JP7450944B2 - 進行膵癌の放射線処置と組み合わせた免疫調節薬 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７４７，８３０号の優先権を主張し、これは、全体が本明細書をもって参照により本明細書に組み込まれる。

膵癌（ＰＣ）は、世界で１２番目に多い悪性腫瘍であるが、疾患の悪性度に起因するがん関連死の７番目の主な原因である（ＵＫ ＣＲ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１８；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ／ｈｅａｌｔｈ－ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ／ｃａｎｃｅｒ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ－ｂｙ－ｃａｎｃｅｒ－ｔｙｐｅ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ－ｃａｎｃｅｒ）。不十分な生存率の統計は、成長（ＫＲＡＳ）、ＤＮＡ損傷対照（ＴＰ５３）、及び細胞周期の調節（ＣＤＫＮ２Ａ）を含むコアシグナル伝達パスウェイにおける一般的な機能不全の結果である（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１（５８９７）：１８０１－１８０６）。これらの異常は、症状の発症前に急激な疾患増悪を引き起こし、１次介入時に局所進行腫瘍（ＬＡＰＣ）の有病率を増加させる（Ｈｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ，１５（１）：８－１８）。現在では、ＰＣの唯一の治癒は、外科的切除であるが、新たに診断された患者の８０～９０％は、切除不能とみなされ、ネオアジュバント療法は、進行／切除不能病変の約９０％の病期の低下が達成できない（Ｇｉｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ，７（４）：ｅ１０００２６７）。

多数の化学療法／化学放射線療法のレジメンが、ほとんどのＬＡＰＣ悪性腫瘍を縮小させることができないが、新興の方策である体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）は、将来性を示している（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ，１２３（１８）：３４８６－３４９３）。低線量の多分割スケジュールを提供する従来の放射線療法（ｃｏｎＲＴ）とは異なり、ＳＢＲＴは、複数のビーム角度を使用して腫瘍を正確に標的とする高線量を利用する。ＳＢＲＴの放射線線量は、４～５分割で照射することができ、周囲の正常組織への損傷が少なく、殺腫瘍能力が高くなる（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３２（２６）：２８４７－２８５４）。加えて、全身白血球細胞毒性を最小化することにより、放射線誘発性壊死中にマスクされていない腫瘍の新抗原は、浸潤Ｔ細胞をプライミングして、強力な免疫原性応答を惹起するために、使用することができる（Ｏｒｄｅｒ，１９７７，Ｃａｎｃｅｒ，３９（２ Ｓｕｐｐｌ）：７３７－４３）。放射線療法は、溢出を促進するための腫瘍内（ＩＴ）化学誘引物質環境の調節及び間質構造の変更を通して、白血球のホーミングを促進することもできる（Ｌｕｇａｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８０（５）：３１３２－３１３９）。しかし、ＲＴは、ナチュラルキラー及びエフェクターＴ細胞を動員することにより強力な炎症誘発性応答を誘導し得るが、それは、炎症性単球（ＩＭ）、また、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、及び制御性Ｔ細胞を含む様々な免疫抑制細胞型を引き付け得る（Ｗａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ，１０：１７５８８３４０１７７４２５７５）。

ＲＴの混合された免疫調節効果は、免疫療法にとって魅力的な組み合わせになる。さらに乳児期では、ＰＣの併用免疫療法は、ほとんどの場合、デュアルチェックポイント阻害薬または化学療法環境でのチェックポイント阻害を利用しており、結果は未だ顕著な利点を示していない（Ｔｈｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｈｅｒａｐ Ａｄｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，１０（１）：１６８－１９４）。プラチナ系薬剤などの特定の細胞毒性化学療法は、免疫原性細胞死を誘発することが示されているが、高用量では、好中球減少症及び白血球減少症も引き起こし得る（Ｐｆｉｒｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４４（２）：３４３－３５４；Ｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ，４７（１９）：６６４５－６６５３）。さらに、ＰＣなどの免疫学的に「冷たい」腫瘍におけるＴ細胞プライミングの失敗及び高い抑制細胞分布は、一般に、免疫チェックポイント阻害の耐性につながる（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，２０１８，Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ，３３（４）：５６３－５６９；Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ，１１８（１）：９－１６）。多面発現性サイトカインであるインターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、Ｔ細胞の活性化を、直接的に、ならびに抗原提示の増加ならびにリンパ球及び骨髄由来抑制細胞の両方の免疫原性リプログラミングを介して間接的に刺激することによる抗腫瘍能で周知である（Ｚｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４（２）：１５５－１６１；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８５（３）：２２３－２２６；Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ，４（４）：３５５－３６８；Ｋｅｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２１（１２）：４７４６－４７５７）。しかし、ＩＬ－１２の翻訳の研究は、失望させる治療効果を示し、治験は、ボーラス全身投与から生じた深刻な毒性のために一時的なものであった（Ｊｅｎｋｓ，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，８８（９）：５７６－５７７）。

従って、切除不能な前立腺癌の予防及び処置のための改善された方法及び組成物の必要性が存在する。本発明は、この満たされていないニーズを満たす。

一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における切除不能な膵癌腫瘍を処置するための方法に関し、方法は、ａ）該腫瘍に有効量の電離放射線を投与すること；及び、ｂ）該対象に免疫調節性サイトカインを含む有効量の組成物を投与すること、を含む。

一実施形態では、該電離放射線は、Ｘ線、ガンマ線、電子、または高線エネルギー付与（ＬＥＴ）放射線を含む。

一実施形態では、該組成物は、マイクロ粒子またはナノ粒子を含む。

一実施形態では、マイクロ粒子またはナノ粒子は、半結晶性マトリックスを含む。

一実施形態では、免疫調節性サイトカインは、半結晶性マトリックスに閉じ込められる。
一実施形態では、該免疫調節性サイトカインは、ＩＬ－１２を含む。

一実施形態では、該電離放射線は、標的放射線療法として投与される。

一実施形態では、該標的放射線療法は、小分割腫瘍標的放射線療法または体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）である。

一実施形態では、標的放射線療法は、３～８分割で与えられる３～８Ｇｙ／分割からなるレジメンにより投与される。

一実施形態では、該組成物は、該電離放射線と同時に投与される。一実施形態では、該組成物は、該電離放射線の後に投与される。一実施形態では、該組成物は、該電離放射線の前に投与される。

一実施形態では、該組成物は、腫瘍内注射により投与される。

一実施形態では、０．５μｇ～１０００ｍｇの該組成物を含む単回投薬量が投与される。

一実施形態では、各投薬量が各組成物の０．５μｇ～１０００ｍｇを占める、該組成物の複数回投薬量が投与される。

一実施形態では、切除不能な膵癌腫瘍は、局所進行膵癌腫瘍（ＬＡＰＣ）または転移性進行膵癌腫瘍である。

一実施形態では、該対象は、哺乳動物である。一実施形態では、該対象は、ヒトである。

上述の要約、ならびに本発明の例示的な実施形態の以下の詳細な説明は、添付図面と併せて読むと、よりよく理解されるであろう。しかし、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことが理解されるべきである。

図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。腫瘍中心（ＵＩ［未照射］、図１Ａ及び図１Ｇ；ＳＢＲＴ、図１Ｃ及び図１Ｉ）ならびにマージン（ＵＩ、図１Ｂ及び図１Ｈ；ＳＢＲＴ、図１Ｄ及び図１Ｊ）を分析した。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。腫瘍中心（ＵＩ［未照射］、図１Ａ及び図１Ｇ；ＳＢＲＴ、図１Ｃ及び図１Ｉ）ならびにマージン（ＵＩ、図１Ｂ及び図１Ｈ；ＳＢＲＴ、図１Ｄ及び図１Ｊ）を分析した。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。腫瘍中心（ＵＩ［未照射］、図１Ａ及び図１Ｇ；ＳＢＲＴ、図１Ｃ及び図１Ｉ）ならびにマージン（ＵＩ、図１Ｂ及び図１Ｈ；ＳＢＲＴ、図１Ｄ及び図１Ｊ）を分析した。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。腫瘍中心（ＵＩ［未照射］、図１Ａ及び図１Ｇ；ＳＢＲＴ、図１Ｃ及び図１Ｉ）ならびにマージン（ＵＩ、図１Ｂ及び図１Ｈ；ＳＢＲＴ、図１Ｄ及び図１Ｊ）を分析した。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。高倍率視野（ＨＰＦ）１ｍｍ^２当たりのイベント数及び中心：マージン分布を、ＣＤ８＋（それぞれ、図１Ｅ及び図１Ｆ）ならびにＣＤ６８＋（それぞれ、図１Ｋ及び図１Ｌ）細胞について計算した。中心：マージンの細胞比は、平均化する前の各試料で計算し；データは、平均±ＳＥＭ、ｔ検定として示される。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。高倍率視野（ＨＰＦ）１ｍｍ^２当たりのイベント数及び中心：マージン分布を、ＣＤ８＋（それぞれ、図１Ｅ及び図１Ｆ）ならびにＣＤ６８＋（それぞれ、図１Ｋ及び図１Ｌ）細胞について計算した。中心：マージンの細胞比は、平均化する前の各試料で計算し；データは、平均±ＳＥＭ、ｔ検定として示される。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。腫瘍中心（ＵＩ［未照射］、図１Ａ及び図１Ｇ；ＳＢＲＴ、図１Ｃ及び図１Ｉ）ならびにマージン（ＵＩ、図１Ｂ及び図１Ｈ；ＳＢＲＴ、図１Ｄ及び図１Ｊ）を分析した。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。腫瘍中心（ＵＩ［未照射］、図１Ａ及び図１Ｇ；ＳＢＲＴ、図１Ｃ及び図１Ｉ）ならびにマージン（ＵＩ、図１Ｂ及び図１Ｈ；ＳＢＲＴ、図１Ｄ及び図１Ｊ）を分析した。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。腫瘍中心（ＵＩ［未照射］、図１Ａ及び図１Ｇ；ＳＢＲＴ、図１Ｃ及び図１Ｉ）ならびにマージン（ＵＩ、図１Ｂ及び図１Ｈ；ＳＢＲＴ、図１Ｄ及び図１Ｊ）を分析した。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。腫瘍中心（ＵＩ［未照射］、図１Ａ及び図１Ｇ；ＳＢＲＴ、図１Ｃ及び図１Ｉ）ならびにマージン（ＵＩ、図１Ｂ及び図１Ｈ；ＳＢＲＴ、図１Ｄ及び図１Ｊ）を分析した。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。高倍率視野（ＨＰＦ）１ｍｍ^２当たりのイベント数及び中心：マージン分布を、ＣＤ８＋（それぞれ、図１Ｅ及び図１Ｆ）ならびにＣＤ６８＋（それぞれ、図１Ｋ及び図１Ｌ）細胞について計算した。中心：マージンの細胞比は、平均化する前の各試料で計算し；データは、平均±ＳＥＭ、ｔ検定として示される。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。予め染色されていなかった（ｎ＝５人の患者）またはＳＢＲＴのみで処置された（ｎ＝７人の患者）ヒトＰＤＡ切片の代表的な（２０ｘ）ＣＤ８（図１Ａ～図１Ｄ）及びＣＤ６８（図１Ｇ～図１Ｊ）免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。高倍率視野（ＨＰＦ）１ｍｍ^２当たりのイベント数及び中心：マージン分布を、ＣＤ８＋（それぞれ、図１Ｅ及び図１Ｆ）ならびにＣＤ６８＋（それぞれ、図１Ｋ及び図１Ｌ）細胞について計算した。中心：マージンの細胞比は、平均化する前の各試料で計算し；データは、平均±ＳＥＭ、ｔ検定として示される。 図１は、図１Ａ～図１Ｍを含み、ＳＢＲＴがヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８Ｔ細胞を動員し且つｃｏｎＲＴに優れていることを示す例示的な実験結果を示す。０日目（ｎ＝４～６）に、放射線療法の標的用の２つのチタン基準クリップを使用して、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を同所移植したことを示す実験を示す。ＳＡＲＲＰプラットフォーム（または基準クリップ移植を伴うＵＩ偽手術）を使用して、ＳＢＲＴ（６Ｇｙで３ ４日）またはｃｏｎＲＴ（２Ｇｙで３ １５日）を照射した。ＩＶＩＳスペクトルを使用して、生物発光イメージングを実施したことを示す。値は、目的の腫瘍領域（ＲＯＩ）内の最大光子放出（生物発光、ＢＬＩ）の幾何平均として表され：Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ群に対して有意性がある。 ０日目（ｎ＝４～６）に、放射線療法の標的用の２つのチタン基準クリップを使用して、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を同所移植したことを示す実験を示す。ＳＡＲＲＰプラットフォーム（または基準クリップ移植を伴うＵＩ偽手術）を使用して、ＳＢＲＴ（６Ｇｙで３ ４日）またはｃｏｎＲＴ（２Ｇｙで３ １５日）を照射した。ＵＩ／ＳＢＲＴ／ｃｏｎＲＴマウスの対応する生存曲線を示す；Ｇｒｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、ＵＩ／ＳＢＲＴプロットは、少なくとも２回の独立した実験を表す。^＊＊ｐ＜０．０１。 図２は、図２Ａ～図２Ｆを含み、ＳＢＲＴ及びＩＬ－１２ ＭＳの組み合わせが、ＰＤＡ腫瘍量を大幅に低減し、生存率を増加させることを示す例示的な実験結果を示す。ＳＢＲＴの標的用の２つの金属基準クリップを用いて、０日目に、腫瘍細胞を移植した。６日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合は３日目）からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙで３ ４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合７日目）にｅｍｐｔｙ ＭＳ対照またはＩＬ－１２ ＭＳのｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。同所性ＰＤＡマウスモデル及び処置スケジュールを概説する概略図を示す。緑矢印は、腫瘍を指し；白矢印は、基準クリップを指す。 図２は、図２Ａ～図２Ｆを含み、ＳＢＲＴ及びＩＬ－１２ ＭＳの組み合わせが、ＰＤＡ腫瘍量を大幅に低減し、生存率を増加させることを示す例示的な実験結果を示す。ＳＢＲＴの標的用の２つの金属基準クリップを用いて、０日目に、腫瘍細胞を移植した。６日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合は３日目）からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙで３ ４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合７日目）にｅｍｐｔｙ ＭＳ対照またはＩＬ－１２ ＭＳのｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。腫瘍成長（図２Ｂ）及び生存率分析（図２Ｃ）を測定するために、ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４－５）を経時的に追跡した例示的な実験結果を示し；２～３回の独立した実験を表す。 図２は、図２Ａ～図２Ｆを含み、ＳＢＲＴ及びＩＬ－１２ ＭＳの組み合わせが、ＰＤＡ腫瘍量を大幅に低減し、生存率を増加させることを示す例示的な実験結果を示す。ＳＢＲＴの標的用の２つの金属基準クリップを用いて、０日目に、腫瘍細胞を移植した。６日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合は３日目）からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙで３ ４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合７日目）にｅｍｐｔｙ ＭＳ対照またはＩＬ－１２ ＭＳのｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。腫瘍成長（図２Ｂ）及び生存率分析（図２Ｃ）を測定するために、ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４－５）を経時的に追跡した例示的な実験結果を示し；２～３回の独立した実験を表す。 図２は、図２Ａ～図２Ｆを含み、ＳＢＲＴ及びＩＬ－１２ ＭＳの組み合わせが、ＰＤＡ腫瘍量を大幅に低減し、生存率を増加させることを示す例示的な実験結果を示す。ＳＢＲＴの標的用の２つの金属基準クリップを用いて、０日目に、腫瘍細胞を移植した。６日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合は３日目）からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙで３ ４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合７日目）にｅｍｐｔｙ ＭＳ対照またはＩＬ－１２ ＭＳのｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＰａｎ０２－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝５）でＩＶＩＳの成長（図２Ｄ）及び生存率（図２Ｅ）の測定を繰り返したことを示す例示的な実験結果を示し；２回の独立した実験を表す。 図２は、図２Ａ～図２Ｆを含み、ＳＢＲＴ及びＩＬ－１２ ＭＳの組み合わせが、ＰＤＡ腫瘍量を大幅に低減し、生存率を増加させることを示す例示的な実験結果を示す。ＳＢＲＴの標的用の２つの金属基準クリップを用いて、０日目に、腫瘍細胞を移植した。６日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合は３日目）からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙで３ ４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合７日目）にｅｍｐｔｙ ＭＳ対照またはＩＬ－１２ ＭＳのｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＰａｎ０２－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝５）でＩＶＩＳの成長（図２Ｄ）及び生存率（図２Ｅ）の測定を繰り返したことを示す例示的な実験結果を示し；２回の独立した実験を表す。 図２は、図２Ａ～図２Ｆを含み、ＳＢＲＴ及びＩＬ－１２ ＭＳの組み合わせが、ＰＤＡ腫瘍量を大幅に低減し、生存率を増加させることを示す例示的な実験結果を示す。ＳＢＲＴの標的用の２つの金属基準クリップを用いて、０日目に、腫瘍細胞を移植した。６日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合は３日目）からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙで３ ４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目（ＫＰＣ ＧＥＭＭの場合７日目）にｅｍｐｔｙ ＭＳ対照またはＩＬ－１２ ＭＳのｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＰＣ ＧＥＭＭの生存率分析を示す例示的な実験結果を示す。ＫＰＣマウス（ｎ＝４－８）を、５週齢で始まる膵臓病変について手動触診し、全ての処置を、マウスが約６～８週齢に達した場合に開始し；マウスを初期腫瘍重量に基づいて治療群に二分した（０日目＝クリップ移植）。「ＬＴＳ」は、補足でさらに説明される長期生存者を示す。４～６回のプールされた独立した実験を表す。各ＩＶＩＳイメージング分析では、値は、ＲＯＩ内の最大光子放出の幾何平均として表される；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定。生存率分析では、Ｇｒｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を実施した。全ては、ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ群に対して有意性がある。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図３は、図３Ａ～図３Ｄを含み、０日目に、同所移植された蛍光標識ＡＦ５９４ ＭＳ ＫＣＫＯ細胞を使用して、腫瘍内マイクロスフェア注射の評価を示す例示的なデータを示す（５０μＬの１：１のＰＢＳ／マトリゲル中の１ｘ１０^５細胞）。１０日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇのビーズ）または蛍光標識ＡＦ５９４ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇのＡＦ５９４－ＢＳＡを含有する２ｍｇのビーズ）を、ｉ．ｔ．またはｉ．ｐ．のいずれかで注射した（ｎ＝１、１回の実験を表す）。注射の２時間後の担腫瘍マウスのＩＶＩＳの代表的なヒートマップを示す。 図３は、図３Ａ～図３Ｄを含み、０日目に、同所移植された蛍光標識ＡＦ５９４ ＭＳ ＫＣＫＯ細胞を使用して、腫瘍内マイクロスフェア注射の評価を示す例示的なデータを示す（５０μＬの１：１のＰＢＳ／マトリゲル中の１ｘ１０^５細胞）。１０日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇのビーズ）または蛍光標識ＡＦ５９４ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇのＡＦ５９４－ＢＳＡを含有する２ｍｇのビーズ）を、ｉ．ｔ．またはｉ．ｐ．のいずれかで注射した（ｎ＝１、１回の実験を表す）。注射の２時間後に死亡させる前の担腫瘍マウスから、血症を収集したことを示す例示的な実験結果を示す。蛍光顕微鏡検査のために、腫瘍をカバーガラス上に全載させたことを示す。イメージングフローサイトメトリー分析の前に、血漿をＣＤ４５及びＣＤ１１ｂマーカーで染色した。 図３は、図３Ａ～図３Ｄを含み、０日目に、同所移植された蛍光標識ＡＦ５９４ ＭＳ ＫＣＫＯ細胞を使用して、腫瘍内マイクロスフェア注射の評価を示す例示的なデータを示す（５０μＬの１：１のＰＢＳ／マトリゲル中の１ｘ１０^５細胞）。１０日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇのビーズ）または蛍光標識ＡＦ５９４ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇのＡＦ５９４－ＢＳＡを含有する２ｍｇのビーズ）を、ｉ．ｔ．またはｉ．ｐ．のいずれかで注射した（ｎ＝１、１回の実験を表す）。代表的な画像（図３Ｃ）及び定量（図３Ｄ）は、血漿中の自由流動性ＡＦ５９４ ＭＳ及びＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞による飲み込みを示す。 図３は、図３Ａ～図３Ｄを含み、０日目に、同所移植された蛍光標識ＡＦ５９４ ＭＳ ＫＣＫＯ細胞を使用して、腫瘍内マイクロスフェア注射の評価を示す例示的なデータを示す（５０μＬの１：１のＰＢＳ／マトリゲル中の１ｘ１０^５細胞）。１０日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇのビーズ）または蛍光標識ＡＦ５９４ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇのＡＦ５９４－ＢＳＡを含有する２ｍｇのビーズ）を、ｉ．ｔ．またはｉ．ｐ．のいずれかで注射した（ｎ＝１、１回の実験を表す）。注射の２時間後に死亡させる前の担腫瘍マウスから、血症を収集したことを示す例示的な実験結果を示す。代表的な画像（図３Ｃ）及び定量（図３Ｄ）は、血漿中の自由流動性ＡＦ５９４ ＭＳ及びＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞による飲み込みを示す。 図４は、図４Ａ～図４Ｅを含み、同所性ルシフェラーゼ発現ＰＤＡモデルの代表的なＩＶＩＳ ＲＯＩ及び組織学を示す例示的なデータ；ＫＰＣ ＧＥＭＭの初期腫瘍体積ならびに長期生存者の画像を示す。図４Ａ～図４Ｅは、腫瘍細胞が０日目にＳＢＲＴターゲティング用の２つの金属基準クリップ（５０μＬの１：１のＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の１ｘ１０^５の細胞）に移植されたことを示す例示的なデータを示す。６日目からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙ×４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇビーズ）またはＩＬ－１２ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇの組み換えＩＬ－１２を含有する２ｍｇのビーズ））のｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った（ｎ＝１）。ＩＶＩＳイメージング（図４Ａ）では、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置された担腫瘍マウスに、２．５ｍｇのＤ－ルシフェリン（１００μＬのＰＢＳ中）をｓ．ｃ．投与し、最大光子放出及び標的ＲＯＩ（赤円）の代表的なヒートマップは、各処置群に対し提示される（１３日目）。１１日目の腫瘍で、ヘマトキシリン及びエオシン染色を実施した。各処置群の２０ｘの代表的な画像（図４Ａ～図４Ｅ）が提示される。１回の実験を表す。 図４は、図４Ａ～図４Ｅを含み、同所性ルシフェラーゼ発現ＰＤＡモデルの代表的なＩＶＩＳ ＲＯＩ及び組織学を示す例示的なデータ；ＫＰＣ ＧＥＭＭの初期腫瘍体積ならびに長期生存者の画像を示す。図４Ａ～図４Ｅは、腫瘍細胞が０日目にＳＢＲＴターゲティング用の２つの金属基準クリップ（５０μＬの１：１のＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の１ｘ１０^５の細胞）に移植されたことを示す例示的なデータを示す。６日目からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙ×４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇビーズ）またはＩＬ－１２ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇの組み換えＩＬ－１２を含有する２ｍｇのビーズ））のｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った（ｎ＝１）。１１日目の腫瘍で、ヘマトキシリン及びエオシン染色を実施した。各処置群の２０ｘの代表的な画像（図４Ａ～図４Ｅ）が提示される。１回の実験を表す。 図４は、図４Ａ～図４Ｅを含み、同所性ルシフェラーゼ発現ＰＤＡモデルの代表的なＩＶＩＳ ＲＯＩ及び組織学を示す例示的なデータ；ＫＰＣ ＧＥＭＭの初期腫瘍体積ならびに長期生存者の画像を示す。図４Ａ～図４Ｅは、腫瘍細胞が０日目にＳＢＲＴターゲティング用の２つの金属基準クリップ（５０μＬの１：１のＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の１ｘ１０^５の細胞）に移植されたことを示す例示的なデータを示す。６日目からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙ×４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇビーズ）またはＩＬ－１２ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇの組み換えＩＬ－１２を含有する２ｍｇのビーズ））のｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った（ｎ＝１）。１１日目の腫瘍で、ヘマトキシリン及びエオシン染色を実施した。各処置群の２０ｘの代表的な画像（図４Ａ～図４Ｅ）が提示される。１回の実験を表す。 図４は、図４Ａ～図４Ｅを含み、同所性ルシフェラーゼ発現ＰＤＡモデルの代表的なＩＶＩＳ ＲＯＩ及び組織学を示す例示的なデータ；ＫＰＣ ＧＥＭＭの初期腫瘍体積ならびに長期生存者の画像を示す。図４Ａ～図４Ｅは、腫瘍細胞が０日目にＳＢＲＴターゲティング用の２つの金属基準クリップ（５０μＬの１：１のＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の１ｘ１０^５の細胞）に移植されたことを示す例示的なデータを示す。６日目からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙ×４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇビーズ）またはＩＬ－１２ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇの組み換えＩＬ－１２を含有する２ｍｇのビーズ））のｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った（ｎ＝１）。１１日目の腫瘍で、ヘマトキシリン及びエオシン染色を実施した。各処置群の２０ｘの代表的な画像（図４Ａ～図４Ｅ）が提示される。１回の実験を表す。 図４は、図４Ａ～図４Ｅを含み、同所性ルシフェラーゼ発現ＰＤＡモデルの代表的なＩＶＩＳ ＲＯＩ及び組織学を示す例示的なデータ；ＫＰＣ ＧＥＭＭの初期腫瘍体積ならびに長期生存者の画像を示す。図４Ａ～図４Ｅは、腫瘍細胞が０日目にＳＢＲＴターゲティング用の２つの金属基準クリップ（５０μＬの１：１のＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の１ｘ１０^５の細胞）に移植されたことを示す例示的なデータを示す。６日目からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙ×４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、１０日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇビーズ）またはＩＬ－１２ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇの組み換えＩＬ－１２を含有する２ｍｇのビーズ））のｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った（ｎ＝１）。１１日目の腫瘍で、ヘマトキシリン及びエオシン染色を実施した。各処置群の２０ｘの代表的な画像（図４Ａ～図４Ｅ）が提示される。１回の実験を表す。 （図４Ｆ～図４Ｉ）ＫＰＣマウス（ｎ＝４～８）を５週齢で始まる膵臓病変について手動触診し、マウスが生後約６～８週齢に達した時に、全ての処置を開始した。マウスを、初期腫瘍重量に基づいて処置群に二分した（０日目＝クリップ移植）。３日目からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙ×４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、７日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇのビーズ）またはＩＬ－１２ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇの組み換えＩＬ－１２を含有する２ｍｇのビーズ）のｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。ノギス測定（図４Ｆ）を使用して、処置群に二分するために腫瘍体積（基準クリップ移植中）を決定した；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定。 （図４Ｆ～図４Ｉ）ＫＰＣマウス（ｎ＝４～８）を５週齢で始まる膵臓病変について手動触診し、マウスが生後約６～８週齢に達した時に、全ての処置を開始した。マウスを、初期腫瘍重量に基づいて処置群に二分した（０日目＝クリップ移植）。３日目からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙ×４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、７日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇのビーズ）またはＩＬ－１２ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇの組み換えＩＬ－１２を含有する２ｍｇのビーズ）のｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。１０～１１日目の腫瘍で、ヘマトキシリン及びエオシン染色を実施し、ＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ及びＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの処置群の２０ｘの代表的な画像が表される（それぞれ図４Ｇ及び図４Ｈ）。 （図４Ｆ～図４Ｉ）ＫＰＣマウス（ｎ＝４～８）を５週齢で始まる膵臓病変について手動触診し、マウスが生後約６～８週齢に達した時に、全ての処置を開始した。マウスを、初期腫瘍重量に基づいて処置群に二分した（０日目＝クリップ移植）。３日目からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙ×４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、７日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇのビーズ）またはＩＬ－１２ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇの組み換えＩＬ－１２を含有する２ｍｇのビーズ）のｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。１０～１１日目の腫瘍で、ヘマトキシリン及びエオシン染色を実施し、ＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ及びＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの処置群の２０ｘの代表的な画像が表される（それぞれ図４Ｇ及び図４Ｈ）。 （図４Ｆ～図４Ｉ）ＫＰＣマウス（ｎ＝４～８）を５週齢で始まる膵臓病変について手動触診し、マウスが生後約６～８週齢に達した時に、全ての処置を開始した。マウスを、初期腫瘍重量に基づいて処置群に二分した（０日目＝クリップ移植）。３日目からＳＢＲＴを照射し（６Ｇｙ×４日、または基準クリップ移植を伴う偽手術）、続いて、７日目に、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２０μＬのＰＢＳ中の２ｍｇのビーズ）またはＩＬ－１２ ＭＳ（２０μＬのＰＢＳ中の０．５μｇの組み換えＩＬ－１２を含有する２ｍｇのビーズ）のｉ．ｔ．マイクロスフェア注射を行った。死亡時の脾臓及び膵腫瘍（図４Ｉ）の代表的な画像。左：脾腫及び最小の腫瘍量を示すＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置された長期生存者（ＬＴＳ）。右：剖検時の平均ＫＰＣ腫瘍；前処置量のほぼ２倍。４～６回のプールされた独立した実験を表す。 図５は、図５Ａ～図５Ｂを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの治療有効性がＩＦＮγ機能に依存し（図５Ａ）、１１／１２／１３日目にＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝３）を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインマルチプレックスアッセイ分析の前に均質化したことを示す例示的なデータを示す。データ値（ｐｇ／ｍＬ）を総タンパク質含有量に対して正規化した。これは、ｐｇ／ｍｇタンパク質で提示され；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、少なくとも２回の独立した実験を表す。 図５は、図５Ａ～図５Ｂを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの治療有効性がＩＦＮγ機能に依存し（図５Ａ）、１１／１２／１３日目にＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝３）を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインマルチプレックスアッセイ分析の前に均質化したことを示す例示的なデータを示す。データ値（ｐｇ／ｍＬ）を総タンパク質含有量に対して正規化した。これは、ｐｇ／ｍｇタンパク質で提示され；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、少なくとも２回の独立した実験を表す。１１日目にＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝５）採取し、フローサイトメトリー分析用に単一細胞懸濁液に消化した。蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照を使用して、ＣＤ４５^＋（図５Ｂ）及びＣＤ４５^＋ＣＤ４^＋（図５Ｃ）免疫細胞集団からＩＦＮγ^＋細胞を同定した。値は、同定された総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントＩＦＮγ＋として提示され（右パネル）；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、少なくとも２回の独立した実験を表す。 １１日目にＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ＬＵＣ同所性腫瘍（ｎ＝５）採取し、フローサイトメトリー分析用に単一細胞懸濁液に消化した。蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照を使用して、ＣＤ４５^＋（図５Ｂ）及びＣＤ４５^＋ＣＤ４^＋（図５Ｃ）免疫細胞集団からＩＦＮγ^＋細胞を同定した。値は、同定された総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントＩＦＮγ＋として提示され（右パネル）；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、少なくとも２回の独立した実験を表す。 腫瘍成長（図５Ｄ）及び生存率分析（図５Ｅ）を追跡するために、ＩＶＩＳの生物発光イメージングを使用して、Ｉｆｎｇ^－／－マウスに移植されたＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝５）を経時的に測定した。ＩＶＩＳイメージング分析では、値は、ＲＯＩ内の最大光子放出の幾何平均として表される；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定。生存率分析では、Ｇｒｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を実施した。１回の実験を表す。ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ群に対して有意性がある。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 腫瘍成長（図５Ｄ）及び生存率分析（図５Ｅ）を追跡するために、ＩＶＩＳの生物発光イメージングを使用して、Ｉｆｎｇ^－／－マウスに移植されたＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝５）を経時的に測定した。ＩＶＩＳイメージング分析では、値は、ＲＯＩ内の最大光子放出の幾何平均として表される；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定。生存率分析では、Ｇｒｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を実施した。１回の実験を表す。ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ群に対して有意性がある。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図６は、図６Ａ～図６Ｅを含み、ＰＤＡ骨髄集団がＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置によりリプログラムされることを示す例示的なデータを示す。１１日目及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー（ｎ＝４－５）及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析用に単一細胞懸濁液に消化した。ＩＭ及びＴＡＭ集団を同するために使用される代表的なフローサイトメトリーゲーティング方策を示す。 図６は、図６Ａ～図６Ｅを含み、ＰＤＡ骨髄集団がＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置によりリプログラムされることを示す例示的なデータを示す。１１日目及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー（ｎ＝４－５）及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析用に単一細胞懸濁液に消化した。フローサイトメトリーを使用して、ＩＭ及びＴＡＭ集団密度を評価したことを示し、これは、同定された総ＣＤ４５^＋細胞のパーセンテージとして表され、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、２回の独立した実験を表す。 図６は、図６Ａ～図６Ｅを含み、ＰＤＡ骨髄集団がＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置によりリプログラムされることを示す例示的なデータを示す。１１日目及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー（ｎ＝４－５）及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析用に単一細胞懸濁液に消化した。ＦＭＯ対照を使用して、ＭＨＣＩＩ^＋（左パネル：野生型［ＷＴ］宿主；右パネル：Ｉｆｎｇ^－／－宿主）ＩＭをゲーティングしたことを示す。ドットプロット値は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、陽性細胞のパーセンテージは、各プロットの右上隅に表され；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、少なくとも２回の独立した実験を表す。 図６は、図６Ａ～図６Ｅを含み、ＰＤＡ骨髄集団がＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置によりリプログラムされることを示す例示的なデータを示す。１１日目及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー（ｎ＝４－５）及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析用に単一細胞懸濁液に消化した。ＩＭ（Ｄ、ｎ＝３）及びＴＡＭ（Ｅ、ｎ＝２～３）集団を、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析の前にフローソートしたことを示す。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ ＤＥＧ（ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＭＳｉｇＤＢ（ＭＳｉｇＤＢ：ＧＳＥ５０９９）の単球、従来のＭ１、及び代替のＭ２マクロファージ遺伝子セットと比較した。遺伝子の一致がボルケーノプロットで表される。青、下方制御；赤、上方制御。１回の実験を表す。 図６は、図６Ａ～図６Ｅを含み、ＰＤＡ骨髄集団がＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置によりリプログラムされることを示す例示的なデータを示す。１１日目及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー（ｎ＝４－５）及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析用に単一細胞懸濁液に消化した。ＩＭ（Ｄ、ｎ＝３）及びＴＡＭ（Ｅ、ｎ＝２～３）集団を、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析の前にフローソートしたことを示す。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ ＤＥＧ（ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＭＳｉｇＤＢ（ＭＳｉｇＤＢ：ＧＳＥ５０９９）の単球、従来のＭ１、及び代替のＭ２マクロファージ遺伝子セットと比較した。遺伝子の一致がボルケーノプロットで表される。青、下方制御；赤、上方制御。１回の実験を表す。 ＩＭ／ＴＡＭ移植実験の概略図（図６Ｆ）を示す。各ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置群からＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍（ｎ＝４～５）を採取し、ＩＭ及びＴＡＭをフローソートした。各群のＩＭ／ＴＡＭを新鮮なＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞と共にプールし、ナイーブマウスに同所移植した（ｎ＝４～５）。さらなる処置を投与しなかった。 ＩＭ／ＴＡＭ移植実験の概略図（図６Ｆ）を示す。各ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置群からＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍（ｎ＝４～５）を採取し、ＩＭ及びＴＡＭをフローソートした。各群のＩＭ／ＴＡＭを新鮮なＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞と共にプールし、ナイーブマウスに同所移植した（ｎ＝４～５）。さらなる処置を投与しなかった。腫瘍の成長を追跡するために、ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、移植された腫瘍を経時的に測定したことを示す。ＲＯＩ内の最大光子放出の幾何平均を、ＫＣＫＯ－ｌｕｃのみの対照腫瘍に対して正規化し、３日目の腫瘍サイズに対する倍数変化として表した。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、ＫＣＫＯ－ｌｕｃのみの対照に対するＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳを除いた全てが、ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ群に対して有意性がある。１回の実験を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図７は、図７Ａ～図７Ｃを含み、拡張された腫瘍内骨髄抑制分析を示す例示的な実験結果を示す。１１及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー（ｎ＝４～５）及びＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝３）解析用に、単一細胞懸濁液に消化した。ＴＡＮ（上パネル）、及び総ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＴＡＮ集団密度（下パネル）を識別するために使用されるフローサイトメトリーゲーティング方策を示す。 図７は、図７Ａ～図７Ｃを含み、拡張された腫瘍内骨髄抑制分析を示す例示的な実験結果を示す。１１及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー（ｎ＝４～５）及びＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝３）解析用に、単一細胞懸濁液に消化した。ＦＭＯ対照を使用して、ＭＨＣＩＩ＋ＴＡＭをゲーティングしたことを示す。ドットプロット値は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表し、陽性細胞のパーセンテージは、各プロットの右下隅に表され；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で；少なくとも２回の独立した実験を表す。 図７は、図７Ａ～図７Ｃを含み、拡張された腫瘍内骨髄抑制分析を示す例示的な実験結果を示す。１１及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー（ｎ＝４～５）及びＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝３）解析用に、単一細胞懸濁液に消化した。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析の前に、ＩＭ及びＴＡＭ集団をフローソートしたことを示す。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析を使用して、ＤＥＧ（ＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）をクラスター化した。著しく変更されたパスウェイが文書化され、活性化ｚスコアは、ヒートマップ形式で各比較のために提示される。 図８は、図８Ａ～図８Ｄを含み、ＳＢＲＴ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ（それぞれ、図８Ａ及び図８Ｂ）ならびにＵＩ／ＩＬ－１２ ＭＳ（それぞれ、図８Ｃ及び図８Ｄ）で処置した後の炎症性単球及びＴＡＭ ＤＥＧ（ＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＭＳｉｇＤＢ（ＧＳＥ５０９９）の単球、従来のＭ１、及び代替のＭ２マクロファージ遺伝子セットと比較したことを示す例示的な実験データ示し、遺伝子の一致がボルケーノプロットで表される。左＝下方制御、右＝上方制御。１回の実験を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。 図８は、図８Ａ～図８Ｄを含み、ＳＢＲＴ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ（それぞれ、図８Ａ及び図８Ｂ）ならびにＵＩ／ＩＬ－１２ ＭＳ（それぞれ、図８Ｃ及び図８Ｄ）で処置した後の炎症性単球及びＴＡＭ ＤＥＧ（ＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＭＳｉｇＤＢ（ＧＳＥ５０９９）の単球、従来のＭ１、及び代替のＭ２マクロファージ遺伝子セットと比較したことを示す例示的な実験データ示し、遺伝子の一致がボルケーノプロットで表される。左＝下方制御、右＝上方制御。１回の実験を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。 図８は、図８Ａ～図８Ｄを含み、ＳＢＲＴ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ（それぞれ、図８Ａ及び図８Ｂ）ならびにＵＩ／ＩＬ－１２ ＭＳ（それぞれ、図８Ｃ及び図８Ｄ）で処置した後の炎症性単球及びＴＡＭ ＤＥＧ（ＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＭＳｉｇＤＢ（ＧＳＥ５０９９）の単球、従来のＭ１、及び代替のＭ２マクロファージ遺伝子セットと比較したことを示す例示的な実験データ示し、遺伝子の一致がボルケーノプロットで表される。左＝下方制御、右＝上方制御。１回の実験を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。 図８は、図８Ａ～図８Ｄを含み、ＳＢＲＴ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ（それぞれ、図８Ａ及び図８Ｂ）ならびにＵＩ／ＩＬ－１２ ＭＳ（それぞれ、図８Ｃ及び図８Ｄ）で処置した後の炎症性単球及びＴＡＭ ＤＥＧ（ＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＭＳｉｇＤＢ（ＧＳＥ５０９９）の単球、従来のＭ１、及び代替のＭ２マクロファージ遺伝子セットと比較したことを示す例示的な実験データ示し、遺伝子の一致がボルケーノプロットで表される。左＝下方制御、右＝上方制御。１回の実験を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。 図９は、図９Ａ～図９Ｄを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの治療有効性が、ＩＦＮγ駆動型抗腫瘍Ｔ細胞の比及び強力なＣＤ８Ｔ細胞の活性化に依存することを示す例示的な実験データを示す。１１及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー分析（ｎ＝４～５）用に、単一細胞懸濁液に消化した。ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞、ならびにＴｒｅｇ集団を特定するために使用される代表的なフローサイトメトリーゲーティング方策を示す。 図９は、図９Ａ～図９Ｄを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの治療有効性が、ＩＦＮγ駆動型抗腫瘍Ｔ細胞の比及び強力なＣＤ８Ｔ細胞の活性化に依存することを示す例示的な実験データを示す。１１及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー分析（ｎ＝４～５）用に、単一細胞懸濁液に消化した。フローサイトメトリーを使用して、１１日目（左パネル）及び１４日目（右パネル）に、ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞集団密度を評価したことを示し、これは、同定された総ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして表され、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、少なくとも２回の独立した実験を表す。 図９は、図９Ａ～図９Ｄを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの治療有効性が、ＩＦＮγ駆動型抗腫瘍Ｔ細胞の比及び強力なＣＤ８Ｔ細胞の活性化に依存することを示す例示的な実験データを示す。１１及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー分析（ｎ＝４～５）用に、単一細胞懸濁液に消化した。ＷＴ（左パネル）及びＩｆｎｇ^－／－（右パネル）マウスで成長した腫瘍において、１１日目に、Ｔ_ｒｅｇ細胞のパーセンテージ（上パネル）及びＣＤ８：Ｔ_ｒｅｇ比（下パネル）を解析したものであり；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検査で、少なくとも２回の独立した実験を表す。 図９は、図９Ａ～図９Ｄを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの治療有効性が、ＩＦＮγ駆動型抗腫瘍Ｔ細胞の比及び強力なＣＤ８Ｔ細胞の活性化に依存することを示す例示的な実験データを示す。１１及び１４日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を採取し、フローサイトメトリー分析（ｎ＝４～５）用に、単一細胞懸濁液に消化した。移植後の５～２０日目の間で３日毎に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４）に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）対照または抗ＣＤ８もしくは抗ＣＤ４枯渇抗体を投与したことを示す。ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、腫瘍サイズを経時的に測定した。値は、ＲＯＩ内の最大光子放出の幾何平均として表され；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ群に対して有意性があり、２回の独立した実験からプールされたデータである。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＣＤ８^＋Ｔ細胞のトランスクリプトームプロファイルを示す例示的な実験データを示す。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析前に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞をフローソートした。ＳＢＲＴ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ、ＵＩ／ＩＬ－１２ ＭＳ、及びＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ ＤＥＧ（ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＭＳｉｇＤＢ（ＭＳｉｇＤＢ：ＧＳＥ１０００００２）のナイーブ（Ｔ_{ｎａｉｖｅ}）、エフェクター（Ｔ_ｅｆｆ）、エフェクター記憶（Ｔ_ｅｍ）、及び枯渇（Ｔ_ｅｘ）Ｔ細胞遺伝子セットと比較した。遺伝子の一致がヒートマップで表される。１回の実験を表す。 図１１は、図１１Ａ～図１１Ｅを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法後のＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍免疫浸潤の包括的な分析を示す例示的な実験データを示す。１１日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４～５）を採取し、フローサイトメトリー分析用に単一細胞懸濁液に消化した。ＡＰＣ（図１１Ａ）、Ｂ細胞（図１１Ｂ）、ＮＫ細胞（図１１Ｃ）、及びＣＤ８＋ＮＫ１．１^＋細胞（図１１Ｄ）の（総ＣＤ４５^＋細胞のパーセンテージとしての）フローサイトメトリーゲーティング方策及び集団密度を示す。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で；少なくとも２回の独立した実験を表す。 図１１は、図１１Ａ～図１１Ｅを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法後のＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍免疫浸潤の包括的な分析を示す例示的な実験データを示す。１１日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４～５）を採取し、フローサイトメトリー分析用に単一細胞懸濁液に消化した。ＡＰＣ（図１１Ａ）、Ｂ細胞（図１１Ｂ）、ＮＫ細胞（図１１Ｃ）、及びＣＤ８＋ＮＫ１．１^＋細胞（図１１Ｄ）の（総ＣＤ４５^＋細胞のパーセンテージとしての）フローサイトメトリーゲーティング方策及び集団密度を示す。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で；少なくとも２回の独立した実験を表す。 図１１は、図１１Ａ～図１１Ｅを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法後のＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍免疫浸潤の包括的な分析を示す例示的な実験データを示す。１１日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４～５）を採取し、フローサイトメトリー分析用に単一細胞懸濁液に消化した。ＡＰＣ（図１１Ａ）、Ｂ細胞（図１１Ｂ）、ＮＫ細胞（図１１Ｃ）、及びＣＤ８＋ＮＫ１．１^＋細胞（図１１Ｄ）の（総ＣＤ４５^＋細胞のパーセンテージとしての）フローサイトメトリーゲーティング方策及び集団密度を示す。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で；少なくとも２回の独立した実験を表す。 図１１は、図１１Ａ～図１１Ｅを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法後のＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍免疫浸潤の包括的な分析を示す例示的な実験データを示す。１１日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４～５）を採取し、フローサイトメトリー分析用に単一細胞懸濁液に消化した。ＡＰＣ（図１１Ａ）、Ｂ細胞（図１１Ｂ）、ＮＫ細胞（図１１Ｃ）、及びＣＤ８＋ＮＫ１．１^＋細胞（図１１Ｄ）の（総ＣＤ４５^＋細胞のパーセンテージとしての）フローサイトメトリーゲーティング方策及び集団密度を示す。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で；少なくとも２回の独立した実験を表す。 図１１は、図１１Ａ～図１１Ｅを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法後のＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍免疫浸潤の包括的な分析を示す例示的な実験データを示す。１１日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４～５）を採取し、フローサイトメトリー分析用に単一細胞懸濁液に消化した。総ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＴ_ｒｅｇ集団密度についての１４日目のＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４～５）のフローサイトメトリー分析を示し；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、少なくとも２回の独立した実験を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。 図１２は、図１２Ａ～図１２Ｃを含み、拡張された腫瘍内ＣＤ８ Ｔ細胞活性化分析を示す例示的な実験データを示す。１１日目に、フローサイトメトリー分析（ｎ＝４～５）、Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインプロファイリング（ｎ＝４～５）、またはＲＮＡ－ｓｅｑ解析（ｎ＝３）用に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４～５）を採取した。ＦＭＯ対照を使用して、ＣＤ４４＋（左端パネル）、ＣＤ１０７ａ＋（左中央パネル）、ＣＴＬＡ４＋（右中央パネル）、及びＰＤ１＋（右端パネル）のＣＤ８ Ｔ細胞をゲーティングしたことを示す。ドットプロット値は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表し、陽性細胞のパーセンテージ／ＭＦＩが各プロットの右上隅に表される；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定。少なくとも２回の独立した実験を表す。 図１２は、図１２Ａ～図１２Ｃを含み、拡張された腫瘍内ＣＤ８ Ｔ細胞活性化分析を示す例示的な実験データを示す。１１日目に、フローサイトメトリー分析（ｎ＝４～５）、Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインプロファイリング（ｎ＝４～５）、またはＲＮＡ－ｓｅｑ解析（ｎ＝３）用に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４～５）を採取した。Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインマルチプレックスアッセイ分析の前に腫瘍を均質化したことを示す。データ値（ｐｇ／ｍＬ）は、全タンパク質含有量に対して正規化された。これは、ｐｇ／ｍｇタンパク質で表される；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定。少なくとも２回の独立した実験を表す。 図１２は、図１２Ａ～図１２Ｃを含み、拡張された腫瘍内ＣＤ８ Ｔ細胞活性化分析を示す例示的な実験データを示す。１１日目に、フローサイトメトリー分析（ｎ＝４～５）、Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインプロファイリング（ｎ＝４～５）、またはＲＮＡ－ｓｅｑ解析（ｎ＝３）用に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝４～５）を採取した。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析用に、腫瘍からＣＤ８^＋ Ｔ細胞をフローソートしたことを示す。３つの処置群のそれぞれをＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照と比較したＩｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析を使用して、ＤＥＧ（ＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）をクラスター化した。著しく変更されたパスウェイが文書化され、活性化ｚスコアは、ヒートマップ形式で各比較のために提示される。１回の独立した実験を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。 図１３は、図１３Ａ～図１３Ｇを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法が、アブスコパル効果を引き起こす全身性抗腫瘍免疫を生成することを示す例示的な実験データを示す。６ヶ月後に、半脾臓転移モデルを使用してＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を肝臓に送達することにより、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置（ｎ＝５）により原発性ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍が治癒したマウスをリチャレンジしたことを示す。リチャレンジされたマウスは、２次治療を受けなかった。成長（図１３Ａ）、及び生存率分析（図１３Ｂ）を測定するために、ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、肝臓腫瘍を経時的に追跡した。ＩＶＩＳイメージング解析では、処置未経験折れ線グラフは、５匹の個々のマウスの幾何平均を表すが、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ折れ線グラフは、個々のマウスを表す。２回の独立した実験を表す。 図１３は、図１３Ａ～図１３Ｇを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法が、アブスコパル効果を引き起こす全身性抗腫瘍免疫を生成することを示す例示的な実験データを示す。６ヶ月後に、半脾臓転移モデルを使用してＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を肝臓に送達することにより、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置（ｎ＝５）により原発性ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍が治癒したマウスをリチャレンジしたことを示す。リチャレンジされたマウスは、２次治療を受けなかった。成長（図１３Ａ）、及び生存率分析（図１３Ｂ）を測定するために、ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、肝臓腫瘍を経時的に追跡した。ＩＶＩＳイメージング解析では、処置未経験折れ線グラフは、５匹の個々のマウスの幾何平均を表すが、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ折れ線グラフは、個々のマウスを表す。２回の独立した実験を表す。 図１３は、図１３Ａ～図１３Ｇを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法が、アブスコパル効果を引き起こす全身性抗腫瘍免疫を生成することを示す例示的な実験データを示す。同齢の腫瘍または処置経験なしのドナー（ｎ＝５）に加えて、半脾臓のリチャレンジを生き延びたマウスを、３．５ヶ月後に死亡させ、負の選択を使用して、脾臓及びリンパ節由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離したことを示す。ＫＣＫＯ－ｌｕｃ移植の１６時間前に、ナイーブレシピエントに、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞を１：１で移植した。担腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞レシピエントマウスは、任意のさらなる処置を受けず、成長を測定するために、ＩＶＩＳ生物発光イメージング（図１３Ｃ）を使用することにより、腫瘍を経時的に追跡した。原発性膵腫瘍のみの処置については、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置パラダイム（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）に従った（図１３Ｅ）。 図１３は、図１３Ａ～図１３Ｇを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法が、アブスコパル効果を引き起こす全身性抗腫瘍免疫を生成することを示す例示的な実験データを示す。同齢の腫瘍または処置経験なしのドナー（ｎ＝５）に加えて、半脾臓のリチャレンジを生き延びたマウスを、３．５ヶ月後に死亡させ、負の選択を使用して、脾臓及びリンパ節由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離したことを示す。ＫＣＫＯ－ｌｕｃ移植の１６時間前に、ナイーブレシピエントに、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞を１：１で移植した。部分的（生物発光腫瘍体積の減少が１０倍以上）及び完全（手動触診による識別不可能な腫瘍）免疫の移行は、総ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで治癒させたドナーのパーセンテージとして円グラフ（図１３Ｄ）で表される。ＩＶＩＳイメージング解析では、処置経験なしの折れ線グラフは、５匹の個々のマウスの幾何平均を表し、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ折れ線グラフは、個々のマウスを表す。１回の実験を表す。原発性膵腫瘍のみの処置については、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置パラダイム（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）に従った（図１３Ｅ）。 図１３は、図１３Ａ～図１３Ｇを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法が、アブスコパル効果を引き起こす全身性抗腫瘍免疫を生成することを示す例示的な実験データを示す。０日目に、半脾臓モデルを使用して、肝臓にＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を移植するが（ｎ＝５）、ＫＣＫＯ細胞を膵臓に同時に注射した。原発性膵腫瘍のみの処置については、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置パラダイム（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）に従った（図１３Ｅ）。 図１３は、図１３Ａ～図１３Ｇを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法が、アブスコパル効果を引き起こす全身性抗腫瘍免疫を生成することを示す例示的な実験データを示す。０日目に、半脾臓モデルを使用して、肝臓にＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を移植するが（ｎ＝５）、ＫＣＫＯ細胞を膵臓に同時に注射した。転移性成長（図１３Ｆ）及び生存率分析（図１３Ｇ）を測定するために、ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ肝転移を経時的に追跡した。ＩＶＩＳイメージング分析では、値は、ＲＯＩ内の最大光子放出の幾何平均として表され；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、２つの独立した実験を表す。各生存率分析では、Ｇｒｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を実行した。全ては、ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ群に対して有意性がある。^＊＊ｐ＜０．０１。 図１３は、図１３Ａ～図１３Ｇを含み、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法が、アブスコパル効果を引き起こす全身性抗腫瘍免疫を生成することを示す例示的な実験データを示す。０日目に、半脾臓モデルを使用して、肝臓にＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を移植するが（ｎ＝５）、ＫＣＫＯ細胞を膵臓に同時に注射した。転移性成長（図１３Ｆ）及び生存率分析（図１３Ｇ）を測定するために、ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ肝転移を経時的に追跡した。ＩＶＩＳイメージング分析では、値は、ＲＯＩ内の最大光子放出の幾何平均として表され；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、２つの独立した実験を表す。各生存率分析では、Ｇｒｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を実行した。全ては、ＵＩ／ｅｍｐｔｙ ＭＳ群に対して有意性がある。^＊＊ｐ＜０．０１。 図１４は、図１４Ａ～図１４Ｆを含み、アブスコパル効果の拡張分析を示す例示的な実験データを示す。（Ａ及びＢ）０日目に、半脾臓モデルを使用して、肝臓にＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を移植したが（ｎ＝３）、膵臓にＫＣＫＯ細胞を同時に注射した。膵腫瘍のみの処置については、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置パラダイムに従った。ＩＶＩＳイメージングで、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ肝腫瘍の生物発光を経時的に追跡した。最大光子放出の代表的なヒートマップを示し、ＲＯＩは、各処置群（１４日目）に対し示される。 図１４は、図１４Ａ～図１４Ｆを含み、アブスコパル効果の拡張分析を示す例示的な実験データを示す。（Ａ及びＢ）０日目に、半脾臓モデルを使用して、肝臓にＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を移植したが（ｎ＝３）、膵臓にＫＣＫＯ細胞を同時に注射した。膵腫瘍のみの処置については、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置パラダイムに従った。ＩＶＩＳイメージングで、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ肝腫瘍の生物発光を経時的に追跡した。６～８週齢のマウスでＩＶＩＳ生物発光により測定されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍の成長を示す。２回の独立した実験を表す。 図１４は、図１４Ａ～図１４Ｆを含み、アブスコパル効果の拡張分析を示す例示的な実験データを示す。ＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を、０日目（ｎ＝５）に各マウスの膵臓及び脚の両方に移植したことを示す（注射１回当たり５ｘ１０^４細胞）。膵腫瘍のみの処置については、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置パラダイムに従った。ＩＶＩＳイメージングでは、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置された担腫瘍マウス（１００μＬのＰＢＳ中）に、２．５ｍｇのＤ－ルシフェリンをｓ．ｃ．投与し、最大光子放出の代表的なヒートマップ（図１４Ｃ）は、重複しない原発性及び続発性腫瘍ＲＯＩを示す各処置群（１３日目）について提示される。 図１４は、図１４Ａ～図１４Ｆを含み、アブスコパル効果の拡張分析を示す例示的な実験データを示す。ＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を、０日目（ｎ＝５）に各マウスの膵臓及び脚の両方に移植したことを示す（注射１回当たり５ｘ１０^４細胞）。膵腫瘍のみの処置については、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置パラダイムに従った。ＩＶＩＳイメージングを使用して、原発性（膵臓、図１４Ｄ）及び続発性（脚、図１４Ｅ、左パネル）の腫瘍成長を経時的に測定した。 図１４は、図１４Ａ～図１４Ｆを含み、アブスコパル効果の拡張分析を示す例示的な実験データを示す。ＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を、０日目（ｎ＝５）に各マウスの膵臓及び脚の両方に移植したことを示す（注射１回当たり５ｘ１０^４細胞）。膵腫瘍のみの処置については、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置パラダイムに従った。ＩＶＩＳイメージングを使用して、原発性（膵臓、図１４Ｄ）及び続発性（脚、図１４Ｅ、左パネル）の腫瘍成長を経時的に測定した。ノギス測定はまた、経時的な平均脚腫瘍直径を決定するために（図１４Ｅ、中央パネル）、及び経時的に群毎の腫瘍のないマウスのパーセンテージを特定するために（図１４Ｅ、右パネル）使用された。脚のノギス測定値は、時点毎、腫瘍毎の２つの測定値の平均を表し；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、１回の実験を表す。 図１４は、図１４Ａ～図１４Ｆを含み、アブスコパル効果の拡張分析を示す例示的な実験データを示す。ＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を、０日目（ｎ＝５）に各マウスの膵臓及び脚の両方に移植したことを示す（注射１回当たり５ｘ１０^４細胞）。膵腫瘍のみの処置については、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置パラダイムに従った。１１日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍（ｎ＝５）を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカイン多重アッセイ分析前に均質化した。データ値（ｐｇ／ｍＬ）は、全タンパク質含有量に対して正規化された。これは、ｐｇ／ｍｇタンパク質で表される；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定。各ＩＶＩＳイメージング分析では、値は、ＲＯＩ内の最大光子放出の幾何平均として表され；Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定で、２回の独立した実験を表す。全ては、ＵＩ／Ｅｍｐｔｙ ＭＳ群に対して有意性がある。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図１５は、図１５Ａ～図１５Ｄを含み、ＰＤＡにおけるＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ治療機序の概略図を示す。ＰＤＡ腫瘍形成が、免疫抑制性Ｔ_ｒｅｇ細胞の顕著な浸潤、ＴＡＭ集団に播種するＩＭ、及び病変周辺部のＣＤ８Ｔ細胞の不足により強調されることを示す。 図１５は、図１５Ａ～図１５Ｄを含み、ＰＤＡにおけるＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ治療機序の概略図を示す。ＳＢＲＴが、ＤＬＮにおけるＴ_ｅｆｆの形成に必要な腫瘍抗原を産生する壊死性細胞死を開始することを示す。腫瘍内のＣＤ８ Ｔｅｆｆ細胞の増加が、Ｔ_ｒｅｇ及びＩＭ／ＴＡＭ抑制因子の補助的動員に起因する適度な抗腫瘍効果を有する。 図１５は、図１５Ａ～図１５Ｄを含み、ＰＤＡにおけるＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ治療機序の概略図を示す。ＩＬ－１２ ＭＳ処置が腫瘍内Ｔエフェクターを刺激して、Ｔ_ｒｅｇｓのＴ_ｈ１再分極化、ＩＭの活性化（ＩＦＮγプールへの追加）、及びＴＡＭのＭ１リプログラミングを開始させるＩＦＮγを産生することを示す。Ｔ_ｅｆｆ細胞数及び機能の作動は、顕著な腫瘍細胞アポトーシスを誘発する。 図１５は、図１５Ａ～図１５Ｄを含み、ＰＤＡにおけるＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ治療機序の概略図を示す。ＰＤＡ腫瘍の消散が、持続性のある腫瘍特異的な免疫記憶をもたらすＴ_ｒｅｇリバウンド及びＴ_ｍｅｍ形成で強調される。

本明細書に記載の方法は、切除不能な膵癌を処置するために免疫調節薬を電離放射線と組み合わせる場合に、抗腫瘍有効性及び正常な組織の防御という利点を提供する。本明細書に記載の方法は、免疫調節療法と組み合わせた電離放射線が、放射線療法または免疫調節療法単独での処置と比較して、抗腫瘍応答を増加させるという予想外の結果を提供する。抗腫瘍応答の増加は、単独療法単独のいずれかにより提供される腫瘍成長の阻害を増強または増加させ得る。本明細書に記載の方法は、（１）腫瘍に高度にコンフォーマルな線量を照射するために、電離放射線療法、及び（２）免疫調節薬、を投与することにより、局所進行及び転移性膵癌を処置するために使用することができる。放射線及び免疫調節薬を組み合わせると、抗がん反応が、免疫調節薬単独または放射線単独療法のいずれかの投与と比較して増強がされる。

定義
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。

一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、ならびに核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該技術分野で周知であり、当該技術分野で一般に用いられるものである。

核酸及びペプチド合成には、標準的な手法が使用される。手法及び手順は一般に、当該技術分野における従来の方法及び種々の一般的参考文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に従い実施され、これらは、本明細書の全体にわたって提示される。

本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載の分析化学及び有機合成で使用される実験手順は、当該技術分野で周知であり、一般に用いられるものである。標準的な手法またはその修正は、化学合成及び化学分析に使用される。

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。

量、持続時間などの測定可能な値を指す時に本明細書で使用される「約」は、明記された値の±２０％、または±１０％、または±５％、または±１％、または±０．１％の変動を包含することを意味し、それ故、変動は、開示の方法を実施するために適切である。

本明細書で使用される「生体適合性」及び「生物学的に適合性」は、任意の代謝物またはそれらの分解生成物と一緒に、レシピエントに対し一般に非毒性であり且つ投与材料の分解の結果として生じる濃度で、レシピエントに対し重大なあらゆる悪影響を引き起こさない材料を指す。一般に言えば、生体適合性材料は、患者に投与された時に、重大な炎症または免疫応答を誘発しない材料である。

本明細書で定義される生分解性とは、組成物がｉｎ ｖｉｖｏで分解または侵食されて、より小さな化学種を形成することを意味する。分解は、例えば、酵素的、化学的、及び物理的プロセスにより生じ得る。

本明細書で使用される「がん」という用語は、異常な細胞の異常な成長を特徴とする疾患として定義される。がん細胞は、局所的に、または血流及びリンパ系を介して、身体の他の部分に広がり得る。種々のがんの例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌（例えば、メラノーマ）、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、肉腫などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「コンジュゲートされた」は、１つの分子の第２の分子への共有結合を指す。

本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または他の分子の化学修飾を含む。本発明の文脈において、「誘導体ポリペプチド」、例えば、グリコシル化、ペグ化、または任意の同様のプロセスにより修飾されたものは、結合活性を保持する。例えば、結合ドメインの「誘導体」という用語は、例えば、１つ以上のポリエチレングリコール分子、糖、リン酸、及び／または他のそのような分子の付加により、化学修飾された結合ドメイン融合タンパク質、多様体、またはフラグメントを含み、分子（複数可）は、野生型結合ドメイン融合タンパク質に自然に結合していない。ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、参照ポリペプチドと比較して、アミノ酸置換、欠失、または挿入を有することにより、参照ポリペプチドから「誘導」されるポリペプチドをさらに含む。従って、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドまたは任意の他のポリペプチドに「由来」してもよい。本明細書で使用される場合、ポリペプチドを含む化合物はまた、特定の供給源、例えば、特定の生物、組織タイプ、もしくは特定のポリペプチド、核酸、または特定の生物もしくは特定の組織タイプに存在する他の化合物に「由来」してもよい。

本明細書で使用される「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸として定義される。

「コード化」は、規定されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）または規定されたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的プロセスならびにそこから生じる生物学的特性において他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。コード鎖（これのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表で提供される）と非コード鎖（遺伝子またはｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして使用される）の両方は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするものと呼ぶことができる。

別途明記のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり且つ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という表現はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンではイントロン（複数可）を含有し得る程度にイントロンを含んでもよい。

「疾患」は、動物が恒常性を維持することができない前記動物の健康状態であり、疾患が改善されない場合、動物の健康は悪化し続ける。

対照的に、動物の「障害」は、動物が恒常性を維持し得る健康状態であるが、動物の健康状態は、障害がない場合よりも好ましくない。未処置のままであっても、障害が必ずしも、動物の健康状態のさらなる低下を引き起こさない。

疾患または障害は、疾患もしくは障害の徴候もしくは症状の重症度、そのような徴候もしくは症状が患者により経験される頻度、またはその両方が低減する場合、「緩和」される。

本明細書で使用される「阻害する」という用語は、活性または機能を、例えば、対照値と比較して約１０パーセント抑制または遮断することを意味する。一実施形態では、活性は、対照値と比較して少なくとも５０％、対照値と比較して少なくとも７５％、または対照値と比較して少なくとも９５％抑制または遮断される。本明細書で使用される「阻害する」はまた、分子、反応、相互作用、遺伝子、ｍＲＮＡ、及び／またはタンパク質の発現、安定性、機能、または活性のレベルを測定可能な量低減させること、または完全に防止することを意味する。阻害薬は、例えば、結合して、タンパク質、遺伝子、及びｍＲＮＡの安定性、発現、機能、及び活性を部分的もしくは完全に遮断するか、減少させるか、防止するか、活性化を遅延させるか、不活化するか、脱感作するか、または下方制御する化合物、例えば、拮抗薬、である。

本明細書で使用される場合、「マトリックス」という用語は、ポリマー化合物の３次元ネットワークを指す。ポリマー化合物は、３次元ネットワーク内に他の化合物を含めることができるように配置される。

様々な形態で、本明細書で使用される目的の分子の「調節薬」及び「調節」という用語は、免疫応答と関連する活性の拮抗作用、作動作用、部分的拮抗作用、及び／または部分的作動作用を包含することが意図される。種々の実施形態では、「調節薬」は、免疫応答または免疫応答と関連する活性を阻害または刺激し得る。そのような調節薬としては、プロテアーゼ分子の小分子作動薬及び拮抗薬、アンチセンス分子、リボザイム、三重らせん分子、及びＲＮＡｉポリヌクレオチド、ならびに他のものが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「取扱説明資料」は、本明細書で引用されている種々の疾患または障害の緩和をもたらすためのキット内に、本発明の化合物、組成物、ベクター、または送達システムの有用性を知らせるために使用することができる刊行物、記録、図、または他の任意の発現媒体を含む。任意に、または代替的に、取扱説明資料は、哺乳動物の細胞または組織における疾患または障害を軽減する１つ以上の方法について記載することができる。本発明のキットの取扱説明資料は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクター、または送達システムを含有する容器に貼り付けられるか、または同定された化合物、組成物、ベクター、または送達システムを含有する容器と一緒に発送することができる。あるいは、取扱説明資料は、取扱説明資料及び化合物がレシピエントにより共に使用されることを意図して、容器とは別々に発送することができる。

「単離された」とは、自然の状態から変化または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物の通常の状況で自然に存在する核酸またはペプチドは、「単離」されないが、自然の状況の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離」される。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または、例えば、宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。

「単離された核酸」は、天然に存在する状態で隣接する配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメント、すなわち、通常、フラグメントに隣接する配列から除去されているＤＮＡフラグメント、すなわち、それが自然に生じるゲノム内のフラグメントに隣接する配列、を指す。用語はまた、核酸に自然に付随する他の構成要素、すなわち、細胞内で自然に付随するＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質、から実質的に精製されている核酸に適用される。それ故、用語は、例えば、ベクターに、自己複製プラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるか、あるいは、他の配列とは独立して、別々の分子（すなわち、ＰＣＲまたは制限酵素消化により生成されたｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメント）として存在する、組み換えＤＮＡを含む。追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡも含まれる。

本発明の文脈では、一般に存在する核酸塩基についての以下の略語が使用される。「Ａ」は、アデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、「Ｕ」は、ウリジンを指す。

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。従って、本明細書で使用される核酸及びポリヌクレオチドは、交換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドである一般的な知識を有し、これは、単量体の「ヌクレオチド」に加水分解することができる。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドとしては、通常のクローニング技術及びＰＣＲなどを使用して、ならびに合成手段により、限定されないが、組み換え手段、すなわち、組み換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列のクローニング、を含む、当該技術分野で利用可能な任意の手段に得られる全ての核酸配列に挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「マイクロ粒子」という用語は、一般に、約１ミクロン～約１００ミクロン、例えば、約１～約５０ミクロン、約１～約３０ミクロン、及び約１ミクロン～約１０ミクロンの直径を有する粒子を指す。マイクロ粒子は、任意の形状をとることができる。球形のマイクロ粒子は、「マイクロスフェア」と呼ばれてもよい。

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は一般に、約１ナノメートル～１０００ナノメートル、例えば、約１０ナノメートル～１０００ナノメートル、約１００ナノメートル～１０００ナノメートル、及び約２５０ナノメートル～１０００ナノメートルの直径を有する粒子を指す。ナノ粒子は、任意の形状をとり得る。球形のナノ粒子は、「ナノスフェア」と呼ばれてもよい。

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合で共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合により互いに結合している２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、用語は、多くの種類がある、短鎖（例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも一般に当該技術分野で呼ばれる）ならびに長鎖（タンパク質と一般的に当該技術分野で呼ばれる）の両方を指す。「ポリペプチド」は、例えば、とりわけ、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの多様体、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。

「保存的置換」という用語は、ポリペプチドについて記載する場合、ポリペプチドの活性を実質的に変化させないポリペプチドのアミノ酸組成の変化、すなわち、類似の特性を有する他のアミノ酸によるアミノ酸の置換、を指す。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。次の６群はそれぞれ、相互の保存的置換を表すと一般に理解されるアミノ酸を含有する：（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（以下も参照のこと、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８４，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）。上記で定義された保存的置換に加えて、アミノ酸残基の他の修飾が、「保存的に修飾された多様体」ももたらし得る。例えば、それらが正であっても負であっても、全ての荷電アミノ酸を互いの置換とみなしてもよい。さらに、保存的に改変された多様体はまた、コードされた配列において、単一のアミノ酸、または割合が少ない、例えば、多くの場合、５％未満のアミノ酸を変更、追加、または欠失する個々の置換、欠失、または付加から生じ得る。さらに、保存的に改変された多様体は、同じアミノ酸の異なるコドンで、天然または野生型遺伝子により用いられるアミノ酸のコドンを置換することにより、組み換えポリペプチドから作製することができる。

本明細書で使用される「ＲＮＡ」という用語は、リボ核酸として定義される。

本明細書で使用される「組み換えＤＮＡ」という用語は、異なる供給源からのＤＮＡの断片を結合させることにより生成されるＤＮＡとして定義される。

「薬学的に許容される」とは、例えば、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントへの投与のための一般に安全である担体、希釈剤、または賦形剤を意味する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、コンジュゲートと組み合わされた場合に、コンジュゲートの活性を保持し且つ対象の免疫系と非応答である任意の材料を含む。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルションなどのエマルション、及び種々のタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。他の担体はまた、滅菌溶液、コーティングされた錠剤及びカプセル剤を含む錠剤を含んでもよい。通常は、そのような担体は、賦形剤、例えば、デンプン、牛乳、砂糖、特定タイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、タルク、植物油脂もしくは油、ガム、グリコール、または他の既知の賦形剤を含有する。そのような担体は、風味及び着色添加物または他の成分も含んでもよい。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法により製剤化される。

「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、状態もしくはその後遺症の治療を必要とするか、または状態もしくはその後遺症にかかりやすいヒトを含む任意の動物を指す。従って、個体は、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、サル、及びマウス、ならびにヒトを含んでもよい。

「治療的」処置は、病状の徴候を示す対象に、それらの徴候を軽減または排除する目的で投与される処置である。

「治療的有効量」は、患者に投与された場合に、疾患の症状を改善する本発明の化合物の量である。「治療的有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、病状、及びその重症度、処置されるべき患者の年齢に応じて変動するであろう。治療的有効量は、当業者自身の知識及びこの開示を考慮して、当業者により日常的に決定することができる。

「処置する」、「処置すること」、及び「処置」という用語は、本明細書に記載の治療的または予防的手段を指す。「処置」の方法は、障害もしくは再発性障害の１つ以上の症状を予防、治癒、遅延、重症度を低減、または改善するために、またはそのような処置がない状態で予想されるよりも対象の生存率を延長させるために、そのような処置を必要とする対象、例えば、膵癌を含む疾患もしくは障害に苦しむ対象、またはそのような膵癌を含む疾患もしくは障害に最終的に罹患し得る対象、への本発明の組成物の投与を用いる。

「多様体」は、この用語が本明細書で使用される場合、それぞれ参照核酸配列またはペプチド配列から配列が異なるが、参照分子の本質的な生物学的特性を保持する核酸配列またはペプチド配列である。核酸多様体の配列の変化は、参照核酸によりコードされるペプチドのアミノ酸配列を変更しないことがあるか、またはアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、及び切断をもたらし得る。ペプチド多様体の配列の変化は通常、限定的または保存的であり、従って、参照ペプチド及び多様体の配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域では、同一である。多様体及び参照ペプチドは、任意の組み合わせでの１つ以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が異なり得る。核酸またはペプチドの多様体は、対立遺伝子多様体などの天然に存在するものであり得るか、または天然に存在することが知られていない多様体であり得る。核酸及びペプチドの天然に存在しない多様体は、変異導入手法または直接合成により作製されてもよい。

範囲：本開示を通して、本発明の種々の態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜及び簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に柔軟性のない限定として解釈すべきではないことを理解すべきである。従って、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６が具体的に開示されていると考えられなければならない。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

説明
本開示は、１つ以上の免疫調節薬と組み合わせて電離放射線を投与することにより、対象の転移性または切除不能な膵癌を処置するための方法について記載する。本明細書に記載の方法は、腫瘍への電離放射線療法及び免疫調節薬を投与することにより、局所進行及び転移性膵癌を処置するために使用することができる。一実施形態では、免疫調節薬は、腫瘍内に投与される。

一態様では、腫瘍に電離放射線及び免疫調節薬を投与することを含む、がんを有する対象の腫瘍を処置するための方法が提供される。免疫調節薬は、阻害性チェックポイント分子に対する阻害薬、刺激性チェックポイント分子の活性化薬、ケモカイン阻害薬、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の阻害薬、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｔ細胞及び腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体などの免疫系細胞に結合する抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞などの細胞性免疫調節薬、ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択することができる。一部の実施形態では、免疫調節薬は、免疫調節性サイトカインである。一実施形態では、免疫調節性サイトカインは、ＩＬ－１２である。

特定の例では、電離放射線は、小分割放射線処置として投与される。電離放射線及び免疫調節薬を同時に投与することができる。あるいは、電離放射線及び免疫調節薬を連続して投与することができる。

別の態様では、がんを有する対象の腫瘍を処置する方法が本明細書で提供され、方法は、電離放射線及び免疫調節薬を含む処置を対象の腫瘍に投与することを含む。一部の場合では、方法はさらに、腫瘍を放射線増感剤と接触させることを含む。電離放射線は、小分割放射線処置として投与することができる。

本明細書に記載の方法は、電離放射線及び免疫調節薬を投与する前に、腫瘍の機能的イメージングを実施することも含み得る。一部の実施形態では、機能的イメージングなどの腫瘍のイメージングは、本明細書に記載の併用療法を受けるべきがん患者を同定または選択するために使用される。機能的イメージングの非限定例としては、単一光子放出コンピューター断層撮影法、光学イメージング、超音波検査法、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、灌流コンピューター断層撮影法、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、機能的磁気共鳴イメージング、磁気共鳴分光イメージング、ダイナミックコントラスト強調イメージング、拡散強調イメージング、血液酸素化レベル依存イメージング、核磁気共鳴分光法、磁気共鳴リンパ管撮影法、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。集学的イメージングなどの機能的イメージングの任意のタイプは、腫瘍を特性決定するために、腫瘍の描写、腫瘍の程度、腫瘍体積を決定するために、及び／または腫瘍微小環境（例えば、腫瘍を取り囲む環境）を評価するために、実施することができる。機能的イメージングは、最良の処置オプションの選択及び／または処置への応答の監視に役立ち得る。

一部の実施形態では、処置は、対象の腫瘍に電離放射線を投与することを含む。一部の実施形態では、特に、腫瘍が分散性または可動性である場合、電離放射線は、対象全体に投与することができる。一部の実施形態では、電離放射線は、例えば、小分割腫瘍標的放射線療法または体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）により、腫瘍に局所的に投与することができる。一部の実施形態では、処置はさらに、腫瘍を放射線増感剤と接触させることを含む。一部の実施形態では、処置はさらに、対象に対する免疫応答を調節する化合物または生物学的薬物を投与することを含む。従って、一部の実施形態では、処置は、免疫調節薬と組み合わせて、標準的な放射線処置プロトコールを投与することを含む。

一部の実施形態では、腫瘍に投与される電離放射線の有効量は、切除不能な膵癌を有する対象の標準治療に基づいており、対象は、さらに免疫調節薬が投与される。処置の既存のコースを含む一部の実施形態では、有効量の電離放射線は、現在有効な用量で維持され、免疫調節薬は、電離放射線と組み合わせて対象に投与される。

放射線療法
当該技術分野で周知のように、電離放射線の有効な線量は、処置されることを必要とする腫瘍のタイプ及びがんの病期と共に変動する。有効な線量はまた、患者に投与されている他の処置モダリティ、例えば、化学療法処置、及び外科的処置、ならびに放射線が手術前または手術後に投与されるかどうかに基づいて変動し得る。

治療用量は、分割して送達することができる。分割は、経時的な、例えば、数日、数週間、または数ヶ月にわたる放射線の総線量を広げることを指す。各分割で照射された線量は、１日約１．５～２Ｇｙとすることができる。処置計画は、各患者の処置の必要性に応じて、１日１回以上、隔日、週１回などの分割処置を含み得る。例えば、小分割スケジュールは、総用量をいくつかの比較的大きな用量に分割すること、及び用量を少なくとも１日間隔で投与することを含む。例示的な小分割線量は、分割毎に３Ｇｙ～２０Ｇｙである。切除不能な膵癌を処置するために使用することができる例示的な分割スケジュールは、３～８分割で投与される分割毎に３Ｇｙ～８Ｇｙである。例えば、一実施形態では、３Ｇｙの放射線は、３分割、４分割、５分割、６分割、７分割、８分割、または８分割以上で、分割毎に投与される。一実施形態では、４Ｇｙの放射線は、３分割、４分割、５分割、６分割、７分割、８分割、または８分割以上で、分割毎に投与される。一実施形態では、５Ｇｙの放射線は、３分割、４分割、５分割、６分割、７分割、８分割、または８分割以上で、分割毎に投与される。一実施形態では、６Ｇｙの放射線は、３分割、４分割、５分割、６分割、７分割、８分割、または８分割以上で、分割毎に投与される。一実施形態では、７Ｇｙの放射線は、３分割、４分割、５分割、６分割、７分割、８分割、または８分割以上で、分割毎に投与される。一実施形態では、８Ｇｙの放射線は、３分割、４分割、５分割、６分割、７分割、８分割、または８分割以上で、分割毎に投与される。

一部の実施形態では、電離放射線は、対象の腫瘍を放射線増感剤と接触させることを含む。例示的な放射線増感剤としては、低酸素腫瘍組織への酸素の拡散を増加させるのを助ける化合物である、ミソニダゾール、メトロニダゾール、及びｔｒａｎｓ－クロセチン酸ナトリウムなどの低酸素放射線増感剤が挙げられる。放射線増感剤はまた、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、相同組み換え（ＨＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含む組み換え修復、ならびに直接修復機序を妨害するＤＮＡ損傷応答阻害薬であり得る。ＳＳＢ修復機序は、ＢＥＲ、ＮＥＲ、またはＭＭＲパスウェイを含む一方、ＤＳＢ修復機序は、ＨＲ及びＮＨＥＪパスウェイからなる。放射線は、修復しない場合に致命的であるＤＮＡの破壊を引き起こす。一本鎖切断は、テンプレートとしてインタクトＤＮＡ鎖を使用して、ＢＥＲ、ＮＥＲ、及びＭＭＲ機序の組み合わせにより修復される。ＳＳＢ修復の主なパスウェイは、ポリ－（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）と呼ばれる関連酵素のファミリーを利用するＢＥＲである。従って、放射線増感剤は、ポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害薬などのＤＮＡ損傷応答阻害薬を含み得る。

本発明の併用処置は、処置計画に組み込むことができる。処置計画は、近くに健康な組織またはリスクのある器官へのダメージを予防するために、照射される必要のある腫瘍体積、腫瘍に照射される放射線の最適または有効な線量、及び最大線量を視覚化または測定することを含み得る。アルゴリズムは、処置計画で使用することができ、用いられる特定の放射線治療手法パラメーター、例えば、ガントリ角度、ＭＬＣリーフ位置など、に基づいて線量計算アルゴリズム、及び処置の効果を最適化する線量計算間でシステムパラメーターを調整する種々の手法を使用することができる検索アルゴリズムを含む。例示的な線量計算アルゴリズムとしては、種々のモンテカルロ（「ＭＣ」）手法及びペンシルビームコンボリューション（「ＰＢＣ」）が挙げられる。例示的な検索アルゴリズムは、種々のシミュレートされたアニーリング（「ＳＡ」）手法、代数的逆処理計画（「ＡＩＴＰ」）、及び同時反復逆処理計画（「ＳＩＩＴＰ」）を含む。そのような手法、及び他のものは、当該技術分野で周知であり、本開示の範囲内に含まれる。

処置計画アルゴリズムは、追加機能及び能力を提供する統合処置計画ソフトウェアパッケージの一部として実施されてもよい。例えば、線量計算アルゴリズム及び検索アルゴリズムは、各ガントリ角度で一連のフルエンスマップを最適化するために使用されてもよく、別々のリーフシーケンサーは、それらを照射する必要があるリーフムーブメントを計算するために使用される。あるいは、線量計算アルゴリズム及び検索アルゴリズムは、リーフムーブメント及び他の機械パラメーターを直接最適化するために使用されてもよい。

本発明の方法で用いることができる放射線療法手法は、マルチリーフコリメータ（「ＭＬＣ」）を備えた直線加速器などの放射線治療システムにより投与することができる外照射（「ＥＢＲＴ」）及び強度変調放射線治療（「ＩＭＲＴ」）を含むが、これらに限定されない。マルチリーフコリメータ及びＩＭＲＴの使用は、放射線ビームの形状及び線量を変化させ、それにより、近くの健康な組織への過剰な照射を回避しながら、複数の角度から患者を処置することが可能である。他の例示的な放射線療法手法は、体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）、強度変調回転照射法、３次元原体照射法（「３Ｄ原体」または「３ＤＣＲＴ」）、画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）を含む。放射線療法手法は、患者の生体構造の変化ならびに器官及び腫瘍の形状に応じて線量分布を最適化するために、放射線療法のコースの間に処置を修正し得るＩＧＲＴの形態である適応放射線療法（ＡＲＴ）も含み得る。別の放射線療法手法は、近接照射療法である。近接照射療法では、放射線源が腫瘍の近くにあるように、放射線源が対象の身体内に埋め込まれる。本明細書で使用される場合、放射線療法という用語は、広く解釈されるべきであり、光子の使用（例えば、高エネルギーＸ線及びガンマ線）、粒子（例えば、電子及び陽子ビーム）、ならびに放射線外科手法を含む、患者を照射するために使用される種々の手法を含むことが意図される。さらに、標的体積に原体照射を提供する任意の方法は、本開示の範囲内にあることが意図される。

免疫調節薬
放射線療法は、１つ以上の免疫調節薬と組み合わせて投与することができる。併用療法は、単独療法としてのいずれかの処置の投与と比較して、増加した抗腫瘍応答（陽性の臨床応答）を提供し得る。一部の場合では、免疫調節薬は、阻害性チェックポイント分子に対する阻害薬、刺激性チェックポイント分子の活性化薬、ケモカイン阻害薬、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の阻害薬、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｔ細胞及び腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体などの免疫系細胞に結合する抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞などの細胞性免疫調節薬、ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択することができる。

免疫調節薬は、抗原提示細胞及びＴ細胞などの免疫系細胞の表面に発現する分子に結合する小分子及び生物学的療法（例えば、抗体、そのフラグメント、及びその誘導体）を含み得る。免疫調節薬は、免疫系を抑制または刺激する小分子も含み得る。一部の場合では、免疫調節薬は、ＩＦＮγの産生を刺激する。一実施形態では、免疫調節薬は、免疫調節性サイトカインである。免疫調節性サイトカインには、ＩＬ－１２及びＩＬ－２が含まれるが、これらに限定されない。

ペプチド
一実施形態では、本発明の免疫調節薬は、タンパク質、ペプチド、免疫調節タンパク質の多様体、ペプチド模倣物、またはタンパク質もしくはペプチドの機能的フラグメントであってよい。例えば、一実施形態では、免疫調節薬は、ＩＬ－１２タンパク質、ＩＬ－１２多様体、ＩＬ－１２ペプチド模倣物、またはＩＬ－１２の機能的フラグメントであってよい。

本発明のペプチドは、化学的方法を使用して作製されてもよい。例えば、ペプチドは、固相手法（Ｒｏｂｅｒｇｅ Ｊ Ｙ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２－２０４）により合成し、樹脂から切断し、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる。自動合成は、例えば、製造業者により提供された指示に従って、ＡＢＩ ４３１ Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成されてもよい。

あるいは、ペプチドは、組み換え手段またはより長いポリペプチドからの切断により作製されてもよい。ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定により確認されてもよい。

本発明によるポリペプチドの多様体は、以下であってよい。（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基存）と置換され且つそのような置換アミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされるものであってもなくてもよいもの、（ｉｉ）１つ以上の修飾アミノ酸残基、例えば、置換基の結合により修飾される残基が存在するもの、（ｉｉｉ）ポリペプチドが本発明のポリペプチドの代替スプライス多様体であるもの、（ｉｖ）ポリペプチドのフラグメント、及び／または（ｖ）ポリペプチドが、別のポリペプチド、例えば、リーダーもしくは分泌配列または精製のために用いられる配列（例えば、Ｈｉｓタグ）もしくは検出のために用いられる配列（例えば、Ｓｖ５エピトープタグ）と融合されるもの。フラグメントは、元の配列のタンパク質分解切断（多部位タンパク質分解を含む）を介して生成されたポリペプチドを含む。多様体は、翻訳後修飾または化学修飾されてもよい。そのような多様体は、本明細書の教示から当業者らの範囲内であるとみなされる。

当該技術分野で既知のように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及び保存されたアミノ酸置換物を、第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。多様体は、元の配列とは異なり、好ましくは、目的のセグメント毎の残基の４０％未満、元の配列と異なり、より好ましくは、目的のセグメント毎の残基の２５％未満、元の配列と異なり、より好ましくは、目的のセグメント毎の残基の１０％未満、元の配列とは異なり、最も好ましくは、目的のセグメント毎のほんの数残基、元のタンパク質配列と異なり、同時に、元の配列の官能性を保存するように元の配列と十分に相同であるポリペプチド配列、ならびに／またはユビキチンもしくはユビキチン化タンパク質に結合する能力を含む。本発明は、元のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、または９５％類似または同一であるアミノ酸配列を含む。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者らに広く知られているコンピューターアルゴリズム及び方法を使用して決定される。例えば、２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用することにより決定することができる［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）］。

本発明のポリペプチドは、翻訳後修飾することができる。例えば、本発明の範囲内にある翻訳後修飾は、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質フォールディング、及びタンパク質分解プロセシングなどを含む。一部の修飾または処理イベントは、追加の生物学的機序の導入を必要とする。例えば、シグナルペプチド切断及びコアグリコシル化などのプロセシングイベントは、イヌのミクロソーム膜またはアフリカツメガエルの卵抽出物（米国特許第６，１０３，４８９号）を標準的な翻訳反応に加えることにより検討される。

本発明のポリペプチドは、翻訳後修飾することにより、または翻訳中に非天然アミノ酸を導入することにより形成される非天然アミノ酸を含んでもよい。タンパク質翻訳中に非天然アミノ酸を導入するための様々なアプローチが利用可能である。例として、特別なｔＲＮＡ、例えば、抑制特性を有するｔＲＮＡ、抑制ｔＲＮＡは、部位特異的非天然アミノ酸置換（ＳＮＡＡＲ）のプロセスで使用されている。ＳＮＡＡＲでは、固有のコドンが、ｍＲＮＡ及び抑制ｔＲＮＡに必要とされ、これは、（ＷＯ９０／０５７８５に記載の）タンパク質合成中に、非天然アミノ酸を固有の部位にターゲティングするように作用する。しかし、抑制ｔＲＮＡは、タンパク質翻訳システムに存在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されるはずがない。特定の場合では、非天然アミノ酸は、特に天然のアミノ酸を特異的に修飾する化学反応を使用して、ｔＲＮＡ分子がアミノアシル化された後に形成することができ、アミノアシル化ｔＲＮＡの機能的活性を著しく変化させない。これらの反応は、アミノアシル化後修飾と呼ばれる。例えば、同族ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬＹＳ）に結合するリジンのイプシロンアミノ基は、アミン特異的な光親和性標識で修飾することができる。

本明細書で使用される「機能的に同等」という用語は、免疫調節タンパク質（例えば、ＩＬ－１２）の特定のアミノ酸配列の少なくとも１つの生物学的機能または活性を保持することが好ましい本発明によるポリペプチドを指す。

本発明の免疫調節薬は、Ｒｅｅｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．に記載の方法などの従来の方法を使用してリン酸化されてもよい（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １１（４）：１３６５，１９９２）。

融合及びキメラポリペプチド
本発明の免疫調節薬は、融合タンパク質を調製するために、タンパク質などの他の分子とコンジュゲートされてもよい。これは、例えば、Ｎ末端またはＣ末端の融合タンパク質の合成により達成されてもよい。但し、得られる融合タンパク質は、免疫調節薬の機能を保持する。

本発明のペプチドまたはキメラタンパク質の環状誘導体もまた、本発明の一部である。環化は、ペプチドまたはキメラタンパク質が他の分子との会合のためにより好ましいコンフォメーションをとることを可能にし得る。環化は、当該技術分野で既知の手法を使用して達成されてもよい。例えば、ジスルフィド結合が、遊離スルフヒドリル基を有する２つの適切に間隔を置いた構成要素間に形成されても、またはアミド結合が、１つの成分のアミノ基と別の成分のカルボキシル基との間に形成されてもよい。環化はまた、Ｕｌｙｓｓｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，８４６６－８４６７により記載のアゾベンゼン含有アミノ酸を使用して達成されてもよい。結合を形成する構成要素は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸構成要素、またはその２つの組み合わせであってよい。本発明の一実施形態では、環状ペプチドは、正しい位置でのベータターンを含んでもよい。ベータターンは、アミノ酸Ｐｒｏ－Ｇｌｙを正しい位置に加えることにより本発明のペプチドに導入されてもよい。

上記のペプチド結合の連結を含有する環状ペプチドよりも柔軟な環状ペプチドを生成することが望ましいことがある。より柔軟なペプチドは、ペプチドの左右の位置にシステインを導入し、２つのシステイン間にジスルフィド架橋を形成することにより調製されてもよい。２つのシステインが、βシートを変形させて回転しないように配置される。ペプチドは、ジスルフィド結合の長さ及びβシート部分における水素結合のより少ない数の結果として、より柔軟である。環状ペプチドの相対的な柔軟性は、分子動力学シミュレーションにより決定することができる。

（ａ）タグ
本発明の特定の実施形態では、本発明の免疫調節ポリペプチドはさらに、タグのアミノ酸配列を含む。タグは、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）（例えば、Ｈ６及びＨ１０など）またはＩＭＡＣシステムで使用される他のタグ、例えば、Ｎｉ２＋アフィニティーカラムなど、ＧＳＴ融合、ＭＢＰ融合、ストレプトアビジンタグ、細菌酵素ＢＩＲＡのＢＳＰビオチン化標的配列、及び抗体により誘導されるタグエピトープ（例えば、とりわけ、ｃ－ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）を含むが、これらに限定されない。当業者により観察されるように、タグペプチドは、本発明の融合タンパク質の精製、検査、選択、及び／または視覚化に使用することができる。本発明の特定の実施形態では、タグは、検出タグ及び／または精製タグである。タグ配列は、本発明の免疫調節薬の機能に干渉しないことが理解されるであろう。

（ｂ）リーダー及び分泌配列
従って、本発明の免疫調節薬は、別のポリペプチドまたはタグ、例えば、リーダーもしくは分泌配列、または精製もしくは検出に用いられる配列、に融合させることができる。例えば、一実施形態では、本発明の免疫調節薬は、本発明のポリペプチドの迅速な高アフィニティー精製の基礎を提供するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタンパク質タグを含む。実に、次に、このＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオンに対する高い親和性を介して細胞から精製することができる。アガロースビーズは、グルタチオンに結合することができ、そのようなグルタチオン－アガロースビーズは、ＧＳＴタンパク質に結合する。従って、本発明の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、固体支持体に結合している。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドがＧＳＴ部分を含む場合、ポリペプチドは、グルタチオン修飾支持体に結合している。特定の場合では、グルタチオン修飾支持体は、グルタチオン－アガロースビーズである。加えて、プロテアーゼ切断部位をコードする配列は、アフィニティータグ及びポリペプチド配列間に含まれる可能性があり、それにより、この特定の酵素とのインキュベーション後に、結合タグが除去され、それにより、対応する目的のタンパク質の精製が容易になる。

（ｃ）ターゲティング配列
一実施形態では、本発明の免疫調節薬は免疫調節薬を所望の細胞構成要素または細胞型もしくは組織に導くことが可能な標的タンパク質及び／または標的ドメインを含む。免疫調節薬は、追加のアミノ酸配列またはドメインも含有してもよい。一実施形態では、本発明の免疫調節薬は、種々の構成要素が異なる供給源由来であるという意味で組み換えであり、それ故、自然界では一緒にみられない（すなわち、異種である）。

標的タンパク質は、分解のために選択されるタンパク質であり、例えば、疾患もしくは状態において変異または過剰発現させるタンパク質であってよい。本発明の別の実施形態では、標的タンパク質は、異常に分解されるタンパク質であり、例えば、疾患または状態において変異または過小発現されるタンパク質であってよい。ターゲティングドメインは、膜貫通ドメイン、膜結合ドメイン、またはタンパク質が、例えば、小胞または核と会合するように導く配列であり得る。ターゲティングドメインは、免疫調節薬を特定の細胞型または組織にターゲティングすることができる。例えば、ターゲティングドメインは、細胞表面リガンドまたは標的組織の細胞表面抗原（例えば、ニューロンまたは腫瘍抗原）に対する抗体であり得る。ターゲティングドメインは、免疫調節薬を細胞構成要素にターゲティングし得る。

（ｄ）細胞内ターゲティング
免疫調節薬は、「トランスサイトーシス」、例えば、上皮細胞によるペプチドの取り込み、を促進する第２のペプチドと共に融合ペプチドを提供することができる。示すために、本発明の免疫調節薬は、ＨＩＶのＴａｔタンパク質のＮ末端ドメインの全てまたはフラグメント、例えば、Ｔａｔの残基１～７２またはトランスサイトーシスを促進することができるそれらの小さなフラグメント、との融合ポリペプチドの一部として提供することができる。他の実施形態では、免疫調節薬は、アンテノペディア（ａｎｔｅｎｏｐｅｄｉａ）ＩＩＩタンパク質の全部または一部との融合ポリペプチドを提供することができる。

さらに示すために、免疫調節薬（またはペプチド模倣物）は、免疫調節薬の細胞内局在化を容易にするために、細胞外形態の免疫調節薬が細胞膜を通って移行することを駆動する異種ペプチド配列（「内在化ペプチド」）を含むキメラペプチドとして提供することができる。この点で、免疫調節薬は、細胞内で活性なものである。内在化ペプチドは、それ自体、比較的高速で、例えば、トランスサイトーシスにより、細胞膜を通過することが可能である。内在化ペプチドは、例えば、融合タンパク質として、免疫調節薬にコンジュゲートされる。得られるキメラペプチドは、ペプチド単独と比較してより高い速度で、細胞に輸送され、それにより、それが適用される細胞への導入を増強するための手段を提供する。

例示的な内在化ペプチドとしては、アポリポタンパク質Ａ－１及びＢのペプチド；ペプチド毒素、例えば、メリチン、ボンボリチン、デルタ溶血素、及びパルダキシン；抗生物質ペプチド、例えば、アラメチシン；ペプチドホルモン、例えば、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、ベータエンドルフィン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、膵臓ポリペプチド；ならびに多数の分泌タンパク質のシグナル配列に対応するペプチドが挙げられる。さらに、例示的な内在化ペプチドは、酸性ｐＨで内在化ペプチドのアルファヘリックス特性を増強する置換基の結合を介して修飾されてもよい。

本発明内での使用に適する内在化ペプチドのさらに別のクラスは、生理学的ｐＨでは「隠される」が、標的細胞エンドソームの低ｐＨ環境に曝露される疎水性ドメインを含む。ｐＨ誘発性のアンフォールディング及び疎水性ドメインの露出時に、部分は、脂質二重層に結合し、細胞質への共有結合したポリペプチドの移行に影響をもたらす。そのような内在化ペプチドは、例えば、シュードモナス外毒素Ａ、クラスリン、またはジフテリア毒素で同定された配列に基づいてモデル化されてもよい。

孔形成タンパク質またはペプチドはまた、本明細書において内在化ペプチドとして機能し得る。孔形成タンパク質またはペプチドは、例えば、Ｃ９補体タンパク質、細胞溶解性Ｔ細胞分子、またはＮＫ細胞分子から得られても、誘導されてもよい。これらの部分は、それにより、膜中に環様構造を形成し、それにより、膜を通って細胞内部に、結合ポリペプチドを輸送させることが可能である。

内在化ペプチドの単なる膜インターカレーションは、細胞膜を通って免疫調節薬またはペプチド模倣物が移行するのに十分であり得る。しかし、乗換えは、細胞内酵素の基質（すなわち、「アクセサリーペプチド」）を内在化ペプチドに結合させることにより改善されてもよい。細胞膜を通って細胞質面に突出する内在化ペプチドの部分（複数可）にアクセサリーペプチドを結合させることが好ましい。アクセサリーペプチドは、有利なことに、移行／内在化部分またはアンカーペプチドの一端に結合させてもよい。本発明のアクセサリー部分は、１つ以上のアミノ酸残基を含有してもよい。一実施形態では、アクセサリー部分は、細胞リン酸化のための基質を提供してもよい（例えば、アクセサリーペプチドは、チロシン残基を含有してもよい）。

この点に関しては、例示的なアクセサリー部分は、Ｎ－ミリストイルトランスフェラーゼのペプチド基質であるであろう（Ｅｕｂａｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ（ｅｄ．），ＥＳＣＯＭ，Ｌｅｉｄｅｎ，１９８８，ｐｐ．５６６－６９）。この構築物では、Ｎ末端グリシンがアクセサリー部分の活性に重要であるので、内在化ペプチドがアクセサリーペプチドのＣ末端に結合するであろう。このハイブリッドペプチドは、Ｃ末端でＥ２ペプチドまたはペプチド模倣物に結合すると、Ｎ－ミリスチル化され、さらに標的細胞膜に固定され、例えば、細胞膜での免疫調節薬の局所濃度を増加させるのに役立つ。

さらにアクセサリーペプチドの使用を示すために、リン酸化可能なアクセサリーペプチドは、まず内在化ペプチドのＣ末端に共有結合し、その後、免疫調節薬またはペプチド模倣物との融合タンパク質に組み込まれる。融合タンパク質のペプチド構成要素は、標的細胞の原形質膜内に挿入し、その結果、アクセサリーペプチドは、膜を通って移行され、標的細胞の細胞質内に突出する。原形質膜の細胞質側で、アクセサリーペプチドは、中性ｐＨで細胞キナーゼによりリン酸化される。リン酸化されると、アクセサリーペプチドは、融合タンパク質を膜に不可逆的に固定するように作用する。細胞表面膜への局在化は、ポリペプチドの細胞質への移行を亢進させ得る。

好適なアクセサリーペプチドは、キナーゼ基質であるペプチド、単一の正電荷を有するペプチド、及び膜結合型グリコトランスフェラーゼによりグリコシル化される配列を含有するペプチドを含む。

内在化及びアクセサリーペプチドは、それぞれ、独立して、化学的架橋により、または融合タンパク質の形態で、免疫調節薬またはペプチド模倣物に添加することができる。融合タンパク質の場合、非構造化ポリペプチドリンカーは、各ペプチド部分のそれぞれの間に含まれ得る。

一般に、内在化ペプチドは、ポリペプチドの直接輸送にも十分であろう。しかし、アクセサリーペプチドが提供される場合、宿主細胞からの融合タンパク質の直接輸送のために分泌シグナル配列を含むことが必要なことがある。好ましい実施形態では、分泌シグナル配列は、最もＮ末端に位置し、（任意に）分泌シグナルと融合タンパク質の残りの部分との間のタンパク質分解部位に隣接する。一部の場合では、核局在化シグナルを含むことも望ましいことがある。

主題の免疫調節薬を含む融合ポリペプチドの生成において、種々のペプチドドメインを確実に適切にフォールドさせるために、非構造化リンカーを含むことが必要なことがある。多くの合成及び天然のリンカーは、当該技術分野で既知であり、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４リンカーを含む、本発明での使用に適合させることができる。

（ｅ）免疫調節模倣物

他の実施形態では、対象の組成物は、免疫調節薬のペプチド模倣物である。ペプチド模倣物は、ペプチド及びタンパク質に基づく、またはそれらに由来する化合物である。本発明の免疫調節ペプチド模倣物は通常、非天然アミノ酸、立体配座拘束、等配座置換などを使用する既知の免疫調節配列の構造的改変により得ることができる。主題のペプチド模倣物は、ペプチド及び非ペプチド合成構造間の構造空間の連続体を構成し；免疫調節薬ペプチド模倣物は、ファーマコフォアを説明すること、及びペプチドを親免疫調節薬の活性を有する非ペプチド化合物に置き換えることを助けることに有用であり得る。

さらに、本開示から明らかなように、主題の免疫調節薬のミメトープを提供することができる。そのようなペプチド模倣物は、非加水分解性（例えば、対応するペプチドを分解するプロテアーゼまたは他の生理学的条件に対する安定性の増加）、特異性及び／または効能の増加、ならびにペプチド模倣物の細胞内局在化のための細胞透過性の増加などの属性を有し得る。例証の目的のために、本発明のペプチドアナログは、例えば、ベンゾジアゼピン（例えば、以下を参照のこと、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８）、置換ガンマラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐ１２３）、Ｃ－７模倣物（Ｈｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐ．１０５）、ケトメチレンプソイドペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５；及びＥｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｌｌ．，１９８５）、βターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、β－アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２６：４１９；及びＤａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）、ジアミノケトン（Ｎａｔａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２４：１４１）、ならびにメチレンアミノ修飾（Ｒｏａｒｋ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐ１３４）を使用して生成することができる。また、一般には、以下を参照のこと、Ｓｅｓｓｉｏｎ ＩＩＩ：Ａｎａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｎ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８。

免疫調節ペプチド模倣物を生成するために実施することができる様々な側鎖置換に加えて、本発明は、ペプチドの２次構造の立体配座が制限された模倣物の使用を具体的に企図する。ペプチドのアミド結合のために多くの代用物が開発されている。アミド結合に頻繁に利用される代用物は、以下の群、（ｉ）トランスオレフィン、（ｉｉ）フルオロアルケン、（ｉｉｉ）メチレンアミノ、（ｉｖ）ホスホンアミド、及び（ｖ）スルホンアミドを含む。

さらに、ミメトープの他の例としては、タンパク質系化合物、炭水化物系化合物、脂質系化合物、核酸系化合物、天然有機化合物、合成由来有機化合物、抗イディオタイプ抗体、及び／もしくは触媒抗体、またはそのフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。ミメトープは、例えば、免疫調節薬に結合可能な化合物について、天然及び合成化合物のライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。ミメトープはまた、例えば、天然及び合成化合物のライブラリー、特に、化学的またはコンビナトリアルライブラリー（すなわち、配列またはサイズが異なるが同じ構成要素を有する化合物のライブラリー）から得ることができる。ミメトープはまた、例えば、合理的なドラッグデザインにより得ることができる。合理的なドラッグデザイン手順では、本発明の化合物の３次元構造は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）またはＸ線結晶学により分析することができる。次に、３次元構造を使用して、例えば、コンピューターモデリングにより潜在的なミメトープの構造を予測することができ、次に、予測されたミメトープ構造は、例えば、化学合成、組み換えＤＮＡ技術、または天然供給源からミメトープを単離することにより生成することができる（例えば、植物、動物、細菌、及び菌類）。

本発明の免疫調節薬は、従来の手法により合成されてもよい。例えば、ペプチドまたはキメラタンパク質は、固相ペプチド合成を使用する化学合成により合成されてもよい。これらの方法は、固相または液相合成法のいずれかを用いる（例えば、以下を参照のこと、固相合成手法については、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．（１９８４）ａｎｄ Ｇ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔｏｒｓ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ Ｖｏｌ．２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０，ｐｐ．３－２５４；及び従来の液体合成については、Ｍ Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４，ならびにＥ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒｓ，Ｖｏｌ １）。例として、ＲＬＰまたはキメラタンパク質は、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相化学を使用して合成されてもよく、Ｎ－フルオレニルメトキシ－カルボニル－Ｏ－ベンジル－Ｌ－ホスホスレオニン誘導体としてホスホスレオニンを直接組み込んだ。

他の分子とコンジュゲートされた本発明の免疫調節薬またはキメラタンパク質を含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質は、組み換え手法により、免疫調節薬またはキメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端、及び所望の生物学的機能を有する選択タンパク質または選択可能なマーカーの配列を融合することにより、調製されてもよい。得られた融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、選択タンパク質またはマーカータンパク質に融合された免疫調節薬またはキメラタンパク質を含有する。融合タンパク質を調製するために使用され得るタンパク質の例としては、免疫グロブリン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、及び切断ｍｙｃが挙げられる。

本発明のペプチドは、生物学的発現システムを使用して開発されてもよい。これらのシステムを使用すると、ランダムなペプチド配列の大きなライブラリーの作成、及び特定のタンパク質に結合するペプチド配列についての、これらのライブラリーのスクリーニングが可能になる。ライブラリーは、好適な発現ベクターに、ランダムなペプチド配列をコードする合成ＤＮＡをクローニングにより生成されてもよい（以下を参照のこと、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ １９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ １９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８）。ライブラリーはまた、重複するペプチドの同時合成により構築されてもよい（以下を参照のこと、米国特許第４，７０８，８７１号）。

本発明のペプチド及びキメラタンパク質は、無機酸、例えば、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸など、または有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベネゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸と反応させることにより、医薬塩に変換されてもよい。

核酸
一実施形態では、本発明は、免疫調節薬をコードする（例えば、免疫調節性サイトカインまたはＩＬ－１２をコードする）ヌクレオチド配列を含む単離核酸を含む。

あるいは、免疫調節薬をコードするヌクレオチド配列は、得られるポリヌクレオチドが本発明のポリペプチドをコードするという条件で、元のヌクレオチド配列に対する配列変異、例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、及び／または欠失、を含み得る。それ故、本発明の範囲は、免疫調節薬をコードする（例えば、免疫調節性サイトカインまたはＩＬ－１２をコードする）ヌクレオチド配列に実質的に相同であるヌクレオチド配列を含む。

この記載で使用される意味では、ヌクレオチド配列は、少なくとも６０％、有利には、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９５％のヌクレオチド配列に対するある程度の同一性を有する場合、本明細書に記載のそのヌクレオチド配列のうちのいずれかと「実質的に相同」である。免疫調節薬をコードするヌクレオチド配列と実質的に相同であるヌクレオチド配列は通常、例えば、保存的または非保存的置換を導入することにより、ヌクレオチド配列に含有される情報に基づいて、本発明のポリペプチドの産生生物から単離することができる。可能な修飾の他の例としては、配列内の１つ以上のヌクレオチドの挿入、配列の末端のいずれかにおいて１つ以上のヌクレオチドの付加、またはいずれかの末端もしくは配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失を含む。２つのポリヌクレオチド間の同一性の程度は、当業者らに広く知られるコンピューターアルゴリズム及び方法を使用して決定される。例えば、２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用することにより決定することができる［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）］。

別の態様では、本発明は、免疫調節薬またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む構築物に関する。特定の実施形態では、構築物は、転写エレメント、任意に、翻訳エレメント、調節エレメントに作動可能に結合している。構築物は、本発明のヌクレオチド配列の発現の作動可能に結合している制御配列を組み込み、それにより、発現カセットを形成することができる。

免疫調節薬またはキメラタンパク質をコードする核酸分子は、組み換えＤＮＡ法を使用して調製されてもよい。従って、免疫調節薬またはキメラタンパク質をコードする核酸分子は、確実に免疫調節薬またはキメラタンパク質を良好に発現させる適切な発現ベクターに既知の方法で組み込まれてもよい。

それ故、別の態様では、本発明は、本発明の免疫調節薬をコードするヌクレオチド配列を含むベクターに関する。ベクターの選択は、その後導入されるべき宿主細胞に依存するであろう。特定の実施形態では、本発明のベクターは、発現ベクターである。好適な宿主細胞としては、多種多様な原核生物及び真核生物の宿主細胞が挙げられる。特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター、及び哺乳動物細胞ベクターからなる群より選択される。ポリヌクレオチドまたはそれらの同族ポリペプチドを生成するために、本発明と共に使用される原核生物及び／または真核生物ベクター系システムを用いることができる。そのようなシステムの多くは、市販されており、幅広く利用可能である。

さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載される。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカーを含有する。（例えば、以下を参照のこと、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）。

ポリヌクレオチドの挿入のための好適なベクターは、原核生物の発現ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージ、ならびに「シャトル」ベクター、例えば、ｐＳＡ３及びｐＡＴ２８、酵母の発現ベクター、例えば、２ミクロンのプラスミド、統合プラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなどの種類の、昆虫細胞の発現ベクター、例えば、ｐＡＣシリーズ及びｐＶＬのベクター、植物のベクター、例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズなど、ならびにウイルスベクター（レトロウイルス、特に、レンチウイルスなどのアデノウイルスと関連するウイルスであるアデノウイルス）に基づく真核細胞の発現ベクター、ならびに非ウイルスベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１－ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＭＣＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ－ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬ、及びＰＫＳＶ－１０、ｐＢＰＶ－１、ｐＭＬ２ｄ、及びｐＴＤＴ１に由来するベクターである。

本発明のベクターはまた、標準の遺伝子送達プロトコールを使用して、核酸免疫化及び遺伝子治療のために使用されてもよい。遺伝子送達の方法は、当該技術分野で既知である。例えば、以下を参照のこと、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号。別の実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。

本発明の免疫調節薬をコードする単離核酸は、多種類のベクターにクローン化することができる。例えば、核酸は、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがベクターにクローン化することができる。特定の目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターを含む。

さらに、ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載される。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカーを含有する。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）。

哺乳動物細胞への遺伝子導入のための多くのウイルス系システムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。選択遺伝子は、ベクターに挿入され、当該技術分野で公知の手法を使用して、レトロウイルス粒子中にパッケージングすることができる。次に、組み換えウイルスは、単離され、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該技術分野で既知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。

例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、娘細胞内の導入遺伝子及びその増殖の長期の安定的な統合を可能にするので、長期の遺伝子移入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスに由来するベクターよりも追加の利点を有する。それらはまた、免疫原性が低いという追加の利点を有する。一実施形態では、組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、種々の障害の処置のための強力な遺伝子送達ツールになっている。ＡＡＶベクターは、病原性の欠如、最小限の免疫原性、ならびに安定で効率的な方法で分裂後の細胞を形質導入する能力を含む、遺伝子治療に理想的に適するようにする多くの特徴を有する。ＡＡＶベクター内に含有される特定の遺伝子の発現は、ＡＡＶ血清型、プロモーター、及び送達方法の適切な組み合わせを選択することにより、１種以上の細胞を特異的に標的にすることができる。

特定の実施形態では、ベクターはまた、本発明により作製されたプラスミドベクターでトランスフェクトされた、またはウイルスを感染させた細胞において、転写、翻訳、及び／または発現させる方法で、導入遺伝子に作動可能に連結される従来の調節エレメントを含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と接触している発現調節配列と目的の遺伝子を調節するためにトランスでまたは少し離れて作用する発現調節配列の両方を含む。発現調節配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、リーダー、及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を亢進させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を亢進させる配列；ならびに、望まれる場合、コードされる産物の分泌を亢進させる配列を含む。天然、構成的、誘導性、及び／または組織特異的なプロモーターを含む多数の発現調節配列は、当該技術分野で既知であり、利用されてもよい。

追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。通常、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、近年、多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は多くの場合、柔軟であるので、エレメントが互いに反転または移動した場合、プロモーター機能が保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐに増加させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントが、転写を活性化するために、協調または独立して機能し得る。

好適なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を引き起こすことが可能な強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかし、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血病ウイルスプロモーター、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス前初期プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーター、を含む他の構成的プロモーター配列も使用されてもよい。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターはまた、本発明の一部として考えられる。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれる場合、それが作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が望まれない場合、発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

ベクター上にみられるエンハンサー配列はまた、そこに含有される遺伝子の発現を調節する。通常、エンハンサーは、遺伝子の転写を亢進するために、タンパク質因子と結合している。エンハンサーは、それが制御する遺伝子の上流または下流に位置してもよい。エンハンサーはまた、特定の細胞または組織タイプにおける転写を亢進するために組織特異的であってよい。一実施形態では、本発明のベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写を促進するための１つ以上のエンハンサーを含む。

タンパク質レポーター、タンパク質レポーターフラグメント、またはタンパク質レポーター変異体の発現を評価するために、細胞に導入されるべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させることが求められる細胞集団から細胞を発現する同定及び選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含有し得る。他の態様では、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ片上に運ばれ、同時トランスフェクション手順において使用されてもよい。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方に、宿主細胞での発現を可能にする適切な制御配列に隣接していてもよい。有用な選択可能なマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオなどを含む。

レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するために及び制御配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子が、レシピエント生物もしくは組織に存在しないか、またはこれらにより発現されない且つ発現が主に一部の容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性、により明示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されている後の好適な時期にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含んでもよい（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。好適な発現システムは、周知であり、既知の手法を使用して調製するか、または商業的に入手されてもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動型転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用されてもよい。

遺伝子を細胞に導入及び発現させる方法は、当該技術分野で既知である。発現ベクターとの関連で、ベクターは、当該技術分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞、に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段により宿主細胞に移すことができる。

宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、以下を参照のこと、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクトである。

宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒトの細胞、に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどに由来することができる。例えば、以下を参照のこと、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号。

宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして使用される例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。宿主細胞への核酸の導入（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏ）のための脂質製剤の使用が企図されている。別の態様では、核酸は、脂質と関連していてもよい。脂質と関連した核酸は、リポソームの水性内部に封入されても、リポソームの脂質二重層内に散在しても、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方と関連する連結分子を介してリポソームに結合しても、リポソームに封入されても、リポソームと複合化されても、脂質を含有する溶液に分散しても、脂質と混合されても、脂質と組み合わせても、脂質に懸濁液として含まれても、ミセルと共に含有または複合化されても、他の方法で、脂質と会合してもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中のいずれか特定の構造に限定されない。例えば、それらは、ミセルとして、または構造が「崩壊した」二層構造で存在してもよい。それらはまた、場合により、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する、単に溶液中に散在し得る。脂質は、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含有する化合物の部類を含む。

使用に適する脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイスから入手することができ；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州プレインビュー）から入手することができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（アラバマ州バーミンガム）から入手されてもよい。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成により形成される様々な単一及び多層脂質ビヒクルを包含する一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重膜及び内部水性媒体を備えた小胞構造を有するものとして特性決定することができる。多層リポソームは、水性媒体により隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁される場合に自然に形成される。脂質構成成分は、閉じた構造を形成する前に自己再配列し、脂質二重層間に水及び溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかし、溶液中で、通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとっても、単に、脂質分子の不均一な凝集体として存在してもよい。リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。

宿主細胞に外因性核酸を導入するために使用される方法に関係なく、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施されてもよい。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者らに周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ；例えば、特定のペプチドの有無を検出する、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）による「生化学的」アッセイが挙げられる。

送達ビヒクル
一実施形態では、本発明は、タンパク質レポーターまたはタンパク質レポーターをコードする核酸分子を含む送達ビヒクルを提供する。例示的な送達ビヒクルとしては、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、リポソーム、及びミセルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、特定の実施形態では、送達ビヒクルは、本発明の免疫調節薬または免疫調節薬をコードする核酸分子が搭載される。特定の実施形態では、送達ビヒクルは、搭載されたカーゴの制御放出、遅延放出、または連続放出を提供する。特定の実施形態では、送達ビヒクルは、標的部位に送達ビヒクルをターゲティングするターゲティング部分を含む。本発明の免疫調節薬の送達に使用することができる例示的なマイクロ粒子及びナノ粒子としては、限定されないが、米国特許公開第ＵＳ２０１７／０２７３９０９Ａ１号に記載のマイクロ粒子及びナノ粒子が挙げられ、これの内容は、全体が本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、送達ビヒクルは、本発明の免疫調節薬または免疫調節薬をコードする核酸分子を含む足場または基材組成物である。本発明の足場は、当該技術分野で既知の任意のタイプのものであってよい。そのような足場の非限定例としては、ヒドロゲル、エレクトロスピニングされた足場、フォーム、メッシュ、シート、パッチ、及びスポンジが挙げられる。

製剤
本明細書に記載の免疫調節薬は、治療的有効用量で投与することができる。治療的有効用量は、投与される免疫調節薬のタイプに基づいて当業者が決定することができる。当該技術分野で記載の投薬量、投与経路、及び投与スケジュールを使用することができる。代表的な用量は、メルクマニュアルプロフェッショナル版で入手できる（以下を参照のこと、インターネットのｍｅｒｃｋｍａｎｕａｌｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）。

さらに、動物に投与される免疫調節薬の用量は、体表面積（ＢＳＡ）（ｍｇ／ｍ^２で表される）正規化方法に基づいてヒトの場合の等価用量に変換することができる（例えば、以下を参照のこと、Ｒｅａｇａｎ－Ｓｈａｗ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，“Ｄｏｓｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ，”ＦＡＳＥＢ Ｊ．２２，６５９－６６１（２００７）；及び“Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ－Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ），Ｊｕｌｙ ２００５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ＢＳＡに基づくヒト等価線量（ＨＥＤ）は、以下の式Ｉで計算することができる。
ＨＥＤ＝動物の用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物の体重（ｋｇ）／ヒトの体重（ｋｇ））０．３３
あるいは、ＨＥＤは、以下の式ＩＩで決定することができる。
ＨＥＤ（ｍｇ／ｋｇ）＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物Ｋｍ／ヒトＫｍ）。

一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫調節薬は、がんまたは腫瘍を処置するのに有効な期間、治療的有効量で投与される。本明細書に記載の免疫調節薬の有効量は、当業者が決定することができ、哺乳動物の場合、約０．５～約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５～約１５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５～１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５～約７５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５～約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１～約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５～約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の免疫調節薬の投薬量、またはその中で導出可能な任意の範囲を含む。一部の実施形態では、免疫調節薬の投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。一部の実施形態では、免疫調節薬の投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ体重である。本明細書に記載の組成物は、単回投与で、または個々の分割用量の形態で、例えば、１日に１～４回、または２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、週に１回、もしくは月に１回、投与することができる。本明細書に記載の組成物はまた、種々の処置サイクル、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の処置サイクルで投与することができる。処置サイクルは、処置されるべきがんに応じて異なる長さの時間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間の処置サイクル、であり得る。さらに、本明細書に記載の免疫調節薬の有効量は、前臨床試験及び臨床試験中に、医師及び臨床医に既知の方法で決定することができる。

あるいは、１μｇ～１００μｇ、１ｍｇ～１００ｍｇ、または１ｇｍ～１００ｇの範囲の量などの、患者の体重に基づかない特定量の投与を与えられてもよい。例えば、部位特異的投与は、本発明の有効量の免疫調節薬のＣＴ誘導経皮腫瘍内注射などの身体の区画または腔へのものであってよい。一実施形態では、有効量の本発明の免疫調節薬の部位特異的投与は、超音波内視鏡（ＥＵＳ）誘導送達を介して実施される。しかし、送達の方法は、上記の方法に限定されず、当該技術分野既知の、例えば、限定されないが、ガイディングカテーテル、カテーテル、内視鏡、トロカール、イントロデューサ、内視鏡作業チャネル、超音波プローブを備えた内視鏡、シースイントロデューサー、スリーブ、ステッパー、ポートなどを含むデバイスを用いて標的部位に少なくとも１つ以上の処置要素を送達することを含む。

本発明の免疫調節薬は、薬学的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って製剤化することができ、それにより、これらの材料またはそれらの機能性誘導体は、薬学的に許容される担体ビヒクルと混合して組み合わされる。他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、を含む好適なビヒクル及びそれらの製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１６ｔｈ ｅｄ．，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．（１９８０））に記載される。効果的な投与に適する薬学的に許容される組成物を形成するために、そのような組成物は、好適量の担体ビヒクルと共に有効量の上記化合物を含有するであろう。作用の持続時間を調節する追加の薬学的方法が用いられてもよい。制御放出調製物は、化合物を複合化または吸収するためにポリマーを使用することにより達成されてもよい。制御放出調製物により作用の持続時間を調節するための別の可能な方法は、本発明の化合物を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどのポリマー材料の粒子に組み込むことである。あるいは、ポリマー粒子に、これらの薬剤を組み込む代わりに、例えば、界面重合により、調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン－マイクロカプセル及びポリ（メチルメタシレート）－マイクロカプセル内に、もしくはコロイド状の薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル内に、またはマクロエマルション内に、これらの材料を閉じ込めることが可能である。本発明の免疫調節薬にカプセル化するために使用することができる例示的なマイクロ粒子及びナノ粒子としては、限定されないが、米国特許公開第ＵＳ２０１７／０２７３９０９Ａ１号に記載のマイクロ粒子及びナノ粒子が挙げられ、この内容は、全体が本明細書に組み込まれる。従って、一実施形態では、本発明の免疫調節薬は、薬剤に増強された安定性を与える結晶性または半結晶性マトリックスにカプセル化される。

本発明の微粒子は、直径約１～２５０ミクロン、直径１０～２００ミクロン、直径１０～１３０ミクロン、または直径約１０～９０ミクロンの範囲のサイズを有してもよい。製剤中に存在する免疫調節薬の量は、所望の１日の放出投与量に、従って、封入マトリックスの生分解速度に依存する。免疫調節薬の正確な量は、生物学的利用能治験で確認されてもよい。

処置は、単回投与スケジュールで、または複数回投与スケジュールとして投与されてもよく、処置の主要コースが、１～１００の別々の投与を用いるもので、続いて、残りの投与が、応答を維持及び／または強化するのに要する後続の時間間隔、例えば、第２の投与のために１～４ヶ月、で投与されてもよく、必要であれば、後続の投与（複数可）が数ヶ月後になされてもよい。好適な処置スケジュールの例としては、（ｉ）０、１ヶ月、及び６ヶ月、（ｉｉ）０、７日、及び１ヶ月、（ｉｉｉ）０及び１ヶ月、（ｉｖ）０及び６ヶ月、または疾患の症状を軽減する、もしくは疾患の重症度を低減することが期待される望ましい応答を引き出すのに十分な他のスケジュールが挙げられる。

持続放出製剤
本発明の免疫調節薬は、持続放出用に製剤化されてもよい。免疫調節薬の持続放出は、免疫調節薬の直接投与後に得られるよりも長い期間にわたって免疫調節薬の測定可能な血清中レベルをもたらす放出である。一実施形態では、持続放出は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、または２ヶ月以上の免疫調節薬の放出である。

ポリマーマトリックスからの免疫調節薬の持続放出は、放出の比較的一定または変化率で、連続的または非連続的に放出することができる。放出される免疫調節薬の連続性及び放出される免疫調節薬のレベルは、とりわけ、所望の効果を生み出す１種以上のポリマー組成物、免疫調節薬の負荷、及び／または賦形剤の選択を使用することにより確立することができる。

本発明の徐放性組成物のポリマーマトリックスを形成するのに適するポリマーは、生分解性もしくは非生分解性ポリマー、またはそれらのブレンドもしくはコポリマーのいずれかであり得る生体適合性ポリマーである。ポリマー、及びポリマーの任意の分解生成物が、レシピエントに非毒性であり且つまた、レシピエントの身体に著しく有害または不適当な効果、例えば、注入部位での免疫学的反応、を呈しない場合、ポリマー、またはポリマーマトリックスは、生体適合性、である。好適な生体適合性、生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステルアミド、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリラート、ポリ（ｐ－ジオキサノン）、ポリ（アルキレンシュウ酸塩）、生分解性ポリウレタン、それらのブレンド及びコポリマーが挙げられる。本発明の調節された放出組成物に適する生体適合性の非生分解性ポリマーは、ポリアクリラート、エチレン－ビニルアセテート及び他のアシル置換酢酸セルロースのポリマー、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン酸塩ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、それらのブレンド及びコポリマーからなる群より選択される非生分解性ポリマーを含む。

一実施形態では、ポリマーマトリックスのポリマーの末端官能基を修飾することができる。例えば、ポリエステルは、ブロックされたポリマー、ブロックされていないポリマー、またはブロックされたポリマーとブロックされていないポリマーのブレンドであり得る。ブロックされたポリマーは、当該技術分野で古典的に定義されている通りであり、具体的には、ブロックされたカルボキシル末端基を有する。一般に、ブロック基は、重合開始剤から誘導され、通常は、アルキル基である。ブロックされていないポリマーは、当該技術分野で古典的に定義されている通りであり、具体的には、遊離のカルボキシル末端基を有する。

本発明の持続放出組成物は、フィルム、ペレット、シリンダー、ディスク、または微粒子などの多くの形状に形成することができる。本発明の免疫調節薬を封入するために使用することができる例示的な持続放出マイクロ粒子及びナノ粒子としては、米国特許公開第ＵＳ２０１７／０２７３９０９Ａ１号に記載のマイクロ粒子及びナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。

徐放性製剤に含有される免疫調節薬の量は、治療的または予防的有効量であり、これは、当業者が決定することができ、体重、処置されるべき状態、使用されるポリマーの種類、及びマトリックスからの放出速度などの要因を考慮に入れる。

持続放出組成物はまた、安定剤、封入剤、染料、増量剤、及びそれらの組み合わせなどの他の賦形剤を含むことができる。安定剤は、放出期間にわたって持続放出組成物の効能を維持するために添加される。好適な安定剤としては、例えば、炭水化物、アミノ酸、脂肪酸、及び界面活性剤を含み、当業者らに既知である。増量剤は通常、不活性材料を含む。好適な増量剤は、当業者らに既知である。

併用療法
本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせは、がんを処置するために、別の治療的処置または薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせは、単独で、または１つ以上の治療上有効な薬剤もしくは処置と組み合わせて、投与されてもよい。他の治療上有効な薬剤は、本発明の免疫調節薬と同じ組成物に組み込まれても、または、別々の組成物として投与されてもよい。他の治療薬または処置は、本発明の免疫調節薬及び放射線治療の組み合わせの投与前、投与中、及び／または投与後に、投与されてもよい。

特定の実施形態では、本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせは、１つ以上の他の治療薬または処置と同時投与される。他の実施形態では、本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせは、１つ以上の他の治療薬または処置の投与とは独立して投与される。例えば、本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせが最初に投与され、続いて、１つ以上の他の治療薬または処置の投与が行われる。あるいは、１つ以上の他の治療薬が最初に投与され、続いて、本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせが投与される。別の例として、処置（例えば、手術など）が最初に実行され、続いて、本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせの投与が行われる。

他の治療上有効な薬剤／処置は、手術、抗腫瘍薬（化学療法剤及び放射線を含む）、抗血管新生薬、他の標的に対する抗体、小分子、光力学的療法、免疫療法、免疫増強療法、細胞毒性薬、サイトカイン、ケモカイン、成長阻害薬、抗ホルモン薬、キナーゼ阻害薬、心臓保護薬、免疫刺激薬、免疫抑制薬、及び血液細胞の増殖を促進する薬剤を含む。

一実施形態では、本明細書で使用される「別の治療薬」は、第２の別個の治療薬または抗がん薬、すなわち、本発明の放射線及び免疫調節薬の組み合わせ「以外の」治療薬または抗がん薬、である。任意の追加の治療薬は、本発明の併用療法で使用されてもよい。相加効果、相加効果よりも大きい、及び潜在的な相乗効果を達成することを目的とする１つ以上の追加の治療薬は、以下のガイダンスに従って選択されてもよい。

併用抗腫瘍療法を実施するために、本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせが、動物または患者に、動物または患者内で組み合わされた抗腫瘍作用をもたらすのに効果的な方法で、もう１つの別個の抗がん薬と組み合わせて投与されるであろう。それ故、薬剤は、腫瘍または腫瘍脈管構造内の組み合わせた、または同時の存在、及び腫瘍環境における組み合わせた作用をもたらすのに効果的な有効な量で及び有効な期間提供されるであろう。この目標を達成するために、免疫調節薬及び１つ以上のさらなる別個の抗がん薬を、単一の組成物で、または異なる投与経路を使用する２つの異なる組成物として、実質的に同時に動物に投与されてもよい。

一実施形態では、本発明の免疫調節薬の投与は、数秒から、数分、数時間、数日、数週までの範囲の間隔で、１つ以上の追加の抗がん薬の投与に先行しても、これに続いてもよい。

別々にタイミングを合わせた併用療法のための１つ以上の追加の治療薬は、本明細書の他の箇所で考察されるものを含む、特定の基準に基づいて選択されてもよい。しかし、事前または事後投与のための１つ以上の別個の抗がん薬の選択は、必要に応じて実質的に同時投与における使用を排除しない。

本発明の１次治療薬の「前の」または「後の」投与のために選択され且つ増加した潜在的な相乗効果を達成するように設計された追加の別個の抗がん薬は、１次治療薬の効果から恩恵を受ける薬剤を含む。従って、続く投与のための効果的な第２の別個の抗がん薬は、転移を阻害する抗血管新生薬；壊死性の腫瘍細胞を標的とする薬剤、例えば、悪性細胞からｉｎ ｖｉｖｏでアクセス可能になる細胞内結合パートナー分子に特異的な抗体（米国特許第５，０１９，３６８号、同第４，８６１，５８１号、及び同第５，８８２，６２６号、それぞれ具体的に参照により本明細書に組み込まれる）；化学療法薬；及び任意の腫瘍細胞を攻撃する抗腫瘍細胞免疫複合体を含む。

本発明の免疫調節薬はまた、１つ以上の追加のがん免疫療法と組み合わせて投与することができる。がん免疫療法は、対象のがん細胞に対する体液性免疫応答、または対象のがん細胞に対する細胞性免疫応答、または対象のがん細胞に対する体液性応答と細胞性応答の組み合わせを誘発するように設計されたものであり得る。本発明の放射線療法及び免疫調節薬の組み合わせと組み合わせた有用ながん免疫療法の非限定例としては、がんワクチン、ＤＮＡがんワクチン、養子細胞療法、養子免疫療法、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗体、免疫増強化合物、サイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２など）、インターフェロン（ＩＦＮ－αなど）、及びチェックポイント阻害薬（例えば、ＰＤ－１阻害薬、ＰＤＬ－１阻害薬、ＣＴＬＡ－４阻害薬など）が挙げられる。

一部の状況では、処置の期間を著しく延長することは、望ましいことがあり、数日（２、３、４、５、６、もしくは７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７、もしくは８）、または数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７、もしくは８）は、それぞれの投与間に経過する。これは、ある処置が本発明の１次治療薬などの腫瘍を実質的に破壊することが意図され且つ別の処置が抗血管新生薬の投与などの転移または腫瘍の再成長を防ぐことが意図された状況において有利であろう。しかし、抗血管新生薬は、効果的な創傷治癒を可能にするために、手術後の慎重な時間に投与しなければならない。次に、抗血管新生薬は、患者の寿命のために投与されてもよい。

本発明の免疫調節薬または放射線療法のいずれかの複数回投与が利用されることも想定される。本発明の免疫調節薬及び放射線療法は、１日置きもしくは１週置きに交互に投与されても；または、一連の放射線療法は、免疫調節薬の１回以上の投与に先行もしくは続いて行われてもよい。いずれにせよ、併用療法を達成するために、必要なことは、投与の時期に関係なく、抗腫瘍効果を発揮するのに有効な合計量で免疫調節薬及び放射線療法の両方を適用することである。

化学療法薬は、本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせと併用することができる。化学療法薬は、増殖中の腫瘍細胞を死滅させて、処置全体により生じる壊死領域を増強し得る。

本発明の一態様は、本発明の放射線療法及び免疫調節薬の組み合わせを使用して、膵癌を処置する方法を提供する。患者のがんを処置することが、非限定例として、がん細胞の死滅及び破壊、ならびに、がん細胞の増殖または細胞分裂速度の低減を含むことを、当業者は理解するであろう。また、がん細胞が、非限定例として、原発性がん細胞、がん幹細胞、または転移性がん細胞であり得ることを、当業者らは理解するであろう。

一実施形態では、本発明は、がんの放射線療法を用いて、本発明の免疫調節薬の投与前、投与と同時、または投与後に対象を処置することを含む、がんを処置する方法を提供する。種々の実施形態では、がんの１つ以上の追加療法は、本発明の免疫調節薬の投与及び放射線療法の投与の少なくとも１つの前、それと同時、またはそれの後に、対象に投与することができる。本発明の免疫調節薬及び放射線療法の組み合わせに加えて投与することができる追加療法の例としては、化学療法薬、抗増殖薬、細胞毒性／抗腫瘍薬、抗血管新生薬、及び他の抗がん薬が挙げられるが、これらに限定されない。

化学療法薬は、以下を含む、細胞障害薬（例えば、５－フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、オキソルビシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シタラビンＵＳＰ、シクロホスファミド、エストラムシンリン酸ナトリウム、アルトレタミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、インターフェロンアルファ－２ａ組み換え体、パクリタキセル、テニポシド、及びストレプトゾシ）、細胞毒性アルキル化剤（例えば、ブスルファン、クロランブシル、シクロホスファミド、メルファラン、またはエチルスルホン酸）、アルキル化剤（例えば、アサリー、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、ビスルファン、カルボキシフタラト白金、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロランブシル、クロロゾトシン、シスプラチン、クロメソン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、シクロホスファミド、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドパン、ヘプスルファム、ヒカントン、イホスファミド、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド、ナイトロジェンマスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポーフイロマイシン、スピロヒダントインマスタード、ストレプトゾトシン、テロキシロン、テトラプラチン、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、及びＹｏｓｈｉ－８６４）、有糸分裂抑制薬（例えば、アロコルヒチン、ハリコンドリンＭ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、メイタンシン、リゾキシン、パクリタキセル誘導体、パクリタキセル、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ビンブラスチン硫酸塩、及びビンクリスチン硫酸塩）、植物アルカロイド（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ、イダルビシン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ミトラマイシン、ミトマイシン、ダウノルビシン、ＶＰ－１６－２１３、ＶＭ－２６、ナベルビン、及びタキソテール）、生物製剤（例えば、アルファインターフェロン、ＢＣＧ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びインターロイキン－２）、トポイソメラーゼＩ阻害薬（例えば、カンプトテシン、カンプトテシン誘導体、及びモルホリノドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬（例えば、ミトキサントロン、アモナフィド、ｍ－ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、メノガリル、Ｎ，Ｎ－ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール、ルビダゾン、ＶＭ－２６、及びＶＰ－１６）、ならびに合成物（例えば、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ｏ，ｐ’－ＤＤＤ、ダカルバジン、ＣＣＮＵ、ＢＣＮＵ、シス－ジアンミンジクロロ白金、ミトキサントロン、ＣＢＤＣＡ、レバミゾール、ヘキサメチルメラミン、オールトランスレチノイン酸、グリアデル、及びポルフィマーナトリウム）。

抗増殖薬は、細胞の増殖を減少させる化合物である。抗増殖薬は、アルキル化薬、代謝拮抗薬、酵素、生物学的応答修飾物質、種々の薬剤、ホルモン及び拮抗薬、アンドロゲン阻害薬（例えば、フルタミド及びロイプロリド酢酸塩）、抗エストロゲン（例えば、クエン酸タモキシフェン及びそのアナログ、トレミフェン、ドロロキシフェン、及びロロキシフェン）を含む。特定の抗増殖剤のさらなる例としては、レバミソール、硝酸ガリウム、グラニセトロン、サルグラモスティムストロンチウム－８９クロリド、フィルグラスチム、ピロカルピン、デクスラゾキサン、及びオンダンセトロンが挙げられるが、これらに限定されない。

細胞毒性／抗腫瘍薬は、がん細胞を攻撃して死滅させる薬剤として定義される。一部の細胞毒性／抗腫瘍薬は、アルキル化薬であり、これは、腫瘍細胞の遺伝材料、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、及びダカバジンをアルキル化するアルキル化薬である。他の細胞毒性／抗腫瘍薬は、腫瘍細胞の代謝拮抗薬、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプイリン、アザチオプライム、及びプロカルバジンである。他の細胞毒性／抗腫瘍薬は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、及びダウノマイシンである。これらの化合物のために市販されている多くのリポソーム製剤がある。さらに他の細胞毒性／抗腫瘍薬は、有糸分裂阻害薬（ビンカアルカロイド）である。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びエトポシドを含む。種々の細胞毒性／抗腫瘍薬は、タキソール及びその誘導体、Ｌ－アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ－２６、イホスファミド、ミトキサントロン、及びビンデシンを含む。

抗血管新生薬は、当業者らに周知である。本開示の方法及び組成物で使用される好適な抗血管新生薬としては、ヒト化及びキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマー、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。血管新生の他の既知の阻害薬としては、アンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（アルファ及びベータを含む）、レチノイン酸、ならびにメタロプロテイナーゼ－１及びメタロプロテイナーゼ－２の組織阻害薬を含む。（ＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２）。抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害薬である、ラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含む小分子も使用することができる。

開示された化合物と組み合わせて使用することができる他の抗がん薬としては、以下が含まれるが、これらに限定されない：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ジメシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カーベタイマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロスタノロン；ジュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（組み換えインターロイキンＩＩ、またはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ－２ａ；インターフェロンアルファ－２ｂ；インターフェロンアルファ－ｎ１；インターフェロンアルファ－ｎ３；インターフェロンベータ－Ｉａ；インターフェロンガンマ－Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；酢酸ランレオチド；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスパー；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；アルブミン結合パクリタキセル；ペグアスパラガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴル；サフィンゴル塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストトラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；酢酸トレストン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンロイロシン；ビノレルビン；ビノレルビン酒石酸塩；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩。他の抗がん薬としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２０－エピ－１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５－エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ－ＴＫ拮抗薬；アルトレタミン；アンバムスティン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォライド；血管新生阻害薬；拮抗薬Ｄ；拮抗薬Ｇ；アンタレリックス；抗背側形態形成タンパク質－１；抗アンドロゲン薬、前立腺癌；抗エストロゲン薬；抗新生物薬；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子調節薬；アポトーシス制御因子；アプリニン酸；ａｒａ－ＣＤＰ－ＤＬ－ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗薬；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータアレチン；ベータクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害薬；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン（ｂｉｓａｚｉｒｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリア痘ＩＬ－２；カペシタビン；カルボキサミド－アミノ－トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ Ｍ３；ＣＡＲＮ ７００；軟骨由来阻害薬；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害薬（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス－ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ－５－アザシチジン；ジヒドロタキソール，９－；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲン作動薬；エストロゲン拮抗薬；エタニダゾール；エトポシドホスファート；エクセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン塩酸塩；ホルフェニメクス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害薬；ゲムシタビン；グルタチオン阻害薬；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン様成長因子１受容体阻害薬；インターフェロン作動薬；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン（ｉｏｂｅｎｇｕａｎｅ）；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４－；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン－Ｎトリアセタート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミゾール；リアロゾール；線状ポリアミンアナログ；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害薬；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害薬；ミフェプリストン；ミルテフォシン；ミリモスチム；ミスマッチの二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナフィド；ミトトキシン線維芽細胞成長因子－サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害薬；多発性腫瘍抑制１ベース治療；マスタード抗がん薬；ミカペロキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ－アセチルジナリン；Ｎ－置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチプ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン（ｎｉｓａｍｙｃｉｎ）；一酸化窒素調節薬；ニトロキシド酸化防止剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；Ｏ６－ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導物質；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペグアスパラガーゼ；ペルデシン；ペントサン多硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；パーフルブロン；ペルフォスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセタート；ホスファターゼ阻害薬；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーター阻害薬；白金錯体；白金化合物；白金－トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス－アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害薬；プロテインＡベースの免疫調節薬；プロテインキナーゼＣ阻害薬；プロテインキナーゼＣ阻害薬、微細藻類；プロテインチロシンホスファターゼ阻害薬；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害薬；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆ拮抗薬
；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬；ｒａｓ阻害薬；ｒａｓ－ＧＡＰ阻害薬；脱メチル化されたレテリプチン；レニウムＲｅ １８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツカイン（ｒｏｈｉｔｕｋｉｎｅ）；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴル；サントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ １模倣物；セムスチン；老化誘導阻害薬１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害薬；シグナル伝達調節薬；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフラン；ソブゾキサン；ボロカプチン酸ナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルフォシン酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害薬；幹細胞分裂阻害薬；スティピアミド；ストロメリシン阻害薬；スルフィノシン；超活性血管活性腸管ペプチド拮抗薬；スラディスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルロピリリウム；テロメラーゼ阻害薬；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスター；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；チマルファシン；サイモポエチン受容体作動薬；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；チタノセンビクロリド（ｔｉｔａｎｏｃｅｎｅ ｂｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害薬；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害薬；チルホスチン；ＵＢＣ阻害薬；ウベニメクス；尿生殖洞由来の成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体拮抗薬；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療；ベラレソル；ベラミン；ベルディン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンクサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；イミリムマブ（ｉｍｉｌｉｍｕｍａｂ）；ミルタザピン；ＢｒＵＯＧ ２７８；ＢｒＵＯＧ ２９２；ＲＡＤ０００１；ＣＴ－０１１；フォルフィリノックス；チピファルニブ；Ｒ１１５７７７；ＬＤＥ２２５；カルシトリオール；ＡＺＤ６２４４；ＡＭＧ ６５５；ＡＭＧ ４７９；ＢＫＭ１２０；ｍＦＯＬＦＯＸ６；ＮＣ－６００４；セツキシマブ；ＩＭ－Ｃ２２５；ＬＧＸ８１８；ＭＥＫ１６２；ＢＢＩ６０８；ＭＥＤＩ４７３６；ベムラフェニブ；イピリムマブ；イボルマブ（ｉｖｏｌｕｍａｂ）；ニボルマブ；パノビノスタット；レフルノミド；ＣＥＰ－３２４９６；アレムツズマブ；ベバシズマブ；オファツムマブ；パニツムマブ；ペムブロリズマブ；リツキシマブ；トラスツズマブ；ＳＴＡＴ３阻害薬（例えば、ＳＴＡ－２１、ＬＬＬ－３、ＬＬＬ１２、ＸＺＨ－５、Ｓ３１－２０１、ＳＦ－１０６６、ＳＦ－１０８７、ＳＴＸ－０１１９、クリプトタンシノン、クルクミン、ジフェルロイルメタン、ＦＬＬＬ１１、ＦＬＬＬ１２、ＦＬＬＬ３２、ＦＬＬＬ６２、Ｃ３、Ｃ３０、Ｃ１８８、Ｃ１８８－９、ＬＹ５、ＯＰＢ－３１１２１、ピリメタミン、ＯＰＢ－５１６０２、ＡＺＤ９１５０など）；低酸素誘導因子１（ＨＩＦ－１）阻害薬（例えば、ＬＷ６、ジゴキシン、ラウレンディテルペノール、ＰＸ－４７８、ＲＸ－００４７、ビテキシン、ＫＣ７Ｆ２、ＹＣ－１など）及びジノスタチン刺激薬。

実験例
ここで、本発明は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、単に例示目的で提供され、本発明は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。

さらなる説明なしに、当業者は、上述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を作製及び利用し、特許請求される方法を実施することができると考えられる。それ故、以下の実施例は、具体的には、本発明の好ましい実施形態を指摘し、決して開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１：体幹部定位放射線及びインターロイキン１２の併用療法は、腫瘍微小環境の複合再分極化により膵腫瘍を根絶する
この研究では、アジュバントＩＬ１２の持続送達が、ＬＡＰＣにおけるＳＢＲＴの抗腫瘍効能を亢進することが示される。本明細書に提示されるデータは、持続放出マイクロスフィア中にカプセル化されるＩＬ１２（ＩＬ１２ＭＳ）のＳＢＲＴへの腫瘍内送達が追加されると、強力な抗腫瘍活性を示し、ＰＣの前臨床同所モデルにおいて腫瘍の低減がもたらされた。併用免疫療法は、炎症性サイトカイン、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の相乗的な産生をもたらし、治療有効性は、この誘導に依存した。続く分析により、ＩＦＮγの発現がＴ制御性及び骨髄抑制細胞の免疫原性リプログラミングに必要であったことが示された。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞と抑制細胞の比の増加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の著しい増加と一致した。局所調節の範囲を超えて、ＳＢＲＴ／ＩＬ１２ ＭＳの組み合わせはまた、全身性腫瘍免疫を付与し、これは、進行転移性疾患の理論的追跡調査を提供する。

ここで、この実施例で使用される材料及び方法が説明される。

同所性腫瘍移植
イソフルラン麻酔薬気化器（Ｓｃｉｖｅｎａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、マウスを麻酔し、１０ｍｍの開腹切開を行い、脾臓及び膵臓を露出させた。細胞株を０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で分離し、１：１のＰＢＳ：マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液に再懸濁させた。５，０００の細胞（１００□）を膵尾に注射し、ＳＢＲＴターゲティングを補助する２つの４ｍｍのチタン基準マーカー（Ｈｏｒｉｚｏｎ）を腫瘍のバブルに隣接して移植した。腫瘍細胞注射の直後の１分間、腹膜漏出を防ぐために、綿棒を注射部位の上に置いた。ＩＶＩＳの生物発光イメージングにより、腹膜播種のない移植の成功を確認し、前処置群を標準化するためのベースライン測定が提供された。

放射線
５ｍｍのコリメータを備えた小動物放射線研究プラットフォーム（ＳＡＲＲＰ、ＸＳｔｒａｈｌ）を使用して、全ての放射線を照射した。全ての放射線治療中に、気化イソフルランで、マウスを麻酔した。腫瘍組織の場合３６及び正常組織の場合５０の生物学的に有効な線量（ＢＥＤ）を生じる従来の放射線療法（ＣｏｎＲＴ）を受けた担腫瘍マウスを１５分割、２Ｇｙで照射した（ａ／ｂ比の１０／３腫瘍／正常組織）。移植後の６～９日目の４分割で６Ｇｙの放射線のスケジュール後に、体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）を担腫瘍マウスに投与し、腫瘍組織の場合３８．４及び正常組織の場合７２のＢＥＤが生じた。上述のチタン基準マーカーを使用して、局所送達を目標とし；マーカーを、処置前コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンで視覚化した。主要な臓器を回避するように設計されたビーム角を使用して、照射回転中心を配置した。それぞれの場合では、腫瘍への全ての線量付与及び周囲の器官（例えば、肝臓）への無視できる量を確認するために、線量体積ヒストグラム（ＤＶＨ）を生成した。

生物発光イメージング
ＩＶＩＳスペクトルイメージングシステム（ＩＶＩＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長を測定した。マウスに、気化イソフルランを麻酔し、１００μｌのＰＢＳビヒクル中にＤ－ルシフェリン（２．５ｍｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を皮下注射した。右側臥位で、２分間隔で２４分間一連の画像を撮影し、光子放出を収集した。腫瘍上に手動で配置された、マッチング（円形の）目的領域（ＲＯＩ）内で、生物発光（ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ^２／ｓｒ）を計算した。シグナル減衰を示す２回の連続測定で、各腫瘍のピーク強度を記録した。

免疫組織化学
ネオアジュバント介入の１０～１４日後に、全てのＳＢＲＴ処置標本を得た。１０％の中性緩衝ホルマリンでヒトＰＤＡＣ組織試料を固定し、処理し、切片化した。ＩＨＣ分析では、抗ＣＤ８（Ｃ８／１４４Ｂ、１：１００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＳ－４５７－５１）、及び抗ＣＤ６８（ＫＰ１、１：２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＳ－３９７－ＰＯ）抗体を用いて、連続切片を４℃で一晩染色した。検出するためにポリマー系システムを使用した（ＧＢＩ広域スペクトルＰｏｌｉｎｋ ２ Ｐｌｕｓ（ＧＢＩ Ｄ２２）、ＤＡＢ色原体（ＧＢＩ ＣＯ２－１２）インキュベーション）。メイヤーのヘマトキシリンを用いて、スライドを対比染色した。汎用陰性対照液（Ｅｎｚｏ ＡＤＩ－９５０－２３１－００２５）を使用した同一の組織切片の染色は全く存在しなかった。組織切片全体を２０×倍率でデジタル化し、登録した。以下の通り、目的領域を認可された病理医が規定した（盲検）：「マージン」－腫瘍／間質界面の手で描かれた線の内側及び外側の５００μｍにより規定された領域；「中心」－侵襲性の前部、粘膜表面、または組織の端の内側の１０００μｍで規定される領域。組織喪失／人為的結果の領域を分析から除外した。ランダムフォレスト分類を使用して、イベントの数を列挙し、マージン指数（マージン：中央の比）を個別に各場合の全ＲＯＩについて計算した。

マイクロスフェア注射
位相反転現象を使用して、ポリ乳酸マイクロスフェアを生成した。腫瘍内送達の前に、凍結乾燥したマイクロスフェアをＰＢＳ（マウス１匹当たり２０μｌ）に再懸濁させた。最終ＳＢＲＴ分割（１０日目）の２４時間後に、マウスに気化イソフルランを麻酔し、１０ｍｍの開腹切開を行って、膵腫瘍を露出させた。１８ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して、Ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照（２ｍｇのビーズ）またはＩＬ １２ ＭＳ（０．５μｇの組み換えＩＬ１２を含有する２ｍｇのビーズ）を腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。

ＴＣＧＡ分析
ＨＴＳｅｑワークフローの膵臓腺癌遺伝子発現データセット（ＦＰＫＭ、正規化された上位四分位）を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データポータルからダウンロードした。ノンパラメトリックＳｐｅａｒｍａｎ相関を使用して、データセット間でＲ^２値を計算した。ヒートマップ表現の場合、データ値を各遺伝子セット内の発現の中央値に正規化した。各細胞は、データセット内の３つの隣接値の平均を表す。

Ｌｕｍｉｎｅｘ分析物アッセイ
死亡させた後、組織ホモジナイザーを用いて、１ｘのＨａｌｔプロテアーゼ阻害薬カクテル及び１ｘのＨａｌｔホスファターゼ阻害薬カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する０．５ｘの細胞溶解緩衝液２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＢＳで希釈）１００μｌ中で、マウス腫瘍を分離した。穏やかに撹拌しながら、組織を室温で３０分間溶解させた。マウスプレミックスサイトカイン／ケモカインマルチアナライトキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、磁気ルミネックスアッセイを実施した。製造業者の指示に従って、アッセイ手順を実施した。マイクロプレートをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ２００システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で実行して、２０％未満の凝集体で標的毎に５０～１００のビーズを収集した。製造元の指示に従って残りの溶解物に対して、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を実施した。ｐｇ／ｍｇタンパク質値への分析物の正規化に、各試料の総タンパク質濃度を使用した。

フローサイトメトリー
死亡させた後に、マウスの腫瘍を機械的に分離し、続いて、３０％のコラゲナーゼで消化した（３０分、３７℃、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。次に、ホモジネートを４０μＭのフィルターに通し、約１×１０^６の細胞／反応で、細胞をＰＡＢ（１ＬのＰＢＳ、１ｇのアジ化ナトリウム、１０ｇＢＳＡ）中に再懸濁させた。以下のコンジュゲート抗体を染色に使用した：ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗マウスＣＤ４５（３０－Ｆ１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｅｆｌｕｏｒ抗マウスＣｄ８（５３－６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ／Ｃｙ７抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＥ／ＣＦ５９４抗マウスＮＫ１．１（ＰＫ１３６、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ）、ＰＥ／Ｃｙ７抗マウスＣＤ２７９（ＲＭＰ１－３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ｅｆｌｕｏｒ抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＣ／Ｃｙ７抗マウスＬｙ－６Ｃ（ＡＬ－２１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ブリリアントバイオレット６０５抗マウスＬｙ－６Ｇ（１Ａ８、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ）、ＡＰＣ抗マウスＦ４８０（ＢＭ８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ抗マウスＩＡ／ＩＥ（Ｍ５／１１４．１５．２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＡＰＣ抗マウス／ラットＦｏｘＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＰＥ抗マウスＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。細胞表面抗原を、暗所、４℃で３０分間染色した。次に、試料をＰＡＢで洗浄し、製造者の使用説明書に従い、ＦＯＸＰ３固定／透過化処理キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して一晩固定した。翌日、細胞をＦＯＸＰ３透過化処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で洗浄し、細胞内標的について、暗所、４℃で３０分間染色した。細胞内活性化マーカーに対して、ＦＭＯ対照を利用した。細胞を洗浄し、ＰＡＢに再懸濁させ、ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行した。５０～１００，０００イベント／試料を収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用して分析した。イメージングフローサイトメトリーについても、同じ手順に従い、試料をＡｍｎｉｓ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｒｅａｍ ＧｅｎＸ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で実行した。

ＲＮＡ－Ｓｅｑ
死亡させた後に、２匹のマウス腫瘍を処置群毎にプールした。組織を機械的に分離し、続いて、３０％のコラゲナーゼで消化した（３０分、３７℃、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。ホモジネートを４０μｍのフィルターに通過させ、細胞をＰＡＢ（１ＬのＰＢＳ、１ｇのアジ化ナトリウム、１０ｇのＢＳＡ）に再懸濁させた。各処置群からの２ｘ１０^６～４ｘ１０^６の細胞を、細胞表面抗原について、暗所、４℃で３０分間染色した。１００μｍのノズルを使用するＦＡＣＳＡｒｉａＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＩＭ、及びＴＡＭ集団をソートした。直ちに、細胞を緩衝ＲＬＴ（β－メルカプトエタノールを含有する）に溶解させ、ＱＩＡＳｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムで均質化し、製造者の使用説明書に従い、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡを精製した。ＲＮＡシーケンシング及び解析を実施した。Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ＲＮＡの品質を評価し、解析された全ての試料は、５を超えるＲＮＡ完全性値を示した。製造業者の説明書に従い、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ試料調製キットＶ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ＣＤＮＡライブラリーを作成し、シーケンシングをＩｌｌｕｍｉｎａ高スループットＨｉＳｅｑＴＭ２５００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で実施した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析（ＩＰＡ）ソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、未照射＋ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する処置群で差次的に発現した遺伝子を解析した。

骨髄移植
１１日目に死亡させた後、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍を採取し、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析に使用された手順に従ってフローソーティングの準備をした。１０％のウシ胎児血清が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ－１２に、１００μｍのノズルを使用するＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、ＩＭ及びＴＡＭ集団を選別した。ソートされたＩＭ及びＴＡＭを計算し、それぞれ１：１：２の比で、新たに培養したＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞と共にプールした。１：１のＰＢＳ：マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液に細胞混合物を再懸濁させ、標準的同所移植手順に従って、１００，０００細胞（５０μｌ）をナイーブマウスの膵尾に注射した。さらなる処置を投与せず、ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、腫瘍の増生を測定した。

抗体の枯渇
０日目のＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍移植後に、２００μｇの枯渇している抗体（ＰＢＳ中１００μＬに再懸濁）をマウスに５～２０日目で３日毎に皮下注射した（６回投与）。送達された抗体（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）は、ラットアイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ、Ｃ１．１８．４）、ラット抗マウスＣＤ８ａ（ＩｇＧ２ａ、５３－６．７）、及びラット抗マウスＣＤ４（ＩｇＧ２ａ、ＧＫ１．５）であった。

半脾臓腫瘍の移植
最初の同所性腫瘍移植の約６ヶ月後に、原発性ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍が治癒したマウスをリチャレンジした。脾臓を露出させるために、１０ｍｍの開腹切開前に、気化イソフルランを使用してマウスを麻酔した。６ｍｍのチタンクリップ（Ｈｏｒｉｚｏｎ）を肝門脈に隣接して配置し、片側切断を結紮間で行った。ＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞を、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡで分離させ、ＰＢＳ中に再懸濁させ、単一細胞懸濁液を達成するために、４０μｍのフィルターに通した。肝門脈に結合している半脾臓セグメントに、５ｘ１０^５の細胞（１００μＬのＰＢＳ中）を１分間かけて徐々に注射した。移植後、第３のチタンクリップを使用して、脾臓に直接隣接する肝門脈を結紮し、注射された脾臓セグメントを切除し、遠位の脈管構造を焼灼した。生物発光イメージングのために、マウスを、仰臥位にして置いた。

Ｔ細胞移植
１次同所移植及び半脾臓リチャレンジ後に腫瘍量の所見がないマウスを、最初の腫瘍チャレンジの約９ヶ月後に死亡させた。加えて、対照用の５匹の同齢の腫瘍ナイーブマウスも死亡させた。脾臓ならびに排液、腋窩、鼠径部、及び腸骨のリンパ節を採取し、機械的に分離した。製造者の使用説明書に従って、ＥａｓｙＳｅｐマウスＣＤ８＋Ｔ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、負の選択によりＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。ドナー毎に５×１０^７の細胞の投入で、ドナー毎に約４×１０^６のＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を１００ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍移植の１６時間前に、尾静脈注射によりレシピエントマウスに送達した（１：１のドナー：レシピエントの移行）。ＩＶＩＳ腫瘍量の測定を使用して、免疫学的記憶（腫瘍体積の減少が１０倍以上）の移行を分類し、４０日目の盲検手動触診を使用して、完全な免疫記憶（識別不能な腫瘍）を確認した。

アブスコパル研究
０日目の標準的なＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所移植に加えて、５０，０００の細胞（１００μＬのＰＢＳに懸濁させた）または５ｘ１０^５の細胞（１００μＬのＰＢＳに懸濁させた）を左後肢に筋肉内注射するか、または半脾臓手法を使用して肝臓内に播種した。ＳＢＲＴターゲティングとの干渉を防ぐために、脾臓及び門脈の結紮にＶｉｃｒｙｌ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用した。原発性膵腫瘍のＳＢＲＴ処置後に、線量体積ヒストグラムを生成して、２次の脚または肝腫瘍に波及することなく、原発性腫瘍への全ての線量付与を確認した。ＩＶＩＳイメージングでは、マウスに２．５ｍｇのＤ－ルシフェリン（１００μＬのＰＢＳ中）をｓ．ｃ．投与し、原発性腫瘍及び続発性腫瘍の両方のＲＯＩを別々の生物発光測定に対して指定した。デジタルノギスを使用して、２つの垂直寸法で脚の腫瘍の直径を測定し、以下の式を使用して、体積を計算した：ｄ１ｘｄ２^２ｘ０．５２。盲検化ノギス測定を使用して、腫瘍のないマウスを特定した。

定量化及び統計分析
プリズム７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を、全ての統計分析のために使用し、０．０５未満のｐ値を有意とみなした。ノンパラメトリックなＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、ＣｏｎＲＴ／ＳＢＲＴ比較及び細胞枯渇実験の生物発光腫瘍成長曲線を比較した。一元ＡＮＯＶＡ（Ｄｕｎｎの多重比較検定）を使用して、他の全ての腫瘍成長アッセイを各時点で分析した。生存分析では、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定を使用して、有意性を評価した。ＩＨＣ分析では、独立したｔ検定を使用して、未処置の腫瘍とＳＢＲＴで処置された腫瘍の平均値を比較した。Ｌａｅｖｅｎｅの検定を使用して、分散の同等性を評価した。二元ＡＮＯＶＡ（Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ多重比較検定）を使用して、多時点の腫瘍重量及びサイトカインプロファイリング測定の統計分析を実施した。ＦｌｏｗＪｏ １０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用して、全てのフローサイトメトリーゲーティングを行った。一元ＡＮＯＶＡ統計分析を使用して、フローサイトメトリーによる細胞密度及び幾何平均強度測定の有意性を評価した。全てのＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現遺伝子解析のために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。全ての概略図を、ＢｉｏＲｅｎｄｅｒで作成した。

ここで、この例の結果が記載される。

ＳＢＲＴは、ヒトＰＤＡ腫瘍の中心にＣＤ８ Ｔ細胞を動員し、ｃｏｎＲＴよりも優れている。
ヒトＰＤＡにおけるＳＢＲＴに対する免疫応答を評価するために、ネオアジュバントＳＢＲＴの１０～１４日後に切除された腫瘍に対して、免疫組織化学を実施した（５グレイ［Ｇｙ］連続３ ５日）。分析された全ての組織は、ＳＢＲＴのみの介入前に切除可能及び処置経験なしと診断された。Ｈ＆Ｅ染色を使用して、各腫瘍の中心及びマージンの境界を定めた。未照射（ＵＩ）腫瘍の免疫組織化学的分析は、病変中心にＣＤ８Ｔ細胞がほとんどなく、マージンに多数が捕捉されていることが示された（図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｅ）。重要なことに、ＳＢＲＴ処置は、中心：マージン細胞比の著しい増加（図１Ｆ）により示されるように、中心腫瘍領域へのＣＤ８ Ｔ細胞のより大きな浸潤をもたらした（図１Ｃ、１Ｄ、及び１Ｅ）。ＣＤ６８^＋骨髄細胞の評価は、中心：マージンの定量化時に、非照射群（図１Ｇ、１Ｈ、及び１Ｋ）ならびにＳＢＲＴ処置群（図１Ｉ、１Ｊ、及び１Ｋ）の両方で、腫瘍のマージン及び中心全体に免疫抑制性骨髄集団が均一に分布していることを示した（図１Ｌ）。ＳＢＲＴが、ＰＤＡ腫瘍全体に抗腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞の均一な分散をもたらすが、処置が、免疫抑制ＣＤ６８^＋細胞の分布を排除または変更しないことを、これらの臨床データは示唆する。

化学療法及び従来の放射線療法を含む標準治療のＰＣ療法は、局所進行病変を縮小化可能であることはめったにないが、ＳＢＲＴは、ＬＡＰＣ患者のｃｏｎＲＴよりも優れた全生存期間と関連している（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ，１２３（１８）：３４８６－３４９３）。ＳＢＲＴ及びｃｏｎＲＴのスケジュールを前臨床的に比較するために、ＰＣの同所性マウスモデルを利用した。ルシフェラーゼ（ＫＣＫＯ－ｌｕｃ）で形質転換されたＫＣ細胞株の誘導体（Ｐ４８－Ｃｒｅ；ＬＳＬ－Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ）を、６日目の放射線療法の開始前に移植した（０日目）。移植中に腫瘍の両側に挿入された２つの基準金属クリップを使用して、放射性同等の線量のＳＢＲＴ（６Ｇｙ×４日）及びｃｏｎＲＴ（２Ｇｙ×１５日）を膵腫瘍にターゲティングした。ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用した腫瘍生物発光の測定により、従来と比較してＳＢＲＴスケジューリングで腫瘍量の大幅な減少が確認され、３０日目に有意に達した（図１Ｍ）。さらに、ＳＢＲＴ処置群は最大の延命効果を示し、２／５匹のマウスが長期生存者（１２０日以上）になった（図１Ｎ）。これらのデータは、ＰＣ腫瘍量の低減において、ＳＢＲＴがｃｏｎＲＴよりも効果的であるという臨床的見解を支持する。

ＳＢＲＴ及びＩＬ１２ ＭＳ療法を組み合わせると、堅牢で安定した抗腫瘍応答が得られる。
ＰＣにおけるネオアジュバントＳＢＲＴの近年の臨床調査は、適度に効果的なダウンステージングを示しており、ＳＢＲＴ後の免疫学的に多様な浸潤の観察により、免疫療法との相乗効果のための手段が示唆される。ＳＢＲＴの多面発現性炎症性サイトカインＩＬ１２との組み合わせを試験するために、膵癌の前臨床マウスモデルで研究を実施した。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内でのＩＬ１２の安定性の増加及び送達の延長のために、サイトカインを、ポリ乳酸マイクロスフェア（ＭＳ）に封入した。同所ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍を、ＳＡＲＲＰで局所的に照射されたＳＢＲＴの臨床的に適切なスケジュール（６Ｇｙで３ ４日）で処置した。ＭＳ（ＩＬ－１２またはｅｍｐｔｙ）を、ＳＢＲＴの２４時間後に腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した（図２Ａ）（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，１４３，２１１号）。ＡＦ５９４蛍光標識ＭＳを使用して、この注射方策がＭＳの腫瘍内隔離をもたらすが、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射（ＭＳの「漏出」をシミュレートするために使用された）は、腹膜骨髄の飲み込み及び続く血流への輸送をもたらすことが示された（図３Ａ及び３Ｂ）。さらに、遊離ＡＦ５９４ ＭＳは、ｉ．ｔ．注射後の血漿中で検出されず、手順中にＭＳの波及効果がないことが示された（図３Ｃ及び３Ｄ）。ＭＳのｉ．ｔ．投与が、治療の局所保持をもたらすと結論付けられた。

ＫＣＫＯ－ｌｕｃマウスモデルでは、ＳＢＲＴ及びＩＬ１２ ＭＳ処置後のみに、腫瘍量の適度な低減が観察された（図４及び図５）。注目すべきことに、ＳＢＲＴ＋ＩＬ１２ ＭＳの組み合わせは、移植後２０日目までに腫瘍を根絶し、病変は、６０日目に測定が終了するまで、ＩＶＩＳ生物発光イメージングでは検出できなかった（図２Ｂ及び図４Ａ）。１１日目の腫瘍の組織学的分析は、これらの抗腫瘍効果を補強し、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ群における顕著な細胞死及び圧倒的な免疫浸潤の領域を示す（図４Ｂ～４Ｅ）。ＳＢＲＴ単独での処置は、全生存期間を延長させ、２０％が１２０日を超える長期生存率を示したが、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置は、１００％のマウスが長期生存を達成するという大きな利益をもたらした（図２Ｃ）。他のＰＣモデル全体に、これらの結果を一般化するために、化学的に誘導され放射線耐性のある細胞株であるＰａｎ０２－ｌｕｃモデルで、分析を繰り返した。ＫＣＫＯ－ｌｕｃ担腫瘍マウスと同様に、ＩＬ－１２ ＭＳ送達単独は、腫瘍量がわずかに低減しただけであった。興味深いことに、併用療法は、腫瘍量の著しい減少及び生存率の増加の両方により表されるように、強力な単剤療法応答がない場合でも、相乗的な抗腫瘍効果を維持した（それぞれ図２Ｄ及び２Ｅ）。さらに、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置Ｐａｎ０２－ｌｕｃマウスの１０％が長期生存をもたらした。

ＫＰＣ遺伝子操作マウスモデル（ＧＥＭＭ）（Ｐ４８－Ｃｒｅ；ＬＳＬ－Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；Ｔｐ５３^Ｌ／Ｌ）で、調査を拡大した。顕著な病変の発生後６～８週齢のＫＰＣマウスを、処置に登録した。この実験で使用された全てのマウスは、基準マーカーの配置時に同様の腫瘍体積測定値を示した（図４Ｆ）。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳは、どちらの処置も単独ではなく、全生存期間を著しく増加させ、未処置の対照のほぼ３倍の生存率を示した（図２Ｆ）。１１日目のＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置された腫瘍（ＩＬ－１２ ＭＳの４日後）の組織学的分析により、未治療の対照と比較して、顕著な細胞死及び免疫浸潤の領域が明らかになった（それぞれ、図４Ｇ及び４Ｈ）。注目すべきことに、このモデルは、全てのＰ４８発現膵管細胞の悪性形質転換をもたらし、治癒の可能性を排除する。そうであっても、１匹のＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたマウスは、著しい延命効果を得、剖検時に、前処置腫瘍塊の多くが消失し、脾腫を示していることが判明し、強力な抗腫瘍免疫応答の向上が示された（図４Ｉ）。総合すると、これらの結果は、複数の前臨床ＰＤＡモデルで延命効果を誘発するＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法の一般化可能な抗腫瘍能力を示す。

ＳＢＲＴ／ＩＬ１２ ＭＳの治療有効性は、ＩＦＮγ機能に依存する。
ＩＬ１２の炎症誘発性の生物学的効果の多くは、ＩＦＮγにより媒介される。ＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所モデルでのＩＬ－１２ ＭＳ処置後に、腫瘍内ＩＦＮγの量をアッセイした。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ投与後の腫瘍のＬｕｍｉｎｅｘサイトカイン分析により、ＭＳ送達後に最大２４時間（１１日目）及び４８時間（１２日目）に対し、併用処置群のみで、それぞれＩＬ－１２及びＩＦＮγタンパク質の大幅な誘導が明らかになった。興味深いことに、最高レベルのＩＦＮγ産生は、処置後最初の２４時間（１１日目）以内に観察された。ＣＸＣＬ１０レベルの同時分析は、ＩＦＮγの結果を補強した（図５Ａ）。さらに、１１日目の腫瘍のフローサイトメトリー分析により、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置群におけるＩＦＮγ陽性ＣＤ４５＋免疫細胞（図５Ｂ）及びＣＤ４Ｔ細胞（図５Ｃ）のパーセントの大幅な増加が確認された。

ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ治療効果が、ＩＦＮγシグナル伝達に依存していたかどうかを判定するために、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍をＩＦＮγヌル、Ｉｆｎｇ^{ｔｍ１Ｔｓ}（Ｉｆｎｇ^－／－）マウスに移植した。予想通り、ＩＶＩＳの成長及び全生存期間の測定値は、サイトカインの消失時にベースラインの腫瘍成長が全体的に増加することを示した。ＩＦＮγの欠失はまた、ＩＬ１２ ＭＳ治療応答の完全な軽減をもたらした（図２Ｂ及び図２Ｃと比較した図５Ｄ及び図５Ｅ）。全体として、これらのデータは、ＳＢＲＴ／ＩＬ１２ ＭＳ処置がＩＦＮγの強力な腫瘍内産生に治療的に依存することを示す。

ＰＣ骨髄集団は、ＳＢＲＴ／ＩＬ１２ ＭＳ処置により前炎症性Ｍ１表現型に分極する。
放射線療法は、処置後数日で腫瘍内免疫抑制骨髄集団を増強することができる（Ｗａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ，１０：１７５８８３４０１７７４２５７５；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，７，８６５２２－８６５３５）。骨髄抑制因子の動員に対するＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの効果を評価するために、１１日目のＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍でフローサイトメトリーを実施した。分析により、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋Ｌｙ６Ｇ^－ＩＭ、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｍｏｄＬｙ６Ｇ^－Ｆ４８０^＋ＴＡＭ、及びＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｍｏｄＬｙ６Ｇ^＋腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）のＳＢＲＴ依存性の増加が明らかになった。これらの応答はまた、ＩＬ－１２ ＭＳ処置単独またはＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳによりも一般に影響を受けなかった（図６Ａ、６Ｂ、左パネル、及び７Ａ）。１４日目の時点から情報を引き出すと、ＩＭに対する同様の処置効果が明らかになったが、興味深いことに、ＳＢＲＴに依存するＴＡＭの増加は、ＩＬ－１２ ＭＳの追加により無効になることが判明した（図６Ｂ、右パネル）。

ＳＢＲＴ／ＩＬ１２ ＭＳ処置時に腫瘍内ＩＦＮγタンパク質レベルの強力な増加が観察されており、ＫＣＫＯ－ｌｕｃモデルにおける炎症性単球及び／または腫瘍関連マクロファージのリプログラミングの所見を調査した。１１日目のフローサイトメトリー分析は、ＩＬ－１２ ＭＳ及びＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置時にＭＨＣＩＩ^＋ＩＭのパーセンテージが著しく増加することを示し、リプログラミングが示された（図６Ｃ、左パネル）。ＩＦＮγ^－／－バックグラウンドでの繰り返し分析により、骨髄免疫細胞のこの増加がＩＦＮγ非依存性であることが確認された（図６Ｃ、右パネル）。循環ＩＭから生じるＴＡＭは、ほぼ排他的にＭＨＣＩＩ＋であり、ＭＨＣＩＩ発現の低減は、腫瘍の進行を促進することが示されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４７：５９７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２：４３）。ＳＢＲＴは、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍におけるＭＨＣＩＩ＋ＴＡＭのパーセンテージを低減させることが判明したが、ＩＬ－１２ ＭＳの追加は、ＭＨＣＩＩ＋表現型を救出した（図７Ｂ）。

骨髄のリプログラミングをさらに確認するために、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍から選別されたＩＭ及びＴＡＭ集団に、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を実施した。差次的に発現した遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析（ＤＥＧ；未照射／ｅｍｐｔｙ ＭＳに対し；＿１．５＜ｚ＜１．５）により、両方の集団にわたって免疫抑制パスウェイ（スフィンゴシン－１、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体、トロンビン、及びＳＴＡＴ３）の下方制御を伴う活性化パスウェイ（エイコサノイド及び誘導性一酸化窒素シンターゼ［ｉＮＯＳ］）の上方制御が示された（Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｄｖ Ｂｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ，５４：９９－１１０；ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５：３２３－３５０；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ，２６（１０）：２２４９－２２５８；Ｂａｒｂｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ，９９（２）：２８９－２９９；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＰｌｏＳ ｏｎｅ，１０（９）：ｅ０１３８７４８；Ｍｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，１７（４）：４２８－３８）。興味深いことに、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置単独が、グリコシス（活性化促進、上方制御）及びコレステロールの生合成（抑制促進、下方制御）を含むＩＭの代謝パスウェイの差次的な調節をもたらした（図７Ｃ）（Ｆｒｅｅｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８９（１１）：７８８４－７８９６；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，５６（１２）：２３３７－２３４７）。ＩＭ及びＴＡＭの両方で、ＩＦＮγの活性化は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置時の差次的発現の上流の制御因子として同定された（表１及び表２）。

表１：ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳへの腫瘍内炎症性単球応答の上位の上流制御因子
ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を１１日目に採取し、単一細胞懸濁液に消化した。溶解物をフローソートして、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析用にＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋Ｌｙ６Ｇ^－ ＩＭを単離した。３処置群のそれぞれを未照射＋ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照と比較するＩｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析を使用して、差次的に発現した遺伝子（非照射＋ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を解析した（ｎ＝３）。差次的に発現したパスウェイの上位の活性化及び阻害された上流制御因子（１０～２０未満の重複のｐ値）が表される。１回の実験を表す。

表２：ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ＭＳへの腫瘍内腫瘍関連マクロファージ応答の上位の上流制御因子
ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を１１日目に採取し、単一細胞懸濁液に消化した。溶解物をフローソートして、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析用にＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ－Ｌｙ６Ｇ－Ｆ４８０＋ＴＡＭを単離した。３処置群のそれぞれを未照射＋ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照と比較するＩｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析を使用して、差次的に発現した遺伝子（未照射＋ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を解析した（ｎ＝３）。差次的に発現したパスウェイの上位の活性化及び阻害された上流制御因子（１０～２０未満の重複のｐ値）が表される。１回の実験を表す。

Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＭＳｉｇＤＢ：ＧＳＥ５０９９）により提供されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓデータベース（ＭＳｉｇＤＢ）の免疫遺伝子セットを使用して、ＤＥＧ（｜ｌｏｇ_２［倍数変化］｜＞０．５対未照射／ｅｍｐｔｙ ＭＳ；ｐ＜０．０５）を単球、Ｍ１、及びＭ２マクロファージのサブセットに分けることにより、発現パターンを個々の遺伝子レベルで解析した。この分類方策を使用して、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置後に、Ｍ２様遺伝子（ＩＭ：単球／Ｍ２＝９遺伝子、単球／Ｍ１＝４遺伝子；ＴＡＭ：Ｍ２＝４、Ｍ１＝１）の優勢な下方制御に加えて、両方の骨髄細胞型（ＩＭ：単球／Ｍ１＝３１、単球／Ｍ２＝７；ＴＡＭ：Ｍ１＝１３、Ｍ２＝３）において、Ｍ１スキュー遺伝子の上方制御を特定した（それぞれ、図６Ｄ及び６Ｅ）。ＳＢＲＴまたはＩＬ－１２ ＭＳを用いる単独療法の処置は、ＩＭまたはＴＡＭにおいて、同等レベルの差次的遺伝子発現を活性化するには不十分であった（図８Ａ～８Ｄ）。

ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍に対する骨髄分極化の機能的影響を評価するために、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置された集団のＩＭ／ＴＡＭ移植を実施した（図６Ｆ）。簡単に言うと、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍からＩＭＳ及びＴＡＭを選別し、新たに培養ＫＣＫＯ－ｌｕｃ細胞と一緒にプールした。各ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置群の細胞混合物を、さらなる処置を受けていないナイーブ宿主に同所移植した。対照のＫＣＫＯ－ｌｕｃのみの腫瘍と比較して、未処置のＩＭ／ＴＡＭプールの追加は、相対的な腫瘍成長の有意な増加を促進し、骨髄抑制因子の十分に裏付けられた腫瘍能力が示される。逆に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＩＭ／ＴＡＭプールの移植は、腫瘍の増生を著しく抑制した（図６Ｇ）。全体として、これらの結果は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置が、腫瘍内骨髄性コンパートメントの活性化された抗腫瘍状態への度重なる腫瘍内再分極化を誘発することを示す。

抗腫瘍Ｔ細胞の比率を高めるＩＦＮγの産生が必要である。
ＳＢＲＴ療法後にＴ細胞浸潤が増加するというヒトＰＤＡＣの結果を検証するために（図１）、リンパ系マーカーパネルを使用してＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍に対して、フローサイトメトリー分析を実施した（図９Ａ）。１１日目の腫瘍の分析は、ＳＢＲＴ及びＳＢＲＴ／ＩＬ－１２処置後のＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージのわずかな増加を示したが、１４日目までに、ＳＢＲＴ依存性のＣＤ８の増加がより顕著になり、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ群で有意に達した（図９Ｂ、上パネル）。ＣＤ４ Ｔ細胞は、１１日目のＳＢＲＴ処置により著しく増加し、興味深いことに、ＩＬ－１２ ＭＳの添加により効果が無効になった。逆に、１４日目までに、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの組み合わせにより、ＣＤ４区画の有意な増加が誘発された（図９Ｂ、下パネル）。Ｂ、ナチュラルキラー（ＮＫ）、及びＣＤ８^＋ＮＫ１．１^＋細胞を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び他のリンパ球系統は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの処置後に、不変または減少していることが判明した（図１０Ｂ～１０Ｄ）。

Ｍ１／Ｍ２パラダイムと同様に、ＩＦＮγは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に炎症誘発性Ｔヘルパー１型（Ｔ_ｈ１）プログラムを引き起こさせる（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３０（５）：６４６－６５５）。１１日目に腫瘍内ＣＤ４＋Ｔ細胞の炎症状態を評価するために、Ｔ_ｒｅｇ転写因子Ｆｏｘｐ３の染色を実施し、ＳＢＲＴ処置を用いて、ＣＤ４＋／Ｆｏｘｐ３＋Ｔ_ｒｅｇ細胞において顕著な増加が観察された。興味深いことに、ＩＬ１２ ＭＳの添加により、Ｔ_ｒｅｇ細胞のパーセンテージの低減がもたらされ、ＩＦＮγ^－／－マウスにおいてこの実験を繰り返すと、炎症性サイトカインに対するこの効果の依存性が確認された（図９Ｃ、上パネル）。興味深いことに、１４日目のＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍の分析は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置を用いて、Ｔｒｅｇ細胞の顕著なリバウンドを示し、ＣＤ４のリプログラミングが一過性のイベントであることが示された（図１１Ｅ）。ＣＤ８ Ｔ細胞及びＴ_ｒｅｇ細胞の分布を組み合わせて、活性化Ｔ細胞の比率を評価すると、ＣＤ８／Ｔ_ｒｅｇ比率の大幅な増加がＳＢＲＴ／ＩＬ１２ ＭＳ処置群のみで観察され、これは、さらにＩＦＮγ^－／－宿主バックグラウンドでは消失した（図９Ｃ、下パネル）。ＳＢＲＴ及びＩＬ－１２ ＭＳ処置が、末梢からＴ細胞を動員し、続いて、免疫抑制制御プログラミングを排除することにより、ＫＣＫＯ腫瘍の免疫原性Ｔ細胞の比率を協調的に増加させることを、これらの結果は示唆する。

ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法の殺腫瘍効果は、活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞に依存する。
ＣＤ８ Ｔ細胞及び／またはＣＤ４ Ｔ_ｈ１細胞が治療有効性のために必要であったかどうかを判定するために、ＫＣＫＯｌｕｃ腫瘍のＳＢＲＴ処置の１日前（５日目）に、ＣＤ８枯渇抗体またはＣＤ４枯渇抗体を投与し、３日毎に２週間、投与を繰り返した。驚くべきことに、ＩＶＩＳ生物発光イメージングは、ＣＤ８^＋枯渇に対する抗腫瘍効果の完全な無効化を示したが、ＣＤ４^＋枯渇は、効果を示さなかった（図９Ｄ）。ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化状態を評価するために、１１日目のＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍のフローサイトメトリー及びＬｕｍｉｎｅｘ分析を実施した。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ後、ＣＤ４４活性化マーカーの発現の上方制御が観察され、脱顆粒ＣＤ１０７ａ＋細胞のパーセンテージが高くなった（それぞれ、図１２Ａ、左端及び左中央のパネル）。ＣＤ１０７ａの脱顆粒の増加を補強するものとして、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）の腫瘍内レベルの上昇がＳＢＲＴ及びＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ群で観察された（図１２Ｂ）。ＣＤ８ Ｔ細胞は、細胞１個当たりの消耗マーカーＣＴＬＡ４及びＰＤ１のレベルの増加を示さなかったが、これらのマーカーを発現する細胞のパーセンテージが高く、活性化されるが枯渇しないＣＤ８ Ｔ細胞の総数が多いことが示唆された（それぞれ、図１２Ａ、右中央及び右端のパネル）。

ＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍モデルにおけるＴ細胞活性化状態をさらに評価するために、４つの実験群のそれぞれから選別されたＣＤ８細胞において、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。ＤＥＧのＩｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析（未照射／ｅｍｐｔｙ ＭＳに対する；－１．５＜ｚ＜１．５）により、ＩＬ－１２ ＭＳ及びＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ群におけるＧ２／Ｍチェックポイント調節の不活性化と一緒に、Ｓ期への移行及びサイクリン調節を含む増殖機能の活性化が同定された。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ群は、タンパク質翻訳（ｔＲＮＡ帯電及びピリドキサール５０リン酸サルベージ）ならびにヌクレオチド生合成パスウェイ（ピリミジンサルベージ及びピリミジンデノボ生合成）の上方制御を示し、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のクローン拡大及びエフェクター及び記憶分化に最重要である。（図１２Ｃ）（Ｑｕｅｍｅｎｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７３（８）：４９４５－４９５２）。個々の遺伝子レベルで、ＭＳｉｇＤＢ（ＭＳｉｇＤＢ：ＧＳＥ１０００００２）を使用して、差次的な発現物質（｜ｌｏｇ２［倍数変化］｜＞０．５対未照射／ｅｍｐｔｙ ＭＳ；ｐ＜０．０５）をサブセットに分類した。ナイーブ（Ｔ_{ｎａｉｖｅ}）、エフェクター（Ｔ_ｅｆｆ）、エフェクター記憶（Ｔ_ｅｍ）、及び消耗（Ｔ_ｅｘ）Ｔ細胞群にＤＥＧを分類すると、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置を用いて、ナイーブの圧倒的な下方制御（２６が下がり、２が上がる）及びエフェクター遺伝子の上方制御（７６が上がり、１が下がる）が観察された。さらに、差次的に発現されたエフェクター記憶遺伝子の７０％が、上方制御され、同定された６～１３の消耗転写のみを増強した。ＳＢＲＴ及びＩＬ－１２ ＭＳ単独療法は、差次的な発現において同様のパターンを示したが、ＤＥＧの量は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳと比較して大幅に低減した（図１０）。インターフェロンｇは、いずれの処置群においても差次的な発現の上流制御因子として同定されておらず、抑制細胞の再分極化による間接的な効果を強調する（表３）。一括して、これらの結果は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの組み合わせ処置により誘発された腫瘍内Ｔ細胞活性化及び記憶形成の増強を示し、治療応答に対する、このプロセスの重要性を示す。

表３．ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳに応答する腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の上位の上流制御因子

ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ＭＳで処置されたＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性腫瘍を１１日目に採取し、単一細胞懸濁液に消化した。溶解物をフローソートして、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析のためにＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。３処置群のそれぞれを未照射＋ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照と比較するＩｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析を使用して、差次的に発現した遺伝子（未照射＋ｅｍｐｔｙ ＭＳ対照に対する）を解析した（ｎ＝３）。差次的に発現するパスウェイの上位の活性化及び阻害された上流制御因子（１０～２０未満の重複のｐ値）が表される。１回の実験を表す。

ＳＢＲＴ／ＩＬ１２ ＭＳ療法は、アブスコパル効果を引き起こす全身性抗腫瘍免疫を提供する
ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍のＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置は、１００％のマウスで長期生存をもたらす。従って、理論に拘束されることなく、免疫学的記憶が確立されていると仮定された。長期免疫を試験するために、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで治癒させたマウスは、原発性腫瘍の処置の約６ヶ月後に、異時性ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍でリチャレンジした。半脾臓腫瘍モデルは、ＰＤＡ播種の最も一般的な部位である肝臓における転移性腫瘍形成を反復する。腫瘍細胞を脾臓に注入し、それらは、肝門脈により肝臓に受動的に拡散した。非特異的な腫瘍形成を防ぐために、移植後に半脾臓摘出術を実施した。リチャレンジの３日後、腫瘍生物発光により測定されるように、同齢ナイーブ対照と比較して、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで治癒させたマウスにおいてＫＣＫＯ－ｌｕｃ播種の減少が観察された。移植後７日目までに、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで治癒させたマウスは、肝臓の腫瘍量を示さず、これは、有意な延命効果により補強された（図１３Ａ及び１３Ｂ）。長期の抗腫瘍免疫をさらに確認するために、リチャレンジマウスからナイーブマウスにＣＤ８ Ｔ細胞を移し、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで治癒させたドナーマウスの細胞が腫瘍チャレンジ中にナイーブレシピエントを防御すると仮定した。原発性腫瘍根絶の９ヶ月後、ＣＤ８ Ｔ細胞をＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたマウスの残りの脾臓及びリンパ節から精製した。ドナーマウスは、Ｔ細胞の単離前に決してプライミングされておらず、ナイーブドナー対照は、同齢であった。同所性ＫＣＫＯ－ｌｕｃ移植の１６時間前に、Ｔ細胞をレシピエントマウスに静脈内注射した。早ければ移植後５日目に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで治癒させたドナー由来のＣＤ８ Ｔ細胞を注入したレシピエントマウスにおいて腫瘍播種の低減が観察され、ＩＶＩＳ生物発光分析により示されるように、２４日目までに、抗腫瘍応答は、５匹のマウス全部で明らかであった（図１３Ｃ）。４０日目のその後の分析により、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで治癒させた群由来のＣＤ８ Ｔ細胞を注入したマウスの６０％に（触診による）腫瘍の所見が全くないことが明らかになり、ナイーブレシピエントへの完全な抗腫瘍免疫の移行が示された（図１３Ｄ）。包括的に、これらの結果は、腫瘍特異的記憶ＣＤ８ Ｔ細胞を生成するＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置時にＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍に向けられた免疫応答の形成を示す。

局所進行膵臓悪性腫瘍の５０％超が、患者から手術を除外する転移性疾患を呈する（Ｈｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ，１５（１）：８－１８）。ＲＴにより誘発されるアブスコパル効果は、ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種の特徴である全身性免疫応答の活性化により引き起こされると仮定されている（ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｍｅｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，５：１０２）。残念ながら、ＲＴ単独療法後のアブスコパル効果が、臨床的に観察されることはめったになく、免疫系（例えば、ＩＬ－１２ ＭＳ）を標的とすることによる最適化の必要性が示唆される。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳが同所性膵腫瘍に対して強力な局所効果を誘発することを示しており、次に、併用療法が、同時性２次腫瘍に対してアブスコパル効果を誘発できるかどうかを試験した。半脾臓手法を使用して、原発性ＫＣＫＯ（ルシフェラーゼヌル）腫瘍を肝臓への２次ＫＣＫＯ－ｌｕｃ転移の同時移植と並行して膵臓に注射した（図１３Ｅ）。ＳＢＲＴ及びＩＬ－１２ ＭＳの治療スケジュールは修正されず、処置を原発性膵腫瘍のみに適用した。ＩＶＩＳ生物発光イメージングを使用して、ルシフェラーゼ発現肝転移を追跡し、未処置及び単独療法で処置された対照は、中悪性度の転移性疾患を発症したが（図１４Ａ及び１３Ｆ）、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置により、確立された肝転移の排除（図１３Ｆ）及び著しく改善された生存率（図１３Ｇ）がもたらされた。これらの実験はまた、老齢マウス（３０週齢）におけるＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの治療効能を示したが、６～８週齢のマウスで実験を繰り返した場合に同様の結果が観察された（図１４Ｂ）。加えて、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳにより誘発されたアブスコパル効果は、肝臓に限定されなかった。遠隔転移モデルも使用し、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ腫瘍細胞を膵臓（１次病変）及び脚の筋肉（２次病変）に同時に移植し、ＩＶＩＳイメージングを使用して、両方を測定した（図１４Ｃ）。原発性腫瘍の治療応答に違いは観察されなかったが、生体発光及びノギス測定の両方により、膵臓のＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置時に、未処置の脚腫瘍の大幅なサイズ縮小が確認され、移植の２５日後にマウスの６０％の腫瘍がなくなった（それぞれ、図１４Ｄ及び１４Ｅ）。血漿ＩＬ－１２濃度をモニタリングすることにより、全身的な増加が、観察されたアブスコパル効果を生じさせたかどうかを判定することができる。血漿ＩＬ－１２レベルは、処置後、ＩＬ－１２ ＭＳ及びＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ＭＳの両方の群で均一に上方制御されることが判明した（図１４Ｆ）が、アブスコパル効果は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置群でのみ観察された。これらのデータは、ＩＬ－１２の全身的増加が２次病変の治療効果に寄与し得るが、ＳＢＲＴのＩＬ－１２ ＭＳとの組み合わせのみが、確立された転移を破壊可能な全身性抗腫瘍効果を生じることを示唆する。

ＰＤＡのためのｃｏｎＲＴの開発は、臨床試験が効果のない全生存期間及び局所腫瘍調節の結果を示した後、近年、主導権を失っている（Ｎｅｏｐｔｏｌｅｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１２００－１２１０．；Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７：５１－５６；Ｈａｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＪＡＭＡ ３１５：１８４４－１８５３）。過去１０年間にわたる研究より、放射線療法後の腫瘍消散に対するインタクトな免疫応答の重要性が特性決定されており、免疫減衰は、これらの臨床の欠点に主に寄与し得る。この作業は、ＰＤＡの２つの新しい治療方策、ＳＢＲＴ、及び免疫療法を検討し、この組み合わせが、局所進行病変を縮小可能な免疫原性応答を刺激するだろうと仮定した。ＰＤＡ腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、ＰＤＡ変換を伴い且つＣＤ８ Ｔエフェクター応答の確立を防ぐ、著しい免疫抑制性のある間質により強調される（Ｆｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８：４２６６－４２７６）。さらに、一般に利用されたｃｏｎＲＴスケジューリングはまた、免疫抑制性細胞環境の促進に加えてリンパ球減少症を与え得る（Ｓｃｈｒｅｋ，１９６１，Ａｎｎ．Ｎ Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：８３９－８４８；Ｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７８：２８２－４２９１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：２７８２－２７９４）。免疫組織化学（ＩＨＣ）の結果（図１）は、ＳＢＲＴの主要な利点を強調し、すなわち、腫瘍内ＣＤ８ Ｔ細胞の搭載を増加させ、それに応じて、ＳＢＲＴスケジューリングは、抗原特異的適応免疫応答を増幅する深刻な腫瘍損傷をもたらす手段として研究された。逆に、豊富な骨髄抑制細胞密度が、未処置及びＳＢＲＴで処置された患者試料の両方で観察され、免疫抑制細胞の存在が依然として中心的な治療上の障害であることが示唆された。これらの結果は、動員されたＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を刺激し且つ腫瘍全体の免疫抑制細胞の存在量をリプログラムすることができる免疫療法の組み合わせ（ＩＬ－１２ ＭＳ）の開発を促進した。

ＰＤＡは、Ｔ_ｒｅｇ及び骨髄抑制細胞の優勢、細胞傷害性Ｔ細胞の排除または枯渇、ならびに線維形成性及び／または無血管性の細胞外マトリックスを含む多様な腫瘍の状況により強調される。これらの特徴のそれぞれは、ＰＤＡに固有の免疫抑制に有利な免疫不均衡に寄与する（Ｆｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８：４２６６－４２７６）。この設定での抗腫瘍免疫応答の開発は、間質構成要素を包括的に再分極させる多面的な介入を必要とする。この理由から、ＩＬ－１２は、多面発現活性のために、魅力的な介入の候補となった。この作業は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置を使用することにより、難治性ＰＤＡ腫瘍における強力な抗腫瘍効果を示す。さらに、治療有効性は、３つの中悪性度の前臨床モデルで示され、ＫＣＫＯ－ｌｕｃ同所性モデルは、１００％の治癒をもたらした（図２）。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法が、ＰＤＡの多様な免疫抑制間質をリプログラムし、乗っ取る能力は、特徴的に冷たい腫瘍モデル全体に強力な免疫応答があった理由を説明し得る。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの組み合わせ後の相乗的なＩＦＮγ誘導は、顕著であり、ＩＦＮγ産生細胞のＳＢＲＴによる増加が重要な前兆イベントであるという推測につながる。ＮＫ細胞及びＡＰＣは、ＩＦＮγ産生の一般的な原因であるが、それらの相対的な存在量は、ＳＢＲＴ処置単独では影響を受けないことが判明した（図１１Ａ及び１１Ｃ）。むしろ、ＩＦＮγ産生のためにプライミングされたＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳで処置されたＣＤ８ Ｔ細胞トランスクリプトームが観察された（図１０）。驚くべきことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇下の腫瘍内ＩＦＮγレベルを調査する調整実験は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置によるサイトカイン量の増加を示し、ＣＤ４ Ｔ細胞及び骨髄の両方の寄与及び補償の可能性が明白になった。強力なＩＦＮγの誘導が観察されたが、発現は一過性であった（ＩＬ－１２放出のプロファイルと同様；図５）。深刻なＩＦＮγプライミングが持続的な抗腫瘍応答を開始し得る機序は、完全に理解されない。１つの要因は、ＩＦＮγ及び腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦα）刺激の調整であり得る。同期的な高レベルのＩＦＮγ／ＴＮＦαシグナル伝達は、炎症誘発性シグナル伝達の自己分泌ループを開始して、骨髄抑制因子の安定したリプログラミングをもたらし得る。ＩＦＮγは、ＩＦＮコンセンサス配列結合タンパク質（ＩＣＳＢＰ）の活性化を通じて、ＩＬ－１２の転写フィードバックを誘発して、フィードフォワード応答が引き起こされたことが示されている。このシグナル伝達構造は、強力な炎症誘発性イベントを生じ得るが、持続的なインターフェロン刺激は、複数のＴ細胞枯渇パラダイムを促進するエピジェネティックな変化を引き起こすことが示されている（Ｂｅｎｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃｅｌｌ １６７：１５４０－１５５４．ｅ１２．）。腫瘍内Ｌｕｍｉｎｅｘプロファイリング（図５）は、フィードフォワードＩＬ－１２／ＩＦＮγ産生が、ＫＣＫＯ－ｌｕｃモデル（図１１Ａ）でのＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置後に生じることを示唆する。重要なことに、ピークＩＬ－１２／ＩＦＮγシグナル伝達（１１日目）中に、顕著なＣＤ８ Ｔ細胞の枯渇は観察されず、１４日目に細胞数の高まりは、ＩＬ－１２ＭＳ送達後に複数日間の持続的増殖を示唆する（図９Ｂ及び１０）。ＩＭ／ＴＡＭの再分極化のイベントに加えて、ＣＤ８ Ｔ細胞応答は、おそらくＩＦＮγにより媒介されたＴ_ｒｅｇの密度の急激な低減により支援される可能性があったが、処置の約９６時間後のＴ_ｒｅｇ回復は、同様の治療上重要なものであってよい（図１１Ｅ）。ＩＦＮγ依存インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の誘導は、細胞傷害性イベント後のＴ_ｒｅｇリバウンドを高めることが判明しており、Ｋａｌｉａ ｅｔ ａｌ．による研究（２０１５，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４２：１１１６－１１２９）は、ＣＴＬＡ４を介するＴ_ｒｅｇシグナル伝達が、適する機能的Ｔ_ｍｅｍ集団の形成に必要であることを示唆するであろう。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳが動的炎症誘発性刺激を引き起こす能力、続く、標準的な免疫調節フィードバック及び記憶形成は、治療有効性に不可欠であり得る。ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ応答後に腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化されたレパートリーを維持すると、３次免疫療法またはＩＬ－１２ ＭＳの反復投与を用いる２ラウンド目の処置の成功する可能性が劇的に改善される。この研究により、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳが抗腫瘍効果を誘発する、図１５に示す多面的な機序が明らかになっている。ＰＤＡ腫瘍形成は通常、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞の顕著な浸潤、ＴＡＭ集団に播種するＩＭ、及び病変周辺部のＣＤ８ Ｔ細胞の不足により強調される（図１５Ａ）。抗腫瘍免疫応答は、ＳＢＲＴにより開始され、免疫原性腫瘍細胞死を誘発して、腫瘍抗原及び提示を生成し、これらは両方とも、流入領域リンパ節（ＤＬＮ）でのＴｅｆｆ形成に必要である（緑色）（図１５Ｂ）。しかし、腫瘍内ＣＤ８ Ｔｅｆｆ細胞のこれらの増加は、Ｔｒｅｇ及びＩＭ／ＴＡＭ抑制因子の補助的な動員により、中程度の抗腫瘍効果がある。この障害を克服するために、局所的なＩＬ－１２ ＭＳ処置は、ＩＦＮγを生成するために腫瘍内Ｔエフェクターを刺激し、これは、リンパ系及び骨髄抑制因子の両方を再分極させる（図１５Ｃ）。ＰＤＡ腫瘍の消散は、Ｔｒｅｇリバウンド及びＴｍｅｍ形成により強調され、遠位転移を調節及び／または排除し得る持続的な腫瘍特異的免疫記憶がもたらされる（図１５Ｄ）。この提案された要旨は、未だ定義されていない多数の細胞及びパスウェイを含む、はるかに複雑な抗腫瘍機序の過度の単純化を表す可能性がある。例えば、ＩＬ－１２／ＩＦＮγ軸は、腫瘍細胞（ＭＨＣＩ発現の増加ならびに細胞毒性及び／または細胞毒性効果）ならびに内皮細胞（抗血管新生及び免疫接着分子の放出）などの非免疫標的に対する効果を誘発することが可能である。これは、免疫媒介性の抗腫瘍効果にも寄与し得る（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２２３－２２６；Ｓｔｒａｓｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：３８９０－３８９９）。腫瘍内ＩＬ－１２投与を使用して、一部の臨床実験で観察された静脈内投与の全身毒性を軽減した（Ｊｅｎｋｓ，１９９６，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８８：５７６－５７７）。重要なことに、マウスは、有害事象を経験したまたはＩＬ－１２ ＭＳ処置に対する免疫反応の徴候を示したマウスはいなかった。局所進行ＰＤＡにおけるＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの第Ｉ相臨床試験が準備中である。連続手術を使用して、ＰＤＡマウスモデルでＩＬ－１２を送達した（図２）が、このアプローチを診療所に置き換えるには、超音波内視鏡ガイド（ＥＵＳ）手法が必要になる可能性があるであろう。ＥＵＳ介入は現在、ＰＤＡの診断及び病期分類ならびに放射線療法の基準マーカーの配置に使用され、ＩＬ－１２ ＭＳのｉ．ｔ．送達のための安全で低侵襲のアプローチとなる（Ａｌ－Ｈａｄｄａｄ ａｎｄ Ｅｌｏｕｂｅｉｄｉ，２０１０，ＪＯＰ １１：１－７）。ＭＳパッケージングは、透過性及び保持（ＥＰＲ）効果の強化に起因して、ＩＬ－１２の腫瘍内隔離のレベルが向上すると仮定された。１～５ｍｍのポリマーコーティングにＩＬ－１２をカプセル化すると、ＴＭＥでのタンパク質分解またはホスファチジルセリンの捕捉からサイトカインを保護しながら、リンパ液の排出を弱めることにより受動的クリアランスを防ぐ可能性がある（Ｓｅｖｅｎｉｃｈ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ，２０１４，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２８：２３３１－２３４７；Ｏｙｌｅｒ－Ｙａｎｉｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６６，６３５－６４７．ｅ７）。ＴＭＥでの維持をサポートする以外に、ＭＳ技術は、Ｃｈａｍｐｉｏｎ ｅｔ ａｌ．による研究（２００８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２５：１８１５－１８２１）が、ラット肺胞マクロファージによる２～３ｍｍのポリスチレンＭＳの食作用及び内在化を示した通り、ＩＬ－１２の細胞取り込み及び輸送にも影響を与える得る。ＡＦ５９４標識ＭＳのｉ．ｐ．注射後に、同様の飲み込みは観察されなかった（図３Ｃ及び３Ｄ）。これらの結果は、細胞内ＩＬ－１２シグナル伝達機序、骨髄のリプログラミングにおける食作用の役割、ならびに肝臓及び腫瘍流入領域リンパ節などのＰＤＡ播種の部位へのＩＬ－１２ ＭＳの活発な細胞輸送の周囲の注目せざるを得ない問題を引き起こす。局所進行ＰＤＡ悪性腫瘍の約６０％が転移性疾患を呈し、さらに、この値は、検出できない微小転移を伴う追加の症例を除外する（Ｇｉｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ，７（４）：ｅ１０００２６７）。局所及び遠位腫瘍調節の両方の能力を利用する療法は、ネオアジュバント介入、潜在的には、外科的候補に適格である患者の数を劇的に増加させるであろう。ＳＢＲＴ及び免疫療法の組み合わせを調査する他の研究（Ｙａｓｍｉｎ－Ｋａｒｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２０３０）と同様に、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ療法後の全身免疫記憶の評価（図１３）により、未処置の同期病変のアブスコパル調節に対する能力、異時性リチャレンジ時の増生の抑制、及びナイーブレシピエントへの防御の移行を確認した。包括的に、これらの結果は、ＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳ処置が強力なｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を開始したことを強く示唆する。この観点から、ＳＢＲＴはまた、ＩＬ－１２ ＭＳを放射線のアジュバントとして分類するのではなく、ＩＬ－１２ ＭＳによる免疫応答をプライミングする新抗原を腫瘍に産生するためのツールとみなされてもよい。強力な全身性免疫応答を増強するこの併用療法の能力は、進行転移性疾患を含む境界切除可能病変の範囲を超えて介入の機会を拡大する。進行疾患の前臨床モデルにおけるＳＢＲＴ／ＩＬ－１２ ＭＳの効能及び耐久性と一緒に、これらの機能は、ＰＤＡに対するこの治療アプローチの継続的な臨床的翻訳を強く支持する。

本明細書で引用されるいずれの特許、特許出願、及び刊行物の開示も、本明細書により、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は特定の実施形態を参照して開示されているが、本発明の他の実施形態及び変形は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の当業者らにより考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような全ての実施形態及び同等の変形を含むと解釈されることが意図される。

Claims (15)

1. 処置を必要とする対象における切除不能な膵癌腫瘍の処置のための、免疫調節性サイトカインを含む医薬組成物であって、
   前記処置が、
   ａ）有効量の電離放射線を該腫瘍に投与することであって、前記電離放射線が、標的放射線療法として投与され、前記標的放射線療法が、小分割腫瘍標的放射線療法及び体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）からなる群より選択される、前記投与すること；及び
   ｂ）有効量の前記免疫調節性サイトカインを含む医薬組成物を前記対象に投与することであって、前記免疫調節性サイトカインがＩＬ－１２を含む、前記投与すること、
   を含む、
   前記医薬組成物。
2. 前記電離放射線が、Ｘ線、ガンマ線、電子、または高線エネルギー付与（ＬＥＴ）放射線を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記組成物が、マイクロ粒子またはナノ粒子を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記マイクロ粒子またはナノ粒子が、半結晶性マトリックスを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 前記免疫調節性サイトカインが、前記半結晶性マトリックスに閉じ込められる、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 前記標的放射線療法が、３～８分割で与えられる３～８Ｇｙ／分割からなる群より選択されるレジメンにより投与される、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. 前記処置が、前記電離放射線と同時に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 前記処置が、前記電離放射線の後に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 前記処置が、前記電離放射線の前に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 腫瘍内注射により投与される、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 前記医薬組成物の投与が、前記医薬組成物の０．５μｇ～１０００ｍｇを含む単回投薬量を投与することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 前記医薬組成物の投与が、各投薬量が前記医薬組成物の０．５μｇ～１０００ｍｇを含む、複数の投薬量の前記医薬組成物を投与することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. 前記切除不能膵癌腫瘍が、局所進行膵癌腫瘍（ＬＡＰＣ）または転移性進行膵癌腫瘍である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 前記対象が、哺乳動物である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 前記対象が、ヒトである、請求項１４に記載の医薬組成物。

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