KR101343682B1 - 개선된 안정성을 갖는 인터류킨-１２ｐ４０ 변이체 - Google Patents

개선된 안정성을 갖는 인터류킨-１２ｐ４０ 변이체 Download PDF

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Abstract

변형 인터류킨-12(IL-12) p40 폴리펩티드가 개시된다. 상기 변형 폴리펩티드는 위치 Lys260 과 Arg261 사이의 단백질분해효소 부위를 제거하기 위해 IL-12 p40 소단위 내에 변형을 갖는다. 본 발명에 따른 상기 변형 IL-12 p40 폴리펩티드는 야생형 성숙 인간 IL-12 p40 폴리펩티드에 비해 개선된 안정성을 갖는다.

Description

개선된 안정성을 갖는 인터류킨-１２Ｐ４０ 변이체{INTERLEUKIN-12P40 VARIANTS WITH IMPROVED STABILITY}
본 발명은 일반적으로 안정성을 개선시키기 위해 변형된, IL-12 p40 을 함유하는 융합 단백질을 포함하는, IL-12 p40 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 IL-12 p40 단백질은 p40 소단위 내의 Lys260 및 Arg261 의 영역에서 단백질분해 부위를 제거한다.
인터류킨-12(IL-12)는 식세포, B 세포 및 활성 수지상 세포를 포함하는 면역계의 다양한 세포에 의해 감염에 대한 반응으로 생산되는 염증성 시토카인이다(Colombo and Trinchieri (2002), Cytokine & Growth Factor Reviews, 13: 155-168). IL-12 는 면역계의 선천적 및 후천적 병기의 상호작용을 매개하는 데 필수적인 역할을 하며, T-세포 및 자연 살생(NK) 세포에 대해 작용하고, 세포독성 림프구의 증식 및 활성 및 다른 염증성 시토카인, 특히 인터페론-γ(IFN-γ)의 생산을 증강시킨다.
IL-12 는 디설피드 가교에 의해 공유적으로 연결되어 생물학적 활성 74 kDa 이형이합체를 형성하는 α-사슬(p35 소단위, IL-12 p35) 및 β-사슬(p40 소단위, IL-12 p40)로 구성된 이형이합체 분자이다. 성숙 (야생형) 인간 IL-12 의 IL- 12 p35 및 IL-12 p40 의 아미노산 서열이 도 1 (SEQ ID NO:1) 및 2 (SEQ ID NO:2)에 각각 나타난다.
인터류킨-23(IL-23)은 독특한 α 사슬(p19 소단위, IL-23 p19)을 갖는다는 점을 제외하고는 IL-12 와 동일한 β 사슬 IL-12 p40 을 갖는다는 점에서 IL-12 와 가깝게 연관된 디설피드-가교된 이형이합체 분자이다(Oppmann et al., (2000), Immunity, 13: 715-725). IL-12 와 같이, IL-23 은 식세포 및 활성 수지상 세포에 의해 생산되고, 일련의 염증성 세포의 동원 및 활성화에 관여하는 것으로 생각된다(Langrish et al., (2004) Immunol. Rev., 202: 96-105). 성숙 인간 IL-23 의 IL-23 p19 의 아미노산 서열이 도 3 (SEQ ID NO:3)에 나타난다.
면역 세포가 생물학적 활성 IL-12 또는 IL-23 이형이합체를 분비하기 위해서는, 동일 세포 내에서 α 및 β 소단위의 동시 발현이 요구된다. 면역 세포에 의한 IL-12 p35 또는 IL-23 p19 의 단독 분비가 관찰되지 않는 것에 반하여, 생물학적 활성 IL-12 또는 IL-23 이형이합체를 생산하는 세포는 자유 형태의 p40 소단위를 이형이합체보다 10 내지 100 배 많이 분비한다(D'Andrea et al . (1992), J. Exp. Med ., 176: 1387-98, Oppmann et al., (2000), Immunity, 13: 715-725 ). 또한, 마우스에서, 심지어 α 소단위가 부존재하는 경우에도, 세포가 생물학적 활성 IL-12 p40 동형이합체를 생산할 수 있음이 관찰되었다(Hikawa et al . (2004), Neuroscience, 129: 75-83).
내인성 IL-12 의 존재는, 이식된 및 화화적으로 유도된 종양에 대해서 뿐만 아니라 다양한 병원체에 대한 면역 저항을 위해서도 필수적인 것으로 나타났 다(Gateley et al. (1998), Annu . Rev . Immunol ., 16: 495-521). IL-12 는 IFN-γ 의 유도 및 CD8+ T-세포 및 NK 세포와 같은 효과기 세포의 활성화에 기초한 잠재적 항종양 활성을 갖는 것으로 증명되었다(Brunda et al. (1993), J. Exp . Med., 178: 1223-30). 증명된 항종양 활성의 결과로서, IL-12 는 인간 임상 시험에서 신장암, 결장암, 난소암, 흑색종 및 T-세포 림프종을 포함하는 다양한 암의 치료를 위한 면역치료제로서(Atkins et al. (1997), Clin . Cancer Res ., 3: 409-17; Gollob et al. (2000), Clin . Cancer Res., 6: 1678-92; 및 Hurteau et al. (2001), Gynecol . Oncol., 82: 7-10) 및 암 백신을 위한 아주반트로서(Lee et al. (2001), J. Clin . Oncol . 19: 3836-47) 시험되었다.
IL-12 또는 IL-23 에 있어서, 바르게 폴딩되고 생물학적 활성인 이형이합체 형태의 재조합 단백질의 생산은 생산 세포주 내에서 α 소단위 및 IL-12 p40 둘다의 동시 발현을 요구한다. 그러나, 정제된 재조합 단백질은 IL-12 p40 의 C-말단 영역 내의 단백질분해 절단의 결과인 어느 정도의 이질성을 나타낸다. IL-12 또는 IL-23 단백질의 불안정성은 치료제로서의 임상적 이용 및 생산에 있어서 문제들을 발생시킬 수 있다. 그러므로, 본 기술분야에서는 단백질분해 절단에 대해 더욱 저항성인 동질 단백질을 산출하는 개선된 재조합 IL-12 또는 IL-23 에 대한 요구가 있다.
발명의 요약
본 발명은 야생형 IL-12 p40 단백질에 비해 개선된 안정성을 갖는 인간 IL-12 p40 소단위의 변이체(p40 변이체)를 제공한다. 상기 p40 변이체에 있어서, 일반적으로 단백질분해 절단에 대해 민감한 C-말단 영역이 단백질분해효소에 의한 분해에 더욱 저항성이도록 공작된다. 특히, 본 발명의 p40 변이체는 변이 단백질을 면역원성으로 만들고 인간의 항체 반응을 유발할 수 있는 잠재적 T-세포 에피토프의 생성을 회피하기 위한 목적으로 D3 도메인 내에 공작된 아미노산 변형을 포함한다. 결과로서, 본 발명의 p40 변이체는 그의 생산, 제형화 및 약동학과 관련하여 야생형 IL-12 p40 단백질에 비해 치료제로서 개선된 특성을 갖는다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 야생형 인간 IL-12 p40 D3 도메인과 85 % 이상의 동일성을 가지고, 성숙 인간 IL-12 p40 의 잔기 258-266 에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 변형을 포함하는, 인간 IL-12 p40 D3 도메인의 변이체(D3 변이체)를 제공한다. 본 발명의 특정 구현예는, 부분적으로, 본 발명에 따른 아미노산 변형 또는 변형들이 Lys260 과 Arg261 사이의 단백질분해 부위를 제거하는 특별한 이점을 갖는다는 인식에 기초한다.
본 발명에 따라서, 잔기 258-266 에 상응하는 하나 이상의 위치에 대한 아미노산 변형은 결손, 치환 또는 삽입일 수 있다. 더욱이, 염기성 아미노산을 비염기성 아미노산으로 치환하는 아미노산 치환이 본 발명에 따른 변이체를 생성하는 데 이용될 수 있다.
특히, 본 발명의 D3 변이체는 Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys 264, Asp265 및 Arg266 으로 이루어진 군에서 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 변형은 단독으로 또는 조합으로 상기 구조적 및/또는 기능적 변화를 유도하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들 어, D3 변이체는 하기 치환을 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상 함입할 수 있다: Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Ala, Lys260Asn, Lys260Gln, Lys260Gly, Arg261Ala, Arg261Asp, Arg261Thr, Lys263Gly, Lys263Ser 및/또는 Lys264Gly.
일부 구현예에서, 상기 치환이 위치 Lys260 이다. 그 치환은 Lys260 을 비염기성 아미노산, 예를 들어, Ala, Asn, Gln 또는 Gly 로 치환할 수 있다. Lys260 에 더하여 추가적 치환이 Ser259 및 Arg261 에서 발생할 수 있다. 특히, 본 발명의 일부 D3 변이체는 치환 Ser259Asp, Lys260Asn 및 Arg261Thr 을 함입한다. 추가적 구현예에서, 본 발명의 D3 변이체는 치환 Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr 및 Lys264Gly 을 함입하는 한편, 임의로 Lys263 및 Asp265 을 결손한다. 대안적으로, 본 발명의 D3 변이체는 치환 Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr 및 Lys264Gly 을 함입하는 한편, Lys263, Lys264 및 Asp265 를 결손한다.
본 발명에 따른 다른 구현예에서, Lys260 을 치환하는 치환을 포함하는 D3 변이체는 대안적으로 Lys258, Ser259, Arg261, Lys263 및 Lys264 중 하나 이상에서 추가적 치환을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, D3 변이체는 치환 Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp, 및 임의로 Lys263Ser 및 Lys264Gly 을 포함한다.
추가적 구현예에서, Ser259, Lys260 및 Arg261 에서의 치환에 더하여, Lys263, Lys264, Asp265 및 Arg266 에 상응하는 잔기 중 하나 이상이 결손되는 한편, 또다른 구현예에서 Lys263, Lys264, Asp265 및 Arg266 중 하나 이상이 비염기성 아미노산으로 치환된다. 추가적 구현예에서, Lys264 에서의 치환이 Lys264Gly 이고, 임의로 Lys263 및 Asp265 가 결손된다. 본 발명의 다른 D3 변이체는 치환 Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr 및 Lys264Gly, 그리고 임의로, Lys263, Asp265 및 Arg 266 에 상응하는 잔기의 결손을 함입한다.
본원에 기술된 D3 변이체를 함입하는 p40 변이체 및 그의 활성 부위가 본 발명의 범위 내임이 당업자에 의해 이해될 것이다. 유사하게, p40 변이체를 함유하는 IL-12 단백질 및 그의 활성 부위(IL-12 변이체)도 또한 본 발명의 범위 내이다. 본 발명은 항체 모이어티, 비-IL-12 시토카인 또는 그의 활성 부위로 이루어진 군에서 선택되는 모이어티 및 본 발명의 IL-12 변이체를 포함하는 융합 단백질을 추가로 포함한다.
유사하게, p40 변이체를 함유하는 IL-23 단백질 및 그의 활성 부위(IL-23 변이체)도 또한 본 발명의 범위 내이다. 본 발명은 항체 모이어티, 비-IL-23 시토카인 또는 그의 활성 부위로 이루어진 군에서 선택되는 모이어티 및 본 발명의 IL-23 변이체를 포함하는 융합 단백질을 추가로 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 D3 변이체, p40 변이체, IL-12 변이체 및 IL-23 변이체 중 임의를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 세포, 예를 들어, 원핵 세포를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 상기 D3 변이체, p40 변이체, IL-12 변이체, IL-23 변이체 및 이들 모이어티를 함유하는 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
다시 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 변이체 및 동일한 것을 코딩하는 핵산을 이용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 p40 변 이체 또는 그의 활성 부위를 치료적 유효량으로 환자에게 투여함을 포함하는 환자 치료 방법을 포함한다.
본 발명 그자체 뿐만 아니라 본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점이 이하 도면, 상세한 설명 및 청구항으로부터 더욱 완전히 이해될 것이다.
요약하면 본 발명은 하기에 관한 것이다:
·야생형 인간 IL-12 p40 D3 도메인과 85 % 이상의 서열 동일성을 가지고, 모체 성숙 인간 IL-12 p40 의 위치 258-266 의 잔기에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 변형을 포함하는, IL-12 p40 D3 도메인의 변이체.
·상기 변형이 Lys260 과 Arg261 사이의 단백질분해효소 부위를 제거하는, 상응하는 변이체.
·상기 변형이 치환 또는 결손인, 상응하는 변이체.
·상기 변형이 Lys258, Lys260, Lys263 및 Lys264 로 이루어진 군에서 선택되는 치환인, 상응하는 변이체.
·하기 아미노산 치환 중 하나 이상이 선택되는, 상응하는 변이체:
Lys258Gln,
Lys260Ala, Lys260Asn, Lys260Gln, Lys260Gly,
Lys263Gly, Lys263Ser 및 Lys264Gly.
·상기 치환이 적어도 위치 Lys260 에서 있는, 상응하는 변이체.
·상기 치환이 염기성 아미노산을 Ala, Asn, Gln 또는 Gly 로 이루어진 군에서 선택되는 비염기성 아미노산으로 치환하는, 상응하는 변이체.
·위치 Ser259, Arg261 또는 Arg 266 에서 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는, 상응하는 변이체.
·상기 치환이 Ser259 및 Arg261 인, 상응하는 변이체.
·상기 치환이 Ser259Asp, Lys260Asn 및 Arg261Thr 인, 상응하는 변이체.
·치환 Lys264Gly 을 추가로 포함하는, 상응하는 변이체.
·잔기 Lys263 및 Asp265 중 하나 또는 둘다가 추가로 결손된, 상응하는 변이체.
·Lys263, Lys264, Asp 265 및 Arg266 에 상응하는 하나 이상의 잔기가 결손된, 상응하는 변이체.
·하기로 이루어진 군에서 선택되는 치환 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 상응하는 변이체:
Lys263, Lys264, Asp 265 및 Arg266(여기서 상응하는 원시 아미노산 잔기가 비염기성 아미노산에 의해 치환됨).
·하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는, 상응하는 변이체:
Lys258, Ser259, Arg261, Lys263 및 Lys264.
·상기 치환이 Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln 및 Arg261Asp 인, 상응하는 변이체.
·치환 Lys263Ser 및 Lys264Gly 을 추가로 포함하는, 상응하는 변이체.
·특히 하기를 포함하는, 상응하는 변이체:
(i) 다음의 치환: Ser259Asp, Lys260Asn 및 Arg261Thr, 및
(ii) 다음의 결손: Lys263, Lys264 및 Asp265
(여기서 상기 위치는 미변형 야생형 분자에 관한 것이고, 따라서 서열 트랙: Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Arg 을 변이체의 위치 258 - 263 에서 형성함).
·특히 하기를 포함하는, 상응하는 변이체:
(i) 다음의 치환: Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr 및 Lys264Gly, 및
(ii) 다음의 결손: Lys263 및 Asp265
(여기서 상기 위치는 미변형 야생형 분자에 관한 것이고, 따라서 서열 트랙: Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Gly - Arg 을 변이체의 위치 258 - 264 에서 형성함).
·하기 치환을 포함하고:
Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp,
따라서 서열 트랙: Gln - Asp - Gln - Asp - Glu - Lys - Lys - Arg 을 변이체의 위치 258 - 265 에서 형성하는, 상응하는 변이체.
·하기 치환을 포함하고:
Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp, Lys263Ser, Lys264Gly,
따라서 서열 트랙: Gln - Asp - Gln - Asp - Glu - Ser- Gly - Arg 을 변이체의 위치 258 - 265 에서 형성하는, 상응하는 변이체.
·상기 및 하기와 같은 변이체를 함유하는, IL-12 단백질, 또는 그의 조각.
·상기 및 하기와 같은 변이체를 함유하는, IL-23 단백질, 또는 그의 조각.
·기술된 바와 같은 변이체, 또는 IL-12 또는 IL-23 단백질, 및 항체 또는 그의 활성 부위를 포함하는, 융합 단백질.
·상기 변이체 또는 상기 단백질이 상기 항체 또는 그의 활성 부위의 C-말단에, 바람직하게는 상기 항체의 Fc 부분에 융합되고, 상기 항체가 종양 항원, 예컨대 KS(EpCam) 또는 14.18, 또는 종양 조직 상에 과발현된 수용체, 예컨대 HER2 또는 EGFR 또는 VEGFR 을 표적화하는, 상응하는 융합 단백질.
·상기 또는 하기와 같은 변이체, 또는 IL-12 또는 IL-23 단백질, 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 또는 DNA 분자.
·상기 핵산을 포함하는 발현 벡터.
·기술된 바와 같은 변이체 또는 IL-12 또는 IL-23 단백질 또는 융합 단백질을 생산하는 숙주 세포.
·상기 변이체, IL-12 또는 IL-23 단백질, 또는 상기 변이체 또는 IL-12 또는 IL-23 단백질을 포함하는 융합 단백질을, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 희석제 또는 부형제와 함께, 또는 조합 치료 요법으로 다른 약학적 유효 약물과 함께, 약학적 유효량으로 포함하는, IL-12 또는 IL-23 유발 질병의 치료에 적합한 약학 조성물.
·상기 약학 조성물 또는 그의 유효 성분의 암 또는 자가면역 질환 치료용 약제의 제조를 위한 용도.
도 1 은 성숙 (야생형) 인간 IL-12 의 α 사슬, 즉 p35 소단위의 성숙 아미 노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:1).
도 2 는 성숙 (야생형) 인간 IL-12 의 β 사슬, 즉 p40 소단위의 성숙 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:2). 위치 211-306 에 상응하는 도메인 D3 은 이탤릭체이고(SEQ ID NO:26), 위치 258-266 에 상응하는 펩티드 조각은 밑줄쳐 있고(SEQ ID NO:5), Lys260 및 Arg261 은 굵은 글씨체이다.
도 3 은 성숙 (야생형) 인간 IL-23 의 α 사슬, 즉 p19 소단위의 성숙 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:3).
도 4A 는 항체 융합 단백질로서 생산된 인간 IL-12 의 몇몇 정제된 배치에 대한 SDS-PAGE 겔을 나타내는 한편(레인 1 - 8), 도 4B 는 항체 융합 단백질로서 생산된 인간 IL-23 의 몇몇 정제된 배치에 대한 SDS-PAGE 겔을 나타낸다(레인 1 - 3). IL-12 p35 및 IL-23 p19 소단위는 항체 중쇄에 공유적으로 부착된다. 6kD 밴드는 화살표로 지시된다. 분자량(kD)이 마커들에 대해 지시된다(레인 M)
도 5 는 성숙 (야생형) 인간 IL-12 p40 소단위의 C-말단 펩티드 조각의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 조각은 Arg261 에서 시작한다(SEQ ID NO:4).
도 6 은 성숙 (야생형) 인간 IL-12 p40 소단위의 위치 258-266 에 상응하는 펩티드 조각의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:5).
도 7A 및 7B 는 인간, 개코원숭이(Papio anubis 파피오 아누비스), 붉은털원숭이(Macaca mulatta 마카카 물라타), 망가베이(Cercocebus torquatos 세르코세부스 토르쿠아토스), 개(Canis familiaris 카니스 파밀리아리스), 고양이(Felis catus 펠리스 카투스), 말(Equus caballus 에쿠우스 카발루스), 돼지(Sus scrota 수스 스크로타), 소(Bos Taurus 보스 타우루스), 염소(Capra hircus 카프라 히르쿠스), 양(Ovis aries 오비스 아리에스), 사슴(Cervus elaphus 세르부스 엘라푸스), 물소(Bubalus bubalis 부발루스 부발리스), 햄스터(Mesocricetus auratus 메소크리세투스 아우라투스), 기니피그(Cavia porcellus 카비아 포르셀루스), 면 랫트(Sigmodon hispidus 시그모돈 히스피두스), 랫트(Rattus norvegicus 라투스 노르베기쿠스) 및 마우스(Mus musculus 무스 무스쿨루스)를 포함하는 다양한 포유류로부터의 IL-12 p40 소단위의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 굵은 글씨체의 두 개의 아미노산은 단백질분해 절단 부위를 지시한다.
도 8 은 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V1 로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:6). 공작된 서열이 밑줄쳐 있다.
도 9 는 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V2 로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID N0:7). 공작된 서열이 밑줄쳐 있다.
도 10 은 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V3 으로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:8). 공작된 서열이 밑줄쳐 있다.
도 11 은 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V4 로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:9). 공작된 서열이 밑줄쳐 있다.
도 12 는 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V5 로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:10). 변형이 밑줄쳐 있다.
도 13 은 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V6 으로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:11). 변형이 밑줄쳐 있다.
도 14 는 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V7 로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:12). 변형이 밑줄쳐 있다.
도 15 는 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V8 로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:13). 변형이 밑줄쳐 있다.
도 16 은 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V9 로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:14). 변형이 밑줄쳐 있다.
도 17 은 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V10 으로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:15). 변형이 밑줄쳐 있다.
도 18 성숙 인간 IL-12 p40 소단위의, 본원에서 p40V11 로 언급된, 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:16). 변형이 밑줄쳐 있다.
도 19 는 전장 (야생형) 인간 IL-12 p40 소단위를 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:21).
도 20 은 p40 변이체 p40V1 및 p40V2 의 부위를 코딩하는, 본원에서 V1V2 로 언급된, 합성 뉴클레오티드 조각의 핵산 서열을 나타낸다. V1V2 조각은 SEQ ID NO:17 을 코딩하는 영역(밑줄친 부분)을 포함하는 V1 조각을 포함한다. 링커 서열(소문자), 및 이어서, SEQ ID NO:18 을 코딩하는 영역(밑줄친 부분)을 포함하는 V2 조각이 이를 뒤따른다.
도 21 은 p40 변이체 p40V3 및 p40V4 의 부위를 코딩하는, 본원에서 V3V4 로 언급된, 합성 뉴클레오티드 조각의 핵산 서열을 나타낸다. V3V4 조각은 SEQ ID NO:19 를 코딩하는 영역(밑줄친 부분)을 포함하는 V3 조각을 포함한다. 링커 서열(소문자), 및 이어서, SEQ ID NO:20 을 코딩하는 영역(밑줄친 부분)을 포함하는 V4 조각이 이를 뒤따른다.
도 22 는 p40 변이체 p40V5 및 p40V6 의 부위를 코딩하는, 본원에서 V5V6 으로 언급된, 합성 뉴클레오티드 조각의 핵산 서열을 나타낸다. V5V6 조각은 Arg261Ala 을 코딩하는 코돈 치환(밑줄친 부분)을 포함하는 V5 조각을 포함한다. 링커 서열(소문자), 및 이어서, Lys260Ala 및 Arg261Ala 을 코딩하는 코돈 치환(밑줄친 부분)을 포함하는 V6 조각이 이를 뒤따른다.
도 23 은 p40 변이체 p40V7 및 p40V8 의 부위를 코딩하는, 본원에서 V7V8 로 언급된, 합성 뉴클레오티드 조각의 핵산 서열을 나타낸다. V7V8 조각은 Lys260Ala 을 코딩하는 코돈 치환(밑줄친 부분)을 포함하는 V7 조각을 포함한다. 링커 서열(소문자), 및 이어서, Lys260Gly 을 코딩하는 코돈 치환(밑줄친 부분)을 포함하는 V8 조각이 이를 뒤따른다.
도 24 는 다클론성 항-hu-p40 항체에 의한 웨스턴 블롯이다. 야생형 IL-12 p40 및 IL-12 p40 변이체(V1-V4)로 형질주입된 세포의 상청액을 수집하고 SDS-PAGE 겔 상에서 수행했다. IL-12 p40 변이체 p40V1, p40V2, p40V3 및 p40V4 각각의 두 개의 독립 클론(a, b)을 시험했다. 화살표는 C-말단 조각을 결여한 절단된 IL12p40 의 밴드를 지시한다(레인 p40 wt).
도 25 는 p40 변이체 p40V1, p40V2, p40V3, p40V4, p40V5, p40V6, p40V7, p40V8, 및 야생형 p40 을 함유하는 항체-IL12 융합 단백질에 대한 SDS-PAGE 겔을 나타낸다(레인 1-9). 제일 위쪽의 주요 밴드는 항체 중쇄와 p35 소단위 사이의 융합 단백질을 나타내고, 아래쪽의 주요 밴드는 항체 경쇄를 나타낸다. 6 kDa 밴드는 레인 5 를 제외하고는 변이 단백질의 어떤 레인에서도 탐지되지 않았다. 분자량(kD)이 마커들에 대해 지시된다(레인 M).
도 26 은 항체-(야생형)-IL12 융합 단백질에 비교하여 정맥내 투여된 p40 변이체 p40V1-p40V8 을 함유하는 항체-IL12 융합 단백질의 약동학 데이터를 나타낸다.
도 27A 는 항체-(야생형)-IL12 융합 단백질(판넬 A)에 비교하여 p40 변이체 p40V1-p40V4 를 함유하는 항체-IL12 융합 단백질의 약동학 데이터를 나타내고, 도 27B 는 항체-(야생형)-IL12 융합 단백질(판넬 B)에 비교하여 피하 투여된 p40 변이체 p40V5-p40V8 을 함유하는 항체-IL12 융합 단백질의 약동학 데이터를 나타낸다.
도 28 은 단백질의 D3 영역 바깥쪽에서 돌연변이를 갖는 IL-12 p40 변이체이다.
본 발명은 야생형 단백질에 비해 개선된 안정성을 갖는 시토카인 인터류킨-12(IL-12) p40 소단위의 변이체를 기술한다. 상기 변이체에서, 일반적으로 구조화되지 않고 단백질분해 절단에 민감한 p40 소단위 영역이 단백질분해 절단에 더욱 저항성이도록 돌연변이된다. 도메인 D3 내의 상기 영역은 p40 소단위의 C-말단 근처이고, 성숙 인간 p40(p40(258-266))의 아미노산 258-266 에 상응하는 폴리펩티드 스트레치를 포함한다.
IL-12 p40 소단위는 또한 시토카인 인터류킨-23(IL-23)의 구성 소단위이다. IL-23 은 두 개의 소단위, α 소단위 "p19" 및 β 소단위 "p40" 을 갖는다. IL-23 의 p40 소단위는 IL-12 p40 과 동일하다. 그러므로, IL-12 p40 소단위의 변이체는 IL-23 p40 소단위의 변이체와 마찬가지이다.
한 일반적 종류의 구현예에서, 절단 부위를 제거하기 위해, 인간 p40 의 Lys260 과 Arg261 사이의 부위에 상응하는, 아미노산 잔기 258-266 에 상응하는 p40 영역 내로 하나 이상의 돌연변이가 도입된다. 추가적 구현예에서, 모델링에 의해 더욱 빈틈없이 폴딩된 구조를 생성하는 상기 영역 내로 특정 돌연변이가 도입된다. 본 발명의 또다른 측면에서, 추가적으로 도입된 돌연변이는 p40 소단위의 공작된 영역을 면역원성으로 만드는 것을 회피할 것으로 예측된다. 예를 들어, p40 소단위의 공작된 영역 내의 아미노산 치환이 인간에서 잠재적 T-세포 에피토프로서 인지될 수 있는 펩티드의 생성을 회피하도록 선택된다.
돌연변이가 아미노산 잔기 258-266 에 상응하는 p40 영역 내로 다양한 메커니즘에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 한 아미노산 잔기의 또다른 잔기에 의한 치환에 의해 돌연변이 또는 돌연변이들이 도입된다. 추가적 구현예에서, p40 소단위의 하나 이상의 잔기의 결손에 의해 돌연변이 또는 돌연변이들이 도입된다. 다시 또다른 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 p40 소단위 내로의 삽입에 의해 돌연변이 또는 돌연변이들이 도입된다.
한 구현예에서, 본 발명의 p40 변이체가 단백질 조성물 예컨대 IL-12 단백질, IL-12 융합 단백질, IL-23 단백질, IL-23 융합 단백질 또는 p40 동형이합체 내에 함유된다. 예를 들어, 한 구현예에서, IL-12 단백질은 본 발명에 따른 p35 소단위 및 p40 변이체를 함유한다. 또다른 구현예에서, IL-23 단백질은 본 발명에 따른 p19 소단위 및 p40 변이체를 함유한다. 추가적 구현예에서, 융합 단백질은 IL-12 p40 변이체를 함유하는 IL-12 에 융합된 항체 부위를 함유한다. 더 추가적 구현예에서, 융합 단백질은 IL-12 p40 변이체를 함유하는 IL-23 에 융합된 항체 부분을 함유한다. 추가적 구현예에서, 융합 단백질의 항체 부위는 완전한(intact) 항체, Fc 영역, sc-Fv, 항체의 항원 결합 부위, 또는 항체의 활성 조각이다. 다시 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 비-IL-12 또는 비-IL-23 시토카인 또는 그의 활성 부위에 융합된 IL-12 p40 변이체를 포함한다.
본 발명의 추가적 측면에서, 본 발명의 p40 변이체 중 하나를 함유하는 단백질 조성물은 상응하는 야생형 단백질보다 더 긴 순환 반감기를 갖는다. 따라서, 야생형 p40 소단위를 함유하는 IL-12 또는 IL-23 단백질과 비교하여, 본 발명의 공작된 p40 소단위를 포함하는 IL-12 변이체 또는 IL-23 변이체는 그의 생산, 제형화 또는 약동학과 관련하여 치료제로서 개선된 특성을 갖는다.
추가적 구현예에서, IL-12 p40 아미노산 서열에 대한 돌연변이가 IL-12 p40(258-266) 영역 바깥쪽 및 임의로 IL-12 p40 의 IL-12 p40 D3 도메인 바깥쪽에 도입된다. 상기 돌연변이는 IL-12 p40 의 D3 도메인 내의 다른 곳에 도입될 수 있고 다른 도메인 내에 도입될 수도 있다. 예를 들어, 도 28 은 잔기 258-266 의 바깥쪽 아미노산 서열에서 변형을 갖는 IL-12 의 p40 소단위의 서열을 나타낸다. 그 내용이 본원에 참조로 인용된 Leong et al ., (2003), Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 100:1163-1168 은 258-266 영역 밖의 IL-12 p40 아미노산 서열에서 돌연변이될 수 있는 다양한 잔기를 기술한다. 또한, IL-12 p40 의 3차원 결정 구조가 공지되고(Yoon et al ., (2000), EMBO J., 19:3530-3541, 그 내용이 본원에 참조로 인용됨), IL-12 의 p40 소단위와 p35 소단위의 상호작용에 필수적인 잔기가 공지되었기 때문에, p40 소단위의 기능성을 파괴하지 않을 다른 돌연변이의 선택이 당업자에 의해 결정가능하다.
절단 생성물의 결정
본 발명은 부분적으로 IL-12 p40 소단위가 특정 단백질분해 절단 사건에 민감하다는 관찰, 및 절단 부위를 결정하는 신규한 실험 결과에 기초한다. 실시예 2 에 기술된 바와 같이 NS/0 세포 내에서 생산된 정제된 재조합 IL-12 단백질은, 그 재조합 단백질이 SDS-PAGE 겔 상에서 환원 조건 하에 전기 영동에 의해 분리되었을 때, 대략 6 kD 분자량의 추가적 단백질 밴드로서 뚜렷하게 볼 수 있었고, 어느 정도의 이질성을 일관되게 나타냄이 발견되었다. 재조합 IL-23 단백질에 대해서도 유사한 관찰을 했다. 이것은 항체 융합 단백질로서 생산된 인간 IL-12(판넬 A) 및 인간 IL-23 단백질 조성물(판넬 B)의 몇몇 정제된 배치들에 대한 SDS-PAGE 겔을 나타내는 도 4 에서 설명된다.
실시예 3 에 기술된 바와 같이 오염물질을 정제하고 그의 아미노산 서열을 결정했고, Lys260 과 Arg261 사이의 단백질분해 절단에 의해 생성된 IL-12 p40 소단위 자체의 C-말단 46 아미노산 조각의 서열에 상응한다는 것이 발견되었다(도 5-SEQ ID NO:4). Lys260 과 Arg261 사이의 절단은 그 절단 부위(...KSKREKKDR... (도 6-SEQ ID NO:5) 여기서 Lys260 및 Arg261 은 굵은 글씨체로 지시되었음)를 둘러싼 영역 내의 염기성 아미노산의 우세에도 불구하고 매우 선호되는 것으로 보인다. 그러나, p40 소단위로부터 절단되었음에도 불구하고, C-말단 펩티드 조각은 p40 소단위의 나머지와 비공유적으로 연관된 채로 유지되고, 재조합 단백질의 추가적 정제에 의해 결과적 이질성을 제거하는 것을 곤란하게 만든다.
L-12 p40 단백질
성숙 인간 p40 소단위는 도메인 D1, D2 및 D3 으로 구성된 가용성 클래스 I 시토카인 D 수용체와 유사한 306 아미노산 단백질이다. 절단 부위(Lys260 과 Arg261 사이)는, I211 에서 S306 까지의 영역을 포함하는 96 개 아미노산의 피브로넥틴 유형 III 도메인인, D3 내에 있다. 성숙 인간 IL-12 p40 소단위에 대한 서열이 도 2 에 제시된다. D3 에 대한 아미노산 서열이 도 2 에서 이탤릭체로 제시된다. 인간 IL-12 이형이합체의 공개된 X-선 결정 구조에서(Yoon et al. (2000), EMBO J., 19: 3530-41), D3 도메인의 인간 p40(258-266) 영역 내 루프의 일부가 해명되지 않았다. 이론에 구속되는 것을 바라지 않으면서, 결정 구조 내의 미해명 영역은 흔히 가변성, 구조화되지 않은 루프의 표지이고, 단백질분해에 대한 표적 부위를 구성할 수 있다.
다양한 포유류 종으로부터의 성숙 p40 소단위의 1차 구조 정렬이 도 7A 및 7B 에 제시되고, 하기를 포함한다: 인간; 영장류 개코원숭이, 붉은털원숭이 및 망가베이; 개; 고양이; 말; 돼지; 반추동물 소, 염소, 양, 사슴, 물소; 및 설치류 햄스터, 기니피그, 면 랫트, 랫트 및 마우스. 정렬에서 p40(258-266) 주위 영역은, 특히 그 길이와 관련하여, 서열 다양성을 나타낸다. 특히, 일부 종, 그중에서도 반추동물에서 서열이 더욱 짧고, 다른 종에서 예컨대 설치류에서 서열이 어떤 경우에는 추가적 삽입(insert)을 함유할 수 있다. 많은 종에서, 인간 p40 K260R261 에 상응하는 디펩티드 모티브가 동일하게 또는 두개의 염기성 아미노산을 나타내도록 보존된다. 이들 종은 농업적 및 상업적으로 중요한 종이며, 말, 소, 염소, 돼지 및 양을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 결과적으로, 인간 IL-12 p40 의 잔기 258-266 에 상응하는 비-인간 IL-12 p40 의 영역 내로, 인간 IL-12 p40 에 관하여 본원에서 기술된 돌연변이와 유사한 하나 이상의 돌연변이를 도입하는 것이, K260R261 절단 부위에서의 비-인간 IL-12 p40 의 단백질분해 절단을 감소 또는 제거하는 데 유용함이 증명될 수 있다.
원칙적으로, 본 발명에 따라, 인간 또는 다른 이종 유기체 내의 인간 IL-12 p40 K260R261 에 상응하는 양전하를 띤 디펩티드 모티브를 결여하는 종으로부터 IL-12 p40 변이체를 이용하는 것이 가능하다. 그러나, 본 발명의 실시에 있어서, IL-12 p40 의 비-인간 형태가 인간에 투여되는 경우 일반적으로 항-p40 항체를 유도할 것임을 유의하는 것이 중요하다. 더 널리, 한 종으로부터 또다른 종으로 p40 을 투여하는 것은 최선이 아니다. 또한, 다양한 비-인간 p40 소단위가 단백질분해 절단될 잠재성은 일반적으로 안알려져 있다. 또한, p35 또는 p19 와 같은 소단위와의 조립 단계에서 또는 수용체 소단위와의 상호작용 단계에서, 한 종으로부터의 p40 소단위는 또다른 종에서는 기능하지 않을 수 있다.
변이체 IL -12 p40 단백질
본 발명은 안정성을 개선시키는 D3 도메인 내 돌연변이를 갖는 변이체 IL-12 p40 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "D3 변이체" 는 야생형 D3 과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는, 예를 들어 IL-12 또는 IL-23 의 인간 p40 소단위의 D3 도메인을 언급한다. 용어 "p40 변이체" 는 본원에서 D3 도메인 내에 돌연변이를 갖는, 예를 들어 IL-12 또는 IL-23 의 인간 p40 소단위, 즉 D3 변이체를 함유하는 p40 소단위를 언급하는 데 이용된다. 용어 "IL-12 변이체" 는 본원에서 p40 변이체를 함유하는 인간 IL-12 단백질을 언급하는 데 이용된다. 용어 "IL-23 변이체" 는 본원에 p40 변이를 함유하는 인간 IL-23 단백질을 언급하는 데 이용된다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, p40 변이체의 D3 도메인은 야생형 IL-12 p40 의 D3 도메인과 70 % 이상의 서열 동일성을 가진다. 추가적 구현예에서, p40 변이체의 D3 도메인은 야생형 IL-12 p40 의 D3 도메인과 75 % 이상의 서열 동일성을 갖는다. 다시 또다른 구현예에서, p40 변이체의 D3 도메인은 야생형 IL-12 p40 의 D3 도메인과 80 % 이상의 서열 동일성을 갖는 한편, 추가적 구현예에서, p40 변이체의 D3 도메인은 야생형 IL-12 p40 의 D3 도메인과 81 % 이상, 또는 82 % 이상, 또는 83 % 이상, 또는 84 % 이상, 또는 85 % 이상, 또는 86 % 이상, 또는 87 % 이상, 또는 88 % 이상, 또는 89 % 이상, 또는 90 % 이상, 또는 91 % 이상, 또는 92 % 이상, 또는 93 % 이상, 또는 94 % 이상, 또는 95 % 이상, 또는 96 % 이상, 또는 97 % 이상, 또는 98 % 이상, 또는 99 % 이상의 동일성을 갖는다.
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, p40 변이체의 아미노산 서열은 성숙 야생형 IL-12 p40 의 아미노산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 갖는다. 추가적 구현예에서, p40 변이체의 아미노산 서열은 성숙 야생형 IL-12 p40 의 아미노산 서열과 75 % 이상의 서열 동일성을 갖는다. 다시 또다른 구현예에서, p40 변이체의 아미노산 서열은 성숙 야생형 IL-12 p40 의 아미노산 서열과 80 % 이상의 서열 동일성을 갖는 한편, 추가적 구현예에서 p40 변이체의 아미노산 서열은 성숙 야생형 IL-12 p40 의 아미노산 서열과 81 % 이상, 또는 82 % 이상, 또는 83 % 이상, 또는 84 % 이상, 또는 85 % 이상, 또는 86 % 이상, 또는 87 % 이상, 또는 88 % 이상, 또는 89 % 이상, 또는 90 % 이상, 또는 91 % 이상, 또는 92 % 이상, 또는 93 % 이상, 또는 94 % 이상, 또는 95 % 이상, 또는 96 % 이상, 또는 97 % 이상, 또는 98 % 이상, 또는 99 % 이상의 동일성을 갖는다.
두 개의 아미노산 서열 사이의 백분율 동일성을 결정하기 위해, 서열들을 최적의 비교를 목적으로 정렬된다(예, 두번째 아미노산 서열과의 최적의 정렬을 위해 첫번째 아미노산 서열의 서열 내에 간극이 도입될 수 있음). 두 서열 사이의 백분율 동일성은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치들의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = (동일한 위치들의 수 #/위치들의 총 수 #) 곱하기 100). 비교되는 서열의 길이가 동일하지 않은 경우, 더 짧은 서열이 위치들의 총 수를 결정하는 데 이용된다. 두 개의 서열 사이의 백분율 동일성의 결정은 또한 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.
두 개의 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 비제한적 예는 Karlin and Altschul, (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:5873-77 에서와 같이 변형된 Karlin and Altschul, (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:2264-68 의 알고리즘이다. 상기 알고리즘이 Altschul et al ., (1990) J. Mol . Biol ., 215:403-10 의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내로 함입된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12 로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3 으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 간극이 있는 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST 가 Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402 에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터들이 이용될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 Lys260 과 Arg261 사이의 단백질분해 절단 부위를 제거하는 변형을 함유하는 D3 변이체를 제공한다. 한 구현예에서, 위치 Lys260 에서 아미노산이 돌연변이된다. 더 구체적인 구현예에서, Lys260 이 비염기성 아미노산으로 치환된다. 비염기성 아미노산은, 예를 들어, Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 을 포함한다. 예를 들어, Lys 260 은 Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 으로 치환된다. 대안적 구현예에서, Lys260 이 셀레노시스테인과 치환된다. Lys260 이 또다른 아미노산으로 치환된 D3 변이체의 예가 도 12, 13, 14, 15, 16 및 18 에 제시된다.
또다른 구현예에서, Arg261 이 돌연변이된다. 예를 들어, 한 구현예에서, Arg 261 이 임의의 비염기성 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 한 구현예에서, Arg261 이 Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 으로 치환된다. 대안적 구현예에서, Arg261 이 셀레노시스테인으로 치환된다. Arg261 이 또다른 아미노산으로 치환된 D3 변이체의 예가 도 12, 13, 17 및 18 에 제시된다. 추가적 구현예에서, Lys260 및 Arg261 이 돌연변이 된다. 예를 들어, 한 구현예에서, Lys260 및 Arg261 이 각각 또다른 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, Lys260 이 Gln, Ala, Asn 또는 Gly 으로 치환되고, Arg261 이 Ala, Asp 또는 Thr 으로 치환된다. Lys260 및 Arg261 이 둘다 다른 아미노산으로 치환된 D3 변이체의 예가 도 13 및 18 에 제시된다.
또한, Lys260 및 Arg261 이 한 구현예에서 결손되는 한편, 추가적 구현예에서, 아미노산이 Lys260 과 Arg261 사이에 삽입된다.
추가적 구현예에서, Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys264 또는 Arg266 중 하나 이상이 각각 또다른 아미노산으로 치환된 D3 변이체가 생성된다. 한 구현예에서, Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys264 또는 Arg266 중 하나 이상이 각각 비염기성 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 한 구현예에서, Lys258 이 Gln 으로 치환된다. 또다른 구현예에서, Ser259 가 Asp 으로 치환된다. 또다른 구현예에서, Lys260 이 Ala, Gly, Asn 또는 Gln 으로 치환된다. 추가적 구현예에서, Arg261 이 Ala, Thr 또는 Asp 으로 치환된다. 다시 또다른 구현예에서, Lys263 이 Ser 으로 치환된다. 추가적 구현예에서, Lys264 가 Gly 으로 치환된다. 한 구현예에서, Arg266 이 Gln, Asp, Asn 또는 Thr 으로 치환된다. 추가적 구현예에서, Lys263 및 Lys264 가 각각 또다른 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 한 구현예에서 Lys263 및 Lys264 가 각각 Ser 및 Gly 으로 치환된다. 다시 또다른 구현예에서, Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263 및 Lys264 가 Gln, Asp, Gln, Asp, Ser 및 Gly 으로 각각 치환된다.
추가적 구현예에서, Ser259, Lys260 및 Arg261 중 하나 이상이 각각 또다른 아미노산으로 치환된 D3 변이체가 생성된다. 추가적 구현예에서, Ser259, Lys260 및 Arg261 중 하나 이상이 각각 비염기성 아미노산에 의해 치환된다. 예를 들어, 한 구현예에서, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 Asp, Asn 및 Thr 으로 각각 치환된다.
또다른 구현예에서, Lys258, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 각각 또다른 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 한 구현예에서, Lys258, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 각각 비염기성 아미노산으로 치환된다. 한 구현예에서, Lys258, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 각각 Gln, Asp, Gln 및 Asp 으로 치환된다. 추가적 구현예에서, Ser259, Lys260, Arg261 및 Lys264 가 Asp, Asn, Thr 및 Gly 으로 각각 치환된다. 다시 추가적 구현예에서, Ser259, Lys260, Arg261 및 Lys264 가 Asp, Asn, Thr 및 Gly 으로 각각 치환되는 한편, Lys263, 및 Asp265 가 결손된다. 다시 또다른 구현예에서, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 각각 Asp, Asn, 및 Thr 으로 치환되는 한편, Lys263, Lys264 및 Asp265 가 결손된다.
이론에 구속되기를 원하지 않으면서, 결손이, p40(258-266) 영역의 입체형태적 유연성을 감소시키고, 따라서 Lys260-Arg261 모티브가 관련된 단백질분해효소에 의한 절단을 허용하는 형태를 취하는 능력을 감소시키는 효과를 가지는 것으로 생각된다. 그러므로, 한 구현예에서, Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys264, Asp265 또는 Arg266 중 하나 이상이 결손된다.
추가적 구현예에서, Lys263, Lys264, Asp265 또는 Arg266 중 하나 이상이 결손된 D3 변이체가 생성된다. 예를 들어, 한 구현예에서, Lys263 및 Asp265 가 결손되는 한편, 또다른 구현예에서, Lys263, Lys264 및 Asp265 가 결손된다. 또다른 구현예에서, Lys263, Lys264 및 Asp265 가 결손되고, 하나 이상의 비염기성 아미노산으로 치환된다. 추가적 구현예에서, Lys263, Lys264, Asp265 및 Arg266 이 결손된다. 추가적 구현예에서, Lys263, Lys264, Asp265 또는 Arg266 중 하나 이상이 결손되는 한편, Ser259, Lys260 또는 Arg261 중 하나 이상이 또다른 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 한 구현예에서, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 Asp, Asn 및 Thr 으로 각각 치환되는 한편, Lys263, Lys264 및 Asp265 가 결손된다. 추가적 구현예에서, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 Asp, Asn 및 Thr 으로 각각 치환되는 한편, Lys263, Lys264, Asp265 및 Arg266 이 결손된다.
다른 구현예에서, 아미노산 치환이, 그것이 신규한 T-세포 에피토프를 생성하는 것을 회피하도록 선택된다. T-세포 에피토프를 생성하는 잠재력에 대해 펩티드 서열을 분석하는 방법이 당 기술분야에 공지되었다(예, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0153043; 국제 공개 번호 WO 00/034317; 및 Sturniolo et al . (1999), Nature Biotech., 17: 555-61 참조). 한 구현예에서, 인간 IL-12 p40(258-266)의 서열이 서열 KDNTER(SEQ ID NO:17)로 치환된다. 바꾸어 말하면, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 Asp, Asn 및 Thr 으로 각각 치환되는 한편, 변이체 내의 잔기 258-263 으로부터 생성된 서열이 KDNTER 이 되도록 Lys263, Lys264 및 Asp265 가 결손된다. 생성된 IL-12 p40 변이체가 도 8 에 제시된다.
또다른 구현예에서, 인간 IL-12 p40(258-266)의 서열이 서열 KDNTEGR (SEQ ID NO:18)로 치환된다. 바꾸어 말하면, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 Asp, Asn 및 Thr 으로 각각 치환되는 한편, 변이체 내의 잔기 258-264 로부터 생성된 서열이 KDNTEGR 이 되도록 Lys263, Lys264 및 Asp265 가 결손되고 오직 Gly 잔기로 치환된다. 생성된 IL-12 p40 변이체가 도 9 에 제시된다.
다시 또다른 구현예에서, 인간 IL-12 p40(258-266)의 서열이 서열 QDQDEKKDR (SEQ ID NO:19)로 치환된다. 바꾸어 말하면, 변이체 내의 잔기 258-266 으로부터 생성된 서열이 QDQDEKKDR 이 되도록 Lys258, Ser259, Lys260 및 Arg261 이 Gln, Asp, Gln 및 Asp 으로 각각 치환된다. 생성된 IL-12 p40 변이체가 도 10 에 제시된다.
추가적 구현예에서, 인간 IL-12 p40(258-266)의 서열이 서열 QDQDESGDR (SEQ ID NO:20)로 치환된다. 바꾸어 말하면, 잔기 258-266 으로부터 생성된 서열이 QDQDESGDR 이 되도록 Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263 및 Lys264 가 Gln, Asp, Gln, Asp, Ser 및 Gly 으로 각각 치환된다. 생성된 IL-12 p40 변이체가 도 11 에 제시된다.
추가적 구현예에서, D3 변이체가 IL-12 p40 소단위 또는 그의 활성 부위 내에 함유된다. 활성 부위에 의해, D3 변이체를 함유하는 IL-12 p40 소단위가, 야생형 IL-12 p40 모이어티의 생물학적 활성과 비교하여, 한 구현예에서 10 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 20 % 이상, 또다른 구현예에서 30 % 이상, 또다른 구현예에서 50 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 70 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 75 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 80 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 90 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 95 % 이상의 활성, 추가적 구현예에서 99 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 100 % 이상의 활성, 추가적 구현예에서 150 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 200 % 이상의 활성, 추가적 구현예에서 300 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 400 % 이상의 활성, 또다른 구현예에서 500 % 이상의 활성, 또는 또다른 구현예에서 1000 % 이상의 활성을 가짐이 의미된다.
IL -12 p40 변이체를 함유하는 단백질
IL-12 p40 변이체가 야생형 IL-12 p40 대신 단백질 조성물 내로 도입될 수 있다. IL-12 p40 을 포함하는 생물학적 활성 단백질 조성물의 예가 p40 동형이합체, IL-12 및 IL-12 융합 단백질, 및 IL-23 및 IL-23 융합 단백질이다. 본 발명의 한 측면에서, IL-12 p35/변이체 p40 이형이합체가 개별적인 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 대안적으로, IL-12 p35/변이체 p40 이형이합체가 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 본 발명의 또다른 측면에서, IL-23 p19/변이체 p40 이형이합체가 개별적 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 대안적으로, IL-23 p19/변이체 p40 이형이합체가 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어진다.
본 발명의 또다른 측면에서, IL-12 융합 단백질의 일부로서, IL-12 융합 상대가 항체 모이어티 또는 항체 모이어티의 일부일 수 있다. 유용한 항체 모이어티는 IL-12 융합 단백질을 종양 환경으로, 예를 들어 종양 세포 자체로, 또는 종양의 괴사성 중심부로 또는 지지 스트로마로 표적화하는 것을 포함한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 융합 상대는 또다른 시토카인일 수 있다. 유용한 시토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15 를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 또다른 측면에서, IL-23 융합 단백질의 일부로서, IL-23 융합 상대가 항체 모이어티 또는 항체 모이어티의 부분일 수 있다. 유용한 항체 모이어티는 IL-23 융합 단백질을 종양 환경으로, 예를 들어 종양 세포 자체로, 또는 종양의 괴사성 중심부로 또는 지지 스트로마로 표적화하는 것을 포함한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 융합 상대는 또다른 시토카인이다. 유용한 시토카인은 L-2, IL-7 및 IL-15 를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
p40 변이체를 코딩하는 핵산
본 발명의 추가적 측면에서, 본 발명의 p40 변이체를 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 고안될 수 있다. 본 발명의 p40 변이체를 코딩하는 핵산이, 예를 들어 당업자에게 용이한 DNA 기술을 이용하여 구성될 수 있다. 전형적인 절차가 실시예 1 에 제시된다.
도 19 는 성숙 인간 IL-12 p40 소단위를 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 도 20-22 는 본 발명의 p40 변이체에서 발견되는 전형적인 돌연변이를 코딩하는 합성 뉴클레오티드 조각을 나타낸다.
p40 변이체를 이용하는 치료 방법
p40 변이체를 함유하는 융합 단백질 및 IL-12 단백질 또는 IL-23 단백질을 포함하는 본 발명의 p40 변이체는, 예컨대 IL-12 단백질의 증명된 항종양 활성에 기초한 다양한 암의 치료를 위한 면역치료제로서 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 p40 변이체는, 바람직하게는 p35 와의 이형이합체로서, 신장암, 결장암, 난소암, 흑색종 및 T-세포 림프종을 포함하나 이에 한정되지는 않는 암의 치료에 있어서, 및 암 백신에 대한 아주반트로서 이용될 수 있다. p40 변이체는 또한 TH 1 반응(예, 자가면역 질환과 관련된 TH 1 반응)을 감소시키기 위해 p40/p40 동형이합체의 일부로서 이용될 수 있다.
투여
IL-12 변이체, IL-23 변이체 둘 다, 및 본 발명의 p40 변이체가 투여에 적합한 약학 조성물 내로 함입될 수 있다. 상기 조성물은 전형적으로 IL-12 변이체, 또는 IL-12 변이체를 함유하는 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 약학적 투여와 적합성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균 제제, 등장성 및 흡수 지연 제제, 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 제제의 이용이 당 기술분야에서 공지되었다.
본 발명의 약학 조성물은 의도된 투여 경로와 적합성이 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 진피내, 피하, 경구(예, 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 진피내 또는 피하 투여에 이용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용 물, 생리 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르빈산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 강직성 조절제 예컨대 소듐 클로리드 또는 덱스트로오스. pH 가 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화 나트륨으로 조절될 수 있다. 비경구적 제제는 앰플, 일회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다중 복용량 바이알 내에 동봉될 수 있다.
IL-12 변이체, IL-23 변이체, 또는 본 발명의 p40 변이체를 함유하는 약제는, 약제의 투여 형태에 따라 그 양이 달라짐에도 불구하고 0.01 미만부터100 % (w/w) 까지의 농도를 가질 수 있다.
투여 용량은 환자의 체중, 질병의 심각성, 이용된 IL-12 p40 변이체의 특정 유형 및 의사의 소견에 따라 다르다. 예를 들어, 본 발명의 IL-12 변이체에 있어서, 일반적으로 하루에 약 0.01 내지 약 10 mg/kg체중, 주사의 경우 약 0.02 내지 약 2 mg/kg/일, 또는 약 0.5 mg/kg/일을 투여하는 것이 바람직하다. 상기 투여는 질병의 심각성 및 의사의 소견에 따라 하루에 한 번 또는 여러 번 투여될 수 있다. 본 발명의 IL-12 p40 변이체를 함유하는 항체-IL-12 융합 단백질 또는 항체-IL23 융합 단백질에 있어서, 하루에 약 0.001 내지 약 1 mg/kg체중, 주사의 경우 약 0.002 내지 약 0.5 mg/kg/일, 또는 약 0.1 mg/kg/일을 투여하는 것이 바람직하다. 투여는 질병의 성질 및 심각성 및 의사의 소견에 따라 2, 3 또는 4 주 기간 당 한 번 또는 두 번 투여될 수 있다.
발명의 측면들이 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 1 : 인간 IL -12 p40 소단위의 변이체의 클로닝
본 발명의 p40 변이체, 특히 p40V1 내지 p40V8 (SEQ ID NOS:6-13)을 코딩하는 핵산을 당업자에게 용이한 표준 DNA 기술을 이용하여 구성했다. 본질적으로, 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는 영역에 걸친 조각을 코딩하고, 편리한 제한효소 부위에 의해 일괄(bracket)되는 DNA 카세트를 새롭게 합성하고(Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA), 이것으로 p40 서열을 수반하는 발현 플라스미드 내에 함유된 야생형 서열의 상응하는 조각을 치환했다(예, 미국 특허 제 6,838,260 호의 pNC-p40 참조). 성숙 (야생형) 인간 IL-12 p40 소단위를 코딩하는 핵산 서열이 도 19 에 제시된다. p40 변이체를 코딩하는 발현 플라스미드를 이처럼 수득했다.
특히, p40V1 및 p40V2 를 코딩하는 핵산을 하기와 같이 생성했다. 도 20 에 제시된 바와 같이 연속 조각으로서 합성된, p40V1 및 p40V2 DNA 카세트를 수반하는 클로닝 벡터(pBHV1V2)를, Bpu10 I 및, EcoR I/Sca I 또는 Bbs I 으로 절단하여, EcoR I/Bpu10 I 적합성 말단을 지닌 EcoR I/Bpu10 I (V1 에 대해) 및 Bbs I/Bpu10 I (V2 에 대해) 카세트를 각각 생성했다. 유사한 크기의 V2 조각을 제거하기 위해 Sca I 절단을 포함시켰다. 상기 정제된 조각을 pNC-p40 발현 벡터 내로 NC-p40 으로부터 수득한 적절한 Bpu10 I/Pvu I 및 Pvu I/EcoR I 조각에 의한 3중 연결(ligation)로 클로닝했다.
동일한 접근을 이용하여 도 21 에 제시된 합성된 서열로 시작되는 p40V5 및 p40V6 을 코딩하는 핵산을 생성했고, 도 23 에 제시된 합성된 서열로 시작되는 p40V7 및 p40V8 을 코딩하는 핵산을 생성했다.
유사하게, p40V3 및 p40V4 를 코딩하는 핵산을 생성하기 위해, 도 22 에 제시된 합성된 서열을 수반하는 플라스미드(pBHV3V4)를 EcoR I/Bbs I/Sca I(유사한 크기의 V4 조각을 제거하기 위해 Sea I 절단을 포함시켰음) 또는 Bbs I 단독으로 절단하여, 각각 EcoR I/Bbs I 절단된 발현 플라스미드 pNC-p40 와 적합성인 말단을 지닌 EcoR I/Bbs I(V3 에 대해) 및 Bbs I(V4 에 대해) 카세트를 각각 생성했다. Bbs I 제한효소에 있어서 인식 및 절단 서열이 분리되어 있고, 따라서 다수의 Bbs I 인식 부위를 함유하는 서열이 상이한 서열-특이적 오버행(overhang)을 생성할 수 있음을 유의한다. V3 및 V4 카세트를 그후 겔 정제하여, 발현 플라스미드 pNC-p40 내로 각각 pNC-p40 으로부터 수득한 적절한 Bbs I/Pvu I 및 Pvu I/EcoR I 조각을 이용한 3중 연결로 연결시켰다.
동일한 일반적 접근을 이용하여 본 발명에 의해 고안된 다른 p40 변이체를 코딩하는 추가적 핵산 분자를 생성할 수 있다.
실시예 2: p40 변이체 , 및 p40 변이체를 함유하는 항체- IL12 융합 단백질의 발현
표준 방법을 이용하여 본 발명의 p40 변이체를 발현하는 세포주를 생성했다(미국 특허 제 6,838,260 호 참조). p40 변이체를 코딩하는 pNC-p40 발현 플라 스미드를 세포, 예를 들어 NS/0 세포 내로 전기천공시켰다. 상기 세포를 평판배양시키고, 형질주입된 세포를 G418-함유 배지 상에서 선택했다. 약물 내성 클론으로부터의 배양 상청액을 ELISA 에 의해 p40 생산에 대해 분석하고, 최고 생산자를 서브클로닝하여 안정한 발현에 대해 시험했다.
본 발명의 p40 변이체를 지닌 항체-IL-12 융합 단백질을 발현하는 세포주를 생성하기 위해, 미국 특허 제 6,838,360 호에 기술된 순차적 형질주입 접근법을 따랐다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역의 C-말단이 IL-12 p35 소단위의 N-말단과 연결된 NHS76 항체를 코딩하는, 제 2 플라스미드 pdHL10람다DI-NHS-p35 에 의해, p40V1 을 발현하는 세포주를 추가로 형질주입시킴으로써, 융합 단백질 DI-NHS-IL12p40V1 을 수득했다. 발현 플라스미드 pdHL1O람다는 코딩된 경쇄 불변 도메인이 람다 사슬인 pdHL7 의 유도체이다. 세포가 메토트렉세이트-함유 배지 상에서 선택되고, 항체 융합 단백질을 발현하는 안정한 형질주입체를 표준 방법에 의해 클로닝했다.
실시예 3: p40 변이체의 정제 및 특성화
p40 변이체 p40V1, p40V2, p40V3 및 p40V4 (SEQ ID NO:6-9)의 본양을 특성화하기 위해, 상기 변이체를 발현하는 2중 일시적 형질주입된 NS-O 세포로부터의 사용된 세포 배양 배지를 수집하여, 도 24 에 제시된 다클론성 항-hu-p40 항체로 웨스턴 블롯 처리했다. 대조 야생형 p40 소단위를 대조군(레인 1)으로서 포함시켰다. 이들 전기영동 조건에 의해 완전한 p40 종들로부터 통상 잘-분해되는(레인 1 의 밴드를 지시하는 화살표 참조), C-말단 6 kDa 조각을 결여한 절단된 종들 이, 시험된 변이체들(레인 2-9) 중 어디에도 존재하지 않았고, 오직 완전한 p40 만을 탐지할 수 있었다. 이처럼, 시험된 p40 변이체는 단백질 발현 과정에 존재하는 단백질분해 활성에 대해 저항성이었다.
IL-12 p40 변이체를 함유하는 항체 융합 단백질을 단백질 A 포획에 기초한 표준 기술을 이용하여 세포 배양 상청액으로부터 정제했다(미국 특허 제 6,838,260 호 참조).
SEQ ID NOS:6-13 에 제시된 p40 변이체(레인 1 - 8) 및 비-돌연변이 대조군(레인 9)의 NS-O 안정한 클론으로부터 정제된 항체 융합 단백질의 SDS-PAGE 겔을 도 25 에 나타냈다. 세 개의 주요 밴드 중 가운데가 비-절단 p40 소단위를 나타내고, 약간 위쪽의 희미한 밴드는 더 글리코실화된 종을 지시한다. 제일 위쪽의 주요 밴드는 항체 중쇄와 p35 소단위 사이의 융합 단백질을 나타내고, 아래쪽 주요 밴드는 항체 경쇄를 나타낸다. IL-12 p40V5 를 함유하는 항체 융합 단백질의 샘플을 제외하고는, 6 kDa 밴드가 존재하지 않음을 발견했다. IL-12 p40V5 에 대해, 잔류 6 kDa 밴드를 관찰했다(레인 5).
실시예 4: 야생형 IL -12 p40 소단위 내의 단백질분해 절단 부위의 특성화
오염물질인 대략 6 kDa 단백질 조각의 정체를 표준 방법에 의해 결정했다. 간단히, 정제된 DI-NHS-IL12 단백질을 완충 6 M 구아니딘/1 mM DTT 용액 내에서 55 ℃ 에서 변성 및 환원시키고, Vydac C4 칼럼 상에서 10 % 내지 90 % 아세토니트릴 기울기로 역상 HPLC 분리 처리했다. 미확인된 펩티드 종에 상응하는 분획을 수집, 건조 및 재-현탁시켜 SDS-PAGE 겔을 실행하여 그것이 6 kDa 조각에 상응함을 확인했고, N-말단 서열분석에 의해 펩티드의 서열을 결정했다. 서열 분석으로 Arg261 에서 시작하는 성숙 (야생형) 인간 IL-12 p40 소단위 내의 서열에 상응하는 서열 REKKDRVFTD 를 지닌 펩티드를 분석했다.
실시예 5: p40 변이체를 함유하는 IL -12 단백질의 대생물활성
p40 변이체를 함유하는 IL-12 단백질의 대생물활성을 인간 PBMC 로부터 IFNγ 의 유도에 의해 측정했다. 변이체 p40V1 내지 p40V8 을 함유하는 항체 융합 단백질 Ab-IL-12 를 야생형 p40 을 지닌 Ab-IL-12 및 재조합 인간 IL-12 단백질과 비교했다.
IFNγ 유도 분석을, Gately et al . (1995), Current Protocols in Immunology, Section 6.16.4, 및 Kobayashi et al . (1989), J. Exp Med ., 170: 827-845 에 기술된 바와 같이 본질적으로 수행했다. PBMCs 를 PHA-P 와 함께 3 일 동안 배양시킨 후, 25 IU/ml 의 hu IL-2(R&D Systems, Minneapolis MN)를 추가적 24 시간 동안 첨가했다. 세포들을 세정하고, 20 IU/ml 의 IL-2 를 모든 세포에 첨가한 후, IL-12 융합 단백질을 첨가하고, 20 ng/ml(분자에 대한 IL-12 의 상대 질량 기여에 의함)에서 시작하는 일련의 2 배 희석을 실시했다. 24 시간 후, IFNγ 의 농도를 R&D Systems 로부터 구입한 항체 쌍을 이용하여 ELISA 에 의해 측정했다.
다른 공여체로부터의 PBMCs 를 이용한 두 개의 개별적 실험의 결과를 표 1 에 요약했다.
Figure 112008054771017-pct00001
재조합 hu IL-12 에 비해, 야생형 p40 을 지닌 Ab-IL12 의 활성이 약 10 배 감소했다. 시험된 항체-IL12 변이체 단백질이 단백질의 활성에 유의한 추가적 영향을 미치지 않았음을 발견했다. Ab-IL12p40V1 대 Ab-IL12p40V8 은 상응하는 야생형 항체-IL-12 융합 단백질에 비해 약간 감소된 활성(대략 1.5-3 배 작음)을 가졌다.
실시예 6: p40 변이체를 함유하는 IL -12 단백질의 약동학
p40 변이체를 함유하는 항체 융합 단백질의 약동학을 측정했다. 당업자에게 용이한 표준 기술을 이용하여 실험을 수행했다. 간단히, BALB/c 마우스(처리 군 당 n=3)를, 25 μg 의 Ab-IL12 또는, 변이체 p40V1, p40V2, p40V3, p40V4, p40V5, p40V6, p40V7 및 p40V8 을 부피 0.2 ml 로 함유하는 Ab-IL12 변이체로, 트레일(trail) 정맥에 정맥내 또는 피하 주사했다. 24 시간까지 및 96 시간까지의 다양한 시점에서, 각각 적은 부피의 혈액을 후-안와 출혈에 의해 취하고 응고를 예방하기 위해 헤파린 코팅된 튜브 내에서 수집했다. 세포를 제거하기 위한 원심분리 후, 혈장을 항-인간 IgG H&L 안티세라에 의한 포획 및 항-인간 IL-12 항체에 의한 탐지로 분석했다. 주사(t = 0)후 30 초 이내에 취해진 각 마우스의 혈장 내 초기 농도로 결과를 표준화했다. 도 26 은 정맥내 투여된 단백질의 약동학을 평가하는 대표적 실험들의 수집이다. 변이체 p40V6 뿐만 아니라 p40V1 및 p40V2, p40V3, p40V4 를 함유하는 항체-IL-12 융합 단백질이 야생형 대조 단백질에 비해 현저히 개선된 약동학 수치를 가짐을 발견했다. 특히, 분포 상(알파 상)의 반감기가 대략 2 배가 되었고, 이와 관련하여 변이체 단백질의 AUC 도 또한 대략 2 배가 되었음을 발견했다. 그러나, 모든 Ab-IL-12 융합 단백질의 제거 상(베타 상)이 실질적으로 유사하게 유지되었다. 상기 결과는 마우스에 피하투여했을 경우 상기 단백질의 약동학과 일치했다. 도 27, 판넬 A 는 야생형 Ab-IL12 의, p40V1, p40V2, p40V3 및 p40 V4 를 함유하는 Ab-IL12 변이체와의 비교를 나타내고, 판넬 B 는 야생형 Ab-IL12 의 p40V5, p40V6, p40V7 및 p40V8 을 함유하는 Ab-IL12 변이체와의 비교를 나타낸다.
실시예 7: IL -12 p40 변이체에 의한 인간 환자의 치료
본 발명의 IL-12 p40 변이체는 하기와 같이 인간 질병 및 장애의 예방 및 치료에 이용된다. 일반적으로, 바람직한 투여 방법은 경구 투여, 및 다른 방법이 또한 가능함에도 불구하고 i.v. 주입 또는 i.v. 주사에 의하거나, 또는 피하 주사, 흡입에 의하는 것이다.
종래의 화합요법에 의한 치료 전력을 지닌 진행 전이성 전립선 암 환자를 하기와 같이 IL-12 p40 변이체를 함유하는 항체-IL12 융합 단백질로 치료했다. 치료 주기 당 항체-IL12 융합 단백질의 투여량은 체중 1 kg 당 약 150 마이크로그램이고, 하루에 또는 연속하는 2 또는 3 일 동안 점적 주입에 의한 투여에 의해 투여할 수 있다. 치료를 의사가 환자에게 적절하다고 결정한 전립선암에 대한 표준 치료와 조합할 수 있다. 비-스테로이드성 항염증성 약물, 예를 들어 Naproxen™ 을 또한 처방했다. 치료 주기를 약 3 주에 한 번 반복했다.
호르몬-불응성 유방암 환자를 IL-12 p40 변이체를 함유하는 항체-IL12 융합 단백질로 점적 주입에 의해 치료했다. 비-스테로이드성 항염증성 약물, 예를 들어 Naproxen™ 를 또한 처방했다.
대안적 치료 전략에서, 진행 호르몬-불응성 전립선암 또는 진행 호르몬-불응성 유방암 환자를 IL-12 p40 변이체를 함유하는 항체-IL12 융합 단백질로 약 3 주에 한 번, KS-IL2 와 같은 IL-2-함유 면역시토카인과 조합하여 치료했다. 상기 두 제제를 점적 주입에 의해 공동-투여할 수 있다. 치료 전에, 환자에게 면역을 자극하는 양의 시클로포스파미드를 투여했다. 비-스테로이드성 항염증성 약물, 예를 들어 Naproxen™ 을 또한 처방했다.
류머티스 관절염 환자를 p40 소단위가 IL-12 p40 변이체인 Fc-p40 융합 단백질로, 약 2 주에 한 번 약 8 mg/kg 의 투여량으로, 점적 주입에 의한 투여에 의해 치료했다. 관절 파괴의 진행이 단독요법에 의해, 심지어 질병-변형 항-류머티스 약물과 비교하는 경우에도, 유의하게 억제됨을 발견했다.
<110> Webster, Gordon McKenzie, Suzanne Lo, Kin-Ming Stein, Pascal <120> Interleukin-12p40 Variants with Improved Stability <130> P05/227-bz/bs (LEX-038) <150> PCT/EP2006/012301 <151> 2006-12-20 <160> 44 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu 1 5 10 15 His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys 20 25 30 Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp 35 40 45 His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu 50 55 60 Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr 65 70 75 80 Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe 85 90 95 Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr 100 105 110 Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys 115 120 125 Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu 130 135 140 Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val 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gtaccctgac acctggagca ctccacattc 60 ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag agcgcccggg aaaagaaaga 120 tagagtcttc acggacaaga cctcagcttt ttttttttga agactcaatt ctcggcaggt 180 ggaggtcagt tgggagtacc ctgacacctg gagtactcca cattcctact tctccctgac 240 attctgcgtt caggtccagg gcaagagcgg tagagaaaag aaagatagag tctttacgga 300 caagacctca gc 312 <210> 26 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn 1 5 10 15 Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr 20 25 30 Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys 35 40 45 Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala 50 55 60 Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp 65 70 75 80 Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 85 90 95 <210> 27 <211> 306 <212> PRT <213> Papio anubis <400> 27 Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val 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Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Ser 1 5 10 15 Pro Asp Ala Ala Gly Glu Arg Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Ser Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Ile Trp Thr Ser Asp Lys Asn Ser Glu Ala Val Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Ser Asn Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Thr Leu Ser His Ser Arg Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Asp Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Ala 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Lys Phe Asn Val Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Arg 130 135 140 Ala Val Thr Cys Gly Ala Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Val 145 150 155 160 Asp Arg Lys Asp Tyr Gln Lys Tyr Ser Val Ala Cys Gln Glu Asp Ile 165 170 175 Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Gly Leu Val Met Glu 180 185 190 Ala Gln His Lys Tyr Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Gly Phe Phe Ile 195 200 205 Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 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110 Ser Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Phe Gly Thr 115 120 125 Asp Val Lys Phe Ser Val Lys Gly Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Ser 130 135 140 Gly Val Thr Cys Gly Glu Ala Glu Arg Val Ser Gly Asp Asn Gln Glu 145 150 155 160 Tyr Lys Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Thr Ala 165 170 175 Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Val Asp Ala Ile His Lys Phe 180 185 190 Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Tyr Ile Arg Asp Ile Ile Lys 195 200 205 Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Ser Val Asn Ser Gln 210 215 220 Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His 225 230 235 240 Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Leu Val Gln Thr His Gly Lys Asn Lys 245 250 255 Asn Arg Arg Glu Lys Lys Tyr Glu Leu Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala 260 265 270 Thr Val Ser Cys His Lys Ile Ser Lys Val Glu Val Arg Ala Arg Asp 275 280 285 Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser 290 295 300 Glu Val Ser Val Ser Arg 305 310 <210> 41 <211> 305 <212> PRT <213> Sigmodon hispidus <400> 41 Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Ser 1 5 10 15 Pro Gly Ala Pro Gly Glu Arg Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Ser Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Ile Trp Thr Ser Asp Gln Ser Ser Glu Val Val Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Ile Val Gln Val Lys Glu Phe Ser Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser Arg Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Asp Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Ala 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Val Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Lys Phe Ser Leu Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Arg 130 135 140 Ser Val Thr Cys Gly Ala Ala Ser Leu Ser Thr Glu Lys Val Thr Val 145 150 155 160 Asp Gln Arg Asp Tyr Asn Lys Tyr Ser Val Ala Cys Gln Glu Asp Ile 165 170 175 Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Val Met Glu 180 185 190 Ala Gln His Lys Tyr Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Gly Phe Phe Ile 195 200 205 Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro 210 215 220 Leu Lys Ser Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Ser Trp 225 230 235 240 Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Gln Val Tyr 245 250 255 Arg Lys Lys Glu Lys Lys Gly Glu Ser Leu Leu Val Asp Lys Pro Ser 260 265 270 Ala Lys Ile Arg Cys Ser Lys Gly Gly Glu Val Arg Val Arg Ala Gln 275 280 285 Asp His Tyr Tyr Asn Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Ser Cys 290 295 300 Asn 305 <210> 42 <211> 313 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 42 Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Arg 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Asp Ser Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Arg Arg Gly Val Ile Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Arg Glu Phe Leu Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Arg Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys 85 90 95 Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser 100 105 110 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val His Arg Asn Thr Asp Leu Lys 115 120 125 Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Glu Ser Arg Ala Val Thr 130 135 140 Cys Gly Arg Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asn Gln Arg 145 150 155 160 Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ala Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro 165 170 175 Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Val Val Glu Ala Gln Gln 180 185 190 Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile 195 200 205 Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Val Lys Pro Leu Lys Asn 210 215 220 Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro 225 230 235 240 His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys 245 250 255 Glu Lys Thr Lys Glu Thr Glu Glu Glu Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe 260 265 270 Leu Val Glu Lys Thr Ser Ala Glu Val Gln Cys Lys Gly Ala Asn Ile 275 280 285 Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp 290 295 300 Thr Cys Val Pro Cys Arg Gly Arg Ser 305 310 <210> 43 <211> 313 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Thr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Arg His Gly Val Ile Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys 85 90 95 Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser 100 105 110 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys 115 120 125 Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr 130 135 140 Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg 145 150 155 160 Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro 165 170 175 Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln 180 185 190 Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile 195 200 205 Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn 210 215 220 Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro 225 230 235 240 His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys 245 250 255 Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe 260 265 270 Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val 275 280 285 Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp 290 295 300 Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 305 310 <210> 44 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: mature IL-12p40 having mutations outside the D3 region <400> 44 Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asn Ala Pro Gly Glu Thr Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly 35 40 45 Thr Gly Lys Thr Leu Thr Ile His Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys Arg Lys Gly Gly Glu Ala Leu Ser Arg Ser Leu Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Ser Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Thr Asp Pro Arg 130 135 140 Gly Val Thr Cys Gly Thr Ala Thr Leu Ser Glu Asp Leu Gly Glu Tyr 145 150 155 160 Lys Lys Tyr Arg Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ala Ala 165 170 175 Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Leu Glu Ala Val His Lys Leu 180 185 190 Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys 195 200 205 Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg 210 215 220 His Val Glu Val Ser Trp Gly Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His 225 230 235 240 Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Ile Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys 245 250 255 Arg Glu Lys Lys Asp Arg Ile Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val 260 265 270 Ile Cys Arg Lys Asn Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg Tyr 275 280 285 Tyr Ser Ser Phe Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser 290 295 300

Claims (30)

  1. 야생형 IL-12 p40 단백질과 비교하여 단백질분해효소에 의한 분해에 더욱 저항성인 IL-12 p40 D3 도메인의 변이체로서, 상기 변이체는 야생형 인간 IL-12 p40 D3 도메인과 90 % 이상의 서열 동일성을 가지고, Lys258Gln, Lys260Ala, Lys260Asn, Lys260Gln, Lys260Gly, Lys263Gly, Lys263Ser 및 Lys264Gly 로 이루어진 군으로부터 선택되는 모체 성숙 인간 IL-12 p40 의 위치 258-266 의 잔기에 상 응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 변형을 포함하고, 상기 변이체는 추가로 하기를 포함하는 변이체:
    (i) 하나 이상의 치환 Ser259Asp 및 Arg261Asp; 또는
    (ii) 하나 이상의 치환 Ser259Asp 및 Arg261Thr, 및 Lys263, Lys264 및 Asp265 에 상응하는 하나 이상의 잔기의 결손으로서, 여기서 상기 위치는 미변형 야생형 분자에 관한 것임.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기를 포함하여:
    (i) 다음의 치환: Ser259Asp, Lys260Asn 및 Arg261Thr, 및
    (ii) 다음의 결손: Lys263, Lys264 및 Asp265,
    서열 트랙 Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Arg 을 변이체의 위치 258 - 263 에서 형성하는 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, 하기를 포함하여:
    (i) 다음의 치환: Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr 및 Lys264Gly, 및
    (ii) 다음의 결손: Lys263 및 Asp265,
    서열 트랙 Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Gly- Arg 을 변이체의 위치 258 - 264 에서 형성하는 변이체.
  4. 제 1 항에 있어서, 하기 치환을 포함하여:
    Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp,
    서열 트랙: Gln - Asp - Gln - Asp - Glu - Lys - Lys - Asp - Arg 을 변이체의 위치 258 - 266 에서 형성하는 변이체.
  5. 제 1 항에 있어서, 하기 치환을 포함하여:
    Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp, Lys263Ser, Lys264Gly,
    서열 트랙: Gln - Asp - Gln - Asp - Glu - Ser - Gly - Asp - Arg 을 변이체의 위치 258 - 266 에서 형성하는 변이체.
  6. 제 1 항의 변이체를 함유하는, IL-12 단백질.
  7. (i) 제 1 항의 변이체, 또는 제 6 항의 단백질, 및 (ii) 항체 또는 그의 활성 부위를 포함하는 융합 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 변이체 또는 상기 단백질이 상기 항체 또는 항체 부위의 C-말단에 융합된 융합 단백질.
  9. 제 1 항에 따른 변이체, 또는 제 6 항의 단백질을 코딩하는 핵산.
  10. 제 7 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
  11. 제 8 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
  12. 제 9 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  13. 제 6 항의 단백질을, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 희석제 또는 부형제와 함께, 약학적 유효량으로 포함하는, 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
  14. 제 7 항의 융합 단백질을, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 희석제 또는 부형제와 함께, 약학적 유효량으로 포함하는, 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
  15. 제 8 항의 융합 단백질을, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 희석제 또는 부형제와 함께, 약학적 유효량으로 포함하는, 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
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