CN117959416A - 一种细胞膜肿瘤疫苗的制备及其应用 - Google Patents
一种细胞膜肿瘤疫苗的制备及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117959416A CN117959416A CN202410135583.2A CN202410135583A CN117959416A CN 117959416 A CN117959416 A CN 117959416A CN 202410135583 A CN202410135583 A CN 202410135583A CN 117959416 A CN117959416 A CN 117959416A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tumor
- cell membrane
- cell
- vaccine
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 89
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 88
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 title claims abstract description 62
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 58
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- KJPRLNWUNMBNBZ-QPJJXVBHSA-N (E)-cinnamaldehyde Chemical group O=C\C=C\C1=CC=CC=C1 KJPRLNWUNMBNBZ-QPJJXVBHSA-N 0.000 claims description 12
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 11
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 11
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 claims description 10
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 claims description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 7
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- RWLOGRLTDKDANT-TYIYNAFKSA-N 2-[(9S)-7-(4-chlorophenyl)-4,5,13-trimethyl-3-thia-1,8,11,12-tetrazatricyclo[8.3.0.02,6]trideca-2(6),4,7,10,12-pentaen-9-yl]-N-[4-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]phenyl]acetamide Chemical compound CC1=NN=C2[C@H](CC(=O)NC3=CC=C(OCCOCCOCCOCCNC4=C5C(=O)N(C6CCC(=O)NC6=O)C(=O)C5=CC=C4)C=C3)N=C(C3=C(SC(C)=C3C)N12)C1=CC=C(Cl)C=C1 RWLOGRLTDKDANT-TYIYNAFKSA-N 0.000 claims description 3
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 claims description 3
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 claims description 3
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 claims description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 55
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 55
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract description 54
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 50
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 abstract description 22
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 11
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 abstract description 11
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000036647 reaction Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 abstract description 2
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract description 2
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 229940117916 cinnamic aldehyde Drugs 0.000 description 10
- KJPRLNWUNMBNBZ-UHFFFAOYSA-N cinnamic aldehyde Natural products O=CC=CC1=CC=CC=C1 KJPRLNWUNMBNBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 6
- 229940122907 Phosphatase inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 5
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 5
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical group 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 102100023347 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Human genes 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- XDFNWJDGWJVGGN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,7-dichloro-3,6-dihydroxy-9h-xanthen-9-yl)benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC(Cl)=C(O)C=C2OC2=CC(O)=C(Cl)C=C21 XDFNWJDGWJVGGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XPULYJRIWWWQFM-UHFFFAOYSA-N CCO.NCCNCCN Chemical compound CCO.NCCNCCN XPULYJRIWWWQFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RRVKOWFYEYMAMH-UHFFFAOYSA-N CCO.O=CC=CC1=CC=CC=C1 Chemical compound CCO.O=CC=CC1=CC=CC=C1 RRVKOWFYEYMAMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N Diethylenetriamine Chemical compound NCCNCCN RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000035999 Recurrence Diseases 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000005746 immune checkpoint blockade Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002618 waking effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了一种细胞膜肿瘤疫苗的制备及其应用，该细胞膜肿瘤疫苗由肿瘤细胞膜和免疫佐剂制成。本发明中肿瘤疫苗以重编程肿瘤细胞膜为抗原来源，借助其抗原谱广、特异性高的优势，克服现有疫苗构建中抗原筛选鉴定耗时长、费用高的问题。本发明加入谷胱甘肽消耗型佐剂调节胞内氧化还原水平，高效激活抗原递呈细胞，解决抗原免疫激活效应不足的问题。本发明提出一种新型抗肿瘤纳米疫苗可引发新的特异性T细胞反应，增强自身抗肿瘤免疫力，有效抑制肿瘤生长，防止肿瘤复发，实现了个性化抗肿瘤免疫治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种细胞膜肿瘤疫苗的制备及其应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学的逐渐发展，肿瘤免疫疗法成为继手术、化疗以及放射治疗后的第四大治疗方法。肿瘤疫苗作为主动免疫疗法的代表性疗法，旨在激发和调动机体的免疫系统，引发新的特异性T细胞反应，使得自身抗肿瘤免疫力增强，从而达到治疗全身性肿瘤、减少肿瘤复发的效果。
肿瘤疫苗根据抗原组分和性质的不同，可分为细胞载体疫苗、病毒疫苗、蛋白/多肽疫苗、核酸疫苗。肿瘤多肽疫苗具有高特异性和高安全性的优势，市场应用前景广阔。相关临床试验证明，HER2/neu3阳性乳腺癌患者在术后接受多肽疫苗GP2治疗后，五年无病生存率为100％，复发率降低至0％(NCT03014076、NCT00524277)。在另一项试验中，构建的个性化新抗原疫苗NeoVax可诱导持续数年的特异性T细胞反应，诱导记忆表型T细胞(Naturemedicine,27(3),515-525.)。数年的研究数据表明，肿瘤多肽疫苗是继免疫检查点封锁和过继型细胞疗法之后的又一里程碑式的进展，或将癌症免疫疗法推向新的时代。
尽管肿瘤疫苗治疗方案前景良好，其临床应用仍然受限。由于技术受限，无法对肿瘤全谱抗原进行鉴别和筛选，迄今为止仅有少量抗原表位已知，且新抗原的筛选流程繁琐，周期长成本高，加之肿瘤具有异质性和突变特征，这些问题的存在制约了肿瘤多肽疫苗的研究和应用。
近年来，一系列基于肿瘤细胞膜的多肽疫苗引起科研工作者的关注。肿瘤细胞膜含有高比例的抗原基序，是肿瘤相关抗原和新抗原的丰富来源，因此，可作为理想的天然抗原用于构建肿瘤多肽疫苗。此外，细胞膜纳米载体具有传统的纳米药物递送载体的优点，药物运输效率大大提高，其具有优异的生物相容性，增强了临床用药的可行性。
抗原是疫苗的关键成分，提供免疫原性。然而肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合体I类分子的表达下降或缺失，阻碍了免疫系统的识别，免疫抑制性分子高表达，导致了抗原呈递障碍。此外，研究表明仅提供抗原而不能有效刺激抗原提呈细胞成熟，更容易引起免疫耐受。因此疫苗制剂多含有免疫佐剂成分以激活抗原提呈细胞，增强抗原摄取和抗原提呈，放大抗原免疫原性。目前临床批准的6种佐剂以激活体液免疫为主，对抗肿瘤细胞免疫激活效能不佳。因此仍需寻找有效的细胞免疫佐剂以增强肿瘤疫苗的效力。
发明内容
为了克服现有疫苗构建中抗原筛选鉴定耗时长、费用高以及抗原免疫激活效应不足的问题，本发明提供了一种细胞膜肿瘤疫苗，以重编程肿瘤细胞膜为抗原来源，加入谷胱甘肽消耗型佐剂调节胞内氧化还原水平，高效激活抗原递呈细胞，引发新的特异性T细胞反应，有效实现抗肿瘤免疫治疗。
本发明采用的技术方案如下：
一种细胞膜肿瘤疫苗，由肿瘤细胞膜和免疫佐剂制成，肿瘤细胞膜的蛋白质和免疫佐剂的质量比为0.1：1-2：1；
所述肿瘤细胞膜是采用免疫原性细胞诱导剂和细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)调节剂处理肿瘤细胞后提取制得；
所述免疫原性细胞诱导剂用于诱导钙网蛋白暴露，所述细胞程序性死亡-配体1调节剂用于下调PD-L1表达。
进一步地，所述免疫原性细胞诱导剂为多柔比星、米托蒽醌或奥沙利铂；
所述细胞程序性死亡-配体1调节剂为JQ1、ARV-825、siPD-L1小干扰基因或调节PD-L1mRNA的microRNA。
进一步地，所述免疫原性细胞诱导剂和细胞程序性死亡-配体1调节剂处理肿瘤细胞的时间为6-72h。
进一步地，所述肿瘤细胞为4T1乳腺癌细胞、MC38结直肠癌细胞、CT26结肠癌细胞、B16F10黑色素瘤细胞或LCC肝癌细胞。
进一步地，所述肿瘤细胞膜的制备方法为：采用免疫原性细胞诱导剂和细胞程序性死亡-配体1调节剂处理肿瘤细胞；消化离心处理后的肿瘤细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤；配制含有氯化钾、氯化镁、Tris以及蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的低渗缓冲液(pH 7.4)，将收集的细胞重悬于低渗液中，4℃放置2-24h；对上述含肿瘤细胞的低渗液进一步进行超声破碎，超声功率为50-250W，超声时间为1-3s，停歇时间为2-4s，总时间为10-30min；采用差速离心法程序对细胞膜悬液进行分离，程序如下：第一次离心10min，转速为2000-3000rpm，温度为4℃，弃去含有细胞核、未破碎细胞等物质的沉淀，取上清液进行二次离心；第二次离心40-60min，转速为12000-15000rpm，温度为4℃，弃去含有溶酶体、过氧化物酶体的上清液，所获沉淀为肿瘤细胞膜片段。
在本发明的一个实施例中，免疫原性细胞诱导剂处理肿瘤细胞具体是采用多柔比星诱导15h，也可以是米托蒽醌诱导6h、奥沙利铂诱导24h；细胞程序性死亡-配体1调节剂处理肿瘤细胞具体是采用JQ1诱导24h，也可以是ARV-825诱导24h。
更进一步地，所述低渗缓冲液的组成为10mM KCI、2mM MgCl2、20mM Tris、1％的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，pH 7.4。
进一步地，所述免疫佐剂为肉桂醛二聚体，其结构式如下式所示：
上述细胞膜肿瘤疫苗的制备方法为：将免疫佐剂溶于无水乙醇，然后加至水中，搅拌后得到纳米佐剂溶液，之后将肿瘤细胞膜溶液和纳米佐剂溶液按肿瘤细胞膜蛋白和免疫佐剂的重量比为0.1：1-2：1混合，冰上探头超声，设置超声功率为50-250W，超声时间为1-3s，停歇时间为2-4s，总时间为2-10min，随后经离心处理得到细胞膜肿瘤疫苗。
上述细胞膜肿瘤疫苗在制备肿瘤防治药物中的应用。具体可用于肿瘤预防、肿瘤治疗，手术切除后的肿瘤复发和转移，以及与化疗、放疗、免疫检查点封锁等疗法的组合疗法。
本发明一方面采用免疫原性细胞诱导剂和细胞程序性死亡-配体1调节剂对肿瘤细胞进行改造，从而获得的细胞膜抗原具有钙网蛋白暴露和PD-L1抑制性信号分子下降的特点；另一方面所述的免疫佐剂含有亲水头部和亲脂尾部，为带有α、β-不饱和酮结构的类脂质小分子，可用于调节树突状细胞氧化还原水平。由于肿瘤细胞膜抗原具有抗原谱广、特异性强的特点，经过体外重编程和佐剂工程化，抗原提呈细胞增强对抗原的摄取能力和提呈能力，在佐剂刺激下进一步成熟而迁移至淋巴结发挥抗肿瘤免疫疗效。
所述肿瘤疫苗接种后，通过激活树突状细胞开启细胞免疫应答，用于抑制肿瘤生长，防止肿瘤复发和转移。以已应用于乳腺癌术后抗复发为例，其免疫治疗机理为：肿瘤疫苗包括细胞膜抗原组分以及佐剂组分，其中抗原组分提取自4T1乳腺癌肿瘤细胞，展示包括已知抗原和未知抗原在内的肿瘤全谱抗原；经由体外工程化改造后，所获细胞膜具有钙网蛋白暴露的特点，促进抗原摄取，所获细胞膜具有PD-L1抑制性信号分子下降的特点，避免拮抗树突状细胞的CD80共刺激信号分子，促进抗原递呈；其中佐剂组分为带有α、β-不饱和酮结构的类脂质小分子，可插入细胞膜构建稳定纳米载体，增加树突状细胞摄取和淋巴蓄积，实现抗原与佐剂的共递送；佐剂的α、β-不饱和酮结构与树突状细胞的胞内谷胱甘肽反应，一方面破坏纳米制剂稳定性，使得细胞膜破碎为更小的抗原片段有利于递呈，另一方面，消耗谷胱甘肽，提高活性氧水平，激活树突状细胞。在手术后，皮下接种细胞膜肿瘤疫苗，树突状细胞摄取纳米疫苗并成熟，回流至淋巴系统，在淋巴结处理加工肿瘤抗原并呈递给CD8+T细胞，引发强烈的抗肿瘤反应，清除残留的肿瘤病灶，抵抗肿瘤复发。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的细胞膜肿瘤疫苗首次将类脂质小分子佐剂插入重编程肿瘤细胞膜，构建疫苗递送系统。相较于现有疫苗，如树突状疫苗、蛋白多肽疫苗、新抗原疫苗，本发明提取肿瘤细胞膜作为抗原，包括已知抗原和未知抗原在内的多种肿瘤抗原，克服了抗原筛选鉴定耗时长、费用高的问题，且抗原种类的多样性可激发多价且更广泛的抗肿瘤免疫效应。相较于已上市的佐剂，难以激发细胞免疫，本发明提出以谷胱甘肽消耗型材料为佐剂，通过调节树突状细胞氧化还原水平促进树突状细胞成熟，增强膜抗原的免疫原性，唤醒细胞免疫。
本发明中的肿瘤细胞膜可来自于各类肿瘤细胞，可从自体肿瘤中获得，具有可扩展性和个性化的特征。进一步地，通过对肿瘤细胞进行体外细胞改造，提高钙网蛋白表达并降低免疫抑制性分子PD-L1，有助于提高细胞膜抗原的摄取效率，改善抗原递呈。
本发明中的细胞膜肿瘤疫苗成分简单，制备流程简易，可大规模扩展，采用温和的超声融合法替代物理挤出方式，减少了抗原在过膜时的损失，最大程度保留细胞膜抗原成分。
本发明构建的细胞膜肿瘤疫苗，显著提高抗原摄取效率，极大改善细胞膜抗原免疫原性，有效激活抗原递呈细胞，引发新的特异性T细胞反应，实现抗肿瘤免疫治疗，具有临床转化潜力。
附图说明
图1为细胞膜重编程和佐剂工程化的肿瘤疫苗的构建过程示意图。
图2为实施例1肿瘤疫苗的粒径电位图。
图3为实施例1肿瘤疫苗的透射电镜图。
图4为实施例1肿瘤疫苗保留抗原的考马斯亮蓝图像。
图5为实施例1肿瘤疫苗的特异性蛋白表达结果。
图6为实施例1肿瘤疫苗的响应GSH的粒径变化和形貌变化。
图7为实施例1肿瘤疫苗提高活性氧水平的DCFH-DA染色图.
图8为实施例1肿瘤疫苗促进DC摄取的流式统计图。
图9为实施例1肿瘤疫苗促进DC成熟的流式统计图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
佐剂工程化仿生疫苗的制备
本发明提出基于细胞膜重编程和佐剂工程化的个性化肿瘤疫苗的制备方法，流程如图1，具体步骤如下：
(1)制备细胞工程化改造肿瘤细胞膜
对4T1乳腺癌细胞进行培养扩增至2×108个细胞，进行多柔比星和JQ1给药，其中多柔比星以2μM的浓度给药15h，JQ1以1μM的浓度给药24h；消化离心改造后的肿瘤细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤3次；配制低渗缓冲液(10mM KCI、2mM MgCl2、20mM Tris、1％的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物，pH 7.4)，将收集的细胞重悬于低渗液中，4℃放置4h；对上述含肿瘤细胞的低渗液进一步进行超声破碎，超声功率为130W，1s-2s(on-off)，总时间为20min；采用差速离心法程序对细胞膜悬液进行分离，程序如下：第一次离心10min，转速为2500rpm，温度为4℃，弃去含有细胞核、未破碎细胞等物质的沉淀，取上清液进行二次离心；第二次离心40min，转速为12000rpm，温度为4℃，弃去含有溶酶体、过氧化物酶体的上清液，所获沉淀为重编程的肿瘤细胞膜片段。将经过工程化改造的4T1肿瘤细胞膜命名为CRThighPD-L1low-4T1 CCM。
(2)构建肉桂醛佐剂囊泡
称取1.32g肉桂醛溶于3mL乙醇，称取0.52g二乙烯三胺溶于2mL乙醇，将二乙烯三胺乙醇溶液在搅拌在逐滴滴加至肉桂醛乙醇溶液，45℃加热反应8小时。以薄层色谱监测反应进程，待反应完毕进行柱层析纯化。取提纯后产物溶于无水乙醇，配制成40mg/mL肉桂醛佐剂溶液。取100μL该佐剂溶液逐滴加入水中，总体积为1mL，搅拌1h后获得肉桂醛佐剂囊泡，浓度为4mg/mL，命名为CDC。
(3)制备基于细胞膜重编程和佐剂工程化的个性化肿瘤疫苗
对获得的细胞工程化改造的4T1肿瘤细胞膜沉淀采用超纯水重悬，并进行超声均质，设定超声功率为50W，工作程序1s-2s(on-off)，超声10个循环。随后进行BCA蛋白浓度定量，并稀释为抗原蛋白浓度为2mg/mL的细胞膜悬液。将肿瘤细胞膜和纳米佐剂溶液按照质量比为1：2进行混合，冰上探头超声，设置超声功率为50W，工作程序2s-2s(on-off)，总时间为3min，离心处理后得到个性化肿瘤疫苗CRThighPD-L1low-4T1 CCM/CDC。
对比例1
本实施例与实施例1的区别在于，未采用多柔比星和JQ1对肿瘤细胞进行改造。
构建基于普通细胞膜和佐剂工程化的个性化肿瘤疫苗的制备方法，具体步骤如下：
(1)提取肿瘤细胞膜
对4T1乳腺癌细胞进行培养扩增至2×108个细胞，消化离心，用磷酸盐缓冲液洗涤3次；配制低渗缓冲液(10mM KCI、2mM MgCl2、20mM Tris、1％的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，pH 7.4)，将收集的细胞重悬于低渗液中，4℃放置4h；对上述含肿瘤细胞的低渗液进一步进行超声破碎，超声功率为130W，1s-2s(on-off)，总时间为20min；采用差速离心程序对细胞膜悬液进行分离，程序如下：第一次离心10min，转速为2500rpm，温度为4℃，弃去含有细胞核、未破碎细胞等物质的沉淀，取上清液进行二次离心；第二次离心40min，转速为12000rpm，温度为4℃，弃去含有溶酶体、过氧化物酶体的上清液，所获沉淀为肿瘤细胞膜片段。将未经过工程化改造的4T1肿瘤细胞膜命名为Normal-4T1 CCM。
(2)构建肉桂醛佐剂囊泡
按照实施例1构建肉桂醛佐剂囊泡CDC。
(3)制备基于细胞膜和佐剂工程化的个性化肿瘤疫苗
对获得的4T1肿瘤细胞膜沉淀采用超纯水重悬，并进行超声均质，设定超声功率为50W，工作程序1s-2s(on-off)，超声10个循环。随后进行BCA蛋白浓度定量，并稀释为抗原蛋白浓度为2mg/mL的细胞膜悬液。将肿瘤细胞膜和纳米佐剂溶液进行混合(w/w＝2：1)，冰上探头超声，设置超声功率为50W，工作程序2s-2s(on-off)，总时间为3min，离心处理后得到肿瘤疫苗Normal-4T1 CCM/CDC。
实施例2
本实施例使用B16-F10小鼠黑色素瘤细胞构建佐剂工程化个性化肿瘤疫苗，具体步骤如下：
(1)制备细胞工程化改造肿瘤细胞膜
对B16-F10黑色素瘤细胞进行培养扩增至2×108个细胞，进行多柔比星和JQ1给药，其中多柔比星以1μM的浓度给药24h，JQ1以1μM的浓度给药24h；消化离心改造后的肿瘤细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤3次；配制低渗缓冲液(10mM KCI、2mM MgCl2、20mM Tris、1％的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，pH 7.4)，将收集的细胞重悬于低渗液中，4℃放置2h；对上述含肿瘤细胞的低渗液进一步进行超声破碎，超声功率为130W，1s-2s(on-off)，总时间为20min；采用差速离心程序对细胞膜悬液进行分离，程序如下：第一次离心10min，转速为2500rpm，温度为4℃，弃去含有细胞核、未破碎细胞等物质的沉淀，取上清液进行二次离心；第二次离心40min，转速为12000rpm，温度为4℃，弃去含有溶酶体、过氧化物酶体的上清液，所获沉淀为重编程的B16-F10肿瘤细胞膜片段，命名为CRThighPD-L1low-B16-F10CCM。
(2)构建肉桂醛佐剂囊泡
按照实施例1构建肉桂醛佐剂囊泡CDC。
(3)制备基于细胞膜重编程和佐剂工程化的个性化肿瘤疫苗
对获得的细胞工程化改造的B16-F10肿瘤细胞膜进行BCA蛋白浓度定量，随后稀释为抗原蛋白浓度为2mg/mL的细胞膜悬液。将肿瘤细胞膜和纳米佐剂溶液进行混合(w/w＝2：1)，冰上探头超声，超声功率为65W，工作程序2s-2s(on-off)，总时间为5min，离心处理后得到个性化肿瘤疫苗CRThighPD-L1low-B16-F10 CCM/CDC。
实施例3
本实施例使用MC38结直肠癌细胞构建佐剂工程化个性化肿瘤疫苗，具体步骤如下：
(1)制备细胞工程化改造肿瘤细胞膜
对MC38结直肠癌细胞进行培养扩增至2×108个细胞，进行多柔比星和JQ1给药，其中多柔比星以2μM的浓度给药24h，JQ1以1μM的浓度给药24h；消化离心改造后的肿瘤细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤3次；配制低渗缓冲液(10mM KCI、2mM MgCl2、20mM Tris、1％的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，pH 7.4)，将收集的细胞重悬于低渗液中，4℃放置2h；对上述含肿瘤细胞的低渗液进一步进行超声破碎，超声功率为130W，1s-2s(on-off)，总时间为20min；采用差速离心程序对细胞膜悬液进行分离，程序如下：第一次离心10min，转速为2500rpm，温度为4℃，弃去含有细胞核、未破碎细胞等物质的沉淀，取上清液进行二次离心；第二次离心40min，转速为12000rpm，温度为4℃，弃去含有溶酶体、过氧化物酶体的上清液，所获沉淀为重编程的MC38肿瘤细胞膜片段，命名为CRThighPD-L1low-MC38 CCM。
(2)构建肉桂醛佐剂囊泡
按照实施例1构建肉桂醛佐剂囊泡CDC。
(3)制备基于细胞膜重编程和佐剂工程化的个性化肿瘤疫苗
对获得的细胞工程化改造的MC38结直肠癌细胞膜进行BCA蛋白浓度定量，随后稀释为抗原蛋白浓度为2mg/mL的细胞膜悬液。将肿瘤细胞膜和纳米佐剂溶液进行混合(w/w＝2：1)，冰上探头超声，超声功率为65W，工作程序2s-2s(on-off)，总时间为3min，离心处理后得到个性化肿瘤疫苗CRThighPD-L1low-MC38 CCM/CDC。
下面对以上实施例制得的肿瘤细胞膜和肿瘤疫苗进行测试。
1、仿生疫苗的粒径电位测试
按照实施例1构建肿瘤疫苗，使用去离子水稀释，配制0.5mg/mL(按照抗原蛋白浓度计算)的细胞膜CRThighPD-L1low-4T1 CCM溶液、佐剂囊泡CDC溶液和肿瘤纳米疫苗CRThighPD-L1low-4T1 CCM/CDC溶液，使用马尔文粒径仪在室温下进行粒径测试。随后进一步稀释5倍进行zeta电位检测。
如图2所示，单独的细胞膜CRThighPD-L1low-4T1 CCM表面电位为-26.9±1.04mV，PDI为0.429±0.109，粒径分布不均一。经过佐剂工程化后，肿瘤疫苗CRThighPD-L1low-4T1CCM/CDC表面电位为-25.8±2.61mV，粒径为145.7±1.375nm，PDI为0.21±0.013，具有较窄的粒径分布。
2、仿生疫苗的形貌测试
取实施例1中的CRThighPD-L1low-4T1 CCM细胞膜溶液和肿瘤疫苗CRThighPD-L1low-4T1CCM/CDC溶液，取20μL液体滴一滴在碳网表面，使其均匀覆盖，待溶剂挥发后进行透射电镜测试。
如图3所示，细胞膜发生聚集，且含有较多破碎物，偶见皱缩的双层膜结构，膜厚度约为8nm。经过佐剂工程化后，肿瘤疫苗CRThighPD-L1low-4T1 CCM/CDC球形圆整，膜厚度约为4nm。结合粒径电位数据，可以判断肿瘤纳米疫苗成功构建。佐剂CDC含有亲水头部和亲脂尾部，通过超声作用促进类脂质CDC的插入，形成稳定的纳米制剂。
3、仿生疫苗的抗原保留测试
取等量(20μg蛋白)的Normal-4T1 CCM、Normal-4T1 CCM/CDC、CRThighPD-L1low-4T1CCM、CRThighPD-L1low-4T1 CCM/CDC，以4T1全细胞裂解液作为对照，进行考马斯亮蓝实验。对细胞膜溶液进行室温温和变性20分钟，对全细胞裂解液进行加热变性10分钟。随后配制10％的聚丙酰胺凝胶，进行100V恒压凝胶电泳。将所获凝胶置于染色盒，使用考马斯亮蓝快速染色液染色30分钟，最后将凝胶置于成像系统进行拍照，对比蛋白条带位置和强度。
如图4所示，以全细胞裂解液为对照，细胞膜(Normal-4T1 CCM、CRThighPD-L1low-4T1CCM)保留大部分的细胞蛋白，其蛋白组分作为抗原用于疫苗构建。以未经过超声处理的CRThighPD-L1low-4T1 CCM为对照，制剂组CRThighPD-L1low-4T1 CCM/CDC与其的蛋白条带位置和深浅基本一致，表明超声融合过程不会降解蛋白，最大程度保留了抗原，所构建制剂可作为肿瘤膜抗原疫苗使用。
4、仿生疫苗的特异性蛋白检测
取等量(20μg蛋白)的Normal-4T1 CCM、Normal-4T1 CCM/CDC、CRThighPD-L1low-4T1CCM、CRThighPD-L1low-4T1 CCM/CDC，进行聚丙酰胺凝胶电泳，电泳程序为30V，10min；80V，20min；120V，50min。将电泳后的凝胶进行冰浴转膜操作，使用0.45μm的PVDF膜，转膜程序为100V，50min。随后进行抗体孵育，包括PD-L1/CD274 Monoclonal antibody以及Calregulin antibody，使用TBST溶液清洗4次后进行ECL发光检测。
如图5所示，对比Normal-4T1 CCM，经过体外细胞工程化改造后的细胞膜CRThighPD-L1low-4T1 CCM，钙网蛋白表达量上升和PD-L1表达量下降，表明体外工程化改造成功，实现了对细胞膜的重编程。且所构建的制剂展示出相同趋势，表明成功构建基于细胞膜重编程和佐剂工程化的个性化肿瘤疫苗。
5、仿生疫苗的GSH响应
取含有0.5mg/mL膜抗原的肿瘤疫苗纳米溶液CRThighPD-L1low-4T1 CCM/CDC与10mM谷胱甘肽孵育1h，进行粒径检测和透射电镜拍摄。
如图6所示，与GSH孵育后，纳米制剂的粒径由133.6±1.429nm增加为1101±72.86nm，TEM结果显示圆整纳米粒破碎为多个碎片聚集体。表明CDC的α、β-不饱和酮结构与GSH成功发生迈克尔加成反应，使得肿瘤膜崩解，分散为更小的抗原片段并聚集，有利于后续的抗原呈递。
6、仿生疫苗体外ROS激活
取对数生长期的DC2.4细胞进行12孔板铺板，于CO2培养箱中培养24小时后进行给药处理。组别设置为空白对照组Control，细胞膜组CRThighPD-L1low-4T1 CCM，佐剂组CDC，以及制剂组CRThighPD-L1low-4T1 CCM/CDC溶液。抗原给药浓度为0.5mg/mL，佐剂浓度为1mg/mL，给药24小时后，进行DCFH-DA染色并拍摄。
DCFH-DA是一种ROS检测探针，当细胞内的活性氧将无荧光的DCFH氧化生成DCF，可产生强烈绿色荧光。如图7所示，相对于空白对照组，佐剂组和制剂组的绿色荧光强度显著提升。表明肿瘤疫苗中的CDC组分能够消耗DC胞内GSH，激活ROS危险信号。
7、仿生疫苗促进DC摄取
取对数生长期的DC2.4细胞进行12孔板铺板，于CO2培养箱中培养24小时后进行给药处理。对4T1肿瘤细胞膜进行DiO细胞膜绿色荧光标记并进行佐剂工程化。设置抗原给药浓度为0.5mg/mL，给药后消化进行流式上机检测。
如图8所示，相较于Normal-4T1 CCM仅有26.57％的DiO信号，经过体外细胞工程化后的肿瘤细胞膜CRThighPD-L1low-4T1 CCM的DiO信号显著增强至76.73％，进一步的佐剂工程化(CRThighPD-L1low-4T1 CCM/CDC)使其DiO信号增强至89.37％。表明肿瘤细胞膜上的CRT信号和CDC佐剂的加入可促进DC摄取，提示体外细胞工程化和佐剂纳米工程化的必要性。
8、仿生疫苗促进DC成熟
取对数生长期的DC2.4细胞进行12孔板铺板，于CO2培养箱中培养24小时后进行给药处理。组别设置为空白对照组Control，细胞膜组Normal-4T1 CCM，重编程细胞膜组CRThighPD-L1low-4T1 CCM，佐剂组CDC，Normal-4T1 CCM/CDC，以及CRThighPD-L1low-4T1CCM/CDC。设置抗原给药浓度为0.5mg/mL，佐剂浓度为1mg/mL，给药24小时后，进行FITC anti-mouse CD80 Antibody、APC anti-mouse CD86 Antibody抗体染色，通过多色流式细胞仪对DC细胞的表型进行考察，评价DC激活能力。
如图9所示，单独的抗原仅激活4.67％的DC成熟，而经过工程化改造后，CD80+CD86+DC比例显著增强至89.43％。体外细胞工程化后，DC成熟度提高10.56％。表明单独的肿瘤细胞膜的免疫原性较弱，不能有效激活DC，佐剂的加入使得肿瘤膜抗原的免疫原性高度提升，高效激活DC成熟，提示该纳米制剂可作为个性化肿瘤疫苗进行使用。
Claims (8)
1.一种细胞膜肿瘤疫苗，其特征在于，由肿瘤细胞膜和免疫佐剂制成，所述肿瘤细胞膜的蛋白质量和免疫佐剂质量的比为0.1：1-2：1；
所述肿瘤细胞膜是采用免疫原性细胞诱导剂和细胞程序性死亡-配体1调节剂处理肿瘤细胞后提取制得；
所述免疫原性细胞诱导剂用于诱导钙网蛋白暴露，所述细胞程序性死亡-配体1调节剂用于下调PD-L1表达。
2.根据权利要求1所述的细胞膜肿瘤疫苗，其特征在于，所述免疫原性细胞诱导剂为多柔比星、米托蒽醌或奥沙利铂；
所述细胞程序性死亡-配体1调节剂为JQ1、ARV-825、siPD-L1小干扰基因或调节PD-L1mRNA的microRNA。
3.根据权利要求2所述的细胞膜肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤细胞为4T1乳腺癌细胞、MC38结直肠癌细胞、CT26结肠癌细胞、B16F10黑色素瘤细胞或LCC肝癌细胞。
4. 根据权利要求3所述的细胞膜肿瘤疫苗，其特征在于，所述免疫原性细胞诱导剂和细胞程序性死亡-配体1调节剂处理肿瘤细胞的时间为6-72 h。
5.根据权利要求1所述的细胞膜肿瘤疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为肉桂醛二聚体，其结构式如下式所示：
。
6.权利要求1所述的细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，将免疫佐剂溶于无水乙醇，然后加至水中，搅拌后得到纳米佐剂溶液，之后将肿瘤细胞膜溶液和纳米佐剂溶液按肿瘤细胞膜蛋白和免疫佐剂的重量比为0.1：1-2：1混合，冰上探头超声，随后经离心处理得到细胞膜肿瘤疫苗。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，设置超声功率为50-250 W，超声时间为1-3 s，停歇时间为2-4 s，总时间为2-10 min。
8.权利要求1所述的细胞膜肿瘤疫苗在制备肿瘤防治药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410135583.2A CN117959416A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | 一种细胞膜肿瘤疫苗的制备及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410135583.2A CN117959416A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | 一种细胞膜肿瘤疫苗的制备及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117959416A true CN117959416A (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=90864362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410135583.2A Pending CN117959416A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | 一种细胞膜肿瘤疫苗的制备及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117959416A (zh) |
-
2024
- 2024-01-31 CN CN202410135583.2A patent/CN117959416A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108992666B (zh) | 靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用 | |
| CN103446580B (zh) | 一种肿瘤疫苗及其制备方法 | |
| CN110124018A (zh) | 一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用 | |
| CN107427466A (zh) | 从细胞膜衍生的纳米囊泡及其用途 | |
| CN111658767B (zh) | 一种亲水性抗原和/或疏水性抗原疫苗递送系统及其制备方法 | |
| CN109908370A (zh) | 一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的携载阿霉素的脂质纳米级超声造影剂及其制备方法 | |
| CN116763907A (zh) | 一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗及其制备方法 | |
| CN114288400A (zh) | 一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗、制备方法及其应用 | |
| Ma et al. | Immunotherapeutic treatment of lung cancer and bone metastasis with a mPLA/mRNA tumor vaccine | |
| CN110269931B (zh) | 一种水凝胶肿瘤疫苗的制备方法以及由其制备的水凝胶肿瘤疫苗和其用途 | |
| CN112451504A (zh) | 一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法及应用 | |
| CN117959416A (zh) | 一种细胞膜肿瘤疫苗的制备及其应用 | |
| CN115737830B (zh) | 一种时空差异化诱导肿瘤免疫原性死亡和增强抗原提呈的水凝胶疫苗及其制备方法和应用 | |
| Ma et al. | Manganese-based nanoadjuvants for enhancement of immune effect of DNA vaccines | |
| Liu et al. | Exploiting immunostimulatory mechanisms of immunogenic cell death to develop membrane-encapsulated nanoparticles as a potent tumor vaccine | |
| CN116004538A (zh) | 一种搭载细胞内生成dsRNA的纳米囊泡、制备与应用 | |
| Li et al. | Mitochondria-targeted nano-AIEgens as a powerful inducer for evoking immunogenic cell death | |
| CN115040643A (zh) | 一种肿瘤细胞-细菌融合材料及其制备方法与应用 | |
| CN115612670A (zh) | 一种微波制备肿瘤细胞微颗粒的方法 | |
| CN115919798A (zh) | 基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN113769075A (zh) | 一种原位疫苗及其制备方法 | |
| CN108114274B (zh) | 一种基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗及其制备方法 | |
| CN110420335B (zh) | 一种基于多孔碳酸钙的纳米免疫制剂的制备及应用 | |
| CN112870340B (zh) | 一种基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗及其制备方法 | |
| CN114748446B (zh) | 一种mRNA的铝基自组装递送系统及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |