KR102632701B1 - 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는 혈관신생촉진용 조성물 - Google Patents
3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는 혈관신생촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 새로운 제조방법으로 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물 및 혈관 신생 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명의 새로운 방법으로 제조된 세포외 소포는 혈관 신생을 촉진할 수 있는 다양한 인자들을 고발현하고, 혈관의 재생을 유도할 수 있으므로, 혈관 재생이 필요한 다양한 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 새로운 제조방법으로 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물 및 혈관 신생 촉진 방법에 관한 것이다.
다양한 질환에서 줄기세포, 특히 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)를 이용한 치료법과 긍정적인 임상 결과들이 보고되어 왔다. 그러나 줄기세포치료제는 부작용으로 혈관 폐색, 종괴형성, 응고장애 등 세포관련 부작용의 위험성이 있으며, 아직까지 임상시험을 통해 효능 검증이 필요한 상황이다. 줄기세포의 근거리 분비(paracrine) 효과가 주변 피부세포의 재생과 혈관 재생능력이 증진을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 특히 세포외소포(extracellular vesicles; EV)가 주요 근거리 분비 효과의 효능인자로 알려져 있다.
세포외소포란 크기에 따라 엑소좀(exosome)과 미세소포(microvesicle)로 분류하는데 엑소좀은 직경 30~150nm이며, 미세소포는 100~1,000nm의 크기를 갖는다. 세포외소포는 세포막 일부가 혈중으로 떨어져 나온 것으로, 단백질과 핵 성분 모두를 함유하고 있어 세포간 커뮤니케이션을 매개하는 것으로 알려져 있다. 줄기세포 대신 세포외소포를 사용하는 것은 줄기세포의 사용에 따른 부작용을 최소화하여 안전성을 높일 뿐 아니라 생체 분포(biodistribution), 생산공정 측면에서도 유리하다.
그러나 아직까지 줄기세포로부터 유래된 세포외소포를 사용하기 위한 대량생산 및 수득방법 등이 확립되어 있지 않고, 줄기세포-유래 세포외소포의 특성을 유지하면서도 세포외소포가 가지고 있는 효능을 더욱 증진시킬 수 있는 방법에 대해서는 연구가 많이 이루지지 않았다.
따라서, 효능이 더욱 증진된 세포외소포 및 이를 이용한 새로운 치료제에 대한 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 3차원 스페로이드형 세포 응집체 또는 이로부터 유래한 세포외소포를 제조하기 위해, 대량 생산이 가능하면서, 배양시간을 단축할 수 있는 방법을 연구하였으며, 그 결과 마이크로웰을 이용한 정적 배양을 통해 3차원 스페로이드형 세포 응집체(3D-정적-스페로이드)를 제조하고, 이를 이용하여 세포외소포를 제조하면 혈관 신생 촉진능이 향상된 세포외소포가 제조되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 혈관 신생 촉진능이 향상된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 제조하고, 이를 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는, 혈관신생 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는, 혈관신생 촉진용 in vitro 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 포함하는, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm 이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포와 소포를 분리하는 단계를 통해 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle)를 필요로 하는 개체에 처리하는 단계; 를 포함하는 혈관 신생 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 새로운 방법으로 제조된 세포외소포는 혈관 신생을 촉진할 수 있는 다양한 인자들을 고발현하고, 혈관의 재생을 유도할 수 있으므로, 혈관 재생이 필요한 다양한 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 3D 스페로이드형 세포 응집체를 제조하고, 이로부터 세포외소포를 분리하는 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2A는 3D-동적-PEG 스페로이드 배양액이 담긴 마이크로웰을 관찰한 도이다.
도 2B는 3D-정적-스페로이드 배양액이 담긴 마이크로웰을 관찰한 도이다.
도 2C는 3D-동적-PEG 스페로이드와 마이크로웰을 이용하여 제조한 3D-정적-스페로이드의 배양기간에 따른 응집체의 면적변화를 나타낸 도이다.
도 3은 3D-정적-스페로이드와 3D-동적-PEG 스페로이드의 크기 분포(size distribution)를 비교한 도이다.
도 4는 3D-정적-스페로이드 EV의 형태를 전자현미경으로 관찰한 도이다.
도 5는 3D-정적-스페로이드 EV의 농도 및 크기 분포를 확인하기 위한 NTA(nanoparticle tracking analysis) 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 3D-정적-스페로이드 EV의 발현 마커를 확인하기 위해, ELISA 및 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 유래 세포당 3D-정적-스페로이드 EV, 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 및 2D-EV의 생산량을 비교한 도이다.
도 8은 2D-EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 miRNA 및 단백질을 나타낸 도이다.
도 9는 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 혈관 신생 관련 miRNA 를 나타낸 도이다.
도 10은 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV 에서 혈관 신생 관련 miRNA 인 miR-210 의 발현을 비교한 결과, 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV 처리에 따른 HUVEC 세포에서 GAPDH를 확인한 결과 및 Ephrin A3 발현 억제에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11a는 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV (WJ-3D EV)에서 donor에 따른 EV 생산량, EV 크기, EV 포함 단백질 양의 차이를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 2D 배양 WJ-MSC, 3D 배양 WJ-MSC, 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV 에서 donor variation 및 혈관 신생 관련 miRNA 발현량 차이를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 3D-정적-스페로이드 EV 를 혈관내피세포(HUVECs) 에 처리한 후, 혈관 신생 관련 인자인 VEGF, Hif-1a, FGF 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 혈관내피세포(HUVECs) 에 PBS(con), VEGF, 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV 를 처리하고, 튜브 형성 효과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 뇌경색 동물모델에 대조군으로 PBS 또는 실험군으로 3D-정적-스페로이드 EV를 처리 후 뇌경색 병변 및 뇌실의 부피 변화 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 뇌경색 동물 모델에 대조군으로 PBS 또는 실험군으로 3D-정적-스페로이드 EV 를 처리 후, 신경 혈관 생성 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 뇌경색 동물 모델에 3D-정적-스페로이드 EV를 주입한 후, 운동 기능 상실 회복 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 3D-정적-스페로이드 EV 제조에 있어, 마이크로웰의 직경, 깊이와 웰 당 세포 수를 달리한 후 제조되는 3D 스페로이드 크기, Roundness, Solidity 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 다양한 조건으로 제조된 3D-정적-스페로이드 EV와 2D-EV 에서 발현되는 miRNA-132 및 miRNA-210 의 발현양을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 다양한 조건으로 제조된 3D-정적-스페로이드 EV와 2D-EV 의 혈관 생성능을 tube formation 실험을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2A는 3D-동적-PEG 스페로이드 배양액이 담긴 마이크로웰을 관찰한 도이다.
도 2B는 3D-정적-스페로이드 배양액이 담긴 마이크로웰을 관찰한 도이다.
도 2C는 3D-동적-PEG 스페로이드와 마이크로웰을 이용하여 제조한 3D-정적-스페로이드의 배양기간에 따른 응집체의 면적변화를 나타낸 도이다.
도 3은 3D-정적-스페로이드와 3D-동적-PEG 스페로이드의 크기 분포(size distribution)를 비교한 도이다.
도 4는 3D-정적-스페로이드 EV의 형태를 전자현미경으로 관찰한 도이다.
도 5는 3D-정적-스페로이드 EV의 농도 및 크기 분포를 확인하기 위한 NTA(nanoparticle tracking analysis) 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 3D-정적-스페로이드 EV의 발현 마커를 확인하기 위해, ELISA 및 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 유래 세포당 3D-정적-스페로이드 EV, 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 및 2D-EV의 생산량을 비교한 도이다.
도 8은 2D-EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 miRNA 및 단백질을 나타낸 도이다.
도 9는 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 혈관 신생 관련 miRNA 를 나타낸 도이다.
도 10은 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV 에서 혈관 신생 관련 miRNA 인 miR-210 의 발현을 비교한 결과, 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV 처리에 따른 HUVEC 세포에서 GAPDH를 확인한 결과 및 Ephrin A3 발현 억제에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11a는 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV (WJ-3D EV)에서 donor에 따른 EV 생산량, EV 크기, EV 포함 단백질 양의 차이를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 2D 배양 WJ-MSC, 3D 배양 WJ-MSC, 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV 에서 donor variation 및 혈관 신생 관련 miRNA 발현량 차이를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 3D-정적-스페로이드 EV 를 혈관내피세포(HUVECs) 에 처리한 후, 혈관 신생 관련 인자인 VEGF, Hif-1a, FGF 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 혈관내피세포(HUVECs) 에 PBS(con), VEGF, 2D-EV 및 3D-정적-스페로이드 EV 를 처리하고, 튜브 형성 효과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 뇌경색 동물모델에 대조군으로 PBS 또는 실험군으로 3D-정적-스페로이드 EV를 처리 후 뇌경색 병변 및 뇌실의 부피 변화 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 뇌경색 동물 모델에 대조군으로 PBS 또는 실험군으로 3D-정적-스페로이드 EV 를 처리 후, 신경 혈관 생성 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 뇌경색 동물 모델에 3D-정적-스페로이드 EV를 주입한 후, 운동 기능 상실 회복 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 3D-정적-스페로이드 EV 제조에 있어, 마이크로웰의 직경, 깊이와 웰 당 세포 수를 달리한 후 제조되는 3D 스페로이드 크기, Roundness, Solidity 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 다양한 조건으로 제조된 3D-정적-스페로이드 EV와 2D-EV 에서 발현되는 miRNA-132 및 miRNA-210 의 발현양을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 다양한 조건으로 제조된 3D-정적-스페로이드 EV와 2D-EV 의 혈관 생성능을 tube formation 실험을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 세포외소포의 분리가 가능한 세포라면 제한없이 사용될 수 있으며, 자연계 생물 개체로부터 분리된 세포일 수 있다. 또한, 상기 세포는 인간 및 비인간 포유류를 포함하는 임의 유형의 동물, 식물 유래일 수 있고, 다양한 종류의 면역세포, 종양세포, 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 3차원 배양은 시험관 내에서 입체적 배치를 취하게 한 상태로 배양하는 것을 의미하며, 2차원 배양과 달리 3차원 배양 시 세포 성장은 세포로 하여금 생체 외 (in vitro)에서 모든 방향으로 성장할 수 있도록 하고, 그것은 생체 내 (in vivo)에서의 세포 환경과 더욱 유사한 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 3차원 배양은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 3차원 세포 배양 기술에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 마이크로웰 어레이 배양, 다공성 미립구 배양, hanging drop 배양, low attachment plate 배양, membrane 기반 cell-detachment 배양, thermal lifting 배양, 원심분리 배양, semisolid medium 배양 등을 이용한 세포 배양일 수 있다. 바람직하게는 상기 3차원 배양은 동적(dynamic) 배양 또는 정적(static) 배양일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 정적(static) 배양하는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, (a) 단계의 3차원 배양을 정적(static) 배양하는 경우 진탕배양에 필요한 장치들을 필요로 하지 않아 배양을 더 용이하게 할 수 있으며, GMP (Good manufacturing practices, 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준) 제조소에서 대량 배양을 가능케 하는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 3차원 (3 dimension) 배양은 1 내지 10일간 배양하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 4일간 배양하는 것 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양을 2 내지 4일간 배양하는 경우 3차원 스페로이드형 세포 응집체 내 존재하는 세포의 생존률이 높은 수준으로 유지되며, 기존 3차원 스페로이드형 세포 응집체 제조 과정에 비해 배양시간이 상대적으로 짧아, 신속하게 3차원 스페로이드형 세포 응집체 및 이로부터 유래한 세포외소포를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 3차원 배양은 마이크로 웰에 중간엽 줄기세포를 100 내지 1000 세포/웰의 밀도로 분주하여 배양하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 600 세포/웰의 밀도로 분주하여 배양하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100 내지 500 세포/웰의 밀도로 분주하여 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포외소포를 분리하는 단계는 세포 또는 세포 응집체를 포함하는 시료를 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 화학 물질 처리, 기계적 분해 및 외부적으로 세포에 힘을 가한 물리적 자극의 처리로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 탄젠셜 플로우 여과 (Tangential Flow filtration, TFF) 방법으로 분리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, MicroRNA의 명명은 "mir"를 앞에 붙이고, 뒤에 "-"와 숫자를 넣는다. 이때 숫자는 종종 명명한 순서를 나타내기도 하는데, 예를 들어 mir-123은 mir-156보다 앞서 명명되었으며 보다 먼저 밝혀졌을 것으로 예상된다. "mir-"는 pre-microRNA를 나타내며, 대문자가 있는 "miR-"은 mature microRNA를 의미한다. 한두 개의 서열을 제외하고 거의 동일한 서열의 microRNA들은 소문자를 추가하여 명명한다. 예를 들어 miR-121a와 miR-121b는 각각의 precursor인 mir-121a와 mir-121b에서 생성되었으며 서열도 매우 유사하다. Mature microRNA는 동일하지만 게놈상에서 다른 부위에 위치한 pre-microRNA는 추가로 "-"와 숫자를 넣어 명명한다. 일례로 pre-microRNA인 mir-121-1과 mir-121-2는 동일한 mature microRNA(miR-121)가 되지만, 게놈상에서 다른 부위에 위치해 있다. 종에 따른 microRNA의 명명은 앞쪽에 표기한다. 예를 들어 hsa-miR-123는 인간(Homo sapiens) microRNA, oar-miR-123는 양 (Ovis aries) microRNA이다. 'v'는 viral(miRNA encoded by a viral genome), 'd'는 Drosophila microRNA를 의미한다. 두 개의 mature microRNA가 동일한 pre-microRNA의 서로 다른 arms (3' arm 또는 5' arm)에서 유래한 경우, '-3p' 또는 '-5p'를 뒤쪽에 추가하여 명명한다. miR-142-3p는 3' arm에서 유래한 것이고, miR-142-5p는 5' arm에서 유래한 것이다. MicroRNA의 명명법은 일반적으로 위와 같은 기준을 따르지만 예외의 경우도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외소포는 임상적으로 유의미한 물질을 공지된 세포외소포와 비교하여 고발현하는 것일 수 있으며, 상기 임상적으로 유의미한 물질은 혈관신생 효과를 나타내는 물질일 수 있다. 예컨대 바람직하게 본 발명의 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 및 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외 소포 대비 혈관 신생과 관련된 miR-27a, miR-132, miR-146a, miR-146b, miR-184, 및 miR-210로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것일 수 있고, VEGF(Vascular endothelial growth factor), Hif-1a (Hypoxia-inducible factor 1-alpha) 및 FGF(Fibroblast growth factor) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게 본 발명의 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 및 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외 소포 대비 혈관 신생과 관련된 miR-27a, miR-132, miR-146a, miR-146b, miR-184, 및 miR-210, VEGF, Hif-1a 및 FGF를 고발현하는 것일 수 있다.
또한, 상기 세포외소포는 세포에 처리시 세포 내로 혼입되어 내재화(internalization) 되는 것 일 수 있으며, 세포 내로 혼입되어 내재화 되는 경우, 세포외소포에서 고발현하는 임상적으로 유의미한 물질을 세포로 효과적으로 전달하여, 세포에서 높게 발현되는 것 일 수 있다.
본 발명에 있어, 혈관 신생 촉진 효과를 나타내는 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포는 “3D-정적-스페로이드-EV”와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한 이와 비교하여 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포는 “3D-동적-PEG-스페로이드-EV”와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, “중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포”는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적배양한 스페로이드형 세포 응집체로부터 분리한 세포외소포라면 제한없이 포함하는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 등록특허(출원번호 10-2016-0053026, 줄기세포 유래의 세포외소포체 생산방법)에 개시된 세포외소포일 수 있다.
본 발명에 있어서, “2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포”는 줄기세포를 통상적인 2차원 배양방법에 따라 배양하고, 통상적인 세포외소포 분리방법에 의해 분리된 세포외소포라면 제한없이 포함하는 것 일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 통상적인 2차원 배양방법을 세포 스택(Cell stack)에서 3일간 배양한 줄기세포를 PBS 세척하고, 무혈청 배지로 교체하여 2일간 추가 배양하는 방법으로 실시하였다.
본 발명에 있어서, 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체는 평균 직경이 74.43 ± 7.756 μm 인 것일 수 있으며 바람직하게는 55 내지 95.0μm 크기 범위를 갖고, 155개의 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체의 크기 분포 측정 결과 평균 직경이 74.43μm, 분산계수(CV)가 9.59% 일 수 있다. 본 발명의 3차원 스페로이드형 세포 응집체는 크기 분포의 첨도가 “중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체” 대비 높은 것 일 수 있다. 따라서, 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체의 크기는 “중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체”와 비교하여 크기가 작고, 상대적으로 균일한 크기분포를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로웰은 TMSPMA(3-(Trimetoxysily) propylmethacrylate), HEA(Hydroxyethyl acrylate), GMA(Glycidyl methacrylate), EGDMA(diethyleneglycol dimethacrylate), THFA(Tetrahydrofurfuryl acrylate), HMAA(Hydroxymethul acrylamide), PEA(Phenyl epoxyacrylate), HOFHA(6-Hydroxy-2, 2,3,3,4,4,5,5-octafluoro), EOPT(Polyethoxylated(4)pentaerythritoltetraacrylate), HPA(Hydroxypropyl acrylate), BMA(Buthylmethacrlate), PETIA(Pentaerythritol triacrylate), HDDA(Hexan diol diacrylate), EGPEA(Ethyleneglycol phenyletheracrylate), BM(Benzylmethacrylate), HPPA(Hydroxyphenoxypropyl acrylate), BHPEA(2-(4-Benzoyl-3-hydroxyphenoxy)ethylacrylate), HEMA(Hydroxyethyl methacrylate), HPMA(N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamide) 및 MPC(2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine Polymer)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 코팅된 것일 수 있으며, 바람직하게는 MPC(2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine Polymer)로 코팅된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 마이크로웰은 직경이 200 내지 800 μm일 수 있고, 바람직하게는 300 내지 800μm, 더욱 바람직하게는 400 내지 800 μm 의 직경을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 마이크로웰은 깊이가 없는 평평한 구조의 마이크로웰이거나, 깊이를 형성하는 마이크로웰인 경우 100 내지 1000 μm, 바람직하게는 100 내지 900μm, 더욱 바람직하게는 200 내지 900 μm인 구조를 갖는 것 일 수 있다.
상기 구조에 의해 배양되는 중간엽 줄기세포가 배양시간 경과 후에도 높은 수준으로 생존률을 유지하는 것 일 수 있다. 바람직하게는 상기 마이크로웰을 1,000개 내지 100,000개 포함하는 마이크로 어레이를 제작하여, 세포응집체의 생산 수율을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 상기 “3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 제조 방법”으로 세포외소포를 제조하면, 정적 배양에 따른 제조상의 장점과 더불어, 임상 적용성, 특히 혈관 신생 능력이 향상된 세포외소포를 신속하고 효율적으로 대량생산 할 수 있다. 특히, “중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포” 제조방법 또는 “2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포” 제조 방법과 같은, 기존의 세포외소포 제조 방법이 GMP에 부적합한 것과 달리, 본 발명의 세포외소포 제조 방법은 GMP 적용에 적합하다는 특징이 있으므로, 혈관 신생을 위한 약학적 조성물 제조에 특히 적합할 수 있다.
본 발명에 있어, 혈관 신생이란 신생혈관 형성(angiogenesis) 를 의미하며, 혈관 내피세포의 이동을 유도 또는 증가시키고, 혈관 내피세포에서 튜브 형성을 촉진하여 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정을 의미한다.
본 발명의 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포는 혈관 신생을 촉진할 수 있는 다양한 인자들을 고발현하고, 혈관의 재생을 유도할 수 있으므로, 혈관 재생이 필요한 다양한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포가 적용될 수 있는 혈관 신생이 필요한 질환의 종류는 이에 제한되는 것은 아니나, 화상, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 심혈관계 질환, 뇌혈관성 질환 및 탈모증으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있고, 특히 심혈관계질환 또는 뇌혈관성 질환일 수 있다.
또한 본 발명의 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포는 특히 뇌혈관 신생 촉진에 유용하므로, 혈관 신생 촉진용 조성물은 뇌 혈관 신생 촉진용일 수 있다.
뇌조직은 평상시 많은 양의 혈류를 공급받고 있으나, 외부 또는 내부의 자극에 의하여 뇌혈관이 막히는 경우가 발생하여 뇌에 공급되는 혈액량이 감소하면 뇌조직이 기능을 제대로 하지 못하게 된다. 뇌혈류 감소가 일정 시간 이상 지속되면 뇌조직이 괴사되는데, 뇌조직이 괴사되어 회복 불가능한 상태에 이른 것을 뇌경색(cerebral infarction)이라고 하며, 여기에는 뇌혈전증과 뇌색전증이 포함된다. 혈전증(血栓症)은 혈관의 국소에서 혈액이 굳어져서 혈관을 막는 것을 말하며, 혈전이 생기면 그 혈관의 영역은 혈류가 두절되며, 다른 곳으로부터의 부혈행로에 의한 보상이 충분하지 않으면 그 부위의 뇌조직은 사멸된다. 색전증은 심장 속에 생긴 혈전이 혈류에 의하여 말초(末梢)로 운반되어 말초의 혈관이 막히는 것을 말하며, 색전에 의하여 혈관이 막히면 그 부분의 뇌조직은 사멸한다. 본 발명의 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포는 뇌 혈관의 신생을 촉진할 수 있으므로, 뇌경색에 의한 뇌혈류 감소를 회복시키는데 유용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 이밖에 다른 약학적 활성 성분이나 활성 혼합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함 될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는, 혈관신생 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 약학적 조성물에 관한 설명을 모두 동일하게 인용할 수 있다. 상기 식품은 특히 건강기능식품을 포함한다. 본 발명에서 정의되는 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 다양한 식품 또는 음료 등에 기능성 성분을 첨가한 형태의 식품 조성물이 될 수있다. 상기 식품은, 예를 들어, 음료, 분말음료, 고형물, 츄잉검, 차, 비타민 복합제, 식품 첨가제 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는, 혈관신생 촉진용 in vitro 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 혈관신생 촉진용 in vitro 조성물은 실험적 목적으로 사용될 수 있으며, 혈관 신생이 필요한 분리된 세포, 조직에 처리하기 위한 목적의 조성물 일 수 있다. 본 발명의 혈관신생 촉진용 in vitro 조성물은 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는 배지 조성물일 수 있고, 상기 배지는 당분야의 통상의 기술자에게 알려진 배지를 제한없이 포함할 수 있고, 예컨대 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, EMEM, MEM, Iscove's MEM, 199 배지, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM, DMEM과 F12의 혼합물, Way-mo, McCoy's 5A, 또는 혈관 신생이 필요한 세포를 배양하기에 적합한 당 분야에 알려진 배지를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 3차원(3D, 3 dimension) 배양하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 포함하는, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법에 의하면, 혈관 신생 촉진효과가 우수한 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 GMP 기준에 맞춰, 신속하게 대량으로 생산할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
웨스턴 블롯
세포 및 세포외소포를 방사선 면역 침전 분석 (radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 완충제(25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.5 % triton X-100, 1 % Na-deoxycholate, 0.1 % sodium dodecyl sulfate (SDS) 및 단백질 분해 효소 억제제)에 용해시켰다. 총 20㎍의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 옮겼다. 그 다음, 니트로셀룰로오스 막을 히스톤 H2A.Z, 히스톤 H3, 라민 A/C, 플로틸린-1 (1:1,000, Cell signaling technology, 비벌리, MA, USA) 또는 칼레티쿨린 (1:1,000, ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA)에 대한 일차항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. Tris-완충 식염수-트윈 20 (Tris-buffered saline-Tween 20)으로 세척 후, 니트로셀룰로오스 막을 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)-접합 이차 항체 (1 : 1,000, 항-토끼, Cell Signaling Technology, 비벌리, MA, USA)와 함께 2 시간 배양하였다. 단백질을 ThermoFisher Scientific, Inc. (Waltham, MA, USA)의 화학 발광 기질을 사용하여 검출하였다. 표지 단백질을 X-선 필름(Agfa, Mortsel, Belgium)을 통해 시각화하였다.
ELISA
ELISA는 개별 제조업체의 메뉴얼에 따라 상용 키트로 수행하였다. 다음과 같은 ELISA 키트를 사용하였다 : 겐타마이신 (5111GEN, EuroProxima, Arnhem, Nederland), 소 알부민 (8100, Alpha Diagnostic, San Antonio, TX, USA), Hsp70 (Abcam, Cambridge, UK), CD63, CD9 및 CD81 (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA), 히스톤 H2A.Z. (Mybiosource, San Diego, CA, USA), 칼레티쿨린 (Mybiosource) 및 사이토크롬 C (ThermoFisher Scientific, Inc.). 모든 키트에는 표준 단백질을 포함하고 있다; 따라서, 단백질 및 세포외소포의 양은 각 키트의 표준 곡선에 기초하여 결정된다.
qPCR
EV에서 TrizolTM 을 이용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출하고 나노드롭(nanodrop)으로 RNA를 정량하였다. RNA는 역전사반응 (reverse transcription;RT) 과정을 거쳐 cDNA로 만들고, 각각의 miRNA 및 mRNA에 적합한 Taqman probe를 사용하여 제조업체의 매뉴얼에 따라 Real Time PCR을 진행하였다.
EV 라벨링 및 세포에 의한 흡수
정제된 EV를 제조업체의 지침에 따라 CFSE (5- (and-6) -Carboxyfluorescein Diacetate, Succinimidyl Ester) 라벨링 염료 (c-1157, Invitrogen)로 염색하였다. 1시간 동안 100.000 g 조건에서 초 원심분리하여 과잉 염료를 제거하였다. 표지된 EV (0.4μg/ml)를 인간 NSC 세포주 (ReNcells®)에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 2 회 세척하고 통상적인 면역 세포 화학 프로토콜을 사용하여 염색하였다. 세포를 마우스 항-SMA (1 : 100, Sigma aldrich) 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고 2 차 항체인 DyLight 표지된 항 마우스 IgG (1 : 200, 594nm, Abcam) 항체와 함께 배양하였다. 1.5 μg/mL 4'-6' diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories)과 함께 VectashieldTM를 사용하여 핵 염색 한 후, 공 초점 현미경 (LSM 700, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 세포를 이미지화하였다.
실시예 1. 중간엽 줄기세포의 3차원 배양을 통한 세포외소포 분리
1.1 중간엽 줄기세포의 준비
5 계대배양(passage 5) 단계의 인간 탯줄 유래의 중간엽 줄기세포(이하, WJ-MSC, Samsung medical center, 서울, 한국)를 분양받아 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양하였다. 성장 배지는 10 % 우 태아 혈청 (FBS) (GIBCO, NY, USA) 및 50 μg/mL 젠타마이신 (GIBCO, NY, USA)을 함유하는 α-modified eagle's medium(α-MEM, GIBCO, NY, USA)을 사용하였다. 6 계대배양(passage 6) 단계의 WJ-MSC를 3D 스페로이드형 세포 응집체 제작에 사용하였다.
1.2 3D 스페로이드형 세포 응집체 배양액 제작
상기 실시예 1.1에서 제작한 6 계대배양(passage 6) 단계의 WJ-MSC를 PBS에 세척하고, 트립신 (TrypLETM Express, GIBCO, NY, USA) 처리하여 CO2 배양기에서 5 분간 반응시켰다. 이 후, 새로운 무혈청배지를 넣어 트립신을 중화시켜 세포를 회수하고, 원심분리기를 이용해 세포 펠렛을 수득하였다. 그 다음, 새 무혈청배지를 넣어 세포 현탁액을 제조하고, 세포를 계수하였다. 세포 계수 후, MPC(2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine Polymer)로 코팅된 직경과 깊이가 각각 500 μm × 200 μm인 마이크로웰을 약 69,000 여개 포함하는 마이크로어레이에 60 ml의 세포 현탁액을 400 cell/well의 밀도가 되도록, 균일하게 분주하고, 정적인 상태를 유지하며 자발적 스페로이드형 세포 응집체 형성을 유도하고, 총 4일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양하여, 3D 스페로이드형 세포 응집체 배양액(이하, 3D-정적-스페로이드 배양액)을 제조하였다.
1.3 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 분리
실시예 1.2에서 제조한 3D-정적-스페로이드 배양액을 회수하고, 세포 이물질 제거를 위해, 2,500g에서 10분간 원심분리하고 0.22 μm 시린지 필터로 여과하였다. 이후, 3D-정적-스페로이드 배양액을 탄젠셜 플로우 여과 (Tangential Flow filtration, TFF) 시스템을 이용해 300kDa의 hollow fiber membrane(Pall, NY, USA)을 거쳐 단백질을 제거하여 세포외소포를 1차 분리하고, 생리식염수로 한 번 더 정제하여 순도 높은 본 발명의 3D-정적-스페로이드 유래 세포외소포(이하, 3D-정적-스페로이드 EV)를 수득하였다.
상기 실시예 1.1 내지 1.3의 과정을 도식화하여 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 3D 스페로이드형 세포 응집체의 특성 분석
상기 실시예 1.2에서 제조한 3D-정적-스페로이드 배양액 내 존재하는 3D 스페로이드형 세포 응집체(이하, 3D-정적-스페로이드)의 특성을 분석하였다. 실험군으로, 실시예 1.2에서 제조한 3D-정적-스페로이드 배양액을 사용하였으며, 비교군으로, 등록특허(출원번호 10-2016-0053026, 줄기세포 유래의 세포외소포체 생산방법)에 개시된 동적 3D 세포 배양 방법에 따라, 5일간 중간엽 줄기세포를 배양하여 제조한 3D 중간엽 줄기세포 스페로이드형 세포 응집체 (이하, 3D-동적-PEG 스페로이드) 배양액을 사용하였다. 광학현미경으로, 각각의 배양액이 담긴 마이크로웰을 관찰하여, 이를 도 2a, 2b에 나타내었고, 배양 초기 대비 배양 후 스페로이드형 세포 응집체의 면적 변화를 도 2c에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 실험군인 3D-정적-스페로이드와 비교군인 3D-동적-PEG 스페로이드의 면적을 비교한 결과, 세포가 조밀하게 응축되어 스페로이드를 형성하는 특성에 따라 3D-동적-PEG 스페로이드 대비 3D-정적-스페로이드는 배양 초기의 스페로이드 대비 면적이 통계적으로 유의하게 감소하는 결과를 보였다. (p=0.0011).
실시예 3. 3D 스페로이드형 세포 응집체의 크기 분석
실시예 1.2에서 제조한 3D-정적-스페로이드와 실시예 3에서 제조한 3D-동적-PEG 스페로이드의 크기 분포(size distribution)를 측정하고, 측정된 크기 분포 데이터를 토대로, 분산계수, 왜도(skewness), 첨도(kurtosis)를 분석하였다.
왜도는 중앙값의 추이로부터 분포가 기울어진 방향과 정도를 알 수 있는 파라미터로 1에 가까울수록 오른쪽으로 꼬리를 길게 뻗은 분포를 나타내며, -1에 가까울수록 왼쪽으로 꼬리를 길게 뻗은 분포를 나타낸다. 정규분포인 경우의 왜도는 0이다.
첨도는 자료 분포의 뾰족함 정도를 나타내는 파라미터로, 값이 양수인 경우 중앙 부분에 상대적으로 많은 수의 자료점이 쌓여있는 것을 의미하며, 음수인 경우 중앙 부분에 상대적으로 적은 수의 자료가 쌓여있는 것을 의미한다. 정규분포인 경우의 첨도는 0이다.
측정한 크기 분포 데이터를 도 3에 나타내었고, 이를 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.
| 3D-동적-PEG 스페로이드 | 3D-정적-스페로이드 | |
| 스페로이드 수 | 154 | 155 |
| 크기 범위(Range) | 108.4 - 225.0 um | 55.0 - 95.0 um |
| 크기 (mean ± SD) | 148.66 ± 20.89 um | 74.43 ± 7.756 um |
| 분산계수 (Coefficient of variance) | 14.1% | 9.59% |
| 왜도 (Skewness) | 0.694 ± 0.195 | -0.745 ± 0.195 |
| 첨도 (Kurtosis) | 0.350 ± 0.389 | 1.799 ±0.389 |
도 3 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 3D-정적-스페로이드의 평균 크기가 74.43um, 분산계수(CV)가 9.59%인 것을 확인하였다. 이와 대조적으로, 3D-동적-PEG 스페로이드는 평균 크기가 148.66um, 분산계수(CV)가 14.1%인 것을 확인하였다.
측정한 분산계수를 비교 검정하기 위해, Feltz and Miller's (1996) asymptotic test를 실시한 결과, p value값이 0.01765604로 산출되었으며, Krishnamoorthy and Lee's (2014) modified signed-likelihood ratio test를 실시한 결과, p value값이 0.01853969로 산출되었다. 따라서, 두가지 테스트 모두에서 3D-정적-스페로이드와 3D-동적-PEG 스페로이드의 크기 분포가 통계적으로 유의한 정도로 상이한 양상을 나타낸다는 것을 확인하였다.
3D-정적-스페로이드와 3D-동적-PEG 스페로이드의 크기 분포를 비교한 결과, 3D-정적-스페로이드의 크기 분포의 첨도 값이 상대적으로 큰 것을 확인하여, 본 발명의 3D-정적-스페로이드의 크기 분포는 중앙값에 많이 몰린 양상을 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 3D-정적-스페로이드 제조방법으로 3D 스페로이드를 제조하면, 크기가 상대적으로 일정한 3D 스페로이드의 제조가 가능한 것을 확인하였다.
실시예 4. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 형태 분석
실시예 1.3에서 분리한 3D-정적-스페로이드 EV의 형태를 관찰하기 위해 전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 이용하여 촬영하였다. 구체적으로, 3D-정적-스페로이드 EV를 0.1M 포스페이트 완충액(PB)에 용해된 1 % OsO4로 2시간 동안 고정시켰다. EM 그리드를 세포외소포 방울 위에 포름바(formvar)측 면을 아래로 향하게 하여 1분간 흡착시켰다. 그 후, 여과지로 블로팅하고, 15 초 동안 2 % 우라닐 아세테이트와 반응시켰다. 과량의 우라닐 아세테이트를 제거하고, EM 그리드를 TEM (JEM-1011, JEOL, Japan)을 사용하여 관찰하였으며, 관찰 영상을 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 3D-정적-스페로이드 EV는 전형적인 세포외소포의 형태인 둥근 형상인 것을 확인하였다.
실시예 5.
3D 스페로이드형 세포 응집체
유래 세포외소포의 농도 및 크기 분석
실시예 1.3에서 분리한 3D-정적-스페로이드 EV의 농도 및 크기 분포를 확인하기 위해, NanoSight NS300 (Malvern, Worcestershire, UK)를 이용한 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 실시하였다. 최적의 분석을 위해 3D-정적-스페로이드 EV를 소포(vesicle)가 없는 포스페이트 완충용액(PBS)에 미리 희석하였다. 평균 크기 및 농도 (particle/mL)는 3 개의 기록을 통합하여 계산하였으며, 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 3D-정적-스페로이드 EV의 평균 입자 직경은 182.5nm이고, 모드 직경은 106.1nm인 것을 확인하였다.
실시예 6.
3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 발현 마커 분석
실시예 1.3에서 분리한 3D-정적-스페로이드 EV의 발현 마커를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 대조군으로 세포 용해물(cell lysate)과 분비체(secretome)을 사용하였다. 세포 용해물은 3D-정적-스페로이드를 PBS 세척하고, 트립신을 처리한 후 세포를 회수하여, 회수된 세포를 원심분리기를 이용하여 세포 펠렛을 수득하는 방법으로 준비하였다. 분비체는 상기 세포 펠렛 수득 후, 상층액인 배양배지에서 실시예 1.3의 공정을 통해 EV를 분리하고, 남은 배양 분비체를 얻는 방식으로 준비하였다. 마커 분석은 ELISA를 이용하여 세포외소포 특이적인 양성 마커 CD9, CD63, CD81 및 HSP70을 정량하였으며, 특정 오염 단백질 마커인 칼레티큘린, 히스톤 H2A.Z, 사이토크롬 C, 알부민, 항생제를 정량하였다. 또한, 웨스턴 블롯을 이용하여 세포외소포의 특정 오염 단백질 마커인 히스톤 H2A.Z, 히스톤 H3, 라민 A/C, 칼레티큘린을 정량하였고, 세포외소포 양성 마커인 플로틸린-1을 정량하였다. ELISA 분석결과 및 웨스턴 블롯 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 3D-정적-스페로이드 EV는 세포외소포 특이 양성 마커인 CD9, CD63, CD81 및 HSP70을 모두 발현하고 있으며, 세포 용해물 및 분비체(secretome)에서 높게 발현되는 오염 단백질 마커인 칼레티큘린, 히스톤 H2A.Z, 히스톤 H3, 사이토크롬 C, 알부민(BSA, bovine serum albumin), 라민 A/C 및 항생제가 거의 발현하지 않는 것을 확인하였다. 특히, 세포 용해물에서 매우 낮게 발현하는 세포외소포 양성 마커 플로틸린-1 (Flotilin-1)이 3D-정적-스페로이드 EV에서 상대적으로 높게 발현하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 생산량 분석
실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV, 실시예 2의 3D-동적-PEG 스페로이드로부터 분리한 세포외소포(3D-동적-PEG 스페로이드 EV) 및 통상적인 2D 배양방법으로 배양한 줄기세포로부터 분리한 세포외소포(2D-EV)의 생산량을 비교하기 위한 실험을 실시하였다. 2D-EV는 다음과 같은 공정으로 준비하였다. 세포 스택(Cell stack)에서 3일간 배양한 줄기세포를 PBS 세척하고, 무혈청 배지로 교체하여 2일간 추가로 배양한다. 배양배지를 회수하고 원심분리 및 0.2 μm 필터를 이용해 세포 이물질을 연속적으로 제거한다. 이후, 배양배지를 TFF 시스템을 이용해 hollow fiber membrane을 거쳐 단백질을 제거하여 EV를 1차 분리하고 생리식염수로 한 번 더 정제하여 순도 높은 2D-EV를 수득하였다. 준비된 3D-정적-스페로이드 EV, 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 및 2D-EV의 유래 세포당 생산량을 비교하였으며, 이를 표 2 및 도 7에 나타내었다.
| 2D-EV | 3D-동적-PEG 스페로이드 EV | 3D-정적-스페로이드 EV | |
| 생산량 (EVs/cell) | 2437 EVs/cell | 6791 EVs/cell | 6840 EVs/cell |
실시예 8. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 발현 마이크로 RNA(miRNA) 분석
실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV, 실시예 2의 3D-동적-PEG 스페로이드로부터 분리한 세포외소포인 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 및 실시예 7에서 제조한 2D-EV의 특성 차이를 확인하기 위하여 miRNAs의 발현 및 단백질 발현을 qPCR을 통해 측정하였다. 2D-EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 miRNA 및 단백질을 도 8에 나타내었으며, 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 대비 3D-정적-스페로이드 EV에서 높게 발현하는 혈관 신생 관련 miRNA 및 단백질을 도 9에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 2D-EV와 비교하여, 3D-정적-스페로이드 EV는 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis) 및 면역조절에 효능을 나타내는 miRNA인 miR-146a, miR-27a, miR-146b를 높게 발현하며, 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis)에 효능을 나타내는 단백질인 인테그린 1/2 및 VEGF/R2 (Vascular endothelial growth factor/R2)를 높게 발현하는 것을 확인하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 3D-동적-PEG 스페로이드 EV와 비교하여, 3D-정적-스페로이드 EV는 혈관신생에 효능을 나타내는 miRNA인 miR-146a, miR-27a, miR-132, miR-184 및 miR-210 을 높게 발현하는 것을 확인하였다.
이러한 결과로부터 실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV는 2D-EV 또는 3D-동적-PEG 스페로이드 EV와 비교하여, miRNA와 단백질 발현이 상이한 새로운 세포외소포이며, 특히, 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis), 면역조절, 회춘(rejuvenation) 또는 항 종양과 관련된 miRNA를 높게 발현하여, 임상적으로 유용하게 사용될 수 있는 세포외소포임을 확인하였다.
실시예 9. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 혈관 신생 촉진 효과 확인
9.1 혈관 신생 관련 miRNA 및 Ephrin A3 발현 비교
실시예 8을 통해, 실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV가 기존의 2D-EV 또는 3D-동적-PEG 스페로이드 EV 와 miRNA 와 단백질 발현 패턴이 상이한 새로운 세포외 소포체임을 확인하였다. 이에 따라 3D-정적-스페로이드 EV의 혈관 신생 촉진에 대한 유용성을 확인하기 위하여 이를 타겟세포인 HUVEC 세포에 처리한 후, 혈관 신생 효과와 관련된 miRNA 와 Ephrin A3(eph-related receptor tyrosine kinase ligand 3)의 발현 변화를 qPCR 및 웨스턴 블랏을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, qPCR 결과 기존의 2D-EV 와 비교하여 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV 에서 miR-210의 발현이 현저하게 증가된 것을 확인하였다. 또한 HUVEC 에서 3D-정적-스페로이드 EV 를 처리한 후, Ephrin A3 의 단백질 발현이 2D-EV 처리 군과 비교하여 현저하게 저해됨을 확인하였다. miR-210 은 혈관 내피 세포의 이동을 촉진하고 모세혈관유사 구조를 형성하는 것으로 알려져 있으며, Ephrin A3 를 타깃으로 한다. 즉, 이와 같은 결과는 3D-정적-스페로이드 EV가 효과적인 혈관 신생을 유도할 수 있음을 다시 한번 보여주는 결과이다.
9.2 공여자에 따른 miRNA 발현 차이 분석
줄기세포 치료제는 공여자에 따라 성분이 상이하게 나타나는 donor variation 문제가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 3D-정적 스페로이드 EV가 donor variation 이슈없이 보다 일관성있는 miRNA 프로파일을 나타내는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 각 공여자의 시료는 Samsung medical center(서울, 한국)에서 분양받아 사용하였다. 실시예 1.1 의 2D 배양된 WJ-MSC와 3D 배양된 WJ-MSC, 실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV 의 공여자 별 생산되는 EV 수, EV 단백질 양과 miRNA 프로파일을 비교하였다. miRNA는 Small RNA sequencing 방법으로 miRNA 프로파일링하였으며, 그 결과를 도 11a 내지 도 11b 에 나타내었다.
도 11a 에 나타낸 바와 같이, 2D 배양된 WJ-MSC 유래 2D-EV는 생산되는 EV 의 양, 크기, EV 생산 단백질 양이 각 공여자에 따라 편차를 나타내었으나, 3D-정적-스페로이드 EV는 공여자 사이에 큰 편차없이 일관성있는 결과를 나타내었다.
또한 도 11b 에 나타낸 바와 같이, 2D 배양된 WJ-MSC, 2D-EV 는 공여자에 따라 생산되는 miRNA 조성 차이가 많은 반면, 3D 배양된 WJ-MSC, 3D-정적-스페로이드 EV 는 공여자에 따른 차이가 줄어드는 것을 확인하였다. 특히 3D-정적-스페로이드 EV 는 공여자에 따른 차이없이 일관성있는 miRNA 프로파일을 나타냄과 동시에 2D-EV와 비교하여 혈관 신생 효과를 나타낼 수 있는 miRNA 인 miR-27a-3p(1.5배), miR-146a-5p(2.3배), miR-210(2.6배), miR-132(2.6배) 가 더 많이 균일하게 포함되어 있는 것을 확인하였다. 또한 그 외 혈관 신생 관련 miRNA 인 miR-199a, miR-125b, miR-26a, let-7, miR-125a, miR-181b, miR-92a 들도 각 공여자들 사이에 균일한 정도의 발현을 나타내는 것을 확인하였다.
이러한 결과는, 3D-정적-스페로이드 EV가 공여자에 따른 치료 유효성분의 차이를 줄이고, 더 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 나타내는 결과이다.
상기 결과를 모두 종합한 결과, 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV는 WJ-2D-EV 나, 3D-동적-스페로이드 EV와 비교하여 혈관 신생과 관련된 miRNA 인 miR-27a, miR-132, miR-146a, miR-146b, miR-184, miR-210 가 현저히 증가되어 있고, Ephrin A3 단백질 발현을 저해시키는 바, 기존 보고된 EV 대비 혈관 신생에 더 우수한 효과를 나타낼 것으로 기대할 수 있으며, 공여자에 따른 차이를 감소시켜 우수한 치료 물질이 될 수 있음을 확인하였다.
실시예 10. 3D 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포 처리에 의한 혈관 신생 관련 인자 발현 변화 확인
실시예 1의 제조방법에 의해 제조한 세포외소포인 3D-정적-스페로이드 EV와 통상적인 2D 배양방법으로 배양한 줄기세포로부터 분리한 세포외소포인 2D-EV를 혈관내피세포(HUVECs) 에 처리한 후, 혈관 신생 관련 인자인 VEGF(Vascular endothelial growth factor), Hif-1a (Hypoxia-inducible factor 1-alpha), FGF(Fibroblast growth factor) 의 발현 변화를 확인하였고 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 2D-EV를 처리한 세포 대비 3D-정적-스페로이드 EV를 처리한 혈관내피세포(HUVECs)는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), Hif-1a (Hypoxia-inducible factor 1-alpha), FGF(Fibroblast growth factor)의 발현이 증가한 것을 확인하였다.
VEGF 및 Hif-1a은 혈관신생 관련 단백질이며, FGF는 세포의 증식, 생존, 분화와 관련한 생물학적 기능을 조절하는 단백질에 해당하는 인자로써, 3D-정적-스페로이드 EV가 혈관 신생에 있어 임상적으로 적용하기에 우수한 세포외소포임을 나타낸다.
실시예 11. 3D-정적-스페로이드 EV 처리에 따른 신경 혈관 생성 효과 확인
3차원 줄기세포 배양으로 얻은 세포외소포에 의한 신생 혈관증식 효과를 보기 위해 Matrigel 위에 부착된 HUVEC에 WJ-2D-EV와 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV 를 처리하여 튜브 형성 효과를 확인하였다. 구체적으로 HUVEC을 20 % FBS, 5 U/mL 헤파린 및 3 ng/mL bFGF가 보충된 M199 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 세포를 1.7 × 104 세포의 밀도로 μ-Slides Angiogenesis (ibidi, Graefelfing, Germany)에서 성장 인자 감소 Matrigel Matrix (BD Bioscience, MA, USA)에 접종하고, 37℃, 5% CO2 환경 가습챔버에서 4 시간 동안 튜브를 형성하도록 하였다. 위상차 현미경 (Olympus)에서 이미지를 촬영하고, 튜브형 구조의 수를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 현미경 필드 (4 배 배율)에서 정량화하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV 를 처리한 실험군에서는 혈관 신생 관련 단백질인 VEGF 처리군과 비교하여 튜브 형성이 현저하게 증가하며, WJ-2D-EV 처리 군과 비교하여도 우수한 튜브 형성 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 12. 뇌졸중 동물 모델에 대한 3D-정적-스페로이드 EV의 효과
12.1 뇌졸중 모델의 제조
뇌졸중 동물 모델을 제조하기 위하여 광혈전성 (Photothrombotic, PT) 뇌경색 모델을 제조하였다. 20 ~ 25g (8 ~ 12 주령)의 성인 수컷 C57BL/6J 마우스 (Orient Bio Inc., 대한민국 성남)를 이용하여 PT 뇌졸중을 마우스의 오른손 감각 운동 피질에서 유도하였다. 간단히 말해서, 케타민 (100 mg/kg, 유한양행, 대한민국 서울)과 자일라진 (10 mg/kg, Rompun®inj., 독일 베를린 바이엘)의 혼합물을 복강 내 투여하여 마우스를 마취하고 정위 장치 (KOPF Instruments, Tujunga, CA, USA)에 배치시켰다. 메스를 사용하여 눈에서 목까지 두피를 따라 중간선 절개를 수행하였으며, 골막을 제거한 후 두개골을 노출시켰다. 로즈 벵갈 용액 (30 mg/kg, 생리 식염수 10 mg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 경정맥으로 정맥 내 투여하고, 5 분 후, 3mm 직경의 조명을 제공하는 100mW, 532nm diode-pumped solid-state green laser (동우 옵트론 (주), 광주)를 bregma 측면 2.5mm에 위치시켰다. 레이저는 관심 영역 (ROI)에서 15 분 동안 활성화되었고 절개 부위를 6-0 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 봉합하였다. 수술 중 랫트는 37.0-37.5℃의 체온을 유지하도록 하였다.
12.2 뇌졸중 모델 병변 개선 효과 확인
실시예 12.1에서 제조한 뇌졸중 동물모델에 대조군으로 PBS 또는 실험군으로 3D-정적-스페로이드 EV 를 6x108 EV/mouse 로 혈관 주입한 후, 3일 (PBS group, n=20; EV group, n=23), 14일 (PBS group, n=8; EV group, n=10), 28일 (PBS group, n=8; EV group, n=6) 후 MRI T2-weighted image(T2WI) 영상을 촬영하여 실험군과 대조군의 뇌경색 병변 및 뇌실의 부피 변화 정도를 비교하였다. 그 결과를 표 3 및 도 14에 나타내었다.
| 뇌경색 병변 | 뇌실 부피 | |||
| 3 day | 14 days | 14 days | 28 days | |
| 대조군 | 11.72 ± 1.17 | 0.84 ± 0.12 | 6.63 ± 0.28 | 6.00 ± 0.49 |
|
3D-정적-스페로이드 EV
처리군 |
8.39 ± 0.93* | 0.54 ± 0.07* | 4.60 ± 0.52** | 4.64 ± 0.32† |
대조군 vs. 3D-정적-스페로이드 EV 처리군, ↑ p value=0.052 * p value<0.05; ** p value<0.01
상기 표 3 및 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, 3D-정적-스페로이드 EV 를 주입한 실험군에서 뇌경색 병변 및 뇌실 부피가 PBS 처리 대조군과 비교하여 현저히 줄어드는 것을 확인하였다.
12.3 면역조직화학 분석을 통한 혈관 신생 효과 확인
뇌졸중 동물 모델에 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV 를 주입하면, 신경 혈관이 효과적으로 생성될 수 있는지를 확인하기 위한 면역조직화학 분석을 수행하였다. 실시예 12.1에서 제조한 뇌졸중 동물모델에 대조군으로 PBS 또는 실험군으로 3D-정적-스페로이드 EV 를 0.3x108 EV/mouse 내지 30x108 EV/mouse 로 정맥을 통해 주입하였고, 뇌졸중 4주 후 뇌 조직에서 혈관 양성 마커인 콜라겐 IV 를 이용하여 면역형광분석을 수행하여 혈관 개수를 확인하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, PBS 처리 대조군과 비교하여 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV를 주입한 뇌졸중 동물 모델에서 혈관 신생이 확인되었고, 이는 주입된 EV 개수에 의존적임을 확인하였다.
12.4
행동 분석을 통한 혈관 신생 효과 확인
뇌경색 동물 모델에 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV 를 주입하면 혈관 신생이 효과적으로 유도됨을 확인하였다. 이러한 혈관 신생에 의해 뇌경색 동물 모델에서 유발되는 운동 기능 상실이 회복되는지 여부를 확인하기 위한 앞다리 비대칭 테스트 (실린더 테스트) 와 발 결함 테스트(그리드 보행 테스트)를 수행하였다. 보다 구체적으로 제조된 광혈전성 뇌경색모델에 3D-정적-스페로이드 EV (6x108 EV/mouse)를 쥐의 혈관에 주입하고 14일 (PBS group, n=8; 3D-정적-스페로이드 EV 처리군, n=10), 28일 (PBS group, n=8; 3D-정적-스페로이드 EV 처리군, n=6) 차에 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV를 주입하면 실린더 테스트 지표 및 그리드 보행 테스트 지표가 모두 개선되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV 처리가 뇌졸중 동물 모델에서 혈관의 신생을 유도하고, 그 결과 손상된 운동 기능 장애를 개선할 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예 13. 제조조건에 따른 3D-정적-스페로이드 EV 효과 검증
13.1 실험 방법 및 조건
상기 실시예들을 통해, 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV 의 우수한 효과를 확인하였다. 실시예 1의 제조방법을 동일하게 수행하되, 마이크로웰 규격 및 세포수 조건을 달리하여 제조된 EV 에서도 동일한 효과를 보이는지 확인하기 위하여, 마이크로웰 당 세포수 규격을 400 cell/well 에서 200 cell/well으로 변화시키거나, 마이크로웰의 규격을 직경과 깊이를 각각 500 μm × 200 μm 조건에서 500 μm × 600 μm, 또는 직경 800 μm에 깊이가 없는 평평한 웰로 변화시켜 세포를 배양하였다.
실시예 1의 제조방법에서 변경된 실험 조건을 하기 표 4에 나타내었다.
| 실험예 1 | 실험예 2 | 실험예 3 | |
| 마이크로웰 당 세포수(cell/microwell) | 400 | 400 | 200 |
| 마이크로웰의 직경 (μm) |
500 | 800 | 4-500 |
| 마이크로웰의 깊이 (μm) |
600 | / | 200 |
실시예 1.1에서 제작한 6 계대배양(passage 6) 단계의 WJ-MSC를 PBS에 세척하고, 트립신 (TrypLETM Express, GIBCO, NY, USA) 처리하여 CO2 배양기에서 5 분간 반응시켰다. 이 후, 새로운 무혈청배지를 넣어 트립신을 중화시켜 세포를 회수하고, 원심분리기를 이용해 세포 펠렛을 수득하였다. 그 다음, 새 무혈청배지를 넣어 세포 현탁액을 제조하고, 세포를 계수하였다. 세포 계수 후, 상기 표 4와 같은 조건으로 마이크로웰에 균일하게 분주하고, 정적인 상태를 유지하며 자발적 스페로이드형 세포 응집체 형성을 유도하고, 총 4일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양하여, 3D 스페로이드형 세포 응집체 배양액을 제조하였다.
13.2 3D 스페로이드형 세포 응집체 형태 확인
상기 실험예 1 내지 3의 조건에서 실시예 1 과 동일하게 스페로이드가 균일하게 형성되는 것을 확인하였으며, 3D 스페로이드형 세포 응집체 배양액을 회수하여 실시예 1.3의 방법으로 스페로이드 유래 세포외소포를 수득하였다. 수득된 세포외소포의 크기 분포(size distribution)를 측정하고, 추가적으로 스페로이드의 Roundness 및 Solidity를 확인하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 실험예 1 내지 3 모두 제조된 3D 스페로이드형 세포 응집체의 크기가 실시예 1에서 제조된 세포 응집체의 크기 범위인 55 내지 131 μm 범위 내의 크기로 형성되는 것을 확인하였으며, 크기 분포의 평균 값이 70.34 내지 99.51 μm 로 나타나는 것을 확인하였다. 또한 Roundness 및 Solidity 를 확인한 결과, 실시예 1의 3D 스페로이드형 세포 응집체의 Roundness 평균값인 0.8697 (CV 2.64%) 과 유사하게 실험예 1 내지 3 의 스페로이드형 세포 응집체 역시 각각 평균 0.8751, 0.8669, 0.8601 의 Roundness 값을 나타내고, 실시예 1의 3D 스페로이드형 세포 응집체의 Solidity의 평균 값인 0.9488 (CV 2.64%) 과 유사하게 실험예 1 내지 3의 스페로이드형 세포 응집체 역시 각각 평균 0.9744, 1, 0.9752 값을 나타내는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 마이크로웰당 세포수가 200, 400 으로 변화되고, 마이크로웰의 직경을 400 내지 800 으로 변화시키더라도, 실시예 1의 방법을 통해 유사한 형태를 갖는 3D 스페로이드형 세포 응집체가 효과적으로 형성될 수 있음을 보여주는 결과이다.
13.3 3D 스페로이드형 유래 EV 의 miRNA 발현 패턴 비교
실험예 1 내지 3의 조건에서도 실시예 1과 유사한 형태를 갖는 스페로이드형 세포 응집체가 제조될 수 있음을 확인하였으므로, 추가적으로 이들로부터 실시예 1.3 의 방법을 통해 세포외소포를 분리 수득하고, 분리 수득된 EV 도 동일한 miRNA 발현 패턴을 나타내는지 여부를 확인하였다. miRNA 발현 패턴 비교는 마이크로웰 조건을 달리한 실험예 1 및 2 의 방법으로 제조된 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 이용하여 확인하였다. 발현 miRNA 분석은 실시예 8과 동일한 qPCR 방법을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다. 실시예 7에서 제조된 2D-EV 와 miRNA 발현 패턴을 비교하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 마이크로웰의 조건을 직경 500, 800μm 으로 변화시키더라도, 실시예 1에서 제조된 EV 와 동일하게 혈관신생/신경신생(angio/neurogenesis) 및 면역조절에 효능을 나타내는 miRNA인 miR-132, miR-210이 기존의 2D-EV 대비 현저한 발현 증가를 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 200 내지 800 μm 직경의 마이크로웰을 이용하여 본 발명의 방법을 통해 수득되는 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 EV 가 miRNA 마커 발현 특성을 공통적으로 나타낼 수 있음을 보여주는 결과이다. 따라서 이들은 모두 3D-정적-스페로이드 EV 로 지칭될 수 있다.
13.4 3D 스페로이드형 유래 EV 의 혈관 신생 효과 확인
200 내지 800 μm 직경의 마이크로웰을 이용하여 본 발명의 방법을 통해 수득되는 3D-정적-스페로이드 EV 의 혈관 신생 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 실험군으로 실험예 1 및 2, 실시예 1의 조건으로 제조된 3D-정적-스페로이드 EV와, 실시예 7에서 제조된 2D-EV 를 이용하였고, 실시예 11 과 동일한 방법으로 튜브 형성 효과를 확인하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 실험예 1 및 2, 실시예 1의 조건으로 제조된 3D-정적-스페로이드 EV 모두 대조군 및 2D-EV 대비 현저히 우수한 튜브 형성 효과를 나타내었다.
상기와 같은 내용을 종합하면, 본 발명의 3D-정적-스페로이드 EV는 혈관 신생과 관련된 miRNA, 혈관 생성 인자가 높게 발현되고, in vitro 및 in vivo 에서 우수한 혈관 생성능 및 이에 따른 뇌졸중 개선 효과가 확인되는 바, 혈관의 손상 및 혈관 신생이 필요한 각종 질환을 예방 또는 치료하는데 있어서 우수한 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
- (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 분주하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 상기 마이크로웰에서 3차원(3D, 3 dimension) 정적 배양하는 단계; 및
(c) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 를 포함하는, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 및 배아줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 분주는 마이크로 웰에 중간엽 줄기세포를 200 내지 600 세포/웰의 밀도로 분주하는 것인, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 및 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외 소포 대비 miR-27a, miR-132, miR-146a, miR-146b, miR-184, 및 miR-210로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 고발현하는 것인, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 세포외소포는 중간엽 줄기세포를 3차원 동적 배양한 스페로이드형 세포응집체 유래 세포외소포 및 2차원 배양한 중간엽 줄기세포 유래 세포외 소포 대비 VEGF(Vascular endothelial growth factor), Hif-1a (Hypoxia-inducible factor 1-alpha) 및 FGF(Fibroblast growth factor) 로 이루어진 군에서 선택된 1종이상을 고발현하는 것인, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 혈관 신생 촉진용 조성물은 화상, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 심혈관계 질환, 뇌혈관성 질환 및 탈모증으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 예방 또는 치료용인, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 혈관 신생 촉진용 조성물은 뇌 혈관신생 촉진용인, 약학적 조성물.
- (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 분주하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 상기 마이크로웰에서 3차원(3D, 3 dimension) 정적 배양하는 단계; 및
(c) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 를 포함하는, 혈관신생 촉진용 식품 조성물.
- (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 분주하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 상기 마이크로웰에서 3차원(3D, 3 dimension) 정적 배양하는 단계; 및
(c) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 를 포함하는, 혈관신생 촉진용 in vitro 조성물.
- (a) 직경이 200 내지 800 μm이고, 깊이가 100 내지 1000 μm인 마이크로웰에 줄기세포를 분주하여 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체를 상기 마이크로웰에서 3차원(3D, 3 dimension) 정적 배양하는 단계; 및
(c) 상기 3차원 스페로이드형 세포 응집체로부터 세포외소포를 분리하는 단계;를 통해 제조된 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포(extracellular vesicle) 를 포함하는, 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물의 제조방법.
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