CN115040643A - 一种肿瘤细胞-细菌融合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肿瘤细胞‑细菌融合材料及其制备方法与应用，所述肿瘤细胞‑细菌融合材料包括去除细菌壁的革兰氏阴性菌、肿瘤细胞的膜和肿瘤细胞的膜内物质。本发明创造性地将肿瘤细胞表面和内部蛋白全部作为肿瘤抗原，同时以细菌成分作为免疫佐剂，二者可以共同递送到同一抗原递呈细胞中，促进其对肿瘤抗原的摄取和呈递以及淋巴结靶向能力，同时具有提高抗原递呈细胞的成熟的效果。

Description

一种肿瘤细胞-细菌融合材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种肿瘤细胞-细菌融合材料及其制备方法与应用。
背景技术
癌症免疫疗法可通过增强人体免疫系统的免疫功能，从而靶向并杀死肿瘤细胞，成为一种有前景的癌症治疗和预防方式。用于癌症免疫治疗的传统肿瘤疫苗包括蛋白质、DNA或RNA疫苗，这些疫苗均基于已知的肿瘤相关抗原(TAAs)进行设计。然而，迄今为止已知的肿瘤相关抗原种类有限。同时，癌细胞可以通过在细胞膜上主动产生新的抗原来逃避免疫识别，从而产生免疫逃逸以延迟、减少特异性免疫攻击。因此，开发个体全抗原疫苗是有意义的。癌细胞表达多种抗原，包括用于癌症疫苗的TAAs等。然而，直接肿瘤细胞表现出较弱的免疫反应，因为肿瘤表面存在的特异性抗原含量有限且细胞表面存在的免疫抑制分子(即PDL1)会导致免疫，从而降低了免疫系统的识别能力。
对此，研究人员开发了细菌衍生的癌症疫苗，通过促进适应性免疫来增强特异性抗肿瘤反应可一定程度上解决这个问题。国家纳米科学中心聂广军等通过将大肠杆菌的细胞膜和自体肿瘤细胞膜整合到纳米颗粒表面开发了一种个体癌症疫苗，该疫苗表现出较好的肿瘤特异性免疫反应。然而，肿瘤抗原包括膜蛋白和内体细胞内容物。用膜蛋白来代表肿瘤抗原是不够的。因此开发包含全肿瘤抗原的肿瘤疫苗非常有意义。除此之外，当细菌衍生的癌症疫苗促进肿瘤特异性免疫反应时，由细菌成分引起的急性毒性反应也不容忽视。因此，同时提高免疫反应效果和改善免疫治疗的安全性有着开阔的应用前景。
除了传统的疫苗方法，得益于基因测序和基因编辑的最新进展，有效的患者特异性细胞疗法(CAR-T和树突状细胞疫苗)逐渐出现。CAR-T和树突状细胞疫苗在临床上被证明是一种安全有效的免疫治疗方法。T细胞是体内重要的免疫细胞，可以直接杀死感染细胞或癌细胞，激活免疫反应。简而言之，CAR-T疗法的本质是将嵌合抗原受体(CAR)引入T细胞，以产生特异性识别肿瘤的抗原特异性T细胞。一旦T细胞表达了这种受体，它们就可以特异性地杀死肿瘤细胞。然而，CAR-T的制备周期长，操作复杂，而且很难在表面修饰大量的抗原识别。
树突状细胞作为机体内特化的抗原提呈细胞，能够消化大量的抗原提呈到表面，激活效应T细胞，从而杀伤肿瘤。载有TAAs的树突状细胞疫苗可以在体内引发抗原特异性免疫反应，这在临床研究中已被证明是一种更安全有效的免疫治疗策略。然而，生产呈递TAAs的树突状细胞工序复杂，并且产量和质量不一，此外，树突状细胞疫苗用于患者时也受限于其严格的储存条件。
因此，如何提供一种成本低、制备方法简单、安全性高、抗肿瘤效果好的新型疫苗产品，成为了本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞-细菌融合材料及其制备方法与应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种肿瘤细胞-细菌融合材料，所述肿瘤细胞-细菌融合材料包括去除细菌壁的革兰氏阴性菌、肿瘤细胞的膜和肿瘤细胞的膜内物质。
优选地，所述去除细菌壁的革兰氏阴性菌的总蛋白量与肿瘤细胞中的总蛋白量的质量比为1:(5-20)，优选为1:(10-15)。
上述(5-20)中的具体数值例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。
上述(10-15)中的具体数值例如10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15等。
优选地，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、变形杆菌或不动杆菌中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如大肠杆菌和肺炎杆菌的组合、肺炎杆菌和布氏杆菌的组合、变形杆菌和不动杆菌的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述肿瘤包括黑色素癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、肾细胞癌、胰腺癌、卵巢癌或食道癌的任意一种或至少两种组合，所述至少两种的组合例如黑色素癌和乳腺癌的组合、结肠癌和肝癌的组合、胰腺癌和卵巢癌的组合等，其他任意的组合方式均可。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的肿瘤细胞-细菌融合材料的制备方法，所述方法包括：将去除细菌壁的革兰氏阴性菌与肿瘤细胞混合，超声，即得。
优选地，所述混合还包括与缓冲溶液混合，所述缓冲溶液包括Tris-HCl溶液或PBS溶液。
优选地，所述Tris-HCl溶液的浓度为20-200mM，例如20mM、50mM、75mM、100mM、120mM、150mM、180mM、200mM等。
优选地，所述缓冲液中可以加入一种或两种以上蛋白酶抑制剂。
优选地，所述超声在0-45℃下进行，超声时间为5-15min，超声功率为100-500W。
上述0-45℃中的具体数值例如0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃等。
上述5-15min中的具体数值例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，所述超声后还包括离心。
优选地，所述离心包括将超声后的溶液于800-1500rpm离心5-15min后，收集上清，于10000-16000rpm离心20-40min，收集沉淀。
优选地，所述离心的温度为0-8℃。
优选地，所述肿瘤细胞-细菌融合材料的制备方法包括：将去除细菌壁的革兰氏阴性菌、肿瘤细胞与缓冲溶液混合，于0-45℃，100-500W下超声5-15min，将超声后的溶液于800-1500rpm离心5-15min后，收集上清，于10000-16000rpm离心20-40min，收集沉淀，即得。
优选地，所述去除细菌壁的革兰氏阴性菌的制备方法包括：将革兰氏阴性菌与溶菌酶混合，在30-40℃下孵育20-60min，即得。
上述30-40℃中的具体数值例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
上述20-60min中的具体数值例如20min、22min、25min、28min、30min、32min、35min、38min、40min、42min、45min、48min、50min、52min、55min、58min、60min等。
优选地，所述混合还包括与缓冲液混合，所述缓冲溶液包括Tris-HCl溶液或PBS溶液。
优选地，在去除细菌壁的革兰氏阴性菌的制备方法中，所述缓冲液中还包括葡萄糖和EDTA 2Na。
优选地，所述葡萄糖的质量百分含量为0.1-2％。
优选地，所述EDTA 2Na的浓度为1-10mM。
优选地，在去除细菌壁的革兰氏阴性菌的制备方法中，所述孵育后还包括离心，收集沉淀，所述离心的速度为2000-5000rpm，时间为10-30min，温度为0-8℃。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的肿瘤细胞-细菌融合材料在制备增强机体免疫功能的药物、抗肿瘤药物、促进抗原呈递细胞对肿瘤抗原进行摄取和呈递的药物或促进树突状细胞成熟的药物中的应用。
所述增强机体免疫功能包括增强机体先天性免疫和/或特异性免疫应答，所述药物包括疫苗，例如树突状细胞疫苗等。
所述肿瘤细胞-细菌融合材料可以促进树突状细胞分泌促炎细胞因子，因此本发明还提供如第一方面所述的肿瘤细胞-细菌融合材料在制备促进树突状细胞分泌促炎细胞因子的药物中的应用。
所述肿瘤细胞-细菌融合材料可以促进脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，因此本发明还提供如第一方面所述的肿瘤细胞-细菌融合材料在制备促进脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的药物中的应用。
所述肿瘤细胞-细菌融合材料可以刺激全身免疫系统分泌炎症因子和趋化因子，因此本发明还提供如第一方面所述的肿瘤细胞-细菌融合材料在制备刺激全身免疫系统分泌炎症因子和趋化因子的药物中的应用。
第四方面，本发明提供一种负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包括树突状细胞或单核吞噬细胞。
优选地，所述负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞由包括如下步骤的方法制备得到：
(1)从外周血或骨髓中获取抗原呈递细胞；
(2)将抗原呈递细胞、细胞培养基与第一方面所述的肿瘤细胞-细菌融合材料混合，孵育，即得。
优选地，所述细胞培养基包括葡萄糖和/或胎牛血清。
优选地，所述细胞培养基包括0.3-2g/L的葡萄糖和质量百分含量为0-2％的胎牛血清。
优选地，所述孵育在25-40℃下进行，孵育时间为12-72h。
上述0.3-2g/L中的具体数值例如0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.7g/L、2g/L等。
上述0-2％中的具体数值例如0、0.001％、0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％等。
优选地，所述孵育在25-40℃下进行，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，孵育时间为12-72h，例如12h、15h、17h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、32h、34h、36h、40h、45h、50h、58h、65h、72h等。
优选地，所述负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)从外周血或骨髓中获取抗原呈递细胞；
将去除细菌壁的革兰氏阴性菌、肿瘤细胞与缓冲溶液混合，于0-45℃，100-500W下超声5-15min，将超声后的溶液于800-1500rpm离心5-15min后，收集上清，于10000-16000rpm离心20-40min，收集沉淀，得肿瘤细胞-细菌融合材料；
(2)将抗原呈递细胞、细胞培养基与肿瘤细胞-细菌融合材料混合，在25-40℃下孵育时间为12-72h，即得；
所述细胞培养基包括0.3-2g/L的葡萄糖和质量百分含量为0-2％的胎牛血清。
优选地，所述负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞为负载肿瘤抗原的树突状细胞，所述负载肿瘤抗原的树突状细胞是一种高度成熟并负载全肿瘤抗原(包括肿瘤细胞膜上及膜内的抗原)的树突状细胞。
第五方面，本发明提供如第四方面所述的负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞在制备增强机体免疫功能的药物或抗肿瘤药物中的应用。
所述增强机体免疫功能包括增强机体先天性免疫和/或特异性免疫应答，所述药物包括疫苗，例如树突状细胞疫苗等。
第六方面，本发明提供一种纳米树突状细胞疫苗，所述纳米树突状细胞疫苗的制备原料包括如第四方面所述的负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞和纳米材料，其中所述抗原呈递细胞为树突状细胞。
所述纳米树突状细胞疫苗以负载肿瘤抗原的树突状细胞的细胞膜为外壳，内核物质包括纳米材料。
所述内核物质还包括制备负载肿瘤抗原的树突状细胞的过程中产生的细胞因子混合物、白介素2(IL2)、免疫检查点抑制剂、SOCS1抑制剂或siRNA中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述纳米材料包括PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、PLGA-PEG(聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇共聚物)、PLGA-PEI(聚乳酸-羟基乙酸-聚醚酰亚胺共聚物)、MOF(金属有机框架材料)、PCL(聚己内酯)、PAMAM(聚酰胺-胺型树枝状高分子)、碳纳米管、石墨烯、金纳米颗粒、介孔二氧化硅纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒或叶酸-铁自组装纳米颗粒中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如PLGA和PLGA-PEG的组合、石墨烯和金纳米颗粒的组合、氧化铁纳米颗粒和叶酸-铁自组装纳米颗粒的组合等，其他任意的组合方式均可。
第七方面，本发明提供如第六方面所述的纳米树突状细胞疫苗的制备方法，所述方法包括：提取负载肿瘤抗原的树突状细胞的细胞膜，与纳米材料混合，即得。
优选地，所述负载肿瘤抗原的树突状细胞的细胞膜与纳米材料的质量比为1:(0.5-10)。
上述(0.5-10)中的具体数值例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10等。
优选地，在纳米树突状细胞疫苗的制备方法中，所述混合的温度为0-45℃，例如0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃等，混合的时间为2-20min，例如2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min等。
优选地，所述纳米树突状细胞疫苗的制备方法包括：
(1)提取负载肿瘤抗原的树突状细胞的细胞膜；
(2)将步骤(1)提取的细胞膜与纳米材料在0-45℃下混合2-20min，并使用冰浴超声或者脂质体挤出器挤出，得到纳米树突状细胞疫苗。
第八方面，本发明提供如第六方面所述的纳米树突状细胞疫苗在制备增强机体免疫功能的药物或抗肿瘤药物中的应用。
所述增强机体免疫功能包括增强机体先天性免疫和/或特异性免疫应答。
优选地，本发明所涉及的叶酸-铁自组装纳米颗粒由叶酸和二价铁通过配位作用自组装得到。
优选地，所述叶酸-铁自组装纳米颗粒由包括如下步骤的方法制备得到：将叶酸、亚铁盐和溶剂混合，得混合液，加热，即得。
优选地，所述亚铁盐包括硫酸亚铁。
优选地，所述溶剂包括二甲基甲酰胺(DMF)。
优选地，所述叶酸与亚铁盐的摩尔比为1:(2-8)。
上述(2-8)中的具体数值例如2、3、4、5、6、7、8等。
优选地，所述混合液中叶酸的浓度为0.5-2mM，例如0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2mM等。
优选地，所述加热的温度为90-120℃，时间为1-10h。
上述90-120℃中的具体数值例如90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃等。
上述1-10h中的具体数值例如1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h等。
所述叶酸-铁自组装纳米颗粒可用于制备增强机体免疫功能的药物或抗肿瘤药物。
所述增强机体免疫功能包括增强机体先天性免疫和/或特异性免疫应答。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明创造性地提供一种肿瘤细胞-细菌融合材料，其包括去除细菌壁的革兰氏阴性菌、肿瘤细胞的膜外壳和膜内物质。本发明创造性地将肿瘤细胞表面和内部蛋白全部作为肿瘤抗原，同时以细菌成分作为免疫佐剂，二者可以共同递送到同一抗原递呈细胞中，促进其对肿瘤抗原的摄取和呈递以及淋巴结靶向能力，进而增强机体的天然免疫、特异性免疫，及抗肿瘤能力，可用于制备增强机体免疫能力(包括先天性免疫和/或特异性免疫应答)的药物或抗肿瘤的药物。此外所述肿瘤细胞-细菌融合材料还具有显著的促进树突状细胞成熟的效果。
由所述肿瘤细胞-细菌融合材料制得的药物(如疫苗)，与现有技术中其他疫苗相比，包含更全面的肿瘤抗原，并包含细菌成分这种良好的免疫佐剂，更好地促进了抗原递呈细胞对肿瘤内部抗原的摄取和呈递能力、显著地增强了机体的天然免疫和特异性免疫能力，以及抗肿瘤的能力。
而且，所述肿瘤细胞-细菌融合材料的制备原料易得，制备成本低，制备方法简单，适用范围广，可根据实际需要在药物表面修饰各种化学基团，具有广阔的应用前景。
此外，所述肿瘤细胞-细菌融合材料显著促进了树突状细胞成熟，因此可用于制备促进树突状细胞成熟的药物中。
(2)本发明创造性地提供一种负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞由肿瘤细胞-细菌融合材料孵育得到，经此处理得到的抗原呈递细胞中包含更全面的肿瘤抗原，并包含细菌成分这种良好的免疫佐剂，显著增强了抗原递呈细胞对肿瘤内部抗原的摄取和呈递能力。
具体地，本发明提供一种高度成熟并负载全肿瘤抗原的树突状细胞，所述高度成熟并负载全肿瘤抗原的树突状细胞经肿瘤细胞-细菌融合材料处理并在低糖低血清或低糖无血清条件下培养得到，肿瘤细胞-细菌融合材料的处理显著促进了树突状细胞成熟、抗原呈递的能力及淋巴结靶向能力的提高。此外，本发明创造性地发现，与正常培养条件相比，使用低糖低血清或低糖无血清的培养条件对于树突状细胞成熟、抗原呈递的能力及淋巴结靶向能力的提高起到显著的促进作用。
(3)本发明创造性地提供一种纳米树突状细胞疫苗，其以上述高度成熟并负载全肿瘤抗原的树突状细胞的膜为外壳，以纳米颗粒作为内核材料，内核材料能够帮助维持膜的刚性结构和稳定性，进而维持膜的免疫增强、淋巴富集的功效；同时可以进一步包载其他生物活性成分例如siRNA或细胞因子等，从而实现更多的功能。
而且，由于肿瘤细胞-细菌融合材料中包含肿瘤细胞表面和内部蛋白，同时以细菌成分作为免疫佐剂，因此由其处理得到的树突状细胞的膜上含有全面的肿瘤细胞抗原及细菌成分，即，制得的纳米树突状细胞疫苗包含全面的肿瘤细胞抗原信息及良好的免疫佐剂，因而显著地提高了其增强机体的天然免疫和特异性免疫以及抗肿瘤的能力。
(4)本发明所涉及的叶酸-铁纳米颗粒为发明人首次合成，创造性地将内源性小分子(叶酸)和铁离子作为原料制备出尺寸均一的纳米颗粒，由于叶酸与铁元素均为人体内源性物质，因此此纳米颗粒以及由其制得的纳米树突状细胞疫苗的安全性非常好，而且分析实验结果发现叶酸-铁纳米颗粒本身就可以降低肿瘤微环境中的Treg细胞，这个结果说明叶酸-铁纳米颗粒在一定程度上可以进一步提高抗肿瘤免疫能力，此优势并不是其他纳米颗粒所普遍具备的，而且所述叶酸-铁纳米颗粒的制备工艺简单，原料易得，可大规模生产。
(5)本发明所涉及的纳米树突状细胞疫苗极大程度上提高了树突状细胞疫苗的成熟度和负载抗原的能力；获得的树突状细胞疫苗细胞膜提取工艺简单，易存储；本发明使用的纳米颗粒可以是2nm-1000nm的任意纳米颗粒，如PLGA等，或者生物分子自组装纳米颗粒，制备简单，成本低，生物安全性高；且由此制备的纳米树突状细胞疫苗保留了树突状细胞的淋巴结靶向和特异性免疫反应的能力，达到了显著的抗肿瘤效果，为更加广泛和便捷的临床试验提供了前期技术基础，而且可根据实际需要在疫苗表面修饰各种化学基团，具有广阔的应用前景。
(6)本发明开发了一种高效、稳定的纳米树突状细胞疫苗及其生产方法。首先，本发明合成了一种基于细菌和肿瘤细胞成分的融合生物材料，它对从小鼠中提取的树突状细胞中表现出很强的刺激能力。同时基于改变体外刺激条件(低糖、低血清或无血清)，本发明可进一步提高BM树突状细胞的成熟度和递呈抗原的能力。然后本发明提取体外产生的树突状细胞疫苗的细胞膜，该细胞膜可低温保存。基于生物小分子为基础的自组装纳米粒子在生物医学中发挥着广泛的作用，本发明下一步开发了一种新的生物分子自组装纳米颗粒来支撑BM树突状细胞细胞膜。该工程策略中，本发明重点强调了提高癌症免疫治疗的有效性和安全性。本发明认为，该基于生物材料的免疫策略为个性化免疫治疗和精准医疗提供了广阔的应用前景。
综上，本发明提供了一种肿瘤细胞-细菌融合材料及其制备方法与应用，所述肿瘤细胞-细菌融合材料包括去除细菌壁的革兰氏阴性菌、肿瘤细胞的膜和肿瘤细胞的膜内物质。本发明创造性地将肿瘤细胞表面和内部蛋白全部作为肿瘤抗原，同时以细菌成分作为免疫佐剂，二者可以共同递送到同一抗原递呈细胞中，促进其对肿瘤内部抗原的摄取和呈递以及淋巴结靶向能力，同时控制低糖或低血清(或无血清)的培养条件可进一步提高抗原递呈细胞的成熟、抗原处理和递呈以及淋巴结靶向能力；以上制备得到的抗原递呈细胞的细胞膜包覆在纳米颗粒表面得到了高成熟、高抗原递呈以及高淋巴结靶向的纳米DC疫苗，该疫苗增强机体的天然免疫和特异性免疫，具有显著的抗肿瘤效果。
附图说明
图1是实施例1得到的原生质体、细菌纳米颗粒及肿瘤细胞-细菌融合材料的透射电镜表征结果图；
图2是实施例1得到的细菌纳米颗粒、肿瘤超声碎片及肿瘤细胞-细菌融合材料的蛋白浓度对比结果图；
图3是实施例2中低糖低血清处理对肿瘤细胞-细菌融合材料促进树突状细胞成熟和抗原呈递的能力的流式分析结果图；
图4是实施例2中无血清处理对肿瘤细胞-细菌融合材料促进树突状细胞成熟和抗原呈递的能力的流式分析结果图；
图5是实施例3制得的叶酸-铁自组装纳米颗粒的扫描电镜表征结果图；
图6是实施例3制得的叶酸-铁自组装纳米颗粒及实施例4制备的纳米树突状细胞疫苗的透射电镜表征结果图；
图7是实施例3制得的叶酸-铁自组装纳米颗粒及实施例4制备的纳米树突状细胞疫苗的粒径和Zeta电位表征结果图；
图8是实施例5中各处理组的淋巴结靶向评估结果对比图；
图9是实施例6中各处理组的抑制肿瘤转移效果结果对比图；
图10是实施例6中各组小鼠肺部H&E切片图；
图11是实施例7的PLGA纳米颗粒及PLGA-纳米DC疫苗的透射电镜表征结果图；
图12是实施例7的PLGA纳米颗粒及PLGA-纳米DC疫苗的粒径和Zeta电位表征结果图；
图13是实施例8纳米树突状细胞疫苗的安全性验证实验的各组小鼠器官组织切片的H&E染色结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1
制备肿瘤细胞-细菌融合材料
大肠杆菌(BL21 CondonPlus(DE3)-RIL，购自艾博森生物)，以0.1％的接种量接种于LB培养基，在37℃，180rpm条件下培养18h，得菌液。取15mL菌液，于4℃，3000rpm离心10min。倒掉上清后，将沉淀分散在50mM Tris-HCl缓冲液中，再次离心进行一次洗涤，倒掉上清后，将大肠杆菌沉淀分散在溶菌酶溶液(含有4mg/mL溶菌酶、0.9％葡萄糖、2mM EDTA2Na的50mM Tris-HCl缓冲液)中，在37℃恒温摇床中，于180rpm条件下孵育30min，于4℃，3000rpm离心20min，收集沉淀，此步骤完成细胞壁的去除，得到原生质体，将沉淀用Tris-HCl缓冲液洗涤后，进行TEM(透射电镜)表征，结果见图1A。
将包含1mg蛋白量的原生质体添加到15mL 50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)中，使用超声破碎仪超声破碎10min(300W，超声间隔为2S/2S)。超声后的溶液先在4℃，1000rpm条件下离心10min后，取上清再次在4℃，13000rpm条件下离心25min，收集沉淀，用50mM Tris-HCl缓冲溶液离心洗涤后，重悬在1mL的50mM Tris-HCl缓冲液，得到不含肿瘤细胞成分的细菌纳米颗粒，TEM表征结果见图1B。
将包含1mg蛋白量的原生质体和包含10mg蛋白量的B16-OVA肿瘤细胞添加到15mL50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，使用超声破碎仪超声破碎10min(300W，超声间隔为2S/2S)，超声后的溶液先在4℃，1000rpm条件下离心10min后，取上清再次在4℃，13000rpm条件下离心25min，收集沉淀，用50mM Tris-HCl缓冲溶液离心洗涤后，重悬在1mL的50mMTris-HCl缓冲液，得到B16-OVA肿瘤细胞-细菌融合材料，进行TEM表征，结果见图1C。
将包含1mg蛋白量的原生质体和包含10mg蛋白量的4T1肿瘤细胞添加到15mL 50mMTris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，使用超声破碎仪超声破碎10min(300W，超声间隔为2S/2S)，超声后的溶液先在4℃，1000rpm条件下离心10min后，取上清再次在4℃，13000rpm条件下离心25min，收集沉淀，用50mM Tris-HCl缓冲溶液离心洗涤后，重悬在1mL的50mM Tris-HCl缓冲液，得到4T1肿瘤细胞-细菌融合材料，进行TEM表征，结果见图1D。
将包含1mg蛋白量的原生质体和包含10mg蛋白量的CT26肿瘤细胞添加到15mL50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，使用超声破碎仪超声破碎10min(300W，超声间隔为2S/2S)，超声后的溶液先在4℃，1000rpm条件下离心10min后，取上清再次在4℃，13000rpm条件下离心25min，收集沉淀，用50mM Tris-HCl缓冲溶液离心洗涤后，重悬在1mL的50mMTris-HCl缓冲液，得到CT26肿瘤细胞-细菌融合材料，进行TEM表征，结果见图1E。
肿瘤超声碎片(UltraT)的制备方法：将包含10mg蛋白量的B16-OVA肿瘤细胞添加到15mL 50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，使用超声破碎仪超声破碎10min(300W，超声间隔为2S/2S)，超声后的溶液先在4℃，1000rpm条件下离心10min后，取上清再次在4℃，13000rpm条件下离心25min，收集沉淀，用50mM Tris-HCl缓冲溶液离心洗涤后，重悬在1mL的50mM Tris-HCl缓冲液，得到UltraT。
测定得到的细菌纳米颗粒(nanoE)、肿瘤超声碎片(UltraT)、B16-OVA肿瘤细胞-细菌融合材料(nanoET)的蛋白浓度，并计算细菌纳米颗粒(nanoE)与肿瘤超声碎片(UltraT)蛋白浓度的加和，结果如图2所示，nanoET的蛋白浓度显著高于nanoE与UltraT蛋白浓度的加和，充分证明了nanoET成功包载了肿瘤细胞的成分。
实施例2
探究肿瘤细胞-细菌融合材料的促进树突状细胞成熟和抗原呈递的能力
利用传统方法从C57小鼠骨髓或者外周血中提取BMDC(Bone Marrow-DerivedDendritic Cells,BMDC)，使用低糖低血清的细胞培养基(1％FBS，0.5g/L葡萄糖，其他成分与常规培养基相同)对BMDC进行0h-24h的预处理，优化预处理时间为24h，同时使用常规1640培养基(10％FBS，2g/L葡萄糖)作为对照。具体方法为：将蛋白量为5μg的实施例1中制备的nanoE、UltraT、nanoET以及1mL 50mM Tris-HCl缓冲液(CON组)分别加入上述两种细胞培养基中，37℃下培养刺激BMDC，24h后收取细胞，利用CD11C、CD40、CD80、CD86、H-2kbbound to SIINIKLE及CD197对细胞进行染色分析后，利用流式细胞仪检测各组细胞表达的上述标志物水平，以评估树突状细胞的成熟程度(CD11C、CD40、CD80、CD86)、抗原递呈能力(H-2kb bound to SIINIKLE)及归巢到淋巴结的能力(CD197)，结果见图3。
除此以外，我们也使用低糖无血清的细胞培养基(0％FBS，2g/L葡萄糖，其他成分与常规培养基相同)与常规1640培养基(10％FBS，2g/L葡萄糖)进行对比，具体方法同上，结果见图4。
结果显示，与其他处理组相比，经肿瘤细胞-细菌融合材料处理的BMDC对于各标志物的表达水平显著高于其他处理组，说明肿瘤细胞-细菌融合材料显著促进了树突状细胞成熟、抗原呈递的能力及归巢能力的提高。此外，本发明意外地发现，在肿瘤细胞-细菌融合材料处理的前提下，与正常培养条件相比，使用低糖低血清或低糖无血清的培养条件对于树突状细胞成熟、抗原呈递的能力及淋巴结靶向能力的进一步提高起到显著的促进作用。
实施例3
制备叶酸-铁自组装纳米颗粒
首先配置含10mM叶酸的DMF(二甲基甲酰胺)溶液作为叶酸母液，配置含20mM硫酸亚铁的DMF溶液作为硫酸亚铁母液，取叶酸母液500μL和硫酸亚铁母液500μL进行混合，添加DMF使得总体积为5mL。将混合溶液在搅拌下逐渐升温至95℃，在95℃条件下反应3h后停止加热，待反应体系冷却至室温(25℃)后，将得到的纳米颗粒溶液进行离心洗涤，利用扫描电镜进行形貌表征，结果见图5。
结果显示，制得的叶酸-铁自组装纳米颗粒形貌良好，尺寸均匀。
实施例4
制备纳米树突状细胞疫苗
将实施例2中由nanoET组处理得到的BMDC分散在纯水中，0℃，150w水浴超声2min后，首先1000rpm离心10min去除沉淀后将上清进行12000rpm离心20min，得到树突状细胞膜。将树突状细胞膜和叶酸-铁自组装纳米颗粒以质量比1:1混合，超声(30w、16℃、5min)后，纯水离心洗涤(10000rpm,10min)即得纳米树突状细胞疫苗。
利用透射电镜对叶酸-铁自组装纳米颗粒及纳米树突状细胞疫苗进行形貌表征，结果见图6，其中A为叶酸-铁自组装纳米颗粒的结果，B为纳米树突状细胞疫苗的结果。利用Zeta电位分析仪对叶酸-铁自组装纳米颗粒及纳米树突状细胞疫苗的粒径和Zeta电位表征，结果见图7。
由图6和图7的结果可知，叶酸-铁自组装纳米颗粒的粒径约为122nm，Zeta电位为正，包被了BMDC细胞膜后制得的纳米树突状细胞疫苗的尺寸增加到141nm，电位由正转为负。此结果充分证实了BMDC细胞膜对叶酸-铁自组装纳米颗粒的包被，证明了纳米树突状细胞疫苗的成功制备。
实施例5
对实施例4得到的纳米树突状细胞疫苗进行体内成像考察
设置四组实验，分别为CON组、FITC组、未处理纳米DC组和纳米DC疫苗组，各组处理方法如下：
CON组(Ⅰ)：将100μL的生理盐水皮下注射于C57小鼠中。
FITC组(Ⅱ)：将20μg FITC分散在100μL的生理盐水中，皮下注射于C57小鼠中。
未处理纳米DC组(Ⅲ)：将1mg叶酸-铁自组装纳米颗粒与50μg FITC充分混合并负载FITC后，得到标记了FITC的叶酸-铁纳米颗粒(实验测定FITC的包封率为80％)。取0.5mg标记了FITC的叶酸-铁纳米颗粒与等量的未处理BMDC的细胞膜(未处理BMDC是指：利用传统方法提取BMDC后不经任何处理，其细胞膜的提取方法参照实施例4)进行超声混合5min，10000rpm离心洗涤三次，每次5min，得到未处理纳米DC，重悬在100μL的生理盐水中，皮下注射于C57小鼠中。
纳米DC疫苗组(Ⅳ)：其与上述未处理纳米DC组的处理方法的区别仅在于将“等量的未处理的BMDC”替换为“等量的实施例2中由nanoET组处理得到的BMDC”，其他条件参照未处理纳米DC组的处理方法。
皮下注射24h后取小鼠的淋巴结进行成像，各组结果见图8，A为各组小鼠不同器官中荧光强度的结果，a为心脏、b为肺、c为肝脏、d为肾、e为脾脏、f为淋巴结，B为各组小鼠的淋巴结中荧光强度的差异对比结果。
由图8中A可知，纳米DC疫苗组小鼠的淋巴结内荧光强度显著高于其他器官，由图8中B可知，纳米DC疫苗组小鼠的淋巴结内荧光强度显著高于其他处理组，证明了本发明经由肿瘤细胞-细菌融合材料处理及低糖低血清(或低糖无血清)培养条件制得的纳米树突状细胞疫苗具有优异的淋巴结靶向的能力，为其增强机体的免疫功能及抗肿瘤功效的发挥奠定了基础。
实施例6
利用实施例4得到的纳米树突状细胞疫苗进行抗肿瘤治疗
通过尾静脉在C57小鼠血液中注射20万个B16-OVA肿瘤细胞，两天后开始实验，将小鼠随机分成四组，分别为Ⅰ(空白组)、Ⅱ(叶酸-铁纳米颗粒组)、Ⅲ(未处理纳米DC组)、Ⅳ(纳米DC疫苗组)，各组分别于开始实验第二天和第九天皮下注射生理盐水、叶酸-铁自组装纳米颗粒(每只鼠100μg)、未处理纳米DC(每只鼠20μg蛋白量)和纳米DC疫苗(每只鼠20μg蛋白量)。17天后，将小鼠解剖，将肺部组织取出并拍照、称重，结果见图9，图10展示了肺部切片H&E染色的典型代表图片。
由图9和图10的结果可知，与其他处理组相比，纳米DC疫苗组小鼠肺部的转移灶的显著降低，及由此导致的肺部组织重量的降低，肺部H&E切片染色组织正常化均充分证实了本发明的纳米树突状细胞疫苗在抗肿瘤转移中的巨大潜力。
实施例7
制备PLGA-纳米DC疫苗
首先，制备PLGA纳米颗粒：称取10mg PLGA(购自济南岱罡，PLGA 75:25，分子量15000)溶解在1ml的二氯甲烷中，加入200μL的超纯水，探头超声(15℃，100w，5min)后，将之分散到2mL 2％胆酸钠水溶液中，再次探头超声(15℃，115w，5min)后，将其分散到10mL的0.6％胆酸钠溶液中，搅拌(300rpm,25℃)15min。12000rpm离心10min后，收集沉淀，纯水重悬后，再同样条件离心洗涤两遍即可得到PLGA纳米颗粒。
将PLGA纳米颗粒与实施例4中制备的树突状细胞膜混合，将混合溶液利用脂质体挤出器来回挤出11次后，收集纳米颗粒溶液，12000rpm离心10min后，收集沉淀，纯水重悬后，同样条件离心洗涤两遍即可得到PLGA-纳米DC疫苗。
利用透射电镜对PLGA纳米颗粒及PLGA-纳米DC疫苗进行形貌表征，结果见图11，其中A为PLGA纳米颗粒的结果，B为PLGA-纳米DC细胞疫苗的结果。利用Zeta电位分析仪对PLGA纳米颗粒及PLGA-纳米DC细胞疫苗的粒径和Zeta电位表征，结果见图12。
由图11和图12的结果可知，PLGA纳米颗粒的粒径约为58.8nm，Zeta电位为-40.4mV，包被了BMDC细胞膜后制得的纳米树突状细胞疫苗的尺寸增加到61.8nm，电位转变为-15mV。此结果充分证实了BMDC细胞膜对PLGA纳米颗粒的包被，证明了纳米树突状细胞疫苗的成功制备。
实施例8
叶酸-铁纳米颗粒及纳米树突状细胞疫苗的安全性验证
将C57小鼠随机分成四组，分别为Ⅰ(空白组)、Ⅱ(叶酸-铁纳米颗粒组)、Ⅲ(未处理纳米DC组)、Ⅳ(纳米DC疫苗组)，第一天、第四天、第七天和第十天将各组分别于皮下注射生理盐水、叶酸-铁自组装纳米颗粒(每只鼠100μg)、未处理纳米DC(每只鼠20μg蛋白量)和纳米DC疫苗(每只鼠20μg蛋白量)。第十三天，将小鼠解剖，将心、肝、脾、肺和肾部组织取出，图13展示了各器官切片H&E染色的典型代表图片。
由图13的结果可知，与空白组相比，其他处理组器官H&E染色均无异常，该结果充分证实了本发明的叶酸-铁自组装纳米颗粒、纳米树突状细胞疫苗的安全性好。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种肿瘤细胞-细菌融合材料及其制备方法与应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种肿瘤细胞-细菌融合材料，其特征在于，所述肿瘤细胞-细菌融合材料包括去除细菌壁的革兰氏阴性菌、肿瘤细胞的膜和肿瘤细胞的膜内物质。
2.如权利要求1所述的肿瘤细胞-细菌融合材料，其特征在于，所述去除细菌壁的革兰氏阴性菌的总蛋白量与肿瘤细胞中的总蛋白量的质量比为1:(5-20)，优选为1:(10-15)；
优选地，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、变形杆菌或不动杆菌中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述肿瘤包括黑色素癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、肾细胞癌、胰腺癌、卵巢癌或食道癌的任意一种或至少两种组合。
3.如权利要求1或2所述的肿瘤细胞-细菌融合材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将去除细菌壁的革兰氏阴性菌与肿瘤细胞混合，超声，即得。
4.如权利要求1或2所述的肿瘤细胞-细菌融合材料在制备增强机体免疫功能的药物、抗肿瘤药物、促进抗原呈递细胞对肿瘤抗原进行摄取和呈递的药物或促进树突状细胞成熟的药物中的应用。
5.一种负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞，其特征在于，所述抗原呈递细胞包括树突状细胞或单核吞噬细胞；
优选地，所述负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞由包括如下步骤的方法制备得到：
(1)从外周血或骨髓中获取抗原呈递细胞；
(2)将抗原呈递细胞、细胞培养基与权利要求1或2所述的肿瘤细胞-细菌融合材料混合，孵育，即得。
6.如权利要求5所述的负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞，其特征在于，所述细胞培养基包括葡萄糖和/或胎牛血清；
优选地，所述细胞培养基包括0.3-2g/L的葡萄糖和质量百分含量为0-2％的胎牛血清；
优选地，所述孵育在25-40℃下进行，孵育时间为12-72h。
7.如权利要求5或6所述的负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞在制备增强机体免疫功能的药物或抗肿瘤药物中的应用。
8.一种纳米树突状细胞疫苗，其特征在于，所述纳米树突状细胞疫苗的制备原料包括如权利要求5或6所述的负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞和纳米材料，其中所述抗原呈递细胞为树突状细胞。
9.如权利要求8所述的纳米树突状细胞疫苗，其特征在于，所述纳米材料包括PLGA、PLGA-PEG、PLGA-PEI、MOF、PCL、PAMAM、碳纳米管、石墨烯、金纳米颗粒、介孔二氧化硅纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒或叶酸-铁自组装纳米颗粒中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述叶酸-铁自组装纳米颗粒由包括如下步骤的方法制备得到：
将叶酸、亚铁盐和溶剂混合，得混合液，加热，即得；
优选地，所述亚铁盐包括硫酸亚铁；
优选地，所述溶剂包括二甲基甲酰胺；
优选地，所述叶酸与亚铁盐的摩尔比为1:(2-8)；
优选地，所述加热的温度为90-120℃，时间为1-10h。
10.如权利要求8或9所述的纳米树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：提取负载肿瘤抗原的树突状细胞的细胞膜，与纳米材料混合，即得。
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