CN115252769A - 一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗的构建及作为肿瘤疫苗的应用 - Google Patents

一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗的构建及作为肿瘤疫苗的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于蛋白‑金属离子的抗原肽纳米疫苗，所述纳米疫苗是蛋白‑金属离子复合纳米粒子负载抗原肽形成的纳米疫苗；所述金属离子是镁离子或锌离子，镁离子或锌离子分别来源于氯化镁或氯化锌；所述蛋白包括人血红蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白中的至少一种；所述抗原包括肿瘤相关抗原和新抗原。

Description

一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗的构建及作为肿 瘤疫苗的应用
技术领域
本发明涉及生物医学及生物工程领域，具体涉及一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗的构建及作为肿瘤疫苗的应用。
背景技术
临床肿瘤治疗过程中，肿瘤免疫治疗具有特异性强、副作用小的优点，是肿瘤治疗极具发展前景的方式之一。目前，已经有包括免疫检查点抑制剂治疗、过继性细胞免疫治疗、癌症疫苗等肿瘤免疫治疗方法。随着新一代基因测序和生物信息学的发展，个体识别肿瘤新抗原成为可能，个体化新抗原疫苗已开始在小规模早期临床试验中取得良好疗效。尽管如此，肿瘤的个体化新抗原免疫治疗依然面临严峻的挑战，如新抗原淋巴归巢能力差、递呈效率低、抗原免疫原性弱等。
近几十年来，在抗肿瘤免疫治疗领域，纳米技术也逐渐成为人们关注的焦点。利用纳米载体负载免疫治疗药物，可以改善药物的溶解性，提高药物的体内循环时间。同时，纳米载体及淋巴器官的结构特点使得纳米粒子更容易集中于淋巴结、脾脏等免疫器官中。通过纳米载体负载新抗原，能够更加精准的将新抗原递送到树突状细胞(DC细胞)、T淋巴细胞(T细胞)等免疫细胞。
肿瘤疫苗是在抗原呈递细胞(APCs)的存在下，通过识别肿瘤抗原刺激体内T细胞从而诱导持续而强大的免疫应答以预防和治疗癌症，是一种极具免疫治疗潜力的新策略。肿瘤疫苗的活性成分包括递送载体、肿瘤抗原、免疫佐剂和制剂四种成分。因此，有效提高抗原的免疫原性和佐剂的激活作用是疫苗研发的两个主要策略。
无机佐剂铝、单磷酰脂质A(MPL)和角鲨烯水包油乳液(MF59)是目前增强疫苗候选者免疫原性使用最广泛的疫苗佐剂，但是游离的抗原和佐剂进入人体后，靶向不同的APCs，导致佐剂不能有效对抗癌细胞，细胞内抗原的免疫原性无法有效扩大。同时，淋巴结的尺寸限制使得疫苗无法精准递送至免疫细胞或淋巴组织。
因此，将抗原和佐剂同时负载在功能性纳米材料中可以获得独特的优势。迄今为止，绝大部分纳米材料通过共价连接、静电作用或交联剂等方法载带抗原，促进免疫细胞对抗原的摄取。然而，纳米材料对抗原载带能力不理想，难以实际应用。
综上所述，急需一种普适的、靶向淋巴结的，促进淋巴结高效传递抗原，激活适应性和先天免疫反应的肿瘤疫苗。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提供一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗，所述纳米疫苗是蛋白-金属离子复合纳米粒子负载抗原肽形成的纳米疫苗；
所述金属离子是镁离子或锌离子，镁离子或锌离子分别来源于氯化镁或氯化锌；
所述蛋白包括人血红蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白中的至少一种；
所述抗原包括肿瘤相关抗原和新抗原。
为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
进一步地，蛋白与金属离子的摩尔比为1:650。
进一步地，所述抗原肽与蛋白-金属离子复合纳米粒子通过静电相互作用或化学键连接。
进一步地，所述蛋白-金属离子复合纳米粒子的水和粒径为100～200nm。
一种基于上述蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、溶解蛋白分子，在pH值为10～12的碱性条件下通过生物矿化作用使蛋白分子与金属离子螯合，反应形成蛋白-金属离子复合纳米粒子(HemoM/HemoZ纳米粒子)；
S2、在水或PBS缓冲液中溶解步骤S1得到的蛋白-金属离子复合纳米粒子和抗原肽，孵育后得到纳米疫苗(HemoMap/HemoZap纳米疫苗、HSAMap/HSAZap纳米疫苗)。
进一步地，步骤S1中，金属离子的浓度为0.1mol/L，蛋白分子的浓度为10mg/mL，所选蛋白表面带负电荷，可以更好地控制蛋白质结构的稳定性，有利于维持后续形成的蛋白-金属离子复合纳米粒子的稳定性。
进一步地，步骤S1中，所述反应为搅拌反应，搅拌温度为40～50℃，搅拌时间为3～5小时，搅拌速率为100～1000r/min。
进一步地，步骤S2中，抗原肽和蛋白-金属离子复合纳米粒子的质量比为1:0.2～1。
进一步地，步骤S2中，蛋白-金属离子复合纳米粒子和抗原肽的孵育温度为25-37℃，孵育时长为1～3小时。
上述基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗用于制备肿瘤疫苗。
本发明的有益效果是：
人血红蛋白(Hemoglobin)和人血清白蛋白(Human serum albumin)分别是由574个和585个氨基酸组成的蛋白质，分子量分别约为64.5kDa和66.5kDa，是来自人体的天然蛋白，生物安全性高，无免疫原性，含有丰富的游离羧基和氨基，易于修饰。本发明提供了一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗的构建方法：通过溶解人血红蛋白分子或人血清白蛋白，在碱性条件下通过生物矿化作用使蛋白分子与金属离子螯合，反应形成蛋白-金属离子复合纳米粒子；再在水或PBS缓冲液中溶解上述步骤得到的蛋白-金属离子复合纳米粒子和抗原肽，孵育后得到纳米疫苗。该合成方法步骤简便，合成原料廉价易得，不涉及复杂的化学反应以及难以除去的中间反应产物。
基于上述方法制备得到的纳米疫苗尺寸能够高效富集于肿瘤引流淋巴结，促进抗原递呈、增强免疫细胞对抗原的摄取效率、增强抗肿瘤效果，在较少的抗原剂量和注射次数的情况下，引起高效的细胞免疫反应；其次，所构建的纳米疫苗中，蛋白-金属离子复合纳米粒子能够稳定负载抗原分子；最后，基于HemoM/HemoZ纳米粒子的HemoMap/HemoZap纳米疫苗的组成部分生物相容性好，荧光成像提示其基本无毒副作用，大大增加了下一步临床研究的可能性。
附图说明
图1为HemoMap/HemoZap纳米疫苗制备流程图；
图2为HemoM纳米粒子的透射电子显微镜图像以及元素分布图像；
图3为HemoM纳米粒子的细胞毒性评价图、体外促进BMDCs成熟实验结果统计图；
图4为HemoM纳米粒子和HemoMap纳米疫苗的水合粒径以及透射电子显微镜图像；
图5为HemoMap纳米疫苗淋巴结靶向荧光成像图、腹股沟和腋窝淋巴结荧光定量分析、抗原内化流式数据图；
图6为HemoMap纳米疫苗体内抗肿瘤实验图、抑瘤效果评价图、小鼠生存期图像；
图7为HSAMap/HSAZap纳米疫苗制备流程图；
图8为HSAM纳米粒子的透射电子显微镜图像以及元素分布图像；
图9为HSAM纳米粒子的细胞毒性评价、体外促进BMDCs成熟实验结果统计图；
图10为HSAMap纳米疫苗淋巴结靶向荧光成像图、主要脏器中荧光分布图；
图11为HSAMap纳米疫苗体内抗肿瘤实验图，抑瘤效果评价图、小鼠生存期图像；
图12为HemoZ纳米粒子的细胞毒性评价图、体外活化BMDCs和T细胞的实验结果统计图。
具体实施方式
实施例1～5以镁离子形成的HemoM纳米粒子及其与小鼠黑色素瘤高表达抗原肽Tyrp1形成的HemoMap纳米疫苗为示例；
实施例6～10以镁离子形成的HSAM纳米粒子及其与小鼠黑色素瘤高表达抗原肽M27形成的HSAMap纳米疫苗为示例；
实施例11～12阐述了锌离子形成的纳米粒子在安全剂量下同样具有免疫细胞刺激作用。其他蛋白分子(如牛血清白蛋白)、镁/锌离子形成的其他纳米粒子和其他肿瘤抗原形成的纳米疫苗的制备与应用与之基本相同，不另外赘述。
实施例1HemoM纳米粒子的制备和表征
HemoM纳米粒子通过以下方法进行制备，如图1所示，具体步骤如下：
S1、配置10mg/mL的人血红蛋白溶液(HB)并在50℃下搅拌2h；
S2、将500μL浓度为1.0M的MgCl2加入HB溶液，50℃搅拌20min后，加入1mL，1.0M的NaOH调节pH至12，继续搅拌3h，透析纯化冻干后得到HemoM纳米粒子。
使用硝酸消解HemoM纳米粒子，利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)对HemoM纳米粒子中的镁、铁浓度进行检测，结果表明1mg的HemoM纳米粒子中含有1.7％镁和0.07％铁。
如图2所示，HemoM纳米粒子的平均粒径为31.25nm，且分散良好，尺寸均匀；元素分布图像显示HemoM纳米粒子中的镁元素集中分布在纳米粒子的核心。
实施例2HemoM纳米粒子的细胞毒性评价以及激活BMDC细胞活性试验
细胞毒性评价：将骨髓来源的BMDCs细胞在第6天按照5000个/孔细胞的密度接种在96孔板中，并培养24h，然后分别与MgCl2、HB溶液或者HemoM纳米粒子孵育24h，使用CCK-8试剂盒评估细胞活力。
流式细胞术分析激活BMDCs细胞活性试验：首先，通过脱颈处死C57BL/6小鼠，无菌分离提取骨髓，裂解红细胞后，制备单细胞悬液。之后，利用20ng/mL含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和10ng/mL白介素-4(IL-4)的完全培养基(含10％胎牛血清、青链霉素)培养，第2天和第4天，3/4换液。培养至第6天，将骨髓来源的BMDC细胞以1×105个/孔的密度接种在96孔板中，并培养24h，然后用阴参生理盐水、阳参LPS(1μg/mL)、HB溶液(3.0mg/mL)、MgCl2·6H2O(2.0mM)或者HemoM纳米粒子每孔加入100μL处理细胞，并孵育48h后，第10天收集细胞并用CD11c-FITC抗体、CD80-APC抗体和CD86-PE抗体(均购自Biolegend)染色以进行流式细胞术分析(CytoFLEX，Beckman，USA)。
如图3所示，与游离的镁离子相比，即使在浓度为2.0mM时，HemoM纳米粒子对BMDCs细胞仍旧无明显细胞毒性；同时，HemoM纳米粒子提高了新抗原肽对BMDC的刺激作用，HemoM诱导了更高水平的BMDCs成熟。
实施例3HemoM纳米粒子结合新抗原Tyrp1构建HemoMap纳米疫苗
实施例1得到的HemoM纳米粒子结合新抗原Tyrp1构建HemoMap纳米疫苗的具体步骤如下：
S1、选取小鼠黑色素瘤高表达抗原肽Tyrp1(氨基酸序列：CTAPDNLGYM)作为免疫抗原研究对象；将3.0mg/mL的HemoM纳米粒子与Tyrp1在25℃条件下，孵育3h得到混合溶液；抗原肽Tyrp1与HemoM纳米粒子中镁元素的质量比为1:0.25；
S2、将步骤S1得到的混合溶液以12000rpm速度离心20min，通过HPLC测量上清液中未结合的抗原浓度。
如图4所示，结合Tyrp1之后形成的HemoMap纳米疫苗水合粒径明显增加，说明Tyrp1抗原与HemoM纳米粒子实现了有效结合。
实施例4HemoMap纳米疫苗荧光成像
S1、在遵循国家动物保护协议的前提下，选取4-6周龄的C57BL/6小鼠并分成2组，每组3只，分别于腹股沟皮下注射以下试剂：a)载带20μg荧光分子Cy5-NHS修饰的Tyrp1抗原；b)载带20μg荧光分子Cy5-NHS修饰的Tyrp1抗原的300μg HemoM纳米粒子构建的HemoMap纳米疫苗；
S2、以注射时间点为0h，在24、48、72、96h荧光成像后，取出小鼠腋窝及腹股沟淋巴结，进行荧光成像分析，对其腹股沟引流淋巴结荧光定量；
S3、使用流式细胞仪，对注射48h后的淋巴结组织中的DC细胞进行分析，统计Tyrp1抗原在DC细胞中的内化情况。
如图5所示，与单独的Tyrp1抗原相比，HemoMap纳米疫苗在淋巴结中诱发更强的荧光信号；定量分析显示，注射48h后，纳米疫苗在淋巴结中的积累效率是游离Tyrp1抗原的2.5倍，表明HemoMap纳米疫苗促进体内抗原向淋巴结的递送和有效蓄积。
实施例5HemoMap纳米疫苗对黑色素瘤的治疗作用评价
S1、在遵循国家动物保护协议的前提下，选取4-6周龄的C57BL/6小鼠并分成4组，每组6只，分别于腹股沟皮下注射以下试剂：a)20μg的Tyrp1抗原，无HemoM纳米粒子；b)HemoM纳米粒子；c)载带20μg Tyrp1抗原的300μg的HemoMap纳米疫苗；d)生理盐水；
S2、小鼠肿瘤模型：B16F10黑色素瘤细胞重悬至1×106个/mL后，每只小鼠皮下接种100μL，即105个细胞，三天后开始治疗；
S3、小鼠免疫：进行3次接种，于小鼠皮下注射1×105个B16F10细胞为第0天，第一次接种为第3天，第二次接种为第5天，第三次接种为第7天；
S4、每周用游标卡尺记录3-4次肿瘤大小，肿瘤体积为长×宽×宽/2，当小鼠肿瘤体积大于1500mm3时，对小鼠实施安乐死，并记录小鼠的生存期。
如图6所示，HemoMap纳米疫苗可以抑制小鼠黑色素瘤的生长，延长小鼠的生存期。
实施例6HSAM纳米粒子的制备和表征
HSAM纳米粒子通过以下方法进行制备，如图7所示，具体步骤如下：
S1、配置10mg/mL的人血清白蛋白溶液(HSA)并在50℃下搅拌2h；
S2、将500μL浓度为1.0M的MgCl2加入HSA溶液，50℃搅拌20min后，加入1mL，1.0M的NaOH调节pH至10，继续搅拌3h，透析纯化冻干后得到HSAM纳米粒子。
使用硝酸消解HSAM纳米粒子，利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)对HSAM纳米粒子中的镁浓度进行检测，结果表明1mg的HSAM纳米粒子中含有1.4％镁。
如图8所示，HSAM纳米粒子的平均粒径为45.8nm，且分散良好，尺寸均匀；元素分布图像显示HSAM纳米粒子中的镁元素均匀分布在白蛋白纳米球中。
实施例7HSAM纳米粒子结合新抗原M27构建HSAMap纳米疫苗
实施例6得到的HSAM纳米粒子结合新抗原M27构建HemoMap纳米疫苗的具体步骤如下：
S1、选取小鼠黑色素瘤高表达抗原肽M27(氨基酸序列：LCPGNKYEM)作为免疫抗原研究对象；在2mL的PBS溶液中分别添加2mg抗原肽M27，按照抗原肽:EDC:NHS摩尔比为1:2:2，加入EDC和NHS，孵育15min，然后加入10mg的HSAM纳米粒子，反应2h。最终反应透析5h，冻干并保存在-80℃环境中；；
S2、将步骤S1得到的混合溶液以12000rpm速度离心20min，通过HPLC测量上清液中未结合的抗原浓度。
结合M27之后形成的HSAMap纳米疫苗水合粒径增加至58.44nm，说明M27抗原与HemoM纳米粒子实现了有效结合。
实施例8HSAMap纳米疫苗的细胞毒性评价以及激活BMDC细胞活性试验
细胞毒性评价：将骨髓来源的BMDCs细胞在第6天按照5000个/孔细胞的密度接种在96孔板中，并培养24h，然后分别与不同浓度的HSAMap纳米疫苗孵育24h，使用CCK-8试剂盒评估细胞活力。
流式细胞术分析激活BMDCs细胞活性试验：首先，通过脱颈处死C57BL/6小鼠，无菌分离提取骨髓，裂解红细胞后，制备单细胞悬液。之后，利用20ng/mL含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和10ng/mL白介素-4(IL-4)的完全培养基(含10％胎牛血清、青链霉素)培养，第2天和第4天，3/4换液。培养至第6天，将骨髓来源的BMDC细胞以1×105个/孔的密度接种在96孔板中，并培养24h，然后用阴参生理盐水、阳参LPS(1μg/mL)、HSAM纳米粒子、HSAMap纳米疫苗每孔加入100μL处理细胞并孵育48h后，第10天收集细胞并用CD11c-FITC抗体、CD80-APC抗体和CD86-PE抗体(均购自Biolegend)染色以进行流式细胞术分析(CytoFLEX，Beckman，USA)。
如图9所示，HSAMap纳米疫苗对BMDCs细胞无明显细胞毒性；HSAM纳米粒子提高了新抗原肽对BMDC的刺激作用，HSAM纳米粒子诱导了更高水平的BMDCs成熟。
实施例9HSAMap纳米疫苗荧光成像
S1、在遵循国家动物保护协议的前提下，选取4-6周龄的C57BL/6小鼠并分成2组，每组3只，分别于腹股沟皮下注射以下试剂：a)载带20μg荧光分子Cy5修饰的M27抗原；b)载带20μg荧光分子Cy5修饰的M27抗原的200μg HSAM纳米粒子构建的HSAMap纳米疫苗；
S2、以注射时间点为0h，在2、4、8、24、48、72、96h荧光成像后，取出小鼠腋窝及腹股沟淋巴结，进行荧光成像分析，对其腹股沟引流淋巴结荧光定量。
如图10所示，与单独的M27抗原相比，HSAMap纳米疫苗在淋巴结中诱发更强的荧光信号；定量分析显示，注射96h后，纳米疫苗在淋巴结中的积累效率是游离M27抗原的1.5倍，表明HSAMap纳米疫苗促进体内抗原向淋巴结的递送和有效蓄积。
实施例10HSAMap纳米疫苗对黑色素瘤的治疗作用评价
S1、在遵循国家动物保护协议的前提下，选取4-6周龄的C57BL/6小鼠并分成4组，每组6只，分别于腹股沟皮下注射以下试剂：a)20μg的M27抗原，无HSAM纳米粒子；b)HSAM纳米粒子；c)载带20μg M27抗原的300μg的HSAMap纳米疫苗；d)生理盐水；
S2、小鼠肿瘤模型：B16F10黑色素瘤细胞重悬至1×106个/mL后，每只小鼠皮下接种100μL，即105个细胞，三天后开始治疗；
S3、小鼠免疫：进行3次接种，于小鼠皮下注射1×105个B16F10细胞为第0天，第一次接种为第3天，第二次接种为第5天，第三次接种为第7天；
S4、每周用游标卡尺记录3-4次肿瘤大小，肿瘤体积为长×宽×宽/2，当小鼠肿瘤体积大于1500mm3时，对小鼠实施安乐死，并记录小鼠的生存期。
如图11所示，HSAMap纳米疫苗可以抑制小鼠黑色素瘤的生长，延长小鼠的生存期。
实施例11制备HemoZ纳米粒子
HemoZ纳米粒子的具体制备方法如下：
S1、配置10mg/mL的人血红蛋白溶液(HB)并在50℃下搅拌2h；
S2、将500μL浓度为1.0M的ZnCl2加入HB溶液，50℃搅拌20min后，加入1mL，1.0M的NaOH调节pH至12，继续搅拌3h，透析纯化冻干后得到HemoZ纳米粒子。
实施例12HemoZ纳米粒子对DC、T细胞的活化作用
细胞毒性评价：以人脐静脉内皮细胞作为正常组织细胞，按照5000个/孔细胞的密度接种在96孔板中，并培养24h，然后分别与不同浓度HemoZ纳米粒子孵育24h，使用CCK-8试剂盒评估细胞活力。
流式细胞术分析激活BMDCs细胞活性试验：首先，通过脱颈处死C57BL/6小鼠，无菌分离提取骨髓，裂解红细胞后，制备单细胞悬液。之后，利用20ng/mL含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和10ng/mL白介素-4(IL-4)的完全培养基(含10％胎牛血清、青链霉素)培养，第2天和第4天，3/4换液。培养至第6天，将骨髓来源的BMDC细胞以1×105个/孔的密度接种在96孔板中，并培养24h，然后用阴参生理盐水、阳参LPS(1μg/mL)、HemoZ纳米粒子(最大安全剂量)每孔加入100μL处理细胞，并孵育48h后，第10天收集细胞并用CD11c-FITC抗体、CD80-APC抗体和CD86-PE抗体(均购自Biolegend)染色以进行流式细胞术分析(CytoFLEX,，Beckman，USA)。
流式细胞术分析激活脾脏T细胞活性试验：首先，通过脱颈处死C57BL/6小鼠，无菌取出脾脏，研磨并裂解红细胞后，制备单细胞悬液。之后使用完全培养基(90％1640+10％FBS+1％P/S)培养，加入阴参生理盐水、HemoZ纳米粒子(最大安全剂量)，孵育48h后，收集细胞并用CD3-FITC抗体、CD8-PerCp/Cy5抗体、CD25-APC抗体和CD69-PE抗体(均购自Biolegend)染色以进行流式细胞术分析(CytoFLEX，Beckman，USA)。
如图12所示，HemoZ纳米粒子在100μmol/L时为安全剂量；在此安全剂量下，HemoZ将成熟DC的比例提高了3倍；T细胞早期(CD69)、晚期(CD25)活化标志物的比例分别提高了3.4倍、2.5倍。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗，其特征在于，所述纳米疫苗是蛋白-金属离子复合纳米粒子负载抗原肽形成的纳米疫苗；
所述金属离子是镁离子或锌离子，镁离子或锌离子分别来源于氯化镁或氯化锌；
所述蛋白包括人血红蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白中的至少一种；
所述抗原包括肿瘤相关抗原和新抗原。
2.根据权利要求1所述的一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗，其特征在于，蛋白与金属离子的摩尔比为1:650。
3.根据权利要求1所述的一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗，其特征在于，所述抗原肽与蛋白-金属离子复合纳米粒子通过静电相互作用或化学键连接。
4.根据权利要求1所述的一种基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗，其特征在于，所述蛋白-金属离子复合纳米粒子的水和粒径为100～200nm。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、溶解蛋白分子，在pH值为10～12的碱性条件下通过生物矿化作用使蛋白分子与金属离子螯合，反应形成蛋白-金属离子复合纳米粒子；
S2、在水或PBS缓冲液中溶解步骤S1得到的蛋白-金属离子复合纳米粒子和抗原肽，孵育后得到纳米疫苗。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
步骤S1中，金属离子的浓度为0.1mol/L，蛋白分子的浓度为10mg/mL，蛋白分子表面带负电荷。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
步骤S1中，所述反应为搅拌反应，搅拌温度为40～50℃，搅拌时间为3～5小时，搅拌速率为100～1000r/min。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
步骤S2中，抗原肽和蛋白-金属离子复合纳米粒子的质量比为1:0.2～1。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
步骤S2中，蛋白-金属离子复合纳米粒子和抗原肽的孵育温度为25-37℃，孵育时长为1～3小时。
10.如权利要求1～4任一项所述的基于蛋白-金属离子的抗原肽纳米疫苗在制备肿瘤疫苗中的应用。
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