KR20220061009A - 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 제조방법 - Google Patents

3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 구조의 마이크로웰을 이용하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하고, 이로부터 치료 효능이 향상된 세포외소포를 제조하는 방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 세포외소포에 관한 것이다. 본 발명의 세포외소포 제조방법을 이용하면, 효능이 증진된 세포외소포를 대량 생산가능하며, 제조된 세포외소포는 다양한 효능 인자를 기존 세포외소포에 비해 높은 수준으로 포함하고 공여자간 차이없이 균일한 특성을 나타내어, 의료업계에서 다양한 목적으로 사용될 수 있다.

Description

3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 제조방법 {Method for manufacturing extracellular vesicles derived from three-dimensional spheroid-type cell aggregates}
본 발명은 특정 구조의 마이크로웰을 이용하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하고, 이로부터 치료 효능이 향상된 세포외소포를 제조하는 방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 세포외소포에 관한 것이다.
다양한 질환에서 줄기세포, 특히 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)를 이용한 치료법과 긍정적인 임상 결과들이 보고되어 왔다. 줄기세포치료제의 치료 효능은 대부분 줄기세포의 근거리 분비(paracrine) 효과로 인하여 주변 피부세포의 재생과 혈관재생능력이 증진되었다고 보고하고 있다. 세포외소포(extracellular vesicles; EV)가 주요 근거리 분비 효과의 효능인자로 알려져 있다. 최근, 줄기세포로부터 분비되는 세포외소포의 분비로 인한 물질들이 다양한 줄기세포 치료효과를 매개한다는 점에서 주목을 받고 있다. 세포외소포는 30~5,000nm의 크기를 가지고 있으며 크기별로 엑소좀(exosome), 미세소포(microvesicle), 세포 사멸체(apoptotic body) 등으로 분류되며, 종류와 유래에 따라서 엑토좀(ectosome), 프로스타토좀(prostatosome) 등으로 불린다.
그러나 아직까지 줄기세포로부터 유래된 세포외소포를 사용하기 위한 대량생산 및 수득방법 등이 확립되어 있지 않다. 기존의 2차원 세포외소포 생산법의 경우 동물혈청(xenogeneic serum)을 사용하거나, 줄기세포로부터 세포외소포의 분비가 제한적이라 대량 생산이 어렵기 때문에, 임상 적용이 가능한 세포외소포를 대량 생산할 수 있는 새로운 생산법에 대한 필요성이 있다.
KR 10-2017-0123852 A
이에 본 발명자들은 3차원 스페로이드형 세포 응집체 또는 이로부터 유래한 세포외소포를 제조하기 위해, 대량 생산이 가능하면서, 배양시간을 단축할 수 있는 방법을 연구하였으며, 그 결과 마이크로웰을 이용한 정적 배양을 통해 3차원 스페로이드형 세포 응집체(3D-정적-스페로이드)를 제조하고, 이를 이용하여 세포외소포를 제조하면 치료 효능 물질이 향상된 세포외소포가 제조되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 마이크로웰을 통해 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하여 효능 인자 수준이 향상된 세포외소포를 제조하는 방법 및 이와 같은 제조방법을 통해 제조되는 세포외소포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000μm인 마이크로웰에 중간엽 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계를 포함하는 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 세포외소포를 제공한다.
또한, 본 발명은 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 중간엽 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 제조한 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 포함하는 세포외소포(extracellular vesicle) 제조용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 포함하는 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 의 공여자간 차이 (donor variation)를 감소시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 포함하는 공여자간 차이 (donor variation)가 감소된 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세포외소포 제조방법을 이용하면, 효능이 증진된 세포외소포를 대량 생산가능하며, 제조된 세포외소포는 다양한 효능 인자를 기존 세포외소포에 비해 높은 수준으로 포함하고 공여자간 차이없이 균일한 특성을 나타내어, 의료업계에서 다양한 목적으로 사용될 수 있다.
도 1은 3D 스페로이드형 세포 응집체를 제조하고, 이로부터 세포외소포를 분리하는 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2의 A는 3D-동적-PEG 스페로이드 배양액이 담긴 마이크로웰을 관찰한 도이다.
도 2의 B는 3D-정적-스페로이드 배양액이 담긴 마이크로웰을 관찰한 도이다.
도 2의 C는 3D-동적-PEG 스페로이드와 마이크로웰을 이용하여 제조한 3D-정적-스페로이드의 배양기간에 따른 응집체의 면적변화를 나타낸 도이다.
도 3은 3D-정적-스페로이드와 3D-동적-PEG 스페로이드의 크기 분포(size distribution)를 비교한 도이다.
도 4는 3D-정적-스페로이드 EV의 형태를 전자현미경으로 관찰한 도이다.
도 5는 3D-정적-스페로이드 EV의 농도 및 크기 분포를 확인하기 위한 NTA(nanoparticle tracking analysis) 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 3D-정적-스페로이드 EV의 발현 마커를 확인하기 위해, ELISA 및 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 3D-정적-스페로이드 EV, 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 및 2D-EV의 유래 세포당 EV 생산량을 비교한 도이다.
도 8은 2D-EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 miRNA 및 단백질을 나타낸 도이다.
도 9는 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 miRNA 및 단백질을 나타낸 도이다.
도 10은 2D 배양 WJ-MSC, 3D 배양 WJ-MSC, 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV 에서 donor variation 및 혈관 신생, 신경 재생 관련 miRNA 발현량 차이를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 3D-정적-스페로이드 EV 또는 2D-EV를 혈관내피세포(HUVECs) 또는 신경줄기세포인 pNSCs(primitive neural stem cells)에 처리한 후, mRNA의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 12는 뇌졸중 랫드 모델을 대상으로 3D-정적-스페로이드 EV 처리 농도에 따른 경색부위 면적 변화를 나타낸 도이다.
도 13은 뇌졸중 랫드 모델을 대상으로 레더 워킹 테스트를 실시하여, 3D-정적-스페로이드 EV 처리 농도에 따른 신경학적 행동 회복능을 측정한 도이다.
도 14는 CFSE 표지한 3D-정적-스페로이드 EV가 처리된 세포를 공 초점 현미경으로 관찰한 도이다.
도 15는 CFSE 표지한 3D-정적-스페로이드 EV에 의해 miR-27a-3p가 세포에 전달되는 것을 확인한 도이다.
본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계; 를 포함하는 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 세포외소포의 분리가 가능한 세포라면 제한없이 사용될 수 있으며, 자연계 생물 개체로부터 분리된 세포일 수 있다. 또한, 상기 세포는 인간 및 비인간 포유류를 포함하는 임의 유형의 동물, 식물 유래일 수 있고, 다양한 종류의 면역세포, 종양세포, 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 3차원 배양은 시험관 내에서 입체적 배치를 취하게 한 상태로 배양하는 것을 의미하며, 2차원 배양과 달리 3차원 배양시 생체 외(in vitro)에서 모든 방향으로 성장할 수 있도록 할 수 있고, 생체 내(in vivo) 세포 환경과 더욱 유사한 환경을 만들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 3차원 배양은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 3차원 세포 배양 기술에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 마이크로웰 어레이 배양, 다공성 미립구 배양, hanging drop 배양, low attachment plate 배양, membrane 기반 cell-detachment 배양, thermal lifting 배양, 원심분리 배양, semisolid medium 배양 등을 이용한 세포 배양일 수 있다. 바람직하게는 상기 3차원 배양은 동적(dynamic) 배양 또는 정적(static) 배양일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 정적(static) 배양하는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, (a) 단계의 3차원 배양을 정적(static) 배양하는 경우 진탕배양에 필요한 장치들을 필요로 하지 않아 배양을 더 용이하게 할 수 있으며, GMP (Good manufacturing practices, 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준) 제조소에서 대량 배양을 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 3차원 배양은 1 내지 10일간 배양하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 4일간 배양하는 것 일 수 있다. 특히 본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양을 2 내지 4일간 배양하는 경우 3차원 스페로이드형 세포 응집체 내 존재하는 세포의 생존률이 높은 수준으로 유지되며, 기존 3차원 스페로이드형 세포 응집체 제조 과정에 비해 배양시간이 상대적으로 짧아, 신속하게 3차원 스페로이드형 세포 응집체 및 이로부터 유래한 세포외소포를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 3차원 배양은 마이크로 웰에 중간엽 줄기세포를 100 내지 1000 세포/웰의 밀도로 분주하여 배양하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 200 내지 600 세포/웰의 밀도로 분주하여 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포외소포를 분리하는 단계는 물리적 분리 또는 화학적 분리에 의한 것일 수 있다. 상기 물리적 분리는 세포 또는 세포 응집체를 포함하는 시료의 압출일 수 있고, 화학적 분리는 세포 또는 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리할 수 있는 화학물질을 처리하는 것일 수 있다. 예컨대 본 발명의 분리하는 단계는 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 화학 물질 처리, 기계적 분해 및 외부적으로 세포에 힘을 가한 물리적 자극의 처리로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 이온 또는 친화도 크로마토그래피 방법으로 이온과 특정 바이오 마커와의 결합을 통해서 분리하는 물리화학적 방법이나, 폴리머 및 시약을 통해 세포를 파괴하고 세포외소포만 결합시켜 분리하는, immunoaffinity EV capture 또는 exosome purification reagent, ExoCAS-2 시약 또는 방법일 수 있고, 바람직하게는 탄젠셜 플로우 여과 (Tangential Flow filtration, TFF) 방법으로 분리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, MicroRNA는 RNA 일종으로 명명은 "mir"를 앞에 붙이고, 뒤에 "-"와 숫자를 넣는다. 이때 숫자는 종종 명명한 순서를 나타내기도 하는데, 예를 들어 mir-123은 mir-156보다 앞서 명명되었으며 보다 먼저 밝혀졌을 것으로 예상된다. "mir-"는 pre-microRNA를 나타내며, 대문자가 있는 "miR"은 mature microRNA를 의미한다. 한두 개의 서열을 제외하고 거의 동일한 서열의 microRNA들은 소문자를 추가하여 명명한다. 예를 들어 miR-121a와 miR-121b는 각각의 precursor인 mir-121a와 mir-121b에서 생성되었으며 서열도 매우 유사하다. Mature microRNA는 동일하지만 게놈상에서 다른 부위에 위치한 pre-microRNA는 추가로 "-"와 숫자를 넣어 명명한다. 일례로 pre-microRNA인 mir-121-1과 mir-121-2는 동일한 mature microRNA(miR-121)가 되지만, 게놈상에서 다른 부위에 위치해 있다. 종에 따른 microRNA의 명명은 앞쪽에 표기한다. 예를 들어 hsa-miR-123는 인간(Homo sapiens) microRNA, oar-miR-123는 양 (Ovis aries) microRNA이다. 'v'는 viral(miRNA encoded by a viral genome), 'd'는 Drosophila microRNA를 의미한다. 두 개의 mature microRNA가 동일한 pre-microRNA의 서로 다른 arms (3' arm 또는 5' arm)에서 유래한 경우, '-3p' 또는 '-5p'를 뒤쪽에 추가하여 명명한다. (과거에는 위와 같은 구분을 's' (sense)와 'as'(antisense)로 표기하였다). miR-142-3p는 3' arm에서 유래한 것이고, miR-142-5p는 5' arm에서 유래한 것이다. MicroRNA의 명명법은 일반적으로 위와 같은 기준을 따르지만 예외의 경우도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외소포는 치료 효능을 나타내는 다양한 물질을 공지된 세포외소포와 비교하여 고발현하는 것일 수 있으며, 상기 치료 효능을 나타내는 다양한 물질은 혈관신생, 신경신생, 세포보호, 면역조절, 회춘, 혈관/BBB 투과 안정, 항암효과 또는 표적화(targeting)에 효과를 나타내는 물질일 수 있다. 바람직하게 상기 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 대비, miR-146a, miR-27a, miR-132, miR-184, miR-210 및 miR-301b 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 및/또는 인테그린 1/2, 및 VEGF/R2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것일 수 있고, 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포 대비 miR-27a, miR-146a, miR-146b 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 인테그린 1/2, 및 VEGF/R2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게 본 발명의 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 대비 miR-146a, miR-27a, miR-132, miR-184, miR-210 및 miR-301b; 및/또는 인테그린 1/2, 및 VEGF/R2을 고발현하는 것일 수 있고, 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포 대비 miR-27a, miR-146a 및 miR-146b; 및/또는 인테그린 1/2, 및 VEGF/R2를 고발현하는 것일 수 있다.
또한, 상기 세포외소포는 세포에 처리시 세포 내로 혼입되어 내재화(internalization) 되는 것 일 수 있으며, 세포 내로 혼입되어 내재화 되는 경우가 있다. 이로 인해 임상적으로 유의미한 물질이 세포로 효과적으로 전달되어, 세포에서 높게 발현되는 것 일 수 있다.
본 발명에 있어서, “중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포”는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포 응집체로부터 분리한 세포외소포라면 제한없이 포함하는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 등록특허(출원번호 10-2016-0053026, 줄기세포 유래의 세포외소포체 생산방법)에 개시된 세포외소포일 수 있다.
본 발명에 있어서, “2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포”는 줄기세포를 통상적인 2차원 배양방법에 따라 배양하고, 통상적인 세포외소포 분리방법에 의해 분리된 세포외소포라면 제한없이 포함하는 것 일 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 통상적인 2차원 배양방법을 세포 스택(Cell stack)에서 3일간 배양한 줄기세포를 PBS 세척하고, 무혈청 배지로 교체하여 2일간 추가 배양하는 방법으로 실시하여 평가하였다.
본 발명에 있어서, 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체는 평균 직경이 65 내지 133 μm일 수 있으며, 바람직하게는 99.20 ± 11.47 μm, 더욱 바람직하게는 154개의 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체의 크기 분포 측정 결과 평균 직경이 99.20 μm, 분산계수(CV)가 11.6% 일 수 있다. 본 발명의 차원 스페로이드형 세포 응집체는 크기 분포의 첨도가 “중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체” 대비 높은 것 일 수 있다. 따라서, 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체의 크기는 “중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체”와 비교하여 크기가 작고, 상대적으로 균일한 크기분포를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로웰은 TMSPMA(3-(Trimetoxysily) propylmethacrylate), HEA(Hydroxyethyl acrylate), GMA(Glycidyl methacrylate), EGDMA(diethyleneglycol dimethacrylate), THFA(Tetrahydrofurfuryl acrylate), HMAA(Hydroxymethul acrylamide), PEA(Phenyl epoxyacrylate), HOFHA(6-Hydroxy-2, 2,3,3,4,4,5,5-octafluoro), EOPT(Polyethoxylated(4)pentaerythritoltetraacrylate), HPA(Hydroxypropyl acrylate), BMA(Buthylmethacrlate), PETIA(Pentaerythritol triacrylate), HDDA(Hexan diol diacrylate), EGPEA(Ethyleneglycol phenyletheracrylate), BM(Benzylmethacrylate), HPPA(Hydroxyphenoxypropyl acrylate), BHPEA(2-(4-Benzoyl-3-hydroxyphenoxy)ethylacrylate), HEMA(Hydroxyethyl methacrylate), HPMA(N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamide) 및 MPC(2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine Polymer)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 코팅된 것일 수 있으며, 바람직하게는 MPC(2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine Polymer)로 코팅된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 마이크로웰은 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 구조를 갖는 것 일 수 있으며, 상기 구조에 의해 배양되는 중간엽 줄기세포가 배양시간 경과 후에도 높은 수준으로 생존률을 유지하는 것 일수 있다.
본 발명의 상기 “3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법”으로 세포외소포를 제조하면, 정적 배양에 따른 제조상의 장점과 더불어, 치료 효능 물질이 향상된 세포외소포를 신속하고 효율적으로 대량생산 할 수 있다. 특히, 본 발명의 세포외소포 제조 방법은 GMP 적용에 적합하다는 특징이 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 세포외소포를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외소포는 치료 효능 물질을 공지된 세포외소포와 비교하여 고발현하는 것일 수 있다. 바람직하게 상기 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 대비, miR-146a, miR-27a, miR-132, miR-184, miR-210 및 miR-301b 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 및/또는 인테그린 1/2, 및 VEGF/R2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것일 수 있고, 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포 대비 miR-27a, miR-146a, miR-146b 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 인테그린 1/2, 및 VEGF/R2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게 본 발명의 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 대비 miR-146a, miR-27a, miR-132, miR-184, miR-210 및 miR-301b; 및/또는 인테그린 1/2, 및 VEGF/R2을 고발현하는 것일 수 있고, 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포 대비 miR-27a, miR-146a 및 miR-146b; 및/또는 인테그린 1/2, 및 VEGF/R2를 고발현하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외소포는 평균 입자 직경이 172.5 내지 192.5nm이고, 모드 직경이 96.1 내지 116.1nm인 것일 수 있다.
또한 본 발명의 제조방법으로 제조되는 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포는 특히 공여자간 차이 (donor variation)가 감소된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외소포는 뇌경색이 발생한 개체에 처리시, 뇌경색 부위를 감소시키는 것일 수 있으며, 신경학적 행동 회복을 유도하는 것 일 수 있다. 바람직하게 상기 세포외소포는 기존 공지된 방법으로 제조된 세포외소포와 비교하여, 적은 양으로 상기 뇌경색 부위 감소 효과 및 신경학적 행동 회복 유도를 나타내는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 중간엽 줄기세포를 3차원 배양하여 제조한 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 포함하는 세포외소포(extracellular vesicle) 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 세포외소포를 제조하기 위해 필요한 성분이라면 제한없이 포함하는 것 일 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 포함하는 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 의 공여자간 차이 (donor variation)를 감소시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 포함하는 공여자간 차이 (donor variation)가 감소된 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 수득되는 세포 응집체 유래 세포외소포들 간 공여자에 따른 miRNA 조성 차이가 감소되어 균일한 특성을 갖는 세포외소포를 제조할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명에 있어 공여자간 차이의 감소란, 공여자에 따라 생산되는 miRNA 조성이 상이하게 나타나는 차이를 감소시켜, 공여자와 무관하게 일관성있는 miRNA 프로파일을 나타내도록 하는 것이며, 더욱 바람직하게는 2D-EV와 비교하여 혈관 신생 효과 또는 신경 재생 효과를 나타낼 수 있는 miRNA 인 miR-27a-3p, miR-146a-5p, miR-210, miR-132를 더 많이 균일하게 포함하거나, 혈관 신생이나 신경 재생과 관련된 miRNA 인 miR-199a, miR-125b, miR-26a, let-7, miR-125a, miR-181b, miR-92a 들을 각 공여자들 유래와 무관하게 균일한 정도로 발현하는 것일 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
웨스턴 블롯
세포 및 세포외소포를 방사선 면역 침전 분석 (radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 완충제(25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.5 % triton X-100, 1 % Na-deoxycholate, 0.1 % sodium dodecyl sulfate (SDS) 및 단백질 분해 효소 억제제)에 용해시켰다. 총 20㎍의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 옮겼다. 그 다음, 니트로셀룰로오스 막을 히스톤 H2A.Z, 히스톤 H3, 라민 A/C, 플로틸린-1 (1:1,000, Cell signaling technology, 비벌리, MA, USA) 또는 칼레티쿨린 (1:1,000, ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA)에 대한 일차항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. Tris-완충 식염수-트윈 20 (Tris-buffered saline-Tween 20)으로 세척 후, 니트로셀룰로오스 막을 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)-접합 이차 항체 (1 : 1,000, 항-토끼, Cell Signaling Technology, 비벌리, MA, USA)와 함께 2 시간 배양하였다. 단백질을 ThermoFisher Scientific, Inc. (Waltham, MA, USA)의 화학 발광 기질을 사용하여 검출하였다. 표지 단백질을 X-선 필름(Agfa, Mortsel, Belgium)을 통해 시각화하였다.
ELISA
ELISA는 개별 제조업체의 메뉴얼에 따라 상용 키트로 수행하였다. 다음과 같은 ELISA 키트를 사용하였다: 겐타마이신 (5111GEN, EuroProxima, Arnhem, Nederland), 소 알부민 (8100, Alpha Diagnostic, San Antonio, TX, USA), Hsp70 (Abcam, Cambridge, UK), CD63, CD9 및 CD81 (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA), 히스톤 H2A.Z. (Mybiosource, San Diego, CA, USA), 칼레티쿨린 (Mybiosource) 및 사이토크롬 C (ThermoFisher Scientific, Inc.). 모든 키트에는 표준 단백질을 포함하고 있다; 따라서, 단백질 및 세포외소포의 양은 각 키트의 표준 곡선에 기초하여 결정된다.
qPCR
EV에서 TrizolTM 을 이용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출하고 나노드롭(nanodrop)으로 RNA를 정량하였다. RNA는 역전사반응 (reverse transcription;RT) 과정을 거쳐 cDNA로 만들고, 각각의 miRNA 및 mRNA에 적합한 Taqman probe를 사용하여 제조업체의 매뉴얼에 따라 Real Time PCR을 진행하였다.
EV 라벨링 및 세포에 의한 흡수
정제된 EV를 제조업체의 지침에 따라 CFSE (5- (and-6) -Carboxyfluorescein Diacetate, Succinimidyl Ester) 라벨링 염료 (c-1157, Invitrogen)로 염색하였다. 1시간 동안 100.000 g 조건에서 초 원심분리하여 과잉 염료를 제거하였다. 표지된 EV (0.4μg/ml)를 인간 NSC 세포주 (ReNcells®)에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 2 회 세척하고 통상적인 면역 세포 화학 프로토콜을 사용하여 염색하였다. 세포를 마우스 항-SMA (1 : 100, Sigma aldrich) 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고 2 차 항체인 DyLight 표지된 항 마우스 IgG (1 : 200, 594nm, Abcam) 항체와 함께 배양하였다. 1.5 μg/mL 4'-6' diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories)과 함께 VectashieldTM를 사용하여 핵 염색 한 후, 공 초점 현미경 (LSM 700, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 세포를 이미지화하였다.
실시예 1. 중간엽 줄기세포의 3차원 배양을 통한 세포외소포 분리
1.1 중간엽 줄기세포의 준비
5 계대배양(passage 5) 단계의 인간 탯줄 유래의 중간엽 줄기세포(이하, WJ-MSC, Samsung medical center, 서울, 한국)를 분양받아 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 성장 배지는 10 % 우 태아 혈청 (FBS) (GIBCO, NY, USA) 및 50 μg/mL 젠타마이신 (GIBCO, NY, USA)을 함유하는 α-modified eagle's medium(α-MEM, GIBCO, NY, USA)을 사용하였다. 6 계대배양(passage 6) 단계의 WJ-MSC를 3D 스페로이드형 세포 응집체 제작에 사용하였다.
1.2 3D 스페로이드형 세포 응집체 배양액 제작
상기 실시예 1.1에서 제작한 WJ-MSC를 PBS에 세척하고, 트립신 (TrypLETM Express, GIBCO, NY, USA) 처리하여 CO2 배양기에서 5 분간 반응시켰다. 이 후, 새로운 무혈청배지를 넣어 트립신을 중화시켜 세포를 회수하고, 원심분리기를 이용해 세포 펠렛을 수득하였다. 그 다음, 새 무혈청배지를 넣어 세포 현탁액을 제조하고, 세포를 계수하였다. 세포 계수 후, MPC(2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine Polymer)로 코팅된 직경과 깊이가 각각 500 μm × 200 μm인 마이크로웰을 포함하는 마이크로어레이에 60 ml의 세포 현탁액을 400 cell/well의 밀도가 되도록, 균일하게 분주하고, 정적인 상태를 유지하며 자발적 스페로이드형 세포 응집체 형성을 유도하고, 총 4일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양하여, 3D 스페로이드형 세포 응집체 배양액(이하, 3D-정적-스페로이드 배양액)을 제조하였다.
1.3 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 분리
실시예 1.2에서 제조한 3D-정적-스페로이드 배양액을 회수하고, 세포 이물질 제거를 위해, 2,500g에서 10분간 원심분리하고 0.22 μm 시린지 필터로 여과하였다. 이후, 3D-정적-스페로이드 배양액을 탄젠셜 플로우 여과 (Tangential Flow filtration, TFF) 시스템을 이용해 300kDa의 hollow fiber membrane(Pall, NY, USA)을 거쳐 단백질을 제거하여 세포외소포를 1차 분리하고, 생리식염수로 한 번 더 정제하여 순도 높은 본 발명의 3D-정적-스페로이드 유래 세포외소포(이하, 3D-정적-스페로이드 EV)를 수득하였다.
상기 실시예 1.1 내지 1.3의 과정을 도식화하여 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 3D 스페로이드형 세포 응집체의 특성 분석
상기 실시예 1.2에서 제조한 3D-정적-스페로이드 배양액 내 존재하는 3D 스페로이드형 세포 응집체(이하, 3D-정적-스페로이드)의 특성을 분석하였다. 실험군으로, 실시예 1.2에서 제조한 3D-정적-스페로이드 배양액을 사용하였으며, 비교군으로, 등록특허(출원번호 10-2016-0053026, 줄기세포 유래의 세포외소포체 생산방법)에 개시된 동적 3D 세포 배양 방법에 따라, 5일간 중간엽 줄기세포를 배양하여 제조한 3D 중간엽 줄기세포 스페로이드형 세포 응집체 (이하, 3D-동적-PEG 스페로이드) 배양액을 사용하였다. 광학현미경으로, 각각의 배양액이 담긴 마이크로웰을 관찰하여, 이를 도 2의 A, B에 나타내었고, 배양 초기 대비 배양 후 스페로이드형 세포 응집체의 면적 변화를 도 2의 C에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 실험군인 3D-정적-스페로이드와 비교군인 3D-동적-PEG 스페로이드의 면적을 비교한 결과, 3D-정적-스페로이드는 배양 초기의 스페로이드 대비 70% 정도의 면적을 유지하였다. 그러나, 3D-동적-PEG 스페로이드에서는 세포 이물질(cell debris)이 발생하여, 배양 초기의 스페로이드 대비 50% 정도의 면적으로 감소하였으며, 3D-정적-스페로이드와 3D-동적-PEG 스페로이드의 면적 감소율 차이는 p≤0.5 로 통계적으로 유의한 결과를 보였다(p=0.019753).
실시예 3. 3D 스페로이드형 세포 응집체의 크기 분석
실시예 1.2에서 제조한 3D-정적-스페로이드와 실시예 3에서 제조한 3D-동적-PEG 스페로이드의 크기 분포(size distribution)를 측정하고, 측정된 크기 분포 데이터를 토대로, 분산계수, 왜도(skewness), 첨도(kurtosis)를 분석하였다.
왜도는 중앙값의 추이로부터 분포가 기울어진 방향과 정도를 알 수 있는 파라미터로 1에 가까울수록 오른쪽으로 꼬리를 길게 뻗은 분포를 나타내며, -1에 가까울수록 왼쪽으로 꼬리를 길게 뻗은 분포를 나타낸다. 정규분포인 경우의 왜도는 0이다.
첨도는 자료 분포의 뾰족함 정도를 나타내는 파라미터로, 값이 양수인 경우 중앙 부분에 상대적으로 많은 수의 자료점이 쌓여있는 것을 의미하며, 음수인 경우 중앙 부분에 상대적으로 적은 수의 자료가 쌓여있는 것을 의미한다. 정규분포인 경우의 첨도는 0이다.
측정한 크기 분포 데이터를 도 3에 나타내었고, 이를 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.
3D-동적-PEG 스페로이드 3D-정적-스페로이드
스페로이드 수 154 154
크기 범위(Range) 108.4 - 225.0 um 55.9 - 131.0 um
크기 (mean ± SD) 148.66 ± 20.89 um 99.20 ± 11.47 um
분산계수 (Coefficient of variance) 14.1% 11.6%
왜도 (Skewness) 0.694 ± 0.195 -0.745 ± 0.195
첨도 (Kurtosis) 0.350 ± 0.389 1.799 ±0.389
도 3 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 3D-정적-스페로이드의 평균 크기가 99.20um, 분산계수(CV)가 11.6%인 것을 확인하였다. 이와 대조적으로, 3D-동적-PEG 스페로이드는 평균 크기가 148.66um, 분산계수(CV)가 14.1%인 것을 확인하였다. 측정한 분산계수를 비교 검정하기 위해, Feltz and Miller's (1996) asymptotic test를 실시한 결과, p value값이 0.01765604로 산출되었으며, Krishnamoorthy and Lee's (2014) modified signed-likelihood ratio test를 실시한 결과, p value값이 0.01853969로 산출되었다. 따라서, 두가지 테스트 모두에서 3D-정적-스페로이드와 3D-동적-PEG 스페로이드의 크기 분포가 통계적으로 유의한 정도로 상이한 양상을 나타낸다는 것을 확인하였다. 3D-정적-스페로이드와 3D-동적-PEG 스페로이드의 크기 분포를 비교한 결과, 3D-정적-스페로이드의 크기 분포의 첨도 값이 상대적으로 큰 것을 확인하여, 본 발명의 3D-정적-스페로이드의 크기 분포는 중앙값에 많이 몰린 양상을 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 3D-정적-스페로이드 제조방법으로 3D 스페로이드를 제조하면, 크기가 상대적으로 일정한 3D 스페로이드의 제조가 가능한 것을 확인하였다.
실시예 4. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 형태 분석
실시예 1.3에서 분리한 3D-정적-스페로이드 EV의 형태를 관찰하기 위해 전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 이용하여 촬영하였다. 구체적으로, 3D-정적-스페로이드 EV를 0.1M 포스페이트 완충액(PB)에 용해된 1 % OsO4로 2시간 동안 고정시켰다. EM 그리드를 세포외소포 방울 위에 포름바(formvar)측 면을 아래로 향하게 하여 1분간 흡착시켰다. 그 후, 여과지로 블로팅하고, 15 초 동안 2 % 우라닐 아세테이트와 반응시켰다. 과량의 우라닐 아세테이트를 제거하고, EM 그리드를 TEM (JEM-1011, JEOL, Japan)을 사용하여 관찰하였으며, 관찰 영상을 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 3D-정적-스페로이드 EV는 전형적인 세포외소포의 형태인 둥근 형상인 것을 확인하였다.
실시예 5. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 농도 및 크기 분석
실시예 1.3에서 분리한 3D-정적-스페로이드 EV의 농도 및 크기 분포를 확인하기 위해, NanoSight NS300 (Malvern, Worcestershire, UK)를 이용한 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 실시하였다. 최적의 분석을 위해 3D-정적-스페로이드 EV를 소포(vesicle)가 없는 포스페이트 완충용액(PBS)에 미리 희석하였다. 평균 크기 및 농도 (particle / mL)는 3 개의 기록을 통합하여 계산하였으며, 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 3D-정적-스페로이드 EV의 평균 입자 직경은 182.5nm이고, 모드 직경은 106.1nm인 것을 확인하였다.
실시예 6. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 발현 마커 분석
실시예 1.3에서 분리한 3D-정적-스페로이드 EV의 발현 마커를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 대조군으로 세포 용해물(cell lysate)과 분비체(secretome)을 사용하였다. 세포 용해물은 3D-정적-스페로이드를 PBS 세척하고, 트립신을 처리한 후 세포를 회수하여, 회수된 세포를 원심분리기를 이용하여 세포 펠렛을 수득하는 방법으로 준비하였다. 분비체는 상기 세포 펠렛 수득 후, 상층액인 배양배지에서 실시예 1.3의 공정을 통해 EV를 분리하고, 남은 배양 분비체를 얻는 방식으로 준비하였다. 마커 분석은 ELISA를 이용하여 세포외소포 특이적인 양성 마커 CD9, CD63, CD81 및 HSP70을 정량하였으며, 특정 오염 단백질 마커인 칼레티큘린, 히스톤 H2A.Z, 사이토크롬 C, 알부민, 항생제를 정량하였다. 또한, 웨스턴 블롯을 이용하여 세포외소포의 특정 오염 단백질 마커인 히스톤 H2A.Z, 히스톤 H3, 라민 A/C, 칼레티큘린을 정량하였고, 세포외소포 양성 마커인 플로틸린-1을 정량하였다. ELISA 분석결과 및 웨스턴 블롯 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 3D-정적-스페로이드 EV는 세포외소포 특이 양성 마커인 CD9, CD63, CD81 및 HSP70을 모두 발현하고 있으며, 세포 용해물 및 분비체(secretome)에서 높게 발현되는 오염 단백질 마커인 칼레티큘린, 히스톤 H2A.Z, 히스톤 H3, 사이토크롬 C, 알부민(BSA, bovine serum albumin), 라민 A/C 및 항생제가 거의 발현하지 않는 것을 확인하였다. 특히, 세포 용해물에서 매우 낮게 발현하는 세포외소포 양성 마커 플로틸린-1이 3D-정적-스페로이드 EV에서 상대적으로 높게 발현하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 생산량 분석
실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV, 실시예 2의 3D-동적-PEG 스페로이드로부터 분리한 세포외소포(3D-동적-PEG 스페로이드 EV) 및 통상적인 2D 배양방법으로 배양한 줄기세포로부터 분리한 세포외소포(2D-EV)의 생산량을 비교하기 위한 실험을 실시하였다. 2D-EV는 다음과 같은 공정으로 준비하였다. 세포 스택(Cell stack)에서 3일간 배양한 줄기세포를 PBS 세척하고, 무혈청 배지로 교체하여 2일간 추가로 배양한다. 배양배지를 회수하고 원심분리 및 0.2 μm 필터를 이용해 세포 이물질을 연속적으로 제거한다. 이후, 배양배지를 TFF 시스템을 이용해 hollow fiber membrane을 거쳐 단백질을 제거하여 EV를 1차 분리하고 생리식염수로 한 번 더 정제하여 순도 높은 2D-EV를 수득하였다. 준비된 3D-정적-스페로이드 EV, 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 및 2D-EV의 유래 세포당 생산량을 비교하였으며, 이를 표 2 및 도 7에 나타내었다.
2D-EV 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 3D-정적-스페로이드 EV
생산량 (EVs/cell) 2437 EVs/cell 6791 EVs/cell 6840 EVs/cell
실시예 8. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 발현 마이크로 RNA(miRNA) 분석8.1 3D-정적-스페로이드 EV에서 발현이 증가된 miRNA 확인
실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV, 실시예 2의 3D-동적-PEG 스페로이드로부터 분리한 세포외소포인 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 및 실시예 7에서 제조한 2D-EV의 특성 차이를 확인하기 위하여 miRNAs의 발현 및 단백질 발현을 qPCR을 통해 측정하였으며, 2D-EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 miRNA 및 단백질을 도 8에 나타내었으며, 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 miRNA 및 단백질을 도 9에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 2D-EV와 비교하여, 3D-정적-스페로이드 EV는 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis) 및 면역조절에 효능을 나타내는 miRNA인 miR-27a, miR-146b, miR-146a을 높게 발현하며, 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis)에 효능을 나타내는 단백질인 인테그린 1/2 및 VEGF/R2 (Vascular endothelial growth factor/R2)를 높게 발현하는 것을 확인하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 3D-동적-PEG 스페로이드 EV와 비교하여, 3D-정적-스페로이드 EV는 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis) 및 면역조절에 효능을 나타내는 miRNA인 miR-146a, 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis)에 효능을 나타내는 miRNA인 miR-27a, miR-132, miR-184 및 miR-210 및 항 종양 효능을 나타내는 miR-301b를 높게 발현하며, 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis)에 효능을 나타내는 단백질인 인테그린 1/2 및 VEGF/R2를 높게 발현하는 것을 확인하였다.
이러한 결과로부터 실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV는 2D-EV 또는 3D-동적-PEG 스페로이드 EV와 비교하여, miRNA와 단백질 발현이 상이한 새로운 세포외소포이며, 특히, 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis), 면역조절, 회춘(rejuvenation) 또는 항 종양과 관련된 miRNA를 높게 발현하여, 임상적으로 유용하게 사용될 수 있는 세포외소포임을 확인하였다.
8.2 공여자에 따른 miRNA 발현 차이 분석
줄기세포 치료제는 공여자에 따라 성분이 상이하게 나타나는 donor variation 문제가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 3D-정적 스페로이드 EV가 donor variation 이슈없이 보다 일관성있는 miRNA 프로파일을 나타내는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 각 공여자의 시료는 Samsung medical center(서울, 한국)에서 분양받아 사용하였다. 실시예 1.1 의 2D 배양된 WJ-MSC와 3D 배양된 WJ-MSC, 실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV 의 공여자 별 miRNA 프로파일을 비교하였다. miRNA 는 Small RNA sequencing 방법으로 miRNA 프로파일링하였으며, 그 결과를 도 10 에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 2D 배양된 WJ-MSC, 2D-EV 는 공여자에 따라 생산되는 miRNA 조성 차이가 많은 반면, 3D 배양된 WJ-MSC, 3D-정적-스페로이드 EV 는 공여자에 따른 차이가 줄어드는 것을 확인하였다. 특히 3D-정적-스페로이드 EV 는 공여자에 따른 차이없이 일관성있는 miRNA 프로파일을 나타냄과 동시에 특히 2D-EV와 비교하여 혈관 신생 효과 또는 신경 재생 효과를 나타낼 수 있는 miRNA 인 miR-27a-3p(1.5배), miR-146a-5p(2.3배), miR-210(2.6배), miR-132(2.6배) 가 더 많이 균일하게 포함되어 있는 것을 확인하였다. 또한 그 외 혈관 신생이나 신경 재생과 관련된 miRNA 인 miR-199a, miR-125b, miR-26a, let-7, miR-125a, miR-181b, miR-92a 들도 각 공여자들 사이에 균일한 정도의 발현을 나타내는 것을 확인하였다.
이러한 결과는, 3D-정적-스페로이드 EV가 공여자에 따른 치료 유효성분의 차이를 줄이고, 더 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 나타내는 결과이다.
실시예 9. 세포에 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포 처리시 발현 mRNA의 분석
실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV와 통상적인 2D 배양방법으로 배양한 줄기세포로부터 분리한 세포외소포인 2D-EV를 혈관내피세포(HUVECs) 또는 신경줄기세포인 pNSCs(primitive neural stem cells)에 처리한 후, mRNA의 발현 변화를 qPCR을 통해 확인하였으며, qPCR 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 2D-EV를 처리한 세포 대비 3D-정적-스페로이드 EV를 처리한 혈관내피세포(HUVECs)는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), Hif-1a (Hypoxia-inducible factor 1-alpha), FGF(Fibroblast growth factor)의 발현이 증가하였으며, 3D-정적-스페로이드 EV를 처리한 pNSCs는 VEGF, BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), FGF, NGF(Nerve growth factor), HGF(Hepatocyte growth factor)의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 특히, 대조군과 비교하여 2D-EV를 처리한 pNSCs의 경우 NGF 및 HGF의 발현이 감소하였으나, 3D-정적-스페로이드 EV를 처리한 pNSCs는 NGF 및 HGF의 발현이 증가하는 효과를 나타낸 바, 3D-정적-스페로이드 EV와 2D-EV는 정성적으로도 다른 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
VEGF, BDNF, NGF, HGF 및 Hif-1a은 혈관신생/신경신생 관련 단백질이며, FGF는 세포의 증식, 생존, 분화와 관련한 생물학적 기능을 조절하는 단백질에 해당하는 인자로써, VEGF, BDNF, NGF, HGF, Hif-1a 및 FGF의 발현 증가 효과가 상대적으로 높은 3D-정적-스페로이드 EV가 임상적으로 적용하기에 우수한 세포외소포임을 확인하였다.
실시예 10. 뇌졸중 랫드 모델에 대한 3D-정적-스페로이드 EV의 효과
10.1 뇌졸중 랫드 모델의 제조
뇌졸중 랫드 모델을 제조하기 위해, 관내 혈관 폐색법(intraluminal vascular occlusion method)을 사용하여 일시적인 중뇌 동맥 폐색 (transient middle cerebral artery occlusion, tMCAo)을 유도하였다. 구체적으로, 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 렛드 (8 주, 270-300g)를 사용하였으며, 1.5 % 이소플루란, 70% N2O 및 30% O2로 마취시키고, 수술시간 동안 가열 패드를 사용하여 37.0-37.5℃로 체온을 유지하였다. 둥근 팁을 갖는 4-0 외과용 단일 필라멘트 나일론 봉합사를 좌측 온목 동맥(left common carotid artery)에서 중뇌 동맥(middle cerebral artery)의 기원(origin)을 막을 때까지 내측 목동맥(internal carotid artery)의 내강으로 전진시켰다. 팁이 온목동맥의 내강을 막을 때까지 봉합사를 당겨내어(withdraw) 중뇌 동맥 폐쇄(tMCAo)하고, 90 분 후에 재관류를 수행하였다. 두개 내 동맥(intracranial artery)의 파열에 의해 유발된 출혈성 변형(hemorrhagic transformation) 또는 지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage)이 발생한 랫드 및 중뇌 동맥 폐쇄(tMCAo) 후 관찰 가능한 신경학적 결함을 나타내지 않은 랫드는 분석에서 제외하였다.
10.2 뇌졸중 랫드 모델에 대한 3D-정적-스페로이드 EV의 뇌 경색 부위 감소 효과 검증
실시예 10.1에서 제조한 뇌졸중 랫드 모델을 대상으로, 3D-정적-스페로이드 EV의 처리농도를 3 X 108, 30 X 108 EVs/rat으로 각각 달리하여 처리하고, 처리 4주 뒤 MRI를 촬영하여, 경색(infarct)이 일어난 부위의 변화를 측정하였다. 대조군으로는 PBS 처리군을 사용하였으며, 측정한 경색 부위 변화를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 3 X 108 EVs/rat 이상의 농도로 처리한 모든 실험군에서 유의하게 경색부가 감소한 것을 확인하였다.
이와 같은 결과는 기존에 알려진 3D 방식으로 제조한 스페로이드형 세포형 응집체 유래의 세포외소포는 30 X 108 EVs/rat의 농도 이상으로 처리한 경우에 유의한 정도의 뇌 경색 부위감소 효과가 나타남을 고려하면, 3D-정적-스페로이드 EV는 적은 양으로도 효과적으로 뇌 경색 부위를 감소시키는 효과를 나타내는 것임을 확인하였다.
10.3 뇌졸중 랫드 모델에 대한 3D-정적-스페로이드 EV의 신경학적 행동 회복능 검증
실시예 10.1에서 제조한 뇌졸중 랫드 모델을 대상으로, 3D-정적-스페로이드 EV의 처리농도를 3 X 108, 30 X 108 EVs/rat으로 각각 달리하여 처리하고, 레더 워킹 테스트(ladder walking test)를 실시하여, 3D-정적-스페로이드 EV의 신경학적 행동 회복능을 검증하였다. 대조군으로 PBS 처리군을 사용하였으며, 비교군으로 3 X 108 cell/rat 농도의 인간 탯줄 유래의 중간엽 줄기세포를 사용하였다.
구체적인, 레더 워킹 테스트 방법은 다음과 같다. 중뇌 동맥 폐쇄 (tMCAo) 전과 중뇌 동맥 폐쇄 후 4, 7, 14 및 28 일에 실험 조건을 모르는 단일 관찰자에 의해 레더 워킹 테스트를 수행하였다. 실험을 위한 사다리 장치는 동물이 가로 질러 걷는 금속 수평 사다리와 투명한 측벽으로 구성되었다. 발을 헛딛는 횟수(발 오류)와 총 걸은 횟수를 측정하여, 발 오류 비율(% of foot fault)을 산정하였으며, 산정한 발 오류 비율을 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 중뇌 동맥 폐쇄 4일 후 측정한 레더 워킹 테스트 결과, 3 X 108, 30 X 108 EVs/rat 농도의 3D-정적-스페로이드 EV 처리군에서만 유의하게 발 오류 비율이 대조군 대비 감소한 것을 확인하였으며, 특히 30 X 108 EVs/rat 농도의 3D-정적-스페로이드 EV 처리군은 모든 구간에서 발 오류 비율을 감소시키는 것을 확인하였다.
이러한 결과로부터 중간엽 줄기세포와 비교하여, 3D-정적-스페로이드 EV가 신경학적 행동 회복을 빠르게 유도함을 확인하였다. 이와 같은 결과는 기존에 알려진 3D방식으로 제조한 스페로이드형 세포형 응집체 유래의 세포외소포는 30 X 108 EVs/rat의 농도 이상으로 처리한 경우에 유의한 정도의 신경학적 행동 회복 효과가 나타난다는 사실과 비교하여, 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV는 적은 양으로도 효과적으로 신경학적 행동 회복을 유도함을 보여주는 결과이다.
실시예 11. 3D-정적-스페로이드 EV의 세포 혼입능 및 miRNA 전달능 평가
11.1 3D-정적-스페로이드 EV의 세포 혼입능 평가
3D-정적-스페로이드 EV의 세포 혼입능을 평가하기 위해, CFSE 표지한 3D-정적-스페로이드 EV를 인간 NSC 세포주 (ReNcells®)에 처리하고 24시간 동안 배양하고, 공 초점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Germany)으로 이를 확인하였으며, 이를 도 14 에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 3D-정적-스페로이드 EV를 세포에 처리하면, 세포로 혼입되어 내재화(internalization)되는 것을 확인하였다.
11.2 3D-정적-스페로이드 EV 처리에 의한 miRNA 발현 평가
실시예 11.1에서 CFSE 표지한 3D-정적-스페로이드 EV가 처리된 인간 NSC 세포주 (ReNcells®)에서 miR-27a-3p의 발현을 RT-qPCR 을 사용하여 측정하였다. 대조군으로 표지한 3D-정적-스페로이드 EV가 처리되지 않은 인간 NSC 세포주 (ReNcells®)를 사용하였으며, 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 대조군 대비 3D-정적-스페로이드 EV를 처리한 세포에서 유의하게 miR-27a-3p의 발현이 증가한 것을 확인하였다.
이를 통해, 3D-정적-스페로이드 EV를 세포에 처리하면, miR-27a-3p와 같은 3D-정적-스페로이드 EV에서 고발현하는 임상적으로 유의미한 물질이 세포로 효과적으로 전달되는 것을 확인하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계; 를 포함하는 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 및 배아줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 3차원 배양은 정적(static) 배양하는 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 3차원 배양은 1 내지 10일간 배양하는 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 3차원 배양은 마이크로 웰에 중간엽 줄기세포를 100 내지 1000 세포/웰의 밀도로 분주하여 배양하는 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포외소포를 분리하는 단계는 물리적 분리 또는 화학적 분리에 의한 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포외소포를 분리하는 단계 이전에 원심분리 후, 필터로 여과하는 단계를 더 포함하는, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포외소포를 분리하는 단계는 탄젠셜 플로우 여과 (Tangential Flow filtration, TFF) 방법으로 분리하는 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 대비 miR-146a, miR-27a, miR-132, miR-184, miR-210 및 miR-301b로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 세포외소포는 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포 대비 miR-27a, miR-146a 및 miR-146b로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 대비 인테그린 1/2 및 VEGF/R2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 세포외소포는 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포 대비 인테그린 1/2 및 VEGF/R2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체는 평균 직경이 65 내지 133 μm 인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 마이크로웰은 TMSPMA(3-(Trimetoxysily) propylmethacrylate), HEA(Hydroxyethyl acrylate), GMA(Glycidyl methacrylate), EGDMA(diethyleneglycol dimethacrylate), THFA(Tetrahydrofurfuryl acrylate), HMAA(Hydroxymethul acrylamide), PEA(Phenyl epoxyacrylate), HOFHA(6-Hydroxy-2, 2,3,3,4,4,5,5-octafluoro), EOPT(Polyethoxylated(4)pentaerythritoltetraacrylate), HPA(Hydroxypropyl acrylate), BMA(Buthylmethacrlate), PETIA(Pentaerythritol triacrylate), HDDA(Hexan diol diacrylate), EGPEA(Ethyleneglycol phenyletheracrylate), BM(Benzylmethacrylate), HPPA(Hydroxyphenoxypropyl acrylate), BHPEA(2-(4-Benzoyl-3-hydroxyphenoxy)ethylacrylate), HEMA(Hydroxyethyl methacrylate), HPMA(N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamide) 및 MPC(2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine Polymer)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 코팅된 것인, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  15. 제1항에 있어서, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle)는 공여자간 차이 (donor variation)가 감소된 것을 특징으로 하는, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle).
  17. 제16항에 있어서, 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle)는 공여자간 차이 (donor variation)가 감소된 것을 특징으로 하는, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle).
  18. 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 중간엽 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 제조한 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 포함하는 세포외소포(extracellular vesicle) 제조용 조성물.
  19. (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 포함하는, 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 의 공여자간 차이 (donor variation)를 감소시키는 방법.
  20. (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 포함하는, 공여자간 차이 (donor variation)가 감소된 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 를 제조하는 방법.
KR1020210143641A 2020-11-05 2021-10-26 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 제조방법 KR102583927B1 (ko)

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