MX2011004193A

MX2011004193A - Tratamiento de cancer con radiacion e inmunocitosinas.

Info

Publication number: MX2011004193A
Application number: MX2011004193A
Authority: MX
Inventors: Stephan G Klinz; Thomas Wickham; Ulrike Gnad-Vogt; Sylvia A Holden; Karl Josef Kallen
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2008-10-21
Filing date: 2009-10-21
Publication date: 2011-05-24
Also published as: WO2010046097A1; CA2741130A1; EP2337579A1; KR20110086101A; BRPI0919857A2; CN102196815A; ZA201103726B; US20100330029A1; AU2009306711A1; EA201100626A1; JP2012506394A

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para el tratamiento de tumores y células cancerígenas administrando una inmunocitosina después del tratamiento de radiación. Esta combinación de tratamientos puede estimular una respuesta inmune en los sitios irradiados y no irradiados, que es útil para erradicar las células cancerígenas que se han expandido desde el sitio del tumor primario. Además, las inmunocitosinas pueden administrarse a una dosis que es menor que la dosis máxima tolerada, la cual reduce los efectos secundarios asociados con la terapia de inmunocitosinas.

Description

TRATAMIENTOS DE CANCER CON RADIACION E INMUNOCITOSINAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para el tratamiento de tumores y células cancerígenas administrando una inmunocitosina después del tratamiento con radiación. Esta combinación de tratamientos puede estimular una repuesta inmune en los sitios irradiados y no irradiados, que es útil para erradicar las células cancerígenas que se han expandido desde el sitio del tumor primario .

Además, mediante este método de tratamiento, las inmunocitosinas, de preferencia NHS-IL2 (D20T) y NHS-IL12 pueden administrarse a una dosis que es menor que la dosis máxima tolerada, la cual reduce los efectos secundarios asociados con la terapia de inmunocitosinas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El tratamiento efectivo de las enfermedades, tal como cáncer, requiere grandes respuestas inmunes por uno o más tipos de células efectoras, tales como células de asesino natural (NK, por sus siglas en inglés) , macrófagos y linfocitos T. Sin embargo, las terapias de cáncer existentes, por ejemplo, tratamiento de radiación y quimioterapia, dirigen rápidamente la división de las células, y por lo tanto, en realidad destruyen las células REF.: 218311 inmunes. Además, el ambiente del tumor mismo es inmunosupresor .

Para combatir los efectos inmunosupresores de las terapias de cáncer actuales, se han realizado estudios para investigar la administración de citosina IL-2 en combinación con la terapia de radiación. Ver Jacobs et al. (2005), Cáncer Immunol . Immunother. , 54:792-798; Everse et al. (1997), Int. J. Cáncer. 72: 1003-1007; Lam, et al. (1995), Journal of Immunotherapy, 18 (1) : 28-34 ; y Jurgenliemk-Schulz et al., (1997), Radiation Oncology Investigations . 5: 54-61. Mientras que se observó alguna respuesta para algunos tipos de cáncer, en muchos casos los tumores no se erradicaron completamente. En otros casos, los tumores recurrieron. Además, algunos tipos de cáncer no mostraron un mejoramiento con el tratamiento. Además, IL-2 se sabe que produce efectos secundarios graves, que incluyen el síndrome de derrame vascular, en el que el fluido se derrama fuera de los vasos sanguíneos causando una presión sanguínea baja, dificultad respiratoria y edema. Por lo tanto, son necesarios mejoramientos que aumenten la estimulación de las respuestas inmunes sistémicas, mientras que al mismo tiempo se minimicen los efectos secundarios producidos por las terapias .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para reducir el crecimiento de tumores o células cancerígenas en un mamífero. Los métodos reducen el crecimiento de tumores o células cancerígenas después de la irradiación de un tumor con la administración de una inmunocitosina, para mejorar una. respuesta inmune que facilita la reducción en el crecimiento del tumor. Algunos métodos para practicar la invención pueden reducir el tamaño del tumor, inhibir la metástasis, inhibir el re-crecimiento del tumor, inhibir la reincidencia, aumentar el tiempo promedio a la progresión, aumentar el tiempo de supervivencia promedio o promover las respuestas parciales o completas a un régimen terapéutico, que puede incluir agentes o actividades terapéuticas adicionales, tales como cirugía. La invención además se relaciona con métodos de negocio para el cuidado de la salud para autorizar la administración de, o autorizar el pago para la administración de las inmunocitosinas de la presente invención.

La presente invención también se relaciona con los usos de inmunocitosinas para reducir el crecimiento de tumores o células cancerígenas siguiendo la irradiación de un tumor con el uso de una inmunocitosina, para mejorar una respuesta inmune que facilita la reducción en el crecimiento del tumor. Algunos usos de las inmunocitosinas de acuerdo con la invención pueden reducir el tamaño del tumor, inhibir la metástasis, inhibir el re-crecimiento del tumor, inhibir la reincidencia, aumentar el tiempo promedio a la progresión, aumentar el tiempo de supervivencia promedio o promover las respuestas parcial o completa a un régimen terapéutico, que puede incluir los agentes o actividades terapéuticas adicionales, tal como cirugía.

En un aspecto, la invención se relaciona con un método para reducir el crecimiento de tumores o células cancerígenas administrando una inmunocitosina a un mamífero (por ejemplo, un humano) que tiene un tumor que ya se ha irradiado. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para mejorar una respuesta inmune sistémica en un mamífero que tiene células cancerígenas en múltiples sitios, que incluye la administración de una inmunocitosina después de que se ha irradiado un subgrupo de los sitios. La irradiación mejora una respuesta inmune en los sitios irradiados y no irradiados .

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una inmunocitosina para reducir el crecimiento del tumor o células cancerígenas en un mamífero (por ejemplo, un humano) que tiene un tumor que ya se ha irradiado. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una inmunocitosina para mejorar una respuesta inmune sistémica en un mamífero que tiene células cancerígenas en múltiples sitios, que incluye el uso de una inmunocitosina después de que se ha irradiado un subgrupo de los sitios. La irradiación mejora una respuesta inmune en los sitios irradiado y no irradiado.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para el cuidado de la salud que incluye autorizar la administración de, o autorizar el pago para la administración de, una inmunocitosina a un mamífero con un tumor o células cancerígenas que se irradiaron previamente .

En algunas modalidades de la invención, la dosis de radiación (por ejemplo, radiación gama) administrada fue de por lo menos 1, por lo menos 2, o por lo menos 3 Gy por día. En algunas modalidades, la dosis de radiación dada es de 1-4 Gy, 1-10 Gy, 1-20 Gy, 2-4 Gy, 2-10 Gy, 2-20 Gy, 3-4 Gy, 3-10 Gy ó 3-20 Gy por día.

Una ventaja de combinar el tratamiento de radiación e inmunocitosina de acuerdo con los métodos y usos de la presente invención es que puede administrarse una dosis menor de inmunocitosina, reduciendo la posibilidad de efectos secundarios. En una modalidad de la invención, la dosis de inmunocitosina se administra o se usa a una dosis menor que la dosis máxima tolerada de la inmunocitosina. En otra modalidad, la inmunocitosina se administra o se usa a una dosis menor que la mitad, menor que un tercio, menor que un cuarto o menor que un décimo de la dosis máxima tolerada. En otra modalidad, la inmunocitosina incluye interleucina-2 , que incorpora opcionalmente una o más mutaciones, tal como una mutación D20T. En aún otra modalidad, la inmunocitosina incluye interleucina-12.

El número de tratamientos de radiación y la cantidad de tiempo entre el tratamiento de radiación y la administración de la inmunocitosina puede variar de acuerdo con los métodos o usos de la invención. En algunas modalidades, el tumor se irradia en sólo un día, o se irradia en múltiples días durante un periodo que no excede 14 días . En algunas modalidades, el periodo es de 6-8 días, 4-10 días, 2-12 días ó 1-14 días. En las modalidades particulares, la inmunocitosina se administra en por lo menos dos días, cuatro días o seis días después del término del periodo. En otra modalidad, la inmunocitosina se administra dentro de 21 días, 18 días, 15 días, 12 días u 8 días de una administración inicial de radiación al tumor. En una modalidad, la inmunocitosina se administra por lo menos cinco días, siete días, nueve días ó 12 días después de una administración inicial de radiación al tumor.

Las modalidades de la invención pueden incluir combinar los métodos de tratamiento de cáncer conocidos con los métodos de la invención. En algunas modalidades, el método además incluye remover quirúrgicamente por lo menos una porción del tumor, administrar un agente terapéutico adicional o irradiar el tumor.

Otras modalidades de la invención pueden incluir usar inmunocitosinas en combinación con los tratamientos de cáncer conocidos. En algunas modalidades, las inmunocitosinas pueden usarse en un mamífero que ha tenido por lo menos una porción de un tumor removida, con un tumor irradiado previamente o en combinación con el uso de un agente terapéutico adicional.

Algunos métodos de práctica y usos de la invención pueden combinar dos o más de las condiciones definidas anteriormente. Por ejemplo, en una modalidad, la radiación dada es de por lo menos 1 Gy/día (por ejemplo, por lo menos 2, por lo menos 3, 1-4, 1-10, 1-20, 2-4, 2-10, 2-20, 3-4, 3-10 ó 3-20 Gy/día) , a únicamente un subgrupo de sitios de células cancerígenas en el mamífero. La inmunocitosina puede administrarse o usarse dentro de 21 días (por ejemplo dentro de 18, dentro de 15, dentro de 12, o dentro de 8 días) de una administración inicial de radiación y puede administrarse o usarse a una dosis menor de la mitad (por ejemplo, menor de un tercio, menor de un cuarto o menor de un décimo) de la dosis máxima tolerada. En otra modalidad, la radiación dada es de 1 Gy/día (por ejemplo, por lo menos 2, por lo menos 3, 1-4, 1-10, 1- 20, 2-4, 2-10, 2-20, 3-4, 3-10 ó 3-20 Gy/día) y la inmunocitosina se administra o se usa dentro de 21 días (por ejemplo, dentro de 18, dentro de 15, dentro de 12 o dentro de 8 días) de una administración inicial de radiación, opcionalmente a una dosis menor de la mitad (por ejemplo, menor de un tercio, menor de un cuarto o menor de un décimo) de la dosis máxima tolerada. En otra modalidad, la radiación dada es de por lo menos 1 Gy/día (por ejemplo, por lo menos 2, por lo menos 3, 1-4, 1-10, 1-20, 2-4, 2-10, 2-20, 3-4, 3-10 ó 3-20 Gy/día) y la inmunocitosina se administra o se usa a una dosis menor de la mitad de dosis máxima tolerada. En otra modalidad, la radiación se administra a sólo un subgrupo de sitios de células cancerígenas en el mamífero y la inmunocitosina se administra o se usa dentro de 21 días (por ejemplo, dentro de 18, dentro de 15, dentro de 12 o dentro de 8 días) de una administración inicial de radiación, opcionalmente a una dosis menor de la mitad (por ejemplo, menor de un tercio, menor de un cuarto o menor de un décimo) de la dosis máxima tolerada. En otra modalidad, la radiación se administra a sólo un subgrupo de sitios de células cancerígenas en el mamífero y la inmunocitosina se administra o se usa a una dosis menor de la mitad (por ejemplo, menor de un tercio, menor de un cuarto o menor de un décimo) de la dosis máxima tolerada. En otra modalidad, la inmunocitosina se administra a, o se usa en un mamífero con un tumor irradiado previamente dentro de 21 días (por ejemplo, dentro de 18, dentro de 15, dentro de 12 o dentro de 8 días) de una administración inicial de radiación y la inmunocitosina se administra a una dosis menor de la mitad (por ejemplo, menor de un tercio, menor de un cuarto o menor de un décimo) de la dosis máxima tolerada.

Para resumir, la invención se relaciona con las siguientes modalidades: « Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de administrar una inmunocitosina a un mamífero con un tumor irradiado previamente a una dosis de por lo menos 1 Gy, de preferencia 2 Gy por día, más preferentemente 2-20 Gy/día.

• Un método de tratamiento de tumores reduciendo, de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de administrar una inmunocitosina a un mamífero con un tumor irradiado previamente a una dosis de por lo menos 1 Gy, de preferencia 2 Gy por día, en donde la inmunocitosina se administra dentro de 21, de preferencia 5-21 días de una administración inicial de radiación al tumor.

• Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de administrar una inmunocitosina a un mamífero con un tumor irradiado previamente a una dosis de por lo menos 1 Gy, de preferencia 2 Gy por día, en donde la inmunocitosina se administra dentro de 21 días, de preferencia 5-21 días después de una administración inicial de radiación al tumor y a 1-6 días, de preferencia 2-5 días después de completar la irradiación o el último tratamiento de irradiación del tumor.

• Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de administrar una inmunocitosina a un mamífero con un tumor irradiado previamente a una dosis de por lo menos 1 Gy, de preferencia 2 Gy por día, en donde la inmunocitosina se administra dentro de 21 días, de preferencia 5-21 días después de una administración inicial de radiación al tumor y a 1-6 días, de preferencia 2-5 días después de completar la irradiación o el último tratamiento de irradiación del tumor a una dosis de inmunocitosina menor de la dosis máxima tolerada al mamífero con un tumor irradiado previamente, de preferencia menor de la mitad, y más preferentemente menor de un tercio o incluso un décimo del máximo, en donde la dosis máxima tolerada se define como la dosis de inmunocitosina que causa efectos secundarios graves en un paciente .

« Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de administrar una inmunocitosina a un mamífero con un tumor irradiado previamente a una dosis de por lo menos 1 Gy, de preferencia 2 Gy por día en sitios de células de tumores múltiples, en donde sólo un subgrupo de los sitios se irradiaron previamente, y en donde la inmunocitosina se administra dentro de 21 días, de preferencia 5-21 días después de una administración inicial de radiación al tumor y después a 1-6 días, de preferencia 2-5 días después de completar la irradiación o el último tratamiento de irradiación del tumor a una dosis menor que la dosis máxima tolerada a un mamífero con un tumor irradiado previamente, de preferencia menor de la mitad, y más preferentemente menor de un tercio o incluso un décimo del máximo, en donde la dosis máxima tolerada se define como la dosis de inmunocitosina que causa efectos secundarios graves en un paciente.

• Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de administrar una inmunocitosina a un mamífero con un tumor irradiado previamente en sitios de células de tumores múltiples, en donde únicamente un subgrupo de los sitios se irradiaron previamente, y en donde la inmunocitosina se administra dentro de 21 días, de preferencia 5-21 días después de una administración inicial de radiación al tumor y además a 1-6 días, de preferencia 2-5 días después de completar la irradiación o el último tratamiento de irradiación del tumor.

· Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un. medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de irradiar células tumorales en un paciente en sólo un día a una dosis total una sola vez o dividida, de por lo menos 1 Gy de preferencia 2 Gy, más preferentemente 2-20 Gy, seguido de una administración en sólo un día de una inmunocitosina después de 1-21 días, de preferencia 1-6 días, más preferentemente 2-5 días después de terminar la irradiación. • Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de irradiar células tumorales en un paciente en sólo un día a una dosis total de una sola vez o dividida, de por lo menos 1 Gy de preferencia 2 Gy, más preferentemente 2-20 Gy, seguido de administraciones múltiples de una inmunocitosina en varios días, en donde la administración inicial se lleva a cabo después de 1-21 días, de preferencia 1-6 días, más preferentemente 2-5 días después del término de tal radiación, y la segundo y opcionalmente la administración adicional se lleva a cabo 1-5 días, de preferencia 1-3 días después de la administración inicial. Opcionalmente, pueden llevarse a cabo intervalos adicionales de tales administraciones múltiples de la inmunocitosina, en donde cada intervalo está entre 3-12 semanas.

• Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de irradiar células tumorales en un paciente en días múltiples durante un periodo que no excede 14 días a una dosis diaria total de una vez o dividida, de por lo menos 1 Gy, de preferencia 2 Gy, más preferentemente 2-20 Gy, seguido de una administración en sólo un día de una inmunocitosina, en donde la administración de la inmunocitosina se lleva a cabo no más de 21 días después de la irradiación inicial de las células tumorales, y después de 1-6 días, de preferencia 2-5 días después de terminar el tratamiento de radiación múltiple .

• Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método la etapa de irradiar células tumorales en un paciente en días múltiples durante un periodo que no excede 14 días a una dosis diaria total de una vez o dividida, de por lo menos 1 Gy, de preferencia 2 Gy, más preferentemente 2-20 Gy, seguido de administraciones múltiples de una inmunocitosina en varios días, en donde la administración de inmunocitosina inicial se lleva a cabo no más de 21 días después de la irradiación inicial de las células tumorales, y después de 1-6 días, de preferencia 2-5 días después de terminar el tratamiento de radiación múltiple, y la segunda y opcionalmente una administración de inmunocitosina adicional se lleva a' cabo 1-5 días, de preferencia 1-3 días después de la administración inicial. Opcionalmente, pueden llevarse a cabo intervalos adicionales de las administraciones múltiples de la inmunocitosina, en donde cada intervalo está entre 3-12 semanas.

· Un método de tratamiento de tumores reduciendo de preferencia el crecimiento del tumor, o una inmunocitosina para el uso en tal tratamiento, o el uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para este tratamiento, comprendiendo el método las etapas de: (i) irradiar las células tumorales en un paciente en sólo un día a una dosis total de una vez o dividida, de por lo menos 1 Gy, de preferencia 2 Gy, más preferentemente 2-20 Gy, (ii) seguido de una administración en sólo un día de una inmunocitosina después de 1-21 días, de preferencia 1-6 días, más preferentemente 2-5 días después de terminar la radiación; (iii) seguido de una segunda etapa de irradiación después de 1-5 días después de la etapa (ii) , pero que no excede 14 días de la etapa de radiación (i) en sólo un día a una dosis total de una vez o dividida, de por lo menos 1 Gy, de preferencia 2 Gy, más preferentemente 2-20 Gy, y (iv) seguido de una segunda administración en sólo un día de una inmunocitosina después de 1-21 días, de preferencia 1-6 días, más preferentemente 2-5 días después de terminar la segunda radiación.

• Un método respectivo, uso o inmunocitosina de acuerdo con cualquiera de los métodos, usos o inmunocitosinas como se listaron anteriormente, en donde la dosis de inmunocitosina es menor que la dosis máxima tolerada a un mamífero con un tumor irradiado previamente, de preferencia menor de la mitad, y más preferentemente menor de un tercio o incluso un décimo del máximo, en donde la dosis máxima tolerada se define como la dosis de inmunocitosina que causa efectos secundarios graves en un paciente.

• Un método respectivo de acuerdo con cualquiera de los métodos, usos o inmunocitosinas como se listaron anteriormente, en donde la porción de citosina de la inmunocitosina es IL2 , IL2 (D20T) o IL12.

· Un método respectivo de acuerdo con cualquiera de los métodos, usos o inmunocitosinas como se listaron anteriormente, en donde la inmunocitosina es NHS-IL2 (D20T) , NHS-IL2, NHS-IL12.

• Un método respectivo de acuerdo con cualquiera de los métodos, usos o inmunocitosinas como se listaron anteriormente, en donde el tumor se irradió previamente en sitios de células tumorales múltiples, en donde sólo un subgrupo de los sitios se irradió previamente.

• Un método respectivo de acuerdo con cualquiera de los métodos, usos o inmunocitosinas como se listaron anteriormente, en donde, por lo menos una porción del tumor se remueve quirúrgicamente .

• Un método respectivo de acuerdo con cualquiera de los métodos, usos o inmunocitosinas como se listaron anteriormente, en donde la radiación es irradiación gama.

• Método para mejorar una respuesta inmune sistémica en un mamífero que tiene células cancerígenas en sitios múltiples, comprendiendo el método la etapa de administrar una inmunocitosina después de que se ha irradiado un subgrupo de los sitios, en donde la radiación mejora una respuesta inmune en los sitios irradiado y no irradiado, y en donde la administración combinada de irradiación y la administración de inmunocitosina se lleva a cabo de acuerdo con el régimen como se listó anteriormente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa un esquema de dosificación ejemplar en donde la radiación "R" y la inmunocitosina "IC" pueden administrarse cada una como dosis simples, separadas por un intervalo 1-1.

La Figura 2 representa un esquema de dosificación ejemplar en donde la radiación "R" se administra en sólo un día, seguido de la administración de una inmunocitosina "IC" en días múltiples .

La Figura 3 representa un esquema de dosificación ejemplar en donde la radiación "R" se administra en más de un día, seguido de la administración de una inmunocitosina "IC" en sólo un día "ICl" .

La Figura 4 representa un esquema de dosificación ejemplar en donde la radiación "R" puede administrarse en más de un día, seguido de la administración de una inmunocitosina "IC" en más de un día.

La Figura 5 representa un esquema de dosificación ejemplar en donde la radiación "R" puede administrarse en más de un día, seguido de la administración de una inmunocitosina "IC" en más de un día, y la "ICl" inicial de la administración de la inmunocitosina se puede presentar antes del término de "R2" del periodo de irradiación.

La Figura 6 representa el tamaño del tumor con el tiempo en los animales tratados con quimiorradiación más quimiorradiación más NHS-mulL12 (cuadrados abiertos) , EMD521873 (círculos abiertos) , sólo quimiorradiación (triángulos cerrados) , sólo NHS-mulL12 (cuadrados cerrados) , sólo EMD521873 (círculos cerrados) o tratamiento de control (X) .

La . Figura 7 representa el tamaño del tumor .con el tiempo en animales tratados con la inmunocitosina NHS-IL12 en combinación con quimiorradiación (círculos cerrados) , EMD521873 (círculos abiertos) en combinación con quimiorradiación, sin tratamiento (X) , sólo quimiorradiación (cuadrados abiertos) , sólo EMD521873 (diamantes abiertos) o sólo NHS-mulL12 (triángulos abiertos) .

La Figura 8 representa el tamaño del tumor con el tiempo en animales tratados con quimiorradiación más EMD521873 (círculos abiertos) , sólo quimiorradiación (triángulos abiertos) , tratamiento de control (X) o sólo EMD521873 (cajás abiertas) .

La Figura 9 representa el tamaño del tumor con el tiempo en animales tratados con 1 mg/kg de EMD521873 más quimiorradiación (cuadrado cerrado) , 5 mg/kg de EMD521873 más quimiorradiación (triángulo cerrado) y 15 mg/kg de EMD521873 más quimiorradiación (círculo cerrado) , 1 mg/kg de EMD 521873 sólo (cuadrado abierto) , 5 mg/kg de EMD521873 sólo (triángulo abierto) y 15 mg/kg de EMD521873 sólo (círculo abierto) , sólo quimiorradiación (+) o sólo vehículo (X) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos de la presente invención proporcionan una terapia de combinación para un mamífero con uno o más tumores, que incluye administración de radiación y de inmunoci osina, y resulta en una respuesta inmune aumentada y la reducción subsecuente en el crecimiento del tumor. Los métodos de la presente invención son útiles para el tratamiento de tumores individuales, tumores múltiples (que incluyen tumores no irradiados) o metástasis debido a que se activa una respuesta inmune sistémica. Después del tratamiento de radiación, pueden administrarse inmunocitosinas a una dosis menor que la dosis máxima tolerada, lo que es ventajoso debido a que el uso de una dosis menor de inmunocitosinas puede conducir a menos efectos secundarios.

Terapia de Radiación De acuerdo con los métodos de la presente invención, la radiación puede administrarse en combinación con inmunocitosinas para tratar cáncer. La terapia de radiación típicamente usa un haz de partículas u ondas de alta energía, tales como rayos X y rayos gama, para erradicar las células cancerígenas induciendo las mutaciones en el ADN celular. Las células cancerígenas se dividen más rápidamente que las células normales, haciendo al tejido del tumor más susceptible a radiación que el tejido normal. Puede administrarse cualquier tipo de radiación a un paciente, con tal de que la dosis de radiación sea tolerada por el paciente sin efectos secundarios negativos significativos. Los tipos apropiados de radioterapia incluyen, por ejemplo, radiación ionizante (por ejemplo, rayos X, rayos gama o radiación de energía lineal alta) . La radiación ionizante se define como la radiación que comprende partículas o fotones que tienen una energía suficiente para producir ionización, es decir, ganancia o pérdida de electrones (como se describe en, por ejemplo, Pat . U.S. No. 5,770,581) . Los efectos de la radiación pueden controlarse por lo menos parcialmente por el clínico. La dosis de radiación se divide de preferencia para una exposición de las células blanco máxima y una toxicidad reducida. La radiación puede administrarse simultáneamente con los radiosensibilizadores que mejoran la muerte de las células tumorales o con radioprotectores (por ejemplo, IL-1 o IL-6) que protegen el tejido saludable de los efectos dañinos de la radiación. De manera similar, la aplicación de calor, es decir, hipertermia o quimioterapia pueden sensibilizar el tejido a la radiación.

La fuente de radiación puede, ser externa o interna al paciente. La terapia de radiación externa es más común e involucra por lo regular dirigir el haz de radiación de alta energía (un haz de partícula) a un sitio de tumor a través de la piel usando, por ejemplo, un acelerador lineal. Mientras que un haz de radiación se localiza en el sitio del tumor, es casi imposible evitar la exposición del tejido normal, saludable. Sin embargo, la radiación externa usualmente es bien tolerada por los pacientes .

En otro ejemplo, la radiación se suministra externamente a un paciente usando rayos gama. Los rayos gama se producen por la ruptura de radioisótopos , tales como cobalto 60. Usando un tratamiento llamado "Gamma Knife®", los rayos gama pueden enfocarse ajustadamente sólo al tejido del tumor blanco, de modo que se daña muy poco tejido saludable. Por otro lado, los rayos X, producidos por un acelerador de partículas, pueden usarse para administrar la radiación sobre un área más grande del cuerpo.

La terapia de radiación interna involucra implantar una fuente de emisión de radiación, tal como cuentas, alambres, pelotillas, cápsulas, etc., dentro del cuerpo en o cerca del sitio del tumor. La radiación usada viene de radioisótopos, tales como, pero no se limitan a, yodo, estroncio, fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato o cobalto. Tales implantes pueden removerse siguiendo el tratamiento, o dejarse en el cuerpo inactivos. Los tipos de terapia de radiación interna incluyen, pero no se limitan a, braquiterapia, irradiación intersticial e irradiación de intracavidad. Una forma actualmente menos común de la terapia de radiación interna involucra vehículos biológicos de radioisótopos, tales como con radioinmunoterapia, en donde se administran a un paciente anticuerpos específicos del tumor enlazados al material radioactivo. Los anticuerpos unen los antígenos tumorales, administrando de esta manera efectivamente una dosis de radiación al tejido relevante.

La terapia de radiación es útil como un componente de un régimen para controlar el crecimiento de un tumor primario (ver, por ejemplo, Comphausen et al. (2001) "Radiation Therapy to a Primary Tumor Accelerates Metastatic Growth in Mice" , Cáncer Res . 61: 2207-2211). Aunque la terapia de radiación sola puede ser menos efectiva para destruir o prevenir metástasis, la radiación de combinación con una inmunocitosina como se describe en la presente, puede mejorar la eficacia local y sistémica de la terapia de radiación. De acuerdo con los métodos de la presente invención, la radiación puede administrarse a un subgrupo de tumores o células cancerígenas en un mamífero con tumores múltiples o células cancerígenas. En una modalidad, el subgrupo de tumores es un tumor. Después de que un subgrupo de sitios se ha irradiado, se administra una inmunocitosina. La radiación mejora una respuesta inmune en los sitios irradiados y no irradiados, comparado con la administración de inmunocitosina sola. De esta manera, los métodos de la presente invención pueden ser efectivos para el tratamiento de mamíferos en los que las células cancerígenas se han expandido desde uno o más tumores hacia otros sitios en el cuerpo .

Debido a que la radiación mata las células efectoras inmunes, la dosis y el tiempo de la radiación son importantes. Las células T y las células dendríticas en un tumor irradiado disminuyen inmediatamente después de la irradiación; sin embargo, los niveles de las células T rebotan más que los niveles de la línea base. Sin importar el método de administración, puede administrarse una dosis completa de radiación durante el transcurso de un día. De preferencia, la dosis total se divide y se administra durante varios días. Por lo tanto, una dosis diaria de radiación comprenderá aproximadamente 3-20 Gy/día, por ejemplo, por lo menos 2, por lo menos 3, 1-4, 1-10, 1-20, 2-4, 2-10, 2-20, 3-4, 3-10, 3-20 Gy/día. La dosis diaria puede administrarse como una sola dosis, o puede ser una dosis "micro-dividida" administrada en dos o más porciones durante el transcurso de un día. Cuando se emplean fuentes de radiación externa, por ejemplo, braquiterapia o radióinmunoterapia, el tiempo de exposición aumentará típicamente, con una disminución correspondiente en la intensidad de radiación.

Como se usa en la presente, una "administración de radiación inicial" puede ser una dosis simple, o el comienzo de una serie de irradiaciones repartidas durante varios días. Mientras que el mamífero puede haber recibido previamente una o más cesiones de terapia de radiación, una "administración inicial" se separa en el tiempo de cualesquiera cesiones de radiación anteriores. Por ejemplo, si un mamífero recibe radiación el lunes, martes y miércoles, la administración del jueves no sería una "administración inicial" . De manera similar, si un mamífero recibe radiación cada lunes, miércoles y viernes durante tres semanas, el primer lunes puede ser una "administración inicial", pero el segundo y tercer lunes no sería. En general, una administración inicial de radiación está precedida por siete o más días sin recibir radiación (por ejemplo, sin recibir una dosis de radiación terapéutica, tal como una dosis de por lo menos 1 Gy) .

Un "periodo" de irradiación, como se usa en la presente, tiene una administración radiación inicial seguido de administraciones de radiación en uno o más días adicionales . Las administraciones de radiación adicionales pueden ser en días consecutivos (por ejemplo, lunes, martes, miércoles) , días alternados (por ejemplo, lunes, miércoles, v viernes) , etc., o, por ejemplo, 2 Ó 3 Ó 4 Ó 5 Ó 6 veces por semana. Un periodo de radiación dado no incluiría siete días consecutivos sin radiación. De hecho, la reanudación de la administración de la radiación regular después de un periodo de siete días en general marcaría el comienzo de un nuevo "periodo" .

Inmunocitosinas Como se usa en la presente, el término "inmunocitosina" se entiende que significa una fusión de (i) un anticuerpo que une un dominio que tiene una especificidad de unión para, y capaz de unir una antígeno pre- seleccionado, por ejemplo, un antígeno específico de un tipo celia-lar, y (ii) una citosina que es capaz de inducir o estimular una respuesta inmune citosidal típicamente contra una célula cancerígena. Ejemplos de los antígenos pre- seleccionados incluyen antígenos de superficie celular, tales como en las células cancerígenas y los otros antígenos que son característicos del microambiente del tumor, ya sea o no asociados directamente con una célula, tal como antígenos que pueden secretarse o liberarse o depositarse de otra manera en la vecindad de un tumor antígenos que se asocian con la membrana extracelular en la vecindad de un tumor, o antígenos asociados con células no malignas que están en contacto con y/o se infiltran al tumor. Los antígenos preferidos son antígenos blanco que son característicos de las células tumorales, tales como antígenos específicos del tumor. Por lo tanto, la inmunocitosina es capaz de liberar selectivamente la citosina a un blanco (que es típicamente una célula) in vivo, de modo que la citosina puede mediar una respuesta inmune localizada contra una célula blanco. Por ejemplo, si el componente del anticuerpo de la inmunocitosina une selectivamente un antigeno en una célula cancerígena, tal como una célula cancerígena en un tumor sólido, y en particular, un tumor sólido más grande o mayor de aproximadamente 100 mm3, la inmunocitosina ejerce actividad anti-cáncer localizada.

Como se usa en la presente, el término "dominio de unión de anticuerpo" se entiende que significa por lo menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, una región variables de inmunoglobulina capaz de unir un antígeno pre-seleccionado, tal como un tipo celular. El dominio de unión de anticuerpo también comprende preferentemente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina que incluye, por ejemplo, un dominio CH1, un dominio CH2 y un dominio CH3 , o por lo menos un dominio CH3, o una o más porciones del mismo. Además, la cadena pesada de inmunoglobulina puede asociarse, ya sea covalente o no covalentemente, a una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende, por ejemplo, una región variables de cadena ligera de inmunoglobulina y opcionalmente una región constante de cadena ligera. Por lo tanto, se contempla que el dominio de unión de anticuerpo puede comprender un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo, o un anticuerpo de cadena simple, capaz de unir el antígeno preseleccionado.

Con respecto a la inmunocitosina, se contempla que el fragmento de anticuerpo puede unirse a la citosina por una variedad de maneras bien conocidas para los experimentados en la técnica. Por ejemplo, el sitio de unión de anticuerpo se enlaza de preferencia por medio de un enlace polipeptídico o enlazador a la citosina en una construcción de proteína de fusión. Alternativamente, el sitio de unión de anticuerpo puede acoplarse químicamente a la citosina por medio de grupos reactivos, por ejemplo, grupos sulfhidrilo, dentro de cadenas laterales de aminoácidos presentes dentro del sitio de unión de anticuerpo y la citosina.

Como se usa en la presente, el término "citosina" se entiende que significa cualquier proteína o péptido, análogo o fragmento funcional del mismo, que es capaz de estimular o inducir una respuesta inmune citosidal contra un tipo celular preseleccionado, por ejemplo, una célula cancerígena o una célula infectada viralmente, en un mamífero. Por lo tanto, se contempla que puede incorporarse una variedad de citosinas en las inmunocitosinas de la invención. Las citosinas que pueden incorporarse en las inmunocitosinas de la invención incluyen, por ejemplo, factores de necrosis tumoral, interleucinas , factores de estimulación de colonia y linfocinas, así como otros conocidos en la técnica. Los factores de necrosis tumoral preferidos incluyen, por ejemplo, el factor de necrosis tisular (TNF a) . Las interleucinas preferidas incluyen, por ejemplo, interleucina-2 (IL-2) , interleucina-4 (IL-4) , interleucina-5 (IL-5) , interleucina-7 (IL-7) , interleucina- 12 (IL-12) , interleucina-15 (IL-15) e interleucina- 18 (IL-18) . Los factores de estimulación de colonia preferidos incluyen, por. ejemplo, factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) y el factor de estimulación de colonia de macrófago (M-CSF) . Las linfocinas preferidas incluyen, por ejemplo, linfotoxina (LT) . Otras citosinas útiles incluyen interferones , que incluyen IFN- , IFN-ß e IFN-?, todas las cuales tienen efectos inmunológicos , así como efectos anti-angiogénicos, que son independientes de sus actividades anti-virales . También pueden usarse formas alteradas de citosinas. Por ejemplo, las mutaciones en la porción de la citosina de la inmunocitosina pueden impartir propiedades mejoradas a la inmunocitosina, tales como la mutación D20T de IL-2 que aumenta la selectividad de la IL-2 alterada a su receptor de alta afinidad con relación a IL-2 de tipo silvestre, disminuyendo de esta manera su toxicidad, como se describe en la patente U.S. No. 7,186,804.

El gen que codifica una citosina particular de interés puede clonarse de novo, obtenido de una fuente disponible, o sintetizado por la síntesis de ADN estándar de una secuencia nucleotídica conocida. Por ejemplo, la secuencia de ADN de LT es conocida (ver, por ejemplo, Nedwin et al. (1985) Nucleic Acids Res . 13: 6361), como son las secuencias para IL-2 (ver, por ejemplo, Taniguchi et al. (1983) Nature 302: 305-318), GM-CSF (ver, por ejemplo, Gasson et al. (1984) Science 266: 1339-1342) y TNFa (ver, por ejemplo, Nedwin et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13: 6361).

En una modalidad preferida, las inmunocitosinas son proteínas de fusión recombinantes producidas por las metodologías de ADN recombinante convencionales, es decir, formando una construcción de ácido nucleico que codifica la inmunocitosina quimérica. La construcción de las proteínas de fusión de anticuerpo-citosina recorabinantes se ha descrito en la técnica anterior. Ver, por ejemplo, Gillies et al. (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89: 1428-1432; Gillies et al. (1998) J . Immunol . 160: 6195-6203; y la patente U.S. No. 5,650,150. De preferencia, una construcción génica que codifica la inmunocitosina dé la invención incluye, en la orientación 5' a 3' , un segmento de ADN que codifica un dominio de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, un segmento de ADN que codifica una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y un ADA que codifica la citosina. El gen fusionado se ensambla o se inserta en un vector de expresión para la transfección en una célula destinada apropiada en donde se expresa el gen fusionado. La cadena polipeptídica híbrida se combina de preferencia con una cadena ligera de inmunoglobulina, de modo que la región variable de inmunoglobulina de la cadena pesada (VH) y la región variable de inmunoglobulina de la cadena ligera (VL) se combinan para producir un sitio simple y completo para unir un antígeno preseleccionado . En una modalidad preferida, las cadenas pesada y ligera de la ^ inmunoglobulina se acoplan covalentemente, por ejemplo, por medio de un enlace de disulfuro de intercadena. Además, dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, ya sea una o ambas, se fusionan a una citosina, pueden acoplarse covalentemente, por ejemplo, por medio de uno o más enlaces de disulfuro de intercadena.

Por lo tanto, los métodos de la invención son útiles para mejorar la actividad de anti-tumor de una inmunocitosina usada en un método terapéutico para tratar un tumor, que incluye composiciones de inmunocitosinas y los métodos descritos en W099/29732, W099/43713, W099/52562, W099/53958 y WOOl/10912 y las proteínas de fusión a base de anticuerpos con una secuencia de aminoácido alterada en la región de unión.

Las inmunocitosinas de la invención pueden considerarse quiméricas en virtud de dos aspectos de su estructura. Primero, la inmunocitosina es quimérica porque incluye una cadena pesada de inmunocitosina que tiene una especificidad de unión de antígeno enlazada a una citosina dada. Segundo, una inmunocitosina de la invención puede ser quimérica en el sentido que incluye una región variable de inmunoglobulina (V) y una región constante de inmunoglobulina (C) , las cuales se derivan de diferentes anticuerpos, de modo que la proteína resultante es una quimera V/C. Por ejemplo, las regiones variable y constante pueden derivarse de moléculas de anticuerpos que se presentan naturalmente aisladas de diferentes especies. Ver, por ejemplo, la patente U.S. No. 4,816,567. También se abarcan construcciones en las que una o ambas de las regiones variables de inmunoglobulina comprenden secuencias de región de marco (FR) y secuencias de región de determinación de complementariedad (CDR) derivadas de diferentes especies. Tales construcciones se describen, por ejemplo, en Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525, Verhoyen et al. (1988) Science 239: 1534-1535 y la patente U.S. Nos. 5,225,539 y 5,585,089. Además, se contempla que las secuencias de región variable pueden derivarse seleccionando bibliotecas, por ejemplo, bibliotecas de exhibición de fago, para las secuencias de región variable que unen un antígeno preseleccionado con una afinidad deseada. Los métodos para elaborar y seleccionar las bibliotecas de exhibición de fago se describen, por ejemplo, en Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281 y Kang et al. (1991) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 88: 11120-11123.

Los dominios de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de las inmunocitosinas pueden seleccionarse de cualquiera de las cinco clases de inmunoglobulina referidas como IgA (Iga) , IgD (Igó) , IgE (Ig ), IgG (Igy) e IgM (Iqv) . Sin embargo, se prefieren las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de la clase IgG. Además, se contempla que las cadenas pesadas de inmunoglobulina pueden derivarse de cualquiera de las subclases del anticuerpo IgG referidas en la técnica como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Como se conoce, cada región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprende cuatro o cinco dominios. Los dominios se llaman secuencialmente como sigue: CH1-bisagra-CH2-CH3- (-CH4) . CH4 está presente en IgM, que no tiene una región de bisagra. Las secuencias de ADN de los dominios de cadena pesada tienen una homología cruzada entre las clases de inmunoglobulina, por ejemplo, el dominio CH2 de IgG es homólogo al dominio CH2 de IgA e IgD, y al dominio CH3 de IgM e IgE . Las cadenas ligeras de inmunoglobulina pueden tener ya sea una cadena constante kappa (K) o lambda (?) . Las secuencias y las alineaciones de secuencia de estas regiones de inmunoglobulina son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" , U.S. Department of Health and Human Services, tercera edición 1983, cuarta edición 1987 y Huck et al. (1986) Nuc. Acids Res. 14: 1779-1789).

En las modalidades preferidas, la región variable se deriva de un anticuerpo específico para un antígeno de superficie celular preseleccionada (un antígeno asociado con una célula enferma, tal como una célula cancerígena o célula infectada viralmente) , y la región constante incluye los dominios CH1 y CH2 y CH3 de un anticuerpo que es el mismo o diferente del anticuerpo que es la fuente de la región variable. En la práctica de esta invención, la porción del anticuerpo de la inmunocitosina es de preferencia no inmunogénica o es débilmente inmunogénica en el receptor pretendido. Por lo tanto, la porción del anticuerpo, tanto como sea posible, se deriva de preferencia de la misma especie como el receptor pretendido. Por ejemplo, si la inmunocitosina se va a administrar a humanos, los dominios de región constante son preferentemente de origen humano. Ver, por ejemplo, patente U.S. No. 4,816,567. Además, cuando la región variable de inmunoglobulina se deriva de una especie diferente del receptor pretendido, por ejemplo, cuando las secuencias de región variable son de origen murino y el receptor pretendido es un humano, entonces la región variable comprende de preferencia las secuencias FR humanas con secuencias CDR de murino interpuestas entre las secuencias FR para producir una región variable quimérica que tiene una especificidad de unión para un antígeno preseleccionado, pero aún minimiza la inmunorreactividad en el huésped pretendido. El diseño y síntesis de tales regiones variables quiméricas se describen en Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525, Verhoyen et al. (1988) Science 239: 1534-1535 y las patentes U.S. Nos. 5,225,539 y 5,585,089. La clonación y expresión de una proteína de fusión de anticuerpo-citosina humanizada, proteína de fusión del anticuerpo IL-12 KS-l/4 anti-EpCAM, así como su capacidad para erradicar la metástasis de carcinoma de colon establecida se ha descrito en Gillies et al. (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203.

El gen que codifica la citosina se enlaza, ya sea directamente o por medio de un enlazador, por ejemplo, por medio de un ADN que codifica un enlazador (Gly4-Ser)3 en el marco al extremo 3' del gen que codifica la región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, un exón CH2 o CH3) . En algunas modalidades, el enlazador puede comprender una secuencias nucleotídica que codifica un sitio de escisión proteolítica. Este sitio, cuando se interpone entre la región constante de inmunoglobulina y la citosina, puede diseñarse para proporcionar una liberación proteolítica de la citosina en el sitio blanco. Por ejemplo, es bien conocido que la plasmina y tripsina cortan después a los residuos de lisina y arginina en sitios que son accesibles a las proteasas. Muchas otras endoproteasas de sitio específico y las secuencias de aminoácido que cortan son bien conocidas en la técnica. Los sitios de división proteolítica preferidos y las enzimas proteolíticas que son reactivas con tales sitios de división se describen en las patentes U.S. Nos . 5,541,087 y 5,726,044.

La construcción de ácido nucleico puede incluir opcionalmente el promotor y mej orador endógeno para el gen que codifica la región variable para regular la expresión de la cadena de inmunoglobulina quimérica. Por ejemplo, los genes que codifican la región variable pueden obtenerse como fragmentos de ADN que comprenden el péptido líder, el gen VJ (regiones variables (V) rearregladas funcionalmente con el segmento de unión (J) ) para la cadena ligera o el gen VDJ para la cadena pesada, y el promotor y mej orador endógeno para estos genes. Alternativamente, el gen que codifica la región variable puede obtenerse aparte de los elementos reguladores endógenos y usarse en un vector de expresión que proporciona estos elementos.

Los genes de la región variable pueden obtenerse por los procedimientos de clonación de ADN estándares a partir de las células que producen el anticuerpo deseado. La selección de la biblioteca genómica para una región variable rearreglada funcionalmente específica, puede realizarse con el uso de sondas de ADN apropiadas, tales como segmentos de ADN que contienen la secuencia de ADN de región J y las secuencias en la dirección 3'. La identificación y confirmación de los clones correctos se logra por secuenciación de los genes clonados y por comparación de la secuencia con la secuencia correspondiente de la longitud total, propiamente ARNm dividido.

El antígeno blanco puede ser un antígeno de superficie celular de una célula tumoral, una célula cancerígena u otra célula neoplásica. Los genes que codifican las regiones variables apropiadas pueden obtenerse en general de líneas celulares linfoides que producen inmunoglobulina. Por ejemplo, las líneas celulares de hibridoma que producen inmunoglobulina específicas para los antígenos asociados con tumores o antígenos virales pueden producirse por las técnicas de hibridación celular somática estándares bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, patente U.S. No. 4,196,285). Estas líneas celulares que producen inmunoglobulina proporcionan la fuente de los genes de región variable en la forma rearreglada funcionalmente . De manera alternativa, las secuencias de región variable pueden derivarse por selección de bibliotecas, por ejemplo, bibliotecas de exhibición de fago, para las secuencias de región variable que unen un antígeno preseleccionado con una afinidad deseada. Los métodos para elaborar y seleccionar bibliotecas de selección de fago se describen, por ejemplo, en Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281 y Kang et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 11120-11123.

El fragmento de ADN que codifica el gen de la región variable funcionalmente activo se enlaza a un fragmento de ADN que contiene el gen que codifica la región constante deseada (o una porción de la misma) . Las regiones constantes de inmunoglobulina (cadena pesada y ligera) pueden obtenerse de células que producen anticuerpos por las técnicas de clonación de genes estándares. Los genes para las dos clases -de cadenas ligeras humanas ( y ?) y se han clonado las cinco clases de cadenas pesadas humanas (OÍ, d, e, ? y µ) , y de esta manera, las regiones constantes de origen humano están fácilmente disponibles a partir de estos clones.

El gen fusionado que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina híbrida se monta o se inserta en un vector de expresión para la incorporación en una célula pretendida. La introducción de la construcción del gen en vectores de plásmidos puede realizarse por los procedimientos de división de gen estándares. La cadena pesada de inmunoglobulina quimérica puede co-expresarse en la misma célula con una cadena ligera de inmunoglobulina correspondiente, de modo que puede expresarse una inmunoglobulina completa y montarse simultáneamente. Para este propósito, las construcciones de cadena pesada y ligera pueden colocarse en el mismo o vectores separados.

Las líneas celulares pretendidas en general son células linfoides. La célula pretendida preferida es un mieloma (o hibridoma) . Los mielomas pueden sintetizar, montar y secretar inmunoglobulinas codificadas por genes transfectados y pueden glucosilar proteínas. Ejemplos de las células pretendidas o huésped incluyen el mieloma Sp2/0 que normalmente no producen células de inmunoglobulina endógena y mieloma de ratón NS/O. Cuando se transfectan, la célula produce únicamente inmunoglobulina codificada por las construcciones del gen transfectado . Los mielomas transfectados pueden crecerse en cultivo o en el peritoneo de ratones cuando la inmunocitosina secretada puede recuperarse de fluido ascitis. Otras células linfoides, tales como linfocitos B pueden usarse como célula receptoras . También pueden usarse células receptoras no linfoides, tales como células de ovario de hámster Chino.

Hay varios métodos para transfectar células linfoides con vectores que contienen las construcciones de ácidos nucleicos que codifican la cadena de inmunoglobulina quimérica. Por ejemplo, los vectores pueden introducirse en células linfoides por fusión de esferoblasto (ver, por ejemplo, Gillies et al. (1989) Biotechnol . 7: 798-804). Otros métodos útiles incluyen electroporación o precipitación con fosfato de calcio (ver, por ejemplo, Sambrook et al. eds (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press).

Otros métodos útiles para producir las inmunocitosinas incluyen la preparación de una secuencia de ARN que codifica la construcción y su traducción en un sistema de expresión in vivo o in vitro apropiado. Se contempla que las metodologías de ADN recombinantes para sintetizar los genes que codifican las proteínas de fusión de anticuerpo-citosina, para introducir los genes en las células huésped, para expresar los genes en el huésped y para cosechar la proteína de fusión resultante son bien conocidas y se documentan completamente en la técnica. Se describen protocolos específicos, por ejemplo, en Sambrook et al. eds (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press.

Se entiende que las inmunocitosinas acopladas químicamente pueden producirse usando una variedad de métodos bien conocidos por los experimentados en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo pueden acoplarse químicamente a la citosina usando cadenas laterales de aminoácidos químicamente reactivos en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y la citosina. Las cadenas laterales de aminoácidos pueden enlazarse covalentemente, por ejemplo, por medio de enlaces de disulfuro, o por medio de reactivos de reticulación homo- o hetero-bifuncionales , que incluyen, por ejemplo, 3 (-2-piridilditio) propionato de N-succinimidilo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinato, éster de n7-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida y 1 , -di- [3 ' (2 ' -piridiltio) propionamido] butano, todos los cuales están comercialmente disponibles en Pierce, Rockford, III.

Las composiciones usadas de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden proporcionarse a un mamífero mediante cualquier medio apropiado, directamente (por ejemplo, localmente, como por inyección, implantación o administración tópica a un locus de tejido) o sistémicamente (por ejemplo, parenteral u oralmente) . Cuando la composición será proporcionada parenteralmente , tal como mediante administración intravenosa, subcutánea, oftálmica, intraperitoneal , intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral , intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal o por aerosol, la composición comprende de preferencia parte de una suspensión o solución de fluido acuosa o fisiológicamente compatible. Las formulaciones serán reconocidas y/o desarrolladas de manera rutinaria por los experimentados en la técnica.

Las dosificaciones preferidas de la inmunocitosina para la administración son menores que la dosis máxima tolerada. Por ejemplo, la inmunocitosina puede administrarse a una dosis menor de la mitad, menor de un tercio, menor de un cuarto, o menor que un décimo de la dosis máxima tolerada. La dosis máxima tolerada (MTD, por sus siglas en inglés) es la dosis más alta a la que una sustancial puede administrarse a un nivel de toxicidad aceptable. Las sustancias que se administran a la dosis máxima tolerada, mientras que están en un nivel de toxicidad aceptable, pueden producir aún efectos secundarios no placenteros. Los efectos secundarios producidos por las inmunoci osinas son mucho menos graves que los efectos secundarios producidos sólo por las citosinas. Sin embargo, los efectos secundarios indeseables se han reportado - con el uso de diferentes inmunocitosinas, que incluyen fiebre, náusea, derrame vascular e hipotensión. Los métodos de la presente invención permiten el uso efectivo de inmunocitosinas a una dosis menor que la dosis máxima tolerada, que tiene la ventaja de producir menores efectos secundarios. Aunque la dosis a administrarse variará con base en la inmunocitosina usada y otros parámetros clínicos, en algunas modalidades la dosis está entre 0.01 mg/kg y 20 mg/kg de inmunocitosina, por ejemplo, por lo menos 0.03-15 mg/kg, 0.03-6 mg/kg, 0.03-1.5 mg/kg, 0.03-0.6 mg/kg, 0.5-20 mg/kg, 0.5-15 mg/kg, 0.5-10 mg/kg, 0.5-6 mg/kg, 0.5-5 mg/kg ó 0.5-1.5 mg/kg. La dosis de inmunocitosina administrada puede variar a través de todo el tratamiento. Por ejemplo, puede administrarse una citosina a una dosis menor más frecuentemente durante un número de días, semanas o meses, y luego administrarse a una dosis superior menos frecuentemente durante un número de días, semanas o meses. Por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0.0375-0.6 mg/kg puede administrarse 3 días por semana durante 3 semanas consecutivas, seguido de un aumento en la dosis de aproximadamente 0.0375-1.5 mg/kg administrada un día por semana durante las siguientes tres semanas.

La administración de la inmunocitosina puede ser por inyecciones de bolo periódicas, o mediante una administración intravenosa o intraperitoneal continua desde un depósito externo (por ejemplo, desde una bolsa intravenosa) o -interna (por ejemplo, desde un implante bioerosionable) . Se contempla, sin embargo, que la combinación óptima de inmunocitosinas y radiación, los modos de administración y las dosificaciones pueden determinarse mediante la experimentación de rutina muy dentro del nivel de un experimentado en la técnica.

La radiación puede matar las células efectoras inmunes. Por ejemplo, las células T y las células dendríticas en un tumor irradiado disminuyen inmediatamente después de la irradiación. Sin embargo, los niveles de las células T después rebotan a un nivel superior que los niveles de la línea base. Por lo tanto, es importante la dosis de inmunocitosina y el esquema de dosificación con relación al tiempo de la terapia de radiación. Se prefiere que la dosificación se esquematice de modo que el rebote de las células efectoras inmunes después de la terapia de radiación coincida con los efectos inmunoestimulantes de la administración de una inmunocitosina.

En una modalidad, una inmunocitosina se administra durante la terapia de radiación. En una modalidad preferida, una inmunocitosina se administra después de la terapia de radiación. La administración de una inmunocitosina durante o, de preferencia, después de la terapia de radiación, resulta en un efecto anti-tumoral sinérgico. La administración de una inmunocitosina antes del tratamiento de radiación puede fracasar para producir el efecto anti-tumoral sinérgico observado cuando se administran las inmunocitosinas después del tratamiento de radiación. De manera similar, la terapia de radiación extendida durante más de cinco días después del inicio de la administración de inmunocitosina, puede reducir el efecto sinérgico que se observa cuando la administración de inmunocitosinas se presenta después del término de la terapia de radiación. Sin desear ser relacionado por la teoría, los efectos inmunoestimulantes de la administración de inmunocitosina pueden truncarse por los efectos inmunosupresores de la radiación cuando la terapia de radiación se da después, o en algunos casos durante, la administración de inmunocitosina. Por otro lado, la administración de inmunocitosina no debería presentarse hasta que la terapia de radiación disminuya el efecto sinérgico.

La radiación y la inmunocitosina pueden administrarse cada una como dosis simples, como se representa en el esquema de dosificación mostrado en la Figura 1. Con referencia a la Figura 1, la radiación "R" se administra como una dosis simple en el día "Rl" . Después del intervalo 1-1, que puede medirse en horas o días, la inmunocitosina "IC" se administra como una dosis simple en el día "IC1" . De preferencia, el intervalo (intervalo 1-1) entre la administración de la radiación y la inmunocitosina está entre 0-21 días. Por ejemplo, el intervalo (intervalo 1-1) puede ser de 1-21 días, o de 2-21 días, o de 2-14 días, etc. Posteriormente, una dosis simple de la inmunocitosina puede administrarse a intervalos apropiados, por ejemplo, cada 2 semanas, cada 3 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas, cada 10 semanas, cada 11 semanas, cada 12 semanas, etc. Un esquema de dosificación ejemplar puede ser como sigue. En el día 1, se administra una dosis simple de radiación, y en el día 4, comienzan ciclos de tratamiento de inmunocitosina, en donde la inmunocitosina se administra como una sola dosis en intervalos de 3 semanas. Después de un número apropiado de ciclos de tratamiento, por ejemplo 5 a 10, el intervalo de dosificación se aumenta, por ejemplo hasta intervalos de 12 semanas .

En otra modalidad, como se muestra en la Figura 2, la radiación se administra en sólo un día, seguido de la administración de una inmunocitosina en días múltiples. Con referencia a la Figura 2, la radiación "R" se administra como una dosis simple en el día "Rl" . Después del intervalo 2-1, que puede medirse en horas o días, la administración de la inmunocitosina "IC" comienza en el día "IC1" . La inmunocitosina puede administrarse diariamente, en días alternados, cada tercer día, cada dos semanas, semanalmente , continuamente, o en cualquier otro esquema apropiado, hasta que termina la administración en el día "IC2" . Por ejemplo, la inmunocitosina puede administrarse una vez al día en 2 días consecutivos, 3 días consecutivos, 4 días consecutivos, etc. De preferencia, el intervalo (intervalo 2-1) entre la administración de la radiación y el comienzo de la administración de una inmunocitosina es de 0-21 días (por ejemplo, entre 1-21 días, entre 2-21 días, entre 2-14 días, etc .). Posteriormente, la inmunocitosina puede administrarse en intervalos apropiados, por ejemplo, cada 2 semanas, cada 3 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas, cada 10 semanas, cada 11 semanas, cada 12 semanas, etc. Un esquema de dosificación ejemplar puede ser como sigue: En el día 1 se administra una dosis simple de radiación, y en el día 4 comienzan ciclos de tratamiento de inmunocitosina, en donde se administra la inmunocitosina una día al día en 3 días consecutivos en intervalos de 3 semanas. Después de un número apropiado de ciclos de tratamiento, por ejemplo 5 a 10, el intervalo de dosificación se aumenta, por ejemplo hasta intervalos de 12 semanas .

En aún otra modalidad, como se muestra en la Figura 3, la radiación "R" se administra durante días múltiples, seguido de la administración de una inmunocitosina "IC" en solamente un día "IC1" . La radiación se administra de preferencia durante un periodo (intervalo 3-1) que no excede 14 días (por ejemplo, 4-10 días) . La radiación puede administrarse diariamente, en días alternados, cada tercer día, continuamente o en cualquier otro esquema apropiado, hasta que termina la administración en el día "R2" . Por ejemplo, la radiación puede administrarse en 3 días consecutivos, en 4 días consecutivos, en 5 días consecutivos, etc. La administración de la inmunocitosina se puede presentar por lo menos 5 días después del inicio "Rl" de la terapia de radiación (intervalo 3-2) , por ejemplo, 5 días después, 6 días después, etc. El intervalo (intervalo 3-3) entre el final "R2" de la terapia de radiación y la administración de la inmunocitosina puede ser de 0 o más días, por ejemplo 1 día, 2 días, etc. De preferencia, el intervalo (intervalo 3-3) entre el final "R2" de la terapia de radiación y la administración de la inmunocitosina "IC1" es de por lo menos 2 días, por ejemplo, 2 días, 3 días, etc. Posteriormente, puede administrarse una sola dosis de la inmunoci osina a intervalos apropiados, por ejemplo, cada 2 semanas, cada 3 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas, cada 10 semanas, cada 11 semanas, cada 12 semanas, etc. Un esquema de dosificación ejemplar puede ser como sigue. En los días -7 a -3 se administra una dosis fraccionada de radiación en 5 días consecutivos (días -7, -6, -5, -4 y -3), y en el día 1 (tres días después) comienzan los ciclos de tratamiento de inmunocitosina, en donde la inmunocitosina se administra como una dosis simple en intervalos de 3 semanas. Después de un número apropiado de ciclos de tratamiento, por ejemplo 5 a 10, se aumenta el intervalo de dosificación, por ejemplo hasta intervalos de 12 semanas .

En otra modalidad, como se muestra en la Figura 4, la radiación "R" puede administrarse en más de un día, seguido de la administración de una inmunocitosina "IC" en más de un día. De preferencia, la radiación se administra durante un periodo (intervalo 4-1) que no excede 14 días (por ejemplo, 4-10 días) . La radiación puede administrarse diariamente, en días alternados, cada tercer día, continuamente, o en cualquier otro esquema apropiado, hasta que termina la administración en el día "R2" . Por ejemplo, la radiación puede administrarse en 3 días consecutivos, en 4 días consecutivos, en 5 días consecutivos, etc. El inicio de la administración de la inmunocitosina se puede presentar por lo menos 5 días después del inicio de la terapia de radiación (intervalo 4-2), por ejemplo, 5 días después, 6 días después, etc. El inicio de la administración de la inmunocitosina se puede presentar por lo menos 1 día después del término de la terapia de radiación (intervalo 4-3) . De preferencia el intervalo (intervalo A-3) entre el final "R2" de la terapia de radiación y el inicio de la administración de la inmunocitosina "IC1" es de por lo menos 2 días, por ejemplo, 2 días, 3 días, etc. La inmunocitosina puede administrarse diariamente, en días alternados, cada tercer día, cada dos semanas, semanalmente , continuamente, o en cualquier otro esquema apropiado, hasta que termina la administración en el día "IC2" . Por ejemplo, la inmunocitosina puede administrarse una vez al día en 2 días consecutivos, 3 días consecutivos, 4 días consecutivos, etc. Posteriormente, la inmunocitosina puede administrarse en intervalos apropiados, por ejemplo, cada 2 semanas, cada 3 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas, cada 10 semanas, cada 11 semanas, cada 12 semanas, etc. Un esquema de dosificación ejemplar puede ser como sigue: En los días -7 a -3 se administra una dosis dividida de radiación en 5 días consecutivos, y en el día 1 comienzan los ciclos de tratamiento de inmunocitosina, en donde la inmunocitosina se administra una vez al día en 3 días consecutivos en intervalos de 3 semanas. Después de un número apropiado de ciclos de tratamiento, por ejemplo 5 a 10, se aumenta el intervalo de dosificación, por ejemplo, hasta intervalos de 12 semanas .

En otra modalidad, como se muestra en la Figura 5, la radiación "R" puede administrarse en más de un día, seguido de la administración de una inmunocitosina "IC" en más de un día. La radiación puede administrarse diariamente, en días alternados, cada tercer día, continuamente o en cualquier otro esquema apropiado, hasta que termina la administración en el día R2. El intervalo (intervalo 5-1) entre el inicio "Rl" de la administración de radiación y el inicio "IC1" de la administración de una inmunocitosina de preferencia no excede 14 días (por ejemplo, 4-10 días) . El inicio "IC1" de la administración de la inmunocitosina se puede presentar antes del final "R2" del periodo de la administración de la radiación. La inmunocitosina puede administrarse diariamente, en días alternados, cada tercer día, cada dos semanas, semanalmente, continuamente, o en cualquier otro esquema apropiado, hasta que termina la administración en el día IC2.

Mientras que estas modalidades describen un tratamiento simple que comprende un transcurso de la radiación seguido de la administración de la inmunocitosina, se visualiza que este tratamiento puede repetirse conforme sea apropiado. Por ejemplo, en una segunda ronda de tratamiento, la radiación puede administrarse al mismo o aun sitio de tumor diferente y/o la inmunocitosina o una inmunocitosina diferente puede administrarse subsecuentemente.

Combinación con otros tratamientos El método inventivo puede realizarse en combinación con otros agentes o métodos terapéuticos para lograr un efecto biológico deseado en un paciente. En una modalidad, la composición farmacéutica se administra antes, durante o después de la resección de un tumor. La remoción quirúrgica completa del tejido tumoral a menudo se complica por la invasión del tejido tumoral en los tejidos circundantes y los márgenes indefinidos de la masa. Como se describe en la presente, el tratamiento de un tumor usando el método de la invención conduce a un encogimiento del tumor, que facilitará la resección. Además, el desempeño post-quirúrgico del método de la invención puede eliminar las células tumorales residuales.

Como la resección quirúrgica, la quimioterapia es un tratamiento estándar para la mayoría de los tipos de cánceres. Por lo tanto, el método de la invención puede realizarse en paralelo, antes o después de las terapias de base química. Los quimioterapéuticos comunes incluyen, pero no se limitan a, adriamicina, asparaginasa, bleomicina, busulfan, cisplatina, carboplatina, carmustina, capecitabina, clorambucil, citarabina, ciclofosfamida, camptotecina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, dexrazoxana, docetaxel, doxorubicina, etoposida, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina, mecloretamina, mercaptopurina, melfalan, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nitrosurea, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, procarbazina, estreptozocina, teniposida, tioguanina, tiotepa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, taxol, transplatino, 5 - fluorouracilo y similares.

El método de la invención puede realizarse junto con la terapia hormonal, que es la manipulación de los niveles hormonales en el cuerpo para tratar una enfermedad. Muchos cánceres se afectan bastante por los niveles de hormonas en el cuerpo y como tales, los terapéuticos típicos asociados con la terapia hormonal, por ejemplo, tamoxifen, trabajan para reducir el nivel de circulación de hormonas e/o interrumpen la unión de hormonas a los receptores hormonales .

El método de la invención puede realizarse en combinación con la administración de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, bevacizumab (Avastin) , cetuximab (Erbitux) , gemtuzumab (Mylotarg) , ibritumomab (Zevalin) , matuzumab y rituximab (Rituxin) . Los anticuerpos monoclonales actúan a través de una variedad de mecanismos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden unir a proteínas de tumores específicos y atraer células inmunes al sitio del tumor. Alguno anticuerpos monoclonales funcionan bloqueando las señales de crecimiento que de otra manera permitirían que los tumores crezcan y se expandan. Otros anticuerpos monoclonales se unen a partículas radioactivas o fármacos quimioterapéuticos y actúan para liberar la radiación o fármacos específicamente a células cancerígenas. Tejido Blanco Los tipos de tumores y las células cancerígenas a tratarse con los métodos de la presente invención incluyen todos los tipos de tumores sólidos, tales como los que se asocian con los siguientes tipos de cánceres: pulmón, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) , pancreático, colon, rectal, esofágico, próstata, mama, carcinoma de ovario, carcinoma renal, linfoma y melanoma. El tumor puede asociarse con cánceres de (es decir, localizado en) la cavidad oral y faringe, el sistema digestivo, el sistema respiratorio, huesos y articulaciones (por ejemplo, metástasis ósea), tejido suave, la piel (por ejemplo, melanoma) , mama, el sistema genital, el sistema urinario, el ojo y la órbita, el cerebro y el sistema nervioso (por ejemplo, glioma) , o el sistema endocrino (por ejemplo, tiroides) y no es necesariamente el tumor primario. Los tejidos asociados con la cavidad oral incluyen, pero no se limitan a, la lengua y los tejidos de la boca. El cáncer puede surgir en los tejidos del sistema digestivo que incluyen, por ejemplo, el esófago, estómago, intestino delgado, colon, recto, ano, hígado, vesícula biliar y páncreas. Los cánceres del sistema respiratorio pueden afectar la laringe, pulmón y bronquios e incluyen, por ejemplo, carcinoma de pulmón de células no pequeñas. Los tumores pueden surgir en la cerviz uterina, cuerpo uterino, vulva de ovario, vagina, próstata, testículos y pene, que forman los sistemas genitales del macho y la hembra, y la vejiga urinaria, riñón, pelvis renal y uretra, que comprenden el sistema urinario.

El tumor puede ser en cualquier etapa, y puede someterse a otras terapias. El método de la invención es útil en el tratamiento de tumores (es decir, destrucción de células tumorales o reducción en el tamaño del tumor) que se han probado que son resistentes a otras formas de terapia de cáncer. El tumor también puede ser de cualquier tamaño. De manera ideal, en el tratamiento del humano para el cáncer, el método de la invención resulta en una tasa disminuida del crecimiento del tumor, muerte celular cancerosa (tumor) y/o reducción, en el tamaño del tumor. Será apreciado que la muerte celular del tumor se puede presentar sin una disminución sustancial en el tamaño del tumor debido a, por ejemplo, la presencia de células de soporte, vascularización, matrices fibrosas, etc. Por lo tanto, mientras que se prefiere la reducción en el tamaño del tumor, no se requiere en el tratamiento de cáncer.

De preferencia, el método de la invención reduce el tamaño de un tumor por lo menos aproximadamente 5% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 10%, 15%, 20% ó 25%) . Más preferentemente, el tamaño del tumor se reduce en aproximadamente 30% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ó 65%) . Aún más preferentemente, el tamaño del tumor se reduce en por lo menos aproximadamente 70% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% ó 95%) . Más preferentemente, el tumor se elimina completamente. Sin embargo, como se describe en la presente, la reducción en el tamaño del tumor, aunque se prefiere, no se requiere. Todo lo que se requiere es la reducción en la velocidad de crecimiento del tumor. Por ejemplo, el tumor puede disminuir su velocidad de crecimiento, detener el crecimiento completamente, encoger o eliminarse completamente. Cualquier reducción en la velocidad del crecimiento del tumor es suficiente para realizar un efecto terapéutico.

Valoración de la eficacia La eficacia de los métodos de la presente invención puede medirse de varias maneras. Por ejemplo, las mediciones del tamaño del tumor, la recurrencia, supervivencia e inicio de la respuesta inmune (por ejemplo, usando un perfil génico, proteómico o celular) pueden usarse para determinar la eficacia del tratamiento. Las mediciones pueden hacerse antes, durante y después del tratamiento para monitorear la efectividad de los métodos de la presente invención. La efectividad de los métodos puede monitorearse a través del transcurso del tratamiento de los pacientes. Alternativamente, los modelos animales descritos en la siguiente sección de ejemplos u otro modelo de animal apropiado pueden usarse por un experimentado en la técnica para probar qué combinaciones de inmunocitosinas y radiación y, opcionalmente, otros tratamientos de cánceres son más efectivos para actuar sinérgicamente para mejorar la destrucción inmune de los tumores establecidos o células cancerígenas. Además, ya que se identifican nuevas inmunocitosinas, un experimentado en la técnica sera capaz de usar estas medidas de eficacia para valorar el potencial de las nuevas inmunocitosinas para mejorar los efectos anticáncer de la radiación.

La recurrencia, supervivencia y tamaño del tumor pueden monitorearse para evaluar la eficacia de los métodos de la presente invención. La recurrencia y la supervivencia pueden valorarse usando los análisis conocidos en la técnica. El tamaño del tumor en los pacientes humanos puede monitorearse usando un número de métodos de formación de imagen conocidos en la técnica, que incluyen endoscopia, imagen radiográfica (que incluye rayos x) , exploraciones de tomografía computada (CT) , imagen de resonancia magnética (MRI) e imagen nuclear. El efecto de la terapia en el crecimiento del tumor en modelos animales puede monitorearse por los métodos de formación de imagen, o por la medición con calibrador o volumétrica .

La eficacia de los métodos de la presente invención también puede determinarse midiendo si se ha estimulado una respuesta inmune. El inicio de una respuesta inmune puede medirse usando una variedad de métodos. En un ejemplo, el perfil de expresión génica puede realizarse para determinar si los genes importantes para la función inmune se han estimulado por los métodos de la presente invención. El perfil de expresión puede realizarse en las muestras de tumores o en otras muestras, tales como muestras de nodo linfático o células mononucleares de sangre periférica, cuyos perfiles de expresión pueden ser indicativos de la presencia o ausencia de una respuesta inmune sistémica. Las muestras pueden tomarse del paciente antes, durante y/o después del tratamiento. El ARN del tejido del tumor de loa mamíferos tratados se extrae y pueden valorarse los niveles de expresión de los genes asociados con una respuesta inmune, tales como por PCR de tiempo real cuantitativo, antes y después del tratamiento con los presentes métodos: El ARN transcrito de los genes involucrados en la función inmune se amplifica para determinar si la expresión se aumenta o se disminuye a través del transcurso del tratamiento .

En otro ejemplo, siguiendo la terapia, los tumores pueden someterse a una biopsia o cortarse, seccionarse y teñirse por medio de los métodos histológicos estándares, o por medio de los reactivos inmunohistológicos específicos para valorar el efecto de la terapia combinada en la respuesta inmune. Por ejemplo, el teñido simple con hematoxolina y eosina puede revelar diferencias en la infiltración linfocítica en los tumores sólidos lo es indicativo de una respuesta inmune celular. Además, el inmunoteñido de sección con anticuerpos a clases específicas de células inmunes puede revelar la naturaleza de una respuesta inducida. Por ejemplo, los anticuerpos que unen a CD45 (un marcador de leucocitos general) , CD4 y CD8 (para la identificación de las subclases de las células T) , CD25 (un marcador de linfocito) y NKl .1 (un marcador en células NK) pueden usarse para valorar el tipo de respuesta inmune que se ha mediado por los métodos de la invención. Además, los anticuerpos contra la inmunocitosina usados en la terapia pueden emplearse para medir el grado al cual la inmunocitosina infiltró el tumor.

El tipo y el grado de respuesta inmune estimulado en respuesta a los métodos de la presente invención también pueden evaluarse usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para analizar las poblaciones de células efectoras inmunes. Usando los métodos bien conocidos en la técnica, las muestras procesadas, tales como muestras de sangre, se exponen a un cóctel de anticuerpos contra diferentes marcadores celulares inmunes, tales como CD4, CD8, CD25, CD44, CD62L, CDllb y DX5. Cada especie de anticuerpo se marca con una etiqueta fluorescente que tiene una longitud de onda de emisión distinta de la de las otras especies de anticuerpos en el cóctel. Las muestras después se procesan por un clasificador FACS, tal como FacsARIA (BD Biosciences) y se analizan para diferentes subpoblaciones celulares .

El inicio de una respuesta inmune también puede medirse usando una prueba de mancha inmunosorbente enlazada a enzima (ELISPOT) . Para determinar si se ha estimulado una célula inmune dada, los anticuerpos a una proteína, por ejemplo, una citosina, que se produce con la activación de la célula, se recubren sobre una placa ELISPOT. Los esplenocitos de ratones tratados con los métodos de la presente invención se adicionan a la placa y se incuban. Si las células se activan, secretarán la proteína de interés y la proteína será capturada por los anticuerpos. Los anticuerpos específicos a un epítopo diferente de la proteína se adicionan a la placa. Estos anticuerpos pueden etiquetarse con cualquiera de un número de etiquetas conocidas en la técnica. Comúnmente, los anticuerpos se etiquetan con biotina, y también se adiciona estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) . La presencia y la cantidad de la etiqueta después se mide para determinar el grado al que una célula se ha activado en la respuesta inmune.

Alternativamente, el tipo de respuesta inmune mediada por los métodos de la presente invención puede valorarse por los estudios de agotamiento del subgrupo celular convencionales descritos, por ejemplo, en Lode et al. (1998) Blood 91: 1706-1715. Ejemplos de los anticuerpos de agotamiento incluyen los que reaccionan con los marcadores de las células T CD4 y CD8 , así como los que unen los marcadores NK NK1.1 y asíalo GM. En forma breve, estos anticuerpos se inyectan a un mamífero antes de iniciar los presentes métodos a dosis bastante altas (por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 0.5 mg/ratón), y se administran en intervalos semanales después de completar el experimento. Esta técnica puede identificar los tipos celulares necesarios para estimular la respuesta inmune observada en el mamífero.

En otro método, la actividad citotóxica de los esplenocitos aislados de los animales que se han tratado con la terapia de combinación, pueden compararse con los de los otros grupos de tratamiento. Los cultivos de esplenocitos se preparan por desmenuzamiento mecánico de los bazos recuperados, estériles por las técnicas estándares encontradas en la mayoría de los manuales de laboratorio de inmunología. Ver, por ejemplo, Coligan et al. (eds) (1988) "Current Protocols in Immunology" , John Wiley & Sons, Inc. Las células resultantes después se cultivan en un medio de cultivo celular apropiado (por ejemplo, DMEM de GIBCO) que contiene suero, antibióticos y una baja concentración de IL-2 (-10 U/mL) . Por ejemplo, para comparar la actividad de NK, 3 días de cultivo normalmente es óptimo, mientras que, para comparar la actividad citotóxica de las células T, 5 días de cultivo normalmente es óptimo. La actividad citotóxica puede medirse etiquetando radio-activamente las células del blanco tumoral (por ejemplo, células LLC) con 51Cr durante 30 minutos. Después de la remoción del exceso de la radioetiqueta, las células etiquetadas se mezclan con concentraciones variadas de células de bazos cultivados durante 4 h. Al final de la incubación, el 51Cr liberado de las células se mide por un contador gama que después se usa para cuantificar el grado de lisis celular inducida en las células inmunes . Se mide de esta manera la actividad del linfocito T citotóxico tradicional (o CTL) .

Autorización del tratamiento o pago para el tratamiento De acuerdo con los métodos de la presente invención, un tercero, por ejemplo, un hospital, clínica, une entidad gubernamental, grupo de reembolso, compañía de seguros (por ejemplo, una compañía de. seguros de salud), HMO, pagador de terceros u otra entidad que paga, o reembolsa gastos médicos puede autorizar el tratamiento, autorizar el pago para el tratamiento o autorizar el reembolso de los costos de tratamiento. Por ejemplo, la presente invención se relaciona con un método de cuidado de la salud que incluye autorizar la administración de, o autorizar el pago o reembolso para la administración de, una inmunocitosina a un mamífero con un tumor o células cancerígenas que se irradiaron previamente. Por ejemplo, el método de cuidado de la salud puede incluir autoriza la administración de, o autorizar el pago o reembolso para la administración de, una inmunocitosina a un mamífero con un tumor previamente irradiado a una dosis de por lo menos 1 Gy por día (por ejemplo, por lo menos 2, por lo menos 3, 1-4, 1-10, 1 -20, 2-4, 2-10, 2-20, 3-4, 3- 10 ó 3-20 Gy/día) . El método de cuidado de la salud de la presente invención puede incluir autorizar la administración de, o autorizar el pago o reembolso para la administración de, una inmunocitosina cuando la inmunocitosina se administrará dentro de 21 días (por ejemplo, dentro de 18, dentro de 15, dentro de 12 o dentro de 8 días) de la primera administración de la radiación al tumor. En una modalidad, el método de cuidado de la salud puede incluir autorizar la administración de, o autorizar el pago o reembolso para la administración de, una inmunocitosina después del tratamiento de radiación,- en el que la inmunocitosina se administra a una dosis menor que la dosis máxima tolerada de la inmunocitosina, por ejemplo, a una dosis menor de la mitad, menor de un tercio, menor de un cuarto o menor de un décimo de la dosis máxima tolerada de la inmunocitosina.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Materiales y Métodos Proteínas NHS-IL2LT, también se refiere como Selectikine o EMD521873, se produjo de una línea celular NS/0 y se purificó. NHS-mulL12 se produjo de una línea celular NS/0 y se purificó.

Células Las células CT26, una línea celular epitelial de colon de murino derivada de la inyección intrarrectal de N-nitroso-N-metiluretano en ratones BALB/C, se transfectaron para expresar el antígeno KS de humano (KSA o EpCAM) que se clonó por PCR y se expresó en células parentales usando un vector retroviral (Gillies 1998) . Las células CT26/KSA se mantuvieron en DMEM, suplementado con 10% de suero fetal de bovino inactivado con calor, L-glutamina, vitaminas, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, penicilina/estreptomicina y Geneticin® (G418) (Life Technologies, Inc.) a 37°C y 7% de C02. Se adicionó G418 para mantener la expresión de KSA. Las células CT26 y CT26/KSA se implantaron en ratones BALB/C hembra.

Las células LL/2 (LLC) , una línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis de murino, se mantuvieron en DMEM, suplementado con 10% de suero fetal de bovino inactivado con calor, L-glutamina, penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Inc.) a 37°C y 7% de C02. Las células LLC se implantaron en ratones C57BL/6 hembra.

Las células B16, una línea celular de melanoma de murino, se mantuvieron en RPMI 1640, suplementado con 10% de suero fetal de bovino inactivado con calor, L-glutamina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Inc.) a 37°C y 7% de C02. Las células B16 se implantaron en ratones C57BL/6 hembra .

Químicos y Soluciones Se formuló EMD521873 en arginina 128 mM, citrato 6 mM, sacarosa al 2.35%, Tween 80 al 0.05%, pH 6.0. Las concentraciones de proteínas de las soluciones diluidas se determinaron usando a absorbancia a 280 nm y el coeficiente de extinción teórica de 12.38 mg/OD2eo basado en la secuencia proteínica conocida. La solución patrón se almacenó a 4°C durante menos de 1 mes. Para la dosificación a los ratones, se retiró una alícuota de material formulado de las ampolletas patrón, diluidas con solución salina al 0.9% y se inyectaron en el animal dentro de una hora después de la dilución. Se desechó el material diluido no usado.

Se formuló NHS-mulL12 en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, Tween 80 al 0.05%, pH 7.0. Para la dosificación a los ratones, el material formulado se diluyó con solución salina al 0.9% a 0.5 mg/ml .

Se obtuvo cisplatina (dicloruro de c/s-diaminplatinio (II)) en polvo de Sigma-Aldrich® (catálogo # P4394) . Una solución de dosificación de 0.4 mg/ml se preparó en solución salina al 0.9%.

Métodos Para la prueba de crecimiento del tumor, las células que crecen exponencialmente en el cultivo se inyectaron como una suspensión celular simple en 100 µ? de PBS intramuscularmente en las patas delanteras de los ratones. En los experimentos que usan un modelo de tumor dual, las células también se implantaron en los flancos de los ratones. Después de que los tumores habían llegado a establecerse, el tratamiento se inició (día 0) . En el experimento LLC-7, los tumores se implantaron en el flanco hasta establecerse. Los ratones se trataron en los días 0 a 9, después, en el día 12, los cortaron se cortaron usando cirugía de supervivencia. Posteriormente, se monitoreó la supervivencia del animal. En el experimento LLC-14, los tumores se implantaron subcutáneamente en el flanco hasta establecerse. Los ratones se trataron en los días 0 a 6 y día 17, y el tamaño del tumor se midió dos veces por semana durante la duración del estudio.

La siguiente tabla resume las condiciones para cada experimento : Tabla 1 Los tumores se midieron con calibres en tres dimensiones durante la duración del experimento. Los volúmenes del tumor se calcularon usando la ecuación: Volumen = 4/3n(L/2 x W/2 x H/2) en donde L = longitud, W = ancho y H = altura del tumor Los animales se pesaron y se monitoreó la salud general durante el transcurso de la prueba.

Para la irradiación local, los ratones se anestesiaron por inyección intraperitoneal de una solución de 2% de tribromoetanol/3% de xilazina. La cantidad inyectada fue de 0.02 ml/gramo del peso del receptor. Los ratones se restringieron para que sólo su pierna que tiene el tumor se expusiera a radiación, mientras que el resto del ratón se protegió. Los tumores se irradiaron con radiación gama 13 Cs a una velocidad de dosificación de 1 Gy/minuto usando un Gammacell® 40 Exactor (Nordion, Ottawa, ON) .

Las poblaciones de las células efectoras inmunes en la sangre se analizaron por FACS. La sangre se colectó del seno retro-orbital de cada ratón. Los glóbulos rojos se eliminaron usando amortiguador de lisis. Después de bloquear con IgG de rata (1:50), las muestras se incubaron con un cóctel de 7 colores de los anticuerpos contra CD4 , CD8 , CD25, CD44, CD62L, CDllb y DX5. Las muestras se corrieron en un FacsARIA y se analizaron para varias sub-poblaciones celulares.

Las pruebas de inmunomanchado enlazadas a enzimas C (ELISPOT) para la inducción IFNy en los esplenocitos se llevaron a cabo recubriendo primero placas ELISPOT con un anticuerpo anti-IFNy (kit IFNy de murino, BD Biosciences) . Los esplenocitos de los ratones tratados se adicionaron a las placas y se incubaron con un péptido AH1:A5 para estimular la liberación de IFNy de las células T CT26 específicas. La detección Ab de IFNy biotinilada y estreptavidina-HRP se adicionaron a las placas. Las manchas resultantes de los linfocitos que producen IFNy individuales se contaron usando un lector de placa Zeiss® KS-ELISPOT.

El perfil génico de los tumores se analizó usando tejidos de tumor cortados colocados en el reactivo de estabilización de ARN RNAlater® con la cosecha. El ARN total se preparó con un kit R easy® (Qiagen) y ADNc se preparó con el kit Superscript® III para qPCR (Life Technologies, Inc.). Las reacciones de qPCR se realizaron en un instrumento ABI7500 de una manera estandarizada y se analizaron los cambios relativos en la expresión génica usando el método ddCt (factor de eficiencia 95%) . Los genes domésticos usados por comparación incluyeron ACTB, B2M y HPRTl.

Métodos de evaluación y estadísticas Los datos de la prueba de crecimiento de tumor subcutáneo se presentan en forma gráfica que representan las desviaciones promedio y estándar (sd) de los volúmenes del tumor o los pesos durante y después de la dosificación. Los cambios del peso del animal se determinaron sustrayendo el peso del animal en cada intervalo del peso corporal inicial, en el día 0, luego dividiendo por el peso corporal inicial y multiplicando por 100. Por lo tanto, un valor de 0 indica sin cambio de peso.

La prueba t de Student de 2 colas o la prueba Mann-Whitney Rank Sum, conforme sea apropiado, se realizó en los volúmenes de tumores individuales o pesos animales, para determinar las diferencias significativas entre los grupos de tratamiento.

Ejemplo 2: Efecto de una dosis simple de radiación seguido de tratamiento de inmunocitosina.

Se evaluó el efecto de una sola dosis de radiación dada en el día 0 seguido por dosificación i.v. de la inmunocitosina (5 mg/kg) en tres modelos de tumores sinérgicos subcutáneos (carcinoma de colon CT26, carcinoma de colon CT26/KSA que expresa EpCAM humano y melanoma B16) . Este ejemplo y, excepto cuando se indique lo contrario, los siguientes ejemplos usaron la inmunocitosina ejemplar dl-NHS76y2 (h) (FN>AQ) -ala-IL2 (D20T) , también designado como Selectikine o EMD521873 y descrito, por ejemplo, en la patente U.S. No. 7,186,804.

En tres experimentos separados usando el modelo CT26/KSA (Experimentos CT26-1-3) , la irradiación de los tumores con 3 ó 4 Gy seguido de EMD521873 en los días 2, 3 y 4 resultaron en un fuerte efecto sinérgico en el que la mayoría de los animales obtuvieron regresiones completas. El análisis ELISPOT usando un antígeno CT26 endógeno demostró un aumento de > 4 veces en la respuesta de las células T comparado con la terapia sola. Se observó un aumento de 4 veces en las células T efectoras en la sangre comparado con la terapia sola, mientras que las técnicas del perfil de qPCR mostraron aumentos dramáticos en las células T y genes asociados con la activación de las células T en el tumor con CD8 , Granzyme B y expresión génica IFNy que aumenta en por lo menos 3.5-4.6 veces comparado con EMD521873 o la radiación sola. La subpoblación de linfocitos CD4+CD25+, que se asocia con las células T reguladoras, aumentó en la sangre con la combinación; sin embargo, no aumentaron los niveles de la expresión génica FoxP3 en el tumor. Además, cuando la inmunocitosina KS-IL12 se probó bajo las mismas condiciones experimentales, la respuesta inmune medida dentro del tumor fue muy similar, lo que indica que los efectos sinérgicos de la radiación administrada y las inmunocitosinas no se limitan al uso con EMD521873, o incluso a las inmunocitosina con un radical NHS o un radical IL2.

En el modelo CT26 (Experimento CT26-4) , los tumores se erradicaron con 4 u 8 Gy seguido de EMD521873 i.v. en los días 2, 3 y 4. La combinación de EMD521873 con la dosis de 8 Gy bloqueó el crecimiento del tumor más allá de con solamente la terapia. No se monitoreó la respuesta inmune en el tumor.

En el modelo B16 (Experimento B16-1) , la irradiación de los tumores con 10 Gy en dO seguido de EMD521873 i.v. en los días 3, 4 y 5 resultó en una actividad anti-tumoral mayor comparado con el tratamiento solo. Además, hubo un aumento moderado, pero significativo en algunos marcadores de respuesta inmune en el tumor medido por los perfiles de expresión génica de marcador inmune con CD25, TNFA, TYROBP, ICOS y CD45 siendo modulado > 4 veces comparado con la terapia sola.

Ejemplo 3: Efecto de la dosis fraccionada de la radiación seguido por las dosis de inmunocitosina múltiples Los efectos anti-tumorales de cinco dosis diarias de 3.6 Gy administradas en los días 0-4 seguido de la dosificación i.v. de la inmunocitosina ejemplar EMD521873 (5 mg/kg) en los días 7, 8 y 9 se evaluó en el modelo de carcinoma de pulmón de Lewis (Experimentos LLC-1, LLC-2) . No se observaron respuestas completas en los grupos de control o monoterapia, mientras que 3/6 animales lograron respuestas completas con la combinación. El perfil de expresión génica usando un panel de marcadores inmunes demostró aumentos en los marcadores para las células T, activación de células T, tráfico de linfocitos y respuesta Thl para la combinación comparado con la radiación o EMD521873 solo. Los genes que se sobre-regularon incluyen CD45, CISH, CD122, MGP, FASL, CD80, PTPRB, CD6 , CCR7 , TXK, CTLA , PDCD1 , IL10R, CCL6 , CD8A, EOMES, CD28, TYROBP, ICAM1, CD206, VCAM1, CD3G, ITGAL, ITGB2, LAT, GZMK, STAT4 , IL1A, CD115, MDM2 , CD26, GIMAP3 , CXCR4, LC , HS6ST2. Los genes sub-regulados incluyen IL23A, SELE, SC4MOL, LDLR, SQLE, RAE1 , CXCL1 , CCL2.

Ejemplo 4: Efecto de la adición de quimioterapia a la radiación más la combinación de citosinas Los efectos anti-tumores del tratamiento con la inmunocitosina (EMD521873, en este ejemplo) después de la radiación combinada con el tratamiento de quimioterapia (quimiorradiación) se evaluaron en el modelo de tumor subcutáneo de pulmón de Lewis (LLC-14) . En este ejemplo, se usó cisplatina como un ejemplo de un agente quimioterapéutico . Los animales que portan tumores (n=10) se trataron sólo con quimiorradiación (cisplatina (4 mg/ml) y radiación fraccionada (3.6 Gy/d, dO-4)), con EMD521873 (5 mg/kg/día i.v.) o NHS-mulL12 (10 yg/animal/día s.c.) solo, o con quimiorradiación combinada con la inmunocitosina EMD521873 (5 mg/kg/día i.v.) o NHS-mulL12 (10 pg/animal/día s.c). La inmunocitosina se administró en únicamente un día en d6 y nuevamente en sólo un día en dl7. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana hasta d24. Como se observa en la Figura 6, el crecimiento del tumor de los animales tratados con quimiorradiación combinada con NHS-mulL12 (cuadrados abiertos) se disminuyó significativamente comparado con los animales tratados sólo con quimiorradiación (triángulos cerrados) , animales tratados sólo con NHS-mulL12 (cuadrados cerrados) , animales tratados sólo con EMD521873 (círculos cerrados) o animales tratados con solución salina (X) . La quimiorradiación también mejoró la eficacia de EMD521873 (círculos abiertos) .

En otro experimento (Experimentos LLC-1, LLC-2, LLC-4), los animales que portan tumores se trataron sólo con radiación fraccionada (3.6 Gy/d, dO-4) , sólo con cisplatina (4 mg/kg, dO) , sólo con EMD521873 (5 mg/kg, d7 , 8, 9), las combinaciones duales o la combinación triple. La combinación de EMD521873 con radiación redujo el crecimiento del tumor comparado con cualquiera de los tratamientos simples y con los otros tratamientos dobles, y resultó en 3/6 regresiones completas. La adición de cisplatina a la terapia de radiación/EMD521873 resultó en un control de crecimiento adicional y 5/6 regresiones completas. Estos resultados demuestran que la terapia con la radiación o quimiorradiación seguido de EMD521873 mejora la respuesta inmune y el control del tumor comparado sólo con la terapia de radiación, quimiorradiación o EMD521873.

Se observaron resultados similares cuando se usó NHS-mulL12 como la inmunocitosina bajo condiciones experimentales idénticas. Como se observa en la Figura 7, cuando se administró NHS-mulL12 (círculos cerrados) o EMD521873 (círculos abiertos) con quimiorradiación bajo las condiciones experimentales descritas anteriormente, resultó una disminución en el crecimiento del tumor comparado con la observada sin usar tratamiento (X) , usando sólo quimiorradiación (cuadrados abiertos) , usando sólo EMD521873 (diamantes abiertos) o sólo con NHS-mulL 12 (triángulos abiertos) .

En otro experimento se usaron las mismas condiciones experimentales, y la triple combinación de quimiorradiación más EMD521873 (círculos abiertos) llevó a una disminución en el volumen del tumor seguido de 9/9 regresiones completas. Cuando se administró sólo la quimiorradiación (triángulos abiertos) , en promedio no se observó una disminución en el crecimiento del tumor y únicamente se presentaron 1/9 regresiones completas. Cuando se usó sólo un tratamiento de control (X) o EMD521873 (cajas blancas) , no se observó una disminución en el crecimiento del tumor y no se presentaron regresiones completas (Figura 8) .

Ejemplo 5: Capacidad de la irradiación local más terapia de inmunocitosina para generar una respuesta anti-tumoral sistémica (Experimentos LLC-3-LLC-7) La capacidad de irradiación seguida por la administración intravenosa de la inmunocitosina ejemplar EMD521873 para generar una respuesta inmune a largo plazo se probó re-estimulando los ratones curados con las células tumores. Los ratones que portan tumores de carcinoma de pulmón de Lewis se trataron originalmente con radiación fraccionada (3.6 Gy/d, dO-4) más cisplatina (4 mg/kg, dO) , sólo EMD521873 (5 mg/kg, d7 , 8, 9), o la combinación de EMD521873 más quimiorradiación . Se determinó el número de respuestas completas y después los ratones que habían logrado las remisiones completas durante más de 50 días se re-estimularon por inyección s.c. de células LLC seguido de monitoreo del crecimiento del tumor comparado con ratones nativos que no se habla tratado previamente. La Tabla 2 muestra que 12 de 13 ratones que habían logrado tasas de respuesta inmune con el tratamiento de EMD521873 /quimiorradiación no volvió a crecer el tumor, lo que demuestra que habían desarrollado una inmunidad protectora a largo plazo a las células tumorales LLC.

Tabla 2: Re-estimulación de ratones C57BL/6 curados con células de carcinoma de pulmón de Lewis Tasa de respuesta completa Inmunidad a la re- estimulación Tratamiento Ctrl Sel Ch/Rx Sel+ Ctrl Sel Ch/Rx Sel+ Ch/Rx nativo Ch/Rx Exp LLC-3 0/6 0/6 0/6 3/5 0/5 n.a. n.a. 3/3 Exp LLC-4 0/8 1/8 1/8 7/8 0/5 0/1 1/1 5/6 Exp LLC-5 0/6 0/6 0/6 4/5 0/5 n.a. n.a. 4/4 En otro experimento, los tumores LLC se establecieron subcutáneamente en la pata y el flanco del mismo animal. Los animales después se trataron con cisplatina (4 mg/kg, dO) más radiación fraccionada administrada al tumor de la pata (3.6 Gy/d, dO-4), EMD521873 i.v. sólo (5 mg/kg, d7 , 8, 9) o la combinación de EMD521873 más quimiorradiación (Experimento LLC- 6) . Se monitorearon el crecimiento del tumor y la respuesta inmune en el tumor de la pata irradiada y el tumor del flanco no irradiado. Como en los estudios previos, la combinación de la quimiorradiación seguido de EMD521873 obtuvo un buen control del crecimiento de la lesión irradiada. Aunque el control del crecimiento del tumor del flanco por la terapia de combinación no sobrepasó el de sólo E D521873, el análisis de la respuesta inmune para la terapia de combinación en la lesión no irradiada demostró un mejoramiento de la respuesta inmune. Las células efectoras CD8 se aumentaron en aproximadamente 4 veces en la sangre con la combinación comparado con la quimiorradiación o sólo con EMD521873. El análisis inmunohistoquímico mostró que la infiltración de células CD8 en los tumores tratados con el grupo de la terapia de combinación comparado con las monoterapias se mejoró en 3.5 veces en la lesión no irradiada contra 9 veces en la lesión irradiada. Asimismo, el perfil de expresión génica inmune mostrado en los tumores de la pata y los tumores del flanco que EMD521873 + quimiorradiacion aumentó CD3 (>20 veces, pata; 8 veces, flanco), CD8 (10 veces, pata; 3.5 veces, flanco), CISH (5.8 veces, pata; 3.2 veces, flanco), CXCL9 (10.5 veces, pata; 14 veces, flanco) e IFNg (14 veces, pata; 7 veces, flanco) más de EMD521873 o la quimiorradiacion sola. Aunque los aumentos observados en los tumores irradiados fueron en general mayores que aquellos en los tumores del flanco, estos resultados demuestran que la radiación local de una lesión primaria más quimioterapia y EMD521873 pueden generar una respuesta inmune sinérgica en un tumor no en el campo de la radiación .

En otro experimento se probó la capacidad de la irradiación local seguido de la administración de inmunoci osina para reducir la recurrencia tumoral después de cirugía (Experimento LLC-7) . Los ratones con tumores LLC subcutánea se trataron con quimiorradiacion (cisplatina 4 mg/kg, do más 3.6 Gy/d, d0-4 de la radiación fraccionada administrada al tumor) o EMD521873 (5 mg/kg, d7 , 8, 9) más quimiorradiacion. El tumor restante después se removió quirúrgicamente en el día 12 ó 13 y se monitoreó la supervivencia. Diez de los 12 ratones tratados con la combinación lograron una supervivencia a largo plazo comparado con 6 de 10 tratados sólo con radiación. Mientras que las diferencias no fueron estadísticamente significativas (p=0.23), no sugirieron que la combinación proporcionaría una protección mejorada contra la recurrencia o expansión metastática después de la cirugía para la combinación de EMD521873 más quimiorradiación comparado sólo con la quimiorradiación.

Ejemplo 6: Comparación del tratamiento con quimiorradiación más inmunocitosina para el tratamiento con terapia de quimiorradiación más citosina (IL-2) (Experimentos LLC-8 y LLC-9) Se diseñó un experimento para comparar la combinación de la inmunocitosina ejemplar E D521873 más quimiorradiación con la citosina ejemplar IL-2 más quimiorradiación. Los ratones con tumores LLC subcutáneos se trataron con quimiorradiación (4 mg/kg de cisplatina, dO más 3.6 Gy/d, do -4 de radiación fraccionada administrada al tumor) , EMD521873 i.v. sólo (5 mg/kg, d7 , 8, 9), IL-2 i.v. sólo (dosis equimolar de IL-2 comparado con EMD521873, 1.5 mg/kg, d7, 8, 9, 10, 11), o la combinación de EMD521873 más quimiorradiación o IL-2 más quimiorradiación. Después se moni orearon el control del crecimiento del tumor, la velocidad de respuesta y la respuesta inmune dentro del tumor .

Para la combinación de EMD521873, un total de 12 marcadores de expresión inmunes (GZMB , PDCD1, NKG7 , NKG2D, CD3G, ITGAL, CD122, CD8A, FASL, CTLA4 , INOS, CD25) se sobre-regularon por lo menos 3 a 6 veces en los grupos de combinación con relación al nivel máximo logrado en los monoterapias . En contraste, los efectos de la combinación de IL2 con quimiorradiación en las muestras de tumor DIO fueron similares sólo con la quimiorradiación sin una contribución obvia de la citosina. La comparación de la velocidad de respuesta completa y el control del crecimiento tumoral reflejaron los datos de la respuesta inmune. La combinación de EMD521873 obtuvo un mejor control del crecimiento y una velocidad de respuesta completa (T/C = 0.03 en el día 21 con 4/6 animales con una respuesta completa) comparado con la combinación IL-2 (T/C = 0.09 en el día 21 con 2/6 animales con una respuesta completa) . De manera importante, la terapia de combinación de EMD521873 obtuvo una respuesta de memoria superior comparado con la combinación de IL- 2/quimiorradiación. Cuatro de los 4 ratones con respuestas completas de la combinación de EMD521873/quimiorradiación fueron inmunes a la re-estimulación con células LLC. Por el contrario, ninguno de los 2 ratones con respuestas completas en la terapia de combinación de IL-2/quimiorradiación fueron inmunes a la re-estimulación con tumor.

Además, se observaron resultados similares a los observados con EMD521873/quimiorradiación con otra _ inmunocitosina, NHS-IL2wt, en combinación con la quimiorradiación bajo las mismas condiciones experimentales. NHS-IL2wt se describe en, por ejemplo, patente U.S. No. 7,186,804. Este resultado demuestra que el efecto sinérgico de la radiación o la quimiorradiación y la administración de inmunocitosina puede observarse con las inmunocitosinas diferentes de EMD521873.

Ejemplo 7: Repuesta de la dosis de radiación en combinación con una dosis y esquema fijos de quimioterapia más inmunocitosina (Experimento LLC-3) Para examinar cómo la dosis radiación afecta el efecto antitumoral de la combinación de la quimiorradiación más la inmunocitosina, los ratones con tumores LLC subcutáneos se trataron con cisplatina (4 mg/kg, dO) más 0, 0.4, 1.2 ó 3.6 Gy/d de irradiación local administrada en los días 0-4. La quimiorradiación se continuó ya sea mediante ningún tratamiento o por EMD521873 (5 mg/kg, d7, 8, 9) . Después se monitorearon el tamaño del tumor y la velocidad de respuesta. La combinación de EMD521873 con cisplatina más 0.4 Gy/d no mejoró el control del crecimiento del tumor sólo con EMD521873 o EMD521873 más cisplatina. 1.2 Gy/d en combinación con EMD521873 mejoró el control del crecimiento comparado sólo con la terapia; sin embargo, no se obtuvieron respuestas completas con la combinación o monoterapias . Por último, la cisplatina más una dosis de 3.6 Gy/d en combinación con EMD521873 mejoró dramáticamente el control del crecimiento del tumor y la velocidad de respuesta completa (T/C = 0.02 en el día 19 con 5/6 respuestas completas) comparado con la cisplatina más 3.6 Gy/d grupo (T/C = 0.32 en el día 19 con 0/6 respuestas completas) o el grupo EMD521873 sólo (T/C = 0.69 en el día 19 con 0/6 respuestas completas) .

Ejemplo 8: Respuesta de la dosis de inmunocitosina en combinación con la dosis y esquema fijados de quimiorradiación (Experimento LLC-10) Para examinar cómo la dosis de la inmunocitosina afecta el efecto antitumoral de la combinación de quimiorradiación más inmunocitosina, los ratones con tumores LLC subcutáneos se trataron con dosis aumentadas de EMD521873 i.v. (0, 1, 5 ó 15 mg/kg, d7, 8, 9) ya sea sola o en combinación con quimiorradiación (4 mg/kg de cisplatina en dO más 3.6 Gy/d de irradiación de tumor local en dO-4) . Después se monitorearon el tamaño del tumor, la velocidad de respuesta y la modulación del gen inmune en el tumor. No se estableció una repuesta a la dosis para los intervalos de dosificación usados dado que todas las dosis en combinación con la quimiorradiación proporcionaron un control de crecimiento similar, velocidad de respuesta (CRs = 2/8, 3/8 y 3/8 para 1, 5 y 15 mg/kg de EMD521873 más quimiorradiación, respectivamente) y los perfiles de modulación génicos inmunes . Los efectos sobre el control de crecimiento se observan en la Figura 9: 1 mg/kg (cuadrado cerrado), 5 mg/kg (triángulo cerrado) y 15 mg/kg (círculo cerrado) EMD521873, en combinación ' con la quimiorradiación, resultó en un volumen de tumor reducido similarmente comparado con 1 mg/kg (cuadrado abierto) , 5 mg/kg (triángulo abierto) y 15 mg/kg (círculo abierto) sólo EMD521873, sólo quimiorradiación ( +) o sólo vehículo (X) . Estos resultados muestran que las dosis de EMD521873 muy por debajo de la dosis máxima tolerada pueden combinarse de manera segura con la quimiorradiación sin afectar significativamente la eficacia.

Ejemplo 9: Efecto de prolongar el número de dosis de radiación antes de administrar inmunocitosina (Experimento LLC-13) Para examinar cómo la dosificación prolongada de la radiación antes de la dosificación de la inmunocitosina impactaría la efectividad de la combinación, los ratones con tumores LLC subcutáneos se trataron con quimiorradiación durante 1 semana (cisplatina, 4 mg/kg en do y 3.6 Gy/d en dO, 2, 4), 2 semanas (cisplatina, 4 mg/kg en dO y 3.6 Gy/d en dO, 2, 4, 7, 9, 11) ó 3 semanas (cisplatina, 4 mg/kg en dO y 3.6 Gy/d en dO, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18) antes de administrar la inmunocitosina ejemplar EMD521873 (administrada en 3 dosis diarias i.v. 3 días después de la última dosis de radiación) . Después se monitorearon el tamaño del tumor, la velocidad de respuesta y la modulación génica inmune en el tumor.

Similares a los resultados previos, los ratones tratados con cisplatina más radiación en la primera semana, seguido de EMD521873 obtuvieron 4/10 respuestas completas y un mejoramiento del control de crecimiento del tumor comparado sólo con la terapia. Por el contrario, los ratones tratados con cisplatina más radiación durante dos semanas o durante tres semanas antes de EMD521873 obtuvieron únicamente 2/10 ó 0/10 respuestas completas, respectivamente, y no proporcionaron un mejoramiento del control de crecimiento del tumor comparado sólo con quimiorradiación . Además, el análisis de los perfiles del gen de la respuesta inmune en los tumores de los ratones tratados con los diferentes regímenes, indicaron que el tratamiento con radiación en la primera semana seguido de EMD521873 proporcionó el mejoramiento más fuerte en los genes claves asociados con Thl (inducciones plagadas aproximadas comparado con el control no tratado: CD3, 50; CD8, 19; IFNY, 22; CD25, 45; granzima, 22 y perforina, 8) . En comparación, se despuntó la respuesta inmune cuando la radiación se administró en las 2 semanas previas a EMD521873 (inducciones plegadas aproximadas comparado con el control no tratado: CD3, 14; CD8 , 6; IFNy, 10; CD25, 22; granzima, 2 y perforina, 5) mientras que proporcionando una radiación en las 3 semanas antes de EMD521873 resultó en una abrogación casi completa de la respuesta inmune. Estos resultados demuestran que administrando quimiorradiación durante solamente una semana antes de proporcionar EMD521873 fue superior a los regímenes de radiación de dos semanas o tres semanas .

Ejemplo 10: Efecto de la administración de inmunocitosina durante la quimiorradiación (Experimento LLC-12) .

Para examinar cómo la dosificación de inmunocitosina durante un transcurso de la radiación impactaría . la efectividad de la combinación, los ratones con tumores LLC subcutáneos se trataron con radiación durante 1 semana (3.6 Gy/d; dO, 2, 4), 2 semanas (3.6 Gy/d; dO, 2, 4, 7, 9, 11) ó 3 semanas (3.6 Gy/d; dO, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18) con o sin administración intravenosa de la inmunocitosina ejemplar EMD521873 (5 mg/kg) en los días 7, 8, 9. Después se monitorearon el tamaño del tumor, la velocidad de respuesta y la modulación génica inmune en el tumor. Los resultados mostraron que la administración de EMD521873 después de una sola semana de radiación resultaron en una mayoría de las regresiones tumorales; sin embargo, no existieron respuestas completas. De manera similar, la administración de EMD521873 durante la segunda semana de un transcurso de 2 semanas de radiació o durante la segunda semana de un transcurso de 3 semanas de radiación también resultó en las regresiones tumorales y mejoraron el control del crecimiento del tumor comparado con EMD521873 o sólo con la radiación. Sin embargo, mientras que la dosificación de EMD521873 durante la segunda semana durante un transcurso de 3 semanas de radiación no obtuvo un control del tumor adicional, el perfil génico inmune demostró que la respuesta inmune en el tumor se despuntó por la radiación adicional comparado con la observada en los tumores que reciben EMD521873 durante la segunda semana de un transcurso de 1 semana ó 2 semanas de radiación. Estos efectos inmunes también están en linea con los resultados descritos anteriormente, que muestran que la radiación continuada despuntó los efectos inmunes de la combinación de EMD521873/radiación.

Ejemplo 11: Efecto de la administración de inmunocitosina antes de la quimiorradiación (Experimento LLC-11) Para examinar si la administración de la inmunocitosina antes de la radiación resultaría en efectos anti- tumorales mejorados, los ratones con tumores LLC subcutáneos se trataron con la inmunocitosina ejemplar EMD521873 (5 mg/kg, dO, 1, 2) en la primera semana antes del tratamiento con radiación en la segunda semana (3.6 Gy/d; d7, 9, 11) o en la segunda y tercera semanas (3.6 Gy/d; d7, 9, 11, 14, 16, 18). Después se monitorearon el tamaño del tumor, la velocidad de respuesta y la modulación génica inmune en el tumor. Los resultados mostraron que la administración de EMD521873 seguido de radiación durante 1 ó 2 semanas, no proporcionó un aumento en el control de crecimiento del tumor comparado con E D521873 -o sólo con el régimen de radiación. Sin embargo, ni las regresiones tumorales ni las respuestas completas se obtuvieron como se observó cuando la radiación se administró antes de EMD521873. Además, el análisis del perfil de la respuesta génica inmune para la combinación no se afectó significativamente comparado con E D521873 o cualquier régimen de radiación sólo. Estos resultados, junto con los resultados anteriores demuestran que el tiempo y la duración de la radiación con relación a la dosificación de EMD521873 son importantes para lograr una respuesta inmune anti-tumoral y un control de crecimiento del tumor.

Ejemplo 12: Tratamiento del cáncer de pulmón de humano Una prueba de dosis intensificada se realiza usando EMD521873 en combinación con la irradiación local (20 Gy) de los tumores primarios o metástasis en pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeña de etapa Illb con efusión pleural maligna o etapa IV, con control de enfermedad (respuesta parcial o enfermedad estable) después de la aplicación de 4 ciclos de quimioterapia de primera línea, a base de platino.

Los pacientes reciben irradiación local (5 x 4 Gy) administrada durante 5 días consecutivos, antes del primer ciclo de tratamiento con EMD521873. Después de un intervalo sin tratamiento de 2 días, se administran infusiones intravenosas de EMD521873 en 3 días consecutivos en ciclos de 3 semanas.

En cada ciclo, los pacientes reciben EMD521873 administrado como una infusión intravenosa l-h, una vez al día en 3 días consecutivos (días 1-3) seguido de un descanso sin tratamiento de 18 días (días 4-21).

La intensificación de la dosis de EMD521873 se realiza en cohortes de 3 pacientes a niveles de dosificación de 0.15, 0.30 y 0.45 mg/kg. La intensificación al siguiente nivel de dosificación se basa en el número de toxicidades que limitan la dosis (DLTs) observadas, si existieran, durante el periodo de evaluación DLT (es decir los 21 días después del día de la primera infusión de EMD528173 en el primer ciclo) . Las DLTs se definen como cualquier grado de toxicidad =3 verificado como relacionado con el tratamiento de la prueba (EMD521873 y/o radiación) . Si no se presenta DLT en los 3 pacientes, los siguientes 3 pacientes se reclutan al siguiente nivel de dosis más alto. Si 1 de los 3 pacientes experimenta DLT(s), una cohorte adicional de 3 pacientes recibe el mismo nivel de dosis. Si 1 o más de los 3 pacientes adicionales experimenta una DLT, la MTD será considerada que se ha excedido y será interrumpida la intensificación de la dosis. El nivel de dosificación precedente será considerado como la MTD. Si 2 ó 3 de los 3 pacientes experimentan DLTs, la MTD será considerada que se ha excedido, la intensificación de la dosis será interrumpida y el nivel de dosificación precedente será considerado como la MTD.

Si las DLTs se presentan en 1 de los 6 pacientes tratados al nivel de dosificación de 0.15 mg/kg, un nivel de dosificación intermedio de 0.225 mg/kg se introduce antes de intensificar a 0.3 mg/kg. Si las DLTs se presentan en =2 pacientes tratados al nivel de dosificación de 0.15 mg/kg, se explora el nivel de dosificación de 0.075 mg/kg. Si 0 ó 1 paciente experimenta una DLT en este nivel de dosificación, sería considerada 0.075 mg/kg la MTD.

Se anticipa que incluso los pacientes tratados a un nivel de dosificación menor que la MTD demostrarán velocidades mejoradas de respuesta tumoral, como se determina por la exploración CT o MRI, y se pueden demostrar mejoramientos en la supervivencia y/o función pulmonar.

Ejemplo 13: Tratamiento de melanoma humano Se realiza un estudio para investigar las respuestas de metástasis cutánea en pacientes con melanoma maligno cutáneo/subcutáneo de etapa IIIb-IV a EMD521873 en el sitio del tumor y en la sangre a EMD521873, en combinación con irradiación local (25 Gy) . El primer ciclo de tratamiento con EMD521873 comienza en el día 1. Los ciclos subsecuentes se administran en intervalos de 3 semanas. Antes de la primera dosis de EMD521873, los pacientes se tratan con dos cesiones de radiación local (25 Gy) administrada en fracciones de 5 Gy en 5 días consecutivos (días -28 a -24; y los días -7 a -3) a diferentes metástasis.

Para cada paciente, por lo menos dos lesiones cutáneas o subcutáneas elegidas para la biopsia se seleccionan para la radiación potencial (lesión Al y lesión A2) y, si está presente, también se selecciona una tercera lesión (lesión A3) . Una biopsia de una lesión cutánea/subcutánea (lesión Al) y el muestreo de sangre se realizan en la línea base (D-28) . Después de 7 días, permitiendo la curación necesaria del área de la biopsia, la lesión Al se irradia (5 x 5 Gy) durante 5 días consecutivos, comenzando en el día -21 (D-21 a D-17) . En el día -7 (D-7) las muestras de sangre se extraen y se toma una biopsia de la lesión irradiada Al. Esta muestra de tumor sirve como un control intra-individual para valorar el efecto de la radiación sola. En el día -14, las lesiones pre-seleccionadas A2 y A3 también se someten a biopsia y se retira la sangre. La radiación local se realiza solamente en la lesión (A2) como anteriormente (5 5 Gy) pero comenzando en el día -7 (D-7 a D-3) . Después de un intervalo sin tratamiento de 2 días, es decir, comenzando en el día 1, se administran 0.3 mg/kg de EMD521873 como una infusión intravenosa de 1 hora en 3 días consecutivos (D 1-3) . El muestreo de sangre para el inmuno-monitoreo y las biopsias de la lesión irradiada A2 y la lesión no irradiada A3 se colectan en intervalos definidos (DI y D8 del ciclo 1) por comparación a la línea base (D-28) y con el control intra-individual (sólo radiación) y con las biopsias colectadas en D-14. Se anticipa que la lesión no irradiada (lesión A3) evidenciará el efecto sistémico de la terapia en los sitios no irradiados (efecto abscopal) .

Los pacientes que reciben EMD521873 y la radiación se esperan que demuestren una progresión tumoral reducida (por ejemplo, como se define por la exploración PET o CT) comparado con los pacientes de control que reciben solamente EMD521873 en ausencia del tratamiento de radiación.

La invención puede tener modalidades en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o las características esenciales de la misma. Por lo tanto, las modalidades anteriores serán consideradas en todos los aspectos ilustrativas en lugar de limitantes de la invención descrita en la presente. De esta manera, el alcance de la invención se indica por las reivindicaciones anexas en lugar de la descripción anterior, y todos los cambios que entran dentro del significado y alcance de equivalencia de las reivindicaciones se pretende que sean abarcados en la presente.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Uso de una inmunocitosina para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de tumores, en donde el tumor se irradió previamente, y la inmunocitosina se destina para la administración dentro de 21 días de una radiación previa inicial del tumor.

2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el tumor se irradió inicialmente 8-21 días antes de la primera administración de la inmunocitosina.

3. Uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde la primera administración de la inmunocitosina se logra después de 1-6 días después del final de la irradiación del tumor.

4. Uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la primera administración de la inmunocitosina se logra después de 2-5 días después del final de la irradiación del tumor .

5. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el tumor se irradió en días múltiples durante un periodo de 1-14 días.

6. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la inmunocitosina se administra en días múltiples durante un periodo de 1-5 días, formando de esta manera un primer ciclo de administración de inmunocitosina.

7. Uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde un segundo ciclo respectivo y adicional de administración de inmunocitosina se programa después de 2-12 semanas después del final del primer ciclo.

8. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el tumor se irradió en uno o varios días una vez o se divide a una dosis de por lo menos 1 Gy por día.

9. Uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el tumor se irradió a una dosis de 1-20 Gy por día.

10. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la dosis de inmunocitosina después de la irradiación es menor que la dosis máxima tolerada por un paciente, definida por la ocurrencia de efectos secundarios graves en el paciente.

11. Uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde la dosis de inmunocitosina es menor de la mitad de la dosis máxima tolerada.

12. Uso de conformidad con la reivindicación 10 u 11, en donde la dosis de inmunocitosina es menor de 1 mg/kg de peso corporal.

13. Uso de conformidad con la reivindicación 10 u 11, en donde la dosis de inmunocitosina es menor de 0.5 mg/kg de peso corporal .

14. Uso de conformidad con la reivindicación 13 , en donde la dosis de inmunocitosina es de 0.1 mg/kg- 0.5 mg/kg.

15. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la irradiación del tumor se llevó a cabo sólo con un subgrupo de células tumorales .

16. Uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el tumor tiene diferentes sitios en el cuerpo que definen los subgrupos de células tumorales.

17. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la citosina con la molécula de inmunocitosina es IL-12, IL2 o IL2 (D20T) .

18. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la inmunocitosina es NHS-IL2(D20T) o NHS-IL12.

19. Inmunocitosina para el uso para el tratamiento de tumores, en donde el tumor se irradió previamente con 1-30 Gy por día, y la inmunocitosina se destina para la administración dentro de 21 días después de la radiación inicial previa del tumor.

20. Inmunocitosina de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la primera administración de la inmunocitosina se logra después de 1-6 días después de completar la irradiación del tumor.

21. Inmunocitosina de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizada porque el tumor se irradió en días múltiples durante un periodo de 1-14 días.

22. Inmunocitosina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizada porque la dosis de inmunocitosina después de la radiación es menor de la mitad de la dosis máxima tolerada por un paciente, definida por la ocurrencia de efectos secundarios graves en el paciente.

23. Inmunocitosina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-22, caracterizada porque la irradiación del tumor se llevó a cabo con un subgrupo de células tumorales sólo localizadas en forma diferente.

24. Inmunocitosina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-23, caracterizada porque la citosina dentro de la molécula de inmunocitosina es IL12, IL2 o IL2 (D20T) .

25. Inmunocitosina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-24, caracterizada porque la inmunocitosina es NHS-IL2 (D20T) o NHS-IL12.