KR102185219B1 - 실크로 제조된 제품 - Google Patents

실크로 제조된 제품 Download PDF

Info

Publication number
KR102185219B1
KR102185219B1 KR1020157010647A KR20157010647A KR102185219B1 KR 102185219 B1 KR102185219 B1 KR 102185219B1 KR 1020157010647 A KR1020157010647 A KR 1020157010647A KR 20157010647 A KR20157010647 A KR 20157010647A KR 102185219 B1 KR102185219 B1 KR 102185219B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
silk
product
dimensional
dimensional silk
ngc
Prior art date
Application number
KR1020157010647A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150087199A (ko
Inventor
안드레아스 토이슐
마르틴 반 그린스벤
하인츠 레들
Original Assignee
몰포메드 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 몰포메드 게엠베하 filed Critical 몰포메드 게엠베하
Publication of KR20150087199A publication Critical patent/KR20150087199A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102185219B1 publication Critical patent/KR102185219B1/ko

Links

Images

Classifications

    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M11/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising
    • D06M11/01—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with hydrogen, water or heavy water; with hydrides of metals or complexes thereof; with boranes, diboranes, silanes, disilanes, phosphines, diphosphines, stibines, distibines, arsines, or diarsines or complexes thereof
    • D06M11/05—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with hydrogen, water or heavy water; with hydrides of metals or complexes thereof; with boranes, diboranes, silanes, disilanes, phosphines, diphosphines, stibines, distibines, arsines, or diarsines or complexes thereof with water, e.g. steam; with heavy water
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43586—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from silkworms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/005—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/04—Macromolecular materials
    • A61L31/043—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof
    • A61L31/047—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L31/044 - A61L31/046
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M11/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising
    • D06M11/07—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with halogens; with halogen acids or salts thereof; with oxides or oxyacids of halogens or salts thereof
    • D06M11/11—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with halogens; with halogen acids or salts thereof; with oxides or oxyacids of halogens or salts thereof with halogen acids or salts thereof
    • D06M11/13—Ammonium halides or halides of elements of Groups 1 or 11 of the Periodic Table
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M11/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising
    • D06M11/07—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with halogens; with halogen acids or salts thereof; with oxides or oxyacids of halogens or salts thereof
    • D06M11/11—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with halogens; with halogen acids or salts thereof; with oxides or oxyacids of halogens or salts thereof with halogen acids or salts thereof
    • D06M11/155—Halides of elements of Groups 2 or 12 of the Periodic Table
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M11/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising
    • D06M11/58—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with nitrogen or compounds thereof, e.g. with nitrides
    • D06M11/64—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with nitrogen or compounds thereof, e.g. with nitrides with nitrogen oxides; with oxyacids of nitrogen or their salts
    • D06M11/65—Salts of oxyacids of nitrogen
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M11/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising
    • D06M11/58—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with nitrogen or compounds thereof, e.g. with nitrides
    • D06M11/67—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with inorganic substances or complexes thereof; Such treatment combined with mechanical treatment, e.g. mercerising with nitrogen or compounds thereof, e.g. with nitrides with cyanogen or compounds thereof, e.g. with cyanhydric acid, cyanic acid, isocyanic acid, thiocyanic acid, isothiocyanic acid or their salts, or with cyanamides; with carbamic acid or its salts
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M13/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
    • D06M13/10—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with compounds containing oxygen
    • D06M13/144—Alcohols; Metal alcoholates
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M13/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
    • D06M13/10—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with compounds containing oxygen
    • D06M13/184—Carboxylic acids; Anhydrides, halides or salts thereof
    • D06M13/188—Monocarboxylic acids; Anhydrides, halides or salts thereof
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M13/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
    • D06M13/10—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with compounds containing oxygen
    • D06M13/184—Carboxylic acids; Anhydrides, halides or salts thereof
    • D06M13/207—Substituted carboxylic acids, e.g. by hydroxy or keto groups; Anhydrides, halides or salts thereof
    • D06M13/21—Halogenated carboxylic acids; Anhydrides, halides or salts thereof
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M13/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
    • D06M13/10—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with compounds containing oxygen
    • D06M13/184—Carboxylic acids; Anhydrides, halides or salts thereof
    • D06M13/207—Substituted carboxylic acids, e.g. by hydroxy or keto groups; Anhydrides, halides or salts thereof
    • D06M13/21—Halogenated carboxylic acids; Anhydrides, halides or salts thereof
    • D06M13/213—Perfluoroalkyl carboxylic acids; Anhydrides, halides or salts thereof
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M23/00—Treatment of fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, characterised by the process
    • D06M23/14—Processes for the fixation or treatment of textile materials in three-dimensional forms
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M2101/00—Chemical constitution of the fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, to be treated
    • D06M2101/02—Natural fibres, other than mineral fibres
    • D06M2101/10—Animal fibres
    • D06M2101/12—Keratin fibres or silk
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/26—Web or sheet containing structurally defined element or component, the element or component having a specified physical dimension
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/31504—Composite [nonstructural laminate]
    • Y10T428/31725—Of polyamide
    • Y10T428/31728—Next to second layer of polyamide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

삼차원 실크 제품의 생산 방법으로서, 삼차원 실크 제품을 실크 제품의 부분 해체가 얻어지도록 제한된 기간 동안 실크 용매로 처리한 후, 부분 해체된 실크 제품을 재안정화 용액에 의해 물리적 β-시트 유도와 함께 재안정화시키는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법이 본원에 개시된다.

Description

실크로 제조된 제품{PRODUCT MADE OF SILK}
본 발명은 실크 재료를 가공하는 분야, 특히, 의료 용도의 실크 재료를 제공하기 위한 실크 재료를 가공하는 분야에 관한 것이다.
역사적으로, 실크는 생물의학 봉합에 수십 년간 사용되고 있는데, 여기서 잠재적인 숙주 면역 반응이 관찰되었다. 이는 실크의 사용에 관한 주요 문제일 수 있으며, 그러한 문제는 과거에 생물의학 적용에서 그 사용을 무시하게 했다. 면역 반응 활성을 유발하는 주된 원인은 세리신과 연관이 있다. 따라서, 생사(raw silk)로부터 세리신의 충분한 제거가 생체적합성 문제를 방지하는 조직 공학 및 재생 의학 적용을 위한 실크의 제조에 있어서 중요한 단계이다.
일반적인 누에 실크는 뽕 누에 Bombyx mori의 유충의 고치로부터 얻어진다. 단일의 누에 고치 섬유는 세리신이라 불리는 아교-유사 단백질에 의해 둘러싸인 두 개의 피브로인 코어로 구성되고, 이러한 세리신은 피브로인 섬유를 서로에 대해 고정시킨다. 피브로인 및 세리신은 각각 약 75중량% 및 25중량%를 차지한다.
형태학상으로, 실크 피브로인은 배향이 고도로 되어 있고, 결정질인 섬유 구조인 것이 특징이다. 이러한 구조는 대부분의 용매, 예컨대, 물, 에탄올, 묽은 산 및 염기에 이를 불용성으로 만드는데 원인이 된다. 피브로인과 대조적으로, 구형의 단백질 세리신은 수성 용매에 용이하게 용해된다. 텍스타일 산업에서, 실크 의류의 광택이 세리신에 의해 나타나지 않기 때문에 세리신의 제거가 또한 큰 관심을 받고 있다. 따라서, 실크에 대한 작업을 하는 연구 그룹들은 최적의 정련 방법을 위하여 생체재료 분야뿐만 아니라 직물 산업 조사로 제한되지 않는다. 이러한 사실로 인해서 알칼리성 용액 w/o 세제, 요소, 타르타르산, 시트르산, 또는 효소, 예컨대, 파파인 또는 엔도펩티다아제를 포함한 다양한 정련 방법이 존재하게 되었다. 전형적인 정련 방식은 섬유질 구조로부터 세리신을 제거하는 것을 돕는 알칼리성 용액 w/o 세제에서 생사를 비등시키는 것이다. 특히 조직 공학 연구 분야에서 정련을 달성하기 위해서 0.02M 소듐 카보네이트 용액을 100℃에서 30-60min 동안 사용하는 것이 일반적이라는 점이 강조될 수 있다. 흔히, 이러한 알칼리성 정련은 알칼리에 더하여 비누 또는 세제를 사용하는 회분식 처리로 수행된다.
산업적 실크 생산은 흔히 피브로인 용액 중에 천연 섬유를 용해시키고, 이러한 용액으로부터 방사와 같은 적합한 공정에 의해서 섬유를 재가공함을 포함한다.
의료 용도를 위한 실크 재료의 공급은 1:2:8의 몰비의 LiBr 또는 CaCl2/EtOH/물과 같이 수성 시스템 중에서 실크 섬유를 용해시키고[CN 101736430 B], 이어서, 예를 들어, 방사, 전기방사, 수성 또는 유기 용매 시스템으로부터의 주조, 겔화, 발포 등에 의해 요망되는 재료 형태로 실크 용액을 재가공하는 것을 거의 독점적으로 이용하고 있다[Vepari et al., 2007, US 5,252,285 A; Sung-Won Ha et al., Biomacromolecules 4(3) 2003 p.488-496].
그러나, 이러한 피브로인 용액으로부터 재가공된 실크 재료는 천연(미가공(native)) 실크 구조와는 달라서, 흔히, 특히 외과 분야에서의 많은 가능한 용도로는 만족스럽지 않은 특성(특히, 기계적 특성)을 지니는 삼차원 제품을 야기한다.
생성된 실크 구조에서 이러한 특성이 약화되는 것을 방지하기 위해서, 정련된 실크 섬유를 원료로서 사용하는 기술이 필요하다. 특히 생물의학 제품 분야에서 텍스타일 조작 기술, 예컨대, 브레이딩(braiding), 노팅(knotting), 위빙(weaving) 등으로의 실크 섬유의 높은 가공성은 Horan 등에 의해 입증되었다[J Biomech 39(12) 2006, p.2232-2240]. 그러한 스캐폴드 생산을 위한 텍스타일 조작 기술의 이용으로부터 얻어질 수 있는 개선에도 불구하고, 텍스타일 조작 기술로는 어렵거나 심지어 달성가능하지 않은 섬유의 결합을 도입하는 것이 유리할 수 있는 특별한 경우가 있다. 따라서, 용매, 접착제(수지에 엠베딩(embedding))를 사용하거나 가열을 이용하여 천연 섬유뿐만 아니라 합성 섬유들을 함께 결합시키는 여러 방법이 개발되었다[US 3 510 390 A]. 인접한 실크 섬유에 대한 다른 실크 섬유의 그러한 결합을 달성하는 한 가지 방법은 이온성 액체를 사용하는 것이다. 이러한 이온성 액체는 실크를 포함한 다수의 바이오폴리머를 위한 용매로서 작용한다. 예를 들어, Haverhals 등[Macromolecular materials and engineering 295, 1 January 2010, p.425-430]은 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 아세테이트를 사용함으로써 미가공의 정련되지 않은 실크 섬유들을 함께 "융착(weld)"할 수 있음을 입증할 수 있었다. 이러한 공정은 섬유를 분열되지 않고 분해되지 않은 구조로 표면 결합시키는 것으로 기재되고 나타나 있다[US 8 202 379 B1].
실크 섬유를 서로 고착시키는데 사용된 또 다른 화학 시약은 포름산이다. 이미, 1915년에, 짧은 실크 섬유로부터 균일한 섬유 펄프를 생산하는 공정이 개시되었다[GB 12374 A]. 생물의학 분야에서, Ghanaati 등[JTERM, 2010 (4) p.464-472]은 융합된 실크 섬유의 연속 상을 형성시키지 않으면서 이식가능한 안정한 스캐폴드를 얻기 위해서 포름산을 정련된 부직포 실크 섬유들을 함께 결합시키는데 포름산을 사용하였다.
생체 재료, 특히, 이식된 생체 재료는 상당한 기계적 안정성, 특히, 압력을 견뎌내기 위한 상당한 기계적 안정성을 가져야 하고, 그러한 재료의 어떠한 의도치않은 붕괴가 방지되거나 배제되어야 함이 분명하다. 이에 따라서, 개선된 방법에는 개선된 기계적 및 형태학적 특성을 지니는 실크를 기반으로 한 강성의 생체재료를 제공하는 것이 필요하다. 이러한 방법은 탄탄하고, 재생산가능하며, 신뢰가능한 생산 방법을 가능하게 해야 하고; 다른 한 편으로, 제품은 생산된 생체재료를 특히 의료 및 세포 배양 방법에 적용가능하게 해야 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 그러한 방법을 제공하는 것이고; 그러한 방법은 또한 특히 의료 용도, 특히, 치료 및 수술에 적합해야 한다.
따라서, 본 발명은 삼차원 실크 제품의 생산 방법으로서, 실크 제품의 부분 해체가 얻어진 후 부분 해체된 실크 제품이 물리적 β-시트의 유도로 재안정화되도록 삼차원 실크 제품을 제한된 기간 동안 실크 용매로 처리하는 생산 방법을 제공한다.
본 발명에서, "삼차원 실크 제품"은 세 개의 차원 중 어느 것도 다른 두 개의 차원과 관련하여 무관하지 않은 그러한 차원을 지니는 제품으로서 뿐만 아니라, 균일한 피브로인 층(영역, 부위, 상 등)과 이방성 재료 특성의 발생을 입체적으로 가능하게 하는 섬유질 피브로인 층인 두 개의 피브로인 층의 적어도 하나의 스택(stack)으로서 규정된 제품인 것으로 이해해야 한다.
본 발명에 따른 방법은 개선된 기계적 특성을 지니는 실크 구조물, 특히, 피브로인 구조물을 제공한다. 이는 본 공정에 의해 얻어질 수 있는 제품이 생체 내에서 특정 기계적 영향에 노출되는 영역으로 그러한 제품을 이식하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 신경 도관의 경우에, 생체내 이식물은 그러한 이식물의 붕괴를 초래할 수 있는 압력에 노출될 수 있다. 그러한 경우에, 미처리된 피브로인의 (직조식) 관은 붕괴되고, 그러한 관에 의해 덮여진 성장하는 신경을 방해할 것이다. 본 발명에 따른 방법은 으스러지거나 뭉게지는 것을 초래하는 그러한 힘에 견디는 이식물의 제공을 가능하게 한다. 분해 단계뿐만 아니라 재안정화 단계는 본 발명에 따른 유리한 특성을 지니는 제품을 생성시키지 않으면서 피브로인 구조물에 대해 수행되는 반면, 이러한 두 가지 단계들의 조합은 본 발명에 따른 제품의 개선된 특성을 야기한다.
본 발명에 따른 부분 해체 단계는 분해 용액인 실크 용매에 노출된 영역에서 실크 제품을 부분 용융시키는 것으로 보일 수 있다. 이는 피브로인이 형상화될 수 있게 하는 피브로인의 베타-시트 구조의 부분 해체을 포함한다. 이러한 해체는 물론 제품을 용액 중에서 변형시키지 않으면서 최종 제품에 요망되는 정도, 예를 들어, 단지 표면에 밀접하게 또는 전체 실크 제품에 걸쳐서 수행될 수 있다. 출발 재료(즉, 실크 제품)의 일반적인 모양은 부분 해체 단계 전체에 걸쳐서 본질적으로 유지된다. 따라서, 실크 용매는 용매화가 완료될 때까지(그리고 평형이 달성될 때까지)가 아니라 제한된 기간 동안에만 적용된다. 용액 또는 현탁액으로의 실크(피브로인) 재료의 완전한 (재)액화는 본 발명에 따라 이루어지지 않고, 단지 제품의 제한된 영역에서 부분적 탈고형화 공정이 이루어진다. 이러한 (부분적) "용융" 단계는 연속상의 형성에 의해 특성화되는 제품의 분해된 영역에서 피브로인 분자의 보다 조밀한 패키징(packaging)을 가능하게 한다. 분해 단계가 실크 제품 상에서 수행되게 하는 정도는 이후에 본 발명에 따른 최종 제품의 상이한 제품 특징의 원인이 된다.
따라서, 본 발명에 따른 "분해"는 다른 실크 가공 단계, 예컨대, 정련("정련"은 코어로부터 외부 시트의 제거와 유사한 두 개의 단백질 부류의 서로로부터의 분리(즉, 세리신이 피브로인 피브릴로부터 분리됨)를 지칭할 것이다)과는 분명히 다르다는 점이 명백하다.
재안정화 단계에서, 실크 제품의 분해된 부분은 다시 고형화되지만, 실크 제품의 분해되지 않은 부분과 상이한 형태학적 및 기계적 특성을 지니는 영역이 초래된다. 재안정화 단계에 의해서, 실크 제품은 다시 완전히 고형화되지만, 일반적으로 이방성의 최종 제품을 초래하고, 실크 가용화 용액에 가장 두드러지게 노출된 표면은 가장 광범위한 구조적 변화를 겪고, 실크 제품의 내부(또는 실크 가용화 용액("실크 용매")에 노출되지 않은 표면)는 거의 변하지 않은 채로 유지되거나 적어도 실크 용매에 더 노출되었던 영역의 정도까지는 변화되지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 재안정화 단계는 형태학적 결정질-유사 상태를 유도하는 것이다. 재안정화 단계는 물리적 β-시트의 유도에 의해 수행된다. 분해는 실크의 "무작위(random)" 구조를 초래한다. 그 후에, 분해된 실크는 β-시트 리폴딩을 달성하도록 물리적으로 처리된다. 이러한 단계를 수행하기 위한 전형적인 방식은 그러한 리폴딩이 발생할 때까지 무작위 실크 형태 내에서 분해된 영역으로부터 물 분자를 제거하는 것이다.
실크 피브로인은 실크 I, II 및 III로 흔히 식별되는 세 개의 상이한 상으로 존재하는 다형태 재료이다. 실크 I은 수용성인 나선형의 무작위 코일 구조의 상태를 나타내고, 실크 (수)용액으로서(또한 재생 실크로서 알려짐) 또는 방사 공정 전에 누에의 샘(gland)에서 발견될 수 있다. 실크 II는 글리신으로부터의 수소 측쇄가 β-시트의 한 면 상에서 주로 노출되고 다른 물질 상의 알라닌으로부터의 소수성 메틸 측쇄가 다른 면 상에서 주로 노출되는 비대칭적인 β-시트 구조라는 점이 특징이다. 그 결과, β-시트는 강한 수소 결합 및 반데르발스 힘(van der Waals force)에 의해 안정화되어 일렬로 맞춰짐으로써 자기-조립된다. 열 또는 전단력에 대한 노출에 의해서, 실크 I에서 실크 II로의 구조적 변화가 유도된다. 이러한 상 전이는 또한 실크 분자로부터 수분 손실을 촉진시키는 메탄올 또는 다른 시약으로 실크 구조물을 처리함으로써 얻어질 수 있다. 그 결과, 무작위 코일(실크 I)에서부터 β-시트 형태(실크 II)로의 전이가 향상된 사슬-사슬 상호작용에 의해 유도된다. 상 전이 외에, 이러한 공정은 또한 내수성 실크 구조를 보장한다. 추가로, 베타-시트 형성을 유도하고 제어하는 공정에는 스팀-오토클레이빙[Park et al., J. Mat. Sci 43 (2008), 6967-6985] 및 물 풀림(water annealing) 방법[Hu et al., Biomacromol. 12 (2011), 1686-1696]이 있다.
재안정화 단계는 바람직하게는 재안정화 용액으로의 처리에 의해 본 발명에 따라 수행된다. 또한, 상이한 재안정화 용액들의 조합이 적용될 수 있다.
재안정화 용액으로의 처리에 의한 재안정화는 실크의 β-시트 형성을 달성시키는 어떠한 용액으로 수행될 수 있다. 그러한 결정화도(재안정화 용액으로의 처리에 의한 재안정화)는 일반적으로 알콜, 예컨대, 메탄올 또는 에탄올에의 침지에 의해 현재 산업 방법에서 두 가지 방법을 통해 유도된다. 알콜 침지가 간단하고 빠르지만, 알콜의 사용을 피하려는 경우에는 포름산과 같은 무알콜 재안정화 용액이 사용될 수 있다.
본 발명을 위한 시험 시스템으로서, 신경 회복을 위한 실크 피브로인 제어 구조가 연구되었다. 더욱 특히, 좌골 신경(N. ischiadicus)의 결손의 연결(bridging)이 래트의 생체내에서 관찰되었고, 이는 놀라운 결과를 보여주었다(실시예 섹션 참고).
놀랍게도, 실크 제품, 특히, 삼차원 피브로인 제품은 본 발명에 따른 두 개의 가공 단계의 적용에 의해 이의 기계적 특성에 대하여, 특히, 생체내 이식 후에 붕괴에 대한 이의 내성에 대하여 효율적으로 개선될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 피브로인 용액으로부터 재가공된 실크 섬유(본 발명에 따른 이러한 강화 단계를 지니지 않음)에 비해서 상당한 이점 및 가능성을 지니는 삼차원 실크 제품의 생산을 가능하게 한다
본 발명에 따른 보다 강성의 복잡한 실크 구조물의 제공은 현대 외과에서 상당한 이점을 제공한다. 또한, 전반적으로 생산 공정이 신뢰가능하고 산업적 대량 생산에 적합하다.
바람직하게는, 본 방법에 따른 실크 용매는 LiBr, LiSCN, 헥사플루오로-2-프로판올(HFIP), 에탄올을 포함한 혼합물 및 CaCl2 또는 메탄올을 포함한 혼합물 및 칼슘 니트레이트; 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직한 구체예에 따르면, LiBr은 1 내지 10M, 바람직하게는 3 내지 10M, 특히 5 내지 7M의 농도로 실크 용매에 사용된다. 바람직한 구체예에 따르면, LiSCN은 1 내지 17.5M, 바람직하게는 5 내지 15M, 특히 8 내지 12M의 농도로 사용된다. 바람직한 구체예에 따르면, HFIP는 1 내지 100%(v/v), 바람직하게는 50 내지 100%(v/v)의 HFIP, 특히 90 내지 100%(v/v)의 HFIP를 함유하는 용액에 사용된다. 에탄올은 예를 들어, 1 내지 50%(v/v)의 에탄올, 바람직하게는 5 내지 40%(v/v)의 에탄올, 특히 10 내지 30%(v/v)의 에탄올을 함유하는 수용액에서 실크 용매에 사용될 수 있다. CaCl2는 예를 들어, 에탄올에 대하여 1:0.3 내지 1:3(즉, 1mol의 CaCl2:0.3mol의 EtOH 내지 1mol의 CaCl2:3 mol의 EtOH), 바람직하게는 1:1 내지 1:2.5, 특히 1:1.5 내지 1:2.2의 몰비로 실크 용매에 사용될 수 있다.
본 방법은 매우 다양한 여러 실크 제품들, 특히 피브로인 제품에 적용가능하다. 바람직하게는, 삼차원 실크 제품은 직포, 부직포, 튜브, 니팅된 제품 또는 프레싱된 제품이다. 본 발명에 따른 방법은 어떠한 실크 스캐폴드로 실시될 수 있지만, 본 방법은 실크 섬유로 구성된 스캐폴드의 처리에 특히 적합하다. 그러한 제품은, 바람직하게는 이방성 제품, 즉, 분해된 표면과 여전히 실크 섬유를 함유하는 내부를 지니는 제품을 제공하는, 분해가 이루어진 영역과 본래의 실크 섬유 구조가 여전히 존재하는 영역을 지니는 실크 스캐폴드로 변형될 수 있다. 실크 피브로인 제품 또는 천연 실크 섬유의 직조 제품을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 방법을 위한 바람직한 출발 재료는 예를 들어, 실크 튜브(예를 들어, Lovett등[Biomaterials 29 (2008), 4650-4657]; US 2008/249639 A1호; Ghaznavi 등[Ann.Pl.Surg. 66 (2011), 273-279]에 의해 생산된 바와 같은), 실크 직물(예를 들어, WO 02/29141 A1에 의해 생산된 바와 같은), 또는 실크막(예를 들어, US 2010/286774 A1)이다.
실크 재료는 모든 천연 및 합성 공급원으로부터 얻어질 수 있지만; 누에(Bombyx mori) 고치로부터의 천연 실크 섬유로부터 제조되거나 유래된 실크 제품을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 섬유(이의 천연 형태 또는 이미 정련된 형태(즉, 섬유로부터 세리신이 제거된 후))는 본 방법을 위한 출발 재료로서 사용되는 실크 제품을 생산하기 위해 천연 섬유로서 사용되거나, 피브로인 용액으로 먼저 변형된 후에 다시 (피브로인) 섬유 및 피브로인 제품으로 재가공(예를 들어, 방사에 의해)될 수 있다. 실크 섬유를 위한 주요 산업적 공급원은 물론 뽕 누에 Bombyx mori이지만, 다른 누에(Lepidopteron)로부터의 실크 섬유가 또한 본 발명에 따른 공정에 사용될 수 있다. 누에는 일반적으로 뽕(Bombyx mori, Bombyx mandarina )과 비-뽕(Antheraea (A.) mylitta , A. proylei , A. pernyi , A. yamamai , A. frithi , A. assamensis , Samia ricini , A. atlas , Gonometa postica , Cricula trifenestrata) 누에로 구별될 수 있다. 야생 누에와 사육된 누에 사이에 추출된 세리신의 아미노산 조성에 대한 패턴-유사도는 적어도 97%인데, 이는 상이한 종의 누에들 간에 다수의 아미노산 서열이 보존된다는 것을 입증하는 것이고[Mondal et al., Caspian J. Env. Sci. 5 (2007), 63-76], 이는 개시된 방법이 또한 다른 실크 공급원으로 적용가능하다는 암시로 작용한다.
다른 한 편으로, 피브로인 용액, 특히, 재조합 피브로인 용액으로 이루어진 재구성 섬유로 제조된 실크 제품에 본 발명에 따른 방법을 적용하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 Bombyx mori 누에로부터의 실크 섬유로 구성된 제품에 대하여 특히 최적화되었다. 이는 또한 텍스타일 산업을 위한 미가공 실크 섬유의 주요 산업적 공급원이다. 그러나, 이미 상기에 명시된 바와 같이, 또한 나방 모충 또는 구형 방사 거미(예컨대, Nephila clavipes)로부터와 같은 다른 실크 섬유가 본 발명에 따른 실크 제품의 생산을 위해 사용될 수 있다. 또한, 절차상의 단계가 제품의 삼차원 모양을 실질적으로 파괴하지 않으면서 이러한 개별적인 조합에 적용되는 한, 실크 재료(섬유) 외에 또한 생체적합성 재료, 예컨대, PEG, 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등을 제공하는데 사용되는 다른 물질들을 함유하는 삼차원 실크 제품에 본 방법을 적용하는 것이 가능하다.
가장 바람직한 미가공 실크 섬유는 Bombyx mori 누에 고치로부터의 것이다. Bombyx mori 누에로부터의 실크 섬유는 모서리가 둥근 5 내지 10μm 너비의 삼각형 단면을 지닌다. 피브로인-중쇄는 일부 변이가 있는 59-mer의 아미노산 반복 서열로 인해 대부분 베타-시트로 구성된다. 피브릴의 평평한 표면은 많은 각도에서 빛을 반사하여 실크에 자연적인 광택을 준다. 그 밖의 누에로부터의 단면은 Anaphe의 경우에는 초승달-유사 그리고 터서(tussah)의 경우에는 긴 쐐기와 같이 모양과 직경이 다를 수 있다. 누에 섬유는 아교와 유사하게 작용하는 세리신 단백질로 함께 붙어 있는 일차 필라멘트(브린)의 일부로서 두 개의 누에 실샘으로부터 자연적으로 추출되어 고치실을 형성시킨다. 터서 실크의 경우 고치실 직경은 65μm에 이를 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조될 바람직한 실크 제품은 의료용 임플란트, 바람직하게는 스텐트, 신경 도관, (조직) 스캐폴드(예, 건(tendon), 기관지(bronchi), 기관(trachea) 등), 탈장 메쉬워크(hernia meshwork), 결찰, 특히, 전방 십자 인대(anterior cruciate ligament: ACL), 또는 연골(cartilage) 및 골 이식편이다.
본 발명에 따른 방법에 의해서, 이방성 실크 제품, 즉, 주어진 제품 내에서 또는 주어진 제품의 상이한 면 또는 상이한 영역에 대하여 변하는 실크 재료 특성을 지니는 제품을 제공하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 이방성 삼차원 실크 제품은 이방성 재료 특성의 발생을 입체적으로 가능하게 하는 두 개의 피브로인 필라멘트 층들("상", "영역", "부위")의 하나 이상의 스택이라는 점이 특징이다. 본 발명에 따른 삼차원 재료는 또한 구멍("포집된 구멍")을 함유하지 않거나 적어도 5%v/v 미만의 포집된 구멍을 함유하는 균일한 (연속적인) 피브로인 상(용해된 후에 재안정화된 제품에서의 영역), 및 연속적이진 않지만 실크 섬유의 섬유질 성질이 특징인 섬유질 피브로인 상(실크 섬유가 용해되지 않은 영역)이 특징이다(균일한 피브로인 상을 지니지 않는(그러나, 필라멘트 성질의 구조("적층된 섬유", "연속 필라멘트" 등)) 종래 기술의 제품을 보여주는 도 13과 대조하여 도 11e 내지 11i 참조; 도 11e 내지 11i에서의 적색 막대는 본 발명에 따른 제품에서 균일한 상의 두께를 나타냄).
본 발명에 따른 제품은 연속적인 외층과 필라멘트성 내층을 지님으로써 이방성이 될 수 있다. 또한, 단지 제품의 내부 코어가 필라멘트 형태로 존재하는 반면, 전체 제품의 표면은 균일하고, 또는 또한 전체 제품이 비-필라멘트성이고 균일하고 연속적인 형태인 것이 가능하다. 균일하지 않아야 하는 제품의 표면 상의 부위는 공정 동안 예를 들어, 물리적 커버링 또는 화학적 보호에 의해서 실크 용매 및 재안정화 용액으로부터 보호될 수 있다.
이는 단지 한 면이 본 발명에 따라 가공되는 반면 반대 면이 이러한 처리에 주어지지 않거나 현저히 주어지지 않도록 실크 제품의 단지 한 면으로만 가용화 용매를 유도함으로써 달성될 수 있다. 이에 의해서 이후 상이한 특성을 지니는 두 개의 상이한 표면(예를 들어, 한 면이 여전히 미처리된 특성을 지니고, 다른 면이 본 발명에 따른 실크 제품의 특성을 지님)으로 되어 있는 제품이 야기된다. 또한, 실크 제품의 내부가 이의 미처리된 성질을 보유하고 오리지 표면(요망되는 "깊이"에 이르기까지)만이 본 발명에 따른 개선되는 변화된 특성을 나타내도록 실크 제품의 특정 "깊이"까지 부분 해체가 이루어지게 함으로써 제품의 이방성 특성을 제공하는 것이 가능하다(예를 들어, 도 2 참조). 본 발명에 따른 방법은 예를 들어, 보다 짧거나 긴 시간 동안(또는, 다른 공정 파라미터, 예컨대, 온도, 농도 또는 공정 화학물질 등을 변화시킴으로써) 부분 해체를 위해 실크 용매로의 처리를 실시하는 것을 가능하게 하기 때문에, 분해가 이루어지는 "깊이"가 규제될 수 있다. 예를 들어, 각각의 실크 제품은 단지 짧게(단지 즉각적인 표면 분해 또는 재안정화 단계에 의한 즉각 강화) 또는 연장된 기간 동안(실크 제품의 대부분이 첫 번째 단계에서 분해되게 함(그리고, 분해가 수행된 후에, 바람직하게는 그 직후에 항상 실시되는 본 발명에 따른 재안정화 단계에 의해 강화됨)) 처리될 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 삼차원 제품은 적어도 0.1mm, 바람직하게는 0.5mm의 가장 작은 치수("두께")의 직경을 지니는 복잡한 삼차원 구조물이다. 이론적으로, 또한 10-15μm의 두께가 가능하지만, 그러한 구체예는 일반적으로 실용성이 낮다. 이는 또한 보다 간단한 삼차원 제품의 폴딩(folding), 용접, 또는 튜빙(tubing)에 의해 이루어질 수 있다. 실제로, 본 발명에 따른 바람직한 삼차원 제품은 적어도 1.0mm, 바람직하게는 적어도 2.0mm, 특히 적어도 5.0mm의 가장 작은 치수의 직경을 지닌다.
가용화 단계 및 재안정화 단계를 위한 공정 파라미터는 재생산가능한 방식으로 얻어질 특정 제품에 대하여 용이하게 최적화될 수 있다. 분해 및 재안정화 화학물질의 온도, 유형 및 농도, 처리 기간이 최종 제품이 가져야 하는 분해 및 강화 정도의 양에 좌우하여 각각의 제품에 맞춰질 수 있다. 예를 들어, 실크 용매로의 처리는 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 78℃, 특히 70 내지 77℃의 온도에서 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에는 예를 들어, 1s 내지 2h, 바람직하게는 1s 내지 0.5h, 특히 10s 내지 30min 동안 실크 용매로의 처리 기간이 적용된다. 재안정화 용액으로의 처리는 예를 들어, 1s 내지 1h, 바람직하게는 5min 내지 1h, 특히 20min 내지 30min 동안 수행될 수 있다. 물론, 적용되는 온도 및 기간이 서로 의존적이고, 주어진 생산 설정에 대하여 서로 개별적으로 조절되어야 하는 것은 분명하다(온도가 높을수록 일반적으로 반응 시간이 짧아진다).
바람직한 재안정화제는 포름산이다. 포름산은 실크 용매뿐만 아니라 실크 결정화제인 것으로 알려져 있다[Um et al. Int. J. Biol. Macromol 33 (2003) 203-213]. 본 발명에 따른 재안정화제에서, 포름산은 그 자체가 실크 피브로인 분자의 수력학적 반경으로 이어지는 포름산의 무작위-코일 구조를 야기하는 약한 용매로서 작용한다. 이는 결정화 전에 미리주문되고/보다 조밀한 포장을 초래한다. 그 후에, 최종 결정화가 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 메탄올로의 처리에 의해(가장 바람직함) 달성될 수 있다. 다른 재안정화 용매는 아세트산, 에탄올, 프로판산, 1 내지 4개의 탄소 원자를 지니는 할로겐화 유기산, 예를 들어, FCOOH, ClCOOH, CF3COOH, CF2HCOOH, CFH2COOH, CCl3COOH, CCl2HCOOH, CClH2COOH 등, 특히, 아세트산일 수 있다. 바람직한 재안정화제는 상기 명시된 바와 같이, 포름산, 바람직하게는 90 내지 100% 포름산, 특히, 97 내지 99% 포름산이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에는 분명한 염기성 화합물인 98% 포름산이 적용된다.
본 발명에 따른 방법에서, 실크 섬유는, 실크 섬유가 용해되고, 그에 따라서 피브로인이 무작위 코일로서 존재하는 영역으로 되어 있는 삼차원 제품을 얻기 위해서 실크 용매에 의해 용해된다. 재안정화 용액, 특히, 포름산은 그 후에 β-시트(연속상)의 형성을 유도하고; 피브로인은 이러한 β-시트 형성에 의해 안정화된다. 결정화제, 특히, 메탄올로의 바람직한 추가의 처리는 수불용성인 연속적인 피브로인 상의 안정화를 야기한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예는 실크 용매가 CaCl2, 에탄올 및 물과 조합되고, 부분적으로 분해된 실크 제품이 포름산으로 재안정화되고, 이에 의해서 얻어진 제품이 최종 재안정화 단계로서 메탄올로 추가로 처리되는 방법이다. 단계들의 이러한 조합은 상당히 개선된 기계적 특성을 지니는 제품을 가능하게 한다(예를 들어, 도 3 참조).
바람직한 구체예에 따르면, 삼차원 실크 제품에는 재안정화된 제품으로부터 제거될 수 있는 용해가능한 비-실크 재료가 제공되고, 바람직하게는 용해가능한 비-실크 재료는 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜), 폴리사카라이드/당, 염, 또는 일반적으로 가용성 포로겐으로서 사용되는 어떠한 물질이다. 이러한 재료는, 본 출원에 따른 제품 후에 분해된 후에, 세포 또는 약제학적으로 활성인 물질을 위한 용기로서 사용가능할 수 있는 제품에 공간을 남기거나, 조직, 예를 들어, 혈관, 특히, 모세혈관의 성장을 위한 공간을 제공하기 위해 용해될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 실크 제품은 추가의 활성 물질을 지닌다. 그러한 활성 분자에 의해서, 가치있고 중요한 특징이 본 발명에 따른 실크 제품에 추가될 수 있다. 예를 들어, 세포 접착 증진 특성(예를 들어, 세포 접착 방지 특성)을 지니는 물질은 실크 제품에 추가될 수 있다. 바람직한 삼차원 실크 제품은 추가로 세포 접착을 증진시키는 물질, 바람직하게는 세포-결합 펩타이드, 특히 Arg-Gly-Asp("RGD") 펩타이드; 세포 접착 증진 단백질, 특히 SF 단백질, 젤라틴, 피브로넥틴 또는 렉틴을 포함한다. 바람직하게는, 삼차원 실크 제품은 세포 접착을 증진시키는 개질된 폴리펩타이드, 특히, 개질된 RGD 펩타이드, SF 단백질, 젤라틴, 피브로넥틴 또는 렉틴을 추가로 포함한다. 일반적으로, 생체재료의 표면 상의 세포 접착의 증진은 조직 공학 적용의 경우에 큰 관심을 받고 있다. 세포 접착을 개선하기 위하여 생체활성 물질, 예컨대, 아르기닌-글리신-아스파트산을 포함한 세포-결합 펩타이드 서열 또는 생체분자-유래된 물질, 예컨대, 젤라틴 또는 피브로넥틴으로 재료 표면을 조정하려는 많은 시도가 이루어졌다[Rowley et al., Biomat. 20 (1999), 45-53; Liu et al., J. Biomed. Mat. Res. A 74 (2005), 84-91]. SF는 글리신과 알라닌의 각각의 모티브로 주로 구성된 5000개 이상의 아미노산의 단백질(등록 번호 P05790)이다. 그럼에도 불구하고, SF는 화학적 변형에 모두 이용가능한 충분한 분율의 반응성 아미노산, 예컨대, 아스파트산 및 글루탐산, 티로신, 세리신 및 트레오닌을 함유한다[Murphy et al., J. Mat. Chem. 19 (2009), 6443-6450]. 예를 들어, 카보디이미드 결합 화학물질은 골 형성을 유도하는 골 형성 단백질 2(bone morphogenetic protein 2: BMP-2)[Karageorgiou et al., J. Biomed. Mat. Res. A 71 (2004), 528-537]과 세포 부착을 촉진하는 RGD 펩타이드[Kardestuncer et al., Clin. Orthop. Rel. Res. 448 (2006), 234-239]에 실크 피브로인을 커플링시키는데 사용되었다. 실크 피브로인을 데코레이팅(decorating)하고 세포 부착을 개선시키는데 사용될 수 있는 추가의 물질은 렉틴, 다양한 형태의 RGD-서열, 콜라겐과 유사한 결합 모티브, 피브로넥틴 또는 그 밖의 천연 단백질이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 삼차원 실크 제품에 관한 것이다.
이미 명시된 바와 같이, 이러한 제품은 개선된 기계적 특성, 특히, 압력 또는 붕괴력에 대해 개선된 저항을 지닌다. 이는 본 발명에 따른 제품을 관형 형태, 특히, 생체내 이식관, 예컨대, 혈관 이식편 또는 신경 도관, 또는 그 밖의 스캐폴드에 특히 적합하게 한다. 이에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 제품은 스텐트, 혈관 이식편, 신경 도관, 탈장 메쉬워크, 또는 조직 공학 또는 재생 의료 적용을 위한 어떠한 다른 스캐폴드이다.
본 발명에 따른 실크 제품 상에 수행되는 부분 해체(그리고, 물론, 제품에서 이러한 분해된 영역의 후속 재안정화)의 정도는 본 발명에 따른 방법에 의해, 바람직하게는 실크 용매로의 처리를 위한 기간에 의해 정확하게 규제될 것이다. 예를 들어, 약 20s 동안의 처리는 실크 용매에 노출된 실크 제품의 표면으로부터 약 50μm의 분해 깊이를 야기하고; 40s의 처리는 약 100μm의 분해를 야기한다. 실크 용매에 노출된 실크 제품의 표면은 물론 완전히 분해된다. 실크 제품의 분해된 영역의 깊이가 그 후에 예를 들어, 실크 용매에 대한 이러한 표면의 노출의 기간에 의해서 조절가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 실크 제품은 이러한 분해가 수행된 영역과 분해가 이루어지지 않은 영역을 지닌다. 이러한 영역들은 일반적으로 작은 경계 영역(또한 이러한 경계 영역이 보이는 실시예 참조)에 의해 최종 제품에서 분명하게 분리된다(즉, 재안정화 후에). 본 발명에 따른 제품은 일반적으로 분해가 완전한(분해된 영역의 특정 깊이를 지니는) 적어도 하나의 표면을 나타내는 반면, 또한 분해되지 않은 영역(일반적으로 분해 용액(즉, 실크 용매)에 노출된 표면의 반대 면 상에)이 존재한다.
바람직하게는, 본 발명의 개선된 기계적 및 형태학적 특징, 예를 들어, 유연 안정성(flexible stability) 및/또는 폐곡면(closed surface)을 나타내는 실크 제품을 제공하기 위해서 분해의 깊이(최종 제품에서 피브로인이 재안정화된(그리고 결정화된) 깊이로 보이고, 조밀한 덩어리로 나타남(대조적으로, 분해되지 않은 실크 제품 부분에는 피브로인 섬유가 여전히 보인다. 즉, 균일하거나 연속적인 피브로인 상))는 5μm 또는 그 이상이다. 예를 들어, 약 1μm 또는 그 미만의 분해 깊이를 지니는 제품은 균열 또는 덜 강한 기계적 특성을 나타낼 수 있다. 본 발명에 따른 실크 제품의 의도된 용도에 좌우하여, 분해의 깊이는 바람직하게는 20μm 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 50μm 또는 그 이상, 특히 100μm 또는 그 이상이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 실크 제품은 실크 제품의 전체 두께의 적어도 10%의 분해 깊이를 지니는데, 이는 실크 제품의 전체 두께의 적어도 10%가 분해된다는 것을 의미한다(실크 제품 안쪽에 노출된 표면으로부터). 더욱 더 바람직한 제품은 적어도 20%, 특히 적어도 30%의 분해 깊이를 나타낸다. "분해 깊이"는 제품의 표면으로부터 재안정화된(그리고 결정화된) 영역의 단부로까지의 거리로서 최종 제품에서 단면으로 보인다. "재안정화된 영역의 단부"는 또한 분해가 이루어진 영역과 실크 제품이 이의 원래의 모양으로 존재하는 영역의 시작 부분이고, 서로 분명하게 구별될 수 있다. "분해 깊이"는 실제로 최종 제품의 균일한 피브로인 상(5%v/v 이상의 포집된 구멍을 지님)의 직경이고; 나머지는 실제로 최종 제품에서 필라멘트성 피브로인 상이다. 연속 상과 필라멘트성 상 사이의 경계에서, 적용되는 반응 조건, 및 출발 재료의 두께 및 성질에 좌우하여 혼합된 상 또는 영역이 존재한다. 그러한 혼합된 영역은 일반적으로 5%v/v 이상의 구멍을 지니고, 적어도 부분적으로 함께 포개어지지만 일반적으로 분해되지 않은 구조로되어 있는 실크 섬유를 지닌다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 이차원 실크 제품은 신규하고 유리한 특성, 특히, 기계적 및 형태학적 특성을 지닌다. 시트 형태, 바람직하게는 의료 용도의 시트 형태의 이차원 제품, 특히, 세포 부착, 확산, 성장 및 분화를 위한 필름, 막, 직조식 시트, 또는 메쉬가 특히 바람직하다.
다른 한 편으로, 본 발명에 따른 방법은 세포가 추가 성장 또는 세포 성분(예를 들어, 세포로부터 분비되는 재조합 단백질 또는 그 밖의 물질)의 생산을 위해 시딩될 수 있는 세포 배양 물질, 예를 들어, 세포 기층(세포를 배양하기 위한)을 생산하는데 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 하기와 같이 규정될 수 있다:
1. 삼차원 실크 제품의 생산 방법으로서, 삼차원 실크 제품을 실크 제품의 부분 해체가 얻어지도록 제한된 기간 동안 실크 용매로 처리한 후, 부분 해체된 실크 제품을 물리적 β-시트의 유도로 재안정화시키는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
2. 구체예 1에 있어서, 실크 용매가 LiBr, LiSCN, 1-에틸-3-메틸이미다졸륨아세테이트, 헥사플루오로-2-프로판올(HFIP), 에탄올과 CaCl2를 포함하는 혼합물 또는 메탄올과 칼슘 니트레이트를 포함하는 혼합물; 또는 이들의 혼합물을 포함하는 방법.
3. 구체예 1 또는 2에 있어서, LiBr가 1 내지 10M, 바람직하게는 3 내지 10M, 특히 5 내지 7M의 농도로 사용되는 방법.
4. 구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 한 구체예에 있어서, LiSCN이 1 내지 17.5M, 바람직하게는 5 내지 15M, 특히 8 내지 12M의 농도로 사용되는 방법.
5. 구체예 1 내지 4 중 어느 한 구체예에 있어서, HFIP가 1 내지 100%(v/v), 바람직하게는 50 내지 100%(v/v)의 HFIP, 특히 90 내지 100%(v/v)의 HFIP를 함유하는 용액에 사용되는 방법.
6. 구체예 1 내지 5 중 어느 한 구체예에 있어서, 에탄올이 1 내지 50%(v/v)의 에탄올, 바람직하게는 5 내지 40%(v/v)의 에탄올, 특히 10 내지 30%(v/v)의 에탄올을 함유하는 수용액에 사용되는 방법.
7. 구체예 1 내지 구체예 6 중 어느 한 구체예에 있어서, CaCl2가 에탄올에 대하여 1:0.3 내지 1:3, 바람직하게는 1:1 내지 1:2.5, 특히 1:1.5 내지 1:2.2의 몰비로 실크 용매에 사용되는 방법.
8. 구체예 1 내지 구체예 7 중 어느 한 구체예에 있어서, 칼슘 니트레이트가 메탄올에 대하여 1:0.3 내지 1:6, 바람직하게는 1:3 내지 1:4.5, 특히 1:3.5 내지 1:4.2의 몰비로 실크 용매에 사용되는 방법.
9. 구체예 1 내지 구체예 8 중 어느 한 구체예에 있어서, 삼차원 실크 제품이 직포, 부직포, 튜브, 니팅된 제품 또는 프레싱된 제품인 방법.
10. 구체예 1 내지 구체예 9 중 어느 한 구체예에 있어서, 실크 제품이 실크 피브로인 제품 또는 천연 실크 섬유의 직조 제품이고, 특히, 실크 제품이 누에(Bombyx mori) 고치로부터의 섬유로 제조되는 방법.
11. 구체예 1 내지 구체예 10 중 어느 한 구체예에 있어서, 실크 용매가 CaCl2, 에탄올 및 물의 조합물이고, 부분 해체된 실크 제품이 포름산으로 재안정화되고, 이와 같이 얻어진 제품이 추가로 최종 재안정화 단계로서 메탄올로 처리되는 방법.
12. 구체예 1 내지 구체예 11 중 어느 한 구체예에 있어서, 실크 제품이 피브로인 용액, 특히, 재조합 피브로인 용액으로 제조된 재구성된 섬유로 제조되는 방법.
13. 구체예 1 내지 구체예 12 중 어느 한 구체예에 있어서, 실크 제품이 의료용 임플란트, 바람직하게는 스텐트, 혈관 이식편, 신경 도관, (조직) 스캐폴드(예, 건(tendon), 기관지(bronchi), 기관(trachea) 등), 또는 탈장 메쉬워크(hernia meshwork)인 방법.
14. 구체예 1 내지 구체예 13 중 어느 한 구체예에 있어서, 부분 해체가 이방성 실크 제품을 제공하고/거나 증가된 기계적 특성(예, 탄성 특성)을 발생시키는데 이용되는 방법.
15. 구체예 1 내지 구체예 14 중 어느 한 구체예에 있어서, 실크 용매로의 처리가 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 78℃, 특히 70 내지 77℃의 온도에서 수행되는 방법.
16. 구체예 1 내지 구체예 15 중 어느 한 구체예에 있어서, 실크 용매로의 처리가 1s 내지 2h, 바람직하게는 1s 내지 0.5h, 특히 10s 내지 30min 동안 수행되는 방법.
17. 구체예 1 내지 구체예 16 중 어느 한 구체예에 있어서, 부분 해체된 실크 제품이 재안정화 용액으로 재안정화되는 방법.
18. 구체예 17에 있어서, 재안정화 용액으로의 처리가 1s 내지 1h, 바람직하게는 5min 내지 1h, 특히 20min 내지 30min 동안 수행되는 방법.
19. 구체예 17 또는 구체예 18에 있어서, 재안정화 용액이 포름산, 바람직하게는 90 내지 100%의 포름산, 특히 97 내지 99%의 포름산인 방법.
20. 구체예 17 내지 구체예 19 중 어느 한 항에 있어서, 재안정화 용액이 아세트산, 프로판산, 1 내지 4개의 탄소 원자를 지니는 할로겐화 유기산, 바람직하게는, FCOOH, ClCOOH, CF3COOH, CF2HCOOH, CFH2COOH, CCl3COOH, CCl2HCOOH, 또는 CClH2COOH, 특히, 아세트산, 또는 이들의 혼합물인 방법.
21. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 한 구체예에 있어서, 부분 해체된 실크 제품이 스팀 오토클레이빙(steam autoclaving)에 의해 재안정화되는 방법.
22. 구체예 1 내지 구체예 21 중 어느 한 구체예에 있어서, 부분 해체된 실크 제품이 재안정화되거나 물 풀림(water annealing)에 의한 것인 방법.
23. 구체예 1 내지 구체예 22 중 어느 한 구체예에 있어서, 삼차원 실크 제품이 추가로 펩타이드(예를 들어, 트랜스글루타미나아제 기질 서열로 변형) 또는 세포 접착을 증진시키는 물질, 바람직하게는 세포-결합 펩타이드, 특히 Arg-Gly-Asp("RGD") 펩타이드; 세포 접착 증진 단백질, 특히 SF 단백질, 젤라틴, 피브로넥틴 또는 렉틴을 포함하는 방법.
24. 구체예 1 내지 구체예 23 중 어느 한 구체예에 있어서, 삼차원 실크 제품이 세포 접착을 증진시키는 개질된 폴리펩타이드, 특히, 개질된 RGD 펩타이드, SF 단백질, 젤라틴, 피브로넥틴 또는 렉틴을 추가로 포함하는 방법.
25. 구체예 1 내지 구체예 24 중 어느 한 구체예에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는, 삼차원 실크 제품.
26. 구체예 25에 있어서, 제품이 스텐트, 혈관 이식편, 신경 도관, (조직) 스캐폴드(예, 건, 기관지, 기관 등), 또는 탈장 메쉬워크인, 삼차원 실크 제품.
27. 연속적인(균일, 결정질) 실크 영역 및 실크 섬유로 되어 있는 실크 영역을 포함하는, 삼차원 실크 제품.
28. 구체예 27에 있어서, 구체예 1 내지 구체예 24 중 어느 한 구체예에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는, 삼차원 실크 제품.
29. 구체예 25 내지 구체예 28 중 어느 한 구체예에 있어서, 결정질 실크 영역 및 실크 섬유로 되어 있는 실크 영역을 포함하고, 결정질 실크 영역이 실크 제품의 표면으로부터 5μm 이상, 바람직하게는 20μm 이상, 더욱 바람직하게는 50μm 이상, 특히 100μm 이상으로 연장되는, 삼차원 실크 제품.
30. 구체예 25 내지 구체예 29 중 어느 한 구체예에 있어서, 실크 제품이 추가로 기계적으로 처리되는, 삼차원 실크 제품.
31. 구체예 30에 있어서, 기계적 처리가 엠보싱 단계인, 삼차원 실크 제품.
32. 구체예 25 내지 구체예 31 중 어느 한 구체예에 있어서, 결정질 실크 영역 및 실크 섬유로 되어 있는 실크 영역을 포함하고, 결정질 실크 영역이 실크 제품의 표면에서부터 실크 제품의 전체 두께의 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 특히 30% 이상으로 연장되는, 삼차원 실크 제품.
33. 구체예 25 내지 구체예 32 중 어느 한 구체예에 있어서, 재안정화된 제품으로부터 제거될 수 있는 용해가능한 비-실크 재료가 삼차원 실크 제품에 제공되고, 바람직하게는, 용해가능한 비-실크 재료가 폴리머(예, 폴리에틸렌 글리콜), 폴리사카라이드/당. 염, 또는 일반적으로 가용성 포로겐으로서 사용되는 어떠한 물질인, 삼차원 실크 제품.
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 예시되지만, 이로 제한되지는 않는다.
도 1은 브레이딩된 관형 구조의 브레이딩 구성(좌측 이미지) 및 주사 전자 현미경사진(우측 이미지)을 나타낸 것이다.
도 2는 실크 피브로인 신경 안내 도관(SF-NGC)의 현미경 사진을 나타낸 것이다: A) SF-NGC의 단면도에 대한 SEM 현미경 사진(배율 23x); B) 이미지 A의 확대 부분(배율 200x); C) SF-NGC의 측면도(배율 50x); 및 D) SF-NGC 벽의 내표면 상의 SC 세포의 형광 현미경 사진.
도 3은 정련된 관형 구조의 변형 후에 개선된 탄성을 입증하는 지정된 시험 시스템에 의한 압축 시험의 결과를 나타낸 것이다. 초기의 생 스캐폴드의 4개의 상이한 처리를 다음과 같이 기계적으로 시험하였다: 메탄올(MeOH)로의 단독 인큐베이션; 포름산 및 메탄올(FA-MeOH)과의 후속 인큐베이션; CaCl2/H2O/에탄올 및 메탄올(CaCl2/H2O/EtOH - MeOH)과의 후속 인큐베이션; 및 CaCl2/H2O/에탄올, 포름산, 및 메탄올(CaCl2/H2O/EtOH - FA - MeOH)과의 후속 인큐베이션.
도 4는 MTT 검정에 의한 세포독성에 대한 측정을 나타낸 것이다. NIH/3T3 섬유아세포를 미가공된 생 스캐폴드 재료 및 제조된 SF-NGC 각각의 침출 배지에서 배양하였다. 표준 배양 배지를 대조군으로서 사용하였다. 모든 데이터는 8개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM이다.
도 5는 NIH/3T3 섬유아세포를 함유하는 피브린 응괴 및 화학색인물질(chemoattractant)로서 PDGF-AA가 투여된 제 2 응괴를 사용한 이동 검정을 통한 세포 투과성 시험의 결과를 나타낸 것이다. 섬유아세포를 100μm의 공극 크기의 셀 스트레이너 메쉬(양성 대조군, 1열) 및 미가공된 관형 실크 구조(2열)을 포함하여 상이한 스페이서(spacer)에 통과시키고, 사용된 SF-NGC에는 통과시키지 않았다. 컬럼 A, B, 및 C는 피브린 응괴를 함유하는 초기 세포, 사용된 스페이서의 반대 부위 및 PDGF-AA를 함유하는 초기 피브린 응괴로부터의 도면을 각각 나타낸 것이다. 모든 샘플을 칼세인 AM 염색을 통해 잔여 또는 침입된 세포에 대하여 염색하였다.
도 6은 A) 래트 좌골 신경 장애 모델에서 생체내 이식된 실크 피브로인 신경 안내 도관(SF-NGC); B) 이식한 지 1주 후에 관찰된 SF-NGC의 근위쪽(검은색 화살은 SF-NGC의 단부를 덮는 새로 형성된 얇은 섬유 조직 층을 지시함); C) 얇은 섬유 조직 층에서 작은 혈관을 보여주는 이식한 지 2주 후에 관찰된 말초 신경 수술 면적; 및 D) C에서 검정색 직사각형의 확대도를 나타낸 것이다.
도 7은 이식한 지 12주 후에 SF-NGC를 통한 축색(axon) 성장의 예를 나타낸 것이다. 축색은 신경필라멘트 200kDa 면역염색을 통해 염색되었다. 별 및 화살은 재생된 축색의 조밀한 망 및 엉성한 망을 각각 나타낸다.
도 8은 수술된 오른쪽 뒷발의 인쇄 면적, 최대 바닥 접촉 면적에서 가해진 강도, 스탠스 지속기간 및 듀티 사이클을 포함한 동물에서 이식한 지 12주 후의 운동 기능 회복에 대한 정량적 분석을 나타낸 것이다. 오른쪽 뒷발의 강도는 반대면-측면 왼쪽 뒷발의 백분율로서 표시된다. 모든 데이터는 6마리의 동물들의 평균 ± SD이다.
도 9는 SF-NGC, 콜라겐-충전된 SF-NGC 및 자가조직 이식편으로 이식된 모든 동물들에 대한 BBB 운동 평가 척도를 나타낸 것이다.
도 10은 A) 최고 활동 전위 진폭(peak action potential amplitude: PAPA)의 전자생리적 측정; B) 합성 신경 활동 전위 면적(compound nerve action potential area: CNAP) 및 C) 신경 전도 속도(nerve conduction velocity: NCV)를 나타낸 것이다. 모든 파라미터는 초극대 자극에서 결정되었다. 모든 데이터는 6마리의 동물들의 평균 ± SD이다. *는 p<0.05의 유의한 차이를 나타낸다.
도 11은 상기 기재된 바와 같은 10 또는 20sec의 CaCl2/EtOH/H2O, 이어서, 10 또는 20sec의 포름산 처리에 주어진 본 발명에 따른 삼차원 실크 제품의 사진을 나타낸 것이다. 도 11a 및 11c는 미처리된 실크 피브로인 제품; 도 11b 및 11d는 CaCl2/EtOH/H2O로의 20초 동안의 처리, 이어서, 20sec의 포름산 처리 후의 제품을 나타낸 것이다. 도 11e 내지 11g는 20sec 동안의 처리(55.902, 73.397 및 73.662μm)에 대한 분해(이어서, 재안정화)의 깊이의 측정을 나타낸 것이고; 도 11h 및 11i는 10sec 처리에 대한 분해(이어서 재안정화)의 깊이의 측정을 나타낸 것이다(17.804 및 27.57μm).
도 12는 좌측: 대조로서 작용하는 처리 없이 브레이딩된 실크 스캐폴드의 주사 전자 현미경(SEM) 사진; 중앙: 20sec 또는 40sec(40sec CaCl2; 40sec FA)의 처리 기간 동안 CaCl2/EtOH/H2O(20sec CaCl2) 또는 포름산(20sec FA)의 처리에 주어진 실크 제품의 표면을 나타내는 SEM 사진; 및 우측: 각각의 단계가 20sec의 처리 기간인(20sec CaCl2/20sec FA) CaCl2/EtOH/H2O 및 포름산의 처리에 주어진 본 발명에 따른 실크 제품의 표면을 보여주는 SEM 사진을 나타낸 것이다. 기준자는 각각 100μm 및 10μm이다.
도 13은 분열되지 않고 분해되지 않은 구조를 얻기 위해 미가공의 정련되지 않은 실크 섬유를 함께 용접하는 것을 나타낸 것이다(13a[US 8 202 379 B1호], 13b[Haverhals et al., 2010], 13c[Ghanaati et al., 2010]).
실시예:
재료 및 방법
달리 언급되지 않는 한, 모든 시약은 Sigma(Vienna, Austria)로부터 분석용 등급으로 입수된 것이었다.
실크 도관의 구성 및 제조
20/22den, 250T/m의 백색 Bombyx mori 생누에 섬유를 Testex AG(
Figure 112015039859004-pct00001
, Switzerland)로부터 구매하였다. 실크 도관은 관형 구성이었고, 상업적 브레이딩 업체(Edelrid GmbH, Isny im
Figure 112015039859004-pct00002
, Germany)와 함께 제작된 것이었다. 6개의 단일 실크 섬유는 상업적 브레이딩 기계를 위한 원료를 나타내는 연사를 형성시킨다. 관형 구조는 6개의 엮여진 연사로부터 구성되고; 이는 도 1에 도시되어 있다. 생성된 생사 도관을 pH = 9.0에서 0.05M 소듐 보레이트 완충제 중의 0.2M 붕산에서 비등시킴으로써 정련시켰다[Jiang et al., Mat. Lett. 60 (2006), 919-925]. 따라서, 2g의 실크 도관을 500mL의 정련 용액에서 45min 동안 2회 비등시켰다. 정련시킨 후, 추가 가공 전에 스캐폴드를 ddH2O에서 철저히 세척하고 공기-건조시켰다.
정련된 SF 튜브를 ABS(아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌) 로드 상에 놓고, 1:8:2 몰비의 삼원 용매 클로라이드/증류수/에탄올(CaCl2/H2O/에탄올)의 비등 용액에서 20초 동안 디핑시켰다. 외표면을 에칭한 직후, 튜브를 100%의 포름산(FA) 중에 실온에서 20초 동안 디핑시켰다. 그 후에, 튜브를 메탄올 중에 20분 동안 담그고, 이어서 ddH2O로 철저히 세척하였다. 튜브를 층류식으로 건조시키고, 사용 전에 오토클레이빙에 의해 살균하였다.
내구성( Endurance ) 및 피로( fatigue ) 시험
미가공된 초기 관형 SF-스캐폴드와 비교하여 SF-NGC의 탄성을 시험하기 위하여, 압축 시험기를 지정하였다. 이러한 장치는 일정한 최대 압력으로 시험 시편을 반복하여 압축하도록 설계된 것이었다. 최상부 위치로부터 시작하여, 프로브가 접촉될 때까지 피스톤을 선형 방식으로 약 5mm/s의 속도로 서보 모터(Modelcraft RS2 MG/BB 표준 서보, Conrad Electronic SE, Hirschau, Germany)를 통해 아래로 이동시켰다. 소정의 힘 역치값에 이를 때까지 피스톤으로 계속해서 프로브에 응력을 가했다. 피스톤으로 일체화된 힘감지 저항기(force sensitive resistor)(Strain gauge FSR 151, Interlink electronics, Camarillo, CA, USA)는 센서로서 작용하고, 분압기의 일부이다. 저항 및 이에 의해 가해지는 힘은 마이크로컨트롤러(microcontroller)(Arduino Duemilanove Controller Board with Atmega 328 μC, Atmel Munich GmbH, Garching/Munich, Germany)의 빌트-인 10비트 ADC를 사용하여 50Hz의 샘플링 주기로 일정하게 샘플링하였다. 시스템을 실험실 저울을 사용하여 보정하고, ±5g의 정확도 내에서 작동시켰다. 역치에 이르면 피스톤을 사용자에 의해 시간 설정이 되어 있는 상부 피스톤으로 되돌렸다. 이러한 절차를 사용자가 시리얼 LCD 디스플레이(SerLCD SFE 09395 2 라인 LCD Display, Sparkfun electronics, Boulder, USA)를 통해 설정한 반복 횟수로 반복하였다.
시험 전에, 각각의 샘플들을 PBS 중에 밤새(o/n) 수화시켰다. 시험을 위하여, 도관을 페트리 디쉬에 고정하고, PBS로 커버링하였다. 기계적 시험 방법은 1,000회 사이클의 압축 및 300g의 하중으로의 이완 및 압축 당 300ms의 압축 기간으로 구성된다. 시험 과정 후에, 시험된 튜브를 실온에서 o/n 동안 공기-건조시키고, 형태학적 분석을 위한 자국(impression) 부위에서 약 mm의 두께로 주의하여 슬라이싱(slicing)하였다. 마지막으로, 압축 후에 남은 변형을 SEM 분석에 의해 평가하였다.
SEM 분석
샘플을 실온에서 o/n 동안 카코딜레이트 완충제 중의 2.5% 글루타르알데하이드에 고정시켰다. 그 후에, 샘플을 등급화된 에탄올 이어서 헥사메틸디실라잔을 통해 탈수시키고, 흄 후드에서 공기-건조되게 하였다. 샘플을 Polaron SC7620 스퍼터 코터(Quorum Tech-nologies Ltd. East Grinstead, United Kingdom)를 사용하여 Pd-Au로 스퍼터 코팅하고, 3kV에서 JEOL JSM-6510 주사 전자 현미경(JEOL GmbH, Eching/Munich, Germany)을 사용하여 검사하였다.
세포 배양 실험
NIH/3T3
NIH/3T3 세포 라인을 ECACC(세포 배양의 유럽 컬렉션(European collection of cell culture), UK)로부터 구매하였다. NIH/3T3 세포를 0.2% 젤라틴 용액으로 코팅된 플레이트에서 2mM의 L-글루타민, 100U/mL의 페니실린 및 0.1mg/mL의 스트렙토마이신이 보충된 10% 우태아혈청(fetal calf serum: FCS)(Lonza Ltd., Basel, Switzerland)을 함유하는 DMEM에서 배양하였다.
슈반(Schwann)-유사 세포
아디포즈-유래된 스트로마 세포(Adipose-derived stroma cell: ASC)를 Sprague-Dawley 래트로부터 분리하고, 슈반 세포-유사 표현형으로 분화하였다[Kingham et al., Exp. Neurol. 207 (2007), 267-274]. 요약하여, 절개된 내장 지방을 절개하고, 콜라게나아제 I형으로 처리하여 ASC를 분리하였다. 성장 배지인 10% 우태아혈청(FCS; PAA, Pasching, Austria)을 함유하는 변형된 이글 배지(Modified Eagle Medium)(α-MEM)에서 세포를 배양하고 통과시킨 후에, 먼저 ASC를 1mM β-머캅토에탄올을 함유하는 성장 배지와 24h 동안 인큐베이션시켰다. 그 후에, 배지를 72h 동안 35ng/mL의 올-트랜스-레티노산이 보충된 신선한 배지와 교체하였다. 마지막으로, 혈소판-유래 성장 인자(platelet-derived growth factor: PDF)(Peprotech, Vienna, Austria), 10ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor: bFGF)(Peprotech, Vienna, Austria), 14μM의 포스콜린 및 252ng/mL의 신경교 성장 인자 2(glial growth factor 2: GGF-2)(Peprotech, Vienna, Austria)를 함유하는 분화 배지를 첨가하였다.
슈반-유사 세포(Schwann-like cell: SLC)를 105개의 세포/mL의 농도로 SF-NGC의 내부 벽 상에 시딩하였다. 두 시간 후, 세포에 10% FCS(PAA, Pasching, Austria), 0.1% 헤레굴린(Preprotech, Vienna, Austria) 및 14μM의 포스콜린를 함유하는 배양 배지를 공급하였다. SF-NGC의 내부 벽 구조에 대한 SLC 부착을 3일 후에 Calcein AM 염색(Invitrogen, Vienna, Austria)으로 평가하였다.
세포 투과성
세포 이동 검정은 SF-NGC의 세포 불투과성을 입증하도록 설계된 것이었다. PDGF-AA(Peprotech, Vienna, Austria)를 함유하는 100μl의 피브린 응괴(Tisseel, Baxter, Vienna, Austria)를 세포 이동을 유도하는데 사용하였다. 250Units/mL의 트롬빈과의 중합을 유도하기 전에 10ng의 PDGF-AA를 완전히 혼합하였다. 생성된 조밀한 피브린 구조는 PDGF-AA의 갑작스런 이완을 방지한다. 그 후에, 이러한 피브린 응괴를 연구되는 튜브 내부에 넣고, 이로써 조립된 구조물을 실리콘-코팅된(Sylgard® 184, Dow Corning Europe S.A., Seneffe, Belgium) 12-웰 플레이트에 핀으로 고정시켰다. 2.5×105의 NIH/3T3 섬유아세포를 함유하는 두 번째 100μl의 피브린 응괴를 튜브의 상부 상에 넣었다. 피브리노겐을 2Units/mL의 트로빈과 중합시켜 느슨하고 균일한 피브린 구조물을 형성시키고, 섬유아세포가 응괴로부터 화학주성 자극을 향해 이동하게 하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 지니는 피브린 응괴를 100μm의 공극 크기를 지니는 셀 스트레이너의 나일론 메쉬(Becton Dickinson, Schwechat, Austria)를 사용하여 PDGF-AA를 함유하는 응괴로부터 분리하였다. 검정을 수행한 지 2일 및 4일 후에 구조물이 완전히 커버링되고 변화될 때까지 배지를 첨가하였다. 6일째에, 칼세인 AM(Invitrogen, Vienna, Austria)으로 PDGF-AA를 함유하는 피브린 응괴를 염색함으로써 세포 이동을 평가하였다. 페트리 디쉬에 구조물을 고정시키는 가능성 외에, Sylgard® 184는 이의 소수성 특징의 결과로 세포 접착을 막는 것으로 알려져 있고[Ai et al., Cell Biochem Biophys. 38 (2003), 103-114], 그에 따라서, 세포 배양 플레이트의 표면 상에서 하나의 응괴로부터 다른 응괴로의 세포 이동의 가능성이 방지된다. 그 결과, 하나의 응괴에서부터 다른 응괴로 이동하는 방법은 오로지 SF-NGC를 통해서이고, 그에 따라서, SF-NGC의 특정 세포 침투성이 필요할 것이다.
세포 독성 검정
제조된 SF-NGC의 세포독성을 시험하기 위해서, 1g의 분석된 SF-NGC 물질을 적어도 24h 동안 5mL의 세포 배양 배지에 침지시켰다. 이와 동시에, 웰 당 0.2×105의 NIH/3T3 섬유아세포를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 그 후에, 분석된 물질로부터 침출된 생성물을 함유하는 배지를 여과하고(0.22μm, Rotilabo, Karlsruhe, Germany), 세포 배양에서 배지를 변화시키는데 사용하였다. 표준 배양 배지를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포 배양 배지를 뽑아내고, 650mg/mL의 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨] 브로마이드를 함유하는 각각의 세포 배양 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션한 지 1h 후에, 배지를 뽑아내고, MTT 포르마잔 침전물을 어두운 곳에서 20min동안 기계적으로 쉐이킹함으로써 DMSO에 용해시켰다. 100μl의 각각의 샘플의 부분표본을 96-웰 플레이트에 옮겼다. 자동 마이크로플레이트 리더(automatic microplate reader)(Spectra Thermo, TECAN Austria GmbH, Austria) 상에서 540nm에서의 흡수를 즉시 판독하였다. 광학 밀도(Optical density: OD) 값을 비특정 배경에 대하여 보정하였다.
동물 및 10 mm 신경 결손 모델
모든 동물들을 온도-제어된 환경에서 실험 및 임상 외상학용 Ludwig Boltzmann 기관 시설에 수용하였다. 동물들에게 자유식으로 사료 및 물을 주었다. 모든 실험 프로토콜은 국립 보건원(National Institute of Health)에 의해 규정된 바와 같은 실험용 동물의 케어 및 사용에 대한 안내에 따라 오스트리아의 비엔나시 정부에 의해 승인된 것이었다.
350-450g 무게의 총 22마리의 암컷 Sprague-Dawley 래트(Animal Research Laboratories, Himberg, Austria)를 실험에 사용하였다. 18마리의 동물들을 12주 관찰 동안 다음과 같이 3개의 상이한 처리군으로 무작위하게 배정하였다: 자가조직 이식(n = 6), SF-NGC (n = 6) 및 콜라겐-충전된 SF-NGC (n = 6). 동물들의 무게를 재고, 800mL/min의 유량에서 3.5% 이소플루레인(Forane®, Abbott, Vienna, Austria)으로 흄 박스에서 마취시켰다. 접비구(nosepiece)를 통해 2.5% 이소플루레인을 사용하여 수술 과정 전체에 걸쳐 후속 마취를 유지하였다. 오른쪽 넙적다리 중간 정도에서, 수술 부위를 면도하고, β-Isodona(Mundipharma, Vienna, Austria)으로 세정하였다. 모든 하기 수술 과정을 수술 현미경(Leica M651, Leica GmbH, Vienna, Austria) 하에 수행하였다. 피부 및 근육의 절개에 의해 골 신경을 노출시켰다. 8mm의 좌골 신경 부분을 잘라내어 원위 및 근위 스텀프를 약간 당긴 후에 10mm의 갭을 생성시켰다. 자가조직 이식 군에서, 8mm의 좌골 신경 부분을 잘라내고 180°뒤집은 후, 신경외막을 통해 Ethilon 8/0(Ethicon-Johnson & Johnson, Brussels, Belgium)을 이용하여 원위 및 근위 스텀프로 다시 봉합하였다. SF-NGC 군 둘 모두에서, 12mm 튜브로 원위 및 근위 신경 스텀프를 삽입함으로써 도관을 이식하고, 두 개의 신경외막 봉합선에 의해 스캐폴드로 접합시켰다. 하나의 군에서, SF-NGC의 루멘을 추가로 래트 꼬리 생성부분(Millipore, Vienna, Austria)으로부터의 콜라겐 I형으로 충전시켰다. 그 후에, 근육 층을 연속적인 런닝 봅합선(Vicryl 4/0, Ethicon-Johnson & Johnson, Brussels, Belgium)으로 봉합하고, 단일의 재흡수가능한 스티치(Vicryl 4/0, Ethicon-Johnson & Johnson, Brussels, Belgium)에 의해 피부를 닫았다. 이어서, 동물들을 회복을 위해 이들의 케이지에 다시 넣었다. 수술 과정 직전과 그 후 2일 동안 0.75mg/kg의 BW Meloxicam(Metacam®, Boehringer Ingelheim, Ingelheim/Rhein, Germany) 및 1.25mg/kg의 BW 부토판올(butamidor®, Richter Pharma AG, Wels, Austria)로 무통 처리하였다.
SF-NGC의 거동 및 주위 조직으로부터의 생체내 반응에 대한 초기 정보를 입수하기 위해서, 상기 기재된 수술 과정에 따라 1주 및 3주(2마리의 동물/시점)로 이식 시점이 짧은 연구를 수행하였다.
조직의 샘플링. 관류 및 면역조직화학
수술한지 각각 1주, 3주 또는 12주 후에, 동물들을 3.5% 이소플루레인을 흡입시켜 깊게 마취시키고, 복강내로 110mg/kg의 BW ketaminhydrochlorid(Ketasol®; Dr. E. Graeub AG, Berne, Suisse) 및 12mg/kg의 BW xylazin(Rompun® 2%, Bayer AG, Vienna, Austria)에 의해 안락사시켰다. 상행 대동맥을 통해, 동물들을 7.4의pH에서 0.1M 인산염 완충제 중의 4% 파라포름알데하이드로 관류시켰다. 그 후에, 자가조직 이식체 또는 이식된 SF-NGC를 원위 및 근위 신경 스텀프와 함께 수술 현미경 하에 채취하였다.
면역조직화학 염색을 통한 축색 재생을 지시하기 위해서, 마우스의 일차 항체인 항-신경필라멘트 200kD(Abcam Ltd., Cambridge, UK)를 사용하였다[Huang et al., Biomat. 33 (2011), 59-71; Huang et al., Eur. J. Neurosci. 23 (2006), 273-278].
행동학적 시험 - 보행 분석( CATWALK ™)
시험 동물의 기능적 회복 진행을 입증하기 위하여, Catwalk(Noldus, Wageningen, Netherlands) 발자국 분석 시스템을 이용하였다. 이 방법은 다중 정적 및 동적 행동 파라미터의 객관적 정량화를 가능하게 한다[Deumens et al., J. Neurosci. Meth. 163 (2007), 120-130; Bozkurt et al., J. Neurosci. Meth. 173 (2008), 91-98]. 동물들의 사전훈련을 수술하기 전에 3주 동안 수행하였다. 그러한 과정 후에, 모든 군에 대하여 동물들을 1주일에서 최대 12주 동안 1회 시험하였다. 각각의 수행 동안, 비디오 카메라를 유리판 밑에 위치시키고, 실제 발자국을 캡쳐하였다. 이러한 분석으로, 각각의 발걸음의 위치, 역동성, 및 압력 사이의 차이가 검출될 수 있다. 인쇄 면적, 워킹 동안의 발에 의한 총 접촉 면적, 최대 강도, 발의 최대 유리 바닥 접촉 시에 가해진 압력, 스탠스 지속시간, 유리 바닥과 발의 접촉 시간, 및 듀티 사이클, 스탠스 지속시간의 분배 및 스탠스 지속시간과 발이 유리 바닥과 접촉되지 않은 시간의 합을 포함하는 운동의 기능적 회복을 위한 다양한 파라미터들을 측정하였다. 오른쪽 뒷발의 강도를 반대쪽 옆의 왼쪽 뒷발의 백분율로 표시하였다. 보행 실험을 블라이드 방식으로 수행하였다.
BBB 시험
Basso, Beattie 및 Bresnahan(BBB) 시험은 원래 래트 척수에서 타박상 상처 후에 운동 기능 회복을 평가하기 위해 구성된 것이었다. 점수의 범위는 완전한 마비(o)에서부터 정상 운동(21)까지이다. 여기서, BBB 점수를 앞서 기재된 바와 같이[Schmidhammer et al., Acta Neurochir. 100 (2007), Supplement 161-167] 말초 신경 회복을 위한 평가 파라미터로서 사용하고, 세 명의 경력있는 검토자들에 의해서 동물들의 식별에 대해 "블라인드"로 수행하였다.
전기생리학 및 조직학:
이식한 지 12주 후에, 전기생리학 분석[NeuroMax; XLTEK, Oakville, Ontario, Canada]을 앞서 기재된 바와 같이[Schmidhammer et al., J. Trauma 56 (2004), 571-584] 수행하였고, 이러한 분석은 최고 활동 전위 진폭, 합성 활동 전위 면적(compound action potential: CNAP) 및 신경 전도 속도(nerve conduction velocity)를 포함하였다.
통계학적 분석
통계 소프트웨어 Graph Pad Prism(Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA)으로 통계적 분석을 수행하였다. 데이터의 정규 분포를 Kolmogorov-Smirnov 시험으로 시험하였다. Catwalk 보행 분석을 통해 얻어진 기능 회복 데이터 및 BBB 점수, MTT 및 전기생리학적 데이터를 일원 ANOVA으로 분석하였다. 이 연구에서의 모든 그래프는 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타나 있다.
결과
실크 도관의 제조 및 지형
도 1에 도시된 바와 같이, 생 SF-NGC는 단일 실크 섬유로 구성된 브레이딩된 구성으로 이루어져 있다. 표면을 정련시킨 후, SF-NGC를 각각 CaCl2/H2O/에탄올 및 FA로 20초 동안 후속적으로 에칭시켜 메탄올에 의해 이의 구조를 고정시켰다. 지형적으로, 이러한 처리는 약 25 내지 75μm 범위의 두께를 지니는 폐쇄 층에 외부의 단일 실크 섬유의 융합을 야기한다(도 2a, b). 대조적으로, 단일 실크 섬유가 융합되어 나타나고, 매끄러운 층을 형성시키는 외부 벽과는 대조적으로(도 2c), 내부 루멘을 향하는 벽쪽은 여전히 단일 실크 섬유의 브레이딩된 구조를 나타낸다. 도 2d는 이러한 내부의 단일 실크 섬유가 SC 세포를 위한 우수한 기층으로서 작용하고, 이의 브레이딩 구성으로 인해 방향지어진 세포 정렬을 야기한다는 것을 나타낸다.
내구성 시험
관형 구조의 붕괴를 부정적으로 초래할 수 있는 주위 조직으로부터 외부 압력을 견디기 위해 필요한 SF-NGC의 탄성을 입증하기 위하여, 지정된 시스템으로 내구성 시험을 수행하였다. 스캐폴드를 압축 당 300g으로 1,000회의 사이클 및 300ms의 압력 기간 동안 압축하였다. 모든 처리에서, SF-NGC를 스캐폴드의 변형 구조를 고정시키는 마지막 단계에서 메탄올로 인큐베이션하였다. 미가공되거나 FA-처리된 SF-NGC는 기계적 하중 후에 극심한 붕괴를 나타냈다(도 3). CaCl2/H2O/에탄올 처리는 SF-NGC의 기계적 저항을 개선시켜 일부 루멘에서 보존을 야기하였지만, 상당한 변형이 여전히 나타나 있다. 이러한 세 가지 처리 어느 것도 외부 압력을 견디는 탄성을 SF-NGC에 제공할 수 없었다. 그러나, CaCl2/H2O/에탄올 이어서 FA로 처리된 SF-NGC는 시험 후에 이의 둥근 모양을 유지할 수 있었다.
세포독성 검정
생성된 SF-NGC에서의 제조 공정으로부터 생성되는 가능한 세포독성 잔여물의 함량을 조사하기 위해서 MTT 검정을 이용하였다. SF-NGC로부터 분석된 물질 및 미가공된 생사 스캐폴드를 세포 배지로 침출시켰다. 이러한 침출 배지를 24h 동안 배양 배지로서 사용하였다. MTT 검정의 결과에 따르면(도 4), 미처리된 표준 세포 배양 배지와 생사 또는 SF-NGC 물질의 침출 배지 간에는 NIH/3T3 섬유아세포의 세포 생존율에 있어서 유의한 차이가 없었는데, 이는 제조된 SF-NGC가 비독성이라는 것을 지시하는 것이다.
세포 투과성
SF-NGC의 세포 불투과성을 입장하는 세포 이동 검정은 세포-운반 피브린 응괴에서부터 PDGF-AA를 함유하는 또 다른 피브린 응괴로의 세포 이동을 유도하는 섬유아세포에 대한 PDGF-AA의 화학주성 특성을 기초로 하여 구성되었다. PDGF-AA를 함유하는 피브린 응괴를 침입하기 위해서, NIH/3T3 섬유아세포는 100μm의 공극 크기를 지니는 셀 스트레이너(양성 대조군), 미가공된 관형 생사 스캐폴드, 또는 SF-NGC를 통과해야 한다. 상당한 섬유아세포 이동이 5일 동안 PDGF-AA 시뮬레이션에 의해 셀 스트레이너(도 5, 1열) 및 생사 스캐폴드(도 5, 2열)의 메쉬를 통해 관찰되었지만, SF-NGC(도 5, 3열)에서는 관찰되지 않았다.
예비 생체내 결과
이식된 SF-NGC의 조직 생체적합성을 평가하기 위해서 예비 생체내 시험을 수행하였다. 도 6a는 두 개의 신경외막 봉합선에 의해 SF-NGC에 접합되는 근위 및 원위 신경 스텀프를 나타낸다. 이식한 지 1주 후에, 시각적 검사는 SF-NGC가 상당한 분해를 나타내지 않음을 보여주었다(도 6b). 게다가, 접합 부위에서 염증 반응 또는 신경종 형성의 신호가 검출되지 않았다. 이식된 이식편의 전체 표면을 얇은 섬유 조직 층에 의해 덮었다. 흥미롭게도, 이식된 SF-NGC의 근위 단부 뿐만 아니라 원위 단부는 섬유 조직에 의해 캡핑되어 스캐폴드 재료와 섬유 스텀프 사이의 상호작용이 육안으로 확인되었다(도 6b). 더욱이, 이러한 얇은 섬유 조직 층에는 작은 혈관이 보였다(도 6c, d).
축색 재생
이러한 결과는 래트 좌골 신경에서 8mm의 짧은 갭이 결손 부위로 SF-NGC를 이식함으로써 연결될 수 있음을 보여주었다. 신경필라멘트 200 염색을 나타내는 도 5는 이식된 SF-NGC의 루멘 전체에 걸쳐서 재생된 축색의 분포를 나타낸 것이다. 근위 단부에서부터 원위 단부로의 축색의 재생 공정에는 약 6.5mm 후에 감소한다는 것이 분명히 보인다(도 5, *로 표시됨). 이러한 축색 밀도의 감소에도 불구하고, 이식한 지 12주 후에 원위 스텀프에 이르는 재생된 축색 다발이 여전히 보인다. 루멘을 콜라겐으로 충전하는 것은 축색 재생에 영향을 미치지 않았다.
기능 회복 - Catwalk
이식한 지 12주 후에, 수술된 오른쪽 뒷발의 평균 인쇄 면적은 자가조직 대조군과 콜라겐-충전된 SF-NGC 군 사이에 비슷했다. 콜라겐이 없는 SF-NGC 군의 평균 인쇄 면적은 자가조직 대조군과 콜라겐-충전된 SF-NGC 군 둘 모두 보다 낮았지만, 크게 다르지 않았다. 오른쪽 뒷발에 의해 가해진 평균 강도는 두 SF-NGC 군 사이에는 유사한 결과를 나타냈지만, 자가조직 대조군에 비해 상당히 감소하지는 않았다. 오른쪽 뒷발의 평균 스탠스 지속기간은 SF-NGC에 콜라겐을 충전하는 경우에 순수한 SF-NGC에 비해 기능 회복에 있어서 개선을 나타냈지만, 통계학적으로 유의한 것은 아니었다. 평균 강도와 유사하게, 오른쪽 뒷발의 평균 듀티 사이클은 콜라겐-충전된 SF-NGC와 SF-NGC 군 간에 다르지 않았지만, 각각의 평균 값은 자가조직 대조군에 대한 것보다 낮았다.
표 1. 수술된 오른쪽 뒷발의 인쇄 면적, 최대 바닥 접촉 면적에서 가해진 강도, 스탠스 지속기간 및 듀티 사이클을 포함한 동물에게 이식한 지 12주 후의 운동 기능 회복에 대한 정량 분석. 오른쪽 뒷발의 강도는 반대쪽 옆의 왼쪽 뒷발의 백분율로 표시되었다. 모든 데이터는 6마리의 동물들의 평균 ± SD이다.
Figure 112015039859004-pct00003
BBB 회복 척도
이식한 지 4, 6, 8, 10 및 12주에 BBB 점수를 확인하였다. 도 8은 외과 수술 후 4주 내지 12주의 신경 기능 회복을 도시한 것이다. 첫 번째 수술후 평가에서(4주), 콜라겐이 있거나 없는 SF-NGC로 이식된 동물의 앞다리 전진 동안 발가락 차기는 자가조직 이식편으로 처리된 동물의 것보다 흔히 발생하였다. 이식한 지 8주 후에, 단독의 SF-NGC 군에 대한 평균 BBB 점수는 자가조직 군뿐만 아니라 콜라겐-충전된 SF-NGC 군보다 유의하게 더 높았다. 마지막 수술 후 평가 시점(12주)에서, 자가조직 이식된 동물은 콜라겐이 있거나 없는 SF-NGC로 이식된 동물보다 BBB 점수가 낮은 것으로 입증되었다. 12주에, 콜라겐으로의 관형 충전의 결과로 SF-NGC 구조물을 수용한 동물의 경우에는 BBB 점수의 개선이 검출되지 않았다.
전기생리학
이식한 지 12주 후에, 세 개의 상이한 파라미터인 최고 활동 전위 진폭(PAPA), 합성 신경 활동 전위 면적(CNAP) 및 신경 전도 속도(NCV)를 알아보는 전기생리학 연구를 수행하였다. 그 결과는 표 2에 요약되어 있고 도 9에 도시되어 있다. SF-NGC, 콜라겐-충전된 SF-NGC 및 자가조직 대조군 사이에서 PAPA 및 CNAP에 대한 유의한 차이는 확인되지 않았다. 대조적으로, 자가조직 군의 NCV 값은 콜라겐이 있거나 없는 SF-NGC 군 둘 모두에 비해 유의하게 더 높았다.
표 2. 최고 활동 전위 진폭, 합성 신경 활동 전위 면적 및 신경 전도 속도의 전기생리학적 측정. 모든 파라미터는 초극대 자극에서 결정되었다. 모든 데이터는 6마리의 동물들의 평균 ± SD이다.
Figure 112015039859004-pct00004
처리 기간 및 분해 깊이
분해의 깊이는 처리 기간의 제어에 의해 용이하게 제어되고 관리될 수 있다. 본 발명에 따른 삼차원 실크 제품을 상기 기재된 바와 같이, 10 또는 20sec의 처리 기간의 CaCl2/EtOH/H2O, 이어서, 10 또는 20sec의 포름산 처리에 주어지게 하였다. 결과는 도 11에 도시되어 있다. 도 11a 및 11c는 미처리된 실크 피브로인 제품을 나타낸 것이고; 도 11b 및 11d는 CaCl2/EtOH/H2O로 20sec 동안의 처리, 이어서, 20sec의 포름산 처리 후의 제품을 나타낸 것이다. 도 11e 내지 11g는 20sec의 처리 동안의 분해(이어서 재안정화) 깊이에 대한 측정을 나타낸 것이다(55.902, 73.397 및 73.662μm); 도 11h 및 11i는 10sec의 처리 동안의 분해(이어서 재안정화) 깊이에 대한 측정을 나타낸 것이다(17.804 및 27.57μm).
고찰
이러한 연구에서, 실크 피브로인(SF) 섬유의 브레이딩된 관형 구조가 신경 안내 도관(NGC)의 생산을 위한 원료로서 작용하였다. 텍스타일 조작된 관형 SF 구조물의 후속 화학 처리를 통해서, NGC로서 이의 용도를 용이하게 하는 지형학적 이방성 및 기계적 특성을 나타내는 도관이 생성되었다.
SF 튜브의 킨킹(kinking)에 대한 탄성 및 저항은 삼차 용매 CaCl2/H2O/에탄올(1:2:8 몰비), FA(본 발명에 따른 재안정화제로서) 및 메탄올로의 화학적 처리에 의해 향상되었다(도 2). CaCl2/H2O/에탄올은 미가공 SF 섬유를 용해시키는 반면, 메탄올은 β-시트를 형성시킴으로써 결정화를 유도한다. 이러한 맥락에서, FA는, 용해시키는 FA를 제거하자마자 β-시트 형성을 초래하는 용액 상태로 정렬된 구조/분자 배열을 유도하는 것으로 기재되었다. FA의 이러한 독특한 특성은 신경 전도 벽의 결정질-유사 외층을 생성시키는데 사용되었다(도 2). 또한, 제조 시약과의 인큐베이션 시간을 달리함으로써 결정질 외층의 두께가 제어될 수 있다. 이러한 제조 공정은 다양한 조직 조작(TE) 및 재생 의료법, 예컨대, 혈관신생 향상 또는 상처 드레싱(wound dressing)을 위한 SF 스캐폴드를 야기한다.
CaCl2/H2O/에탄올 처리 덕분에, SF-NGC의 킨킹에 대한 탄성 및 저항이 상당히 증가하였다. 지정된 시험 시스템으로 수행된 내구성 시험에 의해 입증하는 경우(도 1), 이러한 개선된 기계적 특성은 SF-NGC가주위 조직으로부터 외부 압축력을 견디는 것을 가능하게 한다(도 3).
이식 전, 제조된 SF-NGC로 생체적합성 검정을 수행하였다. 시험관내 세포 독성 시험을 위하여, 일반적인 MTT 검정(도 4)을 이용하였는데, 이는 재료부터 세포 생존율에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 물질이 방출되지 않음을 나타내는 것이다. 더욱이, SLC에 대한 세포 기층으로서 SF-NGC의 내부 면의 사용을 평가하였다(도 2d). 일반적으로, 슈반 세포는 축색이 출아하고 그 후에 길어지는 것을 가능하게 하는 신경 통로를 통한 이의 초기 증식으로 인해 말초 신경 재생에서 가장 중요한 인자로서 여겨진다. 따라서, 말초 신경 TE에 널리 퍼져 있는 아이디어는 슈반 세포 또는 SLC로 잠재적인 말초 신경 재생 생체재료를 시험하는 것이다. 이러한 예에서, 아디포즈 유래된 줄기 세포로부터 분화된 SLC는 검사된 SF-NGC 재료에 대하여 조직 배양 폴리스티렌과 비슷한 우수한 시딩 및 부착 능력을 나타냈다.
또한, 시험관내 시험에는 세포 투과성 분석을 포함되었다. 이동 검정에 의해서 외부로부터 SF-NGC의 루멘으로의 세포 침투를 평가하였다. 섬유아세포는 이식용으로 의도된 100μm의 공극 크기를 지니는 셀 스트레이너 뿐만 아니라 미가공된 생사 스캐폴드의 메쉬를 횡단할 수 있지만, SF-NGC를 횡단할 수 없는 것으로 입증되었다. 이는 생체 내에서 주위 조직으로부터의 세포, 특히, 섬유아세포로부터의 세포가 두 개의 신경 스텀프들 사이의 갭으로 이동할 수 없어야 하기 때문에 중요한 결과이다. 세포를 침투하는 것은 이후에 성장하는 신경을 입체적으로 차단할 섬유 조직을 형성시킬 것이다.
흥미롭게도, SF 용해 및 결정화 제제로서의 이의 작용 외에, FA는 생체내 혈관신생을 개질시키는데 사용될 수 있다. FA로의 처리 시간을 달리함으로써 SF-기반 3D 부직포 마이크로넷의 생체내 혈관신생이 제어될 수 있는 것으로 입증되었다. SF-NGC의 생체내 생체적합성에 대한 이러한 예비 조사에서, 극심한 염증 신호가 없는 것에 더하여 작은 혈관을 함유하는 얇은 섬유 조직 층이 기록되었다(도 6c, d). 이러한 관찰은 아마도 재생 신경으로부터 성장 인자의 방출에 의해 촉발되고 재생 신경을 위한 영양 공급물로서 작용한 SF-NGC 내의 미세혈관 성장을 보여주었다. SF-NGC 내에서 미세펼관 성장은 제조 동안 FA 처리에 의해 영향을 받을 수 있다. 형성된 섬유 조직 층에 대한 또 다른 흥미로운 측면은 이것이 이식편의 단부를 캡핑하여 신경 스텀프와 이식된 SF-NGC 사이에 점진적인 상호작용을 형성시킨다는 것이다. 이러한 점진적인 상호작용은 신경종 형성을 포함한 추가의 신경 손상을 초래할 이식된 SF-NGC의 슬라이딩(sliding)을 방지할 수 있다.
재생된 신경 조직의 세로 부분인 이식한 지 12주 후의 SF-NGC는 재생된 축색에 의한 10mm 좌골 신경 결손의 완전한 연결을 나타냈다(도 7). 그러나, 다발로 된 축색은 전체 결손 크기에서 앞의 65%가 훨씬 더 조밀하다는 점을 주지해야 한다. 축색의 재생 능력은 제한될 수 있고, 추가의 신경 성장 자극 인자, 예컨대, 신경영양 인자, 루멘 충전 세포외 기질 또는 SLC가 필요할 수 있다.
본 발명의 실시예에는 또한 제시된 SF-NGC의 실험관내 및 생체내 평가가 나타나 있다. 생체내 시험을 위하여, 도관의 루멘 내부에 위치된 콜라겐을 지니는 하나의 군을 포함하였다. 인공 신경 도관 분야에서, 특히, 보다 긴, 소위 임계 크기의 갭을 추구하는 경우에 루멘 충전제의 사용이 최근에 관심을 받고 있다. 신경 재생에서 이의 보조 역할로 인한 이의 문헌에서의 평가에 더하여, 말초 신경 재생에 대한 콜라겐의 유리한 효과가 관찰되었다. 더욱이, 콜라겐은 성장 인자 및 세포의 신경 결손 부위로의 전달을 위한 캐리어 매트릭스로서 여겨진다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 실시예에서는 조직학적 분석 또는 운동 기능 회복에서 루멘 충전제로서 콜라겐의 유리한 효과가 관찰되지 않았다. 전기생물학적 측정도 또한 자가조직 대조군에 비해 콜라겐-충전된 SF-NGC 군의 경우 신경 도관 속도의 상당한 감소를 나타냈다(도 9c).
기능 회복 평가에 대한 발자국 분석(Catwalk)은 이식한 지 12주 후에 SF-NGC, 콜라겐-충전된 SF-NGC 및 자가조직 대조군 간에 어떠한 차이를 나타내지 않았다. Catwalk는 도관이 또한 Bombyx mori 실크로부터 제작되었지만 또 다른 실크-기반 생체재료인 Spidrex®의 루멘 섬유 충전물을 함유한 최근 연구와 일치한다.
발자국 분석 외에, 운동 기능 회복을 BBB 척도법을 통해 평가하였다. 이러한 척도법은 원래 척추 외상 모델에서 기능 회복 및 운동능력을 평가하기 위해 사용되었지만, 또한 신경 결함 모델에서 기능 회복을 평가하는데 적합하다. BBB 점수는 전형적으로 사용된 좌골 기능 지수(sciatic functional index: SFI)보다 남아 있는 장애를 검출하는데 있어서 보다 민감한 것으로 여겨졌다. 본 발명의 실시예에서, SF-NGC 및 콜라겐-충전된 SF-NGC 이식을 통한 신경 결손의 연결은 자가조직 대조군에 비해 BBB 운동 척도에서 상당히 우수한 기능 회복을 야기하였다.
더욱이, 본 발명에 따른 제품의 파라미터, 특히, 분해(이후 재안정화됨)의 깊이는 용이하고 재현가능하게 제어될 수 있다(도 11a-i).
결론
사지의 개방된 외상 상처에서 말초 신경 손상의 발생률은 약 5%이다. 더욱이, 종양 절제술 또는 선천적인 기형은 또한 신경 손상을 초래할 수 있다. 결론적으로, 이러한 발생률은 엄청난 건강 관리 비용, 장기간의 결근 및 만성 장애를 초래한다. 이는 이들의 상당히 높은 유행병학적 영향 때문에 이러한 부상의 정확한 임상 관리의 중요성을 입증하는 것이다. 신경의 직접적인 회복은 외상의 치료에서 한 가지 임상 방법이다. 그러나, 엔드-투-엔드(end-to-end) 봉합으로의 이러한 직접적인 접합은 단거리의 갭으로 제한된다. 더 긴 갭의 회복을 위한 현재 임상적 골드 스탠다드(gold standard)는 자가조직 신경 이식이다. 이식의 주요 이점은 이들이 형태상으로 원래 그대로의 구조라는 점이며, 이러한 원래 그대로의 구조는 근위에서부터 원위 신경 스텀프로의 축색-재생을 위한 물리적 안내 역할을 한다. 그러나, 자가이식은 신경 기능 손실, 통증이 있는 신경종 형성 및 지각과민을 포함하여, 공여부에서의 이식편 채취 또는 관련 이환율에 대한 공여부 제한과 같은 여러 단점을 악화시킨다.
이러한 양태는 현재 골드 스탠다드가 신경 회복을 위한 최적의 방법이 아니라는 것을 보여주는 것이고, 그에 따라서, 자가이식에 대한 대안적인 방법이 광범위하게 연구되고 있다. 결손 갭을 연결하는 신경 조직 외에, 다른 자가조직 재료, 예컨대, 정맥 이식편 또는 근육이 시험되었다. 그러나, 지난 몇 년 내의 사전임상 및 임상 결과는 불만족스러운 것으로 남아있다.
조직 공학(TE)에서의 방법은 말초 신경 회복에서 새로운 기회를 열었다. 그 결과, 합성 또는 천연 폴리머로 구성된 인공 신경 안내 도관(NGC)은 신경 결손을 연결하기 위한 연구 중에 있다. NGC의 단서는 새롭게 형성된 신경 조직을 위한 보호 환경을 보장하기 위하여 신경 스텀프 및 그 사이의 갭를 관모양으로 해야 한다.
다양한 합성 및 천연 생체재료가 신경 결손의 연결을 위하여 사전임상 및 임상 평가됨에도 불구하고, 이들의 치료적 이점은 여전히 불만족스럽다.
지난 몇 년 동안, 실크 피브로인은 말초 신경 재생에 적합한 생체재료로서 흥미를 끌었다. 다양한 연구에서, SF는 NGC로서의 이의 용도를 유리하게 하는 다수의 강한 특징, 예컨대, 기계적 안정성, 느린 분해율, 신경-생체적합성 및 신경 재생 보조를 저해하는 것으로 밝혀졌다. 생체적합성을 유지하는 것 외에, NGC는 침윤성 섬유아세포에 대한 배리어(barrier)로서의 기능 또는 주위 조직으로부터의 압축에 대한 이의 기계적 저항을 포함하는 일련의 다른 과제를 충족시켜야 한다. SF로부터 제조된 도관을 생산하는 다양한 방법이 이미 개시되어 있다. TE에서 SF-기반 튜브를 생성시키려는 목적은 신경 재생 분야로 제한되지 않고, 또한 혈관 TE에 초점을 맞춰진 그룹에 의해 해결된다. 신경 TE뿐만 아니라 혈관에서의 대부분의 이러한 방법에는 이의 높은 제어성으로 인해 관형 구조를 생성시키는 전기방사가 이용된다. 그 밖의 기술에는 디핑(dipping), 겔 방사(gel spinning) 또는 몰딩이 포함된다. 앞서 언급된 제조 공정 모두는 수용액 또는 유기 용매로부터 가공된 SF를 기반으로 한다. 본 발명에는 텍스타일-조작된 생사 구조물이 신경 결손을 연결하기 위한 원료로서 사용된다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은 분명한 기계적 및 이방성 지형학적 특성을 지니는 SF의 NGC를 생성시키는데 적합한 것으로 밝혀졌고, 래트 좌골 신경 손상 모델의 시험관 및 생체 내에서 이의 생체적합성 및 기능성이 입증되었다. 본 발명의 실시예에서, 신경 안내 도관(NGC)은 원료로서 생사 텍스타일-조작된 SF 관형 구조물을 사용하고, 이어서, 이를 CaCl2/H2O/에탄올, FA 및 메탄올로 처리함으로써 생산되었다. 이러한 처리에 의해서 관형 벽 표면에서 형태학적 변화를 야기하여 융해된 실크 섬유 층을 형성시켰다. 이러한 이방성의 결과로, SF-NGC의 탄성은 상당히 개선되고, SF-NGC의 루멘으로의 세포 침윤이 방지되었다. 래트 좌골 신경 손상 모델의 시험관내 세포 배양 실험뿐만 아니라 생체내 예비 평가에 의해서, 본 발명에 따라 제조된 SF-NGC는 자가조직 이식과 거의 비슷한 방식, 즉, 임상학에서 신경 결손을 연결하기 위한 현재 "골드 스탠다드"로 신경 재생을 보조하는 것을 보여주는 유망한 결과인 것으로 밝혀졌다. 게다가, SF-NGC에서 루멘 충전제로서 콜라겐의 용도는 비어 있는 관과 비교할 때 우수한 결과를 야기하지 않았다. 본 발명의 SF-NGC, 특히, 신경영양성 성장 인자를 함유하는 루멘 충전제 및 보조 세포, 예컨대, SLC가 첨가된 본 발명의 SF-NGC는 자가조직 신경 이식과는 관계없이 큰 신경세포 결손의 치료에서 대안적인 치료 방법을 나타낸다.

Claims (17)

  1. 삼차원 실크 제품의 생산 방법으로서, 삼차원 실크 제품을 삼차원 실크 제품의 부분 해체가 얻어지도록 용매화가 완료되기 전까지의 제한된 기간 동안 실크 용매로 처리한 후, 부분 해체된 삼차원 실크 제품을 재안정화 용액으로의 처리에 의해 물리적 β-시트의 유도와 함께 재안정화시키고, 재안정화 용액이 포름산인, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 실크 용매가 LiBr, LiSCN, 1-에틸-3-메틸이미다졸륨아세테이트, 헥사플루오로-2-프로판올(HFIP), 에탄올과 CaCl2를 포함하는 혼합물, 또는 메탄올과 칼슘 니트레이트를 포함하는 혼합물; 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 에탄올이 1 내지 50%(v/v)의 에탄올을 함유하는 수용액으로 사용되는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 삼차원 실크 제품이 직포, 부직포, 튜브, 니팅된 제품 또는 프레싱된 제품인, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 삼차원 실크 제품이 실크 피브로인 제품 또는 천연 실크 섬유의 직조 제품인, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 삼차원 실크 제품이 누에(Bombyx mori) 고치로부터의 섬유로 제조되는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 삼차원 실크 제품이 피브로인 용액으로 제조된 재구성된 섬유로 제조되는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 삼차원 실크 제품이 의료용 임플란트, 조직 스캐폴드, 또는 탈장 메쉬워크(hernia meshwork)인, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 의료용 임플란트가 신경 도관인, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 부분 해체가 이방성 실크 제품을 제공하거나 증가된 탄성 특성을 발생시키는데 이용되는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 실크 용매로의 처리가 20 내지 100℃의 온도에서 수행되는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 재안정화 용액이 포름산이고, 재안정화된 제품이 메탄올로 추가로 처리되는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 실크 용매가 에탄올과 CaCl2를 포함하는 혼합물을 포함하는, 삼차원 실크 제품의 생산 방법.
  14. 제 1항 또는 제 2항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는, 삼차원 실크 제품으로서, 두 개의 피브로인 필라멘트 층인, 균일한 피브로인 층과 섬유질 피브로인 층의 하나 이상의 스택을 포함하는, 삼차원 실크 제품.
  15. 제 14항에 있어서, 제품이 스텐트, 혈관 이식편, 신경 도관, 조직 스캐폴드, 또는 탈장 메쉬워크인, 삼차원 실크 제품.
  16. 제 14항에 있어서, 균일한 피브로인 층이 20μm 이상 및 삼차원 실크 제품의 전체 두께보다 짧은 직경을 지니는, 삼차원 실크 제품.
  17. 삭제
KR1020157010647A 2012-09-27 2013-09-27 실크로 제조된 제품 KR102185219B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12186272.6 2012-09-27
EP12186272.6A EP2712955A1 (en) 2012-09-27 2012-09-27 Product made of silk
PCT/EP2013/070232 WO2014049134A1 (en) 2012-09-27 2013-09-27 PRODUCT MADE OF SILK Product made of silk

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150087199A KR20150087199A (ko) 2015-07-29
KR102185219B1 true KR102185219B1 (ko) 2020-12-02

Family

ID=47040546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157010647A KR102185219B1 (ko) 2012-09-27 2013-09-27 실크로 제조된 제품

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10214571B2 (ko)
EP (2) EP2712955A1 (ko)
KR (1) KR102185219B1 (ko)
CN (1) CN104822875B (ko)
DK (1) DK2900861T3 (ko)
ES (1) ES2652171T3 (ko)
HU (1) HUE037699T2 (ko)
NO (1) NO2900861T3 (ko)
PL (1) PL2900861T3 (ko)
PT (1) PT2900861T (ko)
WO (1) WO2014049134A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150057685A1 (en) * 2013-08-22 2015-02-26 Allergan, Inc. Medical device with anti adhesive property
US10011931B2 (en) 2014-10-06 2018-07-03 Natural Fiber Welding, Inc. Methods, processes, and apparatuses for producing dyed and welded substrates
US10982381B2 (en) 2014-10-06 2021-04-20 Natural Fiber Welding, Inc. Methods, processes, and apparatuses for producing welded substrates
KR101582202B1 (ko) * 2014-11-05 2016-01-05 대한민국 누에고치를 이용한 혈관용 패치 및 이의 제조방법
US10172407B2 (en) * 2015-06-10 2019-01-08 New York University Ecostructural bicycle/activity safety helmet
MX2018010421A (es) 2016-03-25 2019-05-20 Natural Fiber Welding Inc Metodos, procesos y aparatos para producir sustratos soldados.
CN113930874B (zh) 2016-05-03 2022-11-01 天然纤维焊接股份有限公司 用于生产染色的焊接基质的方法、工艺和设备
CN106589091A (zh) * 2016-12-09 2017-04-26 宁波芸生纺织品科技有限公司 天然蚕丝纤维的溶解方法
CN109652866B (zh) * 2018-12-07 2021-02-23 武汉纺织大学 一种天然蚕丝微纳米纤维的制备方法
CN111888518B (zh) * 2020-08-19 2021-10-26 西南大学 一种用于无创缝合的透明蚕茧基双面胶的制备方法
CN113601941B (zh) * 2021-07-20 2022-12-30 上海视觉艺术学院 利用静电纺丝蛋白纤维膜修复丝织品文物的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007020449A2 (en) 2005-08-17 2007-02-22 Oxford Biomaterials Ltd. Implantable cartilaginous tissue repair device
CN102430155A (zh) * 2011-12-08 2012-05-02 西安交通大学 一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架及制备方法
US8202379B1 (en) * 2009-12-03 2012-06-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Natural fiber welding

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR472351A (fr) * 1913-05-20 1914-12-03 Gottfried Diesser Procédé pour rendre la soie feutrable
US3510390A (en) * 1967-01-30 1970-05-05 Bjorksten Research Lab Inc Nonwoven fabrics and method for making same
US5252285A (en) 1992-01-27 1993-10-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for making silk fibroin fibers
IT1316885B1 (it) 2000-10-02 2003-05-13 Consorzio Per Gli Studi Uni Procedimento per la preparazione di un tessuto non tessuto in fibroinadi seta.
CN100382772C (zh) 2005-09-28 2008-04-23 南通大学 含蚕丝丝素的医用神经移植物的制备方法
DK2211876T3 (en) * 2007-05-29 2015-01-12 Tufts College PROCESS FOR silk fibroin-GELATION USING sonication
US8680380B1 (en) * 2007-12-03 2014-03-25 Pioneer Hi Bred International Inc Maize variety X6N704
JP5896743B2 (ja) * 2008-10-09 2016-03-30 タフツ ユニバーシティー／トラスティーズ オブ タフツ カレッジ グリセロールを含有する改変された絹フィルム
KR101060910B1 (ko) 2009-05-08 2011-08-30 대한민국(관리부서:농촌진흥청장) 실크단백질을 이용한 인공고막 및 그 제조방법
CN101736430B (zh) * 2010-02-05 2012-07-04 东华大学 具有护肤功效的丝素蛋白纳米纤维的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007020449A2 (en) 2005-08-17 2007-02-22 Oxford Biomaterials Ltd. Implantable cartilaginous tissue repair device
US8202379B1 (en) * 2009-12-03 2012-06-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Natural fiber welding
CN102430155A (zh) * 2011-12-08 2012-05-02 西安交通大学 一种蜂窝状丝素蛋白多孔支架及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2712955A1 (en) 2014-04-02
HUE037699T2 (hu) 2018-09-28
EP2900861A1 (en) 2015-08-05
CN104822875B (zh) 2016-10-19
ES2652171T3 (es) 2018-01-31
US10214571B2 (en) 2019-02-26
US20150239944A1 (en) 2015-08-27
DK2900861T3 (en) 2017-12-11
PL2900861T3 (pl) 2018-10-31
PT2900861T (pt) 2017-12-18
CN104822875A (zh) 2015-08-05
KR20150087199A (ko) 2015-07-29
WO2014049134A1 (en) 2014-04-03
EP2900861B1 (en) 2017-09-13
NO2900861T3 (ko) 2018-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102185219B1 (ko) 실크로 제조된 제품
Catto et al. Small diameter electrospun silk fibroin vascular grafts: Mechanical properties, in vitro biodegradability, and in vivo biocompatibility
Font Tellado et al. Fabrication and characterization of biphasic silk fibroin scaffolds for tendon/ligament-to-bone tissue engineering
Wu et al. Fabrication and preliminary study of a biomimetic tri-layer tubular graft based on fibers and fiber yarns for vascular tissue engineering
Khadka et al. Protein-and peptide-based electrospun nanofibers in medical biomaterials
Lu et al. Anisotropic biomimetic silk scaffolds for improved cell migration and healing of skin wounds
Dinis et al. Method to form a fiber/growth factor dual-gradient along electrospun silk for nerve regeneration.
Huang et al. Silk scaffolds with gradient pore structure and improved cell infiltration performance
Gupta et al. Mimicking form and function of native small diameter vascular conduits using mulberry and non-mulberry patterned silk films
KR102158289B1 (ko) 미가공 실크 섬유로 제조된 제품
US9101693B2 (en) Cell-independent fabrication of tissue equivalents
Wang et al. Heparinized PLLA/PLCL nanofibrous scaffold for potential engineering of small‐diameter blood vessel: Tunable elasticity and anticoagulation property
Nseir et al. Biodegradable scaffold fabricated of electrospun albumin fibers: mechanical and biological characterization
Dikici et al. Bioengineering vascular networks to study angiogenesis and vascularization of physiologically relevant tissue models in vitro
Liu et al. Dual-factor loaded functional silk fibroin scaffolds for peripheral nerve regeneration with the aid of neovascularization
Wu et al. Design and fabrication of a biomimetic vascular scaffold promoting in situ endothelialization and tunica media regeneration
Du et al. Enhanced biocompatibility of poly (l‑lactide‑co‑epsilon‑caprolactone) electrospun vascular grafts via self-assembly modification
Teuschl et al. A new preparation method for anisotropic silk fibroin nerve guidance conduits and its evaluation in vitro and in a rat sciatic nerve defect model
Shen et al. In situ prevascularization strategy with three-dimensional porous conduits for neural tissue engineering
Nan et al. Tantalum and magnesium nanoparticles enhance the biomimetic properties and osteo-angiogenic effects of PCL membranes
Namini et al. Tissue-Engineered Core–Shell Silk-Fibroin/Poly-l-Lactic Acid Nerve Guidance Conduit Containing Encapsulated Exosomes of Human Endometrial Stem Cells Promotes Peripheral Nerve Regeneration
US20190144819A1 (en) Integrated cells
Wang et al. Effect of surface structure on the antithrombogenicity performance of poly (-caprolactone)-cellulose acetate small-diameter tubular scaffolds
Wang et al. Fabrication and performance evaluation of PLCL-hCOLIII small-diameter vascular grafts crosslinked with procyanidins
Zhang et al. Application and effectiveness evaluation of electrostatic spinning plga-silk fibroin-collagen nerve conduits for peripheral nerve regeneration

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant