CN112915206A - 表皮生长因子Amphiregulin在制备施万细胞调控药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了表皮生长因子Amphiregulin在制备施万细胞调控药物中的应用。本发明首次揭示表皮生长因子Amphiregulin能调节施万细胞的增殖和迁移功能，Amphiregulin敲降能够抑制施万细胞的增殖和迁移，或者通过外源性给予Amphiregulin能够促进施万细胞的增殖和迁移。Amphiregulin可以作为药物设计靶点，用于治疗周围神经再生修复相关的疾病。

Description

表皮生长因子Amphiregulin在制备施万细胞调控药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及Amphiregulin(Areg)在制备施万细胞调控药物中的应用。

背景技术

周围神经缺损是外周神经常见的损伤类型之一，常致严重的功能残疾，因此探索安全有效的修复手段一直是临床研究的重点。相比于中枢神经系统，周围神经系统具有一定内源性再生能力，但损伤后神经元轴突的再生和功能恢复效果并不理想，尤其是伴有长距离神经缺损的周围神经损伤仍然是一个严重危害人类健康的问题。周围神经的再生的根本依赖于神经元内源再生能力的激活和再生微环境的成功构建。运用组织工程神经并在损伤局部给予具有神经营养和促神经再生特性的蛋白质和分子，在很大程度上有利于神经再生。

生长因子是一类通过与特异性受体结合，调节细胞功能的多肽类分子。在神经系统中，一些特殊的生长因子，如神经生长因子、脑源性神经营养因子和胶质细胞系源性神经营养因子已被确定为促进神经修复的必需神经营养因子。Amphiregulin属于表皮生长因子家族的一员，是一种自分泌性生长因子，该生长因子可与表皮生长因子/转化生长因子α(EGF/TGFα)受体相互作用，促进正常上皮细胞的生长，并抑制某些侵袭性癌细胞的增殖。在乳腺、卵母细胞和骨组织发育中也起一定作用，Areg基因也与银屑病样皮肤的表型相关。同时Amphiregulin也是施万细胞、星形胶质细胞和成纤维细胞的有丝分裂原。

施万细胞是周围神经系统特有的神经胶质细胞，当周围神经发生损伤后，施万细胞会进行分裂增殖以产生更大的群体，并迁移形成条索，引导再生轴突生长，同时分泌神经营养因子、生长因子、细胞粘附分子、细胞外基质等，为神经再生提供物质和能量支持，重建再生微环境。

发明内容

本发明联合使用高通量测序数据和生物信息学分析筛选了在大鼠坐骨神经损伤后差异表达的关键生长因子，首次揭示了Amphiregulin与施万细胞增殖迁移之间的关系，证明了 Amphiregulin能调节周围神经损伤后再生。

本发明具体技术方案如下：

表皮生长因子Amphiregulin在制备施万细胞调控药物中的应用。

本发明所述Amphiregulin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的应用，Amphiregulin作为药物设计靶点设计抑制Amphiregulin表达的药物，抑制施万细胞的增殖和迁移；或者以Amphiregulin作为药物设计靶点设计促进Amphiregulin表达的药物，或者以Amphiregulin作为外源性活性物质的药物，促进施万细胞的增殖和迁移。本发明一个示例，所述抑制Amphiregulin表达的药物是Amphiregulin基因的小干扰RNA(siRNA)，所述增效剂是Amphiregulin(人源)重组蛋白。

人源重组蛋白是模拟生物体内源的蛋白，运用生物基因工程方法获取的蛋白质药物，能增强内源性蛋白的功能。而小干扰RNA(siRNA)是化学修饰的专门针对细胞中特异性的靶基因的抑制剂，在本发明中根据靶基因Amphiregulin的mRNA目的片段位置的反义序列设计了双链小干扰RNA，其正义链序列如SEQ ID NO:2、4或6所示。

本发明所述施万细胞调控药物包括促周围神经再生药物、治疗周围神经损伤和中枢神经损伤疾病药物、治疗施万细胞过度增殖疾病药物，所述施万细胞过度增殖疾病包括神经鞘瘤以及神经损伤后施万细胞大量增殖引发施万细胞的分化障碍。

本发明所述的抑制Amphiregulin表达的药物为治疗施万细胞过度增殖疾病药物。所述施万细胞过度增殖疾病包括神经鞘瘤以及神经损伤后施万细胞大量增殖引发施万细胞的分化障碍(即大量增殖的施万细胞无法正常分化形成髓鞘)。施万细胞的分化障碍会引发再生的轴突无髓鞘包绕，导致运动和感觉功能恢复受阻，抑制施万细胞增殖也是这类疾病治疗的关键。

所述促进Amphiregulin表达的药物或者Amphiregulin作为活性药物(如Amphiregulin(人源)重组蛋白)为促进施万细胞增值和迁移和治疗神经再生相关疾病药物。

施万细胞是周围神经系统局部微环境中一类特有的胶质细胞，其功能十分活跃。正常生理情况下，施万细胞为神经元提供必要的物理和营养支持，并围绕轴突形成髓鞘，对维持周围神经的正常生理功能十分重要。周围神经遭受创伤后，施万细胞去分化为未成熟细胞类型，大量分裂增殖以产生更大的群体，并消化轴突和髓鞘碎片以清扫随后轴突再生的通道，然后施万细胞开始沿着再生轴突迁移形成Büngner带，并进行再分化和髓鞘形成，同时分泌神经营养因子、细胞粘附分子、细胞外基质等，为神经再生提供营养物质。施万细胞的表型可以被微环境中的各种细胞因子所调节，当周围神经损伤后，加速施万细胞增殖和/或促进施万细胞迁移将有益于神经再生和功能恢复。

为了评价Amphiregulin(Areg)在周围神经再生中的生物学功能，本发明培养并获得了高纯度的原代大鼠施万细胞。采用Real time-PCR检测施万细胞中Areg的表达，代表性的扩增曲线显示，Areg的Ct值远高于Gapdh的Ct值，同时使用anti-Areg抗体对培养的施万细胞进行免疫染色显示，大多数Areg阳性信号与S100β阳性信号重叠，表明Areg蛋白在施万细胞中表达并存在(图1)。采用针对Areg的siRNA片段转染培养的施万细胞或在培养的施万细胞中加入Areg重组蛋白，利用EdU增殖实验和划痕愈合实验发现，Areg促进施万细胞的增殖和迁移(图2和图3)。进一步评估Areg在体内的生物学效应，在大鼠坐骨神经夹伤模型的损伤部位局部注射Areg重组蛋白，与生理盐水组相比，注射Areg重组蛋白组大鼠的神经组织中施万细胞的增殖数量更多并且迁移距离更长，提示Areg蛋白可在体内促进施万细胞增殖和迁移(图4)。

本发明所述Amphiregulin可以直接作为药物或者作为药物的靶点设计促进或抑制其表达的药物(抑制剂或增效剂)，通过与药物的相互作用，提高或抑制机体Amphiregulin的表达，进而发挥调节神经再生修复的作用。

本发明的优点：本发明研究结果表明，可通过调节Amphiregulin的表达调节施万细胞的表型，从而促进神经再生，可以广泛用于临床上有促进周围神经再生需求疾病的治疗，特别是神经损伤后的再生修复。由于组织工程神经移植已被广泛应用于周围神经损伤的治疗。如神经支架的成分/局部结构的调节和干细胞的加入，已经被用来优化组织工程神经移植物，生长因子不仅对神经系统具有保护作用，还可以指导施万细胞在损伤部位的行为，具有强烈的损伤后效应，可调节神经再生修复。因此，促进神经再生的生长因子将有助于构建生长因子复合的组织工程神经移植物，有利于周围神经损伤的治疗。

附图说明

图1为体外培养的大鼠施万细胞中Areg的表达。(图1A为施万细胞中Areg的Realtime-PCR扩增曲线；图1B为施万细胞中Areg和Gapdh扩增Ct值的总结；图C&D为Areg 在施万细胞中的免疫荧光，红色表示Areg，绿色表示S100β，蓝色表示细胞核，紫色代表三者重合信号)。

图2为体外抑制Areg表达对施万细胞增殖和迁移的影响。(图2A为施万细胞中siRNA-Areg三个片段的敲降效率图；图2B为siRNA对照和siRNA-Areg转染施万细胞代表性EdU增殖图像和归一化平均增殖速率统计，红色表示EdU染色，蓝色表示hoechst 33342 染色；图2C为siRNA对照和siRNA-Areg转染施万细胞后代表性划痕愈合图像和空白区域面积的统计)。

图3为Areg重组蛋白对体外培养施万细胞增殖和迁移的影响。(图3A为经Areg重组蛋白处理和未经Areg重组蛋白处理的施万细胞的代表性EdU增殖图像和归一化平均增殖速率统计，红色表示EdU染色，蓝色表示hoechst 33342染色细胞核；图3B为经Areg重组蛋白处理和未经Areg重组蛋白处理的施万细胞代表性划痕愈合图像和空白区域面积的统计)。

图4为大鼠坐骨神经夹伤模型中Areg重组蛋白对施万细胞的体内作用。(图4A为生理盐水和Areg重组蛋白处理后损伤段神经中施万细胞的代表性免疫荧光图像和S100β相对荧光强度统计，红色表示S100β，右侧为高倍镜下的白色方框状区域图；图4B为生理盐水和Areg重组蛋白处理后损伤段神经中施万细胞代表性EdU增殖图像和归一化增殖速率统计，白色表示EdU染色，红色表示S100β，蓝色表示DAPI染色细胞核，白色方框区域的放大图位于图下方)。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1 Amphiregulin的抑制剂和抑制剂对照均由广州市锐博生物科技有限公司合成。序列如下：

siRNA-Areg-1：5’UCAUCCUUCUUCUGAGUCUTT 3’(SEQ ID NO:2)；

3’TTAGACUCAGAAGAAGGAUGA 5’(SEQ ID NO:3)。

siRNA-Areg-2：5’UUUCGCUUAUGGUAGAGACTT 3’(SEQ ID NO:4)；

3’TTGUCUCUACCAUAAGCGAAA 5’(SEQ ID NO:5)。

siRNA-Areg-3：5’UUCGUUAUCAUACUCCUCCTT 3’(SEQ ID NO:6)；

3’TTGGAGGAGUAUGAUAACGAA 5’(SEQ ID NO:7)。

抑制剂对照为无意义随机序列。

转染试剂lipofectamine RNAimax由Invitrogen公司生产。

实施例2细胞培养、纯化和转染

取新生SD大鼠的坐骨神经，剥除血管膜，采用3mg/mL胶原酶I于37℃水浴中消化30min 后去除胶原酶加入0.25％的胰酶，37℃水浴消化5-10min后加入3mL完全培养基终止消化。离心(800rpm×5min、常温)，弃上清，完全培养基清冼两次，以1×10⁶个/mL的细胞密度种至预先用PLL包被中皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱中。连续培养24h后换成含有 10mM阿糖胞苷的完全培养基，继续培养36h-48h后，PBS清洗2遍，换成含有2μM forskolin和10ng/mL HRG的完全培养基，每3-4d换一次液，待细胞长至融合时，可进行施万细胞纯化。制作细胞悬液加入anti-thy1.1(1：1000)冰上孵育2h，离心弃上清，加入含有250μL rabbitcomplement和750μL DMEM培养液(1：3)的混合液，37℃孵育45 min。完全培养基清冼2遍后吹散细胞以2-4×10⁵个/mL的密度种至预先PLL包被好的培养皿中，并放入培养箱。培养24h后换成含有2μM forsokolin和10ng/mL HRG的完全培养基，每隔2-3d换一次液，待细胞长满培养皿即完成细胞纯化，细胞可用于后续实验。

化学合成的Amphiregulin抑制剂和抑制剂对照物如实施例1所示(由RiboBioTechnlogy(中国广州)合成)，转染使用lipofectamine RNAimax试剂(Invitrogen，Carlsbad， CA，USA)，根据说明书操作。

实施例3 real-time RT-PCR(qRT-PCR)

从实施例2转染siRNA-Areg的施万细胞中提取RNA，采用Oligo dT primer(Invitrogen)进行逆转录。Real-time RT-PCR采用SYBR Green Premix Ex Taq(TaKaRa)在Applied Biosystems Stepone real-time PCR System上进行操作。Areg特异性引物序由一对qRT-PCR引物组成，序列如下：

Areg(forward)：5’CCAATGAGAACTCCGTCGCT 3’(SEQ ID NO:8)。

Areg(reverse)：5’AAACCACAAGTCCACCAGCA 3’(SEQ ID NO:9)。

qRT-PCR反应程序：95℃预变性2min；40个PCR循环(95℃，5s；60℃，10s)，在每个循环的延伸阶段收集荧光值；PCR扩增反应结束后，进行产物的溶解曲线分析，以确保PCR产物的质量。用ΔΔCT法分析结果，CT设为反应达到域值时的循环数，则每个基因相对于标准内参的表达量可以用方程2^-ΔCT表示，所有反应设置三个复孔，GAPDH作为内参。

结果如图2A所示，结果显示转染Amphiregulin抑制剂(siRNA-Areg)的施万细胞中Amphiregulin的相对表达量明显低于抑制剂对照(siRNA-Con)组，结果表明本发明设计的Amphiregulin抑制剂能够抑制Amphiregulin的表达。选择转染siRNA-Areg-3的施万细胞用于后续实验研究。

实施例4Amphiregulin(人源)重组蛋白体外暴露实验

Amphiregulin(人源)重组蛋白由BioVision公司生产，采用0.1％BSA配制5ng/mlAreg 重组蛋白，将重组蛋白加入施万细胞培养基中预处理24小时，对照组使用0.1％BSA进行预处理。

实施例5细胞EdU增殖试验

取实施例2和实施例4所获的施万细胞(3×10³个)重悬于100μL完全培养基中，并接种到经多聚L-赖氨酸包被的96孔板上。加入100μM EdU，并于12小时后用4％多聚甲醛固定。根据Cell-Light EdU DNA Cell Proliferation Kit(Ribibio)说明书进行操作。分别统计EdU 阳性细胞和总细胞数，计算EdU阳性细胞数与总细胞数的比值，确定细胞增殖速率。

图2B&图3A为高倍显微镜下细胞EdU增殖图像(比例尺为100μm)，图2B为转染Amphiregulin抑制剂的施万细胞的增殖速率，结果显示，转染Amphiregulin抑制剂的施万细胞的增殖速率低于抑制剂对照组，结果表明Amphiregulin抑制剂能降低施万细胞的增殖速率。图3A为Amphiregulin重组蛋白处理施万细胞的增殖速率，结果显示，Amphiregulin重组蛋白处理组施万细胞的增殖速率高于对照组，结果表明Amphiregulin增效剂能提高施万细胞的增殖速率。

实施例6细胞划痕愈合实验

分别取实施例2和实施例4获得的施万细胞，调整细胞密度为2×10⁵个/mL，接种到置于6 孔板中的1mm宽的模型室中。在移除模型室后的0h和9h分别拍摄相对空白区域，并采用Image Pro Plus(Media Cybernetics,Rockville,MD,USA)来统计相对空白区域的面积。

图2C&图3B为高倍显微镜下细胞划痕愈合实验图(比例尺为100μm)，图2C为转染Amphiregulin抑制剂的施万细胞的迁移速率，结果显示，转染Amphiregulin抑制剂的施万细胞的迁移速率低于抑制剂对照组，结果表明Amphiregulin抑制剂能降低施万细胞的迁移速率。图3B为Amphiregulin重组蛋白处理施万细胞的迁移速率，结果显示， Amphiregulin重组蛋白处理组施万细胞的迁移速率高于对照组，结果表明Amphiregulin增效剂能提高施万细胞的迁移速率。

实施例7构建大鼠坐骨神经夹伤模型实验

取健康成年雄性SD大鼠(180-220g)，腹腔内注射复合麻醉剂，构建大鼠左后肢坐骨神经3 mm夹伤模型，将溶解于0.1％BSA中的50ng Areg重组蛋白稀释于5μL生理盐水中，微量注射器将Areg重组蛋白或等量生理盐水(都需与Matrigel等体积混和均匀)注入压伤部位的神经外膜。在挤压伤后4天收集大鼠坐骨神经段，保留坐骨神经夹伤处及上下各0.5cm 组织，冰冻切片，厚度12μm，切片用施万细胞标记抗体S100β进行免疫荧光染色。

图4A为Areg重组蛋白对坐骨神经夹伤后施万细胞迁移的影响。结果显示施万细胞从损伤处的两端相向迁移，Areg重组蛋白治疗组S100β荧光强度比生理盐水治疗组更高，特别是夹伤近端。表明Areg蛋白促进坐骨神经损伤后施万细胞的迁移。

实施例8大鼠体内Edu实验

将适量EdU粉末溶于生理盐水中，EdU溶液浓度为10mM。取实施例7所获坐骨神经夹伤模型大鼠，取材前24h腹腔注射EdU溶液(5mg/kg)。在夹伤后4天收集大鼠坐骨神经段，保留坐骨神经夹伤处及上下各0.5cm组织，冰冻切片，厚度12μm，切片根据Cell-Light^TM EdUDNA in vivo Kit(Ribibio)说明书进行染色操作。统计EdU阳性并且和S100β共表达的细胞数，确定施万细胞增殖速率。

图4B为Areg重组蛋白对坐骨神经夹伤后施万细胞增殖的影响。结果显示在损伤处的近端和远端均有施万细胞增殖，Areg重组蛋白治疗组施万细胞的增殖率高于生理盐水治疗组。表明Areg蛋白促进坐骨神经损伤后施万细胞的增殖。

序列表

<110> 南通大学

<120> 表皮生长因子Amphiregulin在制备施万细胞调控药物中的应用

<141> 2021-02-26

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> Rat

<400> 1

atgagaactc cgtcgctttc gctggcgctc tcagtgctgt cgctgctggt cttaggctca 60

ggccattatg cagctgggtt ggaactcaat ggcaccagct ctgggaaagg agaaccgtcc 120

tctggggacc acagtgctgg tggacttgtg gtttctgagg tctctaccat aagcgaaatg 180

ccttctggca gtgaactctc cacaggggac tatgactact cggaggagta tgataacgaa 240

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aaggaaaaca agacagaagg agaaaagtct tcagaaaaac ccaaaagaaa gaaaaaggga 360

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<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

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Claims (5)

1.表皮生长因子Amphiregulin在制备施万细胞调控药物中的应用，所述Amphiregulin的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于Amphiregulin作为药物设计靶点设计抑制Amphiregulin表达的药物，抑制施万细胞的增殖和迁移；或者以Amphiregulin作为药物设计靶点设计促进Amphiregulin表达的药物，或者以Amphiregulin作为外源性活性物质的药物，促进施万细胞的增殖和迁移。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑制Amphiregulin表达的药物是Amphiregulin基因的小干扰RNA。

4.一种Amphiregulin抑制剂，其特征为Amphiregulin基因的小干扰RNA为双链小干扰RNA，正义链序列如SEQ ID NO:2、4或6所示。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于施万细胞调控药物包括促周围神经再生药物、治疗周围神经损伤和中枢神经损伤疾病药物、治疗施万细胞过度增殖疾病药物，所述施万细胞过度增殖疾病包括神经鞘瘤以及神经损伤后施万细胞大量增殖引发施万细胞的分化障碍。

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