CN114134122A - 一种巨噬细胞介导间充质干细胞定向分化培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域，公开了一种巨噬细胞介导间充质干细胞定向分化培养方法。包括如下步骤：组织细胞‑巨噬细胞多核巨细胞制备：组织细胞(自体或同种异体，)与巨噬细胞共同孵育，制备组织细胞‑巨噬细胞多核巨细胞；组织细胞‑巨噬细胞多核巨细胞分离纯化：微流控芯片分离出多核巨细胞；间充质干细胞定向分化：间充质干细胞与组织细胞‑巨噬细胞多核巨细胞再融合，合胞体分裂产生的杂交子细胞具有间充质干细胞及组织细胞的双重特性。该方法适合间充质干细胞向各种类型的组织细胞定向分化，而不需加入细胞因子等分化诱导剂。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，本发明涉及一种巨噬细胞介导间充质干细胞定向分化培养方法。特别是用于移植促进损伤组织修复与再生的定向分化干细胞的制备方法。
背景技术
细胞坏死是病理性原因导致的细胞被动死亡。组织损伤、病原微生感染、缺血及免疫反应等均可导致细胞坏死。组织器官大量的细胞坏死致使器官的功能降低，对人体的健康影响较大，而发生在脑、心脏及股骨头等组织细胞坏死具有较高的死亡率或致残率。坏死组织的修复对于器官功能的恢复、降低致残率或死亡率具有重要意义。间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下可分化为神经、肝、心肌、骨、内皮等多种组织细胞。间充质干细胞被认为是具有良好应用前景的细胞。目前干细胞临床研究项目多采用间充质干细胞静脉输注或病变组织局部移植，通过间充质干细胞在损伤微环境中定向分化，促进损伤组织的修复与再生。然而间充质干细胞直接移植常在损伤发生的后一周后移植有较好的治疗效果，同时间充质干细胞分化成组织细胞需要的时间较长，这对于干细胞的治疗效果造成较大影响，尤其是对于受力较大的器官的治疗，干细胞分化的时间长会影响修复的效果和功能的恢复，如心肌梗死的治疗。采用定向分化的干细胞移植，移植细胞更易于与正常组织细胞建立连接，使损伤组织的结构和功能尽快恢复。
然而现行的诱导干细胞分化的培养方法操作步骤多、培养过程中需在细胞培养基中添加细胞因子、分化诱导剂或转基因方法(如现有专利：CN113265373A、CN113215080A、CN113174364A及CN113174408A等)。细胞因子、分化诱导剂或转基因方法诱导干细胞定向分化的方式并非是干细胞在体内自然的分化方式。
发明内容
本发明旨在提供一种适于体内移植的、能够快速修复损伤组织的定向分化干细胞的制备方法。本发明提供的方法以巨噬细胞为中介使组织细胞的蛋白成分进入间充质干细胞或杂交子细胞中。该方法适合间充质干细胞向各种类型的组织细胞定向分化，而不需加入细胞因子等分化诱导剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种巨噬细胞介导间充质干细胞定向分化培养方法；是一种用于移植促进损伤组织修复与再生的定向分化间充质干细胞制备方法，包括如下步骤：
S1.组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞制备；组织细胞(自体或同种异体，)与巨噬细胞共同孵育，制备组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞；
S2.组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞的分离纯化；微流控芯片分离出多核巨细胞；
S3.间充质干细胞定向分化；间充质干细胞与组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞再融合，合胞体分裂产生的杂交子细胞具有间充质干细胞及组织细胞的双重特性。
组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞与间充质干细胞融合，随合胞体分裂间充质干细胞、组织细胞及巨噬细胞的成分随机分入到杂交子细胞中，这些分入到杂交子细胞成分含有蛋白质分子及mRNA等关键分子，杂交子细胞及导入组织细胞成分的间充质干细胞具备初步定向分化的特征。
进一步的，步骤S1.中的组织细胞采用饥饿法进行损伤处理，巨噬细胞与损伤处理后的组织细胞共培养制备组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞。
进一步的，步骤S1.中采用1：6-10巨噬细胞与组织细胞数量比例混合，37℃、5％CO2条件下孵育3-6天。
进一步的，所述S2.步骤中的组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞分离纯化，采用比重1.077±0.001的Ficoll-Hypaque密度梯度法离心，去除细胞碎片。将留取细胞洗涤3次后，调成细胞悬液，采用微流控芯片留取直径大于35微米的大体积细胞去除未融合巨噬细胞和组织细胞。
进一步的，所述S3.步骤中间充质干细胞与组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞按3-6：1比例混合，37℃、5％CO2条件下共培养24-96小时，使间充质干细胞与巨噬细胞-组织细胞多核巨细胞再融合形成组织细胞-巨噬细胞-间充质干细胞多核巨细胞，或多核巨细胞的伪足与间充质干细胞形成连结。组织细胞蛋白分子随组织细胞-巨噬细胞-间充质干细胞合胞体分裂分入杂交子细胞或通过多核巨细胞的伪足导入间充质干细胞中。杂交子细胞或导入组织细胞蛋白分子的间充质干细胞具有母细胞中的黏附分子、表面受体、功能蛋白等重要分子，具备细胞归巢、连接、接受调控和实现功能的分子基础，杂交子细胞具备初步分化为组织细胞的特征。
进一步的，所述S3.步骤中的合胞体分裂的杂交子细胞具有可分裂增殖及组织细胞的特性。
进一步的，所述S3.步骤中以巨噬细胞介导的细胞融合形成间充质干细胞-巨噬细胞-组织细胞多核巨细胞，使母细胞的中的蛋白分子随细胞分裂分入杂交子细胞中，使杂交子细胞兼具干细胞与组织细胞的特性。
所述方法中最终得到的细胞，采用细胞刮取细胞，生理盐水洗细胞3次，根据移植需要采用生理盐水调成1×107至2×108cell/ml备用。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
本发明提供的一种巨噬细胞介导间充质干细胞定向分化培养方法，适于间充质干细胞分化为各种类型的组织细胞，如：神经细胞、心肌细胞、肝细胞、肺上皮细胞、胰岛细胞、骨细胞等。而且本方法无须使用其他细胞因子，不会对干细胞、分化细胞的生物学特性及功能产生其他干扰。
现有技术采用特定的几种特定诱导剂诱导间充质干细胞分化成特定的分化细胞。而本发明提供的方法普适性良好，采用不同的组织细胞与巨噬细胞制备的组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞可使间充质干细胞分化成不同的组织细胞。
附图说明
图1为组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞荧光染料染色图。其中图a为组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞DIC照片；图b为组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞双荧光通道照片。采用Dio染色RAW247.7细胞：巨噬细胞细胞膜为绿色；采用Hoechst3342染色NCTC细胞：肝细胞细胞核为蓝色。
图2为组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞电子显微镜示意图。其中图a为组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞扫描电子显微镜照片；图b为组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞透射电子显微镜照片。
图3为组织细胞-巨噬细胞-干细胞多核巨细胞与杂交子细胞免疫荧光染色图。其中图a为组织细胞-巨噬细胞-干细胞多核巨细胞与杂交子细胞FITC-Albumin免疫荧光染色DIC照片；图b为组织细胞-巨噬细胞-干细胞多核巨细胞与杂交子细胞FITC-Albumin免疫荧光染色三荧光通道照片；图c为组织细胞-巨噬细胞-干细胞多核巨细胞与杂交子细胞FITC-CK18免疫荧光染色DIC照片；图d为组织细胞-巨噬细胞-干细胞多核巨细胞与杂交子细胞FITC-CK18免疫荧光染色三荧光通道照片。
Dil染色BMSC(间充质干细胞，红色细胞膜)，Hoechst3342染色NCTC(肝细胞，细胞核蓝色)；RAW247.7细胞(巨噬细胞)不做标记。杂交子细胞表达肝细胞标识分子Albumin及CK18。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施器材
低温常速离心机(Beckman，美国)、CO2细胞培养箱(Thermo，美国)、移液器(Thermo，美国)、刻度吸管(Kimble，美国)、75cm2培养瓶(Corning，美国)、15ml离心管(Corning，美国)、50ml离心管(Corning，美国)、96孔细胞培养板(Corning,美国)、细胞刮刀(Corning，美国)、细胞滤器(Corning，美国)、倒置显微镜(Nikon，日本)、80i激光扫描共聚焦显微镜与活细胞工作站(Nikon,日本)、酶标仪(BioTek，美国)、SU3500扫描电子显微镜(Hitachi,日本)、7650透射电子显微镜(Hitachi,日本)流式细胞仪(BD，美国)。
实验试剂
Ficoll-Hypaque细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)、氯化钠注射液(石家庄四药公司)、无血清细胞培养基(Gibco，美国)；DMEM细胞培养基(Gibco，美国)；优级胎牛血清(天津灏洋华科生物科技有限公司)；青链霉素混合液(Hyclone，美国)；0.25％EDTA胰蛋白酶(Hyclone，美国)；普通光学显微镜(Nikon，日本)；共聚焦显微镜(Nikon，日本)；Dio荧光染料(Bioss，中国)；Dil荧光染料(Bioss，中国)；Hoechst33342荧光染料(Bioss，中国)；4％多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)。
实施例1
一种巨噬细胞介导间充质干细胞定向分化培养方法；是一种用于移植促进损伤组织修复再生的定向分化的间充质干细胞制备方法，
组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞制备：组织细胞(来自同种异体的捐赠者)的分离与损伤处理：组织剪成2mm3组织块，装入滤网袋中研磨，冲洗滤网袋、200目滤网过滤细胞，Ficoll-Hypaque(密度：1.077±0.001)离心分离单个核细胞。洗涤细胞3次。采用1：6-10巨噬细胞与组织细胞比例混合，细胞总浓度2×105c/ml-2×106c/ml，37℃、5％CO2条件下，不换液、不传代培养6-9天。采用细胞刮刮取细胞，洗涤细胞3次。微流控芯片电泳，收集直径大于35微米的细胞，洗涤细胞3次。
间充质干细胞定向分化：间充质干细胞与组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞按3-6：1数量比例混合，37℃、5％CO2条件下共培养24-96小时，使间充质干细胞与巨噬细胞-组织细胞多核巨细胞再融合，组织细胞-巨噬细胞-间充质干细胞多核巨细胞分裂出的杂交子细胞具备初步定向分化的特征。
采用无血清培基进行效果测试。
巨噬细胞-NCTC1690细胞多核巨细胞制备：分别采用Dio、Dil及Hoechst3342标记巨噬细胞、间充质干细胞和NCTC 1690肝细胞。巨噬细胞与NCTC1690肝细胞按1：6比例混合，无血清培养基将细胞调成2×106c/ml，37℃、5％CO2条件下孵育6天。可见巨噬细胞-NCTC1690细胞多核巨细胞形成。(见图1、图2)。
巨噬细胞-NCTC1690细胞多核巨细胞分离纯化：密度离心、微流控芯片分选3个核以上细胞。
间充质干细胞与巨噬细胞-NCTC1690细胞多核巨细胞融合及分裂或物质交流：(巨噬细胞、间充质干细胞膜荧光染色、NCTC1690细胞荧光素染核)；
间充质干细胞-巨噬细胞-NCTC1690细胞多核巨细胞分裂产生的杂交子细胞具有NCTC1690的分子标识。免疫荧光染色检查结果：采用Dil间充质干细胞，并采用FITC标记的白蛋白、CK18单克隆抗体对子细胞进行免疫荧光染色。结果显示红色的子细胞表达表达白蛋白和CK18分子。蛋白组学检测结果：分别采用Dio、Dil标记巨噬细胞、间充质干细胞，流式细胞仪分选子细胞(红、绿双染色细胞)，对子细胞与间充质干细胞、子细胞与巨噬细胞及子细胞与NCTC细胞蛋白表达差异进行检测。结果显示对子细胞与间充质干细胞蛋白表达差异区段，而这一区段是子细胞与NCTC细胞及子细胞与巨噬细胞的无差异区段，结果表明子细胞中这一区段的蛋白来自NCTC细胞和巨噬细胞。这一区段的蛋白质涵盖细胞表面粘附分子、受体、细胞标识分子及部分功能蛋白等，而这些蛋白分子与细胞连接、调控信号接收及功能相关，这一区段的蛋白质使子细胞具备了初步分化的特征。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (7)
1.用于移植促进损伤组织修复与再生的定向分化间充质干细胞制备方法，其特征是，包括如下步骤：
S1.组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞制备；组织细胞与巨噬细胞共同孵育，制备组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞；
S2.组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞分离纯化；微流控芯片分离出多核巨细胞；
S3.间充质干细胞定向分化；间充质干细胞与组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞再融合，合胞体分裂产生的杂交子细胞具有间充质干细胞及组织细胞的双重特性。
2.如权利要求1所述的用于移植促进损伤组织修复与再生的定向分化间充质干细胞制备方法，其特征是，步骤S1.中的组织细胞采用饥饿法进行损伤处理，巨噬细胞与损伤处理后的组织细胞共培养制备组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞。
3.如权利要求2所述的用于移植促进损伤组织修复与再生的定向分化间充质干细胞制备方法，其特征是，步骤S1.中采用1：6-10巨噬细胞与组织细胞数量比例混合，37℃、5％CO2条件下孵育3-6天。
4.如权利要求1所述的用于移植促进损伤组织修复与再生的定向分化间充质干细胞制备方法，其特征是，所述S3.步骤中的合胞体分裂的杂交子细胞具有可分裂增殖及组织细胞的特性。
5.如权利要求1所述的用于移植促进损伤组织修复与再生的定向分化间充质干细胞制备方法，其特征是，所述S3.步骤中以巨噬细胞介导的细胞融合形成间充质干细胞-巨噬细胞-组织细胞多核巨细胞，使母细胞的中的蛋白分子随细胞分裂分入杂交子细胞中，使杂交子细胞兼具干细胞与组织细胞的特性。
6.如权利要求1所述的用于移植促进损伤组织修复与再生的定向分化间充质干细胞制备方法，其特征是，所述S2.步骤中的组织细胞-巨噬细胞多核巨细胞分离纯化，采用比重1.077±0.001的Ficoll-Hypaque密度梯度法离心，去除细胞碎片；将留取细胞洗涤3次后，调成细胞悬液，采用微流控芯片留取直径大于35微米的大体积细胞去除未融合巨噬细胞和组织细胞。
7.如权利要求1所述的用于移植促进损伤组织修与复再生的定向分化间充质干细胞制备方法，其特征是，所述方法中最终得到的细胞，采用细胞刮取细胞，生理盐水洗细胞3次，根据移植需要采用生理盐水调成1×107至2×108cell/ml备用。
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