を対照として週齢一致マウスに投与した（１５０μｌ／マウス）。図４１Ａは、感染及び処置の過程中のマウスの体重変化を図示する。各点は、各マウスについての攻撃前（０日目）体重に対するパーセント計算値の平均及び標準誤差を表す。図４１Ｂは、ＮＨＰ免疫血清の投与後のマウスの生存率を図示する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、すなわちジカウイルスの前駆体膜及びエンベロープ。
図４２Ａ〜図４２Ｄを含み、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６ワクチンまたはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥブラジルワクチンの免疫応答の特徴付けを実証する実験結果を図示する。図４２Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６ワクチン及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ブラジルＤＮＡワクチンのいずれかでのワクチン接種後の細胞性応答及び抗体応答を測定するＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡ分析を図示する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）を２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６で３回、筋肉内投与により免疫誘導し、続いてインビボエレクトロポレーションを行った。細胞性免疫応答誘導の指標としてのＩＦＮ−γ産出をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。３回目の免疫誘導から１週間後に採取した脾細胞を、全ｐｒＭ及びＥタンパク質に及ぶ６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果を積み上げ棒グラフで示す。データは、脾細胞１００万個当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、このうち値が各々における平均応答±標準誤差を表す。図４２Ｂは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６ワクチン及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ブラジルＤＮＡワクチンのいずれかでのワクチン接種後の細胞性応答及び抗体応答を測定するＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡ分析を図示する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）を２５μｇのＺＩＫＶ ｐｒＭＥ−ブラジルで３回、筋肉内投与により免疫誘導し、続いてインビボエレクトロポレーションを行った。細胞性免疫応答誘導の指標としてのＩＦＮ−γ産出をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。３回目の免疫誘導から１週間後に採取した脾細胞を、全ｐｒＭ及びＥタンパク質に及ぶ６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果を積み上げ棒グラフで示す。データは、脾細胞１００万個当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、このうち値が各々における平均応答±標準誤差を表す。図４２Ｃは、免疫誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける結合抗体産生を測定するＥＬＩＳＡ分析を図示する。免疫誘導後３５日目のマウス由来の血清を種々の希釈率で用いてｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を分析した。図４２Ｄは、免疫誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける結合抗体産生を測定するＥＬＩＳＡ分析を図示する。免疫誘導後３５日目のマウス由来の血清を種々の希釈率で用いてｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を分析した。
図４３Ａ〜図４３Ｄを含み、ＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質の発現、精製、及び特徴付けを実証する実験結果を図示する。図４３Ａは、ｒＺＩＫＶ Ｅ発現のためのクローニングプラスミドを図示する。図４３Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析による組換えＺＩＫＶ−Ｅ（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）タンパク質の特徴付けを図示する。列１−ＢＳＡ対照、列２−ｐＥＴ−２８ａベクタープラスミドで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ培養物由来の溶解物をニッケル金属親和性樹脂カラムによって精製し、ＩＰＴＧ誘導後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。列３、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて（３７）組換えＺＶ−Ｅ精製タンパク質をウェスタンブロットによって分析した。列Ｍ、タンパク質分子量マーカー。図４３Ｃは、精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質をその抗原性について評価したことを図示する。ＥＬＩＳＡプレートをｒＺＩＫＶ−Ｅでコーティングし、次いで、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで免疫誘導したマウス由来の種々の希釈率の免疫血清または陽性対照としての汎フラビウイルス抗体とともにインキュベートした。実験例に記載されるように、結合したＩｇＧをペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体、続いてテトラメチルベンジジン基質の添加によって検出した。図４３Ｄは、ＺＩＫＶ ｐｒＭＥ免疫誘導マウス由来の免疫血清を用いた精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質のウェスタンブロット検出を図示する。記載されるように種々の濃度の精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。１：１００免疫血清、及び１：１５，０００のヤギ抗マウスの希釈物を室温で１時間使用した。洗浄後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像装置で撮像した。Ｏｄｙｓｓｅｙタンパク質分子量標準物質を使用した。矢印はｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質の位置を示す。
図４４Ａ〜図４４Ｃを含み、ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるジカ−ｐｒＭＥ免疫応答の特徴付けを実証する実験結果を図示する。ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥに対する細胞性応答及び抗体応答を測定するＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡ分析。マウス（ｎ＝４／群）を２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで３回、筋肉内投与により免疫誘導し、続いてインビボエレクトロポレーションを行った。図４４Ａは、細胞性免疫応答誘導の指標としてのＩＦＮ−γ産出をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したことを図示する。図４４Ｂは、免疫誘導ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおける結合抗体産生を測定するＥＬＩＳＡ分析を図示する。免疫誘導後の種々の時点におけるマウス由来の血清を用いてｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を分析した。図４４Ｃは、免疫誘導ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおいて産生された抗ＺＩＫＶ抗体の終末点力価分析を図示する。
図４５Ａ〜図４５Ｄを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥに対して免疫誘導したアカゲザル由来の免疫血清の中和活性を実証する実験結果を図示する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで免疫誘導した（６週目）ＮＨＰのプール血清の存在下で、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧ細胞を疑似感染させたか、または０．０１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでのＭＲ７６６で感染させた。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種ＮＨＰ由来の血清を使用して、ジカウイルス感染能を感染から４日後に間接免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）によって分析した。図４５Ａは、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＭＲ７６６及びＰＲ２０９による感染の阻害を実証する、対物２０倍で撮影した染色済み組織試料薄片の写真を図示する。図４５Ｂは、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧによる感染の阻害を実証する、対物２０倍で撮影した染色済み組織試料薄片の写真を図示する。図４５Ｃは、棒グラフが、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＭＲ７６６及びＰＲ２０９による感染の阻害を実証する、感染した（ＧＦＰ陽性細胞）の百分率を示すことを図示する。図４５Ｄは、棒グラフが、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧによる感染の阻害を実証する、感染した（ＧＦＰ陽性細胞）の百分率を示すことを図示する。
図４６Ａ〜図４６Ｄを含み、ＺＩＫＶがＩＦＮＡＲ−／−マウスに対して病毒性であることを実証する実験結果を図示する。これらのデータは、ＺＩＫＶがＩＦＮＡＲ−／−において病毒性であり、病的状態及び死亡をもたらすことを確認する。図４６Ａは、１０６ｐｆｕのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを頭蓋内投与を介して接種したＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプランマイヤー生存曲線を図示する。図４６Ｂは、１０６ｐｆｕのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを静脈内投与を介して接種したＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプランマイヤー生存曲線を図示する。図４６Ｃは、１０６ｐｆｕのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを腹腔内投与を介して接種したＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプランマイヤー生存曲線を図示する。図４６Ｄは、１０６ｐｆｕのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを皮下投与を介して接種したＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプランマイヤー生存曲線を図示する。図４６Ａは、すべての経路に関する感染の過程中のマウスの体重変化を図示する。
持続的及び全身性の抗ジカウイルス−Ｅｎｖ抗体の誘導を実証する実験結果を図示する。抗ＺＩＫＶ抗体応答がＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ＋ＺＶ−ＤＭＡｂ免疫誘導によって誘導される。Ａ１２９マウス（ｎ＝４）を２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドで、２週間間隔で３回、またはＺＩＫＶ−ＤＭＡｂで１回、筋肉内投与により免疫誘導した。示されるように異なる時点の動物由来の血清を用いて組換えＺＩＫＶ−エンベロープへの結合を分析した。単回ＺＶ−ＩｇＧ（ヒト抗ＺＩＫＶ）注射及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導（マウス抗ＺＩＫＶエンベロープ）後の持続的及び全身性の抗ＺＩＫＶ Ｅｎｖ抗体の誘導。示されるデータは少なくとも２回の別個の実験を表すものであり、平均ＯＤ４５０値が±標準偏差で示される。
本発明は、ジカウイルス抗原に対する抗体、及びその機能性断片をコードする組換え核酸配列を含む、組成物に関する。本組成物は、それを必要とする対象に投与して、合成抗体のインビボ発現及び形成を促進することができる。
本発明はまた、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発する第１の組成物と、抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む第２の組成物との組み合わせにも関する。
本発明の別の態様は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を生み出すことが可能な１つ以上の核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む、免疫原性組成物を提供する。一実施形態では、該核酸分子は、哺乳動物においてコンセンサスジカ抗原を発現することが可能な１つ以上の核酸配列と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。一実施形態では、該核酸分子は、コンセンサスジカ抗原をコードするコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一実施形態では、コンセンサスジカ抗原は、コンセンサスｐｒＭＥ、ＮＳ１、カプシド、または前述の抗原のうちの１つ以上の融合物を含む。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む、コンセンサスジカ抗原をコードする最適化された核酸配列を含む。
本発明は、抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物に関する。本組成物は、それを必要とする対象に投与して、合成抗体のインビボ発現及び形成を促進することができる。
特に、組換え核酸配列から発現された重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、合成抗体へと組織化し得る。重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、組織化により、抗原に結合可能な、本明細書に記載の組織化されていない抗体と比較してより免疫原性の、及び抗原に対する免疫応答を誘発または誘導可能な合成抗体がもたらされるように、互いに相互作用し得る。
追加的に、これらの合成抗体は、対象において、抗原誘導性免疫応答に応答して産生される抗体よりも迅速に産出される。本合成抗体は、様々な抗原に有効に結合し、それを中和することができる。本合成抗体はまた、疾患に対して有効に保護し、及び／または疾患生存率を促進することができる。
１．定義
別途規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優位に立つ。好ましい方法及び材料が下記に記載されるが、本明細書に記載の方法及び材料と同様のまたは同等の方法及び材料を本発明の実践または試験において使用することができる。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が援用される。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、例示説明にすぎず、限定することは意図していない。
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、及びその変化形は、追加の作用または構造の可能性を排除しない開放型の移行句、用語、または語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの抗体、またはその断片、断片もしくは誘導体を意味し得、これにはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及び１本鎖抗体、ならびにそれらの誘導体が含まれる。本抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはそれらの混合物であり得、それは所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を呈する。
本明細書で同義に使用される「抗体断片」または「抗体の断片」とは、抗原結合部位または可変領域を含む無傷の抗体の一部分を指す。この部分は、無傷の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変ドメインのみを含有する１本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する１本鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域のみを含有する１本鎖ポリペプチド、及び重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する１本鎖ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
「抗原」とは、宿主において免疫応答を生み出す能力を有するタンパク質を指す。抗原は、抗体によって認識され、結合され得る。抗原は、体内に源を発しても、または外部環境に源を発してもよい。
本明細書で使用される「コード（ｃｏｄｉｎｇ）配列」または「コーディング（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）核酸」とは、本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指すことを意味し得る。コード配列は、該核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を導くことができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、開始シグナル及び終結シグナルをさらに含み得る。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。
本明細書で使用される「補体」または「相補的」とは、核酸を意味し得、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン・クリック型（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対合を意味し得る。
本明細書で使用される「定電流」とは、組織、または該組織を画成する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間にわたって受け取るまたは経験する電流を定義するものである。電気パルスは、本明細書に記載のエレクトロポレーションデバイスから送達される。本明細書に提供されるエレクトロポレーションデバイスは、好ましくは瞬時のフィードバックを有するフィードバック要素を有するため、この電流は、該組織において、電気パルスの寿命にわたって一定のアンペア数にとどまる。フィードバック要素は、パルスの持続期間全体を通して組織（または細胞）の抵抗値を測定し、エレクトロポレーションデバイスにより、同組織における電流が電気パルス全体（およそ数マイクロ秒）を通して、及びパルス間で一定にとどまるように、その電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上昇させる）ことができる。一部の実施形態では、フィードバック要素は、コントローラを含む。
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」は、同義に使用され得、提供されるエレクトロポレーションデバイスの能動的応答を意味し得、これは電極間にある組織における電流を測定し、電流を一定レベルで維持するためにエレクトロポレーションデバイスによって送達されるエネルギー出力を適宜変化させることを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処置の開始前にユーザーによって事前設定される。フィードバックは、エレクトロポレーションデバイスのエレクトロポレーションコンポーネント、例えば、コントローラによって遂行され得、その中の電気回路が、電極間にある組織における電流を継続的に監視し、その監視される電流（または組織内の電流）を事前設定電流と比較し、エネルギー出力を継続的に調整して監視される電流を事前設定レベルに維持することができる。フィードバックループは、それがアナログ閉ループフィードバックであるため瞬時であってもよい。
本明細書で使用される「分散型電流（Ｄｅｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｃｕｒｒｅｎｔ）」とは、本明細書に記載のエレクトロポレーションデバイスの種々の針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、このパターンは、エレクトロポレーションを受けている組織のあらゆる面積に対するエレクトロポレーション関連の熱ストレスの発生を最小化、または好ましくは排除する。
本明細書で同義に使用される「エレクトロポレーション」、「電気透過処理（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」または「電気運動強化（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）は、膜貫通電界パルスを使用した、生体膜における微視的経路（細孔）の誘導を指し得る。この細孔の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどの生体分子、薬物、イオン、及び水が細胞膜の片側から反対側に通過することが可能となる。
本明細書で使用される「内因性抗体」とは、体液性免疫応答の誘導のために有効用量の抗原を投与された対象において産出される抗体を指し得る。
本明細書で使用される「フィードバック機構」とは、ソフトウェアまたはハードウェア（またはファームウェア）によって行われるプロセスを指し得、このプロセスでは、所望の組織（エネルギーのパルスの送達前、最中、及び／または後）のインピーダンスを受信し、それを現在値（ｐｒｅｓｅｎｔ ｖａｌｕｅ）、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーのパルスを調整して事前設定値を達成する。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行われ得る。
「断片」とは、機能である、すなわち、所望の標的に結合し、完全長抗体と同じ意図される効果を有することができる、抗体のポリペプチド断片を意味し得る。抗体の断片は、Ｎ及び／またはＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸を欠損していることを除いて、完全長と１００％同一であり得、いずれの場合もシグナルペプチド及び／または１位のメチオニンの有無を問わない。断片は、追加される任意の異種シグナルペプチドを除いて、特定の完全長抗体の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含み得る。断片は、抗体と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上同一であるポリペプチドの断片を含み得、追加的に、同一性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニン及び／または免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチド、例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニン及び／またはシグナルペプチドは、抗体の断片に連結され得る。
抗体をコードする核酸配列の断片は、５’及び／または３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドを欠損していることを除いて、完全長と１００％同一であり得、いずれの場合もシグナルペプチド及び／または１位のメチオニンをコードする配列の有無を問わない。断片は、追加される任意の異種シグナルペプチドを除いて、特定の完全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含み得る。断片は、抗体と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上同一であるポリペプチドをコードする断片を含み得、追加的に、同一性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を任意選択的に含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニン及び／または免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチド、例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドに対するコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニン及び／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結され得る。
本明細書で使用される「遺伝子構築物」とは、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、該核酸分子が投与される個体の細胞において発現を導くことができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、開始シグナル及び終結シグナルを含む。本明細書で使用されるとき、「発現可能形態」という用語は、個体の細胞に存在するときにそのコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結された、必要な調節エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。
本明細書で２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の関連において使用される「同一」または「同一性」とは、その配列が、指定の領域にわたって同じである指定の百分率の残基を有することを意味し得る。百分率は、２つの配列を最適にアライメントし、２つの配列を指定の領域にわたって比較し、両配列において同一残基が出現する位置の数を決定して一致する位置の数を得、一致する位置の数を指定の領域における位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって計算され得る。２つの配列が異なる長さであるか、またはアライメントにより１つ以上の不揃いな末端がもたらされ、指定の比較領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は計算の分母に含められるが、分子には含められない。ＤＮＡとＲＮＡとを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は同等とみなされてよい。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムの使用によって行われてよい。
本明細書で使用される「インピーダンス」は、フィードバック機構を考察する際に使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができ、このようにして事前設定電流との比較が可能となる。
本明細書で使用される「免疫応答」とは、１つ以上の核酸及び／またはペプチドの導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味し得る。免疫応答は、細胞性応答もしくは体液性応答、または両方の形態にあり得る。
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、一緒に共有結合的に連結した少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。１本鎖の描写はまた相補鎖の配列も定義する。故に、核酸はまた、描写される１本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントが所与の核酸と同じ目的で使用され得る。故に、核酸はまた、実質的に同一の核酸及びその補体も包含する。１本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。故に、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
核酸は１本鎖もしくは２本鎖であり得るか、または２本鎖の配列部分及び１本鎖の配列部分の両方を含有し得る。核酸は、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡいずれのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここにおいて核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は、化学合成法によってまたは組換え法によって得てもよい。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）側に位置付けられ得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、同プロモーターの由来となる遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とおよそ同じであり得る。当該技術分野で知られているように、プロモーター機能を喪失することなくこの距離の多様性が受け入れられ得る。
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」とは、アミノ酸の連鎖配列を意味し得、天然、合成、もしくは修飾または天然及び合成の組み合わせであり得る。
本明細書で使用される「プロモーター」とは、細胞における核酸の発現を付与する、活性化するまたは強化することが可能である合成または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、その発現をさらに強化し、及び／または空間的発現及び／または時間的発現を改変するために、１つ以上の特異的転写調節配列を含み得る。プロモーターはまた、転写の開始部位から最大数千塩基対に位置を定め得る、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含んでもよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子構成要素の発現を構成的に、あるいは、発現が生じる細胞、組織もしくは臓器に対して、発現が生じる発達段階に対して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して差次的に、調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ ４０後期プロモーター及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本明細書で同義に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端に連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は典型的に、タンパク質の局在化を導く。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は好ましくは、それが産生される細胞からのタンパク質の分泌を促進する。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞から分泌されると、しばしば成熟タンパク質と称されるタンパク質の残りの部分から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端で連結される。
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、核酸の複合体混合物中など、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況で様々であろう。ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨで、具体的な配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択され得る。Ｔｍは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰で存在するとき、Ｔｍにおいて、平衡状態でプローブの５０％が占有されている）、（規定のイオン強度ｐＨ、及び核酸濃度のもとでの）温度であり得る。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍナトリウムイオン未満、例えば、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）に関して少なくとも約３０℃及び長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）に関して少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成されてもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例となるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には以下が含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、加えて０．２×ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄。
本明細書で同義に使用される「対象」及び「患者」は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス、非ヒト霊長動物（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジー等といったサル）ならびにヒト）を含むがこれらに限定されない、任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。
本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ヌクレオチドもしくはアミノ酸もしくはそれよりも多くの領域にわたって、第２の配列の補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
本明細書で使用される「実質的に同一」とは、第１及び第２の配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００ヌクレオチドもしくはアミノ酸もしくはそれよりも多くの領域にわたって、または、第１の配列が第２の配列の補体に実質的に相補的である場合、核酸に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であることを意味し得る。
本明細書で使用される「合成抗体」は、本明細書に記載の組換え核酸配列によってコードされ、かつ対象において産出される、抗体を指す。
本明細書で使用される「治療」または「治療する」とは、疾患を予防する、抑制する、抑圧する、または完全に排除する手段を通した、疾患からの対象の保護を意味し得る。疾患の予防には、疾患の発症前に本発明のワクチンを対象に投与することが伴う。疾患の抑制には、疾患の誘導後であるがその臨床的発現前に本発明のワクチンを対象に投与することが伴う。疾患の抑圧には、疾患の臨床的発現後に本発明のワクチンを対象に投与することが伴う。
本明細書で核酸に関して使用される「バリアント」とは、（ｉ）参照のヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照のヌクレオチド配列もしくはその一部分の補体、（ｉｉｉ）参照の核酸もしくはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照の核酸、その補体、もしくはそれと実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を意味し得る。
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換の分だけアミノ酸配列が異なる、あるペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、少なくとも１つの生物学的活性をただ保持するにすぎない。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照のタンパク質と実質的に同一である、アミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を、同様の特性（例えば、親水性度、荷電領域の度合及び分布）を有する異なるアミノ酸と置き換えることは、当該技術分野において、典型的に軽微な変化を伴うものと認識されている。これらの軽微な変化は、部分的には、当該技術分野で理解されるように、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することによって特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性度及び電荷の考慮に基づく。同様のハイドロパシー指数を有するアミノ酸を置換しながらも依然としてタンパク質機能を保持することが可能であることが当該技術分野で知られている。一態様では、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸同士が置換される。アミノ酸の親水性度をまた用いて、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすような置換を明らかにすることができる。ペプチドの関連におけるアミノ酸の親水性度の考慮は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性度の計算を可能にし、これは抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である。米国特許第４，５５４，１０１号（参照により本明細書に全体的に援用される）。同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野で理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸同士で行われ得る。アミノ酸の疎水性指数及び親水性値は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その所見と一貫するように、生物学的機能と適合性であるアミノ酸置換は、疎水性度、親水性度、電荷、サイズ、及び他の特性によって明らかになる、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に左右されることが理解される。
バリアントは、全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
本明細書で使用される「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であってよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであってよい。
本明細書で数値範囲を列挙する場合、それらの間に介在する同じ精度での各数値が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲の場合、６及び９に加えて７及び８という数値が企図され、６．０〜７．０の範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０という数値が明示的に企図される。
２．組成物
本発明の一態様は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発する組成物と、抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物との組み合わせを提供する。本組成物は、それを必要とする対象に投与して、合成抗体のインビボ発現及び形成を促進することができる。一実施形態では、該核酸分子は、抗ＺＩＫＶ−エンベロープ（抗ＺＩＫＶ Ｅ）タンパク質抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発する第１の組成物と、抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む第２の組成物との組み合わせに関する。
ジカワクチン
本発明の別の態様は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を生み出すことが可能である１つ以上の核酸分子を含む、免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を生み出すことが可能である単離核酸分子も提供する。一実施形態では、該核酸分子は、哺乳動物においてコンセンサスジカ抗原を発現することが可能な１つ以上の核酸配列と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。一実施形態では、該核酸分子は、コンセンサスジカ抗原をコードするコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一実施形態では、コンセンサスジカ抗原は、コンセンサスｐｒＭＥ、ＮＳ１、カプシド、または前述の抗原のうちの１つ以上の融合物からなる。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む、コンセンサスジカ抗原をコードする最適化された核酸配列を含む。
配列番号 説明（ジカワクチンに関する）
２３ コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥタンパク質
２４ コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ（構築物１）ＤＮＡ
２５ コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ（構築物１）タンパク質
２６ コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ＮＳ１ ＤＮＡ
２７ コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ＮＳ１タンパク質
２８ コンセンサスジカＩｇＥリーダー−カプシドＤＮＡ
２９ コンセンサスジカＩｇＥリーダー−カプシドタンパク質
３０ ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ ＭＲ７６６ ＤＮＡ
３１ ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ ＭＲ７６６タンパク質
３２ ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥブラジルＤＮＡ
３３ ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥブラジルタンパク質
３４ コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ＮＳ１ ＤＮＡ（ｐＧＸ７２１１）
３５ コンセンサスジカＩｇＥリーダー−カプシドＤＮＡ（ｐＧＸ７２１２）
３６ ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥブラジルＤＮＡ（ｐＧＸ７２１３）
３７ ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ ＭＲ７６６ ＤＮＡ（ｐＧＸ７２１４）
３８ カプシドＤＮＡを含まないジカＰｒｅＥｎｖ（ＭＲ７６６）（ｐＧＸ７２１０）
３９ カプシドタンパク質を含まないジカＰｒｅＥｎｖ（ＭＲ７６６）（ｐＧＸ７２１０）
一部の実施形態では、本明細書の核酸配列は、ＩｇＥリーダー配列を５’末端から除去させ得、本明細書のタンパク質配列は、ＩｇＥリーダー配列をＮ末端から除去させ得る。
一実施形態では、核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するペプチドをコードすることができる。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８に記載のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８に記載のヌクレオチド配列の長さ全体にわたって少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する、ヌクレオチド配列であり得る。他の実施形態では、配列は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９に記載のアミノ酸配列の長さ全体にわたって少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列であり得る。
一部の実施形態では、該核酸分子は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８に記載の核酸配列の長さ全体にわたって少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＤＮＡ配列からの転写物である、ＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、該核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９に記載のアミノ酸配列の長さ全体にわたって少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、ＲＮＡ配列を含む。
コンセンサス−ジカ抗原は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。一部の実施形態では、抗原は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９に記載のアミノ酸配列の長さ全体にわたって少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９の免疫原性断片に対して相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の免疫原性断片が提供され得る。かかる免疫原性断片は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９に対して９５％相同であるタンパク質の、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含むことができる。一部の実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に対して９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。一部の実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に対して９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。一部の実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に対して９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。一部の実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に対して９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。一部の実施形態では、免疫原性断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーのような、リーダー配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列を含まない。
一実施形態では、核酸分子の免疫原性断片は、完全長最適化コンセンサスジカ抗原の少なくとも１つの免疫優性または免疫準優性なエピトープをコードする。
一部の実施形態は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９の完全長の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含む、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９の免疫原性断片に関する。免疫原性断片は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３９の断片に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同であり得る。一部の実施形態では、免疫原性断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーのようなリーダー配列をコードする配列を含む。一部の実施形態では、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
一実施形態では、該核酸分子は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８に対して少なくとも９０％相同な配列を含む。
一部の実施形態では、該核酸分子は、コード配列のＮ末端上にＩｇＥリーダー配列が欠けたジカ抗原をコードする配列を含む。一部の実施形態では、該ＤＮＡ核酸分子は、コード配列のＮ末端に結合するとともにプロモーターに作動可能に連結されたＩｇＥリーダー配列をさらに含む。
該核酸分子は、コード配列のＣ末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含むことができる。一実施形態では、該核酸分子は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントである。好ましくは、アジュバントは、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５からなる群から選択される。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤である。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質、より好ましくはポリ−Ｌ−グルタメート（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）である。好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度にある。一実施形態では、該核酸分子は、ＤＮＡプラスミドである。一実施形態では、該ＤＮＡプラスミドは、総ＤＮＡプラスミドの濃度が１ｍｇ／ｍｌ以上である。
一部の実施形態では、該核酸分子は、複数の固有の核酸分子を含み、複数の固有の核酸分子の各々が、コンセンサスｐｒＭＥタンパク質、コンセンサスｐｒＭＥ（構築物１）、コンセンサスＮＳ１ ＤＮＡ、またはコンセンサスカプシドタンパク質を含むポリペプチドをコードする。
該核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、及び配列番号３３を含むがこれらに限定されないアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、ＤＮＡプラスミドを含むことができる。
一実施形態では、該核酸分子は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８を含むがこれらに限定されないヌクレオチド配列を含む、核酸分子を含むことができる。
一実施形態では、該核酸分子は、最適化された核酸配列を含む。最適化された配列は、改善された発現のためのコンセンサス配列及び／または修飾（複数可）を含むことができる。修飾には、増加した翻訳開始のためのコドン最適化、ＲＮＡ最適化、コザック配列の付加、及び／または免疫原性を増加させるための免疫グロブリンリーダー配列の付加が含まれ得る。最適化された配列によってコードされるジカ抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、限定されないが、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリン（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、最適化コンセンサス配列によってコードされる該抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含むことができる。最適化された配列によってコードされるジカ抗原は、対応する天然抗原よりも強力な細胞性及び／または体液性免疫応答を誘発するように設計され得る。
本発明の一部の実施形態では、該核酸分子ワクチンは、アジュバントをさらに含むことができる。一部の実施形態では、アジュバントは、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナル配列が欠失したＩＬ−１５を含み、任意選択でＩｇＥからのシグナルペプチドを含む）からなる群から選択される。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子には、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌ−アルファ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びそれらの機能性断片をコードするものが含まれる。一部の好ましい実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、またはＭＥＣから選択される。
一部の実施形態では、哺乳動物におけるコンセンサスジカ抗原に対する免疫応答の誘発方法は、粘膜免疫応答の誘導方法を含む。かかる方法は、哺乳動物に、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質及びその機能性断片またはその発現可能なコード配列のうちの１つ以上を、上述のコンセンサスジカ抗原を含むＤＮＡプラスミドと組み合わせて投与することを含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質及びその機能性断片のうちの１つ以上は、本明細書に提供される核酸分子の投与の前、それと同時、またはその後に投与されてもよい。一部の実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ及びその機能性断片からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離核酸分子が、哺乳動物に投与される。
免疫原性組成物は、本組成物を投与された対象において免疫応答を誘導することができる。誘導される免疫応答は、天然抗原に特異的であり得る。誘導される免疫応答は、最適化コンセンサスによりコードされる抗原に関連する天然抗原と反応性であり得る。種々の実施形態では、関連する抗原には、最適化コンセンサスによりコードされる抗原のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、抗原が含まれる。種々の実施形態では、関連する抗原には、本明細書に開示される最適化コンセンサスヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、抗原が含まれる。
免疫原性組成物は、免疫原性組成物を投与された対象において体液性免疫応答を誘導することができる。誘導される体液性免疫応答は、天然抗原に特異的であり得る。誘導される体液性免疫応答は、最適化コンセンサスによりコードされる抗原に関連する天然抗原と反応性であり得る。体液性免疫応答は、免疫原性組成物を投与された対象において、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍、誘導され得る。体液性免疫応答は、免疫原性組成物を投与された対象において、免疫原性組成物を投与されていない対象または非最適化ジカ抗原を投与された対象と比較して少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍、誘導され得る。
免疫原性組成物によって誘導される体液性免疫応答には、免疫原性組成物を投与された対象に関連する、免疫原性組成物を投与されていない対象と比較して上昇した中和抗体レベルが含まれ得る。中和抗体は、最適化コンセンサスによりコードされる抗原に関連する天然抗原に特異的であり得る。中和抗体は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関連する天然抗原と反応性であり得る。中和抗体は、免疫原性組成物を投与された対象において腫瘍増殖、転移または腫瘍関連病変に対する保護及び／またはその治療を提供することができる。
免疫原性組成物によって誘導される体液性免疫応答には、免疫原性組成物を投与された対象に関連する、免疫原性組成物を投与されていない対象と比較して上昇したＩｇＧ抗体レベルが含まれ得る。これらのＩｇＧ抗体は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関連する天然抗原に特異的であり得る。これらのＩｇＧ抗体は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関連する天然抗原と反応性であり得る。免疫原性組成物を投与された対象に関連するＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性組成物を投与されていない対象と比較して約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍、上昇し得る。免疫原性組成物を投与された対象に関連するＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性組成物を投与されていない対象または非最適化ジカ抗原を投与された対象と比較して少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍、上昇し得る。
免疫原性組成物は、免疫原性組成物を投与された対象において細胞性免疫応答を誘導することができる。誘導される細胞性免疫応答は、最適化コンセンサスによりコードされる抗原に関連する天然抗原に特異的であり得る。誘導される細胞性免疫応答は、最適化コンセンサスによりコードされる抗原に関連する天然抗原に反応性であり得る。誘導される細胞性免疫応答には、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の誘発が含まれ得る。誘発されるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関連する天然抗原と反応性であり得る。誘発されるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、多機能性であり得る。誘導される細胞性免疫応答には、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の誘発が含まれ得、ここにおいてＣＤ８＋ Ｔ細胞は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの組み合わせを産生する。
誘導される細胞性免疫応答には、免疫原性組成物を投与された対象に関連する、免疫原性組成物を投与されていない対象と比較して増加したＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が含まれ得る。免疫原性組成物を投与された対象に関連するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、免疫原性組成物を投与されていない対象と比較して約２倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、または約４倍〜約２０倍、増加し得る。免疫原性組成物を投与された対象に関連するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、免疫原性組成物を投与されていない対象または非最適化ジカ抗原を投与された対象と比較して少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１６．０倍、少なくとも約１７．０倍、少なくとも約１８．０倍、少なくとも約１９．０倍、少なくとも約２０．０倍、少なくとも約２１．０倍、少なくとも約２２．０倍、少なくとも約２３．０倍、少なくとも約２４．０倍、少なくとも約２５．０倍、少なくとも約２６．０倍、少なくとも約２７．０倍、少なくとも約２８．０倍、少なくとも約２９．０倍、または少なくとも約３０．０倍、増加し得る。
誘導される細胞性免疫応答には、天然抗原に対して反応性であるＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ／Ｔ−ｂｅｔトリプル陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の増加した頻度が含まれ得る。免疫原性組成物を投与された対象に関連するＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ／Ｔ−ｂｅｔトリプル陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物を投与されていない対象または非最適化ジカ抗原を投与された対象と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍、増加し得る。
誘導される細胞性免疫応答には、天然抗原に対して反応性であるＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγダブル陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の増加した頻度が含まれ得る。免疫原性組成物を投与された対象に関連するＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγダブル陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物を投与されていない対象または非最適化ジカ抗原を投与された対象と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、または１４倍、増加し得る。
免疫原性組成物によって誘導される細胞性免疫応答には、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の誘発が含まれ得る。誘発されるＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関連する天然抗原と反応性であり得る。誘発されるＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、多機能性であり得る。誘導される細胞性免疫応答には、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の誘発が含まれ得、ここにおいてＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、またはＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの組み合わせを産生する。
誘導される細胞性免疫応答には、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋ Ｔ細胞の増加した頻度が含まれ得る。免疫原性組成物を投与された対象に関連するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物を投与されていない対象または非最適化ジカ抗原を投与された対象と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍、増加し得る。
誘導される細胞性免疫応答には、ＴＮＦ−αを産生するＣＤ４＋ Ｔ細胞の増加した頻度が含まれ得る。免疫原性組成物を投与された対象に関連するＣＤ４＋ＴＮＦ−α＋ Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物を投与されていない対象または非最適化ジカ抗原を投与された対象と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、または２２倍、増加し得る。
誘導される細胞性免疫応答には、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方を産生するＣＤ４＋ Ｔ細胞の増加した頻度が含まれ得る。免疫原性組成物を投与された対象に関連するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋の頻度は、免疫原性組成物を投与されていない対象または非最適化ジカ抗原を投与された対象と比較して少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１倍、２２倍、２３倍 ２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、または３５倍、増加し得る。
合成抗体
本発明は、抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物に関する。本組成物は、それを必要とする対象に投与すると、対象において合成抗体の産出をもたらすことができる。本合成抗体は、対象に存在する標的分子（すなわち、抗原）に結合することができる。かかる結合は、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識を遮断し、抗原に対する免疫応答を誘発または誘導することができる。
一実施形態では、本組成物は、合成抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、本組成物は、第１の合成抗体をコードする第１のヌクレオチド配列と、第２の合成抗体をコードする第２のヌクレオチド配列とを含む、核酸分子を含む。一実施形態では、該核酸分子は、切断ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該核酸分子は、抗ＺＩＫＶ−エンベロープ（抗ＺＩＫＶ Ｅ）タンパク質抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜２２のうちの１つ以上に記載のアミノ酸配列をコードする、１つ以上のコドン最適化された核酸配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜２２のうちの１つ以上に対して少なくとも９０％相同なアミノ酸配列をコードする、１つ以上のコドン最適化された核酸配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜２２のうちの１つ以上に記載のアミノ酸の免疫原性断片をコードする、１つ以上のコドン最適化された核酸配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜２２のうちの１つ以上に対して少なくとも９０％相同なアミノ酸配列の免疫原性断片をコードする、１つ以上のコドン最適化された核酸配列を含む。
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜２２のうちの１つ以上に記載のアミノ酸配列をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された、１つ以上のＲＮＡ配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜２２のうちの１つ以上に対して少なくとも９０％相同なアミノ酸配列をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された、１つ以上のＲＮＡ配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜２２のうちの１つ以上に記載のアミノ酸配列の免疫原性断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された、１つ以上のＲＮＡ配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜２２のうちの１つ以上に対して少なくとも９０％相同なアミノ酸配列の免疫原性断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された、１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２の可変ＶＨ及びＶＬ領域をコードする、１つ以上のコドン最適化された核酸配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号４の可変ＶＨ及びＶＬ領域をコードする、１つ以上のコドン最適化された核酸配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号５及び配列番号６の可変ＶＨ及びＶＬ領域をコードする、１つ以上のコドン最適化された核酸配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、配列番号１５または配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７及び配列番号８の可変ＶＨ及びＶＬ領域をコードする、１つ以上のコドン最適化された核酸配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、配列番号２１または配列番号２２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号９及び配列番号１０の可変ＶＨ及びＶＬ領域をコードする、１つ以上のコドン最適化された核酸配列を含む。一実施形態では、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、配列番号１７または配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
本発明の組成物は、ジカ感染症に関連する任意の疾患、障害、または病態を治療する、予防する及び／またはそれに対して保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、ウイルス感染症を治療する、予防する、及びまたは／それに対して保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、先天性欠損を治療する、予防する、及びまたは／それに対して保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、小頭症を治療する、予防する、及びまたは／それに対して保護することができる。
本合成抗体は、本組成物を投与された対象における疾患を治療する、予防する、及び／またはそれに対して保護することができる。本合成抗体は、本組成物を投与された対象のまだ妊娠していない子供、まだ生れていない子供、胎芽または胎児における疾患を治療する、予防する、及び／またはそれに対して保護することができる。本合成抗体は、抗原に結合することによって、本組成物を投与された対象、あるいは対象のまだ妊娠していない子供、まだ生れていない子供、胎芽または胎児における疾患を治療する、予防する、及び／またはそれに対して保護することができる。本合成抗体は、本組成物を投与された対象、あるいは対象のまだ妊娠していない子供、まだ生れていない子供、胎芽または胎児において疾患生存率を促進することができる。本合成抗体は、本組成物を投与された対象、あるいは対象のまだ妊娠していない子供、まだ生れていない子供、胎芽または胎児において、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の疾患生存率を提供することができる。他の実施形態では、本合成抗体は、本組成物を投与された対象、あるいは対象のまだ妊娠していない子供、まだ生れていない子供、胎芽または胎児において、少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％の疾患生存率を提供することができる。
本組成物は、本組成物の対象への投与から少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、または６０時間以内に、対象において合成抗体の産出をもたらすことができる。本組成物は、本組成物の対象への投与から少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日以内に、対象において合成抗体の産出をもたらすことができる。本組成物は、本組成物の対象への投与から約１時間〜約６日、約１時間〜約５日、約１時間〜約４日、約１時間〜約３日、約１時間〜約２日、約１時間〜約１日、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約６０時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約１２時間、または約１時間〜約６時間以内に、対象において合成抗体の産出をもたらすことができる。
本組成物は、それを必要とする対象に投与すると、対象において、体液性免疫応答を誘導する抗原を投与される対象における内因性抗体の産出よりも迅速に合成抗体の産出をもたらすことができる。本組成物は、体液性免疫応答を誘導する抗原を投与された対象における内因性抗体の産出よりも少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日前に、合成抗体の産出をもたらすことができる。
本発明の組成物は、本組成物が疾病または死亡を引き起こさないよう安全である、疾病に対して保護作用がある、及び投与が容易で、副作用が少なく、生物学的に安定かつ用量当たりの費用が低いといった、有効な組成物に必要とされる特徴を有することができる。
３．組換え核酸配列
上述のように、本組成物は、組換え核酸配列を含むことができる。該組換え核酸配列は、抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードすることができる。本抗体は、下記にさらに詳述される。
該組換え核酸配列は、異種核酸配列であり得る。該組換え核酸配列は、１つ以上の異種核酸配列を含むことができる。
該組換え核酸配列は、最適化された核酸配列であり得る。かかる最適化は、抗体の免疫原性を増加または改変することができる。最適化はまた、転写及び／または翻訳を改善し得る。最適化には、以下のうちの１つ以上が含まれ得る：転写を増加させるための低ＧＣ含量のリーダー配列、ｍＲＮＡ安定性及びコドン最適化、増加した翻訳のためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ ＡＣＣ）の付加、シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列の付加、配列内ＩＲＥＳ配列の付加及び可能な範囲でのシス作用配列モチーフ（すなわち、配列内ＴＡＴＡボックス）の排除。
ａ．組換え核酸配列構築物
該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができる。該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含むことができ、これらは下記にさらに詳述される。
該組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。該組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。該組換え核酸配列構築物はまた、プロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位をコードする異種核酸配列も含むことができる。該組換え核酸配列構築物はまた、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする異種核酸配列も含むことができる。ＩＲＥＳは、ウイルスＩＲＥＳまたは真核生物ＩＲＥＳのいずれかであってよい。該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができ、ここにおいて各リーダー配列がシグナルペプチドをコードする。該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーター、１つ以上のイントロン、１つ以上の転写終結領域、１つ以上の開始コドン、１つ以上の終結もしくは終止コドン、及び／または１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。該組換え核酸配列構築物はまた、１つ以上のリンカーまたはタグ配列も含むことができる。タグ配列は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードすることができる。
（１）重鎖ポリペプチド
該組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする異種核酸を含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域及び／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含むことができる。この少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、及び定常重鎖領域３（ＣＨ３）、及び／またはヒンジ領域を含むことができる。
一部の実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域及びＣＨ１領域を含むことができる。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域を含むことができる。
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）の組を含むことができる。ＣＤＲの組は、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含有し得る。重鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」と表される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
（２）軽鎖ポリペプチド
該組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域及び／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。
軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）の組を含むことができる。ＣＤＲの組は、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含有し得る。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」と表される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
（３）プロテアーゼ切断部位
該組換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含むことができる。プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識され得る。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼ、例えば、限定されないが、フリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシン、及びペプシンであり得る。プロテアーゼは、フリンであり得る。他の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または配列内ペプチド結合を切断する（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端ペプチド結合を切断しない）任意のプロテアーゼであり得る。
プロテアーゼ切断部位は、切断効率を促進または増加させる１つ以上のアミノ酸配列を含むことができる。該１つ以上のアミノ酸配列は、個別的なポリペプチドを形成または産出する効率を促進するか、または増加させることができる。１つ以上のアミノ酸配列は、２Ａペプチド配列を含むことができる。
（４）リンカー配列
該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー配列を含むことができる。リンカー配列は、本明細書に記載の１つ以上の構成要素を空間的に隔てるか、または連結することができる。他の実施形態では、リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に隔てるかまたは連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
（５）プロモーター
該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。該１つ以上のプロモーターは、遺伝子発現を駆動し、遺伝子発現を調節することが可能な任意のプロモーターであってよい。かかるプロモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要とされるシス作用配列エレメントである。遺伝子発現を導くのに使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に応じる。プロモーターは、該組換え核酸配列構築物において、その天然の設定における転写開始部位からの距離とおよそ同じ転写開始からの距離に位置付けられてよい。しかしながら、プロモーター機能を喪失することなくこの距離の多様性が受け入れられ得る。
プロモーターは、重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に作動可能に連結され得る。プロモーターは、真核細胞における発現に有効であることが示されるプロモーターであってもよい。コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及びＳＶ４０後期プロモーターなどのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトポリヘドリン、またはヒトメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）などのヒト遺伝子由来のプロモーターであってもよい。
プロモーターは、構成的プロモーター、または、宿主細胞が何らかの特定の外部刺激に曝露されるときのみ転写を開始する誘導性プロモーターであり得る。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは臓器または発達段階に特異的であり得る。プロモーターはまた、天然であろうと合成であろうと、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。かかるプロモーターの例については、米国特許出願公開第ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載されており、同文献の内容はその全体が本明細書に援用される。
プロモーターは、エンハンサーに関連付けられ得る。エンハンサーは、コード配列の上流に位置を定めることができる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶもしくはＥＢＶ由来のものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能強化については、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、及びＷＯ９４／０１６７３７に記載されており、各々の内容は参照により全体的に本明細書に援用される。
（６）イントロン
該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のイントロンを含むことができる。各イントロンは、機能性スプライスドナー及びアセプター部位を含むことができる。イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含むことができる。イントロンは、効率的なスプライシングに必要とされる１つ以上のシグナルを含むことができる。
（７）転写終結領域
該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の転写終結領域を含むことができる。転写終結領域は、効率的な終結を可能にするようにコード配列の下流にあり得る。転写終結領域は、上述のプロモーターと同じ遺伝子から得ることができるか、または１つ以上の異なる遺伝子から得ることができる。
（８）開始コドン
該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の開始コドンを含むことができる。開始コドンは、コード配列の上流に位置を定めることができる。開始コドンは、コード配列のインフレームにあり得る。開始コドンは、効率的な翻訳開始に必要とされる１つ以上のシグナル、例えば、限定されないが、リボソーム結合部位に関連付けられ得る。
（９）終結コドン
該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の終結または終止コドンを含むことができる。終結コドンは、コード配列の下流にあり得る。終結コドンは、コード配列のインフレームにあり得る。終結コドンは、効率的な翻訳終結に必要とされる１つ以上のシグナルに関連付けられ得る。
（１０）ポリアデニル化シグナル
該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、転写物の効率的なポリアデニル化に必要とされる１つ以上のシグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、コード配列の下流に位置付けられ得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであってよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであってよい。
（１１）リーダー配列
該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができる。リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチド、例えば、限定されないが、ＩｇＧシグナルペプチド及びＩｇＥシグナルペプチドであり得る。
ｂ．組換え核酸配列構築物の配置構成
上述のように、該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができ、ここにおいて各組換え核酸配列構築物が１つ以上の構成要素を含むことができる。該１つ以上の構成要素については、上記に詳述される。該１つ以上の構成要素は、該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、互いに対して任意の順序で配置され得る。一部の実施形態では、該１つ以上の構成要素は、該組換え核酸配列構築物において下記に記載するように配置され得る。
（１）配置構成１
１つの配置構成では、第１の組換え核酸配列構築物が、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができ、第２の組換え核酸配列構築物が、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができる。
第１の組換え核酸配列構築物は、ベクター中に定置することができる。第２の組換え核酸配列構築物は、第２のまたは別個のベクター中に定置することができる。該組換え核酸配列構築物のベクター中への定置について、下記にさらに詳述される。
第１の組換え核酸配列構築物はまた、プロモーター、イントロン、転写終結領域、開始コドン、終結コドン、及び／またはポリアデニル化シグナルも含むことができる。第１の組換え核酸配列構築物は、リーダー配列をさらに含むことができ、該リーダー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’側）に位置を定める。したがって、リーダー配列によってコードされるシグナルペプチドは、ペプチド結合によって重鎖ポリペプチドに連結され得る。
第２の組換え核酸配列構築物はまた、プロモーター、開始コドン、終結コドン、及びポリアデニル化シグナルも含むことができる。第２の組換え核酸配列構築物は、リーダー配列をさらに含むことができ、該リーダー配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’側）に位置を定める。したがって、シグナルペプチドは、ペプチド結合によって軽鎖ポリペプチドに連結され得る。
したがって、配置構成１の一例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター（及び故に第１の組換え核酸配列構築物）と、ＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター（及び故に第２の組換え核酸配列構築物）とを含むことができる。配置構成１の第２の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む重鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター（及び故に第１の組換え核酸配列構築物）と、ＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター（及び故に第２の組換え核酸配列構築物）とを含むことができる。
（２）配置構成２
第２の配置構成では、該組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列とを含むことができる。重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’側）に位置付けられ得る。代替的に、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’側）に位置付けられ得る。
該組換え核酸配列構築物は、下記にさらに詳述されるようにベクター中に定置することができる。
該組換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列及び／またはリンカー配列を含むことができる。該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられ得る。したがって、プロテアーゼ切断部位は、発現時に重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの別々のポリペプチドへ分離を可能にする。他の実施形態では、リンカー配列が該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられ得る。
該組換え核酸配列構築物はまた、プロモーター、イントロン、転写終結領域、開始コドン、終結コドン、及び／またはポリアデニル化シグナルも含むことができる。該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。該組換え核酸配列構築物は、２つのプロモーターを含むことができ、これにより１つのプロモーターが、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に関連付けられ得、第２のプロモーターが、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に関連付けられ得る。なおも他の実施形態では、該組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列及び軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に関連付けられている、１つのプロモーターを含むことができる。
該組換え核酸配列構築物は、２つのリーダー配列をさらに含むことができ、ここにおいて第１のリーダー配列が、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’側）に位置を定め、第２のリーダー配列が、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’側）に位置を定める。したがって、第１のリーダー配列によってコードされる第１のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって重鎖ポリペプチドに連結され得、第２のリーダー配列によってコードされる第２のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって軽鎖ポリペプチドに連結され得る。
したがって、配置構成２の一例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドと、ＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（及び故に組換え核酸配列構築物）を含むことができ、ここにおいてリンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられる。
２の配置構成の第２の例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドと、ＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（及び故に組換え核酸配列構築物）を含むことができ、ここにおいてプロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられる。
配置構成２の第３の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む重鎖ポリペプチドと、ＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードするベクター（及び故に組換え核酸配列構築物）を含むことができ、ここにおいてリンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられる。
２の配置構成の第４の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む重鎖ポリペプチドと、ＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（及び故に組換え核酸配列構築物）を含むことができ、ここにおいてプロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられる。
ｃ．組換え核酸配列構築物からの発現
上述のように、該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素の中でもとりわけ、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列及び／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができる。したがって、該組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。
上述の配置構成１が利用される場合、第１の組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドの発現を促進することができ、第２の組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。上述の配置構成２が利用される場合、該組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。
例えば、限定されないが、細胞、生物、または哺乳動物における発現時に、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、合成抗体へと組織化し得る。特に、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、組織化により、抗原に結合可能な合成抗体がもたらされるように、互いに相互作用し得る。他の実施形態では、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、組織化により、本明細書に記載の組織化されていない抗体と比較してより免疫原性の合成抗体がもたらされるように、互いに相互作用し得る。なおも他の実施形態では、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、組織化により、抗原に対する免疫応答を誘発または誘導可能な合成抗体がもたらされるように、互いに相互作用し得る。
ｄ．ベクター
上述の組換え核酸配列構築物は、１つ以上のベクター中に定置することができる。該１つ以上のベクターは、複製起点を含有し得る。該１つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。該１つ以上のベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
該１つ以上のベクターは、異種発現構築物であり得、これは一般に、特異的遺伝子を標的細胞内に導入するのに使用されるプラスミドである。ひとたび発現ベクターが細胞の内部に入ると、該組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドが、細胞転写及び翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。該１つ以上のベクターは、大量の安定なメッセンジャーＲＮＡ、したがってタンパク質を発現することができる。
（１）発現ベクター
該１つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミド及び線状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる。該組換え核酸配列構築物を含む該１つ以上のベクターは、その構成要素のうちの少なくとも１つがその他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して異種性であることを意味する、キメラであってもよい。
（２）プラスミド
該１つ以上のベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、細胞を該組換え核酸配列構築物でトランスフェクトするのに有用であり得る。プラスミドは、該組換え核酸配列構築物を対象内に導入するのに有用であり得る。プラスミドはまた、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現によく適している可能性がある、調節配列を含んでもよい。
プラスミドはまた、プラスミドを染色体外に維持し、細胞においてプラスミドの複数のコピーを生み出すために、哺乳類複製起点を含んでもよい。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４またはｐＲＥＰ４であってもよく、これは、組み込みを伴わずに高コピーのエピソーム複製を生み出し得る、エプスタイン・バーウイルス複製起点及び核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得る。プラスミドの骨格は、ｐＡＶ０２４２であってもよい。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであってもよい。
プラスミドは、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、これはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、これは酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであってもよく、これは昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐｃＤＮＡ１またはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであってもよく、これはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。
（３）ＲＮＡ
一実施形態では、核酸は、ＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、本明細書に記載のＤＮＡ配列から転写される。例えば、一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、配列番号２４、２６、２８、３０または３２のうちの１つに対して少なくとも９０％相同なＤＮＡ配列によってコードされる。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１〜２３、２５、２７、２９、３１、もしくは３３のポリペプチド配列、またはそのバリアントもしくはその断片をコードするＤＮＡ配列によって転写される、ＲＮＡ配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明は、ＤＭＡｂのうちの１つ以上をコードするＲＮＡ分子を提供する。ＲＮＡは、プラス鎖であり得る。したがって、一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、逆転写など、いずれの介在する複製工程も必要とすることなく、細胞によって翻訳され得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば７−メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、ＲＮＡのインビボ翻訳を強化することができる。本発明で有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有し得る。キャップ付加ＲＮＡにおいて、これは５’と５’の架橋を介して７−メチルグアノシンに連結され得る。ＲＮＡ分子は、３’ポリＡ尾部を有し得る。それはまた、その３’末端近くにポリＡポリメラーゼ認識配列（例えばＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、１本鎖であり得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、合成ＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、裸のＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、ベクター内に含まれる。
一実施形態では、ＲＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態では、５’ＵＴＲは、ゼロ〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの様々な領域にアニーリングするＰＣＲ用のプライマーの設計を含むがこれらに限定されない、様々な方法で改変することができる。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するのに必要とされる５’及び３’ＵＴＲの長さを修飾することができる。
５’及び３’ＵＴＲは、目的とする遺伝子に対して天然に存在する内因性５’及び３’ＵＴＲであり得る。代替的に、ＵＴＲ配列を順方向及び逆方向プライマーに組み込むことによって、またはテンプレートの任意の他の修飾によって、目的とする遺伝子に内因性でないＵＴＲ配列が付加され得る。目的とする遺伝子に内因性でないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率を修飾するのに有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵリッチ領域がＲＮＡの安定性を減少させ得ることが知られている。したがって、当該技術分野で周知のＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を増加させるように３’ＵＴＲが選択または設計され得る。
一実施形態では、５’ＵＴＲは、内因性遺伝子のコザック配列を含有し得る。代替的に、上述のように目的とする遺伝子に内因性でない５’ＵＴＲがＰＣＲによって付加されようとするとき、その５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスコザック配列が再設計され得る。コザック配列は、一部のＲＮＡ転写物の翻訳の効率を上昇させ得るが、効率的な翻訳を可能にするためにすべてのＲＮＡに必要とされるようには思われない。多くのＲＮＡに対するコザック配列の必要条件は当該技術分野で知られている。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、当該ＲＮＡゲノムが細胞内で安定しているＲＮＡウイルスに由来し得る。他の実施形態では、種々のヌクレオチド類似体を３’または５’ＵＴＲにおいて使用して、ＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。
一実施形態では、ＲＮＡは、細胞内でのリボソーム結合、翻訳の開始及びＲＮＡの安定性を決定する、５’末端上のキャップ及び３’ポリ（Ａ）尾部の両方を有する。
一実施形態では、ＲＮＡは、ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、例えば、安定性の増加、自然免疫原性の低さまたは不在、及び翻訳の強化を含む、非修飾ＲＮＡを上回る特定の利点を有する。
（４）環状及び線状ベクター
該１つ以上のベクターは、環状プラスミドであり得、これは細胞ゲノムへの組み込みによって標的細胞を形質転換し得るか、または染色体外に存在し得る（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）。ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、またはｐｒｏｖａｘ、あるいは、該組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドを発現することが可能な任意の他の発現ベクターであり得る。
また、エレクトロポレーションを介して対象に効率的に送達され、該組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドを発現することが可能である、線状核酸、すなわち線状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、いかなるリン酸骨格も欠けている任意の線状ＤＮＡであってよい。ＬＥＣは、いかなる抗生物質耐性遺伝子及び／またはリン酸骨格も含有しない場合がある。ＬＥＣは、所望の遺伝子発現に無関係な他の核酸配列を含有しない場合がある。
ＬＥＣは、線状化可能な任意のプラスミドに由来してよい。プラスミドは、該組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドを発現することが可能であり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、またはｐｒｏｖａｘ、あるいは、該組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドを発現することが可能な任意の他の発現ベクターであってよい。
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰ及びｐｃｒＭＲは、それぞれｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）及びｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
（５）ウイルスベクター
一実施形態では、本発明の核酸を細胞に送達可能であるウイルスベクターが本明細書に提供される。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されもよい。ウイルスベクター技術は当該技術分野で周知されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能性の複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能マーカーを含有する。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。ウイルスベクター、とりわけレトロウイルスベクターは、哺乳類、例えば、ヒト細胞への遺伝子の挿入に最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス、ならびに同等物に由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
（６）ベクターの調製方法
該組換え核酸配列構築物が定置された１つ以上のベクターの調製方法が本明細書に提供される。最終サブクローニング工程の後、当該技術分野で既知の方法を使用して、このベクターを大規模発酵タンク内で細胞培養物の植菌に使用することができる。
他の実施形態では、最終サブクローニング工程の後、ベクターを１つ以上のエレクトロポレーション（ＥＰ）デバイスとともに使用することができる。エレクトロポレーションデバイスについては、下記にさらに詳述される。
該１つ以上のベクターは、既知のデバイス及び技法の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは、それらはプラスミド製造技法を使用して製造される。プラスミド製造技法については、ライセンスを付与された同時係属中の米国仮出願米国第６０／９３９，７９２号（２００７年５月２３日に出願された）に記載されている。一部の例では、本明細書に記載のＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技法はまた、ライセンスを付与された特許である米国特許第７，２３８，５２２号（２００７年７月３日に発行された）に記載されるものを含む、米国第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当該技術分野で公知の種々のデバイス及びプロトコルを含むか、またはそれらを組み込む。上記で参照した出願及び特許である、それぞれ米国第６０／９３９，７９２号及び米国特許第７，２３８，５２２号は、それらの全体が本明細書に援用される。
４．抗体
上述のように、該組換え核酸配列は、抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードすることができる。本抗体は、抗原に結合または反応することができ、これについては下記にさらに詳述される。
本抗体は、重鎖及び軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）の組を含み得、これらのＣＤＲはそれぞれ、ＣＤＲに支持を提供するとともにＣＤＲの互いに対する空間的関係を規定する、重鎖及び軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）の組の間に介在する。ＣＤＲ組は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含有し得る。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」と表される。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲ組を含む、６つのＣＤＲを含み得る。
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を生み出し、これらのうちの２つである（Ｆ（ａｂ）断片）が各々、無傷の抗原結合部位を含む共有結合型ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含めた、いくつかの断片を提供可能である。したがって、本抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含むことができる。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域及びＣＨ１領域を含むことができる。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域及びＣＬ領域を含むことができる。
本抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含むことができる。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域を含むことができる。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域及びＣＬ領域を含むことができる。
本抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本抗体は、キメラ抗体、１本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、所望の抗原に結合する非ヒト種由来の抗体であり得る。
本抗体は、下記にさらに詳述される二重特異性抗体であり得る。本抗体は、同じく下記にさらに詳述される二重機能性抗体であり得る。
上述のように、本抗体は、本組成物を対象に投与すると、対象において産出され得る。本抗体は、対象の内部で、ある半減期を有し得る。一部の実施形態では、本抗体は、対象の内部でその半減期を延長または短縮するように修飾されてもよい。かかる修飾については、下記にさらに詳述される。
本抗体は、下記にさらに詳述されるように脱フコシル化され得る。
本抗体は、下記にさらに詳述される抗原に関連付けられる疾患の抗体依存性感染増強（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）（ＡＤＥ）を低減または阻止するように修飾されてもよい。
ａ．二重特異性抗体
該組換え核酸配列は、二重特異性抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードすることができる。二重特異性抗体は、２つの抗原、例えば、下記にさらに詳述される抗原のうちの２つに結合または反応することができる。二重特異性抗体は、本明細書に記載の抗体のうちの２つの断片からなり得、それによって二重特異性抗体が２つの所望の標的分子に結合または反応するのを可能にする。標的分子には、下記にさらに詳述される抗原、受容体に対するリガンドを含めたリガンド、受容体上のリガンド結合部位を含めた受容体、リガンド−受容体複合体、及びマーカーが含まれ得る。
ｂ．二重機能性抗体
該組換え核酸配列は、二重機能性抗体、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードすることができる。二重機能性抗体は、下記に記載される抗原に結合または反応することができる。二重機能性抗体はまた、抗原の認識及び抗原への結合に加えて、追加の機能性を抗体に与えるように修飾され得る。かかる修飾には、Ｈ因子またはその断片へのカップリングが含まれ得るが、これらに限定されない。Ｈ因子は、補体活性化の可溶性調節因子であり、故に、補体媒介性溶解（ＣＭＬ）を介して免疫応答に寄与し得る。
ｃ．抗体半減期の延長
上述のように、本抗体は、対象における抗体の半減期を延長または短縮するように修飾されてもよい。修飾により、対象の血清中の抗体の半減期が延長または短縮され得る。
修飾は、抗体の定常領域に存在してもよい。修飾は、１つ以上のアミノ酸置換を含有しない抗体の半減期と比較して当該抗体の半減期を延長する、抗体の定常領域における１つ以上のアミノ酸置換であり得る。修飾は、１つ以上のアミノ酸置換を含有しない抗体の半減期と比較して当該抗体の半減期を延長する、抗体のＣＨ２ドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換であり得る。
一部の実施形態では、定常領域における１つ以上のアミノ酸置換は、定常領域におけるメチオニン残基のチロシン残基での、定常領域におけるセリン残基のトレオニン残基での、定常領域におけるトレオニン残基のグルタミン酸残基での置き換え、またはそれらの任意の組み合わせを含み得、それによって抗体の半減期を延長する。
他の実施形態では、定常領域における１つ以上のアミノ酸置換は、ＣＨ２ドメインにおけるメチオニン残基のチロシン残基での、ＣＨ２ドメインにおけるセリン残基のトレオニン残基での、ＣＨ２ドメインにおけるトレオニン残基のグルタミン酸残基での置き換え、またはそれらの任意の組み合わせを含み得、それによって抗体の半減期を延長する。
ｄ．脱フコシル化
該組換え核酸配列は、フコシル化されていない抗体（すなわち、脱フコシル化抗体または非フコシル化抗体）、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードすることができる。フコシル化は、糖フコースの分子への付加、例えば、フコースＮ−グリカン、Ｏ−グリカン及び糖脂質への結合を含む。したがって、脱フコシル化抗体において、フコースは、定常領域の炭水化物鎖に結合していない。転じて、このフコシル化の欠如が、フコシル化抗体と比較して当該抗体によるＦｃγＲＩＩＩａ結合及び抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）（ＡＤＣＣ）活性を改善し得る。したがって、一部の実施形態では、非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を呈し得る。
本抗体は、抗体のフコシルを阻止または阻害するように修飾されてもよい。一部の実施形態では、かかる修飾抗体は、未修飾抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を呈し得る。修飾は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせにあってもよい。修飾は、重鎖における１つ以上のアミノ酸置換、軽鎖における１つ以上のアミノ酸置換、またはそれらの組み合わせであり得る。
ｅ．低減されたＡＤＥ応答
本抗体は、抗原に関連付けられる疾患の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を低減または阻止しながらも、依然として抗原を中和するように、修飾されてもよい。
一部の実施形態では、本抗体は、抗体のＦｃγＲ１ａへの結合を低減または阻止する１つ以上のアミノ酸置換を含むように修飾されてもよい。該１つ以上のアミノ酸置換は、抗体の定常領域にあってもよい。該１つ以上のアミノ酸置換は、抗体の定常領域におけるロイシン残基のアラニン残基での置き換えを含み得、すなわち、本明細書で別名ＬＡ、ＬＡ変異またはＬＡ置換ともいう。該１つ以上のアミノ酸置換は、抗体の定常領域における２つのロイシン残基の、各々アラニン残基での置き換えを含み得、本明細書で別名ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ変異、またはＬＡＬＡ置換ともいう。ＬＡＬＡ置換の存在は、抗体がＦｃγＲ１ａに結合するのを阻止または遮断し得、故に、修飾抗体は、抗原に関連付けられる疾患のＡＤＥを増強しないかまたは引き起こさないが、依然として抗原を中和する。
５．抗原
本合成抗体は、抗原またはその断片もしくはバリアントに向けられる。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、多糖類またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。多糖類は、核酸によりコードされた多糖類であり得る。
抗原は、ウイルス由来であり得る。抗原は、ウイルス感染症に関連付けられ得る。一実施形態では、抗原は、ジカ感染症に関連付けられ得る。一実施形態では、抗原は、ジカエンベロープタンパク質であり得る。
一実施形態では、本発明の合成抗体は、２つ以上の抗原を標的とする。一実施形態では、二重特異性抗体の少なくとも１つの抗原は、本明細書に記載の抗原から選択される。一実施形態では、該２つ以上の抗原は、本明細書に記載の抗原から選択される。
ａ．ウイルス抗原
ウイルス抗原は、ウイルス抗原またはその断片もしくはバリアントであり得る。ウイルスは、疾患を引き起こすウイルスであり得る。ウイルスは、ジカウイルスであり得る。
抗原は、ジカウイルス抗原、またはその断片、またはそのバリアントであってもよい。ジカ抗原は、ウイルスの複製、感染または生存を可能にする因子由来であり得る。ジカウイルスの複製または生存を可能にする因子には、構造的タンパク質及び非構造的タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。かかるタンパク質は、エンベロープタンパク質であり得る。
一実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質である。
６．賦形剤及び組成物の他の構成成分
本組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノリン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤が含まれ得る。
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタメートであり、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で本組成物中に存在し得る。トランスフェクション促進剤にはまた、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノリン類似体、ならびにスクアレン及びスクアレンなどの小胞も含まれ得、ヒアルロン酸もまた、本組成物と併用投与して使用され得る。本組成物はまた、トランスフェクション促進剤、例えば、脂質、レシチンリポソームもしくはＤＮＡ−リポソーム混合物（例えばＷＯ９３２４６４０を参照されたい）として当該技術分野で既知の他のリポソームを含めたリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
本組成物は、１９９４年４月１日に出願された米国第０２１，５７９号に記載される遺伝子促進剤（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ａｇｅｎｔ）をさらに含み得、同文献は参照により全体的に援用される。
本組成物は、ＤＮＡを約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で含み得る。一部の好ましい実施形態では、本発明による組成物は、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。一部の好ましい実施形態では、組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。一部の好ましい実施形態では、本組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。一部の好ましい実施形態では、本組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。一部の好ましい実施形態では、本組成物は、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム；約１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。
本組成物は、使用予定の投与様式に従って製剤化され得る。注射用薬学的組成物は、滅菌、発熱物質不含及び微粒子不含であり得る。等張製剤または等張液が使用され得る。等張性を得るための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれ得る。本組成物は、血管収縮剤を含むことができる。等張液には、リン酸緩衝食塩水が含まれ得る。本組成物は、ゼラチン及びアルブミンを含めた安定剤をさらに含むことができる。安定剤は、製剤が室温または周囲温度で長期間安定であることを可能にし得、これにはＬＧＳすなわちポリカチオンまたはポリアニオンが含まれる。
７．合成抗体の産出方法
本発明はまた、合成抗体の産出方法にも関する。本方法は、下記にさらに詳述される送達方法を使用することによって本組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。したがって、本合成抗体は、本組成物を対象に投与すると、対象においてすなわちインビボで産出される。
本方法はまた、本組成物を１つ以上の細胞内に導入することも含み得、したがって、本合成抗体は、１つ以上の細胞において産出または産生され得る。本方法は、本組成物を１つ以上の組織、例えば、限定されないが、皮膚及び筋肉内に導入することもさらに含み得、したがって、本合成抗体は、１つ以上の組織において産出または産生され得る。
８．抗体の同定方法またはスクリーニング方法
本発明はさらに、上述の抗原に反応性であるかまたは結合する、上述の抗体の同定方法またはスクリーニング方法に関する。本抗体の同定方法またはスクリーニング方法は、当該技術分野で既知の手法において抗原を使用して、本抗体を同定またはスクリーニングすることができる。かかる手法には、ライブラリからの抗体の選択（例えば、ファージディスプレイ）及び動物の免疫誘導、続いて抗体の単離及び／または精製が含まれ得るが、これらに限定されない。
９．組成物の送達方法
本発明はまた、本組成物の、それを必要とする対象への送達方法にも関する。送達方法は、本組成物を対象に投与することを含み得る。投与には、インビボエレクトロポレーションを用いた及び用いないＤＮＡ注射、リポソーム媒介送達、ならびにナノ粒子促進送達が含まれ得るが、これらに限定されない。
本組成物の送達を受ける哺乳動物は、ヒト、霊長動物、非ヒト霊長動物、カウ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、スイギュウ、バイソン、ウシ属動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、及びニワトリであり得る。
本組成物は、経口で、非経口で、舌下で、経皮で、直腸で、経粘膜で、局所で、吸入を介して、頬側投与を介して、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、及び関節内またはそれらの組み合わせを含む、様々な経路によって投与されてもよい。獣医学的使用の場合、本組成物は、通常の獣医学診療に準拠して好適に許容される製剤として投与されてもよい。獣医は、特定の動物に最も適切である投薬レジメン及び投与経路を容易に決定することができる。本組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎｓ）」、またはエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与されてもよい。
ａ．エレクトロポレーション
エレクトロポレーションを介した本組成物の投与は、哺乳動物の所望の組織に、可逆的な細孔を細胞膜に形成させるのに有効なエネルギーのパルスを送達するように構成され得る、エレクトロポレーションデバイスを使用して遂行されてもよく、好ましくは、このエネルギーのパルスは、ユーザーにより入力された事前設定電流と同様の定電流である。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーションコンポーネント及び電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含み得る。エレクトロポレーションコンポーネントは、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、伝達ポート、メモリコンポーネント、電源、及び電源スイッチを含めた、エレクトロポレーションデバイスの種々の要素のうちの１つ以上を含み、組み込み得る。エレクトロポレーションは、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進するためのインビボエレクトロポレーションデバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレータ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を使用して、遂行され得る。
エレクトロポレーションコンポーネントは、エレクトロポレーションデバイスの１つの要素として機能してもよく、その他の要素は、エレクトロポレーションコンポーネントと通信している別個の要素（またはコンポーネント）である。エレクトロポレーションコンポーネントは、エレクトロポレーションデバイスの１つよりも多くの要素として機能してもよく、これらは、エレクトロポレーションコンポーネントとは別個の、エレクトロポレーションデバイスのなおも他の要素と通信していてもよい。１つの電気機械または機械デバイスの部品として存在するエレクトロポレーションデバイスの要素は、これらの要素が１つのデバイスとしてまたは互いに通信している別個の要素としてとして機能し得るため、限定されない場合がある。エレクトロポレーションコンポーネントは、所望の組織において定電流を生み出すエネルギーのパルスを送達可能であり得、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置構成にある複数の電極を有する電極アレイを含み得、ここにおいて電極アセンブリは、エレクトロポレーションコンポーネントからエネルギーのパルスを受信し、電極を通してそれを所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中ニュートラルであり、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、そのインピーダンスをエレクトロポレーションコンポーネントに通信する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受信し得、エレクトロポレーションコンポーネントによって送達されたエネルギーのパルスを調整して定電流を維持することができる。
複数の電極が、分散型パターンでエネルギーのパルスを送達してもよい。複数の電極は、プログラムされたシーケンスのもとで電極の制御により分散型パターンでエネルギーのパルスを送達してもよく、プログラムされたシーケンスは、ユーザーによってエレクトロポレーションコンポーネントに入力される。プログラムされたシーケンスは、シーケンスで送達される複数のパルスを含み得、この複数のパルスの各パルスは、少なくとも２つの能動電極によって送達され、それとともに１つのニュートラル電極がインピーダンスを測定し、この複数のパルスのうちの後続するパルスは、少なくとも２つの能動電極のうちの異なる１つによって送達され、それとともに１つのニュートラル電極がインピーダンスを測定する。
フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれによって行われてもよい。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行われてもよい。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓ毎に生じるが、リアルタイムフィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定するために利用可能な技法によって決定したときに実質的に瞬時）であることが好ましい。ニュートラル電極は、所望の組織におけるインピーダンスを測定し得、このインピーダンスをフィードバック機構に通信し、フィードバック機構は、インピーダンスに応答し、エネルギーのパルスを調整して定電流を事前設定電流と同様の値に維持する。フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達中、定電流を継続的かつ瞬時に維持し得る。
本発明の組成物の送達を促進し得るエレクトロポレーションデバイス及びエレクトロポレーション方法の例としては、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されるものが挙げられ、同文献の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。本組成物の送達を促進するのに使用され得る他のエレクトロポレーションデバイス及びエレクトロポレーション方法には、２００７年１０月１７日に出願された同時係属中、譲受人共通の米国特許出願第１１／８７４０７２号によって提供されるものが含まれ、この特許出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第第６０／８５２，１４９号、及び２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号に対する利益を主張するものであり、同文献のすべては参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物における選択組織の細胞中への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極系及びそれらの使用について記載している。このモジュラー電極系は、複数の針電極と、皮下針と、プログラマブル定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電性リンクを提供する電気コネクタと、電源とを含み得る。操作者は、支持構造上に取り付けられた複数の針電極を把持し、それらを身体または植物における選択組織内にしっかりと挿入することができる。次いで、生体分子が皮下針を介して選択組織内に送達される。プログラマブル定電流パルスコントローラが作動され、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間にある細胞中への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は参照により本明細書に援用される。
Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物における選択組織の細胞中への生体分子の導入を有効に促進するために使用され得るエレクトロポレーションデバイスについて記載している。このエレクトロポレーションデバイスは、動作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される電気運動デバイス（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）（「ＥＫＤデバイス」）を含む。ＥＫＤデバイスは、パルスパラメータのユーザー制御及び入力に基づいて、アレイとなった電極間で一連のプログラマブル定電流パルスパターンを生み出し、電流波形データの記憶及び取得を可能にする。エレクトロポレーションデバイスはまた、針電極のアレイを有する交換式電極ディスク、注射針のための中央注射チャネル、及び着脱式ガイドディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容は参照により本明細書に援用される。
米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイ及び方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または臓器への深部浸透用にも適合され得る。電極アレイの構成に起因して、注射針（選定の生体分子を送達する）もまた標的臓器内に完全に挿入され、電極によって予め画成された領域において注射液が標的問題（ｔａｒｇｅｔ ｉｓｓｕｅ）に対して直角に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは長さ２０ｍｍ及び２１ゲージである。
追加的に、エレクトロポレーションデバイス及びその使用を組み込む一部の実施形態では、以下の特許に記載されるものであるエレクトロポレーションデバイスが企図される：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、及び２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号。さらに、２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号（様々なデバイスのうちのいずれかを使用したＤＮＡの送達に関する）、及び２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号（ＤＮＡの注射方法を対象とする）に提供される発明の主題を扱う特許が本明細書で企図される。上記の特許は参照によりそれらの全体が援用される。
１０．治療方法
また、対象において合成抗体を産出させることによって、疾患の治療、それに対する保護、及び／または予防を必要とする対象において疾患を治療する、それに対して保護する、及び／または予防する方法も本明細書に提供される。本方法は、本組成物を対象に投与することを含み得る。本組成物の対象への投与は、上述の送達方法を使用して行うことができる。
ある特定の実施形態では、本発明は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属菌感染症を治療する、それに対して保護する、及び／または予防する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ライム病を治療する、それに対して保護する、及び／または予防する。
対象において合成抗体が産出されると、本合成抗体は、抗原に結合または反応することができる。かかる結合は、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識を遮断し、抗原に対する免疫応答を誘発または誘導し、それによって対象において該抗原に関連する疾患を治療する、それに対して保護する、及び／または予防することができる。
本組成物の用量は、活性構成成分１μｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／回であり得、また構成成分２０μｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／回であり得る。本組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与され得る。有効な治療を達成するための組成物の用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回であり得る。
１１．抗生物質との併用
本発明はまた、本合成抗体及び治療的抗生物質製剤の組み合わせを投与することによって、疾患の治療、それに対する保護、及び／または予防を必要とする対象において疾患を治療する、それに対して保護する、及び／または予防する方法も提供する。
本合成抗体及び抗生物質製剤は、本合成抗体及び抗生物質製剤の組み合わせが両方とも対象に存在するような任意の好適な方法を使用して投与されてもよい。一実施形態では、本方法は、上記に詳述される方法のうちのいずれかによる本発明の合成抗体を含む第１の組成物の投与、及び本合成抗体の投与から１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、７日未満、８日未満、９日未満または１０日未満後の、抗生物質製剤を含む第２の組成物の投与を含み得る。一実施形態では、本方法は、上記に詳述される方法のうちのいずれかによる本発明の合成抗体を含む第１の組成物の投与、及び本合成抗体の投与から１日超、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、８日超、９日超、または１０日超後の、抗生物質製剤を含む第２の組成物の投与を含み得る。一実施形態では、本方法は、抗生物質製剤を含む第１の組成物の投与、及び抗生物質製剤の投与から１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、７日未満、８日未満、９日未満または１０日目未満後の、上記に詳述される方法のうちのいずれかによる本発明の合成抗体を含む第２の組成物の投与を含み得る。一実施形態では、本方法は、抗生物質製剤を含む第１の組成物の投与、及び抗生物質製剤の投与から１日超、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、８日超、９日超、または１０日超後の、上記に詳述される方法のうちのいずれかによる本発明の合成抗体を含む第２の組成物の投与を含み得る。一実施形態では、本方法は、上記に詳述される方法のうちのいずれかによる第１の組成物を含む本発明の合成抗体、及び同時に第２の組成物を含む抗生物質製剤の投与を含み得る。一実施形態では、本方法は、上記に詳述される方法のうちのいずれかによる第１の組成物を含む本発明の合成抗体、及び同時に第２の組成物を含む抗生物質製剤の投与を含み得る。一実施形態では、本方法は、本発明の合成抗体と抗生物質製剤とを含む単一の組成物の投与を含み得る。
本発明の合成抗体と併用され得る抗生物質の非限定的な例としては、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、アミカシン、トブラマイシン）、キノロン（例えば、シプロフロキサシン、レボフロキサシン）、セファロスポリン（例えば、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフピロム、セフトビプロール）、抗緑膿菌性ペニシリン、すなわちカルボキシペニシリン（例えば、カルベニシリン及びチカルシリン）及びウレイドペニシリン（例えば、メズロシリン、アズロシリン、及びピペラシリン）、カルバペネム（例えば、メロペネム、イミペネム、ドリペネム）、ポリミキシン（例えば、ポリミキシンＢ及びコリスチン）ならびにモノバクタム（例えば、アズトレオナム）が挙げられる。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例示される複数の態様を有する。
１２．インビトロ及びエクスビボでの合成抗体の産出
一実施形態では、本合成抗体は、インビトロまたはエクスビボで産出される。例えば、一実施形態では、合成抗体をコードする核酸が、インビトロまたはエクスビボ細胞において導入され、発現され得る。遺伝子の細胞中への導入方法及び発現方法は当該技術分野で知られている。発現ベクターの関連において、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳類、細菌、酵母、または昆虫細胞内に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞内に移入され得る。
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び同等物が含まれる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞の産生方法は当該技術分野で周知されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的とするポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、とりわけレトロウイルスベクターは、哺乳類、例えば、ヒト細胞への遺伝子の挿入に最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス、ならびに同等物に由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含めた脂質ベース系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例となるコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達系が利用される場合、例となる送達ビヒクルは、リポソームである。宿主細胞内への核酸の導入（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）のために脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は、脂質と会合させてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部にカプセル封入され、リポソームの脂質二重層内に散在させ、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方と会合している連結分子を介してリポソームに結合させ、リポソームに封入され、リポソームと複合され、脂質を含有する溶液中に分散させ、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁液として含有され、ミセルに含有またはそれと複合され、あるいは脂質と会合させ得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中のいずれの特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、二重層構造内に、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在し得る。それらはまた、単に溶液中に散在し、ことによるとサイズまたは形状が均一でない凝集体を形成してもよい。脂質は、天然に存在する脂質であってもまたは合成脂質であってもよい脂肪質の物質である。例えば、脂質には、細胞質に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物の部類、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドが含まれる。
本発明は、以下の実施例においてさらに例示される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示説明として提供されるにすぎないことを理解されたい。上述の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更及び修正を行って、それを種々の使用法及び条件に適合させることができる。故に、上述の説明から、本明細書に示され、記載されるものに加えて本発明の種々の修正形態が当業者には明らかとなろう。かかる修正形態もまた、添付の特許請求の範囲内に該当することを意図する。
実施例１
本明細書に提示される研究は、プラスミドＤＮＡの筋肉内エレクトロポレーションを介した機能性抗ジカ「ＤＮＡモノクローナル抗体」（ＤＭＡｂ）の産出を実証するものである。抗ジカモノクローナル抗体由来のコドン最適化可変領域ＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１定常ドメイン上に合成した。抗体をコードするプラスミドＤＮＡをＣ３Ｈマウスに送達した。この研究は、既存の生物学的療法の代替手段としてのＤＭＡｂを裏付ける。
ＺＩＫＶ−Ｅｎｖ（ＺＩＫＶ−Ｅ）タンパク質は、融合ループを有する５０５個のアミノ酸からなるタンパク質である（図１）。ＺＩＫＶ−Ｅタンパク質に対する抗体は、重鎖及び軽鎖を発現するＤＮＡモノクローナル抗体（ｄＭＡＢ）を介してインビボで発現される（図２）。ＺＩＫＶ−Ｅｎｖ特異的モノクローナル抗体、１Ｃ２Ａ６、１Ｄ４Ｇ７、２Ｂ７Ｄ７、３Ｆ１２Ｅ９、４Ｄ６Ｅ８、５Ｅ６Ｄ９、６Ｆ９Ｄ１、９Ｄ１０Ｆ４、８Ａ９Ｆ９、及び９Ｆ７Ｅ１は各々、インビトロでＺＩＫＶ−Ｅｎｖに結合する（図３〜４）。これらのモノクローナル抗体は、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の両方の間で様々な度合の配列相同性を示す（図５〜７）。１Ｄ４Ｇ７の大きなＶＨ ＣＤＲ３を明確に見ることができ、他のＣＤＲにおける及びフレームワーク領域におけるいくつかの他の折り畳みの差異も同様に明確に見ることができる。３Ｆ１２Ｅ９は、配列の相違にもかかわらず、依然として、全体的な配列及び立体構造において１Ｄ４Ｇ７に対するよりも１Ｃ２Ａ６、８Ｄ１０Ｆ４及び８Ａ９Ｆ９により近い。（図７）。１Ｄ４Ｇ７は、その大きなＣＤＲ３ループに起因してＶＨドメインとＶＬドメインとの間に間隙が欠如している。配列類似性は構造的類似性に転換されるため、全体的なＣＤＲ立体構造及び分子形状は、先に実証されたクラスタ化に従って保存されている。（図８）。１Ｃ２Ａ６は、ＣＤＲに遠位で、表面に露出した遊離ＣＹＳ残基を有する。関連する可能性のある別の差異がＶＨ ＦＲ２領域に存在する。この残基は、ＣＤＲ立体構造に直接関与しないが、局所的な残基パッキングには影響を及ぼす。２つの変化がＩＭＧＴ規定のＣＤＲ領域内に存在する。ＶＬ変化（Ｆ、Ｆ、Ｓ）は、ＶＬ−ＶＨ境界面に直接影響を及ぼす。（図９）。遊離ＣＹＳは、分子表面に露出した高度に修飾可能な化学基を残す。（図１０）。開発可能性指数（Ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）は、１Ｄ４Ｇ７について最も高く、これは複数の非極性残基を含有する長いＣＤＲ３ループに起因する可能性が非常に高い。しかしながら、過去の経験に基づいて、このことのみが論点であるようには思われない（図１１）。高い類似度に基づいて、１Ｃ２Ａ６、８Ｄ１０Ｆ４及び８Ａ９Ｆ９は、同じエピトープに同じ基本様式で結合する可能性が高い。これら３つの配列間の小さな差異には、１Ｃ２Ａ６における露出した遊離ＣＹＳ残基、及び８Ｄ１０Ｆ４のＶＨ−ＶＬ境界面における予測されるパイ相互作用の数の減少が含まれる。３Ｆ１２Ｅ９は、ＣＤＲ領域において１Ｃ２Ａ６、８Ｄ１０Ｆ４及び８Ａ９Ｆ９に対して類似性を有するが、同時にいくつかの重要な差異も有する。ｍＡｂ １Ｄ４Ｇ７は、上記で言及した他のｍＡｂとは異なる様式で、または全く異なるエピトープに結合する可能性が高い。
実施例２
ジカワクチンアプローチ
図１３に示されるように、図中に示される骨格を有するジカ抗原発現構築物を産出した。発現カセットをＣＭＶプロモーターの後ろに、後端のポリアデニル化尾部とともに挿入した。カセットは、ｐｒＭＥ、ＮＳ１、及びカプシドを含む、図１４に示される抗原のコーディング配列を含むことができる。
ジカｐｒＭＥの系統発生解析及びワクチン設計
図１６及び１７に示されるように系統発生解析を行った。星印はコンセンサスｐｒＭＥ配列、配列番号３の位置を示す。このコンセンサスｐｒＭＥは、図１８のそれに従って発現ベクターにおけるクローニング部位に挿入されて示される。
発現されたタンパク質を図２０Ａ及び２０Ｂに示されるようにウェスタンブロット分析によって特徴付けた。これにより抗フラビウイルス抗体への特異的結合が示される。
次いでタンパク質を、図２１Ａ及び２１Ｂに示されるように精製した。
マウス免疫誘導
動物−Ｂａｌｂ／Ｃマウス（８匹からなる群）
プラスミド−ジカ−ｐｒＭＥ（配列番号２を含むコーディング配列）
デバイス−３Ｐエレクトロポレーションデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）
免疫誘導スケジュール：
マウスをＤＮＡで０日目に１回（初回）、ならびに１４日目及び２８日目に追加免疫して、総計３回免疫誘導した。ＤＮＡでの３回目の免疫誘導から１週間後、免疫分析を行った。
注射方法−筋肉内
採血スケジュール−事前採血ならびに１４、２８及び３５日目
採血方法−眼窩後方
群及び動物−１０匹の動物／群×３つの群＝３０
（１）ｐＶａｘ１
（２）ｐＶａｘ−１ジカｐｒｅＭＥ（配列番号２）
ジカｐｒＭＥワクチンによって誘発される細胞性免疫応答
スパイク特異的ＣＤ８ Ｔリンパ球応答を、ｐｒＭＥ抗原を網羅するペプチドプールに対するＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した。図２２及び２３を参照されたい。各群における平均応答は、３回目の免疫誘導から１週間後である。エラーバーは標準誤差を示す。ｐＶａｘ対照に対する応答が示される。
マウスにおける抗体の誘導
マウスのジカｐｒＭＥワクチン接種は、ジカ−エンベロープ抗原に反応する陽性抗体応答を誘発した。図２４及び２５を参照されたい。
組換えタンパク質Ｅ抗原への結合に基づいて、ジカｐｒＭＥワクチンはマウスにおいて免疫原性であることが見出された。ウェスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡによって、免疫誘導動物において血清転換が観察された。
実施例３
ジカウイルスの膜前駆体＋エンベロープタンパク質を標的とする、新規の合成ＤＮＡコンセンサスに基づくワクチンが本明細書に記載される。構築物発現を確認後、マウス及び非ヒト霊長動物を、エレクトロポレーションを介して免疫誘導した。これによりワクチン接種動物において中和活性を有する細胞性免疫及び体液性免疫の両方の誘導が示される。ＩＦＮ−α／β Ｒ−／−マウスにおいて、単回注射または２回注射による免疫誘導はいずれも、この致死的攻撃モデルにおいて体重減少または死亡に対して１００％保護作用があった。これはヒト治験用に承認された最初のジカウイルスワクチンに相当する。
これより材料及び方法について記載する。
細胞、ウイルス、及び動物
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＲＬ−Ｎ２６８、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）及びＶｅｒｏ ＣＣＬ−８１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持し、コンフルエンスに達すると継代した。神経細胞性腫瘍細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１１）及びＵ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１４）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ−ｃｅｌｌｇｒｏ）中で維持し、コンフルエンスに達すると継代した。ジカウイルス株ＭＲ７６６（Ｄｒ．Ｓｕｓａｎ Ｗｅｉｓｓからの好意による寄贈）及びＰＲ２０９（Ｂｉｏｑｕａｌ，ＭＤ）の両方をＶｅｒｏ細胞において増幅し、ストックをＶｅｒｏ細胞における標準的なプラークアッセイによって力価測定した。
Ｃ５７／ＢＬ６及びＩＦＮＡＲ−／−マウス及びアカゲザルの処置はケタミン麻酔下で実施した。動物は、管理された湿度、温度、及び光（１２時間の明／１２時間の暗周期）の条件下、隣り合った個々の霊長動物ケージに収容して社会的相互作用を許容した。食物及び水を自由に摂取させた。動物を１日２回監視し、市販のサル用の餌、おやつ、及び果物を１日２回給餌した。
ＤＮＡワクチン構築物及び合成
ジカ−ｐｒＭ＋ＥｎｖプラスミドＤＮＡ構築物は、完全長の膜前駆体（ｐｒＭ）及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする。コンセンサス戦略を使用した。このコンセンサス配列は、現在のジカｐｒＭ＋Ｅタンパク質配列のアライメントによって決定した。ヒトにおいて強化された発現を得るためにワクチン挿入物を遺伝子的に最適化（すなわちコドン及びＲＮＡ最適化）し、発現を促進するためにＩｇＥリーダー配列を付加した。構築物を商業的に合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ）、次いで、以前に記載されたようにサイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下で修飾ｐＶａｘ１発現ベクターにサブクローニングした（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。最終構築物はＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンと名付けられ、対照プラスミド骨格はｐＶａｘ１である。加えて、ＭＲ７６６及び２０１６年ブラジリン（Ｂｒａｚｉｌｉｎ）大流行株からのｐｒＭ及びＥｎｖ遺伝子をコードするいくつかの他の一致したＤＮＡ構築物もまた、さらなる評価のために設計した。ＤＮＡ構築物の大規模な増幅をＩｎｏｖｉｏ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）によって実施し、精製プラスミドＤＮＡを免疫誘導用に水中で製剤化した。アガロースゲル電気泳動を介してＤＮＡ挿入物のサイズを確認した。系統発生解析を、ＭＥＧＡ第５版ソフトウェアを使用してＣｌｕｓｔａｌＷによるマルチプルアライメントによって行った（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。
ＤＮＡ免疫誘導及びエレクトロポレーション
マウス免疫原性研究：雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）及びＩＦＮＡＲ−／−マウス（５〜７週齢）を、総体積２０または３０μｌの水中２５μｇのＤＮＡを前脛骨筋中に送達することにより免疫誘導し（ｎ＝４）、加えてインビボエレクトロポレーション送達を行った。インビボエレクトロポレーションは、免疫誘導の直後、同じ部位にＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応定電流エレクトロポレーションデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＰＡ）により送達した。三つ又のＣＥＬＬＥＣＴＲＡ低侵襲デバイスを筋肉内に約２ｍｍ挿入した。方形波パルスを、２６ゲージの固体ステンレス鋼電極からなる三角３電極アレイを介して送達し、０．１Ａｍｐの定電流パルスを２回、５２マイクロ秒／パルスで１秒遅延間隔で送達した。エレクトロポレーションの使用に関するさらなるプロトコルは以前に詳述された１７。マウスを２週間間隔で３回免疫誘導し、最終免疫誘導から１週間後に屠殺した。各免疫誘導後、血液を細胞性及び体液性免疫応答の分析のために採集した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。アカゲザル免疫原性研究：５匹のアカゲザルを、２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで、２つの部位に４週間間隔で２回皮内投与することにより免疫誘導した。エレクトロポレーションを、マウス免疫誘導に関して記載した同じデバイスを使用して即座に送達した。
ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおける攻撃研究
ＩＦＮＡＲ−／−マウスを３つの群に分割した。第１の群のマウスを１回免疫誘導し、免疫誘導から２週間後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ ＰＲ２０９で攻撃した。第２の群のマウスを２週間間隔で２回免疫誘導し、２回目の免疫誘導から１週間後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ ＰＲ２０９で攻撃した。第３の群のマウスを２週間間隔で２回免疫誘導し、２回目の免疫誘導から１週間後に２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ ＰＲ２０９で攻撃した。攻撃後、動物を秤量し、皮下に位置決めした温度チップによって体温を毎日測定した。加えて、それらを疾患の臨床的徴候について１日２回観察した（運動性低下、円背姿勢、後肢における指背歩行（部分麻痺）、片方の後肢または両方の後肢の麻痺）。福祉的根拠による安楽死の基準は、２０％の体重減少または何らかの異常な臨床的徴候の所見からなっていた。
ウェスタンブロット及び免疫蛍光測定法
インビトロ発現研究のために、製造業者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従って、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ試薬を使用してトランスフェクションを行った。簡潔に述べると、細胞を３５ｍｍディッシュ中で５０％コンフルエンスまで増殖させ、１ｕｇのジカｐｒＭＥワクチンでトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションから２日後に採取し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で溶解させた。以前に記載されたように、ウェスタンブロットを使用して、採取した細胞溶解物からのジカｐｒｅＭ＋Ｅｎｖタンパク質の発現の有効性を確認した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。
ウェスタンブロット分析を使用してマウス及びアカゲザル免疫血清の特異性を確認した。３〜１２％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、５μｇまたは１ｕｇのＺＩＫＶ Ｅｎｖ組換えタンパク質及びＯｄｙｓｓｅｙタンパク質分子量マーカー（製品番号９２８−４００００）をロードした。ゲル泳動をＭＯＰＳ緩衝液中、２００Ｖで５０分間実行した。ｉＢｌｏｔ２ゲル転写デバイス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してタンパク質をニトロセルロース膜上に転写した。膜をＰＢＳ Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、室温で１時間ブロッキングした。ワクチン発現を検出するために抗フラビウイルス群抗原（ＭＡＢ１０２１６−クローンＤ１−４Ｇ２−４−１５）抗体を１：５００希釈し、マウス及びアカゲザル由来の免疫血清を、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中で１：５０希釈し、膜とともに４℃で一晩インキュベートした。膜をＰＢＳＴで洗浄し、次いで適切な二次抗体［マウス血清及びフラビウイルス抗体に対してはヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＣＷ（ＬＩＣＯＲ）、アカゲザル血清に対してはヤギ抗ヒトＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩＣＯＲ）］とともに、マウス血清の場合は１：１５，０００希釈率で、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像装置（ＬＩ−ＣＯＲ）で撮像した。
免疫蛍光測定法に関しては、ＨｅＬａまたはＶｅｒｏ細胞をカバーガラス上で増殖させ、５μｇのジカｐｒｅＭ＋Ｅｎｖワクチンでトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定した。次いで、非特異的結合をＰＢＳ中で希釈した正常ヤギ血清で、室温で１時間ブロッキングした。次いでスライドをＰＢＳ中で５分間洗浄し、その後、１：１００希釈率での免疫誘導マウスまたはアカゲザル由来の血清とともに４℃で一晩インキュベートした。上述のようにスライドを洗浄し、１：２００希釈率での適切な二次抗体［マウス血清に対してはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８（Ｓｉｇｍａ）、アカゲザル血清に対してはヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８］とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＤＡＰＩを含むＦｌｏｕｒｏｓｈｉｅｌｄ封入媒体（Ａｂｃａｍ）を添加して、すべての細胞の核を染色した。その後、カバーガラスを封入し、スライドを顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）下で観察した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。追加的に、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、またはＵ８７−ＭＢ細胞を４チャンバの組織培養物で処理したガラススライド（Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５４１１４）上で増殖させ、０．０１のＭＯＩでのＭＲ７６６ＺＶで４〜６日間感染させ、次いで記載されるように染色した。
脾細胞及びＰＢＭＣ単離
すべてのマウスから脾細胞の単細胞懸濁液を調製した。簡潔に述べると、マウスからの脾臓を、１０％ＦＢＳを補充した５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｒ１０）中に個々に採集し、次いでＳｔｏｍａｃｈｅｒ８０パドル式ブレンダー（Ａ．Ｊ．Ｓｅｗａｒｄ ａｎｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で３０秒間、高速で処理した。処理した脾臓試料を４５ｍｍナイロンフィルタに通して濾過し、次いで、１５００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離した。細胞ペレットを５ｍｌのＡＣＫ（塩化アンモニウム−カリウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ−ｃｈｌｏｒｉｄｅ−ｐｏｔａｓｓｉｕｍ））溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に室温で５分間懸濁させ、次いでＰＢＳを添加して反応を停止させた。試料を再び１５００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離した。細胞ペレットをＲ１０中に１×１０７細胞／ｍｌの濃度で懸濁させ、次いで４５ｍｍナイロンフィルタに通した後、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及びフローサイトメトリー分析に使用した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。アカゲザルの場合、血液（各時点で２０ｍｌ）をＥＤＴＡ管中に採集し、Ａｃｃｕｓｐｉｎ管（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ手順を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
簡潔に述べると、９６ウェルのＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を抗マウスＩＦＮ−γ捕捉Ａｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡで２時間ブロッキングした。ｐＺＶ−ｐｒＭ＋Ｅｎｖ免疫誘導マウスからの２０万個の脾細胞を各ウェルに加え、培地のみ（陰性対照）、ＰＭＡ／イオノマイシンを含む培地（陽性対照）、または９個のアミノ酸だけ重複する１５量体からなり、ジカエンベロープタンパク質（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の長さに及ぶペプチドプール（１μｇ／ｍｌ）を含む培地の存在下で、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、細胞を洗浄し、次いでビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ Ａｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、次いで室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスファートｐ−トルイジン塩及びニトロブルーテトラゾリウムクロリド（色原体発色試薬、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。最後に、プレートを蒸留水ですすぎ、室温で乾燥させ、スポット形成単位を自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダー（ＣＴＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によって定量し、生の値を脾細胞１００万個当たりＳＦＵに正規化した。アカゲザル試料の場合、サルＩＦＮ−γ用ＥＬＩＳＰＯＴＰＲＯキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を製造業者によって説明されるように使用し、２０万個のＰＢＭＣをペプチドプールで刺激し、プレートを洗浄し、スポットを以前に記載されたように呈色させ、計数した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２、Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１２０１１，ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ５：ｅ９２８）。
体液性免疫応答：抗体結合ＥＬＩＳＡ
以前に記載されたように、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、マウス及びアカゲザル血清の力価を決定した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。簡潔に述べると、１μｇ／ｍｌの精製ジカエンベロープタンパク質を使用して、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ中１０％ＦＢＳで少なくとも１時間ブロッキングした後、プレートを０．０５％ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。免疫誘導マウス及びアカゲザル由来の血清試料を１％ＦＢＳ、０．２％ＰＢＳＴ中で段階希釈し、プレートに添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。プレートを再び０．０５％ＰＢＳＴ中で４回洗浄し、次いで、マウス血清の場合は１：３５０００希釈率のＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）とともに、室温で１時間インキュベートした。アカゲザル血清の場合、抗サルＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１：５０００希釈率で、室温で１時間使用した。結合した酵素は、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）錠剤を製造業者の説明書（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って添加することにより検出した。１５分後、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止させた。次いでプレートを４５０ｎｍの光学密度で読み取った。すべてのマウス血清及びアカゲザル血清試料は二連でアッセイした。終末点力価は、Ｆｒｅｙら（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２２１：３５−４１）によって記載される方法を使用して決定した。
中和（ＰＲＮＴ５０）アッセイ
ＭＲ７６６及びＶｅｒｏ細胞に関わるプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）については以前に記載された（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ１９３：１６５８−６５）。簡潔に述べると、マウスまたはアカゲザル血清を無血清ＤＭＥＭ中で段階希釈し（１：１０〜１：１２８０）、等体積のＭＲ７６６ジカウイルス（１００ｐｆｕ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。混合物をＶｅｒｏ細胞のコンフルエントな層に添加し、吸着させるために３７℃で２時間放置した。２×ＤＭＥＭ培地：軟寒天（１：１）重層を細胞の上に加え、プレートを３７℃で５日間インキュベートした。寒天重層をウェルから除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１×ＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット溶液で染色し、１×ＰＢＳで洗浄し、プレートを放置して乾燥させた。アッセイにおいて２４ウェルプレートで形成したプラークを手動で計数した。アッセイにおいて９６ウェルプレートで形成したプラークを自動免疫スポットリーダー（ＣＴＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）で走査し、試料ウェル中のプラークならびに陰性対照（ＤＭＥＭのみ）及び陽性対照（１００ｐｆｕのＭＲ７６６ジカウイルスのみ）中のプラークを、ＥＬＩＳｐｏｔリーダーを備えた自動ソフトウェアを使用して計数した。プラーク減少パーセントは以下のように計算した：減少％＝１００×［１−（各希釈物のプラーク平均数／陽性対照ウェルにおけるプラーク平均数）］。ワクチン接種後応答ピークにおける実際の５０％ＰＲＮＴ力価の線形補間を容易にするために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、プラーク減少％対個々の血清希釈物各々の対数変換の非線形回帰分析を行った。中和率５０％での中央値及び四分位範囲を各中和標的全体について及びワクチン治療群別に計算した。幾何平均力価もまた計算した。力価は、プラーク数の５０％減少をもたらす最も高い希釈率の逆数を表す。
フローサイトメトリー及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ
脾細胞を９６ウェルプレート（２×１０６／ウェル）に加え、それをタンパク質輸送阻害剤カクテル（ブレフェルジンＡ及びモネンシン）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下、ジカｐｒｅＭ及びエンベローププールペプチドにより３７℃／５％ＣＯ２で５時間刺激した。細胞刺激カクテル（加えてタンパク質輸送阻害剤）（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、ブレフェルジンＡ及びモネンシン）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を陽性対照として、及びＲ１０培地を陰性対照として使用した。次いで、製造業者の説明書（ＢＤ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載されるように、すべての細胞を表面及び細胞内タンパク質について染色した。簡潔に述べると、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（０．１％アジ化ナトリウム及び１％ＦＣＳを含有するＰＢＳ）中で洗浄した後、蛍光色素（ｆｌｏｕｒｏｃｈｒｏｍｅ）標識抗体で表面染色を行った。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、固定し、製造業者のプロトコルに従ってＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｔｙｏｐｅｒｍ（商標）（ＢＤ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して透過処理し、続いて細胞内染色を行った。以下の抗体を表面染色に使用した：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１９（Ｖ４５０、クローン１Ｄ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））ＣＤ４（ＦＩＴＣ、クローンＲＭ４−５（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｃｙ７、クローン５３−６．７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、ＣＤ４４（ＢＶ７１１、クローンＩＭ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））。細胞内染色に関しては以下の抗体を使用した：ＩＦＮ−γ（ＡＰＣ、クローンＸＭＧ１．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ−α（ＰＥ、クローンＭＰ６−ＸＴ２２、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、クローン１４５−２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ−２（ＰｅＣｙ７、クローンＪＥＳ６−ＳＨ４、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。すべてのデータは、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。
統計分析
Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｐｒｉｓｍ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を統計分析に利用した。Ｌｏｇ１０変換を終末点結合ＥＬＩＳＡ力価及び全ウイルスＰＲＮＴ５０力価に適用した。
これより、これらの実験の結果について記載する。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサスＤＮＡワクチンの構築
ジカｐｒＭ（前駆体膜）及びＥ（エンベロープ）遺伝子（ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ）のコンセンサス配列を、ヒトにおいて感染症を引き起こした、１９５２年〜２０１５年に単離された種々のジカ由来のｐｒＭ及びＥ配列を使用して産出した（図２７Ａ）。ジカ−ｐｒＭＥコンセンサス配列に対して、高効率の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダーペプチド配列の付加を含めた追加の修飾及び最適化を行ってそのインビボ発現を改善した後、それをｐＶａｘ１ベクターにクローニングした（図２７Ｂ）。エンドヌクレアーゼ制限消化及び遺伝子配列決定を用いて、最終的なワクチンプラスミドの有効性を確認した（図２７Ｃ）。８４トランスフェクションから（ｐｏｓｔ８４ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）４８時間後、ワクチンとともにトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からウェスタン分析及び間接免疫蛍光測定法を行うことによって、プラスミドより生じたジカ−ｐｒＭＥタンパク質の発現を確認した（図２７Ｄ及び２７Ｅ）。
ジカ−ｐＭＥ ＤＮＡワクチンは、マウスにおいて抗原特異的Ｔ細胞または機能性体液性応答を誘導する
ジカ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンが細胞性免疫応答を誘導する能力を評価した。５匹のＣ５７／ＢＬ６マウスからなる群を対照プラスミド骨格（ｐＶａｘ１）またはジカ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンのいずれかで、２週間間隔で３回、筋肉内投与によって免疫誘導し、続いて、記載されるように（９２）送達部位にエレクトロポレーション（ＥＰ）を行った（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。動物をそれらの３回目の注射から１週間後に屠殺し、各動物から採取したバルク脾細胞を標準的な酵素結合免疫スポットアッセイにおいて、それらの脾細胞が、ジカ−Ｅｎｖを包含するペプチドプールへのエクスビボ曝露後にインターフェロン−γを分泌する能力について評価した。アッセイの結果、ジカ−ｐｒＭＥ免疫誘導マウスからの脾細胞が、複数のジカ−Ｅｎｖペプチドプールでの刺激後に明確な細胞性免疫応答を生み出したことが示される（図２８Ａ）。最も強力な細胞性応答（複数可）を誘発したジカ−Ｅｎｖの領域（複数可）をマッピング分析ＥＬＩＳｐｏｔによって、全ジカ−ｐｒＭＥタンパク質に及ぶ１５量体からなる（１１個のアミノ酸だけ重複する）２２個のペプチドプールを使用してマトリックス形式で評価した。図２８Ｂに見られるように、いくつかのプールが亢進したＴ細胞応答を誘導したが、ペプチドプール１５が、１０６応答当たり最も高いＳＦＵを誘導した。マッピングデータにより、それらの配列について１つの優勢なｐｒＭＥエピトープ「ＩＲＣＩＧＶＳＮＲＤＦＶＥＧＭ」が明らかとなった。列挙した優勢なペプチドは、免疫エピトープデータベース解析リソースＩＤＥＰコンセンサスツールを使用することによって、１つのＨ２−Ｄｂ拘束性エピトープを含有することが確認され、この抗原の有効なプロセシングが示唆された。
ジカ−ｐｒＭＥワクチンの細胞性免疫原性のさらなる評価は、最終免疫誘導から１週間後に採集したＣＤ８＋ Ｔ細胞の多機能性特性の決定を伴った。その結果、ジカ−ｐｒＭＥワクチンが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）及びＩＦＮ−γを発現する二重機能性ワクチン特異的Ｔ細胞の割合を増加させたことが示される（図２８Ｃ）。重要なことに、ジカ−ｐｒＭＥワクチン接種は、Ｔ細胞の機能性を拡大する強力な能力を呈した。比較研究のために、最近同定されたブラジルジカ株または最初のＭＲ７６６ジカ株のいずれかのｐｒＭＥ配列をコードするプラスミド１１５を用いて、さらなるワクチン研究を行った。３回目の注射から１週間後、いずれかのプラスミドで免疫誘導したマウスにおける細胞性免疫応答の誘導を、図２８Ａで使用したのと同じジカ−ｐｒｅＭＥペプチドプールで脾細胞を刺激した後にＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。その結果、新規のコンセンサスジカ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチン構築物によって誘導されたＴ細胞応答及び抗体応答が、これらの２つの非コンセンサスプラスミドワクチンのいずれかによって産出されたものよりも少なくとも２倍高かったことが示される（図２９Ａ及び２９Ｂ）。ブラジルまたはＭＲ７６６いずれかのｐｒＭＥワクチンによって誘導された細胞性応答の詳細なマッピング分析により、両者がまた、コンセンサスジカ−ｐｒＭＥプラスミドについて図２８Ｂに特定される優勢なＥｎｖ特異的ＣＴＬエピトープに対してそれらの最も顕著な細胞性応答を誘導したことが明らかとなった（データは図示せず）。全体的に、コンセンサス免疫原はこれらのアッセイにおいて一貫してより強固であるように思われ、これをさらに研究した。
コンセンサスジカ−ｐｒＭＥワクチンがマウスにおいて体液性免疫応答を誘導する能力を評価した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスの群を２５μｇの空の対照プラスミドまたはコンセンサスジカｐｒＭＥワクチンプラスミドのいずれかで、２週間間隔で３回、筋肉内注射によって免疫誘導し、続いてエレクトロポレーションを行った。０日目（１回目の免疫誘導前）、１４日目（１回目の免疫誘導から２週間後）、２１日目（２回目の免疫誘導から１週間後）及び３５日目（３回目の免疫誘導から１週間後）に、各々注射したマウスから血清を得た。採集した各血清をＥＬＩＳＡによって、固定化したｒジカ−Ｅｎｖを捕捉抗原として使用してジカ特異的ＩｇＧ応答について試験した。２１日目に抗ジカ特異的ＩｇＧの顕著な増加が観察され、３５日目の血清において血清中ＩｇＧレベルのさらなる増強が見られた（図３０Ａ）。ワクチン接種動物由来の（１３８）６０日目の血清では、３５日目の血清において見られた高い抗体応答が最終追加免疫後に長期間維持されたことが示される。最も重要なことには、ワクチン接種マウス由来の血清は、終末点力価によって示されるように非常に高レベルの抗体を含有した（図３０Ｂ）。３５日目のプール血清を、ウェスタン分析によってｒジカ−Ｅを検出する（図３０Ｃ）及び免疫蛍光測定法によってジカ感染細胞を染色する（図３０Ｄ）能力についてスクリーニングすることによって、ワクチン誘導性抗体の特異性の追加的評価を行った。これらの分析の両方からの結果として特異性が確認された。
さらに、上述のブラジル株及びＭＲ７６６株からのｐｒＭＥ配列をコードするプラスミドで免疫誘導したマウスにおけるジカ特異的結合抗体応答もまた評価した。疑似免疫誘導またはワクチン免疫誘導マウス由来の３５日目の血清を、ＥＬＩＳＡにおいてｒジカ−Ｅへの結合について分析した。この分析により、両方のプラスミドが顕著な抗体結合を誘導したこと（図２９Ｃ及び２９Ｄ）、及びコンセンサスジカ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンでの免疫誘導が異種ジカエンベロープへの増加した親和性を伴って良好な体液性応答を産出することが示される。
ＤＶ、ＷＮＶ及び他のフラビウイルス１５の分析に関して以前に記載された技法から適合された方法を使用して、空ｐＶａｘ１、コンセンサスジカ−ｐｒＭＥプラスミドワクチン、またはコンセンサスジカ−カプシドプラスミドワクチンのいずれかで３回免疫誘導したマウス由来の３５日目のプール血清に対して、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイを行った。図３０Ｅに示されるように、３回目のワクチン接種後の抗ジカ逆数ＰＲＮＴ５０希釈力価は、ジカ−ｐｒＭＥワクチンを受けた（１６０）マウスにおいて、ジカ−カプシドＤＮＡワクチンまたは対照ＤＮＡ ｐＶａｘ１を受けたマウスにおけるよりも顕著に高かった。この実験で使用したジカ−ｐｒＭＥワクチンによって誘導される中和抗体のＰＲＮＴ５０力価＝４５６であった。１：１００血清希釈率についてのウイルスプラークの代表的な写真が一番下に示される。
非ヒト霊長動物においてジカ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンによって誘発される細胞性及び体液性応答
ＮＨＰを、皮内（ＩＤ）免疫誘導、続いてエレクトロポレーションによって（この方法がＤＮＡワクチンによる抗原特異的体液性免疫応答を強化し得ることを示す以前の研究に基づいて）免疫誘導した。アカゲザル（ＲＭ、ｎ＝５／群）に２．０ｍｇのワクチンプラスミドを、エレクトロポレーションを用いて皮内投与し、０日目（１回目の免疫誘導前の免疫誘導前）、２週目（１回目の免疫誘導の２週間後）、６週目（２回目の免疫誘導の２週間後）に血清及びＰＢＭＣをアカゲザルから採集した。ワクチン誘導性細胞性免疫応答を測定するために、図２８Ａで使用したジカ−Ｅペプチドプールでエクスビボ刺激した６週目のＰＢＭＣに対してＥＬＩＳｐｏｔ分析を行った。その結果、ジカｐｒＭＥ免疫誘導がすべてのアカゲザルにおいて抗ジカＴ細胞応答を増強し、免疫前血清応答と比較してそれらの抗原認識の範囲を広げたことが示される（図３１Ａ）。
皮内＋エレクトロポレーションワクチン接種アカゲザル由来の血清１８１中の特異的抗ジカウイルス抗体応答をＥＬＩＳＡによって評価した。初回ワクチン接種後、１回目の免疫誘導から２週間後のアカゲザルにおいてジカ−Ｅｎｖ特異的結合抗体が検出可能であり、これは後続の免疫誘導によりさらに増強された（図３１Ｂ）。終末点力価を研究するために同じ免疫誘導後時点からのワクチン接種アカゲザル由来の血清を希釈し、ジカ−Ｅｎｖを再びアッセイした（図３１Ｃ）。ＥＬＩＳＡ結果を、ワクチン接種群由来のアカゲザルのプール血清を使用してウェスタン分析によって確認した（図３１Ｄ）。さらに、免疫誘導したアカゲザル由来の血清はまた、免疫蛍光測定法においてジカ−ＭＲ７６６感染Ｖｅｒｏ細胞を認識可能であった（図３１Ｅ）。次に、ジカ免疫誘導アカゲザル由来の血清中の中和抗体（ｎＡｂ）応答を検出することを試みた。ＰＲＮＴ５０（対照ジカ感染症の５０％が阻害された血清希釈率の逆数）を使用してＮＡｂ活性を試験し、個々の免疫誘導動物各々に対して行った。このアッセイの検出限界であった、抗体価＜１０を有する試料を動物の各群に割り付けた。興味深いことに、ジカ−ｐｒＭＥ免疫誘導サルの力価は１６１〜１３８０の範囲（平均５０１±２２４）であった（図３２Ａ）。
ＮＨＰ免疫血清が、ジカに感染させた重要な神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）及び神経前駆細胞（Ｕ−８７ＭＧ）において感染を遮断する能力。対照またはワクチン血清を有し、２４時間時点で感染について分析した、ＭＲ７６６またはＰＲ２０９での細胞株。ワクチン接種アカゲザル由来の血清は、感染後の両細胞株においてそれぞれのウイルスを阻害した（多重感染度１．０）（図２１Ｂ及び２１Ｃ）。これらのデータは、ジカ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチン接種アカゲザル由来の血清がジカ感染症を阻害する有効性を裏付ける。
ジカｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンで免疫誘導した、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮＡＲ）の受容体が欠如したマウスにおけるジカ特異的機能性免疫応答及びジカウイルスに対する保護
ジカ誘導性疾患及び免疫の機構は十分に明確化されておらず、ジカ感染症に対する免疫応答の保護作用対仮説上の病原性は未だに不明確である。ほとんどのマウス株はジカ感染症に耐性であるが、ＩＦＮ−α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）が欠如したマウスは、ほとんどが攻撃（１６）から６〜７日以内に死亡し、感染及び疾患に感受性があることが見出された。コンセンサスジカ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンがこのマウス株において細胞性及び体液性免疫応答を誘導する能力を調査した。ＩＦＮＡＲマウスの群を、空の対照プラスミドでまたはコンセンサスジカ−ｐｒＭＥプラスミドでエレクトロポレーションを用いて２週間間隔で３回、免疫誘導した。０、１４、２１、及び３５日目に血清を免疫誘導マウスから採集し、最終免疫誘導から１週間後に脾細胞をマウスから採取した。ワクチン免疫誘導ＩＦＮＡＲマウスからの脾細胞は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて１０６細胞当たりのＳＦＵのレベルによって示されるように、明確な細胞性免疫応答を生み出した（図３３Ａ）。ｒジカ−Ｅｎｖを捕捉抗原として使用したＥＬＩＳＡからの結果、動物が１４日目までに検出可能な抗ジカ血清ＩｇＧを有したことが示され、これらのレベルは後続の採集時点で増強された（図３３Ｂ）。ワクチン接種マウス由来の血清は、終末点力価によって示されるように顕著なレベルの抗体を含有した（図３３Ｂ）。その結果、コンセンサスジカ−ｐｒＭＥワクチンで免疫誘導したＩＦＮＡＲマウスが、抗ジカ細胞性及び体液性免疫応答能があることが示され、このことはこの潜在的な攻撃モデルにおけるワクチン保護に関するさらなる研究を支持する。
探索的研究において、ＩＦＮＡＲマウスを、１×１０６ＰＦＵのＰＲ２０９単離株の皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｖ）、頭蓋内（ｉ．ｃ．）及び静脈内（ｉ．ｖ）投与で攻撃した。攻撃後、すべての動物を、日常の体重、体温測定値の記録、ならびに後肢衰弱及び麻痺などの瀕死状態の他の徴候を含めた臨床的徴候について監視した。接種後最初の２日間、マウスの全体的外観の変化は何ら観察されなかった。しかしながら、３日目より後、４つすべての感染経路において、活動性低下、運動性低下、円背姿勢が示され、これには後肢衰弱ならびに水分摂取及び明白な体重減少が伴った。攻撃部位を問わず、動物は６日目〜８日目に感染症により死亡し、この攻撃用量を後続の研究に利用した。
ワクチン接種動物の２つの群（１群当たり１０匹）またはｐＶａｘ１免疫誘導対照の２つの組に、０日目に１回及び１４日目に１回ワクチン接種し、２１日目に１×１０６ＰＦＵまたは２×１０６ＰＦＵのＰＲ２０９で攻撃した（図２３Ｂ及び２３Ｃ）。ワクチン接種動物の１００％が生存した一方で、１×１０６ＰＦＵ攻撃対照の３０％または２×１０６ＰＦＵ攻撃対照の１０％のみが生存した。次に、１つの動物の群を１回免疫誘導し、免疫誘導後１４日目にそれらを攻撃した。これらの動物の１００％が生存した一方で、対照動物の１０％が生存した。ジカ−ｐｒＭＥで１回ワクチン接種し、次いでジカウイルスで攻撃したすべてのマウスが致死的攻撃から保護された（図３４Ａ）。すべての攻撃において、ワクチン接種動物はまた疾患の症状を呈さず、体重減少から保護された（図３４Ｄ）。対照マウスのジカウイルスでの感染は、体重の著しい減少をもたらし、これにはしばしば運動性低下、円背姿勢、後肢における指背歩行及び／または両方の後肢の麻痺とともに顕著な死亡率が併発した（図２３Ｅ及び２３Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ＺＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンがマウスをジカ攻撃に対して保護する免疫応答を媒介したことを例示する。
本研究において、ＤＮＡに基づくワクチンとそれに加えたエレクトロポレーションから生み出される、ｐｒＭＥを抗原として使用する体液性及び細胞性応答が、齧歯動物及び非ヒト霊長動物において実証された。エレクトロポレーション送達アプローチによる最適化強化ＤＮＡワクチン技術は、強固で幅広い免疫応答を刺激するのに有効であり、単回免疫誘導がＩＦＮＡＲマウスにおいて疾患及び死亡に対して保護作用がある免疫を誘導した。この研究は、この深刻なエマージングウイルス感染症に対して柔軟で臨床的に迅速に実施可能なＤＮＡワクチン接種戦略を使用して、保護的免疫が産出され得るという概念を裏付ける。
実施例４
受動的抗体移入及びｐｒＭＥｎｖ ＤＮＡワクチンによる能動的免疫誘導を介したＺＩＫＶ感染症及び病理発生に対するインビボ保護
この研究では、ＺＩＫＶの膜前駆体＋エンベロープタンパク質（ｐｒＭＥｎｖ）を標的とする新規の合成ＤＮＡワクチンを産出し、インビボ有効性について評価する。プラスミド構築物の初期のインビトロ開発及び評価研究の後、マウス及び非ヒト霊長動物を、エレクトロポレーション媒介により強化されたＤＮＡ送達を介してこのｐｒＭＥｎｖ ＤＮＡに基づく免疫原で免疫誘導した。ワクチン接種動物は、抗原特異的細胞性及び体液性免疫ならびに中和活性を産出することが見出された。インターフェロン（ＩＦＮ）−α／βの受容体が欠如したマウス（ＩＦＮＡＲ−／−と表記される）において、このＤＮＡワクチンでの免疫誘導は、インビボウイルス攻撃の後、脳組織におけるウイルス病変を予防することに加えて、感染に関連する体重減少または死亡に対して１００％の保護を誘導した。加えて、非ヒト霊長動物抗ＺＩＫＶ免疫血清の受動的移入は、ＩＦＮＡＲ−／−マウスを後続のウイルス攻撃に対して保護した。病原性マウスモデルにおけるこのＺＩＫＶワクチンのこの初期研究は、ＺＩＫＶ感染症においてｐｒＭＥを標的とする免疫応答の重要性を裏付け、ヒトにおけるＺＩＫＶ対策のためにこのワクチンアプローチに関する追加の調査研究が関連性を有し得ることを示唆する。
これより材料及び方法について記載する。
細胞、ウイルス及び動物
ヒト胚腎臓２９３Ｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＲＬ−Ｎ２６８，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）及びＶｅｒｏ ＣＣＬ−８１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ−Ｑ３ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持し、コンフルエンスに達すると継代した。ＺＩＫＶウイルス株ＭＲ７６６（Ｄｒ Ｓｕｓａｎ Ｗｅｉｓｓからの好意による寄贈）及びＰＲ２０９（Ｂｉｏｑｕａｌ，ＭＤ）の両方をＶｅｒｏ細胞において増幅し、ストックをＶｅｒｏ細胞における標準的なプラークアッセイによって力価測定した。５〜６週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＩＦＮＡＲ−／−（ＭＭＲＲＣ貯蔵所−Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｗｉｓｔａｒ及びｔｈｅ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｇｅｎｃｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ ＩＡＣＵＣ（動物実験委員会）ガイドラインに準拠して、温度管理され光周期調整された施設に収容し、処置／ワクチン接種した。
アカゲザルをＢｉｏｑｕａｌ，ＭＤ，ＵＳＡにて収容し、処置／ワクチン接種した。この研究は、ＮＩＨ、ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ、及び米国農務省のＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに記載される勧告に厳格に準拠して実施された。すべての動物免疫誘導作業は、ｔｈｅ Ｂｉｏｑｕａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。Ｂｉｏｑｕａｌは、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅによって認定されている。すべての手順は、訓練された人員が獣医学スタッフの監督のもとケタミン麻酔下で実施し、「Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ ｒｅｐｏｒｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ」勧告に準拠して、動物の福祉を保護するとともに動物の苦痛を最小限に抑えるようあらゆる努力が払われた。動物は、管理された湿度、温度及び光（１２時間の明／１２時間の暗周期）の条件下、隣り合った個々の霊長動物ケージに収容して社会的相互作用を許容した。食物及び水を自由に摂取させた。訓練された人員が動物を１日２回監視し、市販のサル用の餌、おやつ及び果物を１日２回給餌した。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンの構築
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドＤＮＡ構築物は、完全長の膜前駆体（ｐｒＭ）とエンベロープ（Ｅ）をコードし、カプシドタンパク質を合成した。コンセンサス戦略を使用した。このコンセンサス配列は、現在のＺＩＫＶ ｐｒＭＥタンパク質配列のアライメントによって決定した。ヒトにおいて強化された発現を得るためにワクチン挿入物を遺伝子的に最適化（すなわち、コドン及びＲＮＡ最適化）し、発現を促進するためにＩｇＥリーダー配列を付加した。構築物を商業的に合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ，ＵＳＡ）、次いで、以前に記載されたようにサイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下で修飾ｐＶａｘ１発現ベクターにサブクローニングした（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。最終構築物はＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンと名付けられ、対照プラスミド骨格はｐＶａｘ１である。加えて、ＭＲ７６６（ＤＱ８５９０５９．１）及び２０１６年ブラジリン（Ｂｒａｚｉｌｉｎ）（ＡＭＡ１２０８４．１）大流行株からのｐｒＭ及びＥ遺伝子をコードするいくつかの他の一致したＤＮＡ構築物もまた、さらなる評価のために設計した。ＤＮＡ構築物の大規模な増幅をＩｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって実施し、精製プラスミドＤＮＡを免疫誘導用に水中で製剤化した。アガロースゲル電気泳動を介してＤＮＡ挿入物のサイズを確認した。系統発生解析を、ＭＥＧＡ第５版ソフトウェアを使用してＣｌｕｓｔａｌＷによるマルチプルアライメントによって行った（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。
ＤＮＡ免疫誘導及びエレクトロポレーション媒介による送達強化
雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）及びＩＦＮＡＲ−／−マウス（５〜６週齢）を、総体積２０または３０μｌの水中２５μｇのＤＮＡを前脛骨筋中に送達することにより免疫誘導し、加えてインビボエレクトロポレーション送達を行った。インビボエレクトロポレーションは、ＤＮＡ注射の直後、同じ部位にＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応定電流エレクトロポレーションデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）により送達した。三つ又のＣＥＬＬＥＣＴＲＡ低侵襲デバイスを筋肉内に約２ｍｍ挿入した。方形波パルスを、２６ゲージの固体ステンレス鋼電極からなる三角３電極アレイを介して送達し、０．１Ａｍｐの定電流パルスを２回、５２μｓ／パルスで１秒遅延間隔で送達した。エレクトロポレーションの使用に関するさらなるプロトコルは以前に詳述された（Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｒｅｐ５：１２６１６）。マウスを２週間間隔で３回免疫誘導し、最終免疫誘導から１週間後に殺処理した。各免疫誘導後、血液を細胞性及び体液性免疫応答の分析のために採集した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。アカゲザル免疫原性研究：５匹のアカゲザルを、２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで２つの部位に５週間間隔で２回皮内投与することにより免疫誘導した。エレクトロポレーションを、マウス免疫誘導に関して記載した同じデバイスを使用して即座に送達した。
ウェスタンブロット分析
インビトロ発現研究のために、製造業者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従って、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ試薬を使用してトランスフェクションを行った。簡潔に述べると、細胞を３５ｍｍディッシュ中で５０％コンフルエンスまで増殖させ、１μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンでトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に細胞を採集し、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で溶解させた。以前に記載されたように、ウェスタンブロットを使用して、採取した細胞溶解物からのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質の発現、ならびに抗フラビウイルスまたはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種マウス由来の免疫血清のいずれかの使用によるマウス及びアカゲザル血清の免疫特異性の有効性を確認した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。簡潔に述べると、３〜１２％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ−ｇｉｅｓ）に、５μｇまたは１μｇのＺＩＫＶエンベロープ組換えタンパク質（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）、トランスフェクトした細胞溶解物または上清及びＯｄｙｓｓｅｙタンパク質分子量マーカー（製品番号９２８−４００００）をロードした。ゲル泳動をＭＯＰＳ緩衝液中、２００Ｖで５０分間実行した。ｉＢｌｏｔ２ゲル転写デバイス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してタンパク質をニトロセルロース膜上に転写した。膜をＰＢＳ Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、室温で１時間ブロッキングした。ワクチン発現を検出するために、抗フラビウイルス群抗原（ＭＡＢ１０２１６−クローンＤ１−４Ｇ２−４−１５）抗体を１：５００希釈し、マウス及びアカゲザル由来の免疫血清を、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中で１：５０希釈し、膜とともに４℃で一晩インキュベートした。膜をＰＢＳＴで洗浄し、次いで、マウス血清及びフラビウイルス抗体に対しては（ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、アカゲザル血清に対してはヤギ抗ヒトＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の適切な二次抗体とともに、マウス血清の場合は１：１５，０００希釈率で、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像装置（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で撮像した。
免疫蛍光測定法
免疫蛍光測定法に関しては、細胞をカバーガラス上で増殖させ、５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンでトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。次いで、非特異的結合をＰＢＳ中で希釈した正常ヤギ血清で、室温で１時間ブロッキングした。次いでスライドをＰＢＳ中で５分間洗浄し、その後、１：１００希釈率での免疫誘導マウスまたはアカゲザル由来の血清とともに４℃で一晩インキュベートした。上述のようにスライドを洗浄し、１：２００希釈率での適切な二次抗体（マウス血清に対してはヤギ抗マウスＩｇＧＡＦ４８８、アカゲザル血清に対してはヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８（Ｓｉｇｍａ））とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＤＡＰＩを含むＦｌｏｕｒｏｓｈｉｅｌｄ封入媒体（Ａｂｃａｍ）を添加して、すべての細胞の核を染色した。その後、カバーガラスを封入し、スライドを顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）下で観察した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。加えて、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨまたはＵ８７−ＭＢ細胞を４チャンバの組織培養物で処理したガラススライド上で増殖させ、アカゲザル免疫血清（１：２００）とともに／なしでプレインキュベートしたＺＩＫＶ−ＭＲ７６６またはＰＲ２０９で、０．０１のＭＯＩで感染させ、ＺＩＫＶ感染後４日目に、記載されるように汎フラビウイルス（ｆｌａｖｉｒｕｓ）抗体を使用して染色した（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ９４：１３６２−９）。
組織病理学的分析
組織病理学に関して、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した脳組織を５μｍ厚の矢状断切片に切片化し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に定置し、３７℃で一晩バッキング処理（ｂａｃｋｅｄ）した。２回のキシレン交換を用いて切片を脱パラフィンし、１００％、９０％及び次いで７０％エタノールに浸漬することによって再水和した。切片を核構造についてＨａｒｒｉｓヘマトキシリン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）を使用して２分間染色し、続いて１％酸アルコール（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）中で分別し、Ｓｃｏｔｔ’ｓ Ｔａｐ Ｗａｔｅｒで２分間処理した。その後、切片を細胞質構造についてエオシン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）を使用して２分間対比染色した。スライドを７０％、９０％及び１００％エタノールで脱水し、キシレン中できれいにし、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して封入した。
脾細胞及びＰＢＭＣ単離
すべてのマウスから脾細胞の単細胞懸濁液を調製した。簡潔に述べると、マウスからの脾臓を、１０％ＦＢＳを補充した５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｒ１０）中に個々に採集し、次いでＳｔｏｍａｃｈｅｒ８０パドル式ブレンダー（Ａ．Ｊ．Ｓｅｗａｒｄ ａｎｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で３０秒間、高速で処理した。処理した脾臓試料を４５ｍｍナイロンフィルタに通して濾過し、次いで１，５００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離した。細胞ペレットを５ｍｌのＡＣＫ（塩化アンモニウム−カリウム）溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に室温で５分間懸濁させ、次いでＰＢＳを添加して反応を停止させた。試料を再び１，５００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離した。細胞ペレットをＲ１０中に懸濁させ、次いで４５ｍｍナイロンフィルタに通した後、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及びフローサイトメトリー分析に使用した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。アカゲザルの場合、血液（各時点で２０ｍｌ）をＥＤＴＡ管中に採集し、Ａｃｃｕｓｐｉｎ管（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）とともに標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ手順を用いてＰＢＭＣを単離した。血清単離のために各時点で５ミリリットルの血液もまた血清管中に採集した。
フローサイトメトリー及び細胞内サイトカイン染色アッセイ
脾細胞を９６ウェルプレート（２×１０６／ウェル）に加え、それをタンパク質輸送阻害剤カクテル（ブレフェルジンＡ及びモネンシン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））の存在下、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプールペプチドにより３７℃／５％ＣＯ２で５時間刺激した。細胞刺激カクテル（加えてタンパク質輸送阻害剤、ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）、イオノマイシン、ブレフェルジンＡ及びモネンシン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を陽性対照として、及びＲ１０培地を陰性対照として使用した。次いで、製造業者の説明書（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に記載されるように、すべての細胞を表面及び細胞内タンパク質について染色した。簡潔に述べると、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（０．１％アジ化ナトリウム及び１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中で洗浄した後、蛍光色素（ｆｌｏｕｒｏｃｈｒｏｍｅ）標識抗体で表面染色を行った。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、固定し、製造業者のプロトコルに従ってＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｔｙｏｐｅｒｍ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して透過処理し、続いて細胞内染色を行った。以下の抗体を表面染色に使用した：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１９（Ｖ４５０、クローン１Ｄ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））ＣＤ４（ＦＩＴＣ、クローンＲＭ４−５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｃｙ７、クローン５３−６．７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、ＣＤ４４（ＢＶ７１１、クローンＩＭ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））。細胞内染色に関しては以下の抗体を使用した：ＩＦＮ−γ（ＡＰＣ、クローンＸＭＧ１．２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））、ＴＮＦ−α（ＰＥ、クローンＭＰ６−ＸＴ２２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、クローン１４５−２Ｃ１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））、ＩＬ−２（ＰｅＣｙ７、クローンＪＥＳ６−ＳＨ４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））。すべてのデータは、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
簡潔に述べると、９６ウェルのＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を抗マウスＩＦＮ−γ捕捉Ａｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡで２時間ブロッキングした。免疫誘導マウスからの２０万個の脾細胞を各ウェルに加え、培地のみ（陰性対照）、ＰＭＡ／イオノマイシンを含む培地（陽性対照）または９個のアミノ酸だけ重複する１５量体からなり、ＺＩＫＶ ｐｒＭＥタンパク質（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の長さに及ぶペプチドプール（１μｇ／ｍｌ）を含む培地の存在下で、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、細胞を洗浄し、次いでビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ Ａｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、次いで室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスファートｐ−トルイジン塩及びニトロブルーテトラゾリウムクロリド（色原体発色試薬、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。最後に、プレートを蒸留水ですすぎ、室温で乾燥させ、ＳＦＵを自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダー（ＣＴＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によって定量し、生の値を脾細胞１００万個当たりＳＦＵに正規化した。アカゲザル試料の場合、サルＩＦＮ−γ用ＥＬＩＳＰＯＴＰＲＯキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を製造業者によって説明されるように使用し、２０万個のＰＢＭＣをペプチドプールで刺激し、プレートを洗浄し、スポットを以前に記載されたように呈色させ、計数した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。
体液性免疫応答：抗体結合ＥＬＩＳＡ
以前に記載されたように、ＥＬＩＳＡを使用して、マウス及びアカゲザル血清の力価を決定した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。簡潔に述べると、１μｇの精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質を使用して、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ中１０％ＦＢＳで少なくとも１時間ブロッキングした後、プレートを０．０５％ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。免疫誘導マウス及びアカゲザル由来の血清試料を１％ＦＢＳ中で段階希釈し、プレートに添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。プレートを再び０．０５％ＰＢＳＴ中で４回洗浄し、次いで、マウス血清の場合は１：３５，０００希釈率のＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）とともに、室温で１時間インキュベートした。アカゲザル血清の場合、抗サルＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１：５，０００希釈率で、室温で１時間使用した。結合した酵素は、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）基質溶液を製造業者の説明書（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って添加することにより検出した。１５分後、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止させた。４５０ｎｍでの光学密度をＳｙｎｅｒｇｙプレートリーダーで読み取った。すべてのマウス及びアカゲザル血清試料は二連でアッセイした。終末点力価は、以前に記載された方法を使用して決定した（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２１：３５−４１）。
中和（ＰＲＮＴ５０）アッセイ
ＭＲ７６６及びＶｅｒｏ細胞に関わるＰＲＮＴについては以前に記載された（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ１９３：１６５８−６５）。簡潔に述べると、熱失活したマウスまたはアカゲザル血清を無血清ＤＭＥＭ中で段階希釈し（１：１０〜１：１２８０）、等体積のＺＩＫＶ ＭＲ７６６（１００ＰＦＵ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。混合物をＶｅｒｏ細胞のコンフルエントな層に添加し、吸着させるために３７℃で２時間放置した。２×ＤＭＥＭ培地：軟寒天（１：１）重層を細胞の上に加え、プレートを３７℃で５日間インキュベートした。寒天重層を除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１×ＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット溶液で染色し、１×ＰＢＳで洗浄し、プレートを放置して乾燥させた。アッセイにおいて２４ウェルプレートで形成したプラークを自動免疫スポットリーダー（ＣＴＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）で走査し、試料ウェル中ならびに陰性対照（ＤＭＥＭのみ）及び陽性対照（１００ＰＦＵのＭＲ７６６ＺＩＫＶウイルスのみ）ウェル中のプラークを、ＥＬＩＳｐｏｔリーダーを備えた自動ソフトウェアを使用して計数した。プラーク減少パーセントは以下のように計算した：減少％＝１００×｛１−（各希釈物のプラーク平均数／陽性対照ウェルにおけるプラーク平均数）｝。ワクチン接種後応答ピークにおける実際の５０％ＰＲＮＴ力価の線形補間を容易にするために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、プラーク減少％対個々の血清希釈物各々の対数変換の非線形回帰分析を行った。中和率５０％での中央値及び四分位範囲を各中和標的全体について及びワクチン治療群別に計算した。幾何平均力価もまた計算した。力価は、プラーク数の５０％減少をもたらす最も高い希釈率の逆数を表す。
ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ攻撃研究
ジカ攻撃研究のために、ＩＦＮＡＲ−／−マウス（ｎ＝１０／群）をジカ−ｐｒＭＥワクチンまたはｐＶａｘ１で１回または２回免疫誘導した。マウスに１×１０６ＰＦＵまたは２×１０６ＰＦＵいずれかのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを、１５日目（単回免疫誘導群）または２回目の免疫誘導から１週間後の２１日目（２回免疫誘導群）に与えた。また、ＩＦＮＡＲ−／−マウス（ｎ＝１０／群）の追加の群を１回免疫誘導し、１５日目に２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスで攻撃した。攻撃後、動物を秤量し、皮下に位置決めした温度チップによって体温を毎日測定した。加えて、それらを疾患の臨床的徴候について１日２回観察し（運動性低下、円背姿勢、後肢における指背歩行（部分麻痺）、片方の後肢または両方の後肢の麻痺）、ウイルス負荷量の決定のために血液を採取した。福祉的根拠による殺処理の基準は、２０％の体重減少または片方もしくは両方の後肢の麻痺からなっていた。
ＺＩＫＶ負荷量の測定のためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
処置マウスからの脳をＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に４℃で１週間浸漬し、次いで−８０℃で保管した。次いで脳組織を秤量し、２ｍｌクライオバイアル中の６００μｌのＲＬＴ緩衝液中で、ステンレス鋼ビーズとともにＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して３０サイクル／秒で６分間均質化した。ウイルスＲＮＡもまた、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）により血液から単離した。ＺＩＫＶ特異的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを対象動物からのウイルスＲＮＡの検出に利用した。ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ１−Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、プライマーＺＩＫＶ ８３５及びＺＩＫＶ ９１１ｃならびにプローブＺＩＫＶ ８６０ＦＡＭを使用して増幅した。標準曲線を各プレートにつきパラレルで生成し、ウイルスゲノムコピー数の定量に使用した。以前に記載されたように、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）ソフトウェア第２．３版を使用してサイクル閾（Ｃｔ）値を計算し、レプリケートのうちの少なくとも１つについてＣｔ値＜３８の場合、陽性とみなした（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ１４：１２３２−９）。事前採血はこのアッセイにおいて陰性であった。
統計分析
マン・ホイットニー分析を使用して抗体価の上昇倍率における差異を比較した。Ｇｒａｐｈｐａｄ，Ｐｒｉｓｍ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して統計分析を行った。すべての分析について、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。Ｌｏｇ１０変換を終末点結合ＥＬＩＳＡ力価及び全ウイルスＰＲＮＴ５０力価に適用した。
これより、これらの実験の結果について記載する。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサスＤＮＡワクチンの構築
ヒトにおいて感染症を引き起こした、１９５２年〜２０１５年に単離された種々のＺＩＫＶ由来のｐｒＭ及びＥｎｖ配列を使用して、ＺＩＫＶ ｐｒＭ（前駆体膜）及びＥｎｖ（エンベロープ）遺伝子（ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ）のコンセンサス配列を産出した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス配列に対して、高効率の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダーペプチド配列の付加を含めた追加の修飾及び最適化を行ってそのインビボ発現を改善した後、それをｐＶａｘ１ベクターにクローニングした（図３５Ａ）。相同性モデル及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ４．５での可視化を使用してＺＩＫＶ−エンベロープ配列の最適なアライメントを行った。参照モデルには、ＰＤＢ ５ＪＨＭ及びＰＤＢ ５ＩＺ７を含めた。ｐｒＭＥ抗原上の特異的領域に対応するアライメントした残基を、これらのモデルにおいて可視化目的で標識した（図３５Ｂ）。最適化コンセンサスワクチン選択は一般に、この研究で分析した複数のＺＩＫＶ株と比べて保存的または半保存的である。ＥＤＥ特異的中和抗体の構造的研究により、これらの認識決定基がエンベロープ−二量体境界面の血清型インバリアント部位にて見出され得ることが明らかとなっており、この部位は、融合ループの露出した主鎖及び２つの保存されたグリカン鎖（Ｎ６７結合型及びＮ１５３結合型グリカン）を含む（Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ５２０：１０９−１３）。これらの２つのグリコシル化部位は、他のフラビウイルスでは高度に保存されていない。その上、ＺＩＫＶはＮ６７結合型グリコシル化部位を保有せず、Ｎ１５４結合型グリコシル化部位（デングにおけるＮ１５３結合型グリコシル化部位と同等）は、単離ＺＩＫＶ株のうちの一部で不在である。したがって、コンセンサス設計の一環として、このグリコシル化部位を除外して構築物を設計した。この部位におけるグリコシル化の欠如は、ＥＤＥ１型広域中和抗体（ｂｎＡｂ）のＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質への改善された結合と相関付けられてきた（Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ５２０：１０９−１３）。
構築に続いて、プラスミドからのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質の発現をウェスタンブロット分析及び間接免疫蛍光測定法によって確認した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで一過性でトランスフェクトした細胞から調製したタンパク質抽出物を、汎フラビウイルス抗体（図３５Ｃ）及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導マウスから採集した血清（図３５Ｄ）を使用して、ウェスタンブロットによって発現について分析した。ＩＦＡにより、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション後４８時間時点で抗ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体を用いて染色することによって、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ発現をさらに検出した（図３５Ｅ）。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ ＤＮＡワクチンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて抗原特異的Ｔ細胞を誘導する
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖプラスミドワクチンが細胞性免疫応答を誘導する能力を評価した。４匹の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなる群を対照プラスミド骨格（ｐＶａｘ１）またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンのいずれかで、２週間間隔で３回、筋肉内投与（ｉ．ｍ．）により免疫誘導し、続いて送達部位にエレクトロポレーションを行った（図３６Ａ）。動物をそれらの３回目の注射から１週間後に殺処理し、各動物から採取したバルク脾細胞をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、それらの脾細胞が、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥを包含するペプチドプールへのエクスビボ曝露を含めた後にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を分泌する能力について評価した。アッセイの結果、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導マウスからの脾細胞が、複数のＺＩＫＶ−Ｅペプチドプールでの刺激後に細胞性免疫応答を生み出したことが示される（図３６Ｂ）。最も強力な細胞性応答（複数可）を誘発したＺＩＫＶＥｎｖの領域（複数可）をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、全ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質に及ぶ１５量体からなる（１１個のアミノ酸だけ重複する）２２個のペプチドプールを使用してマトリックス形式で評価した。いくつかのプールが亢進したＴ細胞応答を実証し、このうちペプチドプール１５が最高数のスポット形成単位（ＳＦＵ）を呈した（図３６Ｃ）。このマトリックスマッピング分析により、優勢なｐｒＭＥエピトープ「ＩＲＣＩＧＶＳＮＲ ＤＦＶＥＧＭ」（ａａ１６７〜１８１）が明らかとなった。このペプチドは、免疫エピトープデータベース解析リソースツール（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）を利用した分析により、Ｈ２−Ｄｂ拘束性エピトープを含有することが確認され、このことは、このハプロタイプにおいて当該抗原が有効にプロセシングされることを裏付ける。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンの細胞性免疫原性のさらなる評価は、最終免疫誘導から１週間後に採集したＣＤ８＋ Ｔ細胞の多機能性特性の決定を伴った。その結果、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチン接種が、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）及びＩＦＮ−γを発現する二重機能性ワクチン特異的Ｔ細胞の割合を増加させたことが示される。重要なことに、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチン接種は、Ｔ細胞の機能性を拡大する強力な能力を呈した（図３６Ｄ）。
加えて、最近同定されたブラジルＺＩＫＶ株または最初のＭＲ７６６ＺＩＫＶ株のいずれかのｐｒＭＥｎｖ配列をコードする最適化プラスミドを用いて、比較免疫研究を行った。３回目のワクチン接種から１週間後、いずれかのプラスミドで免疫誘導したマウスにおける細胞性免疫応答の誘導を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖペプチドプールで脾細胞を刺激した後にＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ分析により測定した。その結果、コンセンサスＺＩＫＶｐｒＭＥ ＤＮＡワクチン構築物によって誘導されたＴ細胞応答が、これらの２つの非コンセンサスプラスミドワクチンのいずれかによって産出されたものよりも一貫して高かったことが例示される（図４２Ａ及び４２Ｂ）。ブラジルまたはＭＲ７６６いずれかのｐｒＭＥワクチンによって誘導された細胞性応答の詳細なマッピング分析により、両方のワクチンが、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖプラスミドについて図３６Ｂ及び３６Ｃに特定される優勢なＥｎｖ特異的ＣＴＬエピトープに対して顕著な細胞性応答を誘導したことが明らかとなった（データは図示せず）。コンセンサス免疫原はこれらのＴ細胞アッセイにおいて同じ用量でより強固な応答を一貫して誘導し、これを追加のアッセイでさらに評価した。
ＺＩＫＶ組換えエンベロープタンパク質の産出
これらの研究に着手したとき、特異的抗ＺＩＫＶ免疫応答を評価するための市販の試薬は入手可能でなかった。したがって、必然的に、この研究で行うアッセイに対応するために組換えＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）を産出した。この試薬を産出するために、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンコンセンサス抗原に基づくコンセンサスＺＩＫＶ−エンベロープ配列をｐＥＴ３０ａ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現ベクターにクローニングした（図４３Ａ）。ｒＺＩＫＶ−Ｅ抗原をＥ．ｃｏｌｉ培養物中で産生させ、ニッケルカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析したところ、ｒＺＩＫＶ−Ｅでトランスフェクトした細菌からの溶解物中で予測サイズの過剰発現タンパク質が示され、これは抗Ｈｉｓタグ抗体を使用してウェスタン分析によって検出可能であった（図４３Ｂ）。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）において捕捉抗原として使用した、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで免疫誘導したマウス由来の血清は、ｒＺＩＫＶ−Ｅｎｖに結合した（図４３Ｃ）。複数のフラビウイルスのエンベロープタンパク質に反応する市販の抗体（汎フラビウイルスと表記される）もまたｒＺＩＫＶ−Ｅに結合した。ウェスタン分析により、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ免疫誘導マウス由来の免疫血清がｒＺＩＫＶ−Ｅを特異的に認識したことが実証された（図４３Ｄ）。これらのデータは、産出されたｒＺＩＫＶ−Ｅが、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチン接種マウス由来の免疫血清と特異的に反応したことを示しているため、この組換えタンパク質をさらなる免疫原性研究に使用した。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンによるＣ５７ＢＬ／６マウスにおける機能性体液性応答の誘導
コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンがマウスにおいて体液性免疫応答を誘導する能力を評価した。４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスからなる群を、２５μｇの空の対照ｐＶａｘ１またはコンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンプラスミドのいずれかで、２週間間隔で３回、エレクトロポレーション媒介送達を介した筋肉内投与（ｉ．ｍ．）により免疫誘導した。血清を各免疫誘導マウスから得、それをＥＬＩＳＡによって、固定化ｒＺＩＫＶ−Ｅを捕捉抗原として使用してＺＩＫＶ特異的ＩｇＧ応答について試験した。２１日目に抗ＺＩＫＶ特異的ＩｇＧの顕著な増加が観察され、３５日目に血清中ＩｇＧレベルのさらなる増強が認められた（図３７Ａ）。ワクチン接種動物由来の６０日目の血清では、亢進したＺＩＫＶ特異的抗体応答が最終追加免疫後に長期間維持されたことが示される。最も重要なことには、ワクチン接種マウス由来の血清は、終末点力価によって示されるように非常に高レベルのｒＺＩＫＶ−Ｅ特異的抗体を含有した（図３７Ｂ）。ＺＩＫＶｐｒＭＥｎｖプラスミド接種マウス由来のプール血清を、ウェスタン分析によってｒＺＩＫＶ−Ｅ（エンベロープ）を検出する（図３７Ｃ）及び免疫蛍光測定法によってＺＩＫＶ（ＭＲ７６６株）感染細胞を染色する（図３７Ｄ）能力についてスクリーニングすることによって、ワクチン誘導性抗体の特異性の追加的評価を行った。これら両方の分析からの結果として、ワクチン誘導性体液性応答の特異性が確認された。
さらに、上述のブラジル株及びＭＲ７６６株からのｐｒＭＥｎｖ配列をコードするプラスミドで免疫誘導したマウスにおけるＺＩＫＶ特異的結合抗体応答もまた評価した。ｐＶａｘ１免疫誘導マウス及び両方の非コンセンサスワクチン免疫誘導マウス由来の３５日目（３回目の免疫誘導から１週間後）の血清を、ＥＬＩＳＡによってｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合について分析した。この分析により、ＭＲ７６６及びブラジルワクチンプラスミドの両方が顕著な抗体結合を誘導したこと、ならびにコンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンでの免疫誘導がｒＺＩＫＶ−Ｅに対して有効な体液性応答を産出することが示される（図４３Ｃ及び４３Ｄ）。
対照ｐＶａｘ１プラスミド、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖプラスミドワクチンまたはコンセンサスＺＩＫＶ−Ｃ（カプシド）プラスミドワクチンのいずれかで免疫誘導（３回）したマウス由来の３５日目のプール血清に対して、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイを行った。使用したＰＲＮＴアッセイは、デングウイルス、西ナイルウイルス及び他のフラビウイルスの分析について以前に記載された技法から適合された方法であった（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｖｉｒｏｌ７５：４０４０−７）。図３７Ｅに示されるように、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種は顕著な中和応答を生み出し、このうち抗ＺＩＫＶ逆数ＰＲＮＴ５０希釈力価（対照ＺＩＫＶ感染症の５０％が阻害された血清希釈率の逆数）が４５６±５であったが、一方でＺＩＫＶ−Ｃａｐ ＤＮＡワクチンをワクチン接種したマウスは、ｐＶａｘ１対照プラスミドワクチン接種動物（力価＝１５±２）を最小限に上回るのみの力価（３３±６）を示した。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンでの免疫誘導後の、Ｉ型インターフェロン受容体が欠如した（ＩＦＮＡＲ−／−）マウスにおける免疫応答及びＺＩＫＶに対する保護
ＺＩＫＶ誘導性疾患及び免疫の機構は十分に明確化されておらず、ＺＩＫＶ感染症に対する免疫応答の保護作用対仮説上の病原性は未だに不明確である（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ９４：１３６２−９）。ほとんどのマウス株はＺＩＫＶ感染症に耐性であるが、ＩＦＮ−α／β受容体が欠如した（ＩＦＮＡＲ−／−）マウスは、ほとんどが攻撃後６〜７日以内に死亡し、感染及び疾患に感受性があることが見出された（Ｌａｚｅａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ１９：７２０−３０）。コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンがこのマウス株において細胞性及び体液性免疫応答を誘導する能力を調査した。５〜６週齢の雌性ＩＦＮＡＲ−／−マウス（ｎ＝４）を、対照ｐＶａｘ１プラスミドまたはＺＩＫＶ ｐｒＭＥワクチンプラスミドワクチンのいずれかで、２週間間隔で３回、エレクトロポレーション媒介送達を用いた筋肉内投与により免疫誘導した。０、１４、２１、及び３５日目に血清を免疫誘導マウスから採集し、最終免疫誘導（３５日目）から１週間後に脾細胞をマウスから採取した。ワクチン免疫誘導マウスからの脾細胞は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて１０６細胞当たりのＳＦＵのレベルによって示されるように、明確な細胞性免疫応答を生み出した（図４４Ａ）。ｒＺＩＫＶ−Ｅを捕捉抗原として使用したＥＬＩＳＡ分析からの結果、１４日目までに検出可能な抗ＺＩＫＶ血清ＩｇＧ（約１：１，０００の力価）が示され、これらのレベルは後続のワクチン接種により増強され、結合抗体価が少なくとも１：１００，０００に達した（図４４Ｂ及び４４Ｃ）。比較すると、３５日目の免疫誘導後試料のＰＲＮＴ５０力価は１：６０であった（データは図示せず）。その結果、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンで免疫誘導したＩＦＮＡＲ−／−マウスは、抗ＺＩＫＶ細胞性及び体液性免疫応答を産出可能であることが示され、このことは、病原体攻撃におけるこの推定上のワクチン効果のモデルのさらなる研究を支持する。
非ヒト霊長動物においてＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ ＤＮＡワクチンによって誘発されるＺＩＫＶ特異的機能性細胞性及び体液性応答
ＮＨＰを、より低電圧の皮内形式で強力な免疫応答を示す最近の研究に基づいて、皮内エレクトロポレーションを使用した皮内免疫誘導によって免疫誘導した（Ｈｕｔｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ２３：９４３−５０、Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ１：ｅ１１）。アカゲザル（ＲＭ、ｎ＝５／群）に２．０ｍｇのワクチンプラスミドを、エレクトロポレーションを用いて皮内投与し、ここで各動物には４週間間隔で２回ワクチン接種した。０日目（免疫誘導前）及び６週目（２回目の免疫誘導の２週間後）に血清及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採集した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖペプチドプールでエクスビボ刺激した免疫誘導前及び６週目のＰＢＭＣのＥＬＩＳｐｏｔ分析により、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ免疫誘導がアカゲザルにおいて強固な抗ＺＩＫＶ Ｔ細胞応答を誘導したことが示された（図３８Ａ）。
ワクチン接種アカゲザル由来の血清中の特異的抗ＺＩＫＶ抗体応答をＥＬＩＳＡによって評価した。６週目、ＺＩＫＶｐｒＭＥｎｖをワクチン接種した動物においてｒＺＩＫＶ−Ｅｎｖ特異的結合抗体が検出可能であった（図２７Ｂ）。２週目（１回の免疫誘導後）及び６週目（２回の免疫誘導後）、各動物について終末点力価を決定した（図３８Ｃ）。ＥＬＩＳＡ結果を、ワクチン接種動物由来のアカゲザル血清を使用してウェスタンブロット分析によって確認した（図３８Ｄ）。アカゲザルにおいて６週目に産出された抗体の中和活性をＰＲＮＴ５０アッセイによって評価した。ワクチン接種したすべてのサルが顕著な中和活性を有し、このうち抗ＺＩＫＶ逆数ＰＲＮＴ５０希釈力価が１６１〜１３８０の範囲であった（平均５０１±２２４（平均値の標準誤差）、図３８Ｅ）。ＰＲＮＴ力価は、ＥＬＩＳＡ力価と直接相関していなかった（データは図示せず）。
ＮＨＰワクチン免疫血清が、インビトロでＶｅｒｏ細胞、神経芽細胞腫（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）または神経前駆（Ｕ−８７ＭＧ）細胞においてＺＩＫＶ感染を遮断する能力をＩＦＡによって検査した。ＺＩＫＶ Ｑ２株（ＭＲ７６６またはＰＲ２０９）を血清中またはＮＨＰ免疫血清の希釈物中でプレインキュベートし、各細胞型の単層に添加した。感染から４日後、ＺＩＫＶ陽性細胞を、汎フラビウイルス（ｆｌａｖｉｒｕｓ）抗体を使用してＩＦＡによって特定し（図４５Ａ〜４５Ｃ）、ＺＩＫＶ陽性細胞を定量した（図４５Ｂ〜４５Ｄ）。ジカ−ｐｒＭＥワクチン接種アカゲザル由来の血清は、各細胞型においてＺＩＫＶ感染を阻害した。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫誘導後のＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ感染及び疾患に対する保護
探索的研究において、５〜６週齢のＩＦＮＡＲ（−／−）マウス（ｎ＝１０）を、１×１０６個のプラーク形成単位（ＰＦＵ）のＺＩＫＶ−ＰＲ２０９単離株の、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、頭蓋内、または静脈内（ｉ．ｖ．）経路のいずれかによる投与で攻撃した。攻撃後、すべての動物を感染症の臨床的徴候について監視し、これには体重の日常測定、ならびに後肢衰弱及び麻痺などの瀕死状態の他の徴候に関する検査が含まれた。接種後最初の４日間、マウスの全体的外観の変化は何ら観察されなかった。しかしながら、４日目より後、これらの群の各々におけるマウスは、全体的な活動性低下、運動性低下及び円背姿勢を示し、これにはしばしば後肢衰弱、水分摂取量減少及び明白な体重減少が伴った。ウイルス攻撃の経路を問わず、動物は６日目〜８日目に感染症により死亡した（図４６Ａ〜４６Ｅ）。これらのデータに基づいて、このモデルにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ媒介性保護を評価する後続の研究では、皮下経路を攻撃用に用いた。
次にＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンの保護作用の有効性をこのＩＦＮＡＲ−／−マウスモデルにおいて評価した。マウスの２つの群（ｎ＝１０）をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで、エレクトロポレーション媒介性送達を介した筋肉内経路によって免疫誘導（２５μｇのワクチン）した。また、１０匹のマウスからなる２つの群を対照ｐＶａｘ１ベクターで、エレクトロポレーション媒介性送達を介した筋肉内経路によって免疫誘導した。免疫誘導は２週間間隔で２回行い、すべての動物を２１日目（２回目の免疫誘導から１週間後）に攻撃した。対照マウス及びワクチン接種マウスの一方の組には、１×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９を皮下経路により与え、各群の他方の組は、総計２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９で皮下経路により攻撃した。攻撃後３週間時点で、すべてのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種動物の１００％が生存していたが、一方で、単回用量で攻撃した対照の３０％または２回用量で攻撃した対照の１０％のみが生存していた（図３９Ａ及び３９Ｂ）。すべての攻撃において、ワクチン接種動物は、体重減少の形跡の不在を含めて、疾患の徴候がなかった（図３９Ｃ及び３９Ｄ）。対照マウスのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスでの感染は、体重の著しい減少とともに、運動性低下、円背姿勢、後肢における指背歩行及び／または片方もしくは両方の後肢の麻痺をもたらした（図３９Ｅ及び３９Ｆ）。
ＺＩＫＶｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンでの単回の免疫誘導がＩＦＮＡＲ−／−マウスをＺＩＫＶ攻撃から保護する潜在的な能力を評価した。１０匹のマウスからなる群を、対照プラスミドまたはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンのいずれかで１回、エレクトロポレーションを用いた筋肉内投与により免疫誘導し、２週間後、総用量２倍の２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９投与で攻撃した。攻撃後３週間時点で、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種動物の１００％が生存していたが、対照動物の１０％のみが生存していた（図４０Ａ）。肉眼的な組織病理学的変化を決定するために、脳組織を５μｍ厚の矢状断切片に切片化し、核構造について染色し、細胞質構造についてエオシンを使用して対比染色した（図４０Ｂ）。組織学的検査及びウイルス負荷量の分析のために、マウスを攻撃後７日目または８日目に殺処理した。ＺＩＫＶ感染は、マウスにおいて重度の脳病変を引き起こした。ワクチン未接種対照（ｐＶａｘ１）マウス脳切片は、好中球内の核断片（図４０Ｂ）、皮質内の血管の血管周囲性単核細胞浸潤、リンパ球浸潤及び大脳皮質の変性細胞（図２９Ｂ）ならびに海馬内の変性ニューロン（図４０Ｂ）を示した。しかしながら、それとは対照的に、ＺＩＫＶ ｐｒＭＥワクチン接種動物は、脳組織において正常な病理組織学を呈し（図４０Ｂ）、このことは、合成ジカ−ｐｒＭＥワクチンでの免疫誘導によって誘導される保護的抗体が脳内のウイルス誘導性疾患を制限し得ることを裏付ける。この所見は、このモデルにおいてワクチン接種が脳を保護する可能性を実証する。ＺＩＫＶ攻撃後のワクチン接種マウスにおける体重減少及び運動機能障害の回復と一致するように、高（２×１０６ＰＦＵ）用量攻撃群において、ウイルス攻撃したｐＶａｘ１ワクチン接種動物と比較して顕著に低いウイルス負荷量が、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種動物の血液中（図４０Ｃ）及び脳（図４０Ｄ）内で認められた。まとめると、これらのデータは、ワクチン媒介性免疫応答がマウスをＺＩＫＶ攻撃に対して保護し得ることを例示する。
抗ＺＩＫＶ免疫血清の受動的移入はマウスをＺＩＫＶ感染症に対して保護する
次に、ＺＩＫＶｐｒＭＥｎｖワクチン接種アカゲザル由来の免疫血清の移入が、ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおいてＺＩＫＶ媒介性病理発生を予防するかどうかを試験した。この目的で、６週目のアカゲザル由来の１５０μｇ等量のＩｇＧ（ＰＲＮＴ５０≒１／１６０）を、ｒＺＩＫＶウイルス攻撃から１日後にＩＦＮＡＲ−／−マウスに養子移入した。対照マウスの２つの群を含め、このうち一方の群にはアカゲザル由来の免疫前血清を与え、他方の群にはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を与えた。ＰＢＳまたは対照血清を与えたマウスは、感染経過中にそれらの当初の体重が１５〜２５％減少し、すべてが感染から６〜８日後に死亡した。アカゲザル由来のワクチン免疫血清を易感染性マウスに移入したとき、動物は、３日目及び４日目に体重が減少したが、その後、５日目から始まり体重が回復し、８０％が最終的に感染性攻撃から生き延び（図４１Ａ）、このことは、ＮＨＰ血清移入がウイルス攻撃後のＺＩＫＶ感染症の臨床的症状発現に対する保護を付与する能力を実証する（図４１Ｂ）。ＺＩＫＶでの攻撃に対する保護における免疫血清移入の有効性を評価するために行った反復実験において、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫血清レシピエントの間の生存率は、８０〜１００％の範囲であった。これらの研究により、抗ＺＩＫＶワクチン免疫血清が、獲得適応抗ＺＩＫＶ免疫応答の不在下でＺＩＫＶ感染症に対する顕著な保護を付与する能力を有したことが示される。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス構築物でのワクチン接種
近年のＺＩＫＶの蔓延及びヒトにおけるその関連する病理発生により、深刻な懸念が持ち上がっている。現在のところ、このエマージング感染因子に対する認可されたワクチンまたは治療薬は存在しない。ごく最近、一まとまりの実験的ＺＩＫＶワクチンが、非病原性動物感染モデルにおいて攻撃後にウイルス負荷量を低下させることが示された（Ｌａｒｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ５３６：４７４−８、Ａｂｂｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉｅｎｃｅ３５３：１１９２−３２）。これらのデータは心強い。この点に関し、追加のモデルにおいてジカを標的とする追加的な新規のワクチンアプローチを検査することは重要である。ここにおいて、新規のコンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭ及びＥ抗原を発現するように設計された合成ＤＮＡワクチンを、マウス及び非ヒト霊長動物におけるエレクトロポレーション強化免疫誘導後の免疫原性について評価した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチン接種が、マウス及びＮＨＰの両方において免疫原性であり、抗原特異的Ｔ細胞ならびに結合及び中和抗体を産出したことが観察された。独自に、ＮＨＰを皮内経路によって、エレクトロポレーションを介してＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫誘導した。これは、最近記載された筋肉内エレクトロポレーションよりも低い電圧及びより小さいトランスフェクション面積を使用する（Ｔｒｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ３８６：２０７８−８８）。かかるアプローチのさらなる研究が臨床設定において利点を提供し得る。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス構築物は、推定上のグリコシル化部位の除去という、可能性のあるＮＸＳ／Ｔモチーフの設計された変化を含む。この部位におけるグリコシル化の欠失は、ＥＤＥ１型ｂｎＡｂ（広域中和抗体）のＺＩＫＶ−Ｅタンパク質に対する改善された結合と相関付けられてきた（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ７：３０１ｒａ１３２）。コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥによって誘導される抗体応答は、同様に開発されたＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ブラジルワクチンによって誘発される抗体応答と同程度に規模が強固、または場合によってはより優れているように思われる。これらの構築物の配列を、最初のＺＩＫＶ−ＭＲ７６６単離株または近年流通しているブラジル由来のＺＩＫＶ株とそれぞれ一致させた。補助的であるが、誘導性免疫応答に対するかかる組み込み設計された変化の効果に関して、さらなる研究がより多くの洞察を提供するだろう。
ＺＩＫＶに関する病原性攻撃モデルは非常に小数しか存在しないため、Ｃ５７ＢＬ／６及びＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンの免疫応答の推定上の保護的性質を比較した。両方のマウス株が、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫誘導したとき、強固な体液性免疫応答を伴って応答した。Ｔ細胞応答もまた誘導されたが、これはＩＦＮＡＲ−／−動物において誘導されたものと比較して野生型Ｃ５７ＢＬ／６においてより強固であるように思われ、このことは、マウスにおけるノックアウト表現型に起因して予想通りである自然免疫から適応免疫への移行における部分的欠陥を裏付ける。しかしながら、抗原特異的免疫の誘導に基づいて、このモデルは、感染及び病理発生の両方に及ぼすワクチンの影響の評価に有用であった。ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥでの単回ワクチン接種は、神経病理発生の保護を含めて、このモデルにおいて疾患及び死亡に対して保護作用があった。Ｅｎｖ抗原に対して向けられるフラビウイルス中和抗体は、疾患に対する保護において主要な役割を有すると考えられ、この見解は、動物モデルにおける受動的抗体移入実験によって直接的に、及び、蚊媒介ウイルス感染症が生じやすい地理的地域における前向き研究からの疫学的データによって間接的に裏付けられる（Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ１３０：６９−８０、Ｒｏａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ３８７：８４３、Ｓａｍａｒａｓｅｋｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ３８７：５２１−４）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ ＤＮＡワクチンならびに免疫誘導ＮＨＰからの血清移入でのＩＦＮＡＲ−／−マウスの免疫誘導は、このマウスモデルにおいて保護作用があったが、血清移入マウスとは対照的にワクチン接種したＩＦＮＡＲ−／−は、病理発生の管理の指標としての体重減少の管理の改善を示した。追加の研究が必要とされるものの、この結果は、このモデルにおけるこの保護の態様においてＴ細胞応答の役割を示唆する可能性がある。加えて、攻撃から回復した対照ＩＦＮＡＲ−／−マウスが、ＰＣＲによって、少なくとも数週間ウイルス陽性のままであることが観察され、このことはワクチン接種の追加の有益性を示唆する。この研究は、ワクチン接種、及びこの場合、この合成ＤＮＡワクチン接種が、感受性宿主における疾患の予防に影響を及ぼす可能性を裏付ける。
実施例５
ジカウイルスに対するＤＮＡによりコードされる抗体予防投与及びＤＮＡワクチン接種により誘発される迅速な免疫及び長期的免疫
ワクチン接種は、免疫の産出前に誘導期を呈することが知られており、故に、感染中、免疫応答が有効となる前に時間のギャップが存在する。以下は、ワクチン、及び、ＤＮＡ合成抗体またはｄＭａｂを使用した有効な免疫の迅速な産出とともにした天然免疫応答の有益性を利用する、特定の新規アプローチを提供する。
生物学的に活性な抗ジカウイルスエンベロープｍＡｂ（ｄＭＡｂと表記される）をコードする合成プラスミドのエレクトロポレーション媒介性送達を伴う、抗体に基づく予防法／療法を設計し、抗ウイルス有効性について、ならびに新規の受動的免疫に基づく戦略により従来の活性ワクチン接種に固有の欠点を克服する能力について評価する。ＺＩＫＶ−ｄＭＡｂの１回の筋肉内投与により、抗体がインビボで、ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンによる活性ワクチン接種よりも迅速に産生される。このｄＭＡｂは、多様なＺＩＫＶ臨床単離株を中和し、マウスをウイルス攻撃から保護した。両者の組み合わせが迅速かつ長期的な保護をもたらす。
ＤＮＡに基づくｄＭＡｂ戦略は、エマージングウイルス感染に対して迅速な保護を誘導し、これをＤＮＡワクチン接種と組み合わせて、このエマージング感染性疾患に対して独自に短期的保護及び長期的保護の両方を提供することができる。これらの研究は、病原体治療及び管理戦略に対して関連性を有する。
ｄＭＡｂ ＩｇＧ定量及び結合アッセイ
ＺＩＫＶ−ｄＭＡｂを投与された対象由来の血清を用いて、発現動態及び標的抗原結合を定量するＥＬＩＳＡアッセイを行う。
ｄＭＡｂにより産出されたＩｇＧの分析
ＺＩＫＶ感染細胞のＩｇＧ発現をウェスタンブロットによって分析する。免疫蛍光測定分析のために、ＺＩＫＶ感染細胞を共焦点顕微鏡によって可視的に評価し、定量的にまたは半定量的に分析する。
ｄＭＡｂ ＤＮＡプラスミド投与及びインビボ分析
発現動態及び機能性を対照またはＺＩＫＶ−ｄＭＡｂの注射後に対象において評価した。ＤＮＡワクチンを含む研究のために、ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンプラスミドを投与する。
攻撃研究
対象にＺＩＫＶ−ｄＭＡｂまたは対照プラスミドのエレクトロポレーション強化注射を与える。ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンを上述のように送達した。ＤＮＡ送達後、対象をＺＩＫＶで攻撃する。動物を生存及び感染の徴候について監視する。血清試料をサイトカイン定量及び他の免疫分析のために採集する。血液試料を感染後から採集し、ウイルス血症レベルを測定する。
中和抗体分析
ＺＩＫＶ−ｄＭＡｂを投与された対象由来の抗ＺＩＫＶ中和抗体価を決定する。中和力価は、細胞において細胞変性効果の１００％減少を媒介する最も高い希釈率の逆数として計算され得る。
サイトカイン定量的分析
血清を、ＺＩＫＶ−ｄＭＡｂ、及びＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンを注射した対象ならびにＺＩＫＶで攻撃した対象から採集する。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６血清サイトカインレベルを測定する。
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ設計及び発現の確認
抗ＺＩＫＶ−中和ｍＡｂから構築した最適化合成プラスミドをＩｇＧ及びＦａｂ抗体用に設計した。細胞を、ｒＺＩＫＶ−ＩｇＧプラスミドまたはＺＩＫＶ−Ｆａｂ（ＶＬ、ＶＨ、または組み合わせ）プラスミドのいずれかでトランスフェクトして、インビトロでの発現の有効性を確認する。ＺＩＫＶ−Ｆａｂ及びＺＩＫＶ−ＩｇＧは筋肉において、適切に組織化され、インビトロで生物学的に機能性であると思われる抗体を発現した。
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂのインビボ発現及び定量
インビトロ発現の確認後、ＺＩＫＶ−ＦａｂまたはＺＩＫＶ−ＩｇＧがインビボで抗ＺＩＫＶ抗体を産生する能力を測定する。両方の構築物がｍＡｂを産出する。対象にＺＩＫＶ−ＩｇＧまたはＺＩＫＶ−Ｆａｂのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ＥＬＩＳＡにより評価する。ＺＩＫＶ−ＩｇＧ及びＺＩＫＶ−Ｆａｂの両方から注射後に採集した血清は、ＺＩＫＶタンパク質に結合するが、無関係の対照抗原には結合しない。これらのデータにより、ＺＩＫＶ−ＩｇＧまたはＺＩＫＶ−Ｆａｂ構築物からインビボで産生された抗ＺＩＫＶ抗体が、従来的に産生された抗原特異的抗体と同様の生物学的特性を有することが示される。
ＺＩＫＶ ｄＭＡｂを注射した対象由来の血清中のインビボ特異性及び広域中和活性抗
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂにより産出されたｍＡｂを結合特異性及び抗ＺＩＫＶ中和活性について試験する。血清抗体はＺＩＫＶ感染細胞に結合する。抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂプラスミドから産出された抗体の強力な特異性が存在する。
さらに、抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂを受けた対象由来の血清中の抗ＺＩＫＶ中和活性を、ＺＩＫＶ株におけるそれに対して測定する。抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂを注射した対象（ｓｕｂｅｃｔｓ）由来の血清は、ＺＩＫＶ単離株を有効に中和し、このことは単回注射がヒト抗ＺＩＫＶ ＩｇＧの顕著な中和レベルをもたらし得ることを実証する。故に、抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ構築物によってインビボで産生された抗体は、関連性のある生物学的活性（すなわち、ＺＩＫＶへの結合及びそれに対する中和活性）を有する。
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ注射はマウスを致死的ＺＩＫＶ攻撃から保護する
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂから産出された抗体がＺＩＫＶへの早期曝露に対する保護を提供するかどうかを決定するために、１０匹の対象からなる群に０日目に対照または抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂを与える。その後、各群を、自然ＺＩＫＶ感染症を模倣するようにウイルスで皮下投与により攻撃する。その後、対象の生存率及び体重変化を記録する。抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂプラスミドは、保護的免疫を付与する。
免疫保護の存続期間を次に評価する。対象の第２の群を、０日目に抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ、または対照プラスミドの注射後、ＺＩＫＶで攻撃する。対象を生存について監視する。抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂは、より持続的な度合の免疫保護を提供する。
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂは、対照を投与した対象と比較して、対象を皮下ウイルス攻撃及び鼻腔内ウイルス攻撃の両方から保護し、このことは、ＺＩＫＶ ｄＭＡｂが全身感染及び粘膜感染に対して保護し得ることを実証する。
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ投与対ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチン（ＺＩＫＶ−ＤＮＡ）の保護作用の有効性を比較する有効性研究を次に行う。新規のコンセンサスに基づくＤＮＡワクチンを本発明者らの実験室で開発した。これはＺＩＫＶ攻撃に対する保護を提供可能である。ＤＮＡワクチンはまた、測定可能な細胞性免疫応答、ならびに強力な中和抗体応答の両方を誘導した。対象の群に抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ、ＺＩＫＶ−ＤＮＡ、またはｐＶａｘ１の単回注射を投与し、続いてウイルス攻撃を行う。抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂは、ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンよりも迅速に保護的免疫を付与する。
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ投与及びＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチン接種によるインビボでの保護的免疫の間の比較
次に、０日目のＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンでのワクチン接種または抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂの投与後の長期的ＺＩＫＶ攻撃保護に関する研究を行った。ＺＩＫＶ−ＤＮＡは、抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂよりも長い保護的免疫を付与する。
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンの共送達により、インビボで全身性の体液性免疫、細胞媒介性免疫、及び保護がもたらされる
抗体送達をワクチン接種アプローチと組み合わせることの１つの潜在的な問題は、抗体が多くの従来型ワクチンを中和する恐れがあり、故に、不適合性のプラットフォームであるということである。ＺＩＫＶ攻撃の関連における対象の生存率に対する抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡの共投与の効果を評価する。対象に０日目、抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡを投与する。その後、一部の動物は２日目に、及びその他の動物は３５日目にＺＩＫＶで攻撃する。これらの群における生存率を時間の関数として追跡する。抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂは感染からの保護を媒介し、対照（ｐＶａｘ１）動物においては攻撃から４日後に生存百分率がおよそ３０％に減少する。抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンによって誘導されるＩｇＧ両方が検出される。抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂは、ＺＩＫＶ攻撃後に感染及び死亡からの迅速な保護を媒介する。
さらに、抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ、ＺＩＫＶ−ＤＮＡ、または抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂとＺＩＫＶ−ＤＮＡを注射した対象において誘導されたＴ細胞応答を評価する。ＺＩＫＶ−ＤＮＡは、抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂとの共送達とは無関係に強力なＴ細胞応答を誘発し、このことはこれらのアプローチの干渉の欠如を示す。それとは逆に、抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂのみを投与した動物は、Ｔ細胞応答を発現しない。抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンの両方を、相互の干渉を伴わずに同時に投与して、全身性体液性及び細胞性免疫を介した即座でかつ長期的な保護を提供することができる（図８）。
生物学的に機能性のｍＡｂのインビボ迅速産生のための最適化ＤＮＡプラスミドのエレクトロポレーション媒介性送達
抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂを投与した対象は、投与後のすぐ後にウイルス攻撃から完全に保護されるが、一方で、対象は、ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンでの単回免疫誘導後の感染に関しては、恐らく保護的免疫を開始するには不十分な時間に起因して生き延びない。しかしながら、ＺＩＫＶ−ＤＮＡは、免疫誘導レジメン、続いてより後の時点での攻撃後に、完全な保護を提供する。単回用量の抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂを投与した対象において同様のレベルの保護が生じるが、保護は経時的に減弱する。注目すべきことに、抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡの共送達は、迅速かつ持続的な体液性及び細胞性免疫をもたらし、このことは併用アプローチが相加効果または相乗効果を有し得ることを示唆する。重要なことに、抗ＺＩＫＶ ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡの共送達は、短期的または長期的な保護的免疫応答の発現の点から拮抗性でない。
実施例６
配列
●配列番号１ ＺＩＫＶ−３Ｆ１２Ｅ９−ＶＨのアミノ酸配列
●配列番号２ ＺＩＫＶ−３Ｆ１２Ｅ９−ＶＬのアミノ酸配列
●配列番号３ ＺＩＫＶ−８Ａ９Ｆ９−ＶＨのアミノ酸配列
●配列番号４ ＺＩＫＶ−８Ａ９Ｆ９−ＶＬのアミノ酸配列
●配列番号５ ＺＩＫＶ−８Ｄ１０Ｆ４−ＶＨのアミノ酸配列
●配列番号６ ＺＩＫＶ−８Ｄ１０Ｆ４−ＶＬのアミノ酸配列
●配列番号７ ＺＩＫＶ−ＩＣ２Ａ６−ＶＨのアミノ酸配列
●配列番号８ ＺＩＫＶ−ＩＣ２Ａ６−ＶＬのアミノ酸配列
●配列番号９ ＺＩＫＶ−ＩＤ４Ｇ７−ＶＨのアミノ酸配列
●配列番号１０ ＺＩＫＶ−ＩＤ４Ｇ７−ＶＬのアミノ酸配列
●配列番号１１ヒト抗ジカ（３Ｆ１２Ｅ９）−ＩｇＧ４：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号１２ヒト抗ジカ（３Ｆ１２Ｅ９）−ＩｇＧ１：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号１３ヒト抗ジカ（８Ａ９Ｆ９）−ＩｇＧ４：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号１４ヒト抗ジカ（８Ａ９Ｆ９）−ＩｇＧ１：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号１５ヒト抗ジカ（８Ｄ１０Ｆ４）−ＩｇＧ４：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号１６ヒト抗ジカ（８Ｄ１０Ｆ４）−ＩｇＧ１：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号１７ヒト抗ジカ（１Ｄ４Ｇ７）−ＩｇＧ４：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号１８ヒト抗ジカ（１Ｄ４Ｇ７）−ＩｇＧ１：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号１９ヒト抗ジカ（８Ａ９Ｆ９）−ＩｇＧ１：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２（４番目及び５番目の残基においてＬＡＬＡバリアントを有する）−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号２０ヒト抗ジカ（３Ｆ１２Ｅ９）−ＩｇＧ１：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２（４番目及び５番目の残基においてＬＡＬＡバリアントを有する）−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号２１ヒト抗ジカ（ＩＣ２Ａ６）−ＩｇＧ４：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号２２ヒト抗ジカ（ＩＣ２Ａ６）−ＩｇＧ１：ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３−カスタムフリン切断部位−「ＧＳＧ」リンカー及びＰ２Ａペプチド−ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ（カッパ）
●配列番号２３、コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥタンパク質
●配列番号２４コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ（構築物１）ＤＮＡ
●配列番号２５コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ（構築物１）タンパク質
●配列番号２６、コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ＮＳ１ ＤＮＡ
●配列番号２７、コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ＮＳ１タンパク質
●配列番号２８、コンセンサスジカＩｇＥリーダー−カプシドＤＮＡ
●配列番号２９、コンセンサスジカＩｇＥリーダー−カプシドタンパク質
●配列番号３０、ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ ＭＲ７６６ ＤＮＡ
●配列番号３１、ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ ＭＲ７６６タンパク質
●配列番号３２、ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥブラジルＤＮＡ
●配列番号３３、ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥブラジルタンパク質
●配列番号３４コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ＮＳ１ ＤＮＡ（ｐＧＸ７２１１）
●配列番号３５コンセンサスジカＩｇＥリーダー−カプシドＤＮＡ（ｐＧＸ７２１２）
●配列番号３６ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥブラジルＤＮＡ（ｐＧＸ７２１３）
●配列番号３７ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ ＭＲ７６６ ＤＮＡ（ｐＧＸ７２１４）
●配列番号３８カプシドＤＮＡを含まないジカＰｒｅＥｎｖ（ＭＲ７６６）（ｐＧＸ７２１０）
●配列番号３９カプシドタンパク質を含まないジカＰｒｅＥｎｖ（ＭＲ７６６）（ｐＧＸ７２１０）
●配列番号４０、ＩｇＥリーダー
上述の詳細な説明及び付随する実施例は単なる例示説明であり、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ規定されることが理解される。
開示される実施形態に対する種々の変更形態及び修正形態が当業者には明らかとなろう。限定されないが本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関する変更及び修正を含めて、かかる変更及び修正が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなくなされてもよい。

Claims (23)

  1. １つ以上の合成抗体をコードする核酸分子であって、前記核酸分子が、
    ａ）抗ＺＩＫＶエンベロープ（Ｅ）タンパク質合成抗体をコードするヌクレオチド配列、
    ｂ）抗ＺＩＫＶ Ｅタンパク質合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列、からなる群から選択される少なくとも１つを含む、前記核酸分子。
  2. 切断ドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記核酸分子が、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
  4. 前記抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体が、配列番号１１〜２２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項３に記載の核酸分子。
  5. 前記抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体が、配列番号１１〜２２からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項４に記載の核酸分子。
  6. 前記抗ＺＩＫＶ Ｅタンパク質合成抗体が可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖を含む、請求項１に記載の核酸分子。
  7. 抗ＺＩＫＶ Ｅタンパク質合成抗体のＶＨ鎖が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、及び配列番号９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項６に記載の核酸分子。
  8. 抗ＺＩＫＶ Ｅタンパク質合成抗体のＶＨ鎖が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、及び配列番号９からなる群から選択される配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項７に記載の核酸分子。
  9. 抗ＺＩＫＶ Ｅタンパク質合成抗体のＶＬ鎖が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、及び配列番号１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項６に記載の核酸分子。
  10. 抗ＺＩＫＶ Ｅタンパク質合成抗体のＶＬ鎖が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、及び配列番号１０からなる群から選択される配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項９に記載の核酸分子。
  11. 前記ヌクレオチド配列がリーダー配列をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  12. 前記核酸分子が発現ベクターを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組成物。
  14. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記組成物が第２の核酸分子をさらに含み、前記第２の核酸分子がコンセンサスジカ抗原をコードする、請求項１３に記載の組成物。
  16. 前記コンセンサスジカ抗原が、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３及び配列番号３９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記コンセンサスジカ抗原が、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項１５に記載の組成物。
  18. 前記第２の核酸分子が、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相同である核酸配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項１５に記載の組成物。
  19. 前記第２の核酸分子が、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８からなる群から選択される核酸配列、またはその免疫原性断片を含む、請求項１５に記載の組成物。
  20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、対象における疾患の予防方法または治療方法。
  21. 請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の組成物を個体に、前記個体において免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む、免疫応答の誘導方法。
  22. 前記免疫応答が持続的である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記免疫応答が全身性である、請求項２１に記載の方法。
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