JP2004290182A - 昆虫発現用遺伝子ベクターおよび遺伝子産物製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】
カイコに代表される昆虫を用いて、同時に異なる２種の遺伝子のタンパク質発現を２種の遺伝子プロモーターであるポリヘドリンプロモーターおよびp10プロモーターにより可能にすること、また同時に同種の遺伝子のタンパク質発現も可能となる。その結果、異なる２種の遺伝子からなるイヌインターロイキン１２の発現や同じ２つのタンパク質が結合して活性を有するイヌインターフェロン−γの発現も可能にすることを課題とする。
【解決手段】
少なくとも２つのプロモーターを有する昆虫発現用遺伝子ベクター。
【選択図】なし
カイコに代表される昆虫を用いて、同時に異なる２種の遺伝子のタンパク質発現を２種の遺伝子プロモーターであるポリヘドリンプロモーターおよびp10プロモーターにより可能にすること、また同時に同種の遺伝子のタンパク質発現も可能となる。その結果、異なる２種の遺伝子からなるイヌインターロイキン１２の発現や同じ２つのタンパク質が結合して活性を有するイヌインターフェロン−γの発現も可能にすることを課題とする。
【解決手段】
少なくとも２つのプロモーターを有する昆虫発現用遺伝子ベクター。
【選択図】なし
Description
本発明は、少なくとも２つのプロモーターを有することにより同時に少なくとも２種の遺伝子のタンパク質発現を可能にする昆虫用発現遺伝子ベクターおよびそのベクターを用いて遺伝子導入された昆虫細胞、昆虫を用いた外来タンパク質の製造方法に関する。さらに、蛋白質の一次構造がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターロイキン１２を作製し量産して、以って医薬品（抗腫瘍）とする事を目的とした、イヌインターロイキン１２の製造法に関する。
遺伝子組換え技術を用いた外来タンパク質の生産は、様々な産業に利用されている。その宿主として主に大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが用いられている。しかし、あらゆる外来タンパク質を効率よく生産できる宿主は開発されておらず、目的とするタンパク質ごとに生産系を構築することが必要であり、個々の宿主における外来タンパク質生産技術においてさらなる技術革新が望まれている。
大腸菌などの細菌または酵母の系では、翻訳後修飾に問題があり、タンパク質を十分機能する形で合成できないことがある。また、動物細胞は、タンパク質を機能する形で合成できることが多いが、一般的に増殖させるのが困難で産生量も低く経済的ではない。
一方、昆虫または昆虫細胞を用いた遺伝子組み換えタンパク質の生産では、酵素や生理活性を持つ有用タンパク質等が、比較的安価に量産でき、動物に近いタンパク質の翻訳後修飾が得られることが知られている。具体的には、核多核体病ウイルスの一種であるAutographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)のDNAを用いて、組換えバキュロウイルスを調製し、ヨトウガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に感染させ、発現・生産させる報告がある。外来タンパク質の量産が可能であり、医薬品として製品化された生理活性タンパク質も知られている（特許文献１、特許文献２）。
昆虫の中でもカイコを用いた生理活性タンパク質の生産は、ヨトウガ細胞を用いたタンパク質生産に比べタンパク質生産性が高いという報告があり、また比較的安価に製造可能である。カイコでの発現方法としてはポリヘドリンをプロモーターとする発現用遺伝子ベクターに発現させる遺伝子を組み込み、組換えバキュロウイルスを作製し、本ウイルスをカイコ細胞やカイコに添加し、目的となるタンパク質を発現させるというものである（特許文献３、特許文献４）。その他p10プロモーター(特許文献５)を用いた昆虫細胞での生理活性タンパク質の生産に関する報告もある。
しかし、本法では、カイコを用いた一種のタンパク質でのみ構成される外来タンパク質の発現は可能であるが、２種のタンパク質を同時に発現させることで生理活性の得られるタンパク質の発現・生産は不可能であった。中でもサイトカインの一種であるインターロイキン１２は、p35およびp40の２種のタンパク質がヘテロダイマー構造を有しておち、すなわち２種のタンパク質がダイマー構造をとって初めて生理活性を有するタンパク質の発現は困難であった。
特開昭６１−９２８８号公報
特開昭６１−９２９７号公報
特開昭６１−００９２８８号公報
特開昭６２−２０８２７６号公報
米国特許第５５７１７０９号明細書
少なくとも２種の外来タンパク質遺伝子を同時に発現させる発現用遺伝子ベクターの構築が課題である。また、２種のタンパク質が同時に発現することにより生理活性を有するタンパク質の発現ならびに、２種のタンパク質がヘテロダイマー構造を有することより生理活性を発揮するイヌインターロイキン１２の発現・生産を、本発現用遺伝子ベクターを用いることにより可能にすることが課題である。
すなわち、本発明は基本的には以下の構成を有する。
少なくとも２つのプロモーターを有する昆虫発現用遺伝子ベクター。
ポリヘドリンプロモーターを有するpBK blueベクターの下流に昆虫由来p10プロモーターを導入した外来タンパク質の発現用遺伝子ベクターを新規に構築した。
本発現用遺伝子ベクターに、２種の外来タンパク質発現遺伝子を同時に組込む事を可能にし、もって宿主を昆虫やカイコとしたとき同時に異なる２種のタンパク質発現させることを可能にした。また、２種の遺伝子（p35およびp40）からなるイヌインターロイキン１２発現用遺伝子ベクターの構築を可能にし、カイコでのイヌインターロイキン１２の発現を可能にした。また、ホモダイマーを形成することにより活性を発揮するイヌIFN-γ、２種のタンパク質のヘテロダイマーを形成することにより活性を発揮するヒトアクチビンについてもイヌIL12同様に発現用ベクターを構築し、カイコでの発現を可能にした。
本発現用遺伝子ベクターに、２種の外来タンパク質発現遺伝子を同時に組込む事を可能にし、もって宿主を昆虫やカイコとしたとき同時に異なる２種のタンパク質発現させることを可能にした。また、２種の遺伝子（p35およびp40）からなるイヌインターロイキン１２発現用遺伝子ベクターの構築を可能にし、カイコでのイヌインターロイキン１２の発現を可能にした。また、ホモダイマーを形成することにより活性を発揮するイヌIFN-γ、２種のタンパク質のヘテロダイマーを形成することにより活性を発揮するヒトアクチビンについてもイヌIL12同様に発現用ベクターを構築し、カイコでの発現を可能にした。
本発明において、少なくとも２つのプロモーターを有する昆虫発現用遺伝子ベクターとしては、ポリヘドリンプロモーターおよびp10プロモーターを有する昆虫発現用遺伝子ベクターである。これは、２つのプロモーターを有するものであり、かつ、この２つは種類の異なるものであるが、場合によっては同種のプロモーターであっても構わない。前記ベクターとしては、ポリヘドリンプロモーターを有するpBK blueベクターの下流に昆虫由来p10プロモーターを導入した外来タンパク質の発現用遺伝子ベクターである。pBK blueは、プロモーターとしてポリヘドリンを有する昆虫細胞用の発現遺伝子ベクターとして汎用されており、本ベクターを使用することにより外来遺伝子を昆虫やカイコなどで発現させることができる。昆虫や昆虫細胞よりDNAを調製し、適当なプライマーを設計し、PCR法によりp10プロモーター遺伝子を取得することができる（文献１、２）。pBK blueを適当な制限酵素により処理し、p10プロモーターにも制限酵素サイトを付加しておくことにより、両DNAをDNAリガーゼなどにより結合させることにより、ポリヘドリンプロモーターとp10プロモーターの両方を有する発現用遺伝子ベクターを調製することが可能となる。
かかるベクターのそれぞれのプロモーターの下流に、常法により外来タンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入して発現させることにより、前記外来タンパク質を同時に製造することができる。これにより、複数種のサブユニットより構成されるタンパク質、特にヘテロダイマーより構成されるタンパク質等の製造に好適である。ヘテロダイマータンパク質としてはインターロイキン１２やヒトアクチビンAB等が例示され得る。また同じ２つのタンパク質が結合することにより生物活性を有するタンパク質の発現にも本ベクターは適応可能であり、かかるタンパク質としてはイヌインターフェロン−γ等が例示される。
本発明の製造法で得られるインターロイキン１２（以下IL１２）としてはヒトインターロイキン１２、ほ乳類のインターロイキン１２などがあげられ、特にイヌIL１２の製造に好ましく本発明が適用できる。
イヌIL１２の２つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって、イヌIL１２の２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を得ることができる。イヌの細胞、例えばマイトジェンなどで刺激されたイヌリンパ球などによりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献３）、バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献４）、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
イヌリンパ球などより通常の方法、例えば塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロース法などによりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献５）、Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献６）などによりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌIL１２の２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってイヌIL１２の２つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを得ることができる。
宿主として昆虫細胞、例えばヨトウガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）等を使用することができる。
発現ベクターとしては、ウイルス（バキュロ（昆虫））などが使用できる。発現ベクターによる宿主の形質転換は、当該技術分野においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、カレント プロトコールス イン モレキュラー バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
すなわち、カイコに感染する組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製することによって、カイコ発現系を用いても生産することができる。組換えカイコ核多角体病ウイルスは、イヌIL12p35およびp40の蛋白質をコードするＤＮＡをカイコのクローニングベクターに連結して作製した組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランスフェクションして作製することができる。従って、組換え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製することができる。すなわち、イヌIL１２p35およびp40の蛋白質をコードするＤＮＡ部分を、ポリヘドリンプロモーター及びp10プロモーターの両方を有する発現用遺伝子ベクターに、一般的な遺伝子操作に従って連結することにより組換え体プラスミドを作製することができる。この組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献８）とを、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢｍＮ株（文献８）にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをクローニングすることができる。組換え体ウイルスは多角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に区別できる。イヌIL１２の生産は、前記の組換えカイコ核多角体ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生体中で増殖させることにより行なう。
カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換え体ウイルスを含む培養液により、ＢｍＮ細胞を感染させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加したＴＣ−１０培地（文献８）やＴＣ−１００培地（日本農産工業株式会社製）を使用することができる。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心分離しその上清からイヌIL１２を回収する。
産生されたイヌIL１２は非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、見かけの分子量が約７０〜８０ｋＤであると言う結果が得られる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０ｋＤのバンドが還元条件下では分子量約４０ｋＤと約３５ｋＤの２つのサブユニットを生じる。
イヌIL１２は、以下の実施例で示すようにｉｎ ｖｉｔｒｏでイヌ白血球からのインターフェロンγの誘導能により主に特性化される。
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
実施例１ 発現用遺伝子ベクターDNAの調製
カイコ由来p10プロモーターDNAを、カイコ遺伝子の配列を参考に合成した（配列番号１）。合成したDNAの末端にはEcoRＩによる切断部位に相当する塩基配列を付加させており、得られたp10プロモーター遺伝子をT4 polynucleotide kinase、ATP存在下でリン酸化した。次にpBK blue vectorをEcoRＩにより切断し、アルカリフォスファターゼにより脱リン酸化処理を行い、p10プロモーター遺伝子共存下、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下pBK blue vectorとp10 promoterの連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル（Stratagene社製）に形質転換を行った。得られた形質転換体より、常法によりポリヘドリンプロモーター及びp10 promoterを含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した（配列番号２）。
カイコ由来p10プロモーターDNAを、カイコ遺伝子の配列を参考に合成した（配列番号１）。合成したDNAの末端にはEcoRＩによる切断部位に相当する塩基配列を付加させており、得られたp10プロモーター遺伝子をT4 polynucleotide kinase、ATP存在下でリン酸化した。次にpBK blue vectorをEcoRＩにより切断し、アルカリフォスファターゼにより脱リン酸化処理を行い、p10プロモーター遺伝子共存下、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下pBK blue vectorとp10 promoterの連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル（Stratagene社製）に形質転換を行った。得られた形質転換体より、常法によりポリヘドリンプロモーター及びp10 promoterを含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した（配列番号２）。
実施例２ イヌＩＬ１２p40、p35遺伝子を導入したベクターの調製
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ肝臓、およびニワトリニューカッスル病ウイルスで７時間処理した（１０7 ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾臓由来リンパ球より、それぞれ、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたイヌ肝臓由来ＲＮＡとイヌ脾臓由来リンパ球由来ＲＮＡはそれぞれ、以下の通りの処理を行った。即ち、ＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ肝臓、およびニワトリニューカッスル病ウイルスで７時間処理した（１０7 ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾臓由来リンパ球より、それぞれ、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたイヌ肝臓由来ＲＮＡとイヌ脾臓由来リンパ球由来ＲＮＡはそれぞれ、以下の通りの処理を行った。即ち、ＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
かくして、イヌ肝臓由来ＲＮＡとイヌ脾臓由来リンパ球由来ＲＮＡからそれぞれイヌ肝臓由来ｃＤＮＡとイヌ脾臓由来リンパ球由来ｃＤＮＡが得られた。
（２）イヌIL１２p40遺伝子のクローニング
イヌIL１２p40のＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献７）をもとに、
５´ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴ３´（配列番号３）
と
５´ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧ３´（配列番号４）
の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ肝臓より得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献９）に従って調製した。
イヌIL１２p40のＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献７）をもとに、
５´ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴ３´（配列番号３）
と
５´ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧ３´（配列番号４）
の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ肝臓より得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献９）に従って調製した。
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造株式会社のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がイヌＩＬ１２p40をコードする配列であることを確認した（配列番号５）。
（３）イヌIL１２p35遺伝子のクローニング
イヌIL１２p35のＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献７）をもとに、
５´ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴ３´（配列番号６）
と
５´ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴ３´（配列番号７）
の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（２）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、イヌIL１２p35をコードする配列であることを確認した（配列番号８）。
イヌIL１２p35のＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献７）をもとに、
５´ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴ３´（配列番号６）
と
５´ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴ３´（配列番号７）
の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（２）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、イヌIL１２p35をコードする配列であることを確認した（配列番号８）。
（４）イヌIFN-γ遺伝子のクローニング
イヌIFN-γのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡ ３´（配列番号９）
と
５´ＡＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＧＣＧＧＣＣ３´
（配列番号１０）
さらにイヌIFN-γのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡ ３´（配列番号１１）
と
５´ＡＡＣＴＧＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴＴＧＣＧＣＧＧＣＣ３´
（配列番号１２）
の４種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（２）と同様にして約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、イヌIFN-γをコードする配列であることを確認した（配列番号１３）。
イヌIFN-γのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡ ３´（配列番号９）
と
５´ＡＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＧＣＧＧＣＣ３´
（配列番号１０）
さらにイヌIFN-γのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡ ３´（配列番号１１）
と
５´ＡＡＣＴＧＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴＴＧＣＧＣＧＧＣＣ３´
（配列番号１２）
の４種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（２）と同様にして約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、イヌIFN-γをコードする配列であることを確認した（配列番号１３）。
（５）ヒトActivinAB遺伝子のクローニング
ヒトinhibinβA遺伝子のクローニング
ヒトinhibinβAのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＡ ３´（配列番号１４）
と
５´ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣ３´
（配列番号１５）
の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。ヒトｃＤＮＡ（Stratagene社製）を鋳型として上記（２）と同様にして約１５００ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ヒトinhibinβAをコードする配列であることを確認した（配列番号１６）。
ヒトinhibinβA遺伝子のクローニング
ヒトinhibinβAのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＡ ３´（配列番号１４）
と
５´ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣ３´
（配列番号１５）
の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。ヒトｃＤＮＡ（Stratagene社製）を鋳型として上記（２）と同様にして約１５００ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ヒトinhibinβAをコードする配列であることを確認した（配列番号１６）。
ヒトinhibinβB遺伝子クローニング
ヒトinhibinβBのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＣＡＴＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＧＴＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＣ ３´（配列番号１７）
と
５´ＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣ３´
（配列番号１８）
の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。ヒトｃＤＮＡを鋳型（Stratagene社製)として上記（２）と同様にして約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ヒトinhibinβBをコードする配列であることを確認した（配列番号１９）。
ヒトinhibinβBのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＣＡＴＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＧＴＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＣ ３´（配列番号１７）
と
５´ＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣ３´
（配列番号１８）
の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。ヒトｃＤＮＡを鋳型（Stratagene社製)として上記（２）と同様にして約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ヒトinhibinβBをコードする配列であることを確認した（配列番号１９）。
（６）発現用遺伝子ベクターへのイヌIL１２遺伝子の組込み
実施例１で調製した発現用遺伝子ベクター及びイヌIL１２を構成するp40をそれぞれkpnＩおよびXbaＩで制限酵素処理した。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行った。即ち、電気泳動により分離したアガロースゲル上のDNAを、UVランプ照射して目的の遺伝子（p40またはp35遺伝子）を確認して、アガロースゲルごと切り出した。その後、geneclean kitにより余分なアガロースを除き、目的遺伝子のみを抽出した。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとp40遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル(Stratagene社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌIL１２p40遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。次にこの遺伝子ベクターDNAをNcoＩとSse8387Ｉで、イヌIL１２p35遺伝子をNcoＩとPstＩで制限酵素処理し、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとp35遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル（Staratagene社製）に形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌIL１２p35およびp40遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。
実施例１で調製した発現用遺伝子ベクター及びイヌIL１２を構成するp40をそれぞれkpnＩおよびXbaＩで制限酵素処理した。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行った。即ち、電気泳動により分離したアガロースゲル上のDNAを、UVランプ照射して目的の遺伝子（p40またはp35遺伝子）を確認して、アガロースゲルごと切り出した。その後、geneclean kitにより余分なアガロースを除き、目的遺伝子のみを抽出した。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとp40遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル(Stratagene社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌIL１２p40遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。次にこの遺伝子ベクターDNAをNcoＩとSse8387Ｉで、イヌIL１２p35遺伝子をNcoＩとPstＩで制限酵素処理し、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとp35遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル（Staratagene社製）に形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌIL１２p35およびp40遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。
（７）発現用遺伝子ベクターへのイヌIFN-γ遺伝子の組込み
実施例１で調製した発現用遺伝子ベクター及びイヌIFN-γ遺伝子をkpnＩおよびXbaＩで制限酵素処理した。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行った。即ち、電気泳動により分離したアガロースゲル上のDNAを、UVランプ照射して目的の遺伝子を確認して、アガロースゲルごと切り出した。その後、geneclean kitにより余分なアガロースを除き、目的遺伝子のみを抽出した。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとイヌIFN-γ遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル(Stratagene社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌIFN-γ遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。次にこの遺伝子ベクターDNAをNcoＩとSse8387Ｉで、イヌIFN-γ遺伝子をNcoＩとPstＩで制限酵素処理し、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとイヌIFN-γ遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル（Staratagene社製）に形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌIFN-γ遺伝子断片を２つ含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。
実施例１で調製した発現用遺伝子ベクター及びイヌIFN-γ遺伝子をkpnＩおよびXbaＩで制限酵素処理した。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行った。即ち、電気泳動により分離したアガロースゲル上のDNAを、UVランプ照射して目的の遺伝子を確認して、アガロースゲルごと切り出した。その後、geneclean kitにより余分なアガロースを除き、目的遺伝子のみを抽出した。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとイヌIFN-γ遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル(Stratagene社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌIFN-γ遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。次にこの遺伝子ベクターDNAをNcoＩとSse8387Ｉで、イヌIFN-γ遺伝子をNcoＩとPstＩで制限酵素処理し、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとイヌIFN-γ遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル（Staratagene社製）に形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌIFN-γ遺伝子断片を２つ含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。
（８）発現用遺伝子ベクターへのヒトActivinAB遺伝子の組込み
実施例１で調製した発現用遺伝子ベクター及びヒトActivinABを構成するinhibinβAをkpnＩおよびXbaＩで制限酵素処理した。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行った。即ち、電気泳動により分離したアガロースゲル上のDNAを、UVランプ照射して目的の遺伝子（inhibinβA遺伝子）を確認して、アガロースゲルごと切り出した。その後、geneclean kitにより余分なアガロースを除き、目的遺伝子のみを抽出した。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとinhibinβA遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル(Stratagene社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりinhibinβA遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。次にこの遺伝子ベクターDNAをNcoＩとSse8387Ｉで、inhibinβB遺伝子をNcoＩとPstＩで制限酵素処理し、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとinhibinβB遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル（Staratagene社製）に形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりinhibinβAおよびinhibinβB遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。
実施例１で調製した発現用遺伝子ベクター及びヒトActivinABを構成するinhibinβAをkpnＩおよびXbaＩで制限酵素処理した。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行った。即ち、電気泳動により分離したアガロースゲル上のDNAを、UVランプ照射して目的の遺伝子（inhibinβA遺伝子）を確認して、アガロースゲルごと切り出した。その後、geneclean kitにより余分なアガロースを除き、目的遺伝子のみを抽出した。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとinhibinβA遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル(Stratagene社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりinhibinβA遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。次にこの遺伝子ベクターDNAをNcoＩとSse8387Ｉで、inhibinβB遺伝子をNcoＩとPstＩで制限酵素処理し、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片をgenecleanIIkit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit verII（宝酒造株式会社製）により16℃、30分の条件下発現用遺伝子ベクターとinhibinβB遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をXL−10 Gold コンピテントセル（Staratagene社製）に形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりinhibinβAおよびinhibinβB遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。
実施例３ イヌIL１２を発現するカイコ組換えウイルスの調製
（１）組み換えウイルスの作製
文献８の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2HＰＯ4、０．７ｍＭ ＮａＨ2PＯ4カらなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献８）のＤＮＡ１０μｇ、実施例２で得られたカイコ発現用組換えベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献８）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢｍＮ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選択した（限界希釈法）。
（１）組み換えウイルスの作製
文献８の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2HＰＯ4、０．７ｍＭ ＮａＨ2PＯ4カらなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献８）のＤＮＡ１０μｇ、実施例２で得られたカイコ発現用組換えベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献８）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢｍＮ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選択した（限界希釈法）。
限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイルスをクローニングした。ここで作製したイヌインターロイキン１２をコードするＤＮＡ（配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８）を含む組換えウイルスをｒＢＮＶCaIL12とした。
（２）組換え体ウイルス液の調製
７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え体ウイルスを含む培養液５０μｌづつをＢｍＮ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。
７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え体ウイルスを含む培養液５０μｌづつをＢｍＮ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。
実施例４ イヌIL12の製造、検出、活性測定
（１）イヌIL12の昆虫細胞での製造
実施例３で得られたウイルス液を１０7倍希釈し、その１ｍｌをＢｍＮ細胞の培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培養基のＢｍＮ細胞にそれぞれウイルス感染が認められた。
（１）イヌIL12の昆虫細胞での製造
実施例３で得られたウイルス液を１０7倍希釈し、その１ｍｌをＢｍＮ細胞の培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培養基のＢｍＮ細胞にそれぞれウイルス感染が認められた。
（２）イヌIL12のカイコでの製造
実施例３で得られたウイルス液を１０倍希釈し、その50μLを５齢カイコに接種し、２７℃で４〜５日間培養を続け、その後カイコを切開し、その体液をイヌIL12を回収した。
実施例３で得られたウイルス液を１０倍希釈し、その50μLを５齢カイコに接種し、２７℃で４〜５日間培養を続け、その後カイコを切開し、その体液をイヌIL12を回収した。
（３）イヌIL１２の検出
上記（１）および（２）により得られた昆虫細胞およびカイコ体液中のイヌIL１２をウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー株式会社製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー株式会社製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗イヌp40ポリクローナル抗体および抗イヌp35ポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬株式会社製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット株式会社製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ株式会社製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約４０ｋＤ、約７５ｋＤおよび約８５ｋＤの３本のバンドが検出された。このうち、約７５ｋＤのバンドが、イヌp40とp35のヘテロダイマーから成るイヌＩＬ１２であり、約４０ｋＤのバンドは、イヌp40モノマー、約８５ｋＤのバンドは、イヌp40ホモダイマーである。
上記（１）および（２）により得られた昆虫細胞およびカイコ体液中のイヌIL１２をウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー株式会社製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー株式会社製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗イヌp40ポリクローナル抗体および抗イヌp35ポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬株式会社製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット株式会社製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ株式会社製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約４０ｋＤ、約７５ｋＤおよび約８５ｋＤの３本のバンドが検出された。このうち、約７５ｋＤのバンドが、イヌp40とp35のヘテロダイマーから成るイヌＩＬ１２であり、約４０ｋＤのバンドは、イヌp40モノマー、約８５ｋＤのバンドは、イヌp40ホモダイマーである。
（４）イヌＩＬ１２の活性測定
上記（１）および（２）で生産されたイヌIL１２の活性測定は以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性を測定した。イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）２５０Ｕを６ｃｍディッシュに添加した。これに上記（１）で得られた培養上清２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）２５０Ｕを加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、文献１０のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、１０7単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。
上記（１）および（２）で生産されたイヌIL１２の活性測定は以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性を測定した。イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）２５０Ｕを６ｃｍディッシュに添加した。これに上記（１）で得られた培養上清２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）２５０Ｕを加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、文献１０のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、１０7単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。
実施例５ イヌIFN-γを発現するカイコ組換えウイルスの調製
（１）組換えウイルスの作製
文献８の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2HＰＯ4、０．７ｍＭ ＮａＨ2PＯ4カらなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献８）のＤＮＡ１０μｇ、実施例２で得られたカイコ発現用組換えベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献８）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢｍＮ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選択した（限界希釈法）。
（１）組換えウイルスの作製
文献８の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2HＰＯ4、０．７ｍＭ ＮａＨ2PＯ4カらなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献８）のＤＮＡ１０μｇ、実施例２で得られたカイコ発現用組換えベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献８）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢｍＮ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選択した（限界希釈法）。
限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイルスをクローニングした。ここで作製したイヌIFN-γをコードするＤＮＡ（配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３）を含む組換えウイルスをｒＢＮＶCaIFN-gとした。
（２）組換え体ウイルス液の調製
７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え体ウイルスを含む培養液５０μｌづつをＢｍＮ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。
７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え体ウイルスを含む培養液５０μｌづつをＢｍＮ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。
実施例６ イヌIFN-γの製造、検出、活性測定
（１）イヌIFN-γの昆虫細胞での製造
実施例５で得られたウイルス液を１０7倍希釈し、その１ｍｌをＢｍＮ細胞の培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培養基のＢｍＮ細胞にそれぞれウイルス感染が認められた。
（１）イヌIFN-γの昆虫細胞での製造
実施例５で得られたウイルス液を１０7倍希釈し、その１ｍｌをＢｍＮ細胞の培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培養基のＢｍＮ細胞にそれぞれウイルス感染が認められた。
（２）イヌIFN-γのカイコでの製造
実施例５で得られたウイルス液を１０倍希釈し、その50μLを５齢カイコに接種し、２７℃で４〜５日間培養を続け、その後カイコを切開し、その体液を回収した。
実施例５で得られたウイルス液を１０倍希釈し、その50μLを５齢カイコに接種し、２７℃で４〜５日間培養を続け、その後カイコを切開し、その体液を回収した。
（３）イヌIFN-γの検出
上記（１）および（２）により得られた昆虫細胞およびカイコ体液中のイヌIFN-γをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー株式会社製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー株式会社製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗イヌIFN-γポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬株式会社製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット株式会社製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ株式会社製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約２０ｋＤ、約４０ｋＤのバンドが検出された。このうち、約４０ｋＤのバンドは、イヌIFN-γホモダイマーである。
上記（１）および（２）により得られた昆虫細胞およびカイコ体液中のイヌIFN-γをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー株式会社製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー株式会社製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗イヌIFN-γポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬株式会社製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット株式会社製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ株式会社製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約２０ｋＤ、約４０ｋＤのバンドが検出された。このうち、約４０ｋＤのバンドは、イヌIFN-γホモダイマーである。
（４）イヌIFN-γの活性測定
上記（１）および（２）で生産されたイヌIFN-γの活性測定は以下のようにして行った。文献１０のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、１０7単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。
上記（１）および（２）で生産されたイヌIFN-γの活性測定は以下のようにして行った。文献１０のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、１０7単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。
実施例７ ヒトActivinABを発現するカイコ組換えウイルスの調製
（１）組換えウイルスの作製
文献８の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2HＰＯ4、０．７ｍＭ ＮａＨ2PＯ4カらなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献８）のＤＮＡ１０μｇ、実施例２で得られたカイコ発現用組換えベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献８）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢｍＮ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選択した（限界希釈法）。
（１）組換えウイルスの作製
文献８の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2HＰＯ4、０．７ｍＭ ＮａＨ2PＯ4カらなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献８）のＤＮＡ１０μｇ、実施例２で得られたカイコ発現用組換えベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献８）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢｍＮ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選択した（限界希釈法）。
限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイルスをクローニングした。ここで作製したヒトActivinABをコードするＤＮＡ（配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９）を含む組換えウイルスをｒＢＮＶhuActとした。
（２）組換え体ウイルス液の調製
７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え体ウイルスを含む培養液５０μｌづつをＢｍＮ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。
７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え体ウイルスを含む培養液５０μｌづつをＢｍＮ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。
実施例８ ヒトActivinABの製造、検出、活性測定
（１）ヒトActivinABの製造
実施例７で得られたウイルス液を１０倍希釈し、その50μLを５齢カイコに接種し、２７℃で４〜５日間培養を続け、その後カイコを切開し、その体液中に分泌されるヒトActivinABを回収する。
（１）ヒトActivinABの製造
実施例７で得られたウイルス液を１０倍希釈し、その50μLを５齢カイコに接種し、２７℃で４〜５日間培養を続け、その後カイコを切開し、その体液中に分泌されるヒトActivinABを回収する。
（２）ヒトActivinABの検出
上記により得られた昆虫細胞の培養上清中のヒトActivinABをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー株式会社製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー株式会社製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトActivinポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬株式会社製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット株式会社製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ株式会社製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約５０ｋＤ、約９０ｋＤ２本のバンドが検出された。このうち、約９０ｋＤのバンドが、ヒトinhibinβAおよびinhibinβBのヘテロダイマーから成るヒトActivinABであり、約５０ｋＤのバンドは、ヒトinhibinβAまたはinhibinβBモノマーある。
上記により得られた昆虫細胞の培養上清中のヒトActivinABをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー株式会社製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー株式会社製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトActivinポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬株式会社製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット株式会社製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ株式会社製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約５０ｋＤ、約９０ｋＤ２本のバンドが検出された。このうち、約９０ｋＤのバンドが、ヒトinhibinβAおよびinhibinβBのヘテロダイマーから成るヒトActivinABであり、約５０ｋＤのバンドは、ヒトinhibinβAまたはinhibinβBモノマーある。
（３）ヒトActivinの活性測定
上記（２）で生産されたヒトアクチビンの活性測定は以下のようにして行った。すなわちアクチビンによるK562細胞のヘモグロビン放出により行った。（文献１１）
96穴プレートにK562細胞（2×105cells/mL）を10%FBSを含むRPMI-1640培地により、（３）で得られたアクチビンを含む培養上清非存在下または存在下、４日間培養を行う。次に細胞をPBSにより２回Washし、滅菌した水50μLに懸濁し、遠心操作により上清画分40μLを得る。得られた上清に0.5mg/mL O-phenylenediamine と0.03%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液200μLを加え、暗下15分処理した。その後2.5M硫酸を50μL加え、490nmの吸光度の測定を行った。その結果、ヒトアクチビン存在下の方の実施サンプルは、非存在下の方のコントロールサンプル（cont）に比べて有意にヘモグロビンの誘導を行った。
〈参考文献〉
１．Maedaら：Proc.Japan.Acad.Ser、B60、423 (1984)
２．Tomitaら：Cytotechnology、17、65(1995)
３．Chirgwinら：Biochemistry、18、5294(1979)．
４．Bergerら：Biochemistry,18,5143(1979).
５．Gublerら：Geen.25,236-269(1983).
６．Okayamaら：Mol.Cell.Biol.,2,161,(1982) &3,280,(1983).
７．Okanoら：J.Interferon & Cytokine Res.,17,713-718(1997).
８．T.Horiuchiら：Agric.Biol.Chem.,51,1573- 1580,(1987).
９．Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Loboratory.New York.1982.
10.F.L.Grabamラ:Virology 54,536(1973).
11.Jennieら：Endcrinology.1993.132.2732-34
上記（２）で生産されたヒトアクチビンの活性測定は以下のようにして行った。すなわちアクチビンによるK562細胞のヘモグロビン放出により行った。（文献１１）
96穴プレートにK562細胞（2×105cells/mL）を10%FBSを含むRPMI-1640培地により、（３）で得られたアクチビンを含む培養上清非存在下または存在下、４日間培養を行う。次に細胞をPBSにより２回Washし、滅菌した水50μLに懸濁し、遠心操作により上清画分40μLを得る。得られた上清に0.5mg/mL O-phenylenediamine と0.03%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液200μLを加え、暗下15分処理した。その後2.5M硫酸を50μL加え、490nmの吸光度の測定を行った。その結果、ヒトアクチビン存在下の方の実施サンプルは、非存在下の方のコントロールサンプル（cont）に比べて有意にヘモグロビンの誘導を行った。
〈参考文献〉
１．Maedaら：Proc.Japan.Acad.Ser、B60、423 (1984)
２．Tomitaら：Cytotechnology、17、65(1995)
３．Chirgwinら：Biochemistry、18、5294(1979)．
４．Bergerら：Biochemistry,18,5143(1979).
５．Gublerら：Geen.25,236-269(1983).
６．Okayamaら：Mol.Cell.Biol.,2,161,(1982) &3,280,(1983).
７．Okanoら：J.Interferon & Cytokine Res.,17,713-718(1997).
８．T.Horiuchiら：Agric.Biol.Chem.,51,1573- 1580,(1987).
９．Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Loboratory.New York.1982.
10.F.L.Grabamラ:Virology 54,536(1973).
11.Jennieら：Endcrinology.1993.132.2732-34
ポリヘドリンプロモーターを有するpBK blueベクターの下流に昆虫由来p10プロモーターを導入した外来タンパク質の発現用遺伝子ベクターを新規に構築した。
本発現用遺伝子ベクターに、２種の外来タンパク質発現遺伝子を同時に組込む事を可能にし、もって宿主を昆虫やカイコとしたとき同時に異なる２種のタンパク質発現させることを可能にした。また、２種の遺伝子（p35およびp40）からなるイヌインターロイキン１２発現用遺伝子ベクターの構築を可能にし、カイコでのイヌインターロイキン１２の発現を可能にした。また、ホモダイマーを形成することにより活性を発揮するイヌIFN-γ、２種のタンパク質のヘテロダイマーを形成することにより活性を発揮するヒトアクチビンについてもイヌIL12同様に発現用ベクターを構築し、カイコでの発現を可能にした。
本発現用遺伝子ベクターに、２種の外来タンパク質発現遺伝子を同時に組込む事を可能にし、もって宿主を昆虫やカイコとしたとき同時に異なる２種のタンパク質発現させることを可能にした。また、２種の遺伝子（p35およびp40）からなるイヌインターロイキン１２発現用遺伝子ベクターの構築を可能にし、カイコでのイヌインターロイキン１２の発現を可能にした。また、ホモダイマーを形成することにより活性を発揮するイヌIFN-γ、２種のタンパク質のヘテロダイマーを形成することにより活性を発揮するヒトアクチビンについてもイヌIL12同様に発現用ベクターを構築し、カイコでの発現を可能にした。
Claims (7)
- 少なくとも２つのプロモーターを有する昆虫発現用遺伝子ベクター。
- 少なくともポリヘドリンプロモーターおよびp10プロモーターを有する昆虫発現用遺伝子ベクター。
- 少なくとも２種の外来タンパク質発現遺伝子を同時に含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の昆虫発現用遺伝子ベクター。
- 配列番号５および配列番号８で示される塩基配列を含むイヌインターロイキン１２発現用遺伝子ベクターであることを特徴とする請求項２に記載の昆虫発現用遺伝子ベクター。
- 請求項１〜４のいずれかに記載の昆虫遺伝子発現ベクターにより作製された遺伝子組換えバキュロウイルスを用いて遺伝子産物を生産することを特徴とする遺伝子産物製造法。
- 遺伝子組換えバキュロウイルスが組換えカイコ核多角体病ウイルスであることを特徴とする請求項５記載の遺伝子産物製造法。
- 遺伝子組換えしたバキュロウイルスをカイコ樹立細胞中またはカイコ生体中で増殖させることを特徴とする請求項５または６記載の遺伝子産物製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004030183A JP2004290182A (ja) | 2003-03-10 | 2004-02-06 | 昆虫発現用遺伝子ベクターおよび遺伝子産物製造法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003062907 | 2003-03-10 | ||
| JP2004030183A JP2004290182A (ja) | 2003-03-10 | 2004-02-06 | 昆虫発現用遺伝子ベクターおよび遺伝子産物製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004290182A true JP2004290182A (ja) | 2004-10-21 |
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ID=33421460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004030183A Withdrawn JP2004290182A (ja) | 2003-03-10 | 2004-02-06 | 昆虫発現用遺伝子ベクターおよび遺伝子産物製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004290182A (ja) |
-
2004
- 2004-02-06 JP JP2004030183A patent/JP2004290182A/ja not_active Withdrawn
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