CN112870340B - 一种基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于生物医药技术领域，提供了一种基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗及其制备方法。该制备方法包括：在培养过程中对乳腺癌细胞进行处理；提取乳腺癌细胞培养上清中的细胞外囊泡；将所述细胞外囊泡与Toll样受体激动剂混合于PBS液中，制备TLR@EV溶液；将DSPE‑PEG‑Man粉末溶于PBS液中，并将其加入所述TLR@EV溶液中，制备得到TLR@EV‑Man肿瘤疫苗。本发明制备的基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗采用多免疫抗原联合免疫药物的治疗方法，通过调节免疫细胞刺激机体发挥有效的主动免疫作用，进而利用自身免疫功能抑制肿瘤生长，进而达到消除肿瘤的目的，为临床治疗增添新思路，有较高的临床应用前景。

Description

一种基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗及其制备方法。
背景技术
肿瘤疫苗(tumor vaccine)是将肿瘤抗原以不同形式如：肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的基因等，导入患者体内，提供抗原并刺激合适的抗原提呈细胞(Antigen-Presenting Cell,APC)将抗原加工成抗原肽，并呈递给内源性的T细胞，强化T细胞攻击肿瘤的作用，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，实现抑制肿瘤细胞的生长、转移和以及复发的目的。尽管在100多年前有学者就提议可以在临床上应用肿瘤疫苗的提议，但它真正意义上在临床上发挥效用仅仅是在近十年的时间里。2006年，FDA批准了人类历史上第一个肿瘤疫苗，即预防性肿瘤疫苗-Cervarix，这种疫苗可以降低人类宫颈癌的发病率，随后2010年4月，美国食品药品监督管理局批准Provenge/sipuleucel-T用于治疗晚期前列腺癌，使其成为第一个自体主动免疫疗法药及第一个真正的治疗性癌症疫苗。
目前肿瘤疫苗有四种常见的疫苗，第一种是全细胞疫苗，在肿瘤异性抗原还未明确知道的情况下，肿瘤全细胞疫苗包含了完整的肿瘤相关抗原，能够引起全面有效的肿瘤应答；第二种的多肽疫苗是利用肿瘤特异性抗原、癌基因或抑癌基因突变蛋白、病毒相关抗原等多肽组成的疫苗。第三种是基因工程疫苗是通过基因工程技术，把经过编码的肿瘤特异性抗原的基因负载在重组后的病毒载体或质粒DNA上，然后直接注射入体内，通过载体本身或者人体基因表达系统，引起特异性的体液免疫和细胞免疫。RNA-脂质体疫苗刺激BMDC细胞成熟，然后释放细胞因子，进而激活T细胞，以达到后面攻击肿瘤细胞的效果，但是这类基因疫苗也存在不少缺点，因为其长期表达低水平的抗原，容易引起免疫耐受。
现有的认知表明，机体的主动免疫作用在控制乳腺癌细胞形成过程中起关键作用。在乳腺肿瘤细胞建立起逃避机体免疫监视的机制后，肿瘤实体即逐渐形成，成为临床可见的乳腺癌。肿瘤细胞之所以能够逃脱免疫监视有以下原因：(1)肿瘤细胞可以包被、隐藏自身可被识别的抗原，使其无法被免疫提呈细胞识别；(2)肿瘤能够分泌多种抑制因子，使抗原提呈细胞无法进入肿瘤内进行抗原提取；(3)乳腺癌细胞具有较高的异质性，在肿瘤细胞增殖分化过程中，一些抗原只在部分肿瘤细胞上表达，使特定的免疫反应不能覆盖所有癌细胞，这些原因都使得机体不能利用自身免疫功能治疗肿瘤，所以需要全新的疫苗来克服上述困难，以便更好地发挥肿瘤的主动免疫作用，并推广到临床。
发明内容
为解决上述难题，本发提供了一种基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：在培养过程中对乳腺癌细胞进行刺激处理；
步骤S2：提取乳腺癌细胞培养上清中的细胞外囊泡；
步骤S3：将所述细胞外囊泡与Toll样受体激动剂混合，制备TLR@EV溶液；
步骤S4：将DSPE-PEG-Man溶液加入所述TLR@EV溶液中，制备TLR@EV-Man肿瘤疫苗。
进一步地，所述步骤S1中，在培养过程中对乳腺癌细胞进行刺激处理可通过以下方法之一实现：
(1)采用x-ray辐射照射刺激处理；
(2)采用次氯酸过氧化刺激处理；
(3)采用缺氧培养刺激处理。
进一步地，所述步骤S2中，提取乳腺癌细胞培养上清中的细胞外囊泡可通过以下方法之一实现：
(1)采用超高速离心法提取；
(2)采用碎裂细胞获得细胞膜，然后挤压制造获得。
进一步地，所述步骤S3中，包括以下步骤：
步骤S3-1：将2:1重量的细胞外囊泡与Toll样受体激动剂混合于PBS液中，形成混合液；
步骤S3-2：将上述步骤S3-1所得的混合液在37℃条件下摇动温育1-1.5小时，获得TLR@EV溶液。
进一步地，所述步骤S4中，包括以下步骤：
步骤S4-1：将DSPE-PEG-Man粉末溶于PBS液中，得到DSPE-PEG-Man溶液；
步骤S4-2：将上述步骤S4-1所得的DSPE-PEG-Man溶液加入TLR@EV溶液中，形成混合液；
步骤S4-3：将上述步骤S4-2所得的混合液在4℃条件下，搅拌1-1.5小时；
步骤S4-4：在14000-15000rpm条件下离心10-15分钟，获得固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗；
步骤S4-5：用PBS液重悬上述固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗，得到液体TLR@EV-Man肿瘤疫苗。
本发明还提供了一种由以上方法制备的基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗。
本发明相对于现有技术的技术效果是：
(1)细胞来源选择方式多样化，可根据患者疾病种类选择不同来源的细胞制备肿瘤疫苗，从而治疗不同类型的疾病；
(2)在乳腺癌细胞培养上清液收集前，对细胞进行x-ray辐照、次氯酸过氧化处理及缺氧培养处理，可增强细胞外囊泡的免疫原性，从而增强疫苗的治疗效果；
(3)细胞外囊泡提取方式可根据细胞处理的方法灵活变化，且采用超高速离心法提取细胞外囊泡，操作简单，成本较低，获得的细胞外囊泡纯度高，杂质少；
(4)在细胞外囊泡膜上修饰Mannose基团，使其与DC细胞表面的Mannose受体特异性结合，增强了DC细胞的靶向性，使得机体的主动免疫反应能覆盖所有癌细胞；
(5)本发明制备的TLR@EV-Man肿瘤疫苗以细胞外囊泡膜为载体，包裹TLR7/8激动剂，实现了多免疫抗原联合免疫药物治疗肿瘤，抑制肿瘤生长，进而达到消除肿瘤的目的；
(6)本发明制备的TLR@EV-Man肿瘤疫苗可通过调节免疫细胞进而利用自身免疫功能治疗肿瘤，为临床治疗增添新思路，有较高的临床应用前景；
(7)本发明提供的基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗的制备方法简单，便于操作和实现批量生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗的制备流程图；
图2-1为无刺激下DC细胞CD80、CD86的荧光信号强度示意图；
图2-2为添加DTT化学刺激下DC细胞CD80、CD86的荧光信号强度示意图；
图2-3为挤压刺激下DC细胞CD80、CD86的荧光信号强度示意图；
图2-4为缺氧培养刺激下DC细胞CD80、CD86的荧光信号强度示意图；
图2-5为x-ray辐射照射刺激下DC细胞CD80、CD86的荧光信号强度示意图；
图2-6为肿瘤细胞裂解液刺激下DC细胞CD80、CD86的荧光信号强度示意图；
图2-7为添加TNFα刺激下DC细胞CD80、CD86的荧光信号强度示意图。
图3是本发明实施例提供的不同刺激下DC细胞的活化比例示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
根据图1所示的流程图制备TLR@EV-Man肿瘤疫苗，具体为：
肿瘤细胞来源可直接购买或从患者身上提取自体细胞，本发明中，对肿瘤细胞的来源不作限制。
本实施例中，以临床常见的三阴性乳腺癌为对象，取出其肿瘤组织样本，然后进行体外培养扩增，并采用x-ray辐射照射处理培养中的癌细胞，采用x-ray辐射照射的作用是增强EV的免疫原性。待癌细胞处理后，收集该细胞培养液的上清液，然后采用超高速离心法提取乳腺癌细胞培养上清液中的细胞外囊泡。
将500mg的纯化细胞外囊泡与250mg的TLR7/8激动剂R848混合于1ml的PBS液中形成混合液，然后将该混合液在37℃条件下摇动温育1h，获得浓度为0.5mg/mL的TLR@EV溶液。
将DSPE-PEG-Man粉末溶于PBS液中，得到浓度为10mg/mL的DSPE-PEG-Man溶液，该步骤中的DSPE-PEG-Man粉末可通过购买或合成得到，本发明对此不作限制。在本实施例中，DSPE-PEG-Man粉末是通过合成得到的。首先，将10mg的DSPE-PEG-NH2与1.4mg的Mannose-NHS溶于5mL的DMSO溶液中，然后避光搅拌24小时，使得DSPE-PEG-NH2和Mannose-NHS充分结合形成DSPE-PEG-Man溶液，再采用1000kD的透析袋透析DSPE-PEG-Man溶液，1小时换一次水，透析12小时后，将其装入去盖的离心管里冻干，从而得到DSPE-PEG-Man的粉末。
采用移液枪吸取10uL的10mg/mL的DSPE-PEG-Man溶液，并将其加入到1mL的0.5mg/mL的TLR@EV溶液中形成混合液，然后将该混合液在4℃条件下，搅拌1小时，待DSPE-PEG-Man与TLR@EV充分结合后，在转速为14800rpm的离心机中离心10分钟，离心的作用是弃掉上清和除去多余的DSPE-PEG-Man溶液，从而得到固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗，最后采用PBS液重悬该固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗，获得液体TLR@EV-Man肿瘤疫苗。
实施例2
根据图1所示的流程图制备TLR@EV-Man肿瘤疫苗，具体为：
直接从美国ATCC或者中国科学院上海细胞库中购买已有的乳腺癌细胞系，然后进行体外培养扩增，并采用次氯酸过氧化处理培养中的癌细胞，采用次氯酸过氧化处理的作用是增强EV的免疫原性。待癌细胞处理后，收集该细胞培养液的上清液，然后进行细胞碎裂；将破裂后的癌细胞在700g条件下离心10分钟，去掉沉淀；提取去掉沉淀后的癌细胞上清液，在1000g条件下离心10分钟，获得破裂的细胞膜；将获得的细胞膜通过400nm膜反复挤压15-20次，得到EV细胞外囊泡。
将450mg的纯化细胞外囊泡与225mg的TLR7/8激动剂3M052混合于1ml的PBS液中形成混合液，然后将该混合液在37℃条件下摇动温育1.5小时，获得浓度为0.5mg/mL的TLR@EV溶液。
将DSPE-PEG-Man粉末溶于PBS液中，得到浓度为5mg/mL的DSPE-PEG-Man溶液，在本实施例中，DSPE-PEG-Man粉末是通过购买得到的。然后采用移液枪吸取10uL的5mg/mL的DSPE-PEG-Man溶液，并将其加入到1mL的0.5mg/mL的TLR@EV溶液中形成混合液，然后将该混合液在4℃条件下，搅拌1.5小时，待DSPE-PEG-Man与TLR@EV充分结合后，在转速为14000rpm的离心机中离心15分钟，离心的作用是弃掉上清和除去多余的DSPE-PEG-Man溶液，从而得到固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗，最后采用PBS液重悬该固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗，获得液体TLR@EV-Man肿瘤疫苗。
实施例3
根据图1所示的流程图制备TLR@EV-Man肿瘤疫苗，具体为：
以临床常见的三阴性乳腺癌为对象，取出其肿瘤组织样本，然后进行体外培养扩增，并采用缺氧培养处理癌细胞，待癌细胞处理后，收集该细胞培养液的上清液，然后采用超高速离心法提取乳腺癌细胞培养上清液中的细胞外囊泡。
将550mg的纯化细胞外囊泡与275mg的TLR7/8激动剂CL097混合于1ml的PBS液中形成混合液，然后将该混合液在37℃条件下摇动温育1h，获得浓度为1.0mg/mL的TLR@EV溶液。
将DSPE-PEG-Man粉末溶于PBS液中，得到浓度为15mg/mL的DSPE-PEG-Man溶液，在本实施例中，DSPE-PEG-Man粉末是通过购买得到的。然后采用移液枪吸取10uL的15mg/mL的DSPE-PEG-Man溶液，并将其加入到1mL的1.0mg/mL的TLR@EV溶液中形成混合液，然后将该混合液在4℃条件下，搅拌1.5小时，待DSPE-PEG-Man与TLR@EV充分结合后，在转速为15000rpm的离心机中离心15分钟，离心的作用是弃掉上清和除去多余的DSPE-PEG-Man溶液，从而得到固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗，最后采用PBS液重悬该固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗，获得液体TLR@EV-Man肿瘤疫苗。
实验例
以临床常见的三阴性乳腺癌为对象，取出其肿瘤组织样本，进行体外培养扩增，在培养过程中，采用不同的刺激方法对乳腺癌细胞进行处理，然后采用流式细胞技术检测DC细胞CD80、CD86的荧光信号强度，对比DC细胞的活化程度，进而研究不同刺激下乳腺癌细胞分泌的外囊泡的免疫原性差异。实验共分为7组，其中，第一组不采用任何刺激，正常分泌外囊泡，第二组采用添加DTT化学刺激，第三组采用挤压刺激，第四组采用缺氧培养刺激，第五组采用x-ray辐射照射刺激，第六组采用肿瘤细胞裂解液刺激，第七组采用添加TNFα刺激。根据实验结果得到不同刺激下DC细胞CD80、CD86的荧光信号强度示意图，见图2-1～图2-7。
根据图2-1～图2-7可统计出不同刺激下DC细胞的活化比例，其中，如图2-1所示，第一组无刺激正常分泌外囊泡，DC细胞的活化比例为11.3％；如图2-2所示，第二组采用添加DTT化学刺激后，DC细胞的活化比例为10.2％；如图2-3所示，第三组采用挤压刺激后，DC细胞的活化比例为21.4％；如图2-4所示，第四组采用缺氧培养刺激后，DC细胞的活化比例为14.3％；如图2-5所示，第五组采用x-ray辐射照射刺激后，DC细胞的活化比例为13.3％；如图2-6所示，第六组采用肿瘤细胞裂解液刺激后，DC细胞的活化比例为13.0％；如图2-7所示，第七组采用添加TNFα刺激后，DC细胞的活化比例为11.4％。
根据上述结果，处理得到不同刺激下DC细胞的活化比例示意图，见图3。由图3可知，相比于无刺激正常培养的乳腺癌细胞分泌的外囊泡，采用挤压刺激后，DC细胞的活化比例最高，表明乳腺癌细胞分泌的外囊泡的免疫原性最强，其次是缺氧培养刺激、x-ray辐射照射刺激。因此，在培养过程中，采用挤压、缺氧培养、x-ray辐射照射的方法刺激后，乳腺癌细胞分泌的外囊泡免疫原性更强，更有利于提高肿瘤疫苗疗效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：在培养过程中对乳腺癌细胞进行刺激处理；
步骤S2：提取乳腺癌细胞培养上清中的细胞外囊泡；
步骤S3：将所述细胞外囊泡与Toll样受体激动剂混合，制备TLR@EV溶液；
步骤S4：将DSPE-PEG-Man溶液加入所述TLR@EV溶液中，制备TLR@EV-Man肿瘤疫苗；
所述步骤S2中，提取乳腺癌细胞培养上清中的细胞外囊泡通过以下方法实现：采用碎裂细胞获得细胞膜，然后挤压制造获得；
所述步骤S4中，包括以下步骤：步骤S4-1：将DSPE-PEG-Man粉末溶于PBS液中，得到DSPE-PEG-Man溶液；步骤S4-2：将上述步骤S4-1所得的DSPE-PEG-Man溶液加入TLR@EV溶液中，形成混合液；步骤S4-3：将上述步骤S4-2所得的混合液在4℃条件下，搅拌1-1.5小时；步骤S4-4：在14000-15000rpm条件下离心10-15分钟，获得固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗；步骤S4-5：用PBS液重悬上述固体TLR@EV-Man肿瘤疫苗，得到液体TLR@EV-Man肿瘤疫苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，在培养过程中对乳腺癌细胞进行刺激处理通过以下方法之一实现：
(1)采用x-ray辐射照射刺激处理；
(2)采用次氯酸过氧化刺激处理；
(3)采用缺氧培养刺激处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，包括以下步骤：
步骤S3-1：将2:1重量的细胞外囊泡与Toll样受体激动剂混合于PBS液中，形成混合液；
步骤S3-2：将上述步骤S3-1所得的混合液在37℃条件下摇动温育1-1.5小时，获得TLR@EV溶液。
4.一种基于乳腺癌细胞外囊泡的肿瘤疫苗，其特征在于，采用如权利要求1-3任一所述的方法制备。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015120150A1 (en) * 2014-02-05 2015-08-13 Stc.Unm Exosomes as a therapeutic for cancer
CN109568570A (zh) * 2019-01-14 2019-04-05 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种抗肿瘤疫苗复合物及制备方法、注射剂及应用
CN110029088A (zh) * 2019-04-15 2019-07-19 中山大学 肿瘤细胞凋亡小体及其制备方法和应用
CN110124021A (zh) * 2019-05-15 2019-08-16 迪亚思生命科技(武汉)有限公司 一种新型肿瘤疫苗的制备方法
CN111358942A (zh) * 2018-12-25 2020-07-03 国家纳米科学中心 一种疫苗及其制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020155125A1 (en) * 1999-11-30 2002-10-24 Dillon Davin C. Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
US20040022813A1 (en) * 2002-08-05 2004-02-05 Jean-Claude Bystryn Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant
CN109125740B (zh) * 2017-06-28 2022-04-05 成都威斯克生物医药有限公司 一种新型的肿瘤疫苗及其用途
CN109078176B (zh) * 2018-08-14 2020-09-22 武汉大学 肿瘤细胞膜包覆的纳米材料及其制备方法与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015120150A1 (en) * 2014-02-05 2015-08-13 Stc.Unm Exosomes as a therapeutic for cancer
CN111358942A (zh) * 2018-12-25 2020-07-03 国家纳米科学中心 一种疫苗及其制备方法
CN109568570A (zh) * 2019-01-14 2019-04-05 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种抗肿瘤疫苗复合物及制备方法、注射剂及应用
CN110029088A (zh) * 2019-04-15 2019-07-19 中山大学 肿瘤细胞凋亡小体及其制备方法和应用
CN110124021A (zh) * 2019-05-15 2019-08-16 迪亚思生命科技(武汉)有限公司 一种新型肿瘤疫苗的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Cell Membrane-Coated Adjuvant Nanoparticles with Mannose Modification for Effective Anticancer Vaccination;Yang R，等;《ACS Nano》;20180517;摘要、第5122页右栏、第5123页左栏第2段、第5127页右栏第3段 *

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