CN101724010A

CN101724010A - 一种肿瘤组织全抗原的制备方法和用途

Info

Publication number: CN101724010A
Application number: CN200810201438A
Authority: CN
Inventors: 朱学军; 范振芳; 李晓惠; 孙雪梅
Original assignee: Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Current assignee: Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Priority date: 2008-10-21
Filing date: 2008-10-21
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2028-10-21
Also published as: CN101724010B

Abstract

本发明公开了一种肿瘤组织全抗原的制备方法和用途，所述的方法包括步骤：(1)将肿瘤活检组织的福尔马林(4-10％甲醛)固定的石蜡包埋样本和有机溶剂混合，使石蜡溶解，得到含有肿瘤组织的溶液；(2)将含有肿瘤组织的溶液离心、得到沉淀1；(3)将沉淀1和pH小于7的无机物水溶液混合0.5-12小时，离心除去液体得到沉淀2；(4)将沉淀2置于水蒸汽中进行灭活细胞浆中蛋白酶的处理10-30分钟，得到灭活了细胞浆中蛋白酶的肿瘤组织；(5)将步骤(4)得到的肿瘤组织进行匀浆处理，得到乳糜状液体；和(6)将乳糜状液体和生理盐水(或其它溶液)混合得到肿瘤组织全抗原。本发明还公开了将所述的肿瘤组织全抗原冲击树突状细胞获得肿瘤疫苗的方法。

Description

一种肿瘤组织全抗原的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，尤其涉及肿瘤组织全抗原的制备方法和用途。

背景技术

目前应用肿瘤疫苗激发患者体内生成抗肿瘤的免疫力，即主动免疫治疗肿瘤的方法有多种，包括肿瘤特异性/相关性抗原蛋白、肿瘤特异性/相关性抗原多肽、表达肿瘤抗原的质粒、免疫基因修饰的肿瘤细胞、肿瘤抗原冲击的树突状细胞(dendritic cells，DC)等。其中肿瘤抗原冲击的DC最目前具应用前景的肿瘤疫苗，即树突状细胞疫苗(dendritic cell-based vaccine)。

DC疫苗是近十年发展起来的新型肿瘤治疗疫苗，主要机理是通过给肿瘤患者免疫接种携带肿瘤抗原的DC，通过激活体内肿瘤特异性T细胞等机制，诱导患者机体产生特异性的、持久的抗肿瘤免疫应答，清除肿瘤细胞。目前DC疫苗已被批准进入I-III期临床试验，用于治疗淋巴瘤、骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤。

DC疫苗的制备通常包括三个步骤：首先制备获得患者的肿瘤抗原，其次通过体外分离或培养的方法获得患者自身的DC，最后将肿瘤抗原体外冲击DC，DC负载肿瘤抗原后即制备成肿瘤疫苗。

肿瘤抗原有多种形式，包括：细胞性肿瘤抗原(经放射线照射灭活的肿瘤细胞、肿瘤细胞冻融上清或肿瘤细胞冻融后膜碎片等)、肿瘤细胞的亚细胞成分(凋亡小体、外排小体exosome、自噬小体autophage等)、肿瘤特异性/相关性抗原蛋白、肿瘤特异性/相关性抗原多肽、弱酸洗脱的肿瘤细胞表面的抗原肽等。DC的制备也可以选择多种方法，例如直接从外周血分离DC、从外周全血分离单个核细胞培养DC、经免疫磁珠分离单核细胞后培养DC、从骨髓造血干细胞培养DC等。体外抗原冲击的方法一般选择合适的抗原剂量，加入DC培养体系中孵育培养4-24小时，洗去未被DC摄取的游离抗原，获得肿瘤抗原冲击的DC疫苗。

此外还可以通过肿瘤细胞mRNA转染DC制备疫苗、通过细胞融合杂交瘤技术制备肿瘤细胞-DC融合疫苗等。

但是目前DC疫苗的临床应用仍受很多方面的限制。一方面是疫苗的免疫原性仍不够强，另一方面是大部分患者无法获得有效的肿瘤抗原。

肿瘤特异性/相关性抗原蛋白、肿瘤特异性/相关性抗原多肽抗原性较弱，激活免疫靶点单一，疫苗免疫原性差，且大部分类型的肿瘤目前尚无法确定有效的肿瘤特异性/相关性抗原蛋白及抗原多肽，还进一步受HLA限制，只能被用于特定HLA亚型的患者，因此难以广泛应用。经放射线照射灭活的肿瘤细胞、肿瘤细胞冻融上清或肿瘤细胞冻融后膜碎片、肿瘤细胞的亚细胞成分等含有各种肿瘤抗原的蛋白、多肽，抗原性强，DC摄取后制备的疫苗携带的肿瘤抗原靶点全面，激发机体产生的抗肿瘤免疫力较全面，但大部分类型的肿瘤目前无法通过体外培养的方法获得足够数量的肿瘤细胞，因此也难以获得广泛应用。更为重要的问题是，肿瘤患者往往肿瘤复发后才行DC疫苗的免疫治疗，而此时新鲜的肿瘤组织已经丢失，无法制备肿瘤抗原。

医院病理科都长期保留有所有患者的肿瘤组织，但经甲醛固定后石蜡包埋，含有甲醛及石蜡，为坚硬固体，抗原变性，目前无法用于制备有效的肿瘤抗原，因此也就无法制备DC疫苗。

因此，本领域迫切需要提供一种肿瘤抗原，它来源于经过长期保存的肿瘤组织，但含有肿瘤全部蛋白抗原、抗原稳定；抗原冲击的疫苗，操作简便、易于质控，疫苗活性强。

发明内容

本发明旨在提供一种肿瘤组织全抗原及其制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种肿瘤疫苗及其制备方法。

本发明的再一个目的是提供一种肿瘤组织全抗原的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种肿瘤组织全抗原的制备方法，所述的方法包括步骤：

(1)将肿瘤活检组织的福尔马林(4-10％甲醛)固定的石蜡包埋样本和有机溶剂混合，使石蜡溶解，得到含有肿瘤组织的溶液；

(2)将含有肿瘤组织的溶液离心、得到沉淀1；

(3)将沉淀1和pH小于7的无机物水溶液混合0.5-12小时，离心除去液体得到沉淀2；

(4)将沉淀2置于水蒸汽中进行灭活细胞浆中蛋白酶的处理10-30分钟，得到灭活了细胞浆中蛋白酶的肿瘤组织；

(5)将步骤(4)得到的肿瘤组织进行匀浆处理，得到乳糜状液体；和

(6)将乳糜状液体和水溶液混合得到肿瘤组织全抗原；所述水溶液包括生理盐水、RPMI-1640、DMEM、和PBS。

在另一优选例中，所述肿瘤活检组织的石蜡样本是厚度为1-50μm的片状物；更佳地，厚度为5-10μm。

在另一优选例中，所述肿瘤是恶性肿瘤，所述恶性肿瘤选自淋巴瘤、骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌、或结肠癌等实体肿瘤。

在另一优选例中，步骤(1)中所述的有机溶剂选自二甲苯、硬脂酸、松节油、乙醇、丙酮、或异丙醇。

在另一优选例中，步骤(2)中用氯仿、无水乙醇、丙酮、或异丙醇等易挥发的溶剂将步骤(1)中的有机溶剂溶解，并一同挥发除去。

在另一优选例中，步骤(3)中将沉淀1和pH小于5的无机物水溶液混合0.5-12小时。

在另一优选例中，步骤(3)中所述的无机物选自下述的一种或多种：碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钾。

在另一优选例中，步骤(3)中将沉淀1和pH小于5的水溶液在25-65℃混合0.8-8小时。

在另一优选例中，步骤(3)中还包括用纯水将无机物固体除去。

在另一优选例中，步骤(4)中的水蒸汽温度为100-150℃。

在另一优选例中，步骤(4)中的水蒸汽在0.05-0.3mPa压力下产生；更佳地，在0.1-0.2mPa压力下产生。

在本发明的第二方面，提供了一种肿瘤疫苗的制备方法，所述的方法包括步骤：

(a)将肿瘤活检组织的福尔马林(4-10％甲醛)固定的石蜡包埋样本和有机溶剂混合，使石蜡溶解，得到含有肿瘤组织的溶液；

(b)将含有肿瘤组织的溶液离心、得到沉淀1，并除去有机溶剂；

(c)将沉淀1和pH小于7的无机物水溶液混合0.5-12小时，离心除去液体得到沉淀2；

(d)将沉淀2置于水蒸汽中进行灭活细胞浆中蛋白酶的处理10-30分钟，得到灭活了细胞浆中蛋白酶的肿瘤组织；

(e)将步骤(d)得到的肿瘤组织进行匀浆处理，得到乳糜状液体；

(f)将乳糜状液体和和水溶液混合得到肿瘤组织全抗原；所述水溶液包括生理盐水、RPMI-1640、DMEM、和PBS；和

(g)将树突状细胞和步骤(f)得到的肿瘤组织全抗原混合、培养，得到肿瘤疫苗。

在另一优选例中，所述恶性肿瘤选自淋巴瘤、骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌、或结肠癌等实体肿瘤。

在另一优选例中，步骤(a)中所述的有机溶剂选自二甲苯、硬脂酸、松节油、乙醇、丙酮、或异丙醇。

在另一优选例中，步骤(b)中用氯仿、无水乙醇、丙酮、或异丙醇等异挥发的溶剂将步骤(a)中的有机溶剂溶解，并一同挥发除去。

在另一优选例中，步骤(c)中所述的无机物选自下述的一种或多种：碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钾。

在另一优选例中，步骤(c)中将沉淀1和pH小于5的水溶液混合0.5-12小时。

在另一优选例中，步骤(c)中还包括用纯水将无机物固体除去。

在另一优选例中，步骤(d)中的水蒸汽温度为100-150℃。

在另一优选例中，步骤(d)中的水蒸汽在0.05-0.3mPa压力下产生；更佳地，在0.1-0.2mPa压力下产生。

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的制备方法得到的肿瘤组织全抗原。

在本发明的第四方面，提供了一种疫苗组合物，所述的组合物包括如上所述的肿瘤组织全抗原和树突状细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种如上所述的制备方法得到的肿瘤疫苗。

在本发明的第六方面，提供了如上所述的肿瘤组织全抗原的用途，它用作或被用于制备肿瘤疫苗。

据此，本发明提供了一种肿瘤抗原，它来源于经过长期保存的肿瘤组织，但含有肿瘤全部蛋白抗原、抗原稳定；抗原冲击的疫苗，操作简便、易于质控，疫苗活性强。

附图说明

图1显示了ADC疫苗体外诱导的特异性CTL活性。

具体实施方式

甲醛固定后石蜡包埋的患者的肿瘤组织来源广泛，但长期得不到有效的利用，发明人发现如果将甲醛固定后石蜡包埋的患者的肿瘤组织，经脱蜡、脱醛、软化、抗原修复、匀浆破碎等处理后可以获得肿瘤抗原，用于体外冲击培养的DC后，能够制备获得具有较强免疫原性的DC疫苗。从而可以为所有的肿瘤患者(尤其是那些无法应用肿瘤抗原多肽及无法获得新鲜肿瘤组织的患者)提供DC疫苗，实施免疫治疗。

具体地，可以将甲醛固定后石蜡包埋的肿瘤活检组织，切割成为1-50μm厚的薄片；通过有机溶剂溶解石蜡、脱醛、软化的处理，经水溶液的抗原修复；再经灭活细胞浆中蛋白酶的处理、匀浆，能获得充分裂解的全部肿瘤抗原，体外加入不成熟DC培养，进一步加入诱导剂促进DC成熟，收集抗原冲击的DC，制备获得疫苗。

定义

如本文所用，“肿瘤组织全抗原”、“肿瘤组织的全抗原”和“肿瘤组织提取的全抗原”“肿瘤抗原”、“肿瘤组织来源抗原”、“肿瘤裂解抗原”、“肿瘤裂解物”、“肿瘤组织裂解抗原”、“肿瘤组织裂解物”可以互换使用，包括所有的膜抗原和胞浆内抗原，含有各种肿瘤特异性抗原、肿瘤相关性抗原、组织细胞特异性(或高表达)抗原等的蛋白、多肽。

如本文所用，“DC”和“树突状细胞”都是指具有抗原摄取、体内迁移能力的专职抗原提呈细胞，具有典型的形态特征(树突状)、免疫表型(HLA-DR+、CD80+、CD86+)、T细胞激活功能的一群免疫细胞。本发明选用来自于肿瘤组织全抗原同一生物体的DC，也可以是同种异体DC。本发明的DC的培养方法是本领域常规的方法，例如但不限于直接从外周血分离DC、从外周全血直接分离单个核细胞培养DC、经免疫磁珠分离单核细胞后培养DC、和/或从骨髓造血干细胞培养DC。

本发明提供的了一种制备肿瘤组织全抗原的方法，是从肿瘤活检组织的福尔马林(4-10％甲醛)固定的石蜡包埋样本获得肿瘤组织全抗原，通过本发明的这一技术方案，可以使几乎所有的肿瘤患者获得了进行疫苗免疫的可能性，因为对肿瘤患者实施手术切除后，其甲醛固定石蜡包埋肿瘤组织一般都是要保留数十年的。

本发明制备肿瘤组织全抗原的方法包括步骤：

(2)将含有肿瘤组织的溶液离心、得到沉淀1；

(6)将乳糜状液体和生理盐水(或其它溶液，例如但不限于：RPMI-1640，DMEM，PBS等)混合得到肿瘤组织全抗原。

步骤(1)中可以使用本领域熟知的可溶解石蜡的有机溶剂，优选二甲苯、硬脂酸、松节油、乙醇、丙酮、异丙醇、或其混合。

一般溶解石蜡的有机溶剂应当除去，因此在步骤(2)中先通过离心将有机溶剂除去，然后再通过一些易挥发、同时又能同步骤(1)中所使用的有机溶剂共溶的溶剂使沉淀1上不沾有溶剂，可以使用本领域熟知的具有这样的作用的溶剂，优选氯仿、无水乙醇、丙酮、异丙醇、或其混合。

沉淀1是硬的肿瘤组织，抗原物质包裹其内，为了使其软化和进一步脱去甲醛，发明人将沉淀1和碱性溶液(pH小于7(优选pH小于5))混合一定的时间，可以使用本领域熟知的pH在这个范围内的碱性溶液，优选无机物水溶液，所述的无机物选自碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钾、或其混合。混合时间视pH值及软化效果而定，一般为0.5-12小时，优选0.8-8小时，更佳地为1-6小时。可以在一定的温度下进行混合，可以是本领域常规的促进软化同时又能保持抗原生物活性的温度范围，例如5-65℃，优选25-45℃，更佳地为30-39℃。

为了洗去可能残留的无机物，用PBS、生理盐水、培养基、纯水等(优选注射用水)洗涤固体物质，除去液体得到沉淀2。沉淀2应是软化的肿瘤组织。

进一步的软化工作可以通过将沉淀2置于水蒸汽的环境中进行，经过水蒸汽处理，软化组织，经匀浆器研磨破碎细胞，更好地得到均一微小的抗原物质，另一方面高压蒸汽处理灭活了蛋白酶，避免细胞匀浆破碎后降解肿瘤抗原。可以使用本领域熟知的方法进行水蒸汽处理，例如但不限于高压蒸气灭活、常压蒸气处理；优选在0.05-0.3mPa压力下处理，更佳地，为在0.1-0.2mPa压力下处理。

本发明提供的肿瘤疫苗的制备方法，适用于各种实体肿瘤的DC疫苗制备，所述的肿瘤选自淋巴瘤、骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌、或结肠癌等实体肿瘤；优选肾癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤。

本发明建立新的DC疫苗的制备技术，在一个优选例中，具体操作步骤如下：

(一)提取肿瘤抗原

1.甲醛固定后石蜡包埋的患者的肿瘤组织，切割成为5-10μm厚的薄片；

2.将薄片和纯二甲苯混匀，溶解石蜡；

3.离心、除去二甲苯，加入无水乙醇，多次离心，除去具有毒性的有机溶剂，得到沉淀物；再用乙醇洗去有机溶剂；

4.加入pH小于5的碳酸钠水溶液，37℃水浴中1-6小时，离心弃去所有液体，再加入注射用水，振荡混匀、放置，反复1-5次，离心弃去所有液体；5.将沉淀物进行灭活细胞浆中的蛋白酶的处理，同时达到软化组织、肿瘤抗原获得复性的目的；

6.将处理后的沉淀物匀浆，可以使用本领域常规的方法；和

7.溶解获得淋巴瘤组织提取的全抗原。

(二)体外培养DC

1.获得上述淋巴瘤患者单个核细胞液；

2.将单个核细胞液和淋巴细胞分离液混合、离心；

3.吸取界面细胞，加入培养基，离心、收取细胞；所述培养基可以使用本领域常规的培养DC的培养基，例如但不限于，RPMI1640，、DMEM、生理盐水、PBS等；

4.将单个核细胞和DC培养基，例如但不限于，RPMI1640、DMEM、AIM-V等、混合、接种细胞，进行培养；和

5.将贴壁细胞和DC培养基，例如但不限于，Cellgro-DC、RPMI 1640、DMEM、AIM-V等、混合、培养，获得DC；所述的无血清DC培养基中还含有重组人粒细胞-巨噬细胞生长因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)。和

(三)抗原冲击DC

将DC和上述制备的淋巴瘤组织提取的全抗原混合、培养，得到DC疫苗。较佳地可以再加入诱导剂促进DC成熟，所述的诱导剂选自重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα)、IL-1、IFN-a、PGE2、IL-6、单核细胞条件培养上清；所述DC和上述制备的淋巴瘤组织提取的全抗原可以按本领域常规的细胞比例范围进行混合，例如但不限于20-200μg抗原/1×10⁶DC

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、所有患者都可以获得足够量的肿瘤抗原，DC疫苗易于制备，易于质控，可以适用于绝大部分实体肿瘤患者的治疗。

2、颗粒小，抗原性质均一，易于被DC摄取和抗原提呈。

3、获得肿瘤全部蛋白抗原，包括所有的膜抗原和胞浆内抗原，抗原性强，DC摄取后制备的疫苗携带的肿瘤抗原靶点全面，激发机体产生的抗肿瘤免疫更全面。

4、经高压处理，肿瘤抗原获得复性，同时灭活了细胞浆中的蛋白酶，不会消化掉肿瘤抗原，疫苗的抗原性更稳定。

5、制备DC疫苗的过程避免接触脂质转染剂、融合剂，DC疫苗的活性好。

总之，本发明制备的DC疫苗较现有DC疫苗的抗肿瘤免疫激活能力更强，适用性更广，可以被较好的应用于各类实体肿瘤的免疫治疗领域。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

制备淋巴瘤DC疫苗

(一)提取肿瘤抗原

1.甲醛固定后石蜡包埋的患者的淋巴瘤(弥漫大B细胞淋巴瘤)肿瘤组织，切取0.2g肿瘤组织，切割成为5-10μm厚的薄片，放入15ml的离心管内；

2.加入10ml 100％纯二甲苯，立即混匀，50℃孵育5分钟，溶解石蜡；

3.400g，离心1分钟，弃二甲苯。加入10ml无水乙醇，振荡混匀；

4.400g，离心1分钟，弃乙醇，再加入10ml无水乙醇，振荡混匀；

5.400g，离心1分钟，在不破坏沉淀的情况下尽可能地去除残留乙醇；

6.加入20％Na₂CO₃溶液10ml，放入37℃水浴中1-6小时；

7.400g，离心1分钟，弃去所有液体，再加入10ml注射用水，振荡混匀，放置2小时。如此反复3次；

8.400g，离心1分钟，弃去所有液体，放入高压蒸汽灭菌锅中处理15磅、10-30分钟；

9.将处理后的组织薄片放入无菌玻璃匀浆器中，匀浆至全部呈均质乳糜状液体；

10.加入无菌生理盐水2ml，轻轻吹打数次，溶解获得无菌的淋巴瘤组织提取的全抗原；

11.分装后-20℃保存备用。

(二)体外培养DC

1.上述淋巴瘤患者经血细胞分离机分离4个循环，获得1-5×10⁹单个核细胞液(100-200ml)；

2.将收取的单个核细胞液缓慢加入(20ml)数个预加20ml淋巴细胞分离液的50ml Falcon离心管(细胞悬液体积与分离液体积相等)，400×g室温离心20分钟；

3.离心后吸取界面细胞，加入全部界面细胞(各人不同，大约5×10⁸-2×10⁹，一般取1×10⁹细胞量)到30ml RPMI1640培养基(购自Gibco)中，200×g离心10分钟，洗涤3遍，收取细胞；

4.将经离心洗涤的单个核细胞用无血清DC培养基配成4×10⁶/ml的细胞悬液，种入750ml无菌Falcon培养瓶，接种体积50ml；

5.将盛有细胞的培养瓶置37℃、5％二氧化碳，饱和湿度的培养箱中培养贴壁2小时；

6.将培养瓶取出，轻轻摇晃十数次，使非贴壁细胞悬起，去除悬浮细胞，再缓慢往瓶中加入50ml RPMI1640培养基，轻轻晃动洗去残留非贴壁细胞；

7.往保留贴壁细胞的培养瓶中加入50ml含重组人粒细胞-巨噬细胞生长因子(rhGM-CSF)1000U/ml、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)500U/ml的无血清DC培养基(Cellgro-DC)，置5％二氧化碳，37℃，饱和湿度的培养箱中继续培养；

8.培养至第3天，往培养瓶中补充50ml含重组人粒细胞-巨噬细胞生长因子(rhGM-CSF)1000U/ml、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)500U/ml的无血清DC培养基(Cellgro-DC)，继续培养3天，即培养获得DC。

(三)抗原冲击DC

1.将培养瓶中的培养液(含悬浮的DC)吸入50ml离心管，200×g离心10分钟，收取细胞。将收取的DC用含重组人粒细胞-巨噬细胞生长因子(rhGM-CSF)1000U/ml、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)500U/ml的无血清DC培养基配成2×10⁶/ml的细胞悬液；

2.加入制备的淋巴瘤组织提取的全抗原100μg抗原/ml细胞悬液，培养8-18小时；

3.用数支50ml离心管收取经与肿瘤抗原孵育的树突状细胞悬液(100ml，200×g离心10分钟，收取细胞；再加入40ml无菌生理盐水，200×g离心10分钟洗涤，连续3次。收集细胞即为DC疫苗。

实施例2

DC疫苗体外诱导肿瘤特异性CTL

1.按实施例1的方法制备得到肿瘤抗原。

2.按实施例1的方法步骤制备DC。

3.DC抗原冲击：按照实施例1的有关步骤制备，获得DC疫苗。

4.分组及体外细胞毒性T淋巴细胞(CTL)培养：

制备患者外周血单个核细胞，用含10％胎牛血清(FCS)、重组人白细胞介素2(rh IL-2)(100U/ml)的RPMI1640培养基配成5×10⁵/ml的细胞悬液，种入4个培养瓶中，每瓶20ml，各瓶中再分别加入1×10⁵DC疫苗(ADC)；

对照组分别加入DC(DC)、生理盐水(NS)，培养第7天补充新鲜完全培养基及DC疫苗，细胞培养至第14天。

5.CTL检测：以患者肿瘤细胞作为靶细胞，LDH法检测CTL体外杀伤活性。

结果：DC疫苗体外可以诱导生成CTL，能够杀伤肿瘤细胞，活性显著高于对照组(图1)。

结果表明，此DC疫苗可以较好激活肿瘤特异性CTL，诱导较强的抗肿瘤免疫力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种肿瘤组织全抗原的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(2)将含有肿瘤组织的溶液离心、得到沉淀1；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将沉淀1和pH小于5的无机物水溶液混合0.5-12小时。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的无机物选自下述的一种或多种：碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钾。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的水蒸汽温度为100-150℃。

5.一种肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(f)将乳糜状液体和水溶液混合得到肿瘤组织全抗原；所述水溶液包括生理盐水、RPMI-1640、DMEM、和PBS；和

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述的无机物选自下述的一种或多种：碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钾。

7.一种如权利要求1-4任一所述的制备方法得到的肿瘤组织全抗原。

8.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物包括如权利要求7所述的肿瘤组织全抗原和树突状细胞。

9.一种如权利要求5或6任一所述的制备方法得到的肿瘤疫苗。

10.如权利要求7所述的肿瘤组织全抗原的用途，其特征在于，用作或被用于制备肿瘤疫苗。