KR20110086101A - 방사선 및 면역사이토카인으로의 암 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 방사선 치료 후 면역사이토카인 투여에 의한 종양 및 암 세포 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 병용 치료는 조사 및 비조사 부위에서의 면역 반응을 자극할 수 있어, 제 1 종양 부위로부터 퍼진 암 세포를 근절하는데 유용하다. 또한, 면역사이토카인은 면역사이토카인 치료요법과 관련된 부작용을 감소시키는 최대 내약 용량 미만의 용량으로 투여될 수 있다.

Description

방사선 및 면역사이토카인으로의 암 치료 {CANCER TREATMENTS WITH RADIATION AND IMMUNOCYTOKINES}

본 발명은 방사선 치료 후 면역사이토카인 투여에 의한 종양 및 암 세포 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 병용 치료는 조사 및 비조사 부위에서의 면역 반응을 자극할 수 있어, 제 1 종양 부위로부터 퍼진 암 세포를 근절하는데 유용하다.

또한, 이러한 치료 방법에 의해 면역사이토카인, 바람직하게는 NHS-IL2(D20T) 및 NHS-IL12 가 면역사이토카인 치료요법과 관련된 부작용을 감소시키는 최대 내약 용량 (maximum tolerated dose) 미만의 용량으로 투여될 수 있다.

암과 같은 질환의 효과적인 치료는 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포 및 T 림프구와 같은 하나 이상의 효과기 세포 유형에 의한 확고한 면역 반응을 필요로 한다. 그러나, 현존하는 암 치료요법, 예를 들어, 방사선 치료 및 화학요법은 빠르게 분할되는 세포를 표적으로 하므로, 실제로 면역 세포를 파괴한다. 또한, 종양 환경 자체가 면역억제성이다.

현재의 암 치료요법의 면역억제성 효과에 맞서기 위해서, 방사선 치료요법과 병용된 사이토카인 IL-2 의 투여를 조사하기 위한 연구를 수행하였다. [Jacobs et al. (2005), Cancer Immunol . Immunother., 54:792-798; Everse et al. (1997), Int. J. Cancer, 72:1003-1007; Lam, et al. (1995), Journal of Immunotherapy, 18(1):28-34; 및 Jurgenliemk-Schulz et al., (1997), Radiation Oncology Investigations, 5:54-61] 을 참조한다. 특정 암 유형에 대해 일부 반응이 관찰되었으나, 많은 경우에서 종양이 완전히 근절되지는 않았다. 다른 경우, 종양은 재발할 수 있다. 또한, 특정 유형의 암은 치료로 개선이 나타나지 않았다. 또한, IL-2 는 체액이 혈관 밖으로 새어 저혈압, 호흡 곤란 및 부종을 일으키는 혈관 누수 증후군을 포함하는 심각한 부작용을 생성하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 전신 면역 반응의 자극을 증가시키면서 동시에 상기 치료요법에 의해 생성된 부작용을 최소화시키는 개선이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 포유류에서의 종양 또는 암 세포 성장을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 종양 성장 감소를 촉진하는 면역 반응이 강화되도록, 종양의 조사와 함께 면역사이토카인을 투여함으로써 종양 또는 암 세포 성장을 감소시킨다. 본 발명의 일부 실행 방법은 종양 크기를 감소시키고, 전이를 저해하고, 종양 재성장을 저해하고, 재발을 저해하고, 진전에 대한 평균 시간을 증가시키고, 평균 생존 시간을 증가시키거나, 치료적 섭생법에 대한 일부 또는 전체 반응을 촉진시킬 수 있으며, 이에는 추가적인 치료제 또는 활동 (예를 들어 수술) 이 포함될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 면역사이토카인의 투여를 공인하고, 면역사이토카인의 투여를 위한 지불을 공인하기 위한 보건 사업적 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 종양 조사 후 면역사이토카인의 사용으로 종양 또는 암 세포 성장을 감소시키고, 종양 성장 감소를 촉진시키는 면역 반응을 강화시키기 위한 면역사이토카인의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 면역사이토카인의 일부 사용은 종양 크기를 감소시키고, 전이를 저해하고, 종양 재성장을 저해하고, 재발을 저해하고, 진전에 대한 평균 시간을 증가시키고, 평균 생존 시간을 증가시키거나, 치료적 섭생법에 대한 일부 또는 전체 반응을 촉진시킬 수 있으며, 이에는 추가적인 치료제 또는 활동 (예를 들어 수술) 이 포함될 수 있다.

한 양상에서는, 본 발명은 이미 조사된 종양을 갖는 포유류 (예를 들어 인간) 에게 면역사이토카인을 투여함으로써 종양 또는 암 세포 성장을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 또 다른 양상에서는, 본 발명은 소집합의 위치를 조사한 후 면역사이토카인을 투여하는 것을 포함하는, 여러 위치에서 암 세포를 갖는 포유류에서의 전신 면역 반응을 강화시키는 방법에 관한 것이다. 조사는 조사 및 비-조사 위치에서 모두 면역 반응을 강화시킨다.

또 다른 양상에서는, 본 발명은 이미 조사된 종양을 갖는 포유류 (예를 들어 인간) 에서의 종양 또는 암 세포 성장을 감소시키기 위한 면역사이토카인의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양상에서는, 본 발명은 소집합의 위치를 조사한 후 면역사이토카인을 사용하는 것을 포함하는, 여러 위치에서 암 세포를 갖는 포유류에서의 전신 면역 반응을 강화시키기 위한 면역사이토카인의 용도에 관한 것이다. 조사는 조사 및 비-조사 위치에서 모두 면역 반응을 강화시킨다.

또 다른 양상에서는, 본 발명은 이미 조사된 종양 또는 암 세포를 갖는 포유류에게 면역사이토카인을 투여하는 것을 공인하거나, 면역사이토카인의 투여를 위한 지불을 공인하는 것을 포함하는 보건적 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일부 구현예에서는, 주어진 방사선 (예를 들어 감마 방사선) 용량은 1 일 당 1 Gy 이상, 2 Gy 이상 또는 3 Gy 이상이다. 특정 구현예에서는, 주어진 방사선 용량은 1 일 당 1-4 Gy, 1-10 Gy, 1-20 Gy, 2-4 Gy, 2-10 Gy, 2-20 Gy, 3-4 Gy, 3-10 Gy 또는 3-20 Gy 이다.

본 발명의 방법 및 용도에 따라 방사선과 면역사이토카인 치료를 병용하는 것의 이점은 낮은 용량의 면역사이토카인이 투여될 수 있어, 부작용의 가능성을 감소시킨다는 것이다. 본 발명의 한 구현예에서는, 면역사이토카인의 용량은 면역사이토카인의 최대 내약 용량 미만의 용량으로 투여되거나 사용된다. 또 다른 구현예에서는, 면역사이토카인은 최대 내약 용량의 1/2 미만, 1/3 미만, 1/4 미만, 또는 1/10 미만의 용량으로 투여되거나 사용된다. 또 다른 구현예에서는, 면역사이토카인은 D20T 돌연변이와 같은 하나 이상의 돌연변이를 임의로 혼입하는 인터류킨-2 를 포함한다. 또 다른 구현예에서는, 면역사이토카인은 인터류킨-12 를 포함한다.

방사선 치료 횟수, 및 방사선 치료와 면역사이토카인 투여 사이의 시간량은 본 발명의 방법 또는 용도에 따라 다양할 수 있다. 일부 구현예에서는, 종양은 1 일 당 1 회만 조사되거나, 용량이 14 일을 초과하지 않는 기간에 걸쳐 수 일 조사된다. 특정 구현예에서는, 기간은 6-8 일, 4-10 일, 2-12 일 또는 1-14 일이다. 특정 구현예에서는, 면역사이토카인은 기간 종료 후 적어도 2 일, 4 일 또는 6 일에 투여된다. 또 다른 구현예에서는, 면역사이토카인은 종양에 대한 방사선 초기 투여의 21 일, 18 일, 15 일, 12 일 또는 8 일 내에 투여된다. 한 구현예에서는, 면역사이토카인은 종양에 대한 방사선 초기 투여 후 적어도 5 일, 7 일, 9 일 또는 12 일에 투여된다.

본 발명의 구현예는 알려져 있는 암 치료법과 본 발명의 방법을 병용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서는, 본 방법은 일부 이상의 종양을 수술적으로 제거하고, 추가적인 치료제를 투여하거나, 종양을 조사하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 구현예는 면역사이토카인을 알려져 있는 암 치료법과 병용하여 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서는, 면역사이토카인은 이미 종양이 조사되었거나, 추가적인 치료제를 병용하여 사용한, 제거된 일부 이상의 종양을 갖는 포유류에서 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 실행 방법 및 용도는 상기 정의된 둘 이상의 상태를 조합할 수 있다. 예를 들어 한 구현예에서는, 주어진 방사선은 포유류에서의 소집합의 암 세포 위치에 대해서만, 1 Gy/일 이상 (예를 들어 2 Gy/일 이상, 3 Gy/일 이상, 1-4 Gy/일, 1-10 Gy/일, 1-20 Gy/일, 2-4 Gy/일, 2-10 Gy/일, 2-20 Gy/일, 3-4 Gy/일, 3-10 Gy/일 또는 3-20 Gy/일) 이다. 면역사이토카인은 방사선 초기 투여의 21 일 내 (예를 들어 18 일 내, 15 일 내, 12 일 내 또는 8 일 내) 에 투여되거나 사용될 수 있으며, 최대 내약 용량의 1/2 미만 (예를 들어 1/3 미만, 1/4 미만 또는 1/10 미만) 의 용량으로 투여되거나 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서는, 주어진 방사선은 1 Gy/일 (예를 들어 2 Gy/일 이상, 3 Gy/일 이상, 1-4 Gy/일, 1-10 Gy/일, 1-20 Gy/일, 2-4 Gy/일, 2-10 Gy/일, 2-20 Gy/일, 3-4 Gy/일, 3-10 Gy/일 또는 3-20 Gy/일) 이며 면역사이토카인은 방사선 초기 투여의 21 일 내 (예를 들어 18 일 내, 15 일 내, 12 일 내 또는 8 일 내) 에, 임의로는 최대 내약 용량의 1/2 미만 (예를 들어 1/3 미만, 1/4 미만 또는 1/10 미만) 의 용량으로 투여되거나 사용된다. 또 다른 구현예에서는, 주어진 방사선은 1 회 1 Gy/일 이상 (예를 들어 2 Gy/일 이상, 3 Gy/일 이상, 1-4 Gy/일, 1-10 Gy/일, 1-20 Gy/일, 2-4 Gy/일, 2-10 Gy/일, 2-20 Gy/일, 3-4 Gy/일, 3-10 Gy/일 또는 3-20 Gy/일) 이며 면역사이토카인은 최대 내약 용량의 1/2 미만의 용량으로 투여되거나 사용된다. 또 다른 구현예에서는, 방사선은 포유류에서의 소집합의 암 세포 위치에 대해서만 투여되며, 면역사이토카인은 방사선 초기 투여의 21 일 내 (예를 들어 18 일 내, 15 일 내, 12 일 내 또는 8 일 내) 에, 임의로는 최대 내약 용량의 1/2 미만 (예를 들어 1/3 미만, 1/4 미만 또는 1/10 미만) 의 용량으로 투여되거나 사용된다. 또 다른 구현예에서는, 방사선은 포유류에서의 소집합의 암 세포 위치에 대해서만 투여되며, 면역사이토카인은 최대 내약 용량의 1/2 미만 (예를 들어 1/3 미만, 1/4 미만, 또는 1/10 미만) 의 용량으로 투여되거나 사용된다. 또 다른 구현예에서는, 면역사이토카인은 방사선 초기 투여의 21 일 내 (예를 들어 18 일 내, 15 일 내, 12 일 내 또는 8 일 내) 에 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 투여되거나 상기 포유류에서 사용되며, 면역사이토카인은 최대 내약 용량의 1/2 미만 (예를 들어 1/3 미만, 1/4 미만 또는 1/10 미만) 의 용량으로 투여된다.

종합하여, 본 발명은 하기의 구현예에 관한 것이다:

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 적어도 1 Gy/일, 바람직하게는 2 Gy/일, 가장 바람직하게는 2-20 Gy/일의 용량으로 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 면역사이토카인을 투여하는 단계를 포함함.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 1 일 당 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy 의 용량으로 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 면역사이토카인을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역사이토카인은 조사 초기 투여의 21 일 내, 바람직하게는 5-21 일 내에 종양에 투여됨.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 1 일 당 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy 의 용량으로 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 면역사이토카인을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역사이토카인은 조사 초기 투여 후 21 일 내, 바람직하게는 5-21 일 내에, 그리고 조사 완료 또는 종양의 마지막 조사 치료 후 1-6 일, 바람직하게는 2-5 일에 종양에 투여됨.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 1 일 당 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy 의 용량으로 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 면역사이토카인을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역사이토카인은 방사선 초기 투여 후 21 일 내, 바람직하게는 5-21 일 내에 종양에 투여되고, 조사 완료 또는 종양의 마지막 조사 치료 후 1-6 일, 바람직하게는 2-5 일에, 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 최대 내약 용량 미만, 바람직하게는 최대 내약 용량의 1/2 미만, 가장 바람직하게는 1/3 미만 또는 심지어 1/10 미만의 면역사이토카인 용량으로 투여되며, 상기 최대 내약 용량은 환자에서 심각한 부작용을 일으키는 면역사이토카인 용량으로서 정의됨.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 다수의 종양 세포 위치에 1 일 당 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy 의 용량으로 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 면역사이토카인을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 소집합의 위치에만 이미 조사되고, 상기 면역사이토카인은 종양의 조사의 초기 투여 후 21 일 내, 바람직하게는 5-21 일 내에, 그리고 또한 조사 완료 또는 종양의 마지막 조사 치료 후 1-6 일, 바람직하게는 2-5 일에, 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 최대 내약 용량의 미만, 바람직하게는 최대 내약 용량의 1/2 미만, 가장 바람직하게는 1/3 또는 심지어 1/10 미만의 용량으로 투여되며, 상기 최대 내약 용량은 환자에서 심각한 부작용을 일으키는 면역사이토카인 용량으로서 정의됨.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 다수의 종양 세포 위치에 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 면역사이토카인을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 소집합의 위치에만 이미 조사되고, 상기 면역사이토카인은 종양의 조사의 초기 투여 후 21 일 내, 바람직하게는 5-21 일 내에, 그리고 또한 조사 완료 또는 종양의 마지막 조사 치료 후 1-6 일, 바람직하게는 2-5 일에 종양에 투여됨.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy, 가장 바람직하게는 2-20 Gy 의 1 회 또는 분획화된 총 용량으로 1 일만 환자의 종양 세포를 조사한 후, 상기 방사선 조사 완료 후 1-21 일, 바람직하게는 1-6 일, 보다 바람직하게는 2-5 일 후에 면역사이토카인을 1 일만 투여하는 단계를 포함함.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy, 가장 바람직하게는 2-20 Gy 의 1 회 또는 분획화된 총 용량으로 1 일만 환자의 종양 세포를 조사한 후, 수 일에 면역사이토카인을 다수 투여하는 단계를 포함하며, 초기 투여를 상기 방사선 조사 완료 후 1-21 일, 바람직하게는 1-6 일, 보다 바람직하게는 2-5 일 후에 실행하고 제 2 및 임의의 추가 투여를 초기 투여 후 1-5 일, 바람직하게는 1-3 일에 실행함. 임의로는, 더 먼 간격의 상기 면역사이토카인 다수 투여를 실행할 수 있으며, 각각의 간격은 3-12 주 사이임.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy, 가장 바람직하게는 2-20 Gy 의 1 회 또는 분획화된 일간 총 용량으로 14 일을 초과하지 않는 기간에 걸쳐 수 일에 환자의 종양 세포를 조사한 후, 면역사이토카인을 1 일만 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역사이토카인의 투여를 종양 세포의 초기 조사 후 21 일 이내에, 그리고 상기 다수 방사선 치료 완료 후 1-6 일, 바람직하게는 2-5 일 후 실행함.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도로서, 상기 방법은 14 일을 초과하지 않는 기간에 걸쳐 수 일에 환자의 종양 세포를 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy, 가장 바람직하게는 2-20 Gy 의 1 회 또는 분획화된 총 일간 용량으로 조사한 후, 수 일에 면역사이토카인을 다수 투여하는 단계를 포함하며, 초기 면역사이토카인 투여를 종양 세포의 초기 조사 후 21 일 이내에, 그리고 상기 다수 조사 치료의 완료 후 1-6 일, 바람직하게는 2-5 일 후에 실행하고 제 2 및 임의의 추가적인 면역사이토카인 투여를 초기 투여 후 1-5 일, 바람직하게는 1-3 일에 실행함. 임의로는, 더 먼 간격의 상기 면역사이토카인 다수 투여를 실행할 수 있으며, 각각의 간격은 3-12 주 사이임.

ㆍ 바람직하게는 종양 성장을 감소시켜 종양을 치료하는 방법, 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인, 또는 이러한 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함함:

(i) 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy, 가장 바람직하게는 2-20 Gy 의 1 회 또는 분획화된 총 용량으로 1 일만 환자의 종양 세포를 조사하는 단계,

(ii) 이후, 상기 방사선 조사 완료 후 1-21 일, 바람직하게는 1-6 일, 보다 바람직하게는 2-5 일 후 면역사이토카인을 1 일만 투여하는 단계;

(iii) 단계 (ii) 후 1-5 일 후에, 그러나 방사선 조사 단계 (i) 의 14 일을 초과하지 않는 시기에 적어도 1 Gy, 바람직하게는 2 Gy, 가장 바람직하게는 2-20 Gy 의 1 회 또는 분획화된 총 용량으로 1 일만 제 2 조사를 수행하는 단계, 및

(iv) 이후, 상기 제 2 방사선 조사 완료 후 1-21 일, 바람직하게는 1-6 일, 보다 바람직하게는 2-5 일 후 면역사이토카인을 1 일만 제 2 투여하는 단계.

ㆍ 상기 열거된 바와 같은 임의의 방법, 용도 또는 면역사이토카인에 따른 각각의 방법, 용도 또는 면역사이토카인으로서, 상기 면역사이토카인 용량은 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에 대해 최대 내약 용량 미만, 바람직하게는 최대 내약 용량의 1/2 미만, 가장 바람직하게는 1/3 미만 또는 심지어 1/10 미만의 것이며, 최대 내약 용량은 환자에서 심각한 부작용을 일으키는 면역사이토카인 용량으로서 정의됨.

ㆍ 상기 열거된 바와 같은 임의의 방법, 용도 또는 면역사이토카인에 따른 각각의 방법으로서, 상기 면역사이토카인의 사이토카인 부분은 IL2, IL2(D20T) 또는 IL12 임.

ㆍ 상기 열거된 바와 같은 임의의 방법, 용도 또는 면역사이토카인에 따른 각각의 방법으로서, 상기 면역사이토카인은 NHS-IL2(D20T), NHS-IL2, NHS-IL12 임.

ㆍ 상기 열거된 바와 같은 임의의 방법, 용도 또는 면역사이토카인에 따른 각각의 방법으로서, 상기 종양은 여러 종양 세포 위치에서 이미 조사되었고 상기 소집합의 위치에만 이미 조사됨.

ㆍ 상기 열거된 바와 같은 임의의 방법, 용도 또는 면역사이토카인에 따른 각각의 방법으로서, 일부 이상의 종양이 수술적으로 제거됨.

ㆍ 상기 열거된 바와 같은 임의의 방법, 용도 또는 면역사이토카인에 따른 각각의 방법으로서, 방사선이 감마 조사임.

ㆍ 여러 위치에서 암 세포를 갖는 포유류에서의 전신 면역 반응을 강화시키는 방법으로서, 상기 방법은 소집합의 위치에 조사한 후 면역사이토카인을 투여하는 단계를 포함하고 방사선이 조사 및 비-조사 위치 모두에서의 면역 반응을 강화시키며 조사와 면역사이토카인 투여의 병용 투여를 상기 열거된 바와 같은 섭생법에 따라 실행함.

도 1 은 방사선 "R" 및 면역사이토카인 "IC" 가 각각 간격 1-1 로 구분하여 단일 용량으로 투여될 수 있는 예시적인 투여량 일정을 나타낸다.
도 2 는 방사선 "R" 이 1 일만 투여된 후 면역사이토카인 "IC" 가 수 일에 투여되는 예시적인 투여량 일정을 나타낸다.
도 3 은 방사선 "R" 이 1 일 초과 투여된 후 면역사이토카인 "IC" 가 "IC1" 1 일만 투여되는 예시적인 투여량 일정을 나타낸다.
도 4 는 방사선 "R" 이 1 일 초과 투여된 후 면역사이토카인 "IC" 가 1 일 초과 투여될 수 있는 예시적인 투여량 일정을 나타낸다.
도 5 는 방사선 "R" 이 1 일 초과 투여된 후 면역사이토카인 "IC" 가 1 일 초과 투여될 수 있으며 면역사이토카인 투여의 시작 "IC1" 이 조사 기간의 완료 "R2" 전에 발생할 수 있는 예시적인 투여량 일정을 나타낸다.
도 6 은 화학방사선 + 화학방사선 + NHS-mulL12 (개방 사각형), EMD521873 (개방 원형), 화학방사선 단독 (폐쇄 삼각형), NHS-mulL12 단독 (폐쇄 사각형), EMD521873 단독 (폐쇄 원형) 또는 대조군 치료 (X) 로 치료된 동물에서 시간에 걸친 종양 크기를 나타낸다.
도 7 은 화학방사선과 병용의 면역사이토카인 NHS-IL12 (폐쇄 원형), 화학방사선과 병용의 EMD521873 (개방 원형), 비치료 (X), 화학방사선 단독 (개방 사각형), EMD521873 단독 (개방 다이아몬드형) 또는 NHS-mulL12 단독 (개방 삼각형) 으로 치료된 동물에서의 시간에 걸친 종양 크기를 나타낸다.
도 8 은 화학방사선 + EMD521873 (개방 원형), 화학방사선 단독 (개방 삼각형), 대조군 치료 (X) 또는 EMD521873 단독 (개방 상자형) 으로 치료된 동물에서의 시간에 걸친 종양 크기를 나타낸다.
도 9 는 1 mg/kg EMD521873 + 화학방사선 (폐쇄 사각형), 5 mg/kg EMD521873 + 화학방사선 (폐쇄 삼각형) 및 15 mg/kg EMD521873 + 화학방사선 (폐쇄 원형), 1 mg/kg EMD 521873 단독 (개방 삼각형), 5 mg/kg EMD521873 단독 (개방 삼각형) 및 15 mg/kg EMD521873 단독 (개방 원형), 화학방사선 단독 (+) 또는 비히클 단독 (X) 으로 치료된 동물에서의 시간에 걸친 종양 크기를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 방법은 방사선 및 면역사이토카인 투여를 포함하는, 하나 이상의 종양을 갖는 포유류에 대한 병용 치료요법을 제공하며, 면역 반응의 증가 및 종양 성장에 있어서의 후속적인 감소를 유발한다. 본 발명의 방법은 개별적 종양, 다수의 종양 (비-조사 종양을 포함) 또는 전이의 치료에 유용한데, 이는 전신 면역 반응이 활성화되기 때문이다. 방사선 치료 후 면역사이토카인이 최대 내약 용량 미만의 용량으로 투여될 수 있는데, 더 낮은 용량의 면역사이토카인을 사용하는 것이 더 적은 부작용을 일으킬 수 있기 때문이 이것은 유리하다.

방사선 치료요법

본 발명의 방법에 따르면, 방사선을 면역사이토카인과 병용으로 투여하여 암을 치료할 수 있다. 방사선 치료요법은 통상 고에너지 입자 또는 파동, 예컨대 X-선 및 감마선의 빔을 사용하여, 세포 DNA 내의 돌연변이를 유도함으로써 암 세포를 근절시킨다. 암 세포는 정상 세포보다 더 빠르게 분열되어, 종양 조직이 정상 조직보다 방사선에 더 취약하게 만든다. 유의한 부정적 부작용 없이 방사선 용량이 환자에 의해 용인되는 한, 임의 유형의 방사선이 환자에게 투여될 수 있다. 적합한 유형의 방사선요법은, 예를 들어 이온화 방사선 (예를 들어 X-선, 감마선 또는 고 선상 에너지 방사선) 을 포함한다. 이온화 방사선은 이온화 (즉, 전자의 수득 또는 손실) 를 생성하기에 충분한 에너지를 갖는 입자 또는 양자를 포함하는 방사선으로서 정의된다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,770,581 호에 기재된 바와 같음). 방사선의 영향은 임상의에 의해 일부 이상 제어될 수 있다. 방사선 용량은 바람직하게는 최대 표적 세포 노출 및 감소된 독성을 위해 분획화된다. 방사선은 종양 세포의 사멸을 강화시키는 방사선 민감제, 또는 방사선의 유해한 영향으로부터 건강한 조직을 보호하는 방사선 보호제 (예를 들어 IL-1 또는 IL-6) 와 동시에 투여될 수 있다. 유사하게는, 열의 적용, 즉 발열요법 또는 화학요법은 조직을 방사선에 대해 민감화시킬 수 있다.

방사선원은 환자에 대해 외부 또는 내부의 것일 수 있다. 외부 방사선 치료요법이 가장 통상적이며, 전형적으로 고에너지 방사선의 빔 (특정 빔) 을 예를 들어 선상 가속기를 사용하여 피부를 통해 종양 부위에 유도하는 것을 포함한다. 방사선 빔이 종양 부위에 국소화되지만, 정상, 건강한 조직의 노출을 피하는 것은 거의 불가능하다. 그러나, 외부 방사선은 통상 환자에 의해 잘 용인된다.

또 다른 예에서는, 방사선은 감마선을 사용하여 환자에게 외부적으로 공급된다. 감마선은 코발트 60 (cobalt 60) 과 같은 방사성 동위원소의 분해에 의해 생성된다. "Gamma Knife®" 라고 불리는 치료법을 사용하여, 감마선을 표적 종양 조직에만 정확히 맞추어 매우 약간의 건강한 조직만이 손상되도록 할 수 있다. 한편, 입자 가속기에 의해 생성되는 X-선을 사용하여 신체의 더 큰 영역에 걸쳐 방사선을 투여할 수 있다.

내부 방사선 치료요법은 비드, 와이어, 펠렛, 캡슐 등과 같은 방사선-방출원을 종양 부위 또는 종양 부위 근처의 체내에 이식하는 것을 포함한다. 사용된 방사선은 요오드, 스트론튬, 인, 팔라듐, 세슘, 이리듐, 포스페이트 또는 코발트와 같은 방사성 동위원소로부터 유래되나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 이식물은 치료 후 제거되거나 체내에 불활성인 채로 남겨질 수 있다. 내부 방사선 치료요법의 유형은 근접조사요법, 세포간 조사 및 강내 (intracavity) 조사를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 현재 덜 통상적인 형태의 내부 방사선 치료요법은 예컨대 방사성 물질에 결합한 종양-특이적 항체를 환자에게 투여하는 방사선 면역요법과 함께 방사성 동위원소의 생물학적 담체를 포함한다. 항체는 종양 항원에 결합함으로써 관련 조직에 방사선 용량이 효과적으로 투여되게 한다.

방사선 치료요법은 제 1 종양의 성장을 제어하기 위한 섭생법의 요소로서 유용하다 (예를 들어 Comphausen et al. (2001) "Radiation Therapy to a Primary Tumor Accelerates Metastatic Growth in Mice," Cancer Res . 61 :2207-2211 참조). 방사선 치료요법 단독이 전이를 파괴하거나 예방하는데 덜 효과적일 수 있지만, 본원에서 기재된 바와 같은 면역사이토카인과의 병용된 방사선은 방사선 치료요법의 국소 및 전신 효능을 강화시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 방사선은 다수의 종양 또는 암 세포를 갖는 포유류에서의 소집합의 종양 또는 암 세포에 투여될 수 있다. 한 구현예에서는, 소집합의 종양은 하나의 종양이다. 소집합의 위치에 조사한 후, 면역사이토카인을 투여한다. 조사는 면역사이토카인 투여 단독에 비해 조사 및 비-조사 위치에서의 면역 반응을 강화시킨다. 따라서, 본 발명의 방법은 암 세포가 하나 이상의 종양으로부터 체내의 다른 위치로 퍼진 포유류를 치료하는데 있어서 효과적일 수 있다.

방사선이 면역 효과기 세포를 사멸시키기 때문에, 방사선의 용량 및 시기가 중요하다. 조사된 종양에서의 T 세포 및 수지상 세포는 조사 직후 감소되지만; 재결합된 T-세포 수준은 기저선 수준보다 더 높다. 투여 방법이 무엇이든 간에, 방사선의 전체 용량이 하루에 걸쳐 투여될 수 있다. 바람직하게는, 총 용량은 수 일에 걸쳐 분획화되고 투여된다. 따라서, 방사선의 일간 용량은 약 3-20 Gy/일, 예를 들어 2 Gy/일 이상, 3 Gy/일 이상, 1-4 Gy/일, 1-10 Gy/일, 1-20 Gy/일, 2-4 Gy/일, 2-10 Gy/일, 2-20 Gy/일, 3-4 Gy/일, 3-10 Gy/일, 3-20 Gy/일을 포함할 것이다. 일간 용량은 단일 용량으로서 투여될 수 있거나, 하루에 걸쳐 둘 이상의 부분으로 "미세분획화" 용량 투여될 수 있다. 내부원의 방사선이 사용되는 경우 (예를 들어 근접조사요법 또는 방사선-면역요법), 방사선의 세기에 있어서의 감소와 함께 노출 시간은 통상 증가할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "방사선의 초기 투여" 는 단일 용량일 수 있거나, 수 일에 걸쳐 퍼지는 일련의 방사선의 시작일 수 있다. 포유류가 1 회 이상의 방사선 치료요법 과정을 이미 받았을 수 있으나, "초기 투여" 는 방사선의 임의의 선행 과정으로부터 알맞은 때에 분리된다. 예를 들어, 포유류가 월요일, 화요일과 수요일에 방사선 조사된 경우, 화요일 투여는 "초기 투여" 일 수 없을 것이다. 유사하게, 포유류가 3 주 동안 월요일, 수요일과 금요일 마다 방사선 조사된 경우, 첫 번째 월요일이 "초기 투여" 일 수 있으나, 두 번째와 세 번째 월요일은 아닐 것이다. 일반적으로, 방사선의 초기 투여는 방사선을 조사하지 않고 (예를 들어 1 Gy 이상의 용량과 같은 방사선의 치료적 용량을 받지 않고) 7 일 이상 후의 것이다.

본원에서 사용된 바와 같은 조사의 "기간" 에는 방사선의 1 회 초기 투여 후 추가적인 1 일 이상에 방사선이 투여된다. 방사선의 추가적인 투여는 예를 들어 연속일 (예를 들어 월요일, 화요일, 수요일), 격일 (예를 들어 월요일, 수요일, 금요일) 등, 또는 1 주 당 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 회로 있을 수 있다. 방사선의 주어진 기간은 임의의 7 일 연속 무-방사선 조사일을 포함할 수 없다. 반대로, 7 일 중단 후 방사선의 규칙적 투여 재개는 일반적으로 새로운 "기간" 의 시작을 나타낼 것이다.

면역사이토카인

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역사이토카인" 은 (i) 사전-선택된 항원, 예를 들어 세포-유형 특이적 항원에 대한 결합 특이성을 가지며 이에 결합할 수 있는 항체 결합 도메인과 (ii) 통상적으로 암 세포에 대한 세포파괴성 면역 반응을 유도하거나 자극할 수 있는 사이토카인의 융합물을 의미하는 것으로 이해된다. 사전-선택된 항원의 예는 예를 들어 암 세포 상의 세포 표면 항원, 및 세포와 직접적으로 결합하는지 여부에 상관없이 종양 미세환경에서 특징적인 기타 항원, 예를 들어 종양 근처에 분비 또는 다르게는 방출 또는 침착될 수 있는 항원; 종양 근처에서 세포외 막과 결합하는 항원; 또는 종양과 접촉하고/하거나 종양에 침투하는 양성 세포와 결합하는 항원을 포함한다. 바람직한 항원은 종양 특이적 항원과 같은 종양 세포에서 특징적인 표적 항원이다. 따라서, 면역사이토카인은 사이토카인을 생체내 표적 (통상 세포) 에 선택적으로 전달하여 사이토카인이 표적 세포에 대해 국소화된 면역 반응을 매개할 수 있게 한다. 예를 들어, 면역사이토카인의 항체 성분이 고형 종양, 특히 약 100 ㎣ 초과의 큰 고형 종양 내의 암 세포와 같은 암 세포 상 항원에 선택적으로 결합하는 경우, 면역사이토카인은 국소화된 항암 활성을 발휘한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 결합 도메인" 은 일부 이상의 면역글로불린 중쇄, 예를 들어 세포 유형과 같은 사전-선택된 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 가변부를 의미하는 것으로 이해된다. 항체 결합 도메인은 또한 바람직하게는 예를 들어 CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인, 또는 하나 이상의 CH3 도메인, 또는 하나 이상의 이의 일부를 포함하는 일부 이상의 면역글로불린 불변부를 포함한다. 또한, 면역글로불린 중쇄는 예를 들어 면역글로불린 경쇄 가변부 및 임의로는 경쇄 불변부를 포함하는 면역글로불린 경쇄에 공유결합적 또는 비-공유결합적으로 결합할 수 있다. 따라서, 항체 결합 도메인은 사전 선택된 항원에 결합할 수 있는, 손상되지 않은 항체 또는 이의 절편, 또는 단일 사슬 항체를 포함할 수 있는 것으로 고려된다.

면역사이토카인에 대해서는, 항체 절편이 당업자에게 널리 알려져 있는 다양한 방식에 의해 사이토카인에 연결될 수 있다고 고려된다. 예를 들어, 항체 결합 부위는 바람직하게는 폴리펩티드 결합 또는 링커를 통해 융합 단백질 구성물 내의 사이토카인에 연결된다. 대안적으로는, 항체 결합 부위는 항체 결합 부위 및 사이토카인 내에 존재하는 아미노산 측쇄 내의 반응기, 예를 들어 술프히드릴기를 통해 사이토카인에 화학적으로 결합할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사이토카인" 은 포유류에서의 사전 선택된 세포-유형, 예를 들어 암 세포 또는 바이러스 감염된 세포에 대한 세포파괴성 면역 반응을 자극하거나 유도할 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드, 이의 유사체 또는 기능적 절편을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 다양한 사이토카인이 본 발명의 면역사이토카인에 혼입될 수 있다고 고려된다. 본 발명의 면역사이토카인에 혼입될 수 있는 사이토카인은 예를 들어 종양 괴사 인자, 인터류킨, 콜로니 자극 인자 및 림포카인 뿐 아니라 당업계에 알려져 있는 다른 것들을 포함한다. 바람직한 종양 괴사 인자는 예를 들어 조직 괴사 인자 α (TNF α) 를 포함한다. 바람직한 인터류킨은 예를 들어 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-7 (IL-7), 인터류킨-12 (IL-12), 인터류킨-15 (IL-15) 및 인터류킨-18 (IL-18) 을 포함한다. 바람직한 콜로니 자극 인자는 예를 들어 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 를 포함한다. 바람직한 림포카인은 예를 들어 림포톡신 (LT) 을 포함한다. 다른 유용한 사이토카인은 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ 를 포함하는 인터페론을 포함하는데, 이의 항바이러스 활성에 독립적으로, 이들 모두는 면역학적 효과 뿐 아니라 항-혈관신생 효과를 갖는다. 변형된 형태의 사이토카인이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역사이토카인의 사이토카인 부분 내의 돌연변이는, 야생형 IL-2 에 대한 이의 고친화성 수용체에 대한 변형된 IL-2 의 선택성을 증가시켜 이의 독성을 감소시키는 IL-2 의 D20T 돌연변이와 같이, 면역사이토카인에 향상된 특성을 부여할 수 있다 (미국 특허 제 7,186,804 호에 개시된 바와 같음).

특정 관심 사이토카인을 인코딩하는 유전자는 새로이 (de novo) 클로닝되고, 이용가능한 공급원으로부터 수득되거나, 알려져 있는 뉴클레오티드 서열로부터 표준 DNA 합성에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, LT 의 DNA 서열은 알려져 있는데 (예를 들어 Nedwin et al. (1985) Nucleic Acids Res . 13: 6361 참조), IL-2 (예를 들어, Taniguchi et al. (1983) Nature 302: 305-318 참조), GM-CSF (예를 들어, Gasson et al. (1984) Science 266: 1339-1342 참조) 및 TNFα (예를 들어, Nedwin et al. (1985) Nucleic Acids Res . 13: 6361 참조) 에 대한 서열과 같다.

바람직한 구현예에서는, 면역사이토카인은 통상적인 재조합 DNA 방법론에 의해, 즉 키메라 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산 구성물을 형성시켜 생성된 재조합 융합 단백질이다. 재조합 항체-사이토카인 융합 단백질의 구성은 종래 기술에 기재되어 있다. 예를 들어, [Gillies et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 89: 1428-1432; Gillies et al. (1998) J. Immunol . 160: 6195-6203]; 및 미국 특허 제 5,650,150 호를 참조한다. 바람직하게는, 본 발명의 면역사이토카인을 인코딩하는 유전자 구성물은, 면역글로불린 중쇄 가변부 도메인을 인코딩하는 DNA 분절, 면역글로불린 중쇄 불변부를 인코딩하는 DNA 분절 및 사이토카인을 인코딩하는 DNA 를 5' 에서 3' 방향으로 포함한다. 융합된 유전자는 융합된 유전자가 발현되는 적절한 수용체 세포 내로 트랜스팩션시키기 위한 발현 벡터 내에서 어셈블링되거나 상기 벡터 내에 삽입된다. 하이브리드 폴리펩티드 사슬은 바람직하게는, 사전 선택된 항원에 결합하기 위한 단일 및 전체 부위를 생성하기 위해 중쇄의 면역글로불린 가변부 (V_H) 및 경쇄의 면역글로불린 가변부 (V_L) 가 조합되도록 면역글로불린 경쇄와 조합된다. 바람직한 구현예에서는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어 사슬간 디술피드 결합에 의해 공유결합한다. 또한, 두 면역글로불린 중쇄 (이 중 하나 또는 둘 모두가 사이토카인에 융합됨) 는, 예를 들어 하나 이상의 사슬간 디술피드 결합에 의해 공유결합될 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법은 WO99/29732, WO99/43713, WO99/52562, WO99/53958 및 WO01/10912 에 개시된 면역사이토카인 조성물 및 방법, 및 접합부 내에 변경된 아미노산 서열을 갖는 항체-기재 융합 단백질을 포함하는, 종양을 치료하기 위한 치료 방법에서 사용되는 면역사이토카인의 항-종양 활성을 강화시키는데 유용하다.

본 발명의 면역사이토카인은 그 구조의 두 가지 양상에 의해 키메라인 것으로 간주될 수 있다. 첫 번째로, 면역사이토카인은 주어진 사이토카인에 연결된 항원 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함한다는 점에서 키메라이다. 두 번째로, 본 발명의 면역사이토카인은 면역글로불린 가변부 (V) 및 면역글로불린 불변부 (C) 를 포함하며 이들 둘 모두 상이한 항체에서 유래하여 생성된 단백질이 V/C 키메라라는 점에서 키메라일 수 있다. 예를 들어, 가변부 및 불변부는 상이한 종류에서 단리가능한 자연발생적 항체 분자에서 유래할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호를 참조한다. 또한, 면역글로불린 가변부 중 어느 하나 또는 둘 모두가, 상이한 종류에서 유래한 골격부 (FR) 서열 및 상보성 결정 부위 (CDR) 서열을 포함하는 구성물이 포함된다. 이러한 구성물은 예를 들어 [Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525, Verhoyen et al. (1988) Science 239: 1534-1535], 및 미국 특허 제 5,225,539 호 및 제 5,585,089 호에서 개시된다. 또한 가변부 서열이, 원하는 친화성을 갖는 사전 선택된 항원에 결합하는 가변부 서열에 대한 라이브러리, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 유래될 수 있다는 것이 고려된다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하고 스크리닝하는 방법은 예를 들어 [Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281] 및 [Kang et al. (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88: 11120-11123] 에 개시된다.

면역사이토카인의 면역글로불린 중쇄 불변부 도메인은 IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε), IgG (lgγ) 및 IgM (Igμ) 으로 나타내어지는 5 가지 면역글로불린 부류 중 임의의 것에서 선택될 수 있다. 그러나, IgG 부류로부터의 면역글로불린 중쇄 불변부가 바람직하다. 또한, 면역글로불린 중쇄가 당업계에서 IgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4 로 나타내어지는 임의의 IgG 항체 하위부류에서 유래할 수 있다는 것이 고려된다. 알려져 있는 바와 같이, 각각의 면역글로불린 중쇄 불변부는 4 또는 5 개 도메인을 포함한다. 상기 도메인은 하기와 같이 연속하여 불린다: CH1-힌지-CH2-CH3-(-CH4). CH4 는 힌지 부분을 갖지 않는 IgM 내에 존재한다. 중쇄 도메인의 DNA 서열은 면역글로불린 부류 중에서 교차 상동성을 갖는데, 예를 들어 IgG 의 CH2 도메인은 IgA 및 IgD 의 CH2 도메인에 상동이고, IgM 및 IgE 의 CH3 도메인에 상동이다. 면역글로불린 경쇄는 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 불변부를 갖는다. 이들 면역글로불린 부분의 서열 및 서열 정렬은 당업계에 널리 알려져 있다 (예를 들어, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 미국 보건복지부 (U.S. Department of Health and Human Services), 제 3 판 1983, 제 4 판 1987, 및 Huck et al. (1986) Nuc . Acids Res . 14: 1779-1789 참조).

바람직한 구현예에서, 가변부는 사전 선택된 세포 표면 항원 (암 세포 또는 바이러스 감염된 세포와 같은 병든 세포와 결합하는 항원) 에 대해 특이적인 항체에서 유래하고, 불변부는 CH1, 및 CH2 및 CH3 도메인 (가변부의 공급원인 항체와 동일하거나 상이한 항체로부터의) 을 포함한다. 본 발명의 실행에서, 면역사이토카인의 항체 부분은 바람직하게는 의도된 수용체에서 비-면역원성이거나 약하게 면역원성이다. 따라서, 가능한 한 많은 항체 부위는, 바람직하게는 의도된 수용체와 동일한 종류에서 유래된다. 예를 들어, 면역사이토카인이 인간에게 투여되는 경우, 불변부는 바람직하게는 인간 기원의 것이다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호를 참조한다. 또한, 면역글로불린 가변부가 의도된 수용체 외의 종류에서 유래하는 경우, 예를 들어 가변부 서열이 쥐과 기원의 것이며 의도된 수용체가 인간인 경우, 가변부는 바람직하게는 FR 서열 사이에 개입된 쥐과 CDR 서열을 갖는 인간 FR 서열을 포함하여, 사전 선택된 항원에 대한 결합 특이성을 가지지만 한편 의도된 숙주에서의 면역반응성을 최소화시키는 키메라 가변부가 생성된다. 이러한 키메라 가변부의 설계 및 합성은 [Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525, Verhoyen et al. (1988) Science 239: 1534-1535], 및 미국 특허 제 5,225,539 호 및 제 5,585,089 호에 개시된다. 인간화 항체-사이토카인 융합 단백질, KS-1/4 항-EpCAM 항체-IL-12 융합 단백질의 클로닝 및 발현 뿐 아니라 정착된 결장암종 전이를 근절시키는 이의 능력은 [Gillies et al. (1998) J. Immunol . 160: 6195-6203] 에 기재되어 있다.

사이토카인을 인코딩하는 유전자는 직접적으로, 또는 링커, 예를 들어 프레임 내에서 (Gly₄-Ser)₃ 링커를 인코딩하는 DNA 에 의해, 면역글로불린 불변부를 인코딩하는 유전자의 3' 말단 (예를 들어 CH2 또는 CH3 엑손) 에 연결된다. 특정 구현예에서는, 링커는 단백질 분해 절단 부위를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 부위는, 면역글로불린 불변부와 사이토카인 사이에 개입된 경우, 표적 부위에서 사이토카인의 단백질 분해 방출을 제공하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 플라스민 및 트립신이 프로테아제에 대해 접근가능한 부위에서 리신 및 아르기닌 잔기 이후를 절단한다는 것이 잘 알려져 있다. 이들이 절단하는 많은 다른 부위-특이적 엔도프로테아제 및 아미노산 서열이 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 단백질 분해 절단 부위 및 이러한 절단 부위와 반응성인 단백질 분해 효소는 미국 특허 제 5,541 ,087 호 및 제 5,726,044 호에 기재되어 있다.

핵산 구성물은 임의로는, 키메라 면역글로불린 사슬의 발현을 조절하기 위한 가변부-인코딩 유전자에 대한 내인성 프로모터 및 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가변부 인코딩 유전자는 리더 펩티드, 경쇄에 대한 VJ 유전자 (연결 (J) 분절로 기능적으로 재배열된 가변 (V) 부), 또는 중쇄에 대한 VDJ 유전자, 및 이들 유전자에 대한 내인성 프로모터 및 인핸서를 포함하는 DNA 절편으로서 수득될 수 있다. 대안적으로, 가변부를 인코딩하는 유전자는 내인성 조절 요소와 별도로 수득될 수 있으며 이러한 요소를 제공하는 발현 벡터에서 사용될 수 있다.

가변부 유전자는 원하는 항체를 생성하는 세포로부터 표준 DNA 클로닝 절차에 의해 수득될 수 있다. 특정 기능적으로 재배열된 가변부에 대한 게놈 라이브러리의 스크리닝은 J 부분 DNA 서열 및 서열 하류를 함유하는 DNA 분절과 같은 적절한 DNA 프로브를 사용하여 이루어질 수 있다. 올바른 클론의 확인 및 확증은 클로닝된 유전자의 서열분석 및 전체 길이, 적절히 스플라이싱된 mRNA 의 상응하는 서열에 대한 서열 비교에 의해 이루어진다.

표적 항원은 종양 세포, 암 세포, 또는 다른 신생물 세포의 세포 표면 항원일 수 있다. 적절한 가변부를 인코딩하는 유전자는 일반적으로 면역글로불린-생성 림프 세포주로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 종양 결합 항원 또는 바이러스 항원에 특이적인 면역글로불린을 생성하는 하이브리도마 세포주는 당업계에 널리 알려져 있는 표준 체세포 하이브리드화 기술에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제 4,196,265 호 참조). 이러한 면역글로불린 생성 세포주는 기능적으로 재배열된 형태로 가변부 유전자 공급원을 제공한다. 대안적으로는, 가변부 서열은 원하는 친화성을 갖는 사전 선택된 항원에 결합하는 가변부 서열에 대한 라이브러리, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 유래될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하고 스크리닝하는 방법은 예를 들어 [Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281] 및 [Kang et al. (1991) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 88: 11120-11123] 에 개시되어 있다.

기능적으로 활성인 가변부 유전자를 인코딩하는 DNA 절편은 원하는 불변부 (또는 이의 일부) 를 인코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 절편에 연결된다. 면역글로불린 불변부 (중쇄 및 경쇄) 는 표준 유전자 클로닝 기술에 의해 항체-생성 세포로부터 수득될 수 있다. 인간 경쇄의 2 개 부류 (κ 및 λ) 및 인간 중쇄의 5 개 부류 (α, δ, ε, γ 및 μ) 에 대한 유전자가 클로닝됨으로써, 인간 기원의 불변부는 이러한 클론으로부터 쉽게 이용가능하다.

하이브리드 면역글로불린 중쇄를 인코딩하는 융합된 유전자는 수용체 세포에 혼입시키기 위한 발현 벡터 내에 어셈블링되거나 삽입된다. 유전자 구성물의 플라스미드 벡터 내로의 도입은 표준 유전자 스플라이싱 절차에 의해 이루어질 수 있다. 키메라 면역글로불린 중쇄가 상응하는 면역글로불린 경쇄를 갖는 동일 세포 내에서 공동 발현될 수 있어, 이로써 전체 면역글로불린이 동시에 발현되고 어셈블링될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 중쇄 및 경쇄 구성물이 동일하거나 개별적인 벡터 내에 위치할 수 있다.

수용체 세포주는 일반적으로 림프 세포이다. 바람직한 수용체 세포는 골수종 (또는 하이브리도마) 이다. 골수종은 트랜스펙션된 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린을 합성하고, 어셈블링하고, 분비할 수 있으며, 단백질을 글리코실화시킬 수 있다. 예시적 수용체 또는 숙주 세포는, 보통 내인성 면역글로불린 및 마우스 골수종 NS/0 세포를 생성하지 않는 Sp2/0 골수종을 포함한다. 트랜스펙션되는 경우, 상기 세포는 트랜스펙션된 유전자 구성물에 의해 인코딩되는 면역글로불린만을 생성한다. 트랜스펙션된 골수종은 배양물 내에서, 또는 분비된 면역사이토카인을 복수액으로부터 회수할 수 있는 마우스의 복막 내에서 성장할 수 있다. B 림프구와 같은 다른 림프 세포가 수용체 세포로서 사용될 수 있다. 중국 햄스터 난소 세포와 같은 비-림프 수용체 세포가 또한 사용될 수 있다.

키메라 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 핵산 구성물을 함유하는 벡터로 림프 세포를 트랜스펙션시키는 여러 방법이 존재한다. 예를 들어, 벡터는 스페로블라스트 (spheroblast) 융합에 의해 림프 세포 내에 도입될 수 있다 (예를 들어, Gillies et al. (1989) Biotechnol. 7: 798-804 참조). 다른 유용한 방법은 전기천공 또는 인산칼슘 침전법을 포함한다 (예를 들어, Sambrook et al. eds (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press 참조).

면역사이토카인을 생성하는 다른 유용한 방법은 구성물을 인코딩하는 RNA 서열의 제조 및 적절한 생체내 또는 세포내 발현 시스템에서의 이의 번역을 포함한다. 항체-사이토카인 융합 단백질을 인코딩하는 유전자를 합성하기 위한, 유전자를 숙주 세포에 도입하기 위한, 숙주에서 유전자를 발현하기 위한, 그리고 생성된 융합 단백질을 수확하기 위한 재조합 DNA 방법론이 잘 알려져 있으며 종래 기술에서 완전히 문서화되어 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 특정 프로토콜이 [Sambrook et al. eds (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press] 에서 기재된다.

화학적으로 결합된 면역사이토카인이 당업자에게 잘 알려져 있는 다양한 방법을 사용하여 생성될 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 항체 또는 항체 절편은 항체 또는 항체 절편 및 사이토카인 내의 화학적 반응성 아미노산 측쇄를 사용하여 사이토카인에 화학적으로 결합될 수 있다. 아미노산 측쇄는 예를 들어 디술피드 결합을 통해, 또는 예를 들어 N-숙시니미딜 3(-2-피리디일디티오)프로피오네이트, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙시네이트 에스테르, n7-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드 에스테르, 및 1,4-디-[3'(2'-피리딜티오)프로피온아미도]부탄 (모두 Pierce, Rockford, Ill 에서 시판됨) 을 포함하는 단일- 또는 헤테로-이관능성 가교제에 의해 공유결합될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 사용된 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해, 직접적으로 (예를 들어 조직 위치에 대한 주사, 이식 또는 국소 투여에 의한 바와 같이 국소적으로) 또는 전신적으로 (예를 들어 비경구 또는 경구) 포유류에 제공될 수 있다. 조성물이 정맥내, 피하, 안구, 복강내, 근육내, 볼 (buccal), 직장, 질, 안내, 뇌내, 두개골내, 척수내, 심실내, 수막강내, 수조내, 낭내, 비강내로 또는 에어로졸 투여에 의한 것과 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 조성물은 바람직하게는 일부의 수성 또는 생리학적으로 혼화가능한 유체 현탁액 또는 용액을 포함한다. 제형은 당업자에 의해 인지되고/되거나 일상적으로 개발될 것이다.

투여 당 면역사이토카인의 바람직한 투약량은 최대 내약 용량 미만이다. 예를 들어, 면역사이토카인은 최대 내약 용량의 1/2 미만, 1/3 미만, 1/4 미만, 또는 1/10 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 최대 내약 용량 (MTD) 은 물질이 허용가능한 독성 수준으로 투여될 수 있는 최고 용량이다. 허용가능한 독성 수준으로인 한편 최대 내약 용량으로 투여되는 물질은 여전히 악의적인 부작용을 일으킬 수 있다. 면역사이토카인에 의해 유발된 부작용은 사이토카인 단독에 의해 유발된 부작용보다 훨씬 덜 심각하다. 그러나 다양한 면역사이토카인 사용시, 열, 구역, 혈관 누수 및 고혈압을 포함하는 바람직하지 않은 부작용이 보고된 바 있다. 본 발명의 방법은 최대 내약 용량 미만의 용량으로 면역사이토카인이 효과적으로 사용되게 하는데, 이는 적은 부작용을 일으키는 이점을 갖는다. 투여되는 용량은 가변적으로, 사용된 면역사이토카인 및 기타 임상적 매개변수를 기준으로 하는데, 특정 구현예에서는 용량이 0.01 mg/kg 내지 20 mg/kg 의 면역사이토카인, 예를 들어, 적어도 0.03-15 mg/kg, 0.03-6 mg/kg, 0.03-1.5 mg/kg, 0.03-0.6 mg/kg, 0.5-20 mg/kg, 0.5-15 mg/kg, 0.5-10 mg/kg, 0.5-6 mg/kg, 0.5-5 mg/kg, 또는 0.5-1.5 mg/kg 이다. 투여된 면역사이토카인의 용량은 치료 전체를 통해 가변적일 수 있다. 예를 들어, 사이토카인은 수 일, 수 주 또는 수 개월 동안 더 자주 낮은 용량으로 투여될 수 있으며, 이후 수 일, 수 주 또는 수 개월 동안 덜 자주 높은 용량으로 투여된다. 예를 들어, 약 0.0375-0.6 mg/kg 의 용량을 연속 3 주 동안 1 주에 3 일 투여한 후, 용량을 약 0.0375-1.5 mg/kg 로 증가시켜 이후 3 주 동안 1 주에 1 일 투여할 수 있다.

면역사이토카인의 투여는 주기적 볼루스 주사에 의해, 또는 외부 저장소 (예를 들어 정맥내 백) 또는 내부 (예를 들어 생분해성 이식물) 로부터의 연속적인 정맥내 또는 복강내 투여에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 면역사이토카인과 방사선의 최적 병용, 투여 방식, 및 투여량이 당업계의 지식 수준 내의 일상적 실험에 의해 결정될 수 있음이 고려된다.

방사선은 면역 효과기 세포를 사멸시킬 수 있다. 예를 들어, 조사된 종양 내의 T 세포 및 수지상 세포는 조사 직후 감소한다. 그러나, T-세포 수준은 이후 기저 수준보다 더 높게 회복된다. 그러므로, 방사선 치료요법의 시기와 관련하여 면역사이토카인 용량 및 투여 일정이 중요하다. 방사선 치료요법 후 면역 효과기 세포의 회복이 면역사이토카인 투여의 면역자극 효과와 동시에 일어나도록 투여 일정을 잡는 것이 바람직하다.

한 구현예에서는, 면역사이토카인은 방사선 치료요법 동안 투여된다. 바람직한 구현예에서는, 면역사이토카인은 방사선 치료요법 후에 투여된다. 방사선 치료요법 동안, 또는 바람직하게는 방사선 치료요법 후의 면역사이토카인 투여는 상승 작용적 항-종양 효과를 일으킨다. 방사선 치료 전의 면역사이토카인 투여는 면역사이토카인이 방사선 치료 후에 투여되는 경우에 나타난 상승 작용적 항-종양 효과를 생성하는데 실패할 수 있다. 유사하게, 면역사이토카인 투여 개시 후 5 일 초과 동안 방사선 치료요법을 연장시키는 것은, 면역사이토카인 투여가 방사선 치료요법 완료 후 발생할 때보다 상승 작용적 효과를 감소시킬 수 있다. 이론에 속박되지 않고, 면역사이토카인 투여의 면역자극 효과는 면역사이토카인 투여 후, 또는 일부 경우 투여 동안 방사선 치료요법이 주어졌을 때, 방사선의 초기 면역억제 효과에 의해 무뎌질 수 있다. 한편, 면역사이토카인 투여는 상승 작용적 효과가 감소되도록 방사선 치료요법 후까지는 발생하지 않아야 한다.

방사선 및 면역사이토카인은 각각 도 1 에서 나타낸 예시적 스캐줄에서 표시한 바와 같이 단일 용량으로 투여될 수 있다. 도 1 을 참조로, 방사선 "R" 은 "R1" 일에 단일 용량으로 투여된다. 시간 또는 일수로 측정될 수 있는 간격 1-1 후, 면역사이토카인 "IC" 는 "IC1" 일에 단일 용량으로 투여된다. 바람직하게는, 방사선과 면역사이토카인 투여 사이의 간격 (간격 1-1) 은 0-21 일이다. 예를 들어, 간격 (간격 1-1) 은 1-21 일, 또는 2-21 일, 또는 2-14 일 등일 수 있다. 이후, 단일 용량의 면역사이토카인은 적합한 주기, 예를 들어 2 주마다, 3 주마다, 4 주마다, 5 주마다, 6 주마다, 7 주마다, 8 주마다, 9 주마다, 10 주마다, 11 주마다, 12 주마다 등에 투여될 수 있다. 예시적인 투여 일정은 하기와 같을 수 있다. 제 1 일에 단일 용량의 방사선을 투여하고, 제 4 일에 면역사이토카인 치료 사이클을 시작하여, 상기 면역사이토카인을 3-주 간격으로 단일 용량으로서 투여한다. 적합한 수의 치료 사이클 후 (예를 들어 5 내지 10), 투여 간격을 예를 들어 12 주 이하의 간격으로 증가시킨다.

또 다른 구현예에서는, 도 2 에서 나타낸 바와 같이, 방사선이 1 일에만 투여된 후 면역사이토카인이 여러 일에 투여된다. 도 2 를 참조로, 방사선 "R" 은 "R1" 일에 단일 용량으로 투여된다. 시간 또는 일수로 측정될 수 있는 간격 2-1 후, 면역사이토카인 "IC" 의 투여는 "IC1" 일에 시작된다. 면역사이토카인은 매일, 격일로, 3 일마다, 격주로, 매주, 연속으로, 또는 임의의 다른 적합한 일정으로, 투여가 "IC2" 일에 완료될 때까지 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역사이토카인은 2 연속일, 3 연속일, 4 연속일 등에 1 일 1 회로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 방사선 투여와 면역사이토카인 투여 시작 사이의 간격 (간격 2-1) 은 0-21 일 (예를 들어 1-21 일, 2-21 일, 2-14 일 등) 이다. 이후, 면역사이토카인은 적합한 간격, 예를 들어 2 주마다, 3 주마다, 4 주마다, 5 주마다, 6 주마다, 7 주마다, 8 주마다, 9 주마다, 10 주마다, 11 주마다, 12 주마다 등으로 투여될 수 있다. 예시적인 투여 일정은 하기와 같을 수 있다: 제 1 일에 단일 용량의 방사선을 투여하고, 제 4 일에 면역사이토카인 치료 사이클을 시작하여, 상기 면역사이토카인을 3-주 간격으로 3 연속일에 1 일 1회 투여한다. 적합한 수의 치료 사이클 후 (예를 들어 5 내지 10), 투여 간격을 예를 들어 12 주 이하의 간격으로 증가시킨다.

또 다른 구현예에서는, 도 3 에서 나타낸 바와 같이, 방사선 "R" 이 여러 일에 걸쳐 투여된 후, 면역사이토카인 "IC" 가 "IC1" 일에만 투여된다. 방사선은 바람직하게는 14 일을 초과하지 않는 (예를 들어 4-10 일) 기간에 걸쳐 (간격 3-1) 투여된다. 방사선은 매일, 격일로, 3 일마다, 연속적으로, 또는 임의의 다른 적합한 일정으로, 투여가 "R2" 일에 완료될 때까지 투여될 수 있다. 예를 들어, 방사선은 3 연속일, 4 연속일, 5 연속일 등에 투여될 수 있다. 면역사이토카인의 투여는 방사선 치료요법의 시작 "R1" 5 일 이상 후 (간격 3-2), 예를 들어 5 일 후, 6 일 후 등에 발생할 수 있다. 방사선 치료요법의 완료 "R2" 와 면역사이토카인의 투여 사이의 간격 (간격 3-3) 은 0 일 이상, 예를 들어 1 일, 2 일 등일 수 있다. 바람직하게는, 방사선 치료요법의 완료 "R2" 와 면역사이토카인 "IC1" 의 투여 사이의 간격 (간격 3-3) 은 2 일 이상, 예를 들어 2 일 , 3 일 등이다. 이후, 단일 용량의 면역사이토카인은 적합한 간격, 예를 들어 2 주마다, 3 주마다, 4 주마다, 5 주마다, 6 주마다, 7 주마다, 8 주마다, 9 주마다, 10 주마다, 11 주마다, 12 주마다 등에 투여될 수 있다. 예시적인 투여 일정은 하기와 같을 수 있다. 제 7 일에서 제 3 일에 분획화된 용량의 방사선을 5 연속일 (제 7 일, 제 6 일, 제 5 일, 제 4 일 및 제 3 일), 및 면역사이토카인 치료 사이클 시작 제 1 일 (3 일 후) 에 투여하여, 면역사이토카인을 3-주 간격으로 단일 용량으로서 투여한다. 적합한 수의 치료 사이클 후 (예를 들어 5 내지 10), 투여 간격을 예를 들어 12 주 이상의 간격으로 증가시킨다.

또 다른 구현예에서는, 도 4 에서 나타낸 바와 같이, 방사선 "R" 이 1 일 초과로 투여된 후, 면역사이토카인 "IC" 가 1 일 초과로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 방사선은 14 일을 초과하지 않는 (예를 들어 4-10 일) 기간에 걸쳐 (간격 4-1) 투여된다. 방사선은 매일, 격일로, 3 일마다, 연속적으로, 또는 임의의 다른 적합한 일정으로, 투여가 "R2" 일에 완료될 때까지 투여될 수 있다. 예를 들어, 방사선은 3 연속일, 4 연속일, 5 연속일 등에 투여될 수 있다. 면역사이토카인 투여의 시작은 방사선 치료요법의 시작 5 일 이상 후 (간격 4-2), 예를 들어 5 일 후, 6 일 후 등에 발생할 수 있다. 면역사이토카인 투여의 시작은 방사선 치료요법의 완료 1 일 이상 후 (간격 4-3) 에 발생할 수 있다. 바람직하게는 방사선 치료요법의 완료 "R2" 와 면역사이토카인 "IC1" 투여 시작 사이의 간격 (간격 4-3) 은 2 일 이상, 예를 들어 2 일, 3 일 등이다. 면역사이토카인은 매일, 격일로, 3 일마다, 격주로, 매주, 또는 임의의 다른 적합한 일정으로, 투여가 "IC2" 일에 완료될 때까지 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역사이토카인은 2 연속일, 3 연속일, 4 연속일 등에 1 일 1 회 투여될 수 있다. 이후, 면역사이토카인은 적합한 간격, 예를 들어 2 주마다, 3 주마다, 4 주마다, 5 주마다, 6 주마다, 7 주마다, 8 주마다, 9 주마다, 10 주마다, 11 주마다, 12 주마다 등으로 투여될 수 있다. 예시적인 투여 일정은 하기와 같을 수 있다: 제 7 일에서 제 3 일에 분획화된 용량의 방사선을 5 연속일, 및 면역사이토카인 치료 사이클 시작 제 1 일에 투여하여, 면역사이토카인을 3-주 간격으로 3 연속일에 1 일 1 회 투여한다. 적합한 수의 치료 사이클 후 (예를 들어 5 내지 10), 투여 간격을 예를 들어 12 주 이상의 간격으로 증가시킨다.

또 다른 구현예에서는, 도 5 에서 나타낸 바와 같이, 방사선 "R" 이 1 일 초과로 투여된 후, 면역사이토카인 "IC" 가 1 일 초과로 투여될 수 있다. 방사선은 매일, 격일로, 3 일마다, 연속적으로, 또는 임의의 다른 적합한 일정으로, 투여가 R2 일에 완료될 때까지 투여될 수 있다. 방사선의 시작 "R1" 과 면역사이토카인의 투여의 시작 "IC1" 사이의 간격 (간격 5-1) 은 바람직하게는 14 일을 초과하지 않는다 (예를 들어 4-10 일). 면역사이토카인 투여의 시작 "IC1" 은 방사선 투여 기간의 완료 "R2" 전에 발생할 수 있다. 면역사이토카인은 매일, 격일로, 3 일마다, 격주로, 매주, 연속적으로, 또는 임의의 다른 적합한 일정으로, 투여가 IC2 에 완료될 때까지 투여될 수 있다.

이러한 구현예가 방사선 과정 후 면역글로불린 투여를 포함하는 단일 치료를 기술하지만, 이러한 치료가 적절하게 반복될 수 있음이 예견된다. 예를 들어, 치료의 제 2 라운드에서, 방사선은 동일하거나 상이한 종양 부위에 투여될 수 있고/있거나 면역사이토카인 또는 상이한 면역사이토카인이 이후 투여될 수 있다.

다른 치료와의 병용

본 발명의 방법은 환자에서 원하는 생물학적 효과를 얻기 위해 다른 치료제 또는 방법과 병용으로 수행될 수 있다. 한 구현예에서, 약학 조성물은 종양의 수술적 절개 전, 동안, 또는 이후에 투여된다. 종양 조직의 완전한 수술적 제거는 종종 종양 조직의 주변 조직으로의 침습 및 덩어리의 부정형 가장자리에 의해 복잡해진다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용하는 종양의 치료는 종양 수축을 일으켜, 절개를 촉진시킬 것이다. 또한, 본 발명의 방법의 수술 후 성능은 잔여 종양 세포를 제거시킬 수 있다.

수술적 절개와 같이, 화학요법은 대부분의 암 유형에 대한 표준 치료법이다. 따라서, 본 발명의 방법은 화학 약품-기준 치료요법과 동시에, 그 전에, 또는 이후에 수행될 수 있다. 통상적인 화학요법제는 아드리아마이신, 아스파라기나아제, 블레오마이신, 부술판, 시스플라틴, 카르보플라틴, 카르무스틴, 카페시타빈, 클로람부실, 시타라빈, 시클로포스파미드, 캄프토테신, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, 에토포시드, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로무스틴, 메클로레타민, 머캅토푸린, 메플하란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 니트로수레아, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프로카르바진, 스트렙토조신, 테니포시드, 티오구아닌, 티오테파, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 탁솔, 트랜스플라티늄, 5-플루오로우라실 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 방법은 질환을 치료하기 위해 체내 호르몬 수준을 조작하는 호르몬 치료요법과 함께 수행될 수 있다. 많은 암은 체내 호르몬의 수준에 의해 어떤 식으로든 영향받으며, 마찬가지로, 호르몬 치료요법과 관련된 전형적인 치료제, 예를 들어 타목시펜은 순환 호르몬의 수준을 감소시키고/시키거나 호르몬 수용체에 대한 호르몬의 결합을 방해하는데 작용한다.

본 발명의 방법은 단일클론 항체, 예를 들어 베바시주맙 (Avastin), 세툭시맙 (Erbitux), 겜투주맙 (Mylotarg), 이브리투모맙 (Zevalin), 마투주맙 및 리툭시맙 (Rituxin) 의 투여와 병용으로 수행될 수 있다. 단일클론 항체는 다양한 메카니즘을 통해 작용한다. 예를 들어, 단일클론 항체는 특이적 종양 단백질에 결합할 수 있으며 면역 세포를 종양 부위로 유인한다. 일부 단일클론 항체는 다르게는 종양이 성장하고 퍼지게 할 수 있는 성장 신호를 차단함으로써 기능한다. 다른 단일클론 항체는 방사성 입자 또는 화학요법제 약물에 결합하며 방사선 또는 약물을 암 세포에 특이적으로 전달하는 역할을 한다.

표적 조직

본 발명의 방법으로 치료될 종양 및 암 세포의 유형은 모든 유형의 고형 종양, 예컨대 하기 유형의 암과 연관되는 것들을 포함한다: 폐, 두경부의 편평 세포 암종 (SCCHN), 췌장, 결장, 직장, 식도, 전립선, 유방, 난소암종, 신장암종, 림프종 및 흑색종. 종양은 구강 및 인두, 소화기계, 호흡기계, 뼈 및 관절 (예를 들어 골전이), 연조직, 피부 (예를 들어 흑색종), 유방, 생식기계, 비뇨기계, 눈 및 안와, 뇌 및 신경계 (예를 들어 신경교종), 또는 내분비계 (예를 들어 갑상선) 의 (즉, 이에 위치한) 암 과 연관될 수 있으며 반드시 제 1 종양인 것은 아니다. 구강과 연관된 조직은 혀 및 입 조직을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 암은 예를 들어 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭 및 췌장을 포함하는 소화기계의 조직에서 발생할 수 있다. 호흡기계의 암은 후두, 폐 및 기관지에 영향을 줄 수 있으며 예를 들어 비-소세포 폐암종을 포함한다. 종양은 또한 남성 및 여성 생식기계를 구성하는 자궁경부, 자궁체부, 난소 외음부, 질, 전립선, 고환 및 음경, 및 비뇨기계를 구성하는 방광, 신장, 신우 및 요관에서 발생할 수 있다.

종양은 임의의 단계에 있을 수 있으며, 다른 치료요법이 가해질 수 있다. 본 발명의 방법은 다른 형태의 암 치료요법에 내성이 있는 것으로 증명된 종양을 치료하는데 유용하다 (즉, 종양 세포의 파괴 또는 종양 크기의 감소). 종양은 또한 임의의 크기의 것일 수 있다. 이상적으로는, 암에 대한 인간 치료에 있어서, 본 발명의 방법으로 종양 성장 속도 감소, 암 (종양) 세포 사멸 및/또는 종양 크기 감소가 유도된다. 종양 세포 사멸이 예를 들어 지지 세포, 혈관화, 섬유성 매트릭스 등의 존재로 인해 종양 크기에서의 실질적 감소 없이 발생할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 종양 크기에서의 감소가 바람직하지만, 암 치료에서는 필요하지 않다.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 종양 크기를 적어도 약 5% (예를 들어, 적어도 약 10%, 15%, 20% 또는 25%) 감소시킨다. 보다 바람직하게는, 종양 크기는 약 30% (예를 들어, 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65%) 감소된다. 보다 더 바람직하게는, 종양 크기는 적어도 약 70% (예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%) 감소된다. 가장 바람직하게는, 종양은 완전히 제거된다. 그러나, 본원에서 토의한 바와 같이, 종양 크기의 감소가 바람직하지만, 필요하지는 않다. 필요한 모든 것은 종양의 성장 속도에서의 감소이다. 예를 들어, 종양은 이의 성장 속도가 감소되고, 성장하는 것이 완전히 정지되고, 수축되거나 완전히 제거될 수 있다. 종양 성장 속도에서의 임의의 감소는 치료 효과를 현실화시키기에 충분한 것이다.

효능의 평가

본 발명의 방법의 효능은 여러 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 종양 크기, 재발, 생존 및 면역 반응 개시의 측정 (예를 들어 유전자, 프로테오믹 또는 세포 프로파일링을 사용하는) 을 사용하여 치료 효능을 측정할 수 있다. 측정은 본 발명의 방법의 효능을 모니터링하기 위해 치료 전, 동안, 및 이후에 이루어질 수 있다. 방법의 효능은 환자에 대한 치료 과정을 통해 모니터링될 수 있다. 대안적으로는, 면역사이토카인과 방사선, 및 임의로는 다른 암 치료법의 어떤 병용이 정착된 종양 또는 암 세포의 면역 파괴가 강화되도록 상승 작용적으로 작용하는데 가장 효과적인지를 시험하기 위해, 하기 실시예 부분에서 기재된 동물 모델 또는 다른 적합한 동물 모델이 숙련된 기술자에 의해 사용될 수 있다. 또한, 신규한 면역사이토카인이 확인되었기 때문에, 숙련된 기술자는 이를 방사선의 항암 효과가 강화되도록 하는 신규한 면역사이토카인의 가능성을 평가하기 위한 효능 측정에 사용할 수 있을 것이다.

재발, 생존 및 종양 크기를 모니터링하여 본 발명의 방법의 효능을 평가할 수 있다. 재발 및 생존은 당업계에 알려져 있는 통계학적 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 인간 환자에서의 종양 크기는, 내시경 검사, 방사선 사진 영상화 (x-선 포함), 전산화 단층촬영 (CT) 스캔, 자기 공명 영상화 (MRI) 및 핵 영상화를 포함하는 당업계에 알려져 있는 많은 영상화 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 동물 모델에서의 종양 성장에 대한 치료요법의 효과는 영상화 방법, 또는 캘리퍼스 또는 체적 측정에 의해 모니터링될 수 있다.

본 발명의 방법의 효능은 또한 면역 반응이 자극되었는지 여부를 측정함으로써 측정될 수 있다. 면역 반응의 개시는 다양한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 한 예에서는, 유전자 발현 프로파일링을 수행하여, 본 발명의 방법에 의해 면역 기능에 중요한 유전자가 자극되었는지 여부를 측정할 수 있다. 발현 프로파일링은 종양 샘플, 또는 이의 발현 프로파일이 전신 면역 반응의 존재 또는 부재를 표시할 수 있는 림프절 샘플 또는 말초 혈액 단핵 세포와 같은 다른 샘플에 대해 수행될 수 있다. 샘플은 치료 전, 동안 및/또는 이후에 환자로부터 채취될 수 있다. 치료 포유류의 종양 조직으로부터 RNA 를 추출하며, 면역 반응과 연관되는 유전자의 발현 수준을 예를 들어 정량 실시간 PCR 에 의해 본 발명으로의 치료 전 및 이후에 평가할 수 있고: 면역 기능에 포함되는 유전자로부터 전사된 RNA 를 증폭하여, 치료 과정에 걸쳐 발현이 증가 또는 감소되는지 여부를 측정한다.

또 다른 예에서는, 치료요법 후에, 종양을 생검 또는 절개하고, 표준 조직학적 방법을 통해, 또는 특이적인 면역조직학적 시약을 통해 단면화하고 염색하여 면역 반응에 대한 병용 치료요법의 효과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 헤마톡솔린 및 에오신으로의 단순 염색으로, 고형 종양 내로의 림프구 침윤 (세포 면역 반응을 표시함) 에 있어서의 차이점이 밝혀질 수 있다. 또한, 특정 부류의 면역 세포에 대한 항체로의 박편 면역염색으로, 유도된 반응의 성질이 밝혀질 수 있다. 예를 들어, CD45 (일반적인 백혈구 마커), CD4 및 CD8 (T 세포 하위부류 확인용), CD25 (림프구 마커) 및 NK1.1 (NK 세포에 대한 마커) 에 결합하는 항체를 사용하여 본 발명의 방법에 의해 매개된 면역 반응의 유형을 평가할 수 있다. 추가적으로, 치료요법에 사용된 면역사이토카인에 대한 항체를 사용하여 면역사이토카인이 종양을 침윤하는 정도를 측정할 수 있다.

본 발명의 방법에 반응하여 자극된 면역 반응의 유형 및 정도는 또한, 면역 효과기 세포 집단을 분석하기 위한 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 를 사용하여 평가될 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여, 혈액 샘플과 같은 처리된 샘플을 CD4, CD8, CD25, CD44, CD62L, CD11b 및 DX5 와 같은 다양한 면역 세포 마커에 대한 항체의 칵테일에 노출시킨다. 각 종류의 항체를 칵테일 내의 다른 종류의 항체와 구별되는 발광 파장을 갖는 형광 표지로 표지한다. 이후 샘플을 FacsARIA (BD Biosciences) 와 같은 FACS 분류기로 처리하고, 다양한 세포 하위집단에 대해 분석한다.

면역 반응의 개시는 또한 효소-연결 면역흡착 스팟 (ELISPOT) 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 주어진 면역 세포가 자극되었는지 여부를 측정하기 위해, 단백질, 예를 들어 세포의 활성화시 생성되는 사이토카인에 대한 항체를 ELISPOT 플레이트 상에 코팅한다. 본 발명의 방법으로 치료한 마우스로부터의 비장세포를 플레이트에 첨가하고 인큐베이션한다. 세포가 활성화되는 경우, 이는 관심 단백질을 분비할 것이고, 단백질은 항체에 의해 포획될 것이다. 단백질의 상이한 에피토프에 특이적인 항체를 플레이트에 첨가한다. 이러한 항체를 당업계에 알려져 있는 많은 표지 중 임의의 하나로 표지할 수 있다. 흔히, 항체는 비오틴 표지되며, 스트렙타비딘-HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제) 를 또한 첨가한다. 표지의 존재 및 양을 이후 측정하여, 세포가 면역 반응에서 활성화된 정도를 측정한다.

대안적으로는, 본 발명의 방법에 의해 매개된 면역 반응의 유형은 예를 들어 [Lode et al. (1998) Blood 91: 1706-1715] 에서 기재된 통상적인 세포 소집합 고갈 연구에 의해 평가될 수 있다. 고갈 항체의 예는 T 세포 마커 CD4 및 CD8 과 반응하는 것들 뿐 아니라 NK 마커 NK1.1 및 asialo GM 과 결합하는 것들을 포함한다. 간략하게는, 이러한 항체는 본 발명을 개시하기 전 상당히 높은 용량 (예를 들어 약 0.5 mg/마우스의 용량) 으로 포유류에 주사되며, 이후 실험이 완료될 때까지 매주 간격으로 주어진다. 이러한 기술로, 포유류에서 관찰된 면역 반응을 이끌어내는데 필요한 세포 유형을 확인할 수 있다.

또 다른 접근법에서는, 병용 치료요법으로 치료된 동물에서 단리된 비장세포의 세포독성 활성을 다른 치료군으로부터의 것들과 비교할 수 있다. 비장세포 배양물은 대부분의 면역학 실험 매뉴얼에서 발견되는 표준 기술에 의해 회수된, 무균 비장의 기계적 저밈 (mincing) 에 의해 생성된다. 예를 들어, [Coligan et al. (eds) (1988) "Current Protocols in Immunology," John Wiley & Sons, Inc.] 를 참조한다. 생성된 세포를 이후 혈청, 항생제 및 저농도의 IL-2 (약 10 U/mL) 를 함유하는 적합한 세포 배양 배지 (예를 들어 GIBCO 로부터의 DMEM) 에서 배양한다. 예를 들어, NK 활성을 비교하기 위해서는, 3 일의 배양이 보통 최적인 반면, T 세포 세포독성 활성을 비교하기 위해서는, 5 일의 배양이 보통 최적이다. ⁵¹Cr 로 30 분 동안 종양 표적 세포 (예를 들어 LLC 세포) 를 방사성 표지하여 세포독성 활성을 측정할 수 있다. 과량의 방사성표지를 제거한 후, 표지된 세포를 다양한 농도의 배양된 비장 세포와 4 시간 동안 혼합한다. 인큐베이션 완료시, 이후 면역 세포에 의해 유도된 세포 용해 정도를 정량화하는데 사용되는 감마 계수기에 의해 세포로부터 방출된 ⁵¹Cr 을 측정한다. 통상적인 세포독성 T 림프구 (또는 CTL) 활성을 이러한 방식으로 측정한다.

치료 또는 치료를 위한 지불의 공인

본 발명의 방법에 따라서, 제 3 자, 예를 들어 병원, 클리닉, 정부 기관, 배상 부서, 보험 회사 (예를 들어 건강 보험 회사), HMO, 제 3 자 지불인, 또는 의료 비용을 지불하거나 배상하는 다른 부서가 치료를 공인하고, 치료를 위한 지불을 공인하거나, 치료 비용의 배상을 공인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 면역사이토카인을 이미 조사된 종양 또는 암 세포를 갖는 포유류에 투여하는 것을 공인하거나, 이의 투여를 위한 지불 또는 배상을 공인하는 것을 포함하는 보건 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 보건 방법은 면역사이토카인을 1 일 당 1 Gy 이상 (예를 들어 2 Gy/일 이상, 3 Gy/일 이상, 1-4 Gy/일, 1-10 Gy/일, 1-20 Gy/일, 2-4 Gy/일, 2-10 Gy/일, 2-20 Gy/일, 3-4 Gy/일, 3-10 Gy/일 또는 3-20 Gy/일) 의 용량으로 이미 조사된 종양을 갖는 포유류에게 투여하는 것을 공인하거나, 이의 투여를 위한 지불 또는 배상을 공인하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 보건 방법은 면역사이토카인이 종양에 대한 방사선 제 1 투여의 21 일 내 (예를 들어 18 일 내, 15 일 내, 12 일 내 또는 8 일 내) 에 투여되는 경우 면역사이토카인을 투여하는 것을 공인하거나, 이의 투여를 위한 지불 또는 배상을 공인하는 것을 포함할 수 있다. 한 구현예에서는, 보건 방법은 면역사이토카인이 면역사이토카인의 최대 내약 용량 미만의 용량, 예를 들어 면역사이토카인의 최대 내약 용량의 1/2 미만, 1/3 미만, 1/4 미만 또는 1/10 미만의 용량으로 투여되는, 방사선 치료 후 면역사이토카인을 투여하는 것을 공인하거나, 이의 투여를 위한 지불 또는 배상을 공인하는 것을 포함할 수 있다.

실시예

실시예 1: 물질 및 방법

단백질

셀렉티카인 (Selectikine) 또는 EMD521873 로서 또한 나타내어지는 NHS-IL2LT 를 NS/0 세포주에서 생성시키고 정제하였다. NHS-mulL12 를 NS/0 세포주에서 생성시키고 정제하였다.

세포

BALB/C 마우스에서 N-니트로소-N-메틸우레탄의 직장내 주사에 의해 유래되는 쥐과 결장 상피 세포주인 CT26 세포를 트랜스팩션시켜, PCR 에 의해 클로닝되고 레트로바이러스 벡터를 사용하여 모체 세포에서 발현된 인간 KS 항원 (KSA 또는 EpCAM) 을 발현시켰다 (Gillies 1998). CT26/KSA 세포를, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청, L-글루타민, 비타민, 나트륨 피루베이트, 비-필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신 및 Geneticin® (G418) 이 보충된 DMEM (Life Technologies, Inc.) 에서, 37℃ 및 7% CO₂ 에서 유지시켰다. G418 을 첨가하여 KSA 발현을 유지시켰다. CT26 및 CT26/KSA 세포를 암컷 BALB/C 마우스에 이식하였다.

쥐과 루이스 폐암종 세포주인 LL/2 (LLC) 세포를, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Life Technologies, Inc.) 에서, 37℃ 및 7% CO₂ 에서 유지시켰다. LLC 세포를 암컷 C57BL/6 마우스에 이식하였다.

쥐과 흑색종 세포주인 B16 세포를, 10% 열 활성화 소 태아 혈청, L-글루타민, 나트륨 피루베이트, 비-필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 (Life Technologies, Inc.) 에서, 37℃ 및 7% CO₂ 에서 유지시켰다. B16 세포를 암컷 C57BL/6 마우스에 이식하였다.

화학 약품 및 용액

EMD521873 을 128 mM 아르기닌, 6 mM 시트레이트, 2.35% 수크로오스, 0.05% Tween 80, pH 6.0 에서 제형화하였다. 알려져 있는 단백질 서열을 기준으로, 280 nm 에서의 흡광도 및 12.38 mg/OD₂₈₀ 의 이론적 흡광 계수 (extinction coefficient) 를 사용하여, 희석 용액의 단백질 농도를 측정하였다. 저장 용액을 1 개월 미만 동안 4℃ 에서 보관하였다. 마우스에 투여하기 위해, 제형화된 물질의 분취액을 저장액 바이알에서 제거하고, 0.9% 염수로 희석하고, 희석 후 1 시간 내에 동물에 주사하였다. 미사용 희석 물질은 폐기하였다.

NHS-mulL12 를 50 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, 0.05% Tween 80, pH 7.0 에서 제형화하였다. 마우스에 투여하기 위해, 제형화된 물질을 0.9% 염수로 0.5 mg/㎖ 로 희석하였다.

시스플라틴 (Cisplatin) (시스-디암민플래티늄 (II) 디클로라이드) 분말을 Sigma-Aldrich® (카탈로그 # P4394) 에서 입수하였다. 0.4 mg/㎖ 의 투여액을 0.9% 염수에서 제조하였다.

방법

종양 성장 검정을 위해, 배양물 내에서 대수증식적으로 성장하는 세포를 100 ㎕ 의 PBS 중 단일 세포 현탁액으로서 마우스의 상부 다리에 근육내 주사하였다. 이중 종양 모델을 사용하는 실험에서는, 세포를 또한 마우스의 옆구리에 이식하였다. 종양이 정착된 후, 치료를 개시하였다 (제 0 일). 실험 LLC-7 에서는, 정착될 때까지 종양을 옆구리에 이식하였다. 마우스를 제 0 일 내지 제 9 일에 치료한 후, 제 12 일에, 생존 수술을 사용하여 종양을 절개하였다. 이후, 동물 생존을 모니터링하였다. 실험 LLC-14 에서는, 정착될 때까지 종양을 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 제 0 일 내지 제 6 일 및 제 17 일에 치료하고, 연구 지속기간 동안 매주 2 회 종양 크기를 측정하였다.

하기의 표에서 각 실험에 대한 조건을 요약하였다.

[표 1]

실험의 지속기간 동안 3 가지 치수에 있어서 캘리퍼스로 종양을 측정하였다. 하기 등식을 사용하여 종양 부피를 측정하였다:

부피 = 4/3 π (L/2 x W/2 x H/2)

(식 중, L = 종양의 길이, W = 종양의 너비, 및 H = 종양의 높이임).

검정 기간 동안 동물을 칭량하고 일반적인 건강 상태를 모니터링하였다.

국소적 조사를 위해서, 마우스에 2% 트리브로모에탄올/3% 자일라진의 용액을 복강내 주사하여 마취시켰다. 주사량은 수용체 중량 g 당 0.02 ㎖ 였다. 마우스를 종양을 갖는 다리만 방사선에 노출되도록 억누르는 한편, 마우스 나머지 부분은 보호하였다. Gammacell® 40 Exactor (Nordion, Ottawa, ON) 를 사용하여, 1 Gy/분의 용량 속도로 종양에 ¹³⁷Cs 감마 방사선을 조사하였다.

혈액 내의 면역 효과기 세포 집단을 FACS 로 분석하였다. 혈액을 각 마우스의 후안구동에서 채취하였다. 용해 완충액을 사용하여 적혈구 세포를 제거하였다. 랫트 IgG 로 블로킹한 후 (1:50), 샘플을 CD4, CD8, CD25, CD44, CD62L, CD11b 및 DX5 에 대한 항체의 7-색 칵테일로 인큐베이션하였다. 샘플을 FacsARIA 상에서 실험 수행한 후 다양한 세포 하위집단에 대해 분석하였다.

항-IFNγ 항체 (쥐과 IFNγ 키트, BD Biosciences) 로 ELISPOT 플레이트를 1 차 코팅하여, 비장세포에서의 IFNγ 유도를 위한 효소-연결 면역스팟 C (ELISPOT) 검정을 수행하였다. 치료된 마우스에서의 비장세포를 플레이트에 첨가하고 AH1:A5 펩티드로 인큐베이션하여 CT26-특이적 T-세포로부터의 IFNγ 방출을 자극하였다. 비오티닐화 IFNγ 검출 Ab 및 스트렙타비딘-HRP 를 플레이트에 첨가하였다. Zeiss® KS-ELISPOT 플레이트 판독기를 사용하여, 개별적인 IFNγ-생성 림프구로부터의 생성된 스팟을 계수하였다.

수확시 RNAlater® RNA 안정화 시약 내에 둔 절개된 종양 조직을 사용하여 종양의 유전자 프로파일을 분석하였다. RNeasy® 키트 (Qiagen) 로 총 RNA 를 제조하고, qPCR 용 Superscript® III 키트 (Life Technologies, Inc.) 로 cDNA 를 제조하였다. 표준화 방식으로 ABI7500 기기에서 qPCR 반응을 수행하고, ddCt 법 (효율 인자 95%) 을 사용하여 유전자 발현에서의 상대적 변화를 분석하였다. 비교용으로 사용되는 항존 유전자 (Housekeeping gene) 는 ACTB, B2M 및 HPRT1 을 포함하였다.

평가 방법 및 통계학

피하 종양 성장 검정으로부터의 데이터를, 투여 동안 및 이후의 종양 부피 또는 중량의 평균 및 표준 편차 (sd) 를 나타내는 그래픽 형태로 나타내었다. 제 0 일에서의 초기 체중으로부터 각각의 시간 지점에서의 동물 중량을 뺀 후 이를 초기 체중으로 나누고 100 을 곱하여 동물 중량 변화를 측정하였다. 그러므로, 0 의 값은 중량 변화가 없었음을 나타낸다.

스튜던트 양방 t 검정 (Student's 2-tailed t test) 또는 만-휘트니 순위 합 검정 (Mann-Whitney Rank Sum test) 을 적절하게, 개별적인 종양 부피 또는 동물 중량에 대해 수행하여 치료군 사이의 유의한 차이점을 측정하였다.

실시예 2: 단일 용량의 방사선 후 면역사이토카인 치료의 효과

제 0 일에 단일 용량 방사선 조사 후 면역사이토카인의 i.v. 투여 (5 mg/kg) 의 효과를 3 가지 피하 공통유전자형 종양 모델 (CT26 결장암종, 인간 EpCAM 을 발현하는 CTs26/KSA 결장암종, 및 B16 흑색종) 에서 평가하였다. 다르게 나타낸 것을 제외하고는, 상기 실시예 및 하기 실시예는 셀렉티카인 또는 EMD521873 으로서 또한 지정되며 예를 들어 미국 특허 제 7,186,804 호에서 기재되는 예시적 면역사이토카인 dI-NHS76γ2(h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 를 사용하였다.

CT26/KSA 모델을 사용하는 3 가지 별도의 실험 (실험 CT26-1-3) 에서, 3 또는 4 Gy 로 종양을 조사한 후 제 2, 3 및 4 일에 EMD521873 을 투여하는 것은 대다수의 동물이 완전 퇴축 (complete regression) 을 달성하는 강한 상승 작용적 효과를 야기하였다. 내인성 CT26 항원을 사용하는 ELISPOT 검정으로, 치료요법 단독과 비교하여 T 세포 반응이 4 배 초과로 증가하였음이 입증되었다. 혈액 내의 효과기 T 세포에서의 4 배 증가가 치료요법 단독과 비교하여 관찰된 한편, qPCR 프로파일링 기술은 EMD521873 또는 방사선 단독과 비교하여 3.5-4.6 배 이상 증가된 CD8, 그랜자임 (Granzyme) B 및 IFNγ 유전자 발현을 갖는 종양에서의 T 세포 및 T 세포 활성화 관련 유전자가 극적으로 증가되었음을 나타냈다. 조절 T 세포와 연관되는 CD4⁺CD25⁺ 림프구 하위집단은 병용시 혈액 내에서 증가하였으나; 종양 내의 FoxP3 유전자 발현 수준은 증가하지 않았다. 또한, 면역사이토카인 KS-IL12 를 동일한 실험 조건 하에 시험하는 경우, 종양 내에서 측정된 면역 반응은 매우 유사하였는데, 이는 방사선과 면역사이토카인을 투여하는 것의 상승 작용적 효과가 EMD521873 의 사용에 제한되지 않거나, 심지어 NHS 부분 또는 IL2 부분을 갖는 면역사이토카인에 제한되지 않음을 나타낸다.

CT26 모델 (실험 CT26-4) 에서, 종양을 4 또는 8 Gy 로 조사한 후 EMD521873 을 제 2, 3 및 4 일에 i.v. 투여하였다. 8 Gy 용량과 EMD521873 과의 병용은 치료요법 단독보다 더 종양 성장을 차단하였다. 종양에서의 면역 반응은 모니터링하지 않았다.

B16 모델 (실험 B16-1) 에서, 종양을 10 Gy 로 d0 에 조사한 후 EMD521873 을 제 3, 4 및 5 일에 i.v. 투여하여, 치료 단독과 비교하여 더 큰 항-종양 활성이 야기되었다. 또한, 치료요법 단독과 비교하여 4 배 초과로 조정되는 CD25, TNFA, TYROBP, ICOS 및 CD45 를 갖는 면역 마커 유전자 발현 프로파일에 의해 측정된 바, 종양에서의 특정 면역 반응 마커에서 적당하지만 유의한 증가가 존재하였다.

실시예 3: 분획화된 용량의 방사선 후 면역사이토카인 다용량의 효과

제 0 일 - 제 4 일에 3.6 Gy 의 5 일간 용량 후 제 7, 8 및 9 일에 예시적 면역사이토카인 EMD521873 의 i.v. 투여 (5 mg/kg) 의 항-종양 효과를 루이스 폐암종 모델에서 평가하였다 (실험 LLC-1, LLC-2). 대조군 또는 단일치료요법군에서는 완전 반응이 관찰되지 않은 반면, 병용으로는 3/6 동물에서 완전 반응이 이루어졌다. 면역 마커 패널을 사용하는 유전자 발현 프로파일링으로, 방사선 또는 EMD521873 단독과 비교하여 병용 치료에 대해서, T 세포에 대한 마커, T 세포 활성화, 림프구 이동 (trafficking) 및 Th1 반응에서의 증가가 입증되었다. 상향조절된 유전자는 CD45, CISH, CD122, MGP, FASL, CD80, PTPRB, CD6, CCR7, TXK, CTLA4, PDCD1, IL10R, CCL6, CD8A, EOMES, CD28, TYROBP, ICAM1, CD206, VCAM1, CD3G, ITGAL, ITGB2, LAT, GZMK, STAT4, IL1A, CD115, MDM2, CD26, GIMAP3, CXCR4, LCK, HS6ST2 를 포함한다. 하향조절된 유전자는 IL23A, SELE, SC4MOL, LDLR, SQLE, RAE1, CXCL1, CCL2 를 포함한다.

실시예 4: 방사선 + 사이토카인 병용에 대한 화학요법 부가의 효과

화학요법 치료 (화학방사선) 와 병용된 방사선 이후 면역사이토카인 (이 실시예에서는 EMD521873) 치료의 항-종양 효과를 루이스 폐 피하 종양 모델 (LLC-14) 에서 평가하였다. 이 실시예에서는, 시스플라틴을 예시적 화학요법제로서 사용하였다. 종양을 갖는 동물 (n = 10) 을 화학방사선 단독 (시스플라틴 (4 mg/㎖) 및 분획화된 방사선 (3.6 Gy/d, d0-4)) 으로, EMD521873 (5 mg/kg/일 i.v.) 또는 NHS-mulL12 (10 ㎍/동물/일 s.c.) 단독으로, 또는 면역사이토카인 EMD521873 (5 mg/kg/일 i.v.) 또는 NHS-mulL12 (10 ㎍/동물/일 s.c) 와 병용된 화학방사선으로 치료하였다. 면역사이토카인을 d6 에 1 일만 투여하고, 다시 d17 에 1 일만 투여하였다. d24 까지 종양 크기를 매주 2 회 측정하였다. 도 6 에서 나타낸 바와 같이, NHS-mulL12 와 병용된 화학방사선으로 치료된 동물의 종양 성장 (개방 사각형) 은, 화학방사선 단독으로 치료된 동물 (폐쇄 삼각형), NHS-mulL12 단독으로 치료된 동물 (폐쇄 사각형), EMD521873 단독으로 치료된 동물 (폐쇄 원형), 또는 염수로 치료된 동물 (X) 과 비교하여 유의하게 감소되었다. 화학방사선은 또한 EMD521873 (개방 원형) 의 효능을 강화시켰다.

또 다른 실험 (실험 LLC-1, LLC-2, LLC-4) 에서는, 종양을 갖는 동물을 분획화된 방사선 단독 (3.6 Gy/d, d0-4), 시스플라틴 단독 (4 mg/kg, d0), EMD521873 단독 (5 mg/kg, d7, 8, 9), 이중 병용, 또는 삼중 병용으로 치료하였다. EMD521873 과 방사선의 병용은 임의의 단일 치료 및 다른 이중 치료와 비교하여 종양 성장을 감소시켰고, 3/6 완전 퇴축을 야기하였다. 방사선/EMD521873 치료요법에 시스플라틴을 첨가한 것은 추가적인 성장 제어 및 5/6 완전 퇴축을 야기하였다. 이러한 결과는, 방사선 또는 화학방사선 이후 EMD521873 으로의 치료요법이 방사선, 화학방사선, 또는 EMD521873 치료요법 단독과 비교하여 면역 반응 및 종양 제어를 향상시킨다는 것을 입증하였다.

동일한 실험 조건 하에 NHS-mulL12 를 면역사이토카인으로 사용하는 경우, 유사한 결과가 나타났다. 도 7 에서 나타낸 바와 같이, 상기 기재한 실험 조건 하에 NHS-mulL12 (폐쇄 원형) 또는 EMD521873 (개방 원형) 을 화학방사선과 함께 투여한 경우, 비치료 (X), 화학방사선 단독 (개방 사각형), EMD521873 단독 (개방 다이아몬드형) 또는 NHS-mulL12 단독 (개방 삼각형) 을 사용하여 나타낸 것에 비해 종양 성장에 있어서 감소가 야기되었다.

또 다른 실험에서 동일한 실험 조건이 사용되었고, 화학방사선 + EMD521873 의 삼중 병용 (개방 원형) 은 종양 부피에서의 감소 후 9/9 완전 퇴축을 유발하였다. 화학방사선 단독 (개방 삼각형) 을 투여한 경우, 평균적으로 종양 성장에 있어서 감소가 관찰되지 않았으며 단지 1/9 완전 퇴축만이 발생하였다. 대조 치료군 (X) 또는 EMD521873 단독 (개방 상자형) 이 사용된 경우, 종양 성장에서의 감소가 관찰되지 않았으며 완전 퇴축이 발생하지 않았다 (도 8).

실시예 5: 국소 조사 + 면역사이토카인 치료요법의 전신 항-종양 반응 생성 능력 (실험 LLC -3 - LLC -7)

종양 세포를 갖는 치료된 마우스를 재챌린지하여, 조사 후 예시적 면역사이토카인 EMD521873 의 정맥내 투여의 지속성 면역 반응 생성 능력을 시험하였다. 루이스 폐암종 종양을 갖는 마우스를 본래, 분획화된 방사선 (3.6 Gy/d, d0-4) + 시스플라틴 (4 mg/kg, d0), EMD521873 단독 (5 mg/kg, d7, 8, 9), 또는 EMD521873 + 화학방사선의 병용으로 치료하였다. 완전 반응의 수를 측정한 후, 50 일 초과 동안 완전 경감이 이루어진 이들 마우스를 LLC 세포를 s.c. 주사하여 재챌린지한 후 이전에 치료받지 않은 무경험 마우스와 비교하여 종양 성장을 모니터링하였다. 표 2 는 EMD521873/화학방사선 치료로 완전 반응률을 달성한 13 마리 마우스 중 12 마리 마우스에서 종양이 재성장되지 않았음을 나타내는데, 이는 LLC 종양 세포에 대해 장기간 보호 면역성이 발전되었음을 입증한다.

[표 2]

치료된 C57BL/6 마우스의 루이스 폐암종 세포로의 재챌린지

또 다른 실험에서는, 동일한 동물의 다리와 옆구리 모두에서 LLC 종양을 피하 정착시켰다. 이후 동물을 시스플라틴 (4 mg/kg, d0) + 다리 종양에 투여된 분획화 방사선 (3.6 Gy/d, d0-4), i.v. EMD521873 단독 (5 mg/kg, d7, 8, 9), 또는 EMD521873 + 화학방사선의 병용으로 치료하였다 (실험 LLC-6). 조사된 다리 종양 및 비-조사된 옆구리 종양 모두에서의 종양 성장 및 면역 반응을 모니터링하였다. 이전의 연구에서와 같이, 화학방사선 후 EMD521873 의 병용으로, 조사된 병변의 양호한 성장 제어가 이루어졌다. 병용 치료요법에 의한 옆구리 종양의 성장 제어가 EMD521873 단독으로의 제어를 능가하지는 못했으나, 비-조사된 병변에서의 병용 치료요법에 대한 면역 반응의 분석은 면역 반응의 강화를 입증하였다. CD8 효과기 세포는 화학방사선 또는 EMD521873 단독과 비교하여 병용 치료요법으로 혈액 내에서 약 4 배 증가하였다. 면역조직화학적 검정은, 단일치료요법과 비교하여 병용 치료요법으로 치료된 종양에서의 CD8 세포 침윤이 비-조사된 병변에서의 3.5 배 대 조사된 병변에서의 9 배로 강화되었음을 나타내었다. 면역 유전자 발현 프로파일링은 마찬가지로 다리 종양과 옆구리 종양 모두에서 EMD521873 + 화학방사선이 EMD521873 또는 화학방사선 단독보다 더 크게 CD3 (20 배 초과, 다리; 8 배, 옆구리), CD8 (10 배, 다리; 3.5 배, 옆구리), CISH (5.8 배, 다리; 3.2 배, 옆구리), CXCL9 (10.5 배, 다리; 14 배, 옆구리), 및 IFNg (14 배, 다리; 7 배, 옆구리) 를 증가시켰음을 나타내었다. 조사된 종양에서 관찰된 증가가 일반적으로 옆구리 종양에서보다 더 크지만, 이러한 결과는 제 1 병변의 국소 방사선 + 화학요법 및 EMD521873 이 방사선 범위 내에 없는 종양에서의 상승 작용적 면역 반응을 생성시킬 수 있다는 것을 입증한다.

또 다른 실험에서는 국소 조사 후 면역사이토카인 투여의 수술 후 종양 재발 감소 능력을 시험하였다 (실험 LLC-7). 피하 LLC 종양을 갖는 마우스를 화학방사선 (시스플라틴 4 mg/kg, d0 + 3.6 Gy/d, d0-4 에 종양에 분획화 방사선 조사) 또는 EMD521873 (5 mg/kg, d7, 8, 9) + 화학방사선으로 치료하였다. 남아있는 종양을 이후 제 12 일 또는 제 13 일에 수술적으로 제거하고 생존을 모니터링하였다. 방사선 단독으로 치료된 10 마리 마우스 중 6 마리와 비교하여, 병용 치료요법으로 치료된 12 마리 마우스 중 10 마리에서 장기간 생존이 달성되었다. 차이점이 통계적으로 유의하지 않지만 (p = 0.23), 이는 병용이, 화학방사선 단독과 비교하여 EMD521873 + 화학방사선의 병용에 대해서 수술 후 재발 또는 전이성 퍼짐에 대한 향상된 보호를 제공할 것이라는 것을 제안하였다.

실시예 6: 화학방사선 + 사이토카인 ( IL -2) 치료요법으로의 치료에 대한 화학방사선 + 면역사이토카인으로의 치료의 비교 (실험 LLC -8 및 LLC -9)

예시적 사이토카인 IL-2 + 화학방사선에 대한 예시적 면역사이토카인 EMD521873 + 화학방사선의 병용을 비교하기 위해 실험을 설계하였다. 피하 LLC 종양을 갖는 마우스를 화학방사선 (시스플라틴 4 mg/kg, d0 + 3.6 Gy/d, d0-4 에 종양에 분획화 방사선 투여), i.v. EMD521873 단독 (5 mg/kg, d7, 8, 9), i.v. IL-2 단독 (EMD521873 과 비교하여 등몰의 IL-2 용량, 1.5 mg/kg, d7, 8, 9, 10, 11), 또는 EMD521873 + 화학방사선 또는 IL-2 + 화학방사선의 병용으로 치료하였다. 종양 성장 제어, 반응률, 및 종양 내의 면역 반응을 이후 모니터링하였다.

EMD521873 병용에 대해서는, 총 12 개의 면역 발현 마커 (GZMB, PDCD1, NKG7, NKG2D, CD3G, ITGAL, CD122, CD8A, FASL, CTLA4, INOS, CD25) 가 단일치료요법에서 달성된 최대 수준에 대해 병용군에서 3 내지 6 배 이상 상향조절되었다. 반대로, D10 종양 세포에서의 IL2 와 화학방사선의 병용의 효과는 사이토카인으로부터의 명백한 기여 없이 화학방사선 단독의 경우와 유사하였다. 완전 반응률 및 종양 성장 제어의 비교는 면역 반응 데이터를 반영하였다. EMD521873 병용으로, IL-2 병용 (완전 반응을 갖는 2/6 동물로의 제 21 일에서 T/C = 0.09) 과 비교하여 더 양호한 성장 제어 및 완전 반응률이 달성되었다 (완전 반응을 갖는 4/6 동물로의 제 21 일에서 T/C = 0.03). 중요하게는 EMD521873 병용 치료요법으로, IL-2/화학방사선 병용과 비교하여 우수한 기억 반응이 달성되었다. EMD521873/화학방사선 병용으로부터 완전 반응을 갖는 4 마리 마우스 중 4 마리는 LLC 세포로 재챌린지되도록 면역성이었다. 반대로, IL-2/화학방사선 병용 치료요법에서 완전 반응을 갖는 2 마리 마우스 중 종양으로 재챌린지되도록 면역성인 마우스는 없었다.

또한, EMD521873/화학방사선으로 나타낸 것들과 유사한 결과가, 동일한 실험 조건 하에 화학방사선과 병용되는 또 다른 면역사이토카인, NHS-IL2wt 로 나타났다. NHS-IL2wt 는 예를 들어 미국 특허 제 7,186,804 호에 기재된다. 이러한 결과는 방사선 또는 화학방사선 및 면역사이토카인 투여의 상승 작용적 효과가 EMD521873 보다는 면역사이토카인으로 관찰될 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 7: 고정 용량으로의 병용에서의 방사선 용량-반응 및 화학요법 + 면 역사이토카인의 일정 (실험 LLC -3)

방사선의 용량이 화학방사선 + 면역사이토카인의 병용의 항종양 효과에 어떻게 영향을 주는지 검사하기 위해서, 피하 LLC 종양을 갖는 마우스를 시스플라틴 (4 mg/kg, d0) + 제 0 일 - 제 4 일에 조사된 0, 0.4, 1.2, 또는 3.6 Gy/d 의 국소 조사로 치료하였다. 화학방사선 이후에는 치료를 수행하지 않거나 EMD521873 (5 mg/kg, d7, 8, 9) 을 처리하였다. 종양 크기 및 반응률을 이후 모니터링하였다. 시스플라틴 + 0.4 Gy/d 와의 EMD521873 병용은 EMD521873 단독 또는 EMD521873 + 시스플라틴에 대해 종양 성장 제어를 향상시키지 않았다. EMD521873 과 병용된 1.2 Gy/d 는 단독의 치료요법 중 어느 하나와 비교하여 성장 제어를 향상시켰으나; 병용 또는 단일치료요법으로는 완전 반응이 달성되지 않았다. 마지막으로, EMD521873 과 병용된 시스플라틴 + 3.6 Gy/d 용량은, 시스플라틴 + 3.6 Gy/d 군 (0/6 완전 반응을 갖는 제 19 일에서 T/C = 0.32) 또는 EMD521873 단독군 (0/6 완전 반응을 갖는 제 19 일에서 T/C = 0.69) 과 비교하여, 종양 성장 제어 및 완전 반응률을 극적으로 향상시켰다 (5/6 완전 반응을 갖는 제 19 일에서 T/C = 0.02).

실시예 8: 고정 용량으로의 병용에서의 면역사이토카인 용량 반응 및 화학방사선 일정 (실험 LLC -10)

면역사이토카인의 용량이 화학방사선 + 면역사이토카인 병용의 항종양 효과에 어떻게 영향을 주는지 검사하기 위해서, 피하 LLC 종양을 갖는 마우스를 증가 용량의 i.v. EMD521873 (0, 1 , 5, 또는 15 mg/kg, d7, 8, 9) 단독 또는 화학방사선 (d0 에서의 4 mg/kg 시스플라틴 + d0-4 에서의 3.6 Gy/d 국소 종양 조사) 과 병용하여 치료하였다. 종양 크기, 반응률, 및 종양에서의 면역 유전자 조정을 이후 모니터링하였다. 사용된 용량 범위에 대해서는 용량-반응이 확립되지 않았는데, 이는 화학방사선과 병용된 모든 용량이 유사한 성장 제어, 반응률 (1, 5 및 15 mg/kg EMD521873 + 화학방사선에 대해 각각 CR = 2/8, 3/8 및 3/8) 및 면역 유전자 조정 프로파일을 부여했기 때문이다. 성장 제어에 대한 효과를 도 9 에 나타내었다: 1 mg/kg (폐쇄 사각형), 5 mg/kg (폐쇄 삼각형) 및 15 mg/kg (폐쇄 원형) EMD521873 의 화학방사선과의 병용은, 1 mg/kg (개방 사각형), 5 mg/kg (개방 삼각형) 및 15 mg/kg (개방 원형) EMD521873 단독, 화학방사선 단독 (+), 또는 비히클 단독 (X) 과 비교하여 유사하게 감소된 종양 부피를 야기하였다. 이러한 결과는, 최대 내약 용량 미만의 EMD521873 용량이 효능에 유의하게 영향을 주지 않고 화학방사선과 안전하게 병용될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 9: 면역사이토카인 투여 전 방사선 용량 수 연장의 효과 (실험 LLC -13)

면역사이토카인 투여 전에 방사선을 얼마나 연장하여 투여하는 것이 병용의 유효성에 영향을 주는지 검사하기 위해서, 피하 LLC 종양을 갖는 마우스를 예시적 면역사이토카인 EMD521873 (마지막 용량의 방사선 3 일 후 3 일간 i.v. 용량으로 투여) 투여 전 1 주 (시스플라틴, d0 에 4 mg/kg, 및 d0, 2, 4 에 3.6 Gy/d), 2 주 (시스플라틴, d0 에 4 mg/kg, 및 d0, 2, 4, 7, 9, 11 에 3.6 Gy/d), 또는 3 주 (시스플라틴, d0 에 4 mg/kg, 및 d0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 에 3.6 Gy/d) 동안 화학방사선으로 치료하였다. 종양 크기, 반응률, 및 종양에서의 면역 유전자 조정을 이후 모니터링하였다.

이전의 결과와 유사하게, 1 번째 주에 시스플라틴 + 방사선으로 치료된 후 EMD521873 으로 치료된 마우스에서는 단독 치료요법 중 어느 하나와 비교하여 4/10 완전 반응 및 종양 성장 제어의 강화가 달성되었다. 반대로, EMD521873 전에 2 주 또는 3 주 동안 시스플라틴 + 방사선으로 치료된 마우스에서는 화학방사선 단독과 비교하여 단지 2/10 또는 0/10 완전 반응이 각각 달성되었고, 종양 성장 제어의 강화도 나타나지 않았다. 또한, 상이한 섭생법으로 치료된 마우스로부터의 종양에서의 면역 반응 유전자 프로파일의 분석은 1 번째 주에서의 방사선 치료 후 EMD521873 이 핵심 Th1-관련 유전자에 있어서 최강의 강화를 제공하였다는 것을 나타내었다 (비처리 대조군과 비교하여 대략적 배-유도: CD3, 50; CD8, 19; IFNγ, 22; CD25, 45; 그랜자임, 22; 및 퍼포린, 8). 비교하여, 방사선이 EMD521873 전 2 주에 주어진 경우 면역 반응이 무뎌진 반면 (비처리 대조군과 비교하여 대략적 배-유도: CD3, 14; CD8, 6; IFNγ, 10; CD25, 22; 그랜자임, 2; 및 퍼포린, 5), EMD521873 전 3 주에 주어지는 방사선은 면역 반응의 거의 완전한 저지를 야기하였다. 이러한 결과는, EMD521873 투여 전 단지 1 주 동안만 화학방사선을 부여하는 것이 2 주 또는 3 주 방사선 섭생법보다 우수하다는 것을 입증한다.

실시예 10: 화학방사선 동안 면역사이토카인 투여의 효과 (실험 LLC -12).

방사선 과정 동안 면역사이토카인을 어떻게 투여하는 것이 병용의 유효성에 영향을 주는지 검사하기 위해서, 피하 LLC 종양을 갖는 마우스를, 제 7, 8, 9 일에 예시적 면역사이토카인 EMD521873 (5 mg/kg) 을 정맥내 투여하거나 투여하지 않고 1 주 (3.6 Gy/d; d0, 2, 4), 2 주 (3.6 Gy/d; d0, 2, 4, 7, 9, 11 ), 또는 3 주 (3.6 Gy/d; d0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18) 동안 방사선으로 치료하였다. 종양 크기, 반응률, 및 종양에서의 면역 유전자 조정을 이후 모니터링하였다. 결과는 방사선의 1 주 이후 EMD521873 의 투여가 대다수의 종양 퇴축을 야기하였으나; 완전 반응은 없었음을 나타내었다. 유사하게, 방사선의 2 주 과정의 2 번째 주 동안, 또는 방사선의 3 주 과정의 2 번째 주 동안 EMD521873 의 투여는 EMD521873 또는 방사선 단독과 비교하여 종양 퇴축 및 향상된 종양 성장 제어를 또한 야기하였다. 그러나, 방사선의 3 주 과정 동안의 2 번째 주 동안 EMD521873 을 투여하는 것으로는 추가적인 종양 제어를 달성할 수 없었던 한편, 면역 유전자 프로파일링은 방사선의 1 주 또는 2 주 과정의 2 번째 주 동안 EMD521873 을 투여한 종양에서 관찰된 것과 비교하여, 종양에서의 면역 반응이 추가적인 방사선에 의해 무뎌졌다는 것을 입증하였다. 이러한 면역 효과는 또한 상기 기재된 결과와 일치하는데, 이는 지속된 방사선이 EMD521873/방사선 병용의 면역 효과가 무뎌지게 했다는 것을 나타낸다.

실시예 11: 화학방사선 전 면역사이토카인 투여의 효과 (실험 LLC -11)

방사선 전 면역사이토카인을 투여하는 것이 강화된 항-종양 효과를 야기하는지 여부를 검사하기 위해서, 피하 LLC 종양을 갖는 마우스를 2 번째 주 (3.6 Gy/d; d7, 9, 11) 또는 2 번째 및 3 번째 주 (3.6 Gy/d; d7, 9, 11, 14, 16, 18) 에서 방사선으로 치료하기 전 1 번째 주에 예시적 면역사이토카인 EMD521873 (5 mg/kg, d0, 1, 2) 으로 치료하였다. 종양 크기, 반응률, 및 종양에서의 면역 유전자 조정을 이후 모니터링하였다. 결과는 EMD521873 의 투여 후 1 또는 2 주 동안의 방사선이 EMD521873 또는 방사선 섭생법 단독과 비교하여 종양 성장 제어에 있어서 증가를 제공하였다는 것을 나타내었다. 그러나, 방사선이 EMD521873 이전에 주어진 경우 관찰된 바와 같이, 종양 퇴축도, 완전 반응도 달성되지 않았다. 또한, 병용을 위한 면역 유전자 반응 프로필의 분석은 EMD521873 또는 방사선 섭생법 단독과 비교하여 유의하게 영향받지 않았다. 이러한 결과는 상기 결과와 함께, EMD521873 투여에 관한 방사선의 시기 및 지속기간이 항-종양 면역 반응 및 종양 성장 제어를 달성하는데 중요하다는 것을 입증한다.

실시예 12: 인간 폐암의 치료

백금-기재, 제 1 선 화학요법의 4 사이클 적용 후, 악성 늑막 삼출물을 갖는 비-소세포 폐암 병기 IIIb, 또는 질환 제어 (부분 반응 또는 안정한 질환) 를 갖는 병기 IV 의 대상에서의 제 1 종양 또는 전이의 국소 조사 (20 Gy) 와 병용된 EMD521873 을 사용하여 용량-상승 시험을 수행하였다.

EMD521873 으로의 제 1 치료 사이클 전에 5 연속일에 걸쳐 대상에게 국소 조사 (5 x 4 Gy) 하였다. 2-일 비-치료 간격 후, EMD521873 을 3 주 사이클에서 3 연속일에 정맥내 주입하였다.

각각의 사이클에서, 환자에게 EMD521873 을 3 연속일 (제 1 일 - 제 3 일) 에 1 일 1 회, 1 시간 정맥내 주입한 후 18-일 비-치료 휴식을 가지게 하였다 (제 4 일 - 제 21 일).

0.15, 0.30 및 0.45 mg/kg 의 용량 수준에서 3 명 대상의 코호트에서 EMD521873 의 용량 상승을 수행하였다. 다음 용량 수준으로의 상승은, 존재한다면, 용량 제한 독성 (DLT) 평가 기간 (즉, 제 1 사이클에서 EMD528173 의 제 1 주입일 후 21 일) 동안 관찰된 용량 제한 독성의 수를 기준으로 하였다. DLT 는 시험 치료 (EMD521873 및/또는 방사선) 에 대한 바와 같이 평가된 3 등급 이상의 임의의 독성으로서 정의된다. 3 명의 대상에서 DLT 가 발생하지 않은 경우, 다음의 3 명 대상을 다음으로 높은 용량 수준에서 보충하였다. 3 명의 대상 중 1 명의 대상이 DLT(들) 를 경험하는 경우, 3 명 대상의 추가적인 코호트에 동일한 용량 수준을 주었다. 추가적인 3 명의 대상 중 1 명 이상이 DLT 를 경험하는 경우, MTD 가 초과된 것으로 여겨질 것이며 용량 상승이 중단될 것이다. 선행 용량 수준이 MTD 로 고려될 것이다. 3 명의 대상 중 2 명 또는 3 명이 DLT 를 경험하는 경우, MTD 가 초과된 것으로 여겨질 것이며 용량 상승이 중단될 것이고, 선행 용량 수준이 MTD 로 고려될 것이다.

DLT 가 0.15 mg/kg 의 용량 수준으로 치료된 6 명의 대상 중 1 명에서 발생하는 경우, 0.3 mg/kg 으로 상승시키기 전에 0.225 mg/kg 의 중간 용량 수준을 도입한다. DLT 가 0.15 mg/kg 의 용량 수준으로 치료된 2 명 이상의 대상에서 발생하는 경우, 0.075 mg/kg 의 용량 수준이 탐색된다. 0 명 또는 1 명의 대상이 이러한 용량 수준에서 DLT 를 경험하는 경우, 0.075 mg/kg 가 MTD 로 고려될 것이다.

CT 또는 MRI 스캔에 의해 측정되는 바와 같이, 심지어 MTD 미만의 용량 수준으로 치료된 대상에서도 향상된 비율의 종양 반응이 입증될 것이며, 생존 및/또는 폐 기능에서의 향상이 입증될 수 있다.

실시예 13: 인간 흑색종의 치료

국소 조사 (25 Gy) 와 병용된 EMD521873 에 대한 종양 부위 및 혈액에서의 EMD521873 에 대한 병기 IIIB-IV 피부/피하 악성 흑색종을 갖는 환자에서의 피부 전이의 반응을 조사하기 위해 연구를 수행하였다. EMD521873 으로의 제 1 치료 사이클은 제 1 일에 시작한다. 후속 사이클을 3-주 간격으로 시행한다. EMD521873 의 제 1 용량 전에, 상이한 전이에 대해 5 연속일 (제 28 일 내지 제 24 일; 및 제 7 일 내지 제 3 일) 에 5 Gy 의 분획으로 2 개 과정의 국소 방사선 (25 Gy) 으로 대상을 치료하였다.

각각의 환자에 대해서, 생검에 적당한 2 개 이상의 피부 또는 피하 병변을 잠재적 방사선에 대해 선택하고 (병변 A1 및 병변 A2), 존재하는 경우, 제 3 병변 (병변 A3) 을 또한 선택하였다. 피부/피하 병변 (병변 A1) 의 생검 및 혈액 샘플링을 기저선 (D-28) 에서 수행하였다. 생검 부위의 치유에 필요한 7 일 후, 제 21 일에 시작하는 5 연속일 (D-21 내지 D-17) 에 걸쳐 병변 A1 을 조사하였다 (5 x 5 Gy). 제 7 일 (D-7) 에 혈액 샘플을 회수하고 조사된 병변 A1 의 생검을 수행하였다. 이러한 종양 샘플은 방사선 단독의 효과를 평가하기 위한 개인내 대조군으로서 역할한다. 제 14 일에, 사전 선택된 병변 A2 및 A3 을 또한 생검하고 혈액을 빼냈다. 상기와 같지만 (5 x 5 Gy) 제 7 일에 시작하여 (D-7 내지 D-3), 병변 (A2) 에 대해서만 국소 방사선을 수행하였다. 2 일 비-치료 간격 후 (즉, 제 1 일에 시작), 0.3 mg/kg EMD521873 을 3 연속일 (D 1-3) 에 1 시간 정맥내 주입으로 투여하였다. 기저선 (D-28) 및 개인내 대조군 (방사선만) 및 D-14 에 채취된 생검에 대한 비교를 위해, 조사된 병변 A2 및 비-조사된 병변 A3 의 생검 및 면역모니터링을 위한 혈액 샘플링을 지정된 시간 지점 (사이클 1 의 D1 및 D8) 에서 채취하였다. 비-조사된 병변 (병변 A3) 이 비-조사된 부위에 대한 치료요법의 전신 효과 (압스코팔 (abscopal) 효과) 를 증명할 것이라는 점이 예견된다.

EMD521873 및 방사선을 투여받은 대상은 방사선 치료의 부재 하에 EMD521873 만을 받은 대조군 대상과 비교하여 감소된 종양 퇴축을 입증하는 것으로 예측된다 (예를 들어 PET 또는 CT 스캔에 의해 정의되는 바와 같이).

본 발명은 이의 취지 또는 필수적인 특징에서 벗어나지 않는 다른 특이적 형태로 구체화될 수 있다. 그러므로 전술한 구현예는 모든 점에 있어서 본원에서 기재된 발명을 제한하기보다는 설명하는 것으로 고려될 것이다. 따라서, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명보다는 첨부된 청구항에 의해 표현되며, 청구항의 동등성의 범위 및 의미 내에 있는 모든 변화가 이에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (25)

1. 종양이 이전에 조사되고, 면역사이토카인이 상기 종양의 초기 이전 조사의 21 일 내에 투여되는 것으로 의도되는, 종양 치료용 약제의 제조를 위한 면역사이토카인의 용도.
2. 제 1 항에 있어서, 종양이 면역사이토카인의 제 1 투여 8 - 21 일 전에 처음 조사되는 용도.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역사이토카인의 제 1 투여가 종양 조사 완료 후 1 - 6 일 후에 이루어지는 용도.
4. 제 3 항에 있어서, 면역사이토카인의 제 1 투여가 종양 조사 완료 후 2 - 5 일 후 이루어지는 용도.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 1 - 14 일의 기간에 걸쳐 여러 일에 조사되는 용도.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역사이토카인이 1 - 5 일의 기간에 걸쳐 여러 일에 투여됨으로써 면역사이토카인 투여의 제 1 사이클이 형성되는 용도.
7. 제 6 항에 있어서, 면역사이토카인 투여의 각각의 제 2 및 추가 사이클이 제 1 사이클의 완료 후 2 - 12 주 후에 일정 잡히는 용도.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 1 일 당 1 Gy 이상의 1 회 또는 분획화된 용량으로 1 일 또는 수 일에 조사되는 용도.
9. 제 8 항에 있어서, 종양이 1 일 당 1 - 20 Gy 의 용량으로 조사되는 용도.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선 후 면역사이토카인 용량이 환자에서의 심각한 부작용 발생에 의해 정의되는 최대 내약 용량 미만인 용도.
11. 제 10 항에 있어서, 면역사이토카인 용량이 최대 내약 용량의 1/2 미만인 용도.
12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 면역사이토카인 용량이 1 mg/kg (체중) 미만인 용도.
13. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 면역사이토카인 용량이 0.5 mg/kg (체중) 미만인 용도.
14. 제 13 항에 있어서, 면역사이토카인 용량이 0.1 mg/kg - 0.5 mg/kg 인 용도.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 조사가 소집합의 종양 세포로만 실행되는 용도.
16. 제 15 항에 있어서, 종양이 소집합의 종양 세포를 한정하는 체내 상이한 위치를 갖는 용도.
17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역사이토카인 분자 내의 사이토카인이 IL-12, IL2 또는 IL2(D20T) 인 용도.
18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역사이토카인이 NHS-IL2(D20T) 또는 NHS-IL12 인 용도.
19. 종양이 1 일 당 1 - 30 Gy 로 이전에 조사되고, 면역사이토카인이 종양의 초기 이전 조사 후 21 일 내에 투여되는 것으로 의도되는, 종양 치료에 사용하기 위한 면역사이토카인.
20. 제 19 항에 있어서, 면역사이토카인의 제 1 투여가 종양 조사 완료 후 1 - 6 일 후에 이루어지는 면역사이토카인.
21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 종양이 1 - 14 일의 기간에 걸쳐 여러 일에 조사되는 면역사이토카인.
22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선 후 면역사이토카인 용량이 환자에서의 심각한 부작용 발생에 의해 정의되는 최대 내약 용량의 1/2 미만인 면역사이토카인.
23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 조사가 상이하게 위치한 소집합의 종양 세포로만 실행되는 면역사이토카인.
24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역사이토카인 분자 내의 사이토카인이 IL12, IL2 또는 IL2(D20T) 인 면역사이토카인.
25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, NHS-IL2(D20T) 또는 NHS-IL12 인 면역사이토카인.
    

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