KR102158289B1

KR102158289B1 - 미가공 실크 섬유로 제조된 제품

Info

Publication number: KR102158289B1
Application number: KR1020157010648A
Authority: KR
Inventors: 안드레아스 토이슐; 마르틴 반 그린스벤; 하인츠 레들
Original assignee: 몰포메드 게엠베하
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2020-09-22
Also published as: KR20150086243A; CN104822867A; EP2904134A1; HUE036460T2; ES2658955T3; US20150275398A1; NO2904134T3; EP2904134B1; DK2904134T3; EP3296434A1; CN107881571A; CN107881571B; PL2904134T3; CN104822867B; US10227712B2; PT2904134T; WO2014049129A1; EP2712947A1

Abstract

미가공 실크 섬유를 삼차원 실크 제품으로 형성시키고, 형성된 실크 제품을 정련 단계에 주어지게 하는, 이차원 또는 삼차원 실크 제품의 생산 방법으로서, 보레이트 완충제가 정련제로서 사용되고, 형성된 실크 제품이 바람직하게는 정련 단계 전에 수성 에탄올 완충제와 접촉되는 방법이 개시된다.

Description

미가공 실크 섬유로 제조된 제품{PRODUCT MADE OF NATIVE SILK FIBRES}

본 발명은 실크 가공 분야, 특히, 의료 용도의 실크 재료를 제공하기 위한 실크 가공 분야에 관한 것이다.

역사적으로, 실크는 생물의학 봉합에 수십 년간 사용되고 있는데, 여기서 잠재적인 숙주 면역 반응이 관찰되었다. 이는 실크의 사용에 관한 주요 문제일 수 있으며, 그러한 문제는 과거에 생물의학 적용에서 그 사용을 무시하게 했다. 면역 반응 활성화를 유발하는 주된 원인은 세리신과 연관이 있다(문헌[Altman et al., Biomaterials 24 (2003), 401-416]에 보고됨). 따라서, 생사(raw silk)로부터 세리신의 충분한 제거가 생체적합성 문제를 방지하는 조직 공학 및 재생 의학 적용을 위한 실크의 제조에 있어서 중요한 단계이다.

대부분의 경우에, 누에 실크는 뽕 누에 Bombyx mori의 유충의 고치로부터 얻어진다. 단일의 누에 고치 섬유는 세리신이라 불리는 아교-유사 단백질에 의해 둘러싸인 피브로인 가닥의 두 개의 코어로 구성되고, 이러한 세리신은 피브로인 섬유를 서로에 대해 고정시킨다. 피브로인 및 세리신은 각각 약 75중량% 및 25중량%를 차지한다.

형태학상으로, 실크 피브로인은 배향이 고도로 되어 있고, 결정질인 섬유 구조인 것이 특징이다. 이러한 구조는 대부분의 용매, 예컨대, 물, 에탄올, 묽은 산 및 염기에 이를 불용성으로 만드는데 원인이 된다. 피브로인과 대조적으로, 구형의 단백질 세리신은 수성 용매에 용이하게 용해된다. 텍스타일 산업에서, 실크 의류의 광택이 세리신에 의해 나타나지 않기 때문에 세리신의 제거가 또한 큰 관심을 받고 있다. 따라서, 실크에 대한 작업을 하는 연구 그룹들은 최적의 정련 방법을 위하여 생체재료 분야뿐만 아니라 직물 산업 조사로 제한되지 않는다. 이러한 사실로 인해서 알칼리성 용액 w/o 세제, 요소, 타르타르산, 시트르산, 또는 효소, 예컨대, 파파인 또는 엔도펩티다아제를 포함한 다양한 정련 방법이 존재하게 되었다. 보레이트 염과 조합된 붕산을 정련제로서 사용하는 가능성이 직물 공학 분야에 개시되어 있다. 이러한 연구에서, 보레이트 완충제가 미가공된 생사 섬유를 단독으로[Jiang et al. Materials Letters 60/7 (2006), 919-925)] 또는 계면활성제와 조합하여[JP 2 269870 A] 정련하기 위해서 또는 단일 섬유 또는 직물에 대한 소위 "정련제(scouring agent)"로서 사용되었다. 후자의 경우에는 세리신을 완전히 제거하려는 목적 없이 섬유의 표면을 정련시켜 표백, 염색 등과 같은 추가의 텍스타일 조작 공정에 이용가능하게 하는데 보레이트 완충제를 사용하였다[JP 1 229803 A]. 따라서, 그러한 제품은 여전히 다량의 세리신을 함유하고 있다(예를 들어, 전체 세리신의 절반 이상이 여전히 제품에 존재함). 세리신의 불완전한 제거는 잔여의 세리신으로부터의 면역 반응 유발로 인해 의료 분야의 경우에는 불충분할 것이다. 이에 따라서, 본 발명의 적용 분야에는 적절하지 않다.

이의 높은 다양성 및 일관된 기능으로 인해, 보레이트 완충제는 많은 생화학 및 생명공학 적용에 통상적으로 사용된다. 이러한 맥락에서, 보레이트 완충제는 효소-기반 정련 방법에서 특이적 프로테아제의 최적의 작업 범위내로 pH-값을 유지하는데 사용되었음을 주지해야 한다[CN 102 605 439 A (초록)]. 이는 여기서 완충제가 정련제 자체로서 사용되지는 않지만, 정련시키는 프로테아제에 대하여 pH 면에서 최적의 작업 범위를 제공하는 제제로서 사용된다는 것을 의미한다. 유사한 방식으로, 붕산이 비누를 사용하는 텍스타일 조작 정련 공정에서 pH를 제어하는데 사용되었다[FR 2 528 076 A1].

통상적인 정련 방식은 섬유 구조로부터 세리신을 제거하는 것을 돕는 알칼리성 용액 w/o 세제 중에서 생사를 삶는 것이다. 정련을 달성하기 위해서, 특히, 조직 공학 연구 분야에서 정련을 달성하기 위해서 0.02M의 소듐 카보네이트 용액을 100℃에서 30-60분 동안 사용하는 것이 흔하다는 점이 강조될 수 있다. 흔히, 이러한 알칼리성 정련은 알칼리에 더하여 비누 또는 세제를 사용하여 배치식 처리로 수행된다.

그러나, 여러 연구에서 세리신의 제거는 실크 섬유를 닳게 하고 이의 구조적 특성을 약화시켜 조직 공학 적용의 경우에 이를 스캐폴드로 텍스타일 조작(예, 니팅(knitting) 또는 브레이딩(braiding))하기 매우 어렵게 하는 것으로 밝혀졌다[Liu et al. J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater. 82 (2007), 129-138]. 따라서, 몇몇 연구에서 실크 스캐폴드는 미리 제작되고, 그 후에 정련 공정이 수행된다[Fan et al., Biomaterials 30 (2009), 4967-4977; Fan et al., Biomaterials 29 (2008), 3324-3337; Chen et al., Biomaterials 29 (2008), 3683-3692]. 그러나, 모든 이러한 연구의 스캐폴드 기반은 500μm를 초과하지 않는 두께의 "플레인(plain)" 메쉬(mesh)임을 주지해야 한다[Chen et al., Biomaterials 29 (2008), 3683-3692]. 더욱이, 기재된 메쉬는 낮은 기하학적 계층 레벨, 예를 들어, 단순한 텍스타일 니팅 기술이라는 것이 특징이다. 보다 고차의 텍스타일 조작된 스캐폴드에 비해서 단일 실크 섬유는 정련 용액에 꽤 우수하게 노출되고, 그에 따라서, 전형적인 소듐 카보네이트 용액을 사용하여 정련될 수 있다[도 11a 및 11b 참조].

세리신-비함유 섬유의 가공 특징을 향상시키는 노동-집약적인 방법이 2007년 Liu 등에 의해 제안되었다. 상기 연구에는 세리신-비함유 실크 섬유를 젤라틴과 화학적 가교시킴으로써 세리신을 젤라틴으로 대체하는 방법이 개시되어 있다.

Altman 등[Biomaterials 23 (2002), 4131-4141]은 동적 기계 하중으로 조직에서 전방 십자 인대(anterior cruciate ligament: ACL)의 조직 공학을 위한 3D 스캐폴드로서 미가공 실크 피브로인 섬유(실)의 가능성을 연구하였다. 세리신 추출 후에, 실크 피브로인 섬유를 평행한 섬유로부터 형성된 동등한 매트릭스와 비교해 볼 때 인장 강도를 손실하지 않으면서 개선된 탄성을 지니는 6-코드 와이어-로프 매트릭스로 떴다. 이러한 매트릭스는 본래의 ACL에서의 콜라겐 섬유의 구조와 유사한 계층적 구조를 지니고, 기계적 특성이 강도, 강성도, 항복점, 및 파단시 신율에 대하여 본래의 인간 ACL의 기계적 특성과 비슷하였다. 또한, 와이어-로프 기하학적 구조는 세포 부착 및 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 증착에 대한 표면적을 증가시키고, 물질 이동 제한을 최소화시켰는데, 이들 모두는 향상된 네오-조직 형성에 기여한다. 실크 피브로인 스캐폴드는 성인 인간 골수 유래된 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)의 부착, 확산, 증식 및 분화를 도왔다.

조직 공학 적용에서 실크의 새로운 사용 및 생의학적 및 산업적 연구 그룹에 의한 정련 공정의 다수의 연구에도 불구하고, 높은 기하학적 계층의 텍스타일 조작된 구성물을 정련하는 방법에 대한 지식은 여전히 부족하다. 따라서, 조밀하고 고차인 생 Bombyx mori 실크-섬유 매트릭스, 예를 들어, 전방 십자 인대 조직 공학을 위해 의도된 매트릭스로부터 세리신을 제거할 수 있는 이용가능한 정련 방법이 현재 존재하지 않는다.

매우 대조적으로, 의료 용도를 위한 실크 재료의 공급은 수성 시스템 중에 실크 섬유의 완전히 용해시키고, 이어서, 실크 용액을 요망되는 재료 형태로 예를 들어, 방사, 전기방사, 수성 또는 유기 용매 시스템으로부터의 주조, 겔화, 발포 등에 의해 재가공하는 것을 거의 독점적으로 이용한다[Vepari et al., 2007, US 5,252,285 A].

그러나, 피브로인 용액으로부터 재가공된 실크 재료는 기계적 강도가 감소되는 것과 같이 자연적인(미가공) 고유의 실크 구조와 다르다. 다른 한 편으로, 실크 섬유는 상처 결찰을 위한 봉합으로서 가장 광범위하게 사용되고 있지만; 섬유는 세리신에 의해 유발되는 악영향으로 인해서 적용 전에 정련되어야 한다[Kaplan et al., Biomaterials 24 (2003), 401-416]. 원래 그대로의 실크에는 다수의 대부분의 실크 봉합의 생체적합성 문제가 보고되어 있는데, 이러한 원래 그대로의 실크에서는 세리신이 여전히 중앙의 실크 피브로인 섬유를 덮고 있다. 원래 그대로의 실크로 봉합된 환자에게는 천식 유발 및 면역 글로불린 E 수준의 상향조정이 관찰될 수 있다. Dewair 등의 연구[J. Allergy Clin. Immunol. 76 (1985), 537-542]에서, 피부 시험에서 가장 높은 세리신 함량을 지니는 군(시험된 실크 샘플들 중에서)에는 특이적 IgE가 최고 수준 일뿐만 아니라 실크 민감성 환자의 양성 반응도가 보여질 수 있다. 게다가, 원래 그대로의 실크 섬유 주위에서 마이크로파지(macrophage)를 포함한 염증 세포의 활성이 발견된 반면, 세리신-비함유 또는 젤라틴-코팅된 피브로인 섬유의 대조군에서는 활성이 발견되지 않은 것으로 입증될 수 있다. 이식된 생체재료는 그러한 이물질 반응을 초래하지 않아야 하는 것이 분명하다. 이에 따라서, 실크로 제조된 생체재료는 세리신을 함유하지 않아야 한다. 그러나, 최종 생체재료, 특히, 삼차원 생체 재료를 형성하는 공정(예, 결찰)에서 정련된 실크 섬유의 부정적인 특성으로 인해, 실크를 기반으로 한 생체재료를 제공하는 개선된 방법이 필요하다. 이러한 방법은 탄탄하고, 재생산가능하며, 신뢰가능한 생산법을 가능하게 해야 하며; 다른 한 편으로, 생산된 생체 재료가 특히 의약에 적용가능하도록 제품에는 본질적으로 세리신이 함유되지 않아야 한다. 따라서, 본 발명의 목적은 그러한 방법을 제공하는 것이고; 그러한 방법은 또한 의료 용도, 특히, 치료 및 수술에 특히 적합해야 한다.

따라서, 본 발명은 미가공 실크 섬유를 삼차원 실크 제품으로 형성시키고, 형성된 실크 제품을 정련 단계에 주어지게 하는 삼차원 실크 제품의 생산 방법으로서, 보레이트 완충제가 정련제로서 사용되고, 형성된 실크 제품이 바람직하게는 정련 단계 전에 수성 에탄올 함유 완충제와 접촉되는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법은 실크의 효율적인 정련, 특히, 삼차원 제품의 정련을 가능하게 한다. 선행 기술에 따른 정련된 제품은 여전히 적어도 1 %(w/w)(또는 또한 적어도 2 %(w/w))의 세리신을 함유하는 반면, 본 발명에 따른 제품은, 세리신 함량이 0.1%(w/w) 미만, 바람직하게는 0.05 %(w/w) 미만, 특히, 0.01%(w/w) 미만(또한, 실제로, 상이한 검출 한계를 지니는 세리신을 검출하는 방법에 좌우됨)으로서, 세리신을 본질적으로 함유하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 제품의 경우에는 전자 현미경에서 세리신 잔여물이 보이지 않거나, 세리신 염색 검정에서 세리신 색이 보이지 않는다. 또한, 높은 세리신 함량을 지니는 텍스타일 제품[예컨대, JP 2 269870 A호로 또는 JP 1229803 A호에 개시된 제품]은 의료 분야에 적합하지 않아서 원칙적으로 본 발명에서 배제됨이 분명하다(세리신을 (부분적으로) 제거하는 방법과는 관계없음).

놀랍게도, 본 발명의 과정에서 세리신은 본 발명에 따른 정련 단계에 의해서 미가공 실크 섬유로 제조된 복잡한 삼차원 실크 제품으로부터 효율적으로 제거될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이에 의해서, 천연 실크 섬유의 보다 우수한 취급 특성 때문에 정련된 실크 섬유 또는 재가공된 실크 섬유(피브로인 용액으로부터)에 비해 상당한 이점 및 가능성을 제공하는, 천연 실크 섬유(섬유의 일부가 여전히 세리신임)로 되어 있는 삼차원 제품의 생산이 가능하다.

실크 직물에 대한 성공적인 정련이 보고되지 않은[Fan et al., 2008, 2009; Freddi et al., 2003] 알칼리 또는 프로테아제 처리와 같은 선행 기술 방법과는 대조적으로, 본 발명에 제공된 정련 방법에 의해서 세리신을 본질적으로 함유하지 않는 삼차원 실크 제품이 얻어진다. 선행 기술 방법은 예를 들어, 직물 등에서 고도로 꼬아진 위사(weft yarn)로부터 세리신을 제거하는 것을 성공하지 못한 반면, 본 발명에 따른 정련 방법은 의료 적용에 필수적인 세리신 제거를 제공한다.

따라서, 본 발명에 의해서, 복잡한 삼차원 실크 구조물을 미리 생성시키고, 그 후에 정련 단계를 수행하는 것이 가능하다. 이에 의해서 정련된 실크 섬유 또는 재가공된 실크 섬유를 사용함에 의한 것보다 더 많고 강성인 복잡한 실크 구조물이 제공되는데, 이는 현대 외과에서 상당한 이점이다. 따라서, 또한 전반적인 생산 공정이 보다 탄탄하고 산업적 대량 생산에 적합한데, 그 이유는 정련된 섬유가 특성의 약화를 겪지 않기 때문이다.

본 발명에서, "삼차원 실크 제품"은 세 개의 차원 중 어느 것도 다른 두 개의 차원과 관련하여 무관하지 않은 그러한 차원을 지니는 제품으로서만이 아니라, 하나 이상의 기하학적 계층 레벨을 지니는 제품으로서 이해해야한다. 본 발명에 따른 하나 이상의 기하학적 계층 레벨을 지니는 텍스타일-조작된 구조물은 적어도 0.5mm의 가장 작은 치수("두께")의 직경을 지니는 복잡한 삼차원 구조물이다. 실제로, 본 발명에 따른 바람직한 삼차원 제품은 적어도 1.0mm, 바람직하게는 적어도 2.0mm, 특히 적어도 5.0mm의 가장 작은 치수의 직경을 지닌다. 이에 따라서, 본 발명에 사용되는 스캐폴드는 쉬딩(sheathing) 및 코어(core) 부분(제 1 계층 레벨)으로 세분될 수 있다. 코어 부분 자체는 4개의 가닥으로 추가로 분리될 수 있고, 여기서, 하나의 가닥은 8개의 다발(제 2 계층 레벨)로 형성된다. 이러한 다발들 중 하나는 24개의 연사(제 3 계층 레벨)로 추가로 나뉘어질 수 있고, 이러한 연사는 각각 6개의 단일 실크 섬유(제 4 계층 레벨)로 각각 이루어진다. 이러한 다중-필라멘트 이식편은 5.8mm의 직경을 지닌다. 본 발명에는 높은 계층적 차수(즉, 적어도 2 레벨의 기하학적 계층)의 전방 십자 인대로서 사용하려고 의도된 삼차원 스캐폴드로부터의 세리신의 제거가 나타나 있다. 이러한 복잡한 구조의 정련은 흔히 사용되는 소듐 카보네이트의 경우에는 가능하지 않지만, 본 발명에 따른 보레이트 완충제로는 달성될 수 있다.

더욱이, 본 발명에 따른 바람직한 삼차원 실크 제품은 삼차원의 비율이고, 여기서 가장 낮은 치수는 가장 큰 치수의 1/100보다 작지 않고, 바람직하게는 가장 큰 치수의 1/50보다 작지 않으며, 특히 가장 큰 치수의 1/20보다 작지 않다. 바람직한 구체예에서(예를 들어, 전방 십대 인대의 경우), 두 개의 더 작은 치수가 심지어 비슷한 범위일 수 있다. 예를 들어, 1:1 내지 1:5의 비율을 지닌다(예를 들어, 도 7 및 10 참조).

본 발명에 사용되는 스캐폴드와 대조적으로, 생사 섬유로 미리 생산된 후 정련 과정을 거친 실크 구조물은 주로 플레인 메쉬인 단순한 구조물로 되어 있다(이하 참조).

2008년 Chen 등의 연구에 사용된 스캐폴드는 12개의 경편식(warp-knitting) 실로 이루어지고, 여기서 하나의 실은 하나의 단일 실크 섬유(하나의 계층 레벨)로 형성된다. 유사하게는, 2008년 Liu 등 및 2008년 Fan 등의 연구에 사용된 메쉬는 실로 구성되고, 이러한 각각의 실은 최대 80개의 단일 실크 섬유로 이루어진다. 따라서, 이러한 메쉬는 단지 하나의 계층 레벨을 나타내고, 그에 따라서, 오히려 정련 용액에 매우 이용가능한 헐거운 섬유 구조이다. 더욱이, 이러한 플레인 메쉬는 본 발명의 실시예 섹션에 제시된 바와 같이 전방 십자 인대를 위해 본 발명에 의해 일반적으로 제공된 스캐폴드의 단지 1/10인 약 0.325 +/- 0.116mm의 세리신-비함유 상태의 평균 두께를 지니는 것으로 기재되어 있다. 생체 재료로서 실크에 의한 인대 및 건 조직 공학 분야에서, 최근에 다수의 연구가 이루어졌다(문헌[Vepari et al., Prog. Polym. Sci. 32 (2007), 991-1007]에 보고됨). 이러한 헐거운 섬유 구조와 함께 0.5mm 미만의 두께 값은 소듐 카보네이트와 같은 흔한 제제로 정련시키는 것을 가능하게 한다. 이러한 차이점은 예를 들어, 도 1, 7 또는 10과 비교하여 도 11a 및 11b로부터 또한 알 수 있다.

본 발명에 따른 공정에 의한 세리신 제거 효율은 중량 손실, 피크르산 및 카민 염색 및 주사 전자 현미경에 의해 밝혀졌다. 또한, 실크와 배지 접촉된 전방 십자 인대 섬유아세포(anterior cruciate ligament fibroblast: ACLF) 및 아디포즈-유래된 스트로마 세포(adipose-derived stroma cell: ASC)의 세포 생존율 및 증식은 각각 MTT 검정 및 BrdU-Elisa를 이용하여 검사되었다.

본 발명에 따른 "미가공 실크 섬유"는 세리신을 포함하는 어떠한 천연 실크 섬유이다. "미가공 실크 섬유"는 온전한 피브로인 구조를 지닌다. 이와는 대조적으로, "재생 실크 섬유"는 인공 실크 섬유를 생성시키 위한 방사 공정 또는 이와 관련된 인공적인 공정에 의해 피브로인 용액/현탁액으로부터 새롭게 생성된 실크 섬유이다. 미가공 실크 섬유는 실크 섬유를 얻기 위해 고치로부터 얻어지고 물리적으로 처리될 수 있다(일반적으로, 고치는 추출되고 방사 휠로 공급될 개별적인 장섬유를 얻기 위해서 끓는 물에 용해되지만; 천연 공급원으로부터 얻어진 실크 섬유의 피브로인 구조에 영향을 미치는 "미가공 실크 섬유" 상에 화학적 단계가 적용되지 않는다).

이에 따라서, 세리신을 포함하는 천연 공급원으로부터의 어떠한 실크 섬유는 본 발명에 따른 방법에 주어질 수 있다. 그러한 섬유를 위한 대부분의 산업적 공급원은 물론 뽕 누에 Bombyx mori이지만, 다른 누에로부터의 실크 섬유(Lepidopteron)가 또한 본 발명에 따른 공정에 사용될 수 있다. 누에는 일반적으로 뽕(Bombyx mori, Bombyx mandarina )과 비-뽕(Antheraea (A.) mylitta , A. proylei, A. pernyi , A. yamamai , A. frithi , A. assamensis , Samia ricini , A. atlas, Gonometa postica , Cricula trifenestrata) 누에로 구별될 수 있다. 야생 누에와 사육된 누에 사이에 추출된 세리신의 아미노산 조성에 대한 패턴-유사도는 적어도 97%인데, 이는 상이한 종의 누에들 간에 다수의 아미노산 서열이 보존된다는 것을 입증하는 것이다[Mondal et al., Caspian J. Env. Sci. 5 (2007), 63-76]. 세리신은 누에 종들과는 상관없이 어떠한 미가공 실크 섬유로부터 성공적으로 제거될 수 있다. 다른 가능한 천연 실크 공급원은 개미, 나방, 벼룩, 잎벌, 사마귀 등과 같이 다른 곤충들로부터 이후의 누에이다.

바람직하게는, 정련 단계는 보레이트 이온을, 특히, 소듐 보레이트, 붕산 및 카보네이트 이온, 특히, 소듐 카보네이트를 포함하는 보레이트 완충제를 형성된 실크 제품과 접촉시킴으로써 수행된다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 정화 단계가 정련 단계 전에 1 내지 98%(v/v)의 에탄올, 바람직하게는 60 내지 80%(v/v)의 에탄올, 특히, 65 내지 75%(v/v)의 에탄올을 함유하는 수용액 중의 에탄올로 수행된다.

바람직하게는, 보레이트는 10 내지 2000mM의 보레이트, 바람직하게는 50 내지 1000mM의 보레이트, 특히 100 내지 1000mM의 보레이트를 함유하는 수용액 중에서 정련 단계에 사용된다. 바람직하게는, 보레이트 완충제는 7 내지 11, 바람직하게는 8 내지 10, 특히 8.5 내지 9.5의 pH를 지닌다. 주어진 설정에 대하여 pH를 지정하는 경우, pH, 완충제 성분의 농도 및 온도/기간의 조합이 제품의 피브로인 구조의 실질적인 파괴를 방지하는 설정임을 주의해야 한다. 바람직하게는, 에탄올 정제 단계 및 정련 단계는 승온, 바람직하게는, 60 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 100℃, 특히 90 내지 100℃에서 수행된다. 에탄올 정제 단계와 정련 단계 둘 모두는 바람직하게는 30분 또는 그 이상, 바람직하게는 60min 또는 그 이상, 특히 90min 또는 그 이상의 기간 동안 수행된다. 경제적 관점으로 이러한 처리에 대한 기술적 상한은 없지만, 48h 또는 그 이상, 24h 또는 그 이상, 또는 또한 10h 또는 그 이상의 기간은 덜 바람직한데, 그 이유는 정련이 그 전에 이미 완료되기 때문이다.

본 발명은 현재 천연 실크 섬유에 가능한 복합 실크 제품의 생성을 위한 모든 생산 단계를 가능하게 한다. 실크 섬유 또는 실크 제품의 균열 및 파열에 대한 위험성은 본 발명에 다른 방법에 의해서 상당히 감소된다.

이에 따라서, 미가공 실크 섬유로 삼차원 구조를 형성하는 것으로 알려진 모든 기술은 본 발명에 의해서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 삼차원 실크 제품의 형성은 위빙(weaving), 브레이딩(braiding), 니팅(knitting) 또는 프레싱(pressing)에 의해 수행된다.

어떠한 미가공 실크 섬유로 본 발명에 따른 방법을 수행하는 것이 가능하지만; 본 방법은 Bombyx mori 누에로부터의 실크 섬유에 대하여 특히 최적화되었다. 이는 또한 텍스타일 산업의 경우 미가공 실크 섬유의 주요 산업적 공급원이다. 그러나, 또한 다른 세리신-함유 실크 섬유가 본 발명에 따른 실크 제품의 생산에 사용될 수 있다.

가장 바람직한 미가공 실크 섬유는 Bombyx mori 누에 고치로부터의 것이다. Bombyx mori 누에로부터의 실크 섬유는 모서리가 둥근 5 내지 10μm 너비의 삼각형 단면을 지닌다. 피브로인-중쇄는 일부 변이가 있는 59-mer의 아미노산 반복 서열로 인해 대부분 베타-시트로 구성된다. 피브릴의 평평한 표면은 많은 각도에서 빛을 반사하여 실크에 자연적인 광택을 준다. 그 밖의 누에로부터의 단면은 Anaphe의 경우에는 초승달-유사 그리고 터서(tussah)의 경우에는 긴 쐐기와 같이 모양과 직경이 다를 수 있다. 누에 섬유는 아교와 유사하게 작용하는 세리신 단백질로 함께 붙어 있는 일차 필라멘트(브린)의 일부로서 두 개의 누에 실샘으로부터 자연적으로 추출되어 고치실을 형성시킨다. 터서 실크의 경우 고치실 직경은 65μm에 이를 수 있다.

상기에 이미 언급된 바와 같이, 어떠한 삼차원 실크 제품이 본 발명에 따라 가공될 수 있다. 바람직하게는, 제품은 사람 및 가축의 수술(사람의 수술이 본 발명에 의해서 약제학적으로 적용가능한 실크 제품을 제공하는 가능성으로 인해 바람직함), 예를 들어, 의료용 임플란트, 바람직하게는 스텐트, 신경 도관, 탈장 메쉬워크(hernia meshwork), 결찰, 특히, 전방 십자 인대(ACL), 또는 연골 및 골 스캐폴드, 또는 기관(trachea) 또는 기관지(bronchi)용 스캐폴드에 이용되는 본 방법으로 제조된다.

다른 한 편으로, 본 발명에 따른 방법은 세포가 추가 성장 또는 세포 성분(예를 들어, 세포로부터 분비되는 재조합 단백질 또는 그 밖의 물질)의 생산을 위해 시딩될 수 있는 세포 배양 물질, 예를 들어, 세포 배양 기층을 생산하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 삼차원 제품의 성질 또는 미가공 실크의 성질뿐만 아니라 특정 정련 방법에 좌우하여 용이하게 최적화될 수 있다.

바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 방법에는 20 내지 100℃, 바람직하게는 70 내지 100℃의 온도에서, 특히 비점(예, 100℃)에서 수행되는 정련 단계가 이용된다.

본 발명에 따른 방법은 또한 삼차원 실크 제품의 생산에 이용될 수 있다. 이차원 실크 제품의 생산을 위한 종래의 방법[Freddi et al., 2003]과 비교해 볼 때, 본 발명은 미가공 실크 섬유로 제조된 미가공 이차원 실크 구조물의 정련에 대한 우수한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 미가공 실크 섬유를 이차원 실크 제품으로 형성시키고, 형성된 실크 제품을 정련 단계에 주어지게 하는, 이차원 실크 제품의 생산 방법으로서, 형성된 실크 제품이 바람직하게는 수성 에탄올 완충제와 먼저 접촉되고, 이어서, 본 발명에 따른 정련 단계에 주어지며, 보레이트 완충제가 정련제로서 사용되는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 삼차원 실크 제품에 관한 것이다. 본 발명에 따라 얻어질 수 있는 제품은 탁월한 기계적 안정성을 지니고, 특히 세리신으로 인한 부작용이 없는 생체적합성이고, 생분해성이며, 큰 형태학적 가요성을 지닌다. 다른 정련 방법과는 대조적으로, 본 발명은 최종 제품의 기계적 특성이 그러한 정도로 감소되지 않은 제품을 야기하고, 매우 대조적으로, 기계적 안정성(예, 인장 강도 등)이 미가공 실크 제품의 것과 비슷하고 알칼리 정련된 제품에서와 같이 감소되지 않는다.

본 발명에 따른 삼차원 실크 제품은 매트릭스 스캐폴드, 바람직하게는, 의료 용도, 특히, 세포 부착, 확산, 성장 및 분화를 위한 매트릭스 스캐폴드일 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 제품은 의료용 임플란트, 바람직하게는 스텐트, 신경 도관, 탈장 메쉬워크, 또는 결찰, 특히, 전방 십자 인대(ACL), 또는 기관 또는 기관지용 스캐폴드이다. 본 발명에 따라 그러한 제품의 생산을 취급하는 것은 상당히 유리한데, 그 이유는 세리신이 실크 섬유 상에 여전히 존재하면서 제품이 형성되기 때문이다.

본 발명에 따른 제품은 선행 기술에 따른 제품과 상당히 다른데, 그 이유는 본 발명의 제품은 기계적 취급에 의해 특정 모양으로 변화되는 정련된 일차원 또는 이차원 제품으로부터 형성되지 않은 실제 삼차원 제품이기 때문이다. 따라서, 본 발명의 제품은 또한 예를 들어, 2008년 또는 2009년 Fan 등의 제품과 상당히 다른 내부 구조를 지닌다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 이차원 실크 제품에 관한 것이다.

바람직하게는, 이러한 제품은 시트 형태의 제품, 바람직하게는 의료 용도의 시트 형태의 제품, 특히, 세포 부착, 확산, 성장 및 분화를 위한 필름, 막, 직조식 시트 또는 메쉬이다.

본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 예시되지만, 이로 제한되지 않는다.

도 1은 실크 스캐폴드 계층의 개략도는 나타낸 것이다. 숫자는 다음과 같이 추가 분석을 위한 실크 섬유의 샘플링 위치를 나타낸다: 1) 외부 쉬딩, 2) 내부 쉬딩, 3) 외부 다발 및 4) 내부 다발 섬유.
도 2는 A: 70% 에탄올에서 비등된 실크 샘플, B: 70% 에탄올에서 비등괴고 Na₂CO₃정련이 수행된 실크 샘플 및 C: 70% 에탄올에서 비등괴고 보레이트 완충제 정련이 수행된 실크 샘플의 결과에 따른 실크 스캐폴드의 중량 손실을 나타낸다. 모든 데이터는 8개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 의미하고, ***은 P<0.001인 유의한 차이를 나타낸다.
도 3은 와이어-로프 구성으로 상이하게 정련된 실크 스캐폴드의 UTS 값을 나타낸 것이다. 정련되지 않은 실크 스케폴드가 대조군으로서 작용하였다. 실크 스캐폴드는 보레이트 완충제 또는 소듐 카보네이트(Na₂CO₃)를 기반으로 한 알칼리성 용액으로 정련되었다. 컬럼 높이는 적어도 7개의 값의 평균 및 SD에 대한 에러 바에 상응한다. ***은 대조군에 대해 유의한 차이를 나타내고, *은 P<0.05의 유의한 차이를 나타낸다.
도 4는 와이어-로프 구성으로 상이하게 정련된 실크 스캐폴드의 강성도 값을 나타낸 것이다. 정련되지 않은 실크 스캐폴드는 대조군으로서 작용한다. 실크 스캐폴드는 보레이트 완충제를 기반으로 한 알칼리성 용액으로 또는 소듐 카보네이트(Na₂CO₃)로 정련된 것이었다. 컬럼 높이는 적어도 7개의 값의 평균 및 SD에 대한 에러 바에 상응한다.
도 5는 상이하게 정련된 실크 스캐폴드의 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 것이다. 미가공) 원래의 상태인 처리되지 않은 미가공 실크 섬유. EtOH) 에탄올 처리된 실크; 0.01 M Na₂CO₃) 1.1g/L의 소듐 카보네이트 용액을 사용한 Na₂CO₃ 정련된 실크; 0.02 M Na₂CO₃) 2.1g/L의 소듐 카보네이트 용액을 사용한 Na₂CO₃ 정련된 실크; 및 보레이트) 상이한 계층의 유래로부터 선택되는 pH = 9.0에서 0.05M의 소듐 보레이트 완충제 중의 0.2M의 붕산을 사용한 보레이트 완충제 정련된 실크; 외부 쉬딩 섬유, 내부 쉬딩 섬유, 외부 다발 섬유 및 내부 다발 섬유. 모든 이미지는 500x의 배율로 얻어진 것이었다.
도 6은 미가공) 정련되지 않은 생사 스캐폴드, Na₂CO₃) 소듐 카보네이트 정련된 실크 스캐폴드 및 보레이트) 보레이트 완충제 정련된 실크 스캐폴드의 피크르산 및 카민 염색을 나타낸 것이다. 각각의 사진에서, 좌측에서 우측으로까지는 다음과 같다: 쉬딩의 외부, 쉬딩의 내부, 외부를 향하는 다발 및 스캐폴드 구조물의 내부.
도 7은 상이한 추출 배지로 배양된 전방 십자 인대 섬유아세포(ACLF) 및 아디포즈-유래된 스트로마 세포(ASC)의 MTT 분석을 나타낸 것이다. 대조군, Na₂CO₃ 및 보레이트 완충제는 각각 5%의 CO₂로 37℃에서 가습된 인큐베이터에서 24h 동안 상이하게 처리된 실크 스캐폴드를 침지시키는데 사용된 배지에 상응한다. 모든 데이터는 8개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다.
도 8은 상이한 추출 배지로 배양된 전방 십자 인대 섬유아세포(ACLF) 및 아디포즈-유래된 스트로마 세포(ASC)의 BrdU 분석을 나타낸 것이다. 대조군, Na₂CO₃ 및 보레이트 완충제는 각각 5%의 CO₂로 37℃에서 가습된 인큐베이터에서 24h 동안 상이하게 처리된 실크 스캐폴드를 침지시키는데 사용된 배지에 상응한다. 모든 데이터는 8개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다.
도 9는 CalceinAM를 사용한 생-세포 염색(녹색)에 의해 가시화된 보레이트 완충제 정련된 내부 섬유 다발에 대한 아디포즈-유래된 스트로마 세포(ASC)의 생존율을 나타낸 것이다. 청색)은 실크 피브로인 섬유의 자가형광을 나타내는 청색 채널의 형광이미지이다. 청색/녹색은 Calcein AM-염색된 세포(녹색) 상에 실크의 자가형광 사진(청색)을 더한 것을 나타낸다.
도 10은 피크르산 및 카민 염색을 통해 결정되는 세리신 제거를 나타낸 것이다(A-D). 스캐폴드 구조물의 쉬딩, 외부를 향한 다발 및 내부의 정련되지 않은 생사 스캐폴드(미가공), 소듐 카보네이트 정련된 실크 스캐폴드(Na₂CO₃) 및 보레이트 완충제 정련된 실크 스캐폴드(보레이트)의 피크르산 및 카민 염색이다. B)는 Definiens XD 1.0 소프트웨어를 사용한 이미지의 RGB-값으로부터 계산된 "적색도(redness)"의 절대값을 나타낸 것이다. 적색도 = (2×적색 - 녹색 - 청색)/(2×적색 + 녹색 + 청색). 기준자는 5mm를 나타낸다.
도 11은 2008년 Chen 등의 문헌(11a: 니팅된 실크 스캐폴드의 SEM 이미지; 공극 크기는 약 1×1mm임) 및 2008년 Liu등의 문헌(11b; 니팅된 실크 스캐폴드의 SEM 이미지, 기준자=200μm)에 기재된 바와 같은 단지 하나의 기하학적 계층 레벨을 지니는 실크 메쉬를 나타낸 것이다.

실시예:

재료 및 방법

재료

달리 지시되지 않는 경우 모든 시약들은 Sigma(Vienna, Austria)로부터 구매된 것이고, 분석용 등급이었다.

실크 -매트릭스 구성

Testex AG(

, Switzerland)로부터 20/22den, 250T/m의 백색의 생 Bombyx mori 누에 섬유를 구매하였다. 그 후에, 브레이딩된 스캐폴드를 Edelrid(Edelrid GmbH, Isny im

, Germany)와 함께 생성시켰다. 브레이딩된 스캐폴드는 와이어-로프 구성을 나타내고, 쉬딩 및 코어 성분으로 세분될 수 있다. 쉬딩 요소와 코어 요소 둘 모두는 가닥, 다발, 연사 및 단일 실크 섬유로 구성된 계층 구조를 지닌다(도 1 참조). 브레이딩 구조의 기본 단위는 6개의 단일 실크 섬유에 의해 형성된 연사를 나타낸다. 6개 및 24개의 연사는 각각 쉬딩 및 가닥을 위한 구조적 기반이다. 전체 스캐폴드는 관형 쉬딩에 의해 싸여진 코어 성분(4개의 가닥)으로 이루어져 전체 직경이 5.8mm가 된다. 쉬딩 및 코어 가닥의 관형 구조물은 각각 열여섯 개의 보빈의 섬유와 함께 시중의 브레이딩 기계의 도움으로 제조된다. 전체 쉬딩 및 코어 다발의 브레이딩 밀도는 각각 10 내지 15크로싱/프랑스식 인치(crossings/French inch)이다. 1의 프랑스식 인치는 27.072mm에 상응한다.

에탄올에 의한 정제 단계

왁스와 같은 생사 상에 사이즈제(sizeing agent) 또는 고유의 물질과 같이 제조 공정으로부터 생기는 물질로부터 생 Bombyx mori 실크로부터 제조된 스캐폴드를 세정하기 위해서 70% 에탄올에 의한 세척 단계를 수행하였다. 따라서, 스캐폴드를 둥근 바닥 플라스크에서 70% 에탄올로 침지시키고, 회분식으로 2회 환류하에 조리하였다.

정련

분석용 샘플을 제조하기 위해서 연구 전체에 걸쳐 두 개의 상이한 정련 용액 (i) 0.02 M Na₂CO₃ 및 (ii) pH = 9.0에서의 0.05M 소듐 보레이트 완충제 중의 0.2 M 붕산을 사용하였다[Jiang et al., 2006]. 주사 전자 현미경 분석을 위하여, 하나의 샘플 군을 0.01 M Na₂CO₃로 정련하였다. 진행된 정련 방법은 다음과 같다: 8cm의 긴 스캐폴드를 1000ml 비커에 넣고, 500ml의 정련 용액을 첨가하고, 비커를 알루미늄 호일로 밀봉하고, 정련 용액이 비등하기 시작할 때까지 핫 플레이트를 포함한 일반적인 자석 교반기 상에서 가열하였다. 45min 후에, 정련 용액을 새로 교체하고, 비등 단계를 반복하였다. 정련 후에, 샘플을 ddH₂O 중에서 철저히 세척하였다. 마지막으로, 모든 샘플을 추가의 시험을 수행하기 전에 공기-건조시켰다.

중량 손실

각각의 정련 방법의 효율을 중량 손실을 측정함으로써 정량적으로 평가하였다. 중량 손실을 초기 중량의 백분율로 표시하고, 연속적인 칭량이 0.1mg 내로 일치할 때까지 중량을 기록하였다.

실크 섬유의 샘플링

피로카민 염색 및 SEM-분석을 이용하여 위치-의존 정련 효율을 입증하였다. 와이어-로프 구성된 스캐폴드 내에서 상이한 위치로부터의 실크 섬유를 샘플링하였다(도 1).

피로카민 염색

피로카민 염색은 조직 분야용 전형적인 염색법이고, 카민과 피크르산의 용액을 혼합함으로써 수행된다. Wang 등의 문헌[Wang et al., 2011]에 개시된 방법에 따르면, 이러한 염색은 실크 정련 효과의 정량적 평가 방법으로서 사용되었다. 요약하면, 염색 용액은 포화 피크르산 수용액과 25% 암모니아 중에 용액된 카민을 혼합하고, pH를 8.0 내지 9.0으로 조절함으로써 제조된다. 실크 섬유를 염색하기 위해서, 매트릭스를 분리된 시험 튜브에서 염색 용액 중에 침지시키고, 그 후에 끓는 워터 배쓰에서 5min 동안 가열하였다. 이어서, 샘플을 ddH₂O로 철저히 세척하고, 실온에서 건조시켰다. 염색된 실크 매트릭스의 디지털 이미지를 디지털 카메라(Ixus 100S, Canon, Japan)를 사용하여 얻었다. 이후, 이러한 이미지를 Definiens XD 1.0 소프트웨어(Definiens AG, Germany, Munich)를 사용하여 다음 계산식을 기초로 하는 각각의 "적색도" 값을 계산하는데 사용하였다: 적색도 = (2×적색 - 녹색 - 청색)/(2×적색 + 녹색 + 청색).

주사 전자 현미경( SEM ) 분석

정련 공정 후에, 인산 완충 식염수(pH 7.4)로 즉시 세정하고, 실온에서 o/n 동안 2.5% 글루타르알데하이드에 고정시켰다. 그 후에, 샘플을 등급화된 에탄올 이어서 헥사메틸디실라잔을 통해 탈수시키고, 흄 후드에서 공기 건조되게 하였다. 샘플을 Polaron SC7620 스퍼터 코터(Quorum Technologies Ltd. East Grinstead, United Kingdom)를 사용하여 Pd-Au로 스퍼터 코팅하고, 3kV에서 JEOL JSM-6510 주사 전자 현미경(JEOL GmbH, Eching/Munich, Germany)을 사용하여 검사하였다.

기계적 시험

실크 스캐폴드는 Zwick Z050 재료 시험기(Zwick GmbH & Co. KG, Ulm, Germany)를 사용하여 인장 시험을 거쳤다. 시험기 내에 안정한 고장을 보장하기 위하여, 스캐폴드 단부를 에폭시 수지(에폭시 수지, BK, VOSSCHEMIE GmbH, Uetersen, Germany)에 엠베딩시켰다. 시험 전에, 스캐폴드를 적어도 24h 동안 PBS에 인큐베이션시켰다. 샘플을 23 ± 2℃ 및 45-65%의 상대 습도에서 10mm/min의 변형 속도에서 파단이 될 때까지 당겼다. 50N의 초기장력으로 파단으로의 당김 시험(Pull-to-failure test)을 수행하였다. 파단 전에 달성되는 가장 높은 하중을 최대 인장 응력(ultimate tensile stress: UTS)으로 취하였다. 강성도 값을 계산하기 위하여, 응력/변형 곡선의 선형 부분을 이용하였다.

세포 배양

전방 십자 인대 섬유아세포(ACLF)

AUVA의 윤리 심사 위원회(IRB)에 의해 전체 ACL 재구성을 거치는 환자들로부터 ACL 조직을 수거하는 절차가 승인되었다. 전방 십자 인대 섬유아세포(ACLF)를 Nagineni 등[Nagineni, Amiel, Green, Berchuck, & Akeson, 1992]의 프로토콜을 기초로 하는 변형된 방법에 의해 입수하였다. 요약해서, ACL 조직을 채취하고, 1-3mm³의 작은 조각으로 무균적으로 절단하였다. 그 후에, 이러한 절편체를 100mm의 세포 배양 페트리 접시로 옮기고, 10% FCS(PAA, Pasching, Austria), 2 mM의 L-글루타민, 100U/mL의 페니실린 및 0.1mg/mL의 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 90%의 밀집(confluence)에 이를 때까지 절편체로부터의 세포 성장을 모니터링하고, 이어서, 세포를 계대배양하였다.

아디포즈-유래된 스트로마 세포(ASC)

국부적으로 팽창하는 마취하에 외래 환자 지방 흡인술 과정 동안 피하 아디포즈 조직을 얻었다(IRB의 동의를 얻음). 종래에 개시된 문헌[Wolbank et al., 2007]에 따라 아디포즈 유래된 스트로마 세포(ASC)를 분리하고, 10% FCS(PAA, Pasching, Austria), 2mM의 L-글루타민, 및 1ng/mL 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(recombinant human basic fibroblast growth factor: rhFGF)(R&D Systems, Minneapolis, USA)가 보충된 DMEM-저 글루코오스/ HAM's F-12를 함유하는 배지에서 배양하였다.

세포 생존율 및 증식 시험

세포 생존율 및 증식 거동에 대한 상이하게 정련된 실크 스캐폴드의 영향을 시험하기 위해서, 1g의 정련된 실크를 5% CO₂ 환경에 37℃에서 적어도 24h 동안 5ml의 세포 배양-배지에 침지시켰다. 이와 동시에, 세포를 0.2×10⁵의 세포/웰의 세포 밀도로 24-웰 플레이트 중에 시딩시켰다. 그 후에, 각각 실크 재료로부터 침출되는 생성물을 함유하는 배지를 여과하고(0.22μm, Rotilabo, Karlsruhe, Germany), 세포 배양에서 배지를 교환하는데 사용하였다. 음성 대조군으로서, 표준 배양 배지를 사용하였다.

증식

5-브로모-2-데옥시우리딘(BrdU) 흡수 검정(세포 증식 ELISA 검정 키트, Cat 1647229, Roche Diagnostics)을 제조업체의 지시에 따라 이용하여 증식을 측정하였다. 요약하여, 37℃ 및 5% CO₂에서 가습된 인큐베이터에서 12h 동안 100μM의 BrdU를 함유하는 각각의 배지로 세포를 배양하였다. 베지를 제거하고, 배양 플레이트를 15min 동안 공기-건조시켰다. FixDenat® 용액을 30min 동안 첨가하고, 이어서, 항-BrdU POD(퍼옥시다아제) 항체와 실온에서 60min 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 테트라메틸 벤지딘을 기질로서 30분 동안 첨가하였다. 1M H₂SO₄를 첨가함으로써 반응을 중지하고, 참조 파장으로서 690nm로 450nm에서 흡수를 측정하였다.

MTT 검정에 의한 세포 생존율/세포독성 시험

세포 배양 배지를 뽑아내고, 650mg/ml의 MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨] 브로마이드를 함유하는 각각의 세포 배양 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 5% CO₂ 환경에 37℃에서 1h 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 뽑아내고, MTT 포르마잔 침전물을 DMSO 중에 20min 동안 어둡게 기계적으로 쉐이킹함으로써 용해시켰다. 100μl의 각각의 샘플의 부분표본을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 550nm에서의 흡광도를 자동 마이크로플레이트 리더(Spectra Thermo, TECAN Austria GmbH, Austria) 상에서 바로 판독하였다. 광학 밀도(Optical density: OD) 값을 비특정 바탕에 대하여 보정하였다.

보레이트 완충제 정련된 실크 스캐폴드에 대한 세포 생존율

보레이트 완충제 정련된 실크 스캐폴드에 대한 ASC의 세포 생존율을 예측하기 위해서, 길이가 1cm인 전체 구조물의 내부 섬유 다발을 5% CO₂ 환경에 37℃에서 24h 동안 1×10⁶ 세포/mL로 세포 현탁액에 시딩하였다. 그 후에, 세포-시딩된 스캐폴드 재료를 칼세인-아세톡시-메틸에스테르(CalceinAM, Invitrogen, Lofer, Austria)로 염색하였다. 따라서, 구조물은 5mg/ml의 CalceinAM을 함유하는 CM에 15min 동안 인큐베이션시키고, PBS로 세척하였다. PBS로 다시 세척한 후에, Leica DMI6000B 형광 현미경(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)을 사용하여 현미경 형광 사진을 찍었다.

통계 분석

GraphPad 소프트웨어(GraphPad software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 모든 계산을 수행하였다. 데이터의 정규 분포를 Kolmogorov-Smirnov 시험으로 시험하였다. 통계적 유의성을 갖기 위해서 일원 ANOVA 이어서 Tukey의 사후 검증을 이용하고, 0.05 미만의 P-값을 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

결과:

중량 손실

전형적인 Na₂CO₃ 정련 방법과 비교하여 보레이트 완충제 기반 정련의 효과를 확인하기 위하여, 처리된 실크 스캐폴드의 중량 손실을 알아보았다. 세리신 제거 전에, 실크 스캐폴드를 70% 에탄올(w/w)에서 비등시켜 어떠한 가능한 텍스타일 보존제를 떼어놓았다. 알콜로의 이러한 처리에 의해서 2.9% ± 0.1%의 실크 스캐폴드 중량 손실이 야기되었다. 각각 Na₂CO₃ 또는 보레이트 완충제로의 하기 정련 공정에 의해서 25.2 ± 0.3% 및 27.1% ± 0.1%의 중량 손실이 초래되었다.

와이어 -로프 실크 스캐폴드의 기계적 특성에 대한 정련의 영향

파단으로의 당김 시험으로부터 얻어진 인장 파라미터는 표 1에 요약되어 있다. 보충적으로 표는 또한 Woo 등의 연구[Woo, Hollis, Adams, Lyon, & Takai, 1991]로부터 인간 대퇴골-ACL-경골 복합체의 기준치, 선형 강성도(242 ± 28 N/mm) 및 UTS(2160 ± 157 N)를 함유한다.

표 1. 와이어-로프 실크 스캐폴드의 기계적 특성에 대한 정련 공정의 영향 및 Woo 등[Woo et al., 1991]으로부터 얻어진 인간 ACL 기준치. 모든 데이터는 적어도 7개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM이다.

최대 인장 강도( UTS )

이용된 정련 방법 둘 모두는 정련된 대조군에 비해서 UTS 값에 상당한 감소를 초래하였다(도 3). 미가공의 정련되지 않은 실크 스캐폴드, 보레이트 완충제 정련된 실크 스캐폴드 및 소듐 카보네이트 정련된 스캐폴드는 각각 2757 ± 42, 2440 ± 182 및 2230 ± 94의 UTS 값을 나타냈다. 이러한 값은 보레이트 완충제 정련된 실크 스캐폴드의 경우에 세리신의 제거 전에 초기 UTS의 89%에 상응하고, 소듐 카보네이트 정련된 스캐폴드의 경우에는 81%에 상응한다. 따라서, 보레이트 완충제 정련된 스캐폴드의 경우에 UTS는 전형적인 소듐 카보네이트 정련으로 얻어진 것보다 상당히 더 높다.

강성도

소듐 카보네이트 또는 보레이트 완충제로 정련된 실크 스캐폴드의 강성도는 각각 271 ± 34 N/mm 내지 290 ± 29 N/mm의 범위로 매우 동등하고, 정련되지 않은 미가공 실크 스캐폴드와 통계적으로 다르다(270 ± 49).

SEM -분석

3D 구조에 따른 세리신 제거의 효율을 조사하기 위하여, 상이한 계층 기원의 섬유를 수거하고, SEM을 사용하여 시각적으로 분석하였다. 도 5는 이러한 실크 섬유의 표면 형태를 나타낸 것이다. 명백하게, 정련되지 않은 SF 생사는 아래의 실크 피브로인 필라멘트를 덮고 있는 불균일한 검-유사 코팅의 세리신을 나타내고 있다(도 5, 생사). 도 5에서 "EtOH" 열인 실크 섬유는 에탄올에서 비등되어 지질 물질, 예컨대, 텍스타일-조작 보존제를 없앤 것이다. 2열은 알콜로 처리된 정련되지 않은 SF 생사를 나타낸 것이다. 분명히, 알콜 처리된 SF 섬유와 미처리된 SF 섬유 사이에는 차이가 없다. 전형적인 Na₂CO₃ 방법(도 5, 0.01 M Na₂CO₃, 0.02 M Na₂CO₃) 및 보레이트 완충제 기반 방법(도 5, 보레이트)에 의해 정련된 SF 스캐폴드의 현미경 사진은 특히 3D 구조의 스캐폴드의 내부에서 세리신 제거에 차이를 나타내고 있다. 보레이트 완충제 정련된 스캐폴드(도 5, 보레이트)는 외부 쉬딩에서부터 내부 섬유까지 일관되게 세리신-비함유 SF 섬유를 나타내고 있다.

피크르산 및 카민 염색

SEM 분석 외에, 피크르산 및 카민 염색에 의해 세리신 제거를 또한 확인하였다. Wang 등의 문헌[Wang et al., 2011]에 개시된 바와 같이, 피브로인 및 세리신은 카민 및 피크르산을 상이하게 흡착한다. 세리신은 카민과 피크르산 둘 모두를 동시에 흡수하는데, 여기서 피브로인은 피크르산 분자를 선택적으로 흡착한다. 따라서, 실크의 적변(red coloration)이 잔여의 세리신에 의해 기인될 수 있다. 도 3a는 적색으로 집중적으로 염색된 정련되지 않은 생사 스캐폴드를 내는데, 이는 이러한 스캐폴드 섬유의 표면 상에 상당량의 세리신의 존재를 나타내는 것이다. 도 3b 및 3c는 Na₂CO₃ 및 보레이트 완충제로 각각 정련된 염색된 실크 스캐폴드를 나타낸다. Na₂CO₃ 정련된 실크 스캐폴드는 쉬딩 상에 그리고 외부 섬유 다발 상에 드문 적색을 나타내지만 내부 다발 섬유 상에는 강한 적색을 나타낸다. 이와는 대조적으로, 보레이트 완충제로 정련된 실크 스캐폴드는 백색에서 황색을 나타내는데 이는 3D 계층적 구조의 스캐폴드의 내부에서 뚜렷한 세리신의 성공적인 제거를 지시하는 것이다.

농도 분석을 위하여 상이한 색의 스캐폴드를 사진찍었고, 생성된 사진(도 10에서 A, C, E)을 상이한 스캐폴드 샘플로부터의 적색도 값을 계산하는데 사용하였다. 도 10의 B에는 이러한 값이 상기 기재된 관찰을 정량적으로 입증하는 막대 그래프가 나타나 있다.

세포-생존율

상이하게 정련된 실크 스캐폴드의 침출 배지에서 배양된 ACLF 및 ASC 세포에 대한 MTT 검정 결과는 도 7에 나타나 있다. 둘 모두의 세포 유형에서, 세포 생존율은 24h의 배양 후에 미처리된 표준 세포 배양 배지 생존율과 유의한 차이가 없었다.

증식

BrdU ELISA의 결과에 따르면, 24h의 배양 후에 상이하게 정련된 실크 추출액 또는 미처리된 표준 배양 배지에서 배양된 ACLF 또는 ASC(도 8)의 경우에 세포 증식에서 유의한 차이가 검출되지 않았다.

보레이트 완충제 정련된 실크 스캐폴드 상의 세포의 시딩

보레이트 완충제 정련된 실크 구조물 상의 ASC의 세포 생존율을 확인하기 위하여, CalceinAM에 의한 생세포 염색을 ASC로 시딩된 내부 섬유 다발 상에서 수행하였다. 도 9(녹색)는 실크 피브로인 섬유 상에서 생존가능한 세포를 나타낸 것이다. 녹색 채널(도 9, 녹색) 상에 더해진 청색 채널(도9, 청색)로부터 이미지는 섬유 구조의 스캐폴드 재료에 따른 ASC의 부착을 입증하는 것이다(도 9, 청색/녹색).

고찰

TE 및 재생 의료 적용에서 실크 섬유의 스캐폴드를 사용하기 위하여, 세리신 제거는 생체적합성을 보장하는데 있어서 필수적이다. 그러나, 높은 계층적 차수의 실크 스캐폴드로부터 세리신의 제거를 조사한 연구는 없었다. 따라서, 전형적인 Na₂CO₃-용액으로 여러 레벨의 기하학적 계층을 나타내는 사전제작된 실크 스캐폴드를 정련하는 능력이 보레이트 완충제를 기초로 한 정련 방법에 비교하여 연구되었다. TE에서의 표준 절차는 스캐폴드 제작 전에 생사로부터 검을 제거하는 것이다. 그러나, 세리신의 제거는 실크 섬유를 닳게 하고, 이의 구조적 특성을 약화시켜서, TE 적용의 경우 이들을 스캐폴드로 텍스타일 조작하는 것(예를 들어, 니팅 또는 브레이딩)을 매우 어렵게 한다. 세리신-비함유 섬유의 가공 특징을 향상시키는 노동 집약적인 방법은 Liu 등[Liu et al., 2007]에 의해 제안되었다. 이러한 연구에서, 세리신은 세리신-비함유 실크 섬유를 젤라틴과 화학적 가교시킴으로써 대체되고, 여기서 젤라틴은 미끄럼면으로서 작용을 하고, 텍스타일-조작 가공성을 보장한다. 다른 연구에서는 실크 스캐폴드가 미리 제작되고, 정련 공정이 그 후에 수행되었다[Fan et al., 2009][Fan et al., 2008][Chen et al., 2008]. 그럼에도 불구하고, 이러한 모든 연구의 구조적 기반은 플레인 메쉬였다. 고차의 계층적 텍스타일 조작된 구조에 비해서, 이들은 정련 제제에 의해 용이하게 침투된다.

Bombyx mori 생사에서 세리신 함량이 약 25wt.%을 차지하고 있다는 것은 잘 알려져 있다. 중량 손실 측정은 보레이트 완충제 기반 정련 용액을 사용(27.1%±0.1%)한 세리신의 제거가 흔히 사용되는 Na2CO₃ 정련 방법(25.2±0.3% 중량 손실)에 비해 더 효율적이었다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 Na2CO₃ 정련된 실크가 여전히 계층적 스캐폴드의 내부 구조에 주로 위치되어 있는 세리신 잔여물을 나타낸다는 것을 입증하는 SEM 분석에 의해 추가로 뒷받침된다. 보레이트 완충제의 표면과 대조적으로, 정련된 실크 스캐폴드는 샘플링 위치와는 관계없이 매우 부드럽고 깨끗했다. 피크르산 민 카민 염색은 Na₂CO₃ 처리된 실크에서, 특히, 내부 구조의 섬유 상에서 적색 영역으로 세리신 잔여물을 나타냄으로써 SEM 분석의 결과를 입증하였다. 중량 손실 측정, SEM 분석 및 PACS 염색에 의해 얻어진 결과는 보레이트 완충제 기반 정련에 의한 효과적인 세리신 제거를 입증하였다.

실크 구조의 기계적 특성에 대한 정련 효과를 분석하기 위해서, 와이어-로프 구성의 정련된 및 정련되지 않은 실크 스캐폴드로 파단으로의 당김 시험을 수행하였다. 정련 후 실크의 기계적 강도(UTS)를 감소시키는 것은 종래의 문헌과 일관되었다[Liu et al., 2007][Wang et al., 2011]. 흥미롭게도, UTS 값은 소듐 카보네이트 정련 군에 비해 보레이트 완충제에서 상당히 더 높았다. 이러한 결과는 Jiang 등[Jiang et al., 2006]에 의한 연구 결과에 따른 것이다. 그러한 작업에서, 보레이트 완충제가 실크 섬유의 고유의 기계적 특성을 보존하는데 있어서 소듐 카보네이트에 비해 보다 우수한 정련 제제라는 결과와 함께 상이하게 정련된 단일 실크 섬유의 인장 파라미터가 결정되었다.

단일 실크 섬유는 세리신 제거 후에 더 낮은 탄성 특성을 나타낸다. 놀랍게도, 본 발명에서 강성도 값은 정련된 실크 스캐폴드와 정련되지 않은 실크 스캐폴드 사이에 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 정련이 감소된 후에 그러한 스캐폴드 강성도의 초기 예상과는 일치하지 않는다. 이러한 반대의 결과에 대한 가능한 설명은 텍스타일 조작된 스캐폴드의 대부분의 강성도 특성이 단일 섬유의 기계적 특징보다는 오히려 이의 계층적 구조에 기인된다는 것일 수 있다. 이러한 설명은 다양한 텍스타일 방법을 선택함으로써 제작된 실크 스캐폴드의 UTS 및 강성도를 조정하는 능력이 입증된 연구[Horan et al., 2006]에 의해 뒷받침된다.

아디포즈 유래된 스트로마 세포(ASC)와 전방 십자 인대 섬유아세포(ACLF) 세포와 조합된 상이하게 정련된 실크 스캐폴드들 사이의 시험관 생체적합성 차이에 대한 견해를 얻기 위하여(상기 세포 유형 둘 모두는 추후 인대 TE 방법에 사용되도록 의도됨), 세포 생존율과 증식 검정을 수행하였다. 두 검정 모두에서, 실크 피브로인 추출액이 세포 생존율 및 세포 증식에 대하여 부정적인 효과를 지니지의 여부를 시험하였다. MTT 검정 결과는 사용된 정련 용액과는 관계없이, 실크의 유체 추출물이 연구된 세포 유형에 대하여 세포독성 효과를 지니지 않음을 시사하였다. BrdU 도입에 의한 세포 증식의 분석은 정련군 둘 모두에서 변화를 나타내지 않았다. 또한, 보레이트 완충제 정련된 실크에 대한 ASC의 세포-생존율을 칼세인 AM 염색을 통해 입증하였다.

시험관 결과의 추측에도 불구하고, 추가로 생체내 시험에서 생체내 거동, 특히, 분해율에 관한 생체내 거동에 대한 보레이트 완충제 정련의 효과를 연구하는 것이 수행되어야 한다.

결론

이러한 결과는 전형적인 소듐 카보네이트 정련 용액으로는 가능하지 않은 고차의 계층적 3D 스캐폴드의 정련이 보레이트 완충제 기반 시스템을 통해, 바람직하게는, 에탄올 세척 단계와 함께 달성될 수 있다는 것을 보여준다. 실크 스캐폴드의 기계적 건전성(mechanical integrity)을 실질적으로 보존하면서, 보레이트 완충제는 또한 시험된 실크 스캐폴드의 내부 구조에서도 면역 반응-유발 세리신을 완전히 제거하는데 적합한 것으로 밝혀졌다. 텍스타일 조작 공정 후에 세리신을 잘 제거하는 가능성은 고차의 스캐폴드 구조물의 생산을 용이하게 한다. 이러한 결과는 정교하고 복잡한 계층적 구조를 필요로 하는 추가의 TE 및 재생 의료 적용에서 스캐폴드 재료로서의 실크의 용도를 발전시킬 수 있다.

Claims

삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품의 생산 방법으로서, 미가공(native) 실크 섬유를 삼차원 실크 제품으로 형성시키고, 형성된 삼차원 실크 제품을 정련 단계에 주어지게 하고, 보레이트 완충제가 정련제로서 사용되고, 가장 작은 치수의 상기 삼차원 실크 제품의 직경이 가장 큰 치수의 상기 삼차원 실크 제품의 직경의 1/100보다 작지 않거나, 가장 작은 치수의 상기 삼차원 실크 제품의 직경이 0.5 mm 이상인 방법.
제 1항에 있어서, 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품이 0 내지 0.1%(w/w) 미만의 세리신 함량을 지니는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 정련 단계가, 형성된 삼차원 실크 제품을 보레이트 이온 및 카보네이트 이온을 포함하는 보레이트 완충제와 접촉시킴으로써 수행되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 형성된 삼차원 실크 제품이 정련 단계 전에 수성 에탄올 완충제와 접촉되고, 에탄올이 1 내지 98%(v/v)의 에탄올을 함유하는 수용액으로 사용되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 보레이트가 10 내지 2000mM의 보레이트를 함유하는 수용액으로 사용되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 삼차원 실크 제품의 형성이 위빙(weaving), 브레이딩(braiding), 니팅(knitting) 또는 프레싱(pressing)에 의해 수행되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 미가공 실크 섬유가 누에(Bombyx mori) 고치로부터의 섬유인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 형성된 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품이 스텐트, 신경 도관, 탈장 메쉬워크(hernia meshwork), 결찰, 건(tendon), 기관(trachea) 또는 기관지(bronchi)용 스캐폴드, 또는 골 스캐폴드인 방법.
제 8항에 있어서, 형성된 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품이 전방 십자 인대(anterior cruciate ligament: ACL)인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 형성된 삼차원 실크 제품이 세포 기층인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 정련 단계가 20 내지 100℃의 온도에서 수행되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는, 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품.
제 12항에 있어서, 제품이 매트릭스 스캐폴드인, 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품.
제 12항에 있어서, 가장 작은 치수의 제품의 직경 대 가장 큰 치수의 제품의 직경의 비가 1:1 내지 1:100인, 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품.
제 12항에 있어서, 가장 작은 치수의 제품의 직경 대 두번째 가장 작은 치수의 제품의 직경의 비가 1:1 내지 1:5인, 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품.
제 12항에 있어서, 가장 작은 치수의 제품의 직경이 1.0mm 이상인, 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품.
제 12항에 있어서, 제품이 스텐트, 신경 도관, 탈장 메쉬워크, 결찰, 건, 기관 또는 기관지용 스캐폴드, 또는 골 스캐폴드인, 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품.
제 17항에 있어서, 제품이 전방 십자 인대(ACL)인, 삼차원 실크의 의료용 임플란트 제품.