CN117844750A - 一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微流控技术、化学合成与癌症免疫治疗学的交叉技术领域，公开了一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，包括以下步骤：(1)将抗体通过碳二亚胺法修饰到海藻酸盐上，获得抗体修饰的海藻酸盐；(2)人工抗原呈递凝胶液滴的制备：将步骤(1)制备的抗体修饰的海藻酸盐制备成凝胶液滴，同时将可溶性细胞因子和胶原模拟肽封装到凝胶液滴中。利用本发明制备的AAPGD在体外增殖T细胞，细胞增殖速度快、活性高。增殖的T细胞中，具有低分化和特异性抗肿瘤能力的T细胞比例大。回输治疗时，AAPGD还能增强体内T细胞对肿瘤部位的浸润。

Description

一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备与应用

技术领域

本发明涉及微流控技术、化学合成与癌症免疫治疗学的交叉技术领域，具体涉及一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备与应用。

背景技术

近年来，免疫疗法已成为治疗各种类型癌症和复发性病毒疾病的一种强有力和潜在的治疗方法。过继细胞疗法(adoptive cell transfer,ACT)是一种免疫疗法，包括体外分离和扩增抗原特异性T细胞，随后过继转移回患者。越来越多的证据表明，抗原特异性CD8⁺T细胞的过继转移可能是对抗慢性病毒感染和恶性肿瘤(如黑色素瘤)的一种有效策略。最近Rosenberg SA的研究表明：外周血中循环的PD-1⁺CD 8⁺T细胞能够特异性识别黑色素瘤抗原，并且与肿瘤局部表达PD-1的肿瘤侵润的特异性CD 8⁺T具有相似的T细胞抗原受体(Tcell receptor,TCR)，因此，从外周血获取T细胞具有抗肿瘤的能力。

然而从外周血中获得的T细胞体外无法控制其低分化、特异性、大规模增殖以及常规给药方式很难使抗肿瘤T细胞浸润到复杂的肿瘤微环境中。而且制备工艺非常复杂，成本高昂，治疗价格昂贵，限制其在临床上的推广。

T细胞体外增殖，需要提供三个信号：T细胞受体刺激(信号1)；共刺激(信号2)；和可溶性促有丝分裂细胞因子(信号3)，其中信号1和信号2的浓度能够影响细胞的分化程度，信号3的释放速率和种类制约增殖细胞中肿瘤抗原特异性T细胞的比例。国内外基于生物材料体外扩增T细胞的方法中，如聚乙烯小球、磁性纳米颗粒、脂质体、水凝胶等，或是难以定量的控制信号1和2的浓度，或是无法模拟生物抗原呈递细胞缓释信号3，亦或是制备复杂，耗时费力，更无法同时满足提高T细胞对肿瘤的浸润。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备与应用。利用化学耦合和液滴微流控技术实现多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备。该液滴在体外可以快增殖从宿主体内获得的外周血T细胞，增殖的细胞分化程度低，活性好，有着良好的抗肿瘤能力。随后，无需分离提纯，直接将液滴和增殖的细胞共同注射到宿主体内，液滴在体内又促进了T细胞的浸润肿瘤的能力。在小鼠实验中，提高了小鼠的生存率。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将抗体通过碳二亚胺法修饰到海藻酸盐上，获得抗体修饰的海藻酸盐；

(2)人工抗原呈递凝胶液滴的制备：将步骤(1)制备的抗体修饰的海藻酸盐制备成凝胶液滴，同时将可溶性细胞因子和胶原模拟肽封装到凝胶液滴中，所述胶原模拟肽序列为GGYGGGPC(GPP)₅GFOGER(GPP)₅GPC，其中O为羟基脯氨酸。

进一步地；步骤(1)的修饰方法为：将海藻酸盐溶解在MES溶液中，然后向溶液中加入EDC和磺基-NHS，在25～30℃下持续搅拌反应20～24小时，随后向溶液中加入抗体，继续搅拌反应25～35分钟，透析后冻干，获得抗体修饰的海藻酸盐。

进一步地；步骤(2)所述人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法为：将步骤(1)制备的抗体修饰的海藻酸盐溶于水中制备成2wt％的抗体修饰的藻酸盐溶液，然后与50mM Ca-EDTA络合物溶液、可溶性细胞因子和胶原模拟肽按质量体积比为100μL∶50μL∶1μg∶1μg混合制备成水相，将所述水相和油相均由恒流微泵驱动，进入具有疏水通道表面的PDMS液滴微流控芯片，所述油相为碳氟化合物油，在出口处收集液滴，向收集的液滴中加入醋酸，液滴凝胶化后，向油相中加入PFO溶液，将凝胶液滴从油相中分离出来，漂洗数次后获得凝胶液滴，简称AAPGD。

进一步地；所述海藻酸盐为海藻酸钠，所述MES溶液包含0.1M MES和0.3M NaCl，pH为6.5，所述透析用透析膜的截留分子量为200kDa，透析时间为3～4天。

进一步地；所述抗体与MES溶液的质量体积比为40μg∶1mL，所述抗体包括抗体FITC-anti-CD3和抗体PE-anti-CD28，抗体FITC-anti-CD3和抗体PE-anti-CD28的质量比为1∶1，所述海藻酸盐、EDC、磺基-NHS之间的质量比为30∶19∶6，所述海藻酸盐与MES溶液的质量体积比为0.6g∶1mL。

进一步地；所述水相和油相的体积比为1∶1，所述水相和油相的流速均为20μL/min。

进一步地；所述PFO溶液的体积分数为20％，所述醋酸的体积分数为0.05％，所述漂洗用pH为7.4的1×PBS缓冲液漂洗三次。

进一步地；所述可溶性细胞因子选自IL-2、IL-15、IL-21中的一种。

本发明的另一技术方案是：一种所述多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法制备的凝胶液滴在体外扩增黑色素瘤小鼠外周血T细胞中的应用。

本发明的有益效果：本发明制备的多功能人工抗原呈递凝胶液滴(AAPGD)，其表面提供T细胞体外增殖所需的T细胞受体刺激信号和共刺激信号，两种信号(FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28)密度可调。同时，能缓慢释放有丝分裂细胞因子和胶原模拟肽(CMP)。高度均匀的AAPGD是通过液滴微流控芯片制备。利用AAPGD在体外增殖T细胞，细胞增殖速度快、活性高。增殖的T细胞中，具有低分化和特异性抗肿瘤能力的T细胞比例大。回输治疗时，AAPGD还能增强体内T细胞对肿瘤部位的浸润。在使用AAPGD对黑色素瘤小鼠进行过继细胞治疗的实验中，肿瘤生长受到了抑制，引起了强烈的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应，提高了小鼠的存活率。将AAPGD的制备与过继细胞治疗有机的结合起来。简化了过继细胞疗法的准备步骤，提高了治疗效果，为过继细胞治疗实体瘤提供了一条新途径。

附图说明

图1是抗体修饰的海藻酸钠的制备路线图；

图2是AAPGD重悬于细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)中，在倒置荧光显微镜下的观察图；

图3中(A)是加入FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28后不同搅拌时间制备的AAPGD上修饰的抗体蛋白的质量图；(B)加入不同质量比的FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28制备的AAPGD上修饰的抗体蛋白的质量图；

图4是采用流式细胞术验证海藻酸钠凝胶上两种抗体的功能图；

图5是凝胶液滴中细胞因子和CMP的释放量图，(A)是不同时间凝胶液滴和上清液中IL-2的水平；(B)是不同时间凝胶液滴和上清液中IL-15的水平；(C)是不同时间上清液中IL-21的水平，图中插图是不同时间凝胶液滴中IL-21的水平；(D)是不同时间上清液中CMP的水平，图中插图是不同时间凝胶液滴中CMP的水平。

图6是黑色素瘤小鼠外周血T细胞在含有AAPGD的培养基中11天内增殖实验图；

图7是黑色素瘤小鼠外周血T细胞在培养瓶(In culture flask)、含无液滴状凝胶培养皿(in non-droplet)和含凝胶液滴培养皿(use droplet)中培养不同时间的增殖细胞的数量对比图；

图8是黑色素瘤小鼠外周血T细胞分别在培养瓶、含无液滴状凝胶培养皿和含凝胶液滴培养皿中培养11天后，T细胞中TAS-T细胞的比例图；

图9是黑色素瘤小鼠外周血T细胞分别在培养瓶、含无液滴状凝胶培养皿和含凝胶液滴培养皿中培养11天后，(A)为表达CD27⁺CD28⁺的TAS-T细胞比例图；(B)为表达颗粒酶B的TAS-T细胞比例图；(C)为表达穿孔素的TAS-T细胞比例图；(D)为分泌的IFN-γ的量对比图；(E)为分泌的TNF-α的量对比图；

图10是T细胞浸润黑色素瘤的免疫荧光图像，图中AAPGD+CMP+T Cells表示AAPGD(含CMP)+T Cells，AAPGD+T Cells表示AAPGD(不含CMP)+T Cells；

图11是TME中浸润的CD3⁺CD8⁺T细胞数量的对比图；

图12中(A)是肿瘤中IFN-γ的浓度对比图；(B)是TME中浸润的TAS-T细胞数量的对比图；

图13是第12天，肿瘤组织切片T细胞浸润黑色素瘤的免疫荧光图像，图中PBS为注射PBS缓冲液组、T细胞为注射培养瓶中增殖的T细胞组、AAPGD+CMP+T细胞为注射培养皿中增殖的T细胞组、AAPGD+CMP+T细胞+Anti-PD-L1为注射培养皿中增殖的T细胞与Anti-PD-L1的混合液组；

图14是第17天时小鼠肿瘤图片；

图15是不同注射剂治疗后肿瘤小鼠原发肿瘤的生长曲线图；

图16是不同注射剂治疗后肿瘤小鼠存活时间图；

图17中(A)是不同注射剂治疗后肿瘤小鼠脾脏内分泌的IFN-γ的量；(B)是不同注射剂治疗后肿瘤小鼠脾脏中CD3⁺CD8⁺T细胞的百分比。

具体实施方式

本发明所用RMPI-1640培养基购自Gibco公司；

PDMS液滴微流控芯片购自苏州中芯启恒芯片科技有限公司；

抗体FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28购自Sigma-Aldrich公司；

使用FACSAria III流式细胞仪(BD Biosciences，购自贝克曼库尔特公司)对细胞进行分拣；

本发明中所用荧光抗体包括抗-CD8-PE、抗-PD-1-Cy3、抗-CD3-PC7、抗-CD27-PC5.5、抗-CD28-APC、抗-PD-1-FITC、颗粒酶B-FITC和穿孔素-FITC。

实施例1：

一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，包括以下步骤：

(1)将抗体通过碳二亚胺法修饰到海藻酸钠上：

将0.6g海藻酸钠溶解在MES(2-吗啉乙磺酸)溶液(0.1M MES，0.3M NaCl，pH 6.5)中，然后向溶液中加入0.38g EDC(碳二亚胺)和0.12g磺基-NHS(磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)，在30℃下持续搅拌反应20小时，随后分别加入FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28各20μg，将溶液搅拌30分钟，然后采用截留分子量为200kDa的透析膜透析3天，然后冻干获得抗体修饰的海藻酸钠，整个过程中注意避光。

(2)人工抗原呈递凝胶液滴的制备：

取步骤(1)制备的抗体修饰的海藻酸钠溶解于水中制备成2wt％的抗体修饰的海藻酸钠溶液，将100μL 2wt％抗体修饰的海藻酸钠溶液、100μL 50mM Ca-EDTA络合物水溶液、2μg IL-2和2μg胶原模拟肽(CMP)混合制备成水相，所述CMP序列为GGYGGGPCGPPGPPGPPGPPGPPGFOGERGPPGPPGPPGPPGPPGPC，其中O为羟基脯氨酸，碳氟化合物油(HFE7500)为油相，将水相和油相均由恒流微泵驱动，进入具有疏水通道表面的PDMS液滴微流控芯片，水相和油相的流速均为20μL/min，在出口处收集液滴，向收集的液滴中加入醋酸(0.05Vol％)，以促使钙离子从络合物中释放出来并使液滴凝胶化，凝胶化后，在油相中加入20Vol％的PFO(1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇)溶液，将凝胶液滴从油相中分离出来，并用1×PBS缓冲液(pH＝7.4)漂洗三次，漂洗过程中注意不要扰动液滴，即得人工抗原呈递凝胶液滴(简称AAPGD)。

实施例2：

一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，与实施例1不同之处为可溶性细胞因子为IL-15。

实施例3：

一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，与实施例1不同之处为可溶性细胞因子为IL-21。

实施例4：

一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，包括以下步骤：

(1)将抗体通过碳二亚胺法修饰到海藻酸钠上：

将0.6g海藻酸钠溶解在MES(2-吗啉乙磺酸)溶液(0.1M MES，0.3M NaCl，pH 6.5)中，然后向溶液中加入0.38g EDC(碳二亚胺)和0.12g磺基-NHS(磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)，在25℃下持续搅拌反应24小时，随后分别加入FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28各20μg，将溶液搅拌25分钟，然后采用截留分子量为200kDa的透析膜透析3天，然后冻干获得凝胶状态的抗体修饰的海藻酸钠，整个过程中注意避光。

(2)人工抗原呈递凝胶液滴的制备：同实施例1

实施例5：

一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，包括以下步骤：

(1)将抗体通过碳二亚胺法修饰到海藻酸钠上：

将0.6g海藻酸钠溶解在MES(2-吗啉乙磺酸)溶液(0.1M MES，0.3M NaCl，pH 6.5)中，然后向溶液中加入0.38g EDC(碳二亚胺)和0.12g磺基-NHS(磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)，在30℃下持续搅拌反应20小时，随后分别加入FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28各20μg，将溶液搅拌35分钟，然后采用截留分子量为200kDa的透析膜透析3天，然后冻干获得凝胶状态的抗体修饰的海藻酸钠，整个过程中注意避光。

(2)人工抗原呈递凝胶液滴的制备：同实施例1。

对比例1：

一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，与实施例1不同之处为步骤(2)中未加入CMP。

(一)测试实验

将实施例1制备的200μLAAPGD重悬于400μL细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)中，用倒置荧光显微镜(TE2000-U，尼康，日本)观察AAPGD，如图2所示，绿色为用抗体FITC-anti-CD 3修饰的凝胶液滴，红色为用抗体PE-anti-CD28修饰的凝胶液滴。

采用荧光定量表征法比较实施例1中加入FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28后，不同搅拌时间10min、20min、30min、40min、50min制得的AAPGD上修饰的抗体蛋白的质量，如图3(A)所示，通过比较荧光强度标准曲线与AAPGD上的荧光强度，换算出AAPGD上修饰抗体蛋白的质量，随着搅拌时间的延长，FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28在凝胶液滴上修饰的质量逐渐增加，30分钟后，质量减少，30分钟时海藻酸钠表面含有5.7μgFITC-anti-CD3和6μg PE-anti-CD28。

采用荧光定量表征法比较实施例1中加入FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28总量为40μg条件下，通过控制不同质量比1∶0、0∶1、1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1，调控AAPGD上修饰的抗体蛋白的质量密度，如图3(B)所示，当只修饰FITC-anti-CD3时，AAPGD中的抗体修饰量为11.3μg，而只修饰PE-anti-CD28时为11.8μg。这可能是因为表面的抗体阻止了游离抗体继续共价偶联。这表明可以通过调整添加的FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28的质量比，调控AAPGD表面的抗体质量。

采用流式细胞术验证实施例1步骤(1)制备的抗体修饰的海藻酸钠凝胶上抗体的功能：收集1x10⁶个细胞于1.5mL的EP管中，4℃离心5min，弃上清；然后用1mL 1×PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬沉淀，加入荧光抗体(实施例1步骤(1)制备的抗体修饰的海藻酸钠)50μL，充分混合并在室温下孵育30分钟，然后用2mLPBS/BSA洗涤细胞，以400×g离心5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于2mL 1×PBS缓冲液(pH＝7.4)通过流式细胞仪获取数据。

利用FlowJo10软件分析，如图4所示，修饰了FITC-anti-CD3和PE-anti-CD28抗体的海藻酸钠可以作为荧光抗体，在流式细胞仪上显示细胞表达CD3和CD28(双阳性率为61.6％)，即海藻酸钠上的抗体可以结合细胞表面表达的CD3和CD28，说明海藻酸钠上修饰的抗体功能没有被破坏，保持其功能。

(二)有丝分裂细胞因子和CMP的旁分泌研究

分别将IL-2、IL-15、IL-21、CMP各2μg加入200μL水相(100μL 2wt％抗体修饰的海藻酸钠(实施例1制备)溶液和100μL 50mM Ca-EDTA络合物水溶液)中，采用实施例1的制备方法制成AAPGD。将包裹细胞因子的液滴重新分散到400μL细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)中。每天收集凝胶液滴和上清液。使用ELISA分别测量并记录液滴和上清液中IL-2、IL-15和IL-21的水平。将封装的CMP液滴同样分散到400μL相同的细胞培养基中，每天对液滴和上清液中的CMP进行评估。凝胶液滴和上清液中的CMP用BSA法测定。

如图5(A)和5(B)所示，凝胶液滴中的IL-2和IL-15逐渐释放到上清液(supermatant)中。第11天，凝胶液滴(gel droplet)中残留的IL-2和IL-15分别为630纳克和330纳克。IL-21的释放速度较慢，到第11天，上清液中检测到48纳克(如图5(C)所示)，大部分被包裹在凝胶液滴中。海藻酸凝胶具有复杂的阴离子网状结构，当蛋白质的分子量相似时，蛋白质从海藻酸凝胶中的释放取决于蛋白质本身的有效净电荷，电荷-电荷相互作用在这些分子的释放速度中起主导作用。IL-2(15kD)和IL-15(12.8kD)的pI分别为6.5和5.6，在pH＝7.2的溶液中带负电荷，因此释放速度较快。IL-21(16.2kD)，pI＝8.4，带正电荷，因此由于静电力的作用，释放速度较慢。CMP的pI＝8.9，带明显的正电荷，AAPGD释放CMP的速度较慢(如图5(D)所示)。

(三)利用AAPGD体外增殖T细胞实验

从黑色素瘤小鼠外周血中获得的T细胞，将1x10⁵个T细胞放入含有200μLAAPGD(实施例1制备)和1mL细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)的培养皿中。将培养皿放入培养箱中培养(37℃，5％的二氧化碳)。第1、3、5、7、9和11天收集T细胞，采用倒置荧光显微镜观察T细胞(细胞被钙黄绿素AM染色)，如图6所示，黑色素瘤小鼠外周血中的T细胞在有AAPGD存在的11天内迅速增殖。

将相同数量T细胞分别放入培养瓶(含1mL细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)中，及含有200μL 1wt％无液滴状凝胶(实施例1步骤(1)制备的抗体修饰的海藻酸钠)和1mL细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)的培养皿中，在培养箱中培养(37℃，5％的二氧化碳)，进行对比测试。利用细胞计数器，记录细胞增殖的数量，并用荧光抗体染色，5天后，含有AAPGD培养皿中的细胞增殖率明显高于培养瓶中，而使用无液滴状凝胶的培养皿中细胞增殖率与培养瓶中的细胞增殖率相似(如图7所示)。这可能是因为液滴的三维形状更有利于与细胞形成免疫突触，从而促进细胞增殖，而且液滴可以缓慢释放佐剂，这也有利于细胞增殖。

利用流式细胞术对增殖细胞的表型进行检测。黑色素瘤小鼠血液中肿瘤抗原特异性T细胞(TAS-T，CD8⁺PD-1⁺)的比例约为2％，经过11天的培养后，含有AAPGD培养皿中的T细胞中TAS-T细胞的比例明显增加，是在培养瓶中培养的4倍(如图8所示)，这意味着使用AAPGD培养的T细胞具有更好的抗癌效果。

利用流式细胞术检测增殖的TAS-T细胞的分化程度。培养11天后，含有AAPGD培养皿中的TAS-T细胞中约有82％表达CD27⁺CD28⁺(如图9(A)所示)，这表明用AAPGD培养的细胞分化程度较低，比较"年轻"，具有良好的细胞活性。采用流式细胞术对培养11天后增殖细胞中分泌颗粒酶B、穿孔素的T细胞比例进行测定(如图9(B)、图9(C)所示)，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对培养11天后T细胞分泌的干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度进行了检测(如图9(D)、图9(E)所示)。含有AAPGD培养的细胞中，上述指标均有所增加，说明增殖细胞具有良好的抗肿瘤能力。数值代表至少三次独立实验的平均值±SD(n＝5)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

(四)AAPGD促进T细胞浸润肿瘤微环境实验

为了提高ACT疗法的疗效，减少治疗所需的复杂繁琐步骤，本发明对AAPGD在体内增强T细胞向肿瘤微环境浸润的能力进行了研究。

从黑色素瘤小鼠外周血中获得的T细胞，将1x10⁵个T细胞放入含有200μLAAPGD(实施例1制备)和1mL细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)的培养皿中，将培养皿放入培养箱中培养(37℃，5％的二氧化碳)。

将相同数量T细胞放入含有200μLAAPGD(对比例1制备)和1mL细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)的培养皿中，在培养箱中培养，进行对比测试。培养9天后分别收集T细胞，利用细胞计数器，记录细胞增殖的数量。

第0天将3×10⁶个B16F10细胞皮下注射到C57BL/6小鼠体内，建立肿瘤模型。第7天，在未进行分离纯化的情况下，直接取200μL上述两种增殖9天的T细胞(1x10⁶个)与AAPGD一起皮下注射到黑瘤小鼠体内；同时分离纯化取上述含有AAPGD(实施例1制备)的细胞培养基增殖9天的T细胞(1x10⁶个)溶解在200μL 1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中皮下注射到黑瘤小鼠体内进行对比。第15天切除肿瘤并分析肿瘤微环境(TME)，将肿瘤组织切片，荧光抗体染色，免疫荧光图像显示实施例1制备的含有CMP的AAPGD增加了T细胞对肿瘤的浸润(如图10所示)，且浸润的CD3⁺CD8⁺T细胞数量是对比例1制备的不含CMP的AAPGD的4倍(如图11所示)。此外，实施例1制备的含CMP的AAPGD能显著提高肿瘤中IFN-γ的浓度(ELISA测定，如图12A所示)，肿瘤中肿瘤抗原特异性T细胞(TAS-T)的数量也大大增加(如图12B所示)。

(五)利用AAPGD治疗黑色素瘤小鼠

AAPGD被用于黑色素瘤小鼠的ACT治疗。对于实体瘤，免疫联合疗法具有优势，因此，本发明研究了AAPGD与免疫检查点抑制剂的联合疗法。使用抗PD-L1抗体作为模型佐剂。临床试验表明，高剂量的抗PD-L1抗体会导致严重的毒性。在本发明中，使用了低剂量的抗PD-L1抗体(每只小鼠50μg)。

将C57BL/6小鼠(5～6周龄，20g)随机分为两组(α组和β组)，向α组每只C57BL/6小鼠皮下注射3×10⁶个B16F10细胞，建立肿瘤模型。

7天后，从血液中分离出T细胞。将1x10⁵个T细胞放入含有200μLAAPGD(实施例1制备)和1mL细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)的培养皿中进行扩增，将培养皿放入培养箱中培养(37℃，5％的二氧化碳)。作为对比，将相同数量T细胞放入含1mL细胞培养基(RMPI-1640培养基，添加10％胎牛血清和1％硫酸青霉素-链霉素)的培养瓶中进行培养扩增。同时，分别将3×10⁶个B16F10细胞注入β组每只C57BL/6小鼠。同样，7天后，β组的黑色素瘤长大，收集上述扩增的T细胞，在未进行分离纯化的情况下，直接取200μL上述培养皿增殖7天的T细胞(1x10⁶个)皮下注射到患有黑色素瘤的β组小鼠体内；同时取200μL上述培养皿中增殖7天的T细胞(1x10⁶个)与50μg抗PD-L1混合皮下注射到患有黑色素瘤的β组小鼠体内、200μL1×PBS缓冲液(pH＝7.4)、200μL上述培养瓶(不含AAPGD培养)中增殖的T细胞(1x10⁶个)皮下注射到患有黑色素瘤的β组小鼠体内作为对照。

然后，每5天给小鼠注射一次，共注射3次，并进行观察。第12天时，切除肿瘤，将肿瘤组织切片，荧光抗体染色，如图13所示，免疫荧光图像显示实施例1制备的含有CMP的AAPGD促进了T细胞对肿瘤的浸润。第17天时小鼠肿瘤图片如图14所示，与只回输T细胞(培养瓶中不含AAPGD增殖的T细胞)相比，AAPGD+CMP+T细胞能很好地控制肿瘤的生长(如图15所示)。一些接受AAPGD+CMP+T细胞治疗的小鼠存活了35天以上(如图16所示)，第22天时，小鼠脾脏组织切片，荧光抗体染色，ELISA测量IFN-γ浓度(如图17A所示)，流式细胞术检测脾脏中CD3⁺CD8⁺T细胞的百分比(如图17B所示)，结果显示接受AAPGD+CMP+T细胞治疗的小鼠脾脏中IFN-γ和CD3⁺CD8⁺T细胞显著增加，引发了体内的免疫反应。

如图14和图15所示，AAPGD与抗PD-L1抗体联合治疗可明显抑制肿瘤生长。所有小鼠在实验中均存活(至少35天)(如图16所示)。

数值代表至少三次独立实验的平均值±SDs(n＝5)。*p<0.05，**p<0.01。

以上所述的实施例只是本发明较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (9)

1.一种多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将抗体通过碳二亚胺法修饰到海藻酸盐上，获得抗体修饰的海藻酸盐；

(2)人工抗原呈递凝胶液滴的制备：将步骤(1)制备的抗体修饰的海藻酸盐制备成凝胶液滴，同时将可溶性细胞因子和胶原模拟肽封装到凝胶液滴中，所述胶原模拟肽序列为GGYGGGPC(GPP)₅GFOGER(GPP)₅GPC，其中O为羟基脯氨酸。

2.根据权利要求1所述的多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，其特征在于，步骤(1)的修饰方法为：将海藻酸盐溶解在MES溶液中，然后向溶液中加入EDC和磺基-NHS，在25～30℃下持续搅拌反应20～24小时，随后向溶液中加入抗体，继续搅拌反应25～35分钟，透析后冻干，获得抗体修饰的海藻酸盐。

3.根据权利要求1所述的多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法为：将步骤(1)制备的抗体修饰的海藻酸盐溶于水中制备成2wt％的抗体修饰的藻酸盐溶液，然后与50mM Ca-EDTA络合物溶液、可溶性细胞因子和胶原模拟肽按质量体积比为100μL∶50μL∶1μg∶1μg混合制备成水相，将所述水相和油相均由恒流微泵驱动，进入具有疏水通道表面的PDMS液滴微流控芯片，所述油相为碳氟化合物油，在出口处收集液滴，向收集的液滴中加入醋酸，液滴凝胶化后，向油相中加入PFO溶液，将凝胶液滴从油相中分离出来，漂洗数次后获得凝胶液滴，简称AAPGD。

4.根据权利要求2所述的多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，其特征在于：所述海藻酸盐为海藻酸钠，所述MES溶液包含0.1M MES和0.3M NaCl，pH为6.5，所述透析用透析膜的截留分子量为200kDa，透析时间为3～4天。

5.根据权利要求2所述的多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，其特征在于：所述抗体与MES溶液的质量体积比为40μg∶1mL，所述抗体包括抗体FITC-anti-CD3和抗体PE-anti-CD28，抗体FITC-anti-CD3和抗体PE-anti-CD28的质量比为1∶1，所述海藻酸盐、EDC、磺基-NHS之间的质量比为30∶19∶6，所述海藻酸盐与MES溶液的质量体积比为0.6g∶1mL。

6.根据权利要求3所述的多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，其特征在于：所述水相和油相的体积比为1∶1，所述水相和油相的流速均为20μL/min。

7.根据权利要求3所述的多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，其特征在于：所述PFO溶液的体积分数为20％，所述醋酸的体积分数为0.05％，所述漂洗用pH为7.4的1×PBS缓冲液漂洗三次。

8.根据权利要求3所述的多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法，其特征在于：所述可溶性细胞因子选自IL-2、IL-15、IL-21中的一种。

9.一种权利要求1所述多功能人工抗原呈递凝胶液滴的制备方法制备的凝胶液滴在体外扩增黑色素瘤小鼠外周血T细胞中的应用。