CN113908256B - Lancl1蛋白在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

Lancl1蛋白在制备抗病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LANCL1蛋白在制备抗病毒药物中的应用。本发明意外发现，在培养SVA的培养基中加入LANCL1蛋白，能够使SVA的复制水平降低，表明LANCL1蛋白具有抑制SVA复制的作用，可用于制备抗SVA病毒感染的药物或佐剂，用于抑制SVA病毒的复制。但本发明并不局限于SVA，在本发明所述的LANCL1蛋白能够抑制SVA病毒的复制的基础上，同样也能抑制小RNA病毒科其他病毒的复制，也可用于抑制其他病毒的复制，制备抗病毒感染的药物，或佐剂。

Description

LANCL1蛋白在制备抗病毒药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LANCL1蛋白在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)是近年新传入我国的病毒，是小RNA病毒科(Picornaviridae)新增的塞内卡病毒属的唯一成员，临床症状与口蹄疫难以区分，主要表现为口鼻部、蹄部等产生水泡和溃疡。2014年之前，SVA仅在美国和加拿大零星发生，但自2015年以来，巴西、越南、哥伦比亚、泰国、中国等陆续出现SVA疫情，并不断蔓延。2015年SVA传入我国，中国学者首先在广东省发现猪感染SVA的病例。随后，湖北、黑龙江、福建、河南、广西、河北、辽宁、山东、浙江、安徽、四川、江西和陕西等省份发生疫情，不断流行和蔓延、致病性增强，危害加重。由于SVA是新发传染病，目前尚无商业化的疫苗，且其致病和免疫机制仍不完全清楚。
前期研究表明RIG-I是SVA激活天然免疫的关键分子，但是SVA的2C和3Cpro蛋白能够降低RIG-I的蛋白表达，对RIG-I起到相反的拮抗功能；SVA的2C和3Cpro也能够激活Caspase-3，诱导细胞凋亡；SVA的3Cpro利用自身的酶活性切割MAVS、TRIF和TANK等关键天然免疫分子，抑制宿主的天然免疫应答；SVA的3Cpro蛋白还抑制IRF3/7的蛋白表达和去除RIG-I、TBK1和TRAF3分子的泛素化，拮抗宿主的抗病毒功能；因此，由于上述免疫关键分子及SVA蛋白的存在，抑制了SVA的复制，无法实现大规模的复制。此外，SVA感染还可激活细胞的自噬。
LANCL1(Lanthionine 1)羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白1，也称为P40或GRP69A，是LANC样蛋白超家族的哺乳动物成员，存在于植物和细菌。原核LANCL1蛋白是一种含锌酶，与羊毛硫型细菌素脱水酶协同作用，促进半胱氨酸与丝氨酸或苏氨酸残基的分子内缀合，产生具有强效抗菌活性的大环硫醚(羊毛硫氨酸)。人类LANCL1蛋白结合锌离子和谷胱甘肽，在轴突生长中发挥调节作用，LANCL1在脑神经元中表达，在发育过程中受到调节，由神经元活动诱导，并且对于减轻正常出生后发育过程中的神经元氧化应激和对氧化应激的反应至关重要。本发明意外发现，在培养SVA的培养基中加入LANCL1蛋白，能够使SVA的复制水平降低，表明LANCL1蛋白具有抑制SVA复制的作用，可用于制备抗SVA病毒感染的药物或佐剂，用于抑制SVA病毒的复制。
发明内容
本发明提供了一种LANCL1蛋白在制备抗病毒感染药物中的应用。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种LANCL1蛋白或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗病毒感染药物中的应用。
优选地，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
优选地，所述病毒为塞内卡病毒。
第二方面，本发明提供了一种LANCL1蛋白或其药学上可接受的盐在制备病毒疫苗佐剂中的应用。
优选地，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
优选地，所述病毒为塞内卡病毒。
优选地，所述LANCL1蛋白或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
优选地，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
本发明的有益效果是：本发明意外发现，在培养SVA的培养基中加入LANCL1蛋白，能够抑制SVA的复制，表明LANCL1蛋白具有抑制SVA复制的作用，可用于制备抗SVA病毒感染的药物或佐剂，用于抑制SVA病毒的复制。
附图说明
图1转染LANCL1质粒后LANCL1蛋白含量检测结果；
图2转染LANCL1质粒后SVA复制结果；
图3转染LANCL1质粒后SVATCID50的检测结果；
图4 LANCL1蛋白抑制SVA非结构蛋白2C的表达结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
LANCL1蛋白质粒由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队构建；所述LANCL1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SVA非结构蛋白2C质粒由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队构建，SVA非结构蛋白2C的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
PCMV-3×FALG-VEC空载体质粒由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队构建并保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。
塞内卡病毒菌株SVA/FJ-201加入绿色荧光GFP标签，构建SVA/FJ-201-GFP，并保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。
实施例1不同浓度的LANCL1蛋白抑制SVA复制
1.LANCL1蛋白孵育细胞的制备
在HEK-293T细胞中，分别转染不同剂量的LANCL1质粒，分别为0μg、1μg、2μg和3μg。
2.LANCL1蛋白孵育细胞感染SVA的样品制备
转染20小时以后，接种SVA/FJ-201(1MOI)，接种后8h拍照并收取上清，同时Western Blot测定LANCL1蛋白含量。
3.SVA病毒滴度测定
测定上步骤2中获得的上清的TCID50，进行病毒滴度分析。
TCID50的测定步骤如下：提前16h将IB细胞接种96孔板，在细胞形成单层细胞后，用PBS洗3遍IB细胞，接种步骤2收取的上清(10-1-10-10)作为感染空孔，另设两列阴性对照孔。在感染孔中加入100μL病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液，待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
实验结果如图1-3所示，LANCL1蛋白含量检测结果如图1所示，说明随着转染质粒量的增加，其蛋白含量逐渐增加，呈剂量依赖关系；SVA病毒复制结果如图2所示，在HEK-293T细胞中随着转染LANCL1蛋白质粒的增多后，绿色荧光显著减少，说明SVA的复制量显著降低；SVA的病毒TCID50结果如图3所示，随着LANCL1蛋白含量的增加，SVA的TCID50降低，呈剂量依赖关系。上述结果表明，LANCL1蛋白显著降低了SVA的病毒TCID50，抑制了SVA病毒的复制。
实施例2 LANCL1蛋白抑制SVA2C蛋白的表达
1.LANCL1与SVA 2C蛋白质粒转染至HEK-293T细胞中
在HEK-293T细胞中，转染SVA 2C质粒1μg+PCMV-3×FALG-VEC质粒1μg、SVA 2C质粒1μg+LANCL1质粒1μg
2.SVA 2C蛋白表达量测定
转染24小时后收取细胞样品，利用Western Blot技术测定结构蛋白的表达量。
实验结果如图4所示，在转染LANCL1质粒后，SVA 2C蛋白的表达量明显降低，表明LANCL1蛋白能够降低SVA 2C蛋白的表达从而抑制病毒的复制。
综上，本发明实施例以宿主细胞HEK-293T细胞为例，研究了LANCL1蛋白能够在宿主细胞HEK-293T细胞中抑制SVA病毒的复制，表明，本发明所述的LANCL1蛋白能够抑制SVA病毒的复制，可用于制备抗SVA病毒感染的药物或佐剂。
需要说明的是，小RNA病毒科主要包括以下四个属：肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口疮病毒属，而SVA属于口疮病毒属。由于小RNA病毒科四个属之间的病毒结构蛋白具有高度保守性。本发明虽然以小RNA病毒科病毒的SVA为例，证明了LANCL1蛋白可以抑制SVA病毒的复制，但本发明并不局限于SVA，在本发明所述的LANCL1蛋白能够抑制SVA病毒的复制的基础上，同样也能抑制小RNA病毒科其他病毒的复制，也可用于抑制其他病毒的复制，制备抗病毒感染的药物，或佐剂。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> LANCL1蛋白在制备抗病毒药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 402
<212> PRT
<213> 人源(Human)
<400> 1
Met Ala Gln Arg Ala Phe Pro Asn Pro Tyr Ala Asp Tyr Asn Lys Ser
1 5 10 15
Leu Ala Glu Gly Tyr Phe Asp Ala Ala Gly Arg Leu Thr Pro Glu Phe
20 25 30
Ser Gln Arg Leu Thr Asn Lys Ile Arg Glu Leu Leu Gln Gln Met Glu
35 40 45
Arg Gly Leu Lys Ser Ala Asp Pro Arg Asp Gly Thr Gly Tyr Thr Gly
50 55 60
Trp Ala Gly Ile Ala Val Leu Tyr Leu His Leu Tyr Asp Val Phe Gly
65 70 75 80
Asp Pro Ala Tyr Leu Gln Leu Ala His Gly Tyr Val Lys Gln Ser Leu
85 90 95
Asn Cys Leu Thr Lys Arg Ser Ile Thr Phe Leu Cys Gly Asp Ala Gly
100 105 110
Pro Leu Ala Val Ala Ala Val Leu Tyr His Lys Met Asn Asn Glu Lys
115 120 125
Gln Ala Glu Asp Cys Ile Thr Arg Leu Ile His Leu Asn Lys Ile Asp
130 135 140
Pro His Ala Pro Asn Glu Met Leu Tyr Gly Arg Ile Gly Tyr Ile Tyr
145 150 155 160
Ala Leu Leu Phe Val Asn Lys Asn Phe Gly Val Glu Lys Ile Pro Gln
165 170 175
Ser His Ile Gln Gln Ile Cys Glu Thr Ile Leu Thr Ser Gly Glu Asn
180 185 190
Leu Ala Arg Lys Arg Asn Phe Thr Ala Lys Ser Pro Leu Met Tyr Glu
195 200 205
Trp Tyr Gln Glu Tyr Tyr Val Gly Ala Ala His Gly Leu Ala Gly Ile
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Leu Met Gln Pro Ser Leu Gln Val Ser Gln Gly Lys Leu
225 230 235 240
His Ser Leu His Ser Leu Val Lys Pro Ser Val Asp Tyr Val Cys Gln
245 250 255
Leu Lys Phe Pro Ser Gly Asn Tyr Pro Pro Cys Ile Gly Asp Asn Arg
260 265 270
Asp Leu Leu Val His Trp Cys His Gly Ala Pro Gly Val Ile Tyr Met
275 280 285
Leu Ile Gln Ala Tyr Lys Val Phe Arg Glu Glu Lys Tyr Leu Cys Asp
290 295 300
Ala Tyr Gln Cys Ala Asp Val Ile Trp Gln Tyr Gly Leu Leu Lys Lys
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Leu Cys His Gly Ser Ala Gly Asn Ala Tyr Ala Phe Leu
325 330 335
Thr Leu Tyr Asn Leu Thr Gln Asp Met Lys Tyr Leu Tyr Arg Ala Cys
340 345 350
Lys Phe Ala Glu Trp Cys Leu Glu Tyr Gly Glu His Gly Cys Arg Thr
355 360 365
Pro Asp Thr Pro Phe Ser Leu Phe Glu Gly Met Ala Gly Thr Ile Tyr
370 375 380
Phe Leu Ala Asp Leu Leu Val Pro Thr Lys Ala Arg Phe Pro Ala Phe
385 390 395 400
Glu Leu
<210> 2
<211> 319
<212> PRT
<213> 塞内卡病毒(Senecavirus A)
<400> 2
Thr Val Lys Asp Trp Asn Gln Ile Ala Ala Gly Leu Lys Asn Phe Gln
1 5 10 15
Phe Val Arg Asp Leu Val Lys Glu Val Val Asp Trp Leu Gln Ala Trp
20 25 30
Ile Asn Lys Glu Lys Ala Ser Pro Val Leu Gln Tyr Gln Leu Glu Met
35 40 45
Lys Lys Leu Gly Pro Val Ala Leu Ala His Asp Ala Phe Met Ala Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Pro Leu Gly Asp Asp Gln Ile Glu Tyr Leu Gln Asn Leu
65 70 75 80
Lys Ser Leu Ala Leu Thr Leu Gly Lys Thr Asn Leu Ala Gln Ser Leu
85 90 95
Thr Thr Met Ile Asn Ala Lys Gln Ser Ser Ala Gln Arg Val Glu Pro
100 105 110
Val Val Val Val Leu Arg Gly Lys Pro Gly Cys Gly Lys Ser Leu Ala
115 120 125
Ser Thr Leu Ile Ala Gln Ala Val Ser Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Gln
130 135 140
Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp Pro Asp Phe Phe Asp Gly Tyr Lys
145 150 155 160
Gly Gln Phe Val Thr Leu Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly
165 170 175
Gln Asp Phe Ser Thr Phe Cys Gln Met Val Ser Thr Ala Gln Phe Leu
180 185 190
Pro Asn Met Ala Asp Leu Ala Glu Lys Gly Arg Pro Phe Thr Ser Asn
195 200 205
Leu Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu Pro His Phe Ser Pro Val Thr Ile
210 215 220
Ala Asp Pro Ser Ala Val Ser Arg Arg Ile Asn Tyr Asp Leu Leu Thr
225 230 235 240
Leu Glu Val Ser Glu Ala Tyr Lys Lys His Thr Arg Leu Asn Phe Asp
245 250 255
Leu Ala Phe Arg Arg Thr Asp Ala Pro Pro Ile Tyr Pro Phe Ala Ala
260 265 270
His Val Pro Phe Val Asp Val Ala Val Arg Phe Lys Asn Gly His Gln
275 280 285
Ser Phe Asn Leu Leu Glu Leu Val Asp Ser Ile Cys Ala Asp Ile Arg
290 295 300
Ala Lys Gln Gln Gly Ala Arg Asn Met Gln Thr Leu Val Leu Gln
305 310 315

Claims (3)

1.LANCL1蛋白在制备治疗塞内卡病毒感染药物中的应用，所述LANCL1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LANCL1蛋白或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
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