BRPI0620648A2

BRPI0620648A2 - variação de um domìnio d3 da interleucina-12p40, proteìna il-12 ou um fragmento da mesma, proteìna de fusão, ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica e uso da mesma

Info

Publication number: BRPI0620648A2
Application number: BRPI0620648-4A
Authority: BR
Inventors: Gordon D Webster; Suzanne P Mckenzie; Kin-Ming Lo; Pascal Andre Stein
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2011-11-22
Also published as: ZA200806611B; KR20080090483A; AU2006332138B2; EA200870131A1; AU2006332138A1; US20110097792A1; US20070154453A1; BRPI0620648B1; ES2384055T3; JP2009521911A; CY1112884T1; ATE555125T1; PL1966238T3; WO2007076933A1; EP1966238B1; CA2635618C; PT1966238E; US8188248B2; US9029330B2; BRPI0620648A8

Abstract

VARIAçãO DE UM DOMìNIO D3 DA INTERLEUCINA-12P40, PROTEìNA IL-12 OU UM FRAGMENTO DA MESMA, PROTEìNA DE FUSãO, áCIDO NUCLéICO, VETOR DE EXPRESSãO, CéLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA E USO DA MESMA. A presente invenção refere-se a polipeptídeos interleucina-12(IL-1 2) p40 modificados. Os polipeptídeos modificados possuem alterações na subunidade IL-12p40 para eliminar o sítio de protease entre as posições Lys26O e Arg26l. Os polipeptideos IL-12p40 modificados de acordo com a invenção possuem maior estabilidade comparada com a dos polipeptídeos IL-12p40 humanos maduros do tipo selvagem.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIAÇÃO DE UM DOMÍNIO D3 DA INTERLEUCINA-12P40, PROTEÍNA IL-12 OU UM FRAGMENTO DA MESMA, PROTEÍNA DE FUSÃO, ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FAR- MACÊUTICA E USO DA MESMA".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se, de forma geral, a proteínas IL-12p40, incluindo proteínas de fusão contendo IL-12p40, modificadas para aumentar a sua estabilidade. Em particular, as proteínas IL-12p40 da invenção removem um sítio proteolítico na região de Lys260 e de Arg261 na subunidade p40.

Antecedentes da Invenção

A interleucina-12 (IL-12) é uma citocina inflamatória que é pro- duzida em resposta à infecção por uma variedade de células do sistema i- munológico, incluindo células fagocíticas, células B e células dendríticas ati- vadas (Colombo e Trinchieri (2002), Cytokine & Growth Factor Reviews, 13: 155-168). A IL-12 desempenha uma função essencial na mediação da inte- ração dos instrumentos de defesa inatos e adaptativos do sistema imunoló- gico, atuando sobre células T e células "natural killer" (NK), aumentando a proliferação e a atividade de linfócitos citotóxicos e a produção de outras citocinas inflamatórias, especialmente interferon-γ (IFN-γ).

A IL-12 é uma molécula heterodimérica composta de uma cadeia α (a subunidade p35, IL-12p35) e uma cadeia β (a subunidade p40, IL-12p40) liga- das covalentemente através de uma ponte de dissulfeto para formar um hetero- dímero de 74 kDa biologicamente ativo. As seqüências de aminoácidos de IL- 12p35 e IL-12p40 de uma IL-12 humana madura (do tipo selvagem) são apre- sentadas nas figuras 1 (SEQID NO: 1) e 2 (SEQ ID NO: 2), respectivamente.

A interleucina-23 (IL-23) é uma molécula heterodimérica com ponte de dissulfeto intimamente relacionada a IL-12, no fato de que possui a mesma cadeia β IL-12p40 que a da IL-12, mas uma única cadeia α (a subu- nidade p19, IL-23p19) (Oppmann e outros, (2000), Immunity, 13: 715-725). Como a IL-12, a IL-23 é produzida por células fagocíticas e células dendríti- cas ativadas e acredita-se que esteja envolvida no recrutamento e na ativa- ção de uma faixa de células inflamatórias (Langrish e outros, (2004) lmmunol. Rev., 202: 96-105). A seqüência de aminoácidos de IL-23p19 de uma IL-23 humana madura é representada na figura 3 (SEQ ID NO: 3).

Para as células imunológicas secretarem heterodímeros de IL-12 ou de IL-23 biologicamente ativos, é necessária a expressão concomitante das subunidades α e β na mesma célula. A secreção por células imunológi- cas da IL-12p35 ou da IL-23p19 isoladamente não foi observada, enquanto que as células que produzem o heterodímero de IL-12 ou de IL-23 biologi- camente ativo secretam a subunidade p40 na forma livre em um excesso de até 100 vezes em relação ao heterodímero (D' Andréa e outros (1992), J. 10 Exp. Med., 176: 1387-98, Oppmann e outros, (2000), Immunity1 13: 715- 725). Em adição, foi observado no camundongo que, mesmo na ausência da subunidade a, as células podem produzir um homodímero de IL-12p40 bio- logicamente ativo (Hikawa e outros (2004), Neuroscience, 129: 75-83).

Foi mostrada que a presença de IL-12 endógena era necessária para a resistência imunológica a um amplo arranjo de agentes patogênicos, assim como a tumores transplantados ou quimicamente induzidos (Gateley e outros (1998), Annu. Rev. Immunol., 16: 495-521). Foi demonstrado que a IL-12 possui uma atividade antitumor potente baseada na indução de IFN-γ e na ati- vação de células efetoras tais como células T CD8+ e células NK (Brunda e outros (1993), J. Exp. Med., 178: 1223-30). Como um resultado desta atividade antitumor demonstrada, a IL-12 foi testada em testes clínicos com seres huma- nos como um agente imunoterapêutico para o tratamento de uma ampla varie- dade de cânceres (Atkins e outros (1997), Clin. Câncer Res., 3: 409-17; Gollob e outros (2000), Clin. Câncer Res., 6: 1678-92; e Hurteau e outros (2001), Gy- necol. Oncol., 82: 7-10), incluindo câncer renal, câncer de cólon, câncer ovaria- no, melanoma e Iinfoma de células T e como um adjuvante para vacinas para câncer (Lee e outros (2001), J. Clin. Oncol. 19: 3836-47).

Para IL-12 ou IL-23, a produção da proteína recombinante em sua forma heterodimérica corretamente dobrada e biologicamente ativa, re- quer a expressão concorrente tanto da subunidade α quanto de IL-12p40 na linhagem de células produtora. A proteína recombinante purificada, entretan- to, exibe um grau de heterogeneidade resultante da clivagem proteolítica na regição C-terminal da IL-12p40. A instabilidade da proteína IL-12 ou IL-23 pode dar origem a problemas em sua produção e uso clínico como um agen- te terapêutico. Portanto, há uma necessidade na técnica de variações de IL- 12 ou de IL-23 recombinantes melhoradas que produzem uma proteína ho- mogênea mais resistente à clivagem proteolítica.

Sumário da Invenção

A invenção fornece variações de subunidades p40 da IL-12 hu- mana (variações p40) que possuem maior estabilidade comparada com a das proteínas p40 da IL-12 do tipo selvagem. Nestas variações de p40, a região C-terminal, que é normalmente sensível à clivagem proteolítica, foi engenheirada para ser mais resistente à digestão pelas proteases. Especifi- camente, as variações de p40 da invenção incluem alterações de aminoáci- dos engenheiradas no domínio D3 direcionadas para evitar a criação de epi- topos potenciais de células T que poderiam tornar as proteínas variantes imunogênicas e ativar respostas de anticorpos em seres humanos. Como um resultado, as variações de p40 da invenção possuem melhores proprie- dades como agentes terapêuticos em relação às proteínas IL-12p40 do tipo selvagem referentes a sua produção, formulação e farmacocinética.

Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção fornece uma variação de um domínio D3 de p40 da IL-12 humana (variação D3), em que a variação D3 possui pelo menos 85% de identidade com o domínio D3 da IL-12p40 humana do tipo selvagem e inclui uma alteração de aminoácido em uma ou mais posições correspondentes aos resíduos 258-266 da p40 da IL- 12 humana madura. Certas modalidades da invenção se baseiam, em parte, em uma consideração de que uma alteração ou alterações de aminoácidos de acordo com a invenção possuem o benefício particular de remover o sítio proteolítico entre Lys260 e Arg261.

De acordo com a invenção, as alterações de aminoácidos em uma ou mais posições correspondentes aos resíduos 258-266 podem ser deleções, substituições ou inserções. Além disso, as substituições de ami- noácidos que substituem aminoácidos básicos por aminoácidos que não são básicos podem ser utilizadas para criar variações de acordo com a invenção. Em particular, as variações de D3 da invenção podem incluir uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições selecionadas do grupo que consiste em Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys 264, Asp265 e Arg266. Tais alterações de aminoácidos podem ser utilizadas iso- ladamente ou em combinação para induzir as alterações estruturais e/ou funcionais descritas anteriormente. Por exemplo, a variação D3 pode incor- porar uma, duas, três, quatro ou mais das substituições a seguir: Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Ala, Lys260Asn, Lys260Gln, Lys260Gly, Arg261Ala, Arg261 Asp, Arg261Thr, Lys263Gly, Lys263Ser, e/ou Lys264Gly.

Em algumas modalidades, a substituição é uma posição Lys260. A substituição pode substituir Lys260 por um aminoácido que não é básico, por exemplo, Ala, Asn, Gln ou Gly. Substituições adicionais em adição a Lys260 podem ocorrer em Ser259 e Arg261. Particularmente, algumas vari- ações de "D3 da invenção incorporam as substituições Ser259Asp, Lys260Asn e Arg261Thr. Em uma modalidade adicional, as variações de D3 da invenção incorporam as substituições Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr e Lys264Gly, enquanto opcionalmente deletam Lys263 e Asp265. Alternati- vamente, uma variação D3 da invenção incorpora as substituições Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr e Lys264Gly enquanto deleta Lys263, Lys264 e Asp265.

Em outras modalidades de acordo com a invenção, uma varia- ção D3 que inclui uma substituição que substitui Lys260 inclui alternativa- mente substituições adicionais em um ou mais de Lys258, Ser259, Arg261, Lys263 e Lys264. Por exemplo, em uma modalidade, uma variação D3 inclui as substituições Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261 Asp e opcio- nalmente Lys263Ser e Lys264Gly.

Em modalidades adicionais, em adição às substituições em Ser259, Lys260 e Arg261, um ou mais dos resíduos que correspondem a Lys263, Lys264, Asp265 e Arg266 são deletados, enquanto que em uma ou- tra modalidade, um ou mais de Lys263, Lys264, Asp265 e Arg266 são substi- tuídos por um aminoácido que não é básico. Em uma modalidade adicional, a substituição em Lys264 é Lys264Gly e, opcionalmente, Lys263 e Asp265 são deletados. Outras variações de D3 da invenção incorporam as substituições Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr e Lys264Gly e opcionalmente, a deleção de resíduos que correspondem a Lys263, Asp265 e Arg 266.

Será entendido pelos versados na técnica que as variações de p40 e as partes ativas das mesmas que incorporam uma variação D3 como é descrito aqui estão dentro do âmbito da invenção. Similarmente, as proteí- nas IL-12 e as partes ativas das mesmas que contêm uma variação de p40 (variações de IL-12) também estão dentro do âmbito da invenção. A inven- ção abrange ainda proteínas de fusão que incluem as variações de IL-12 da invenção e uma porção selecionada do grupo que consiste em uma porção de anticorpo, uma citocina sem ser IL-12 ou uma parte ativa da mesma.

Similarmente, as proteínas IL-23 e as partes ativas das mesmas que contêm uma variação de p40 (variações de IL-23) também estão dentro do âmbito da invenção. A invenção abrange ainda proteínas de fusão que incluem as variações de IL-23 da invenção e uma porção selecionada do grupo que consiste em uma porção de anticorpo, uma citocina sem ser IL-23 ou uma parte ativa da mesma.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um ácido nucléico que codifica qualquer uma das variações de D3, variações de p40, variações de IL-12 e variações de IL-23 da invenção. A invenção abrange ainda uma célula, por exemplo, uma célula procariótica, que inclui tal ácido nucléico.

A invenção apresenta ainda métodos de produção de tais varia- ções de D3, variações de p40, variações de IL-12, variações de IL-23 e pro- teínas de fusão contendo estas porções.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece métodos de uti- lização das variações da invenção e os ácidos nucléicos que codificam as mesmas. Por exemplo, a invenção abrange um método de tratamento de um paciente que inclui a administração ao paciente de uma quantidade terapeu- ticamente eficiente de uma variação de p40 da invenção ou de uma parte ativa da mesma.

As características e as vantagens anteriores e outras da inven- ção assim como a própria invenção, serão mais completamente entendidas partindo das figuras, da descrição e das reivindicações a seguir.

Em resumo, a invenção refere-se a:

• Uma variação de um domínio D3 da p40 da IL-12, em que a variação possui pelo menos 85% de identidade de seqüência com um domí- nio D3 da p40 da IL-12 humana do tipo selvagem e compreende uma altera- ção de aminoácido em uma ou mais posições que correspondem aos resí- duos nas posições 258-266 da p40 da IL-12 humana madura parental.

• Uma variação correspondente, em que a alteração elimina o sítio de protease entre Lys260 e Arg261.

• Uma variação correspondente, em que a alteração é uma subs- tituição ou uma deleção.

• Uma variação correspondente, em que a alteração é uma subs- tituição selecionada do grupo que consiste em Lys258, Lys260, Lys263 e Lys264.

• Uma variação correspondente, em que uma ou mais das subs- tituições de aminoácidos a seguir são selecionadas:

Lys258Gln,Lys260Ala, Lys260Asn, Lys260Gln, Lys260Gly,

Lys263Gly, Lys263Ser e Lys264Gly.

• Uma variação correspondente, em que a substituição ocorre pelo menos na posição Lys260.

• Uma variação correspondente, em que a substituição coloca no lugar de um aminoácido básico um aminoácido que não é básico, seleciona- do do grupo que consiste em Ala, Asn, Gln ou Gly.

• Uma variação correspondente, em que a variação compreende ainda uma ou mais substituições nas posições Ser259, Arg261 ou Arg 266.

• Uma variação correspondente, em que as substituições são Ser259 e Arg261.

• Uma variação correspondente, em que as substituições são Ser259Asp, Lys260Asn e Arg261Thr.

• Uma variação correspondente, que compreende ainda a substi- tuição Lys264Gly.

• Uma variação correspondente, em que adicionalmente um ou ambos os resíduos Lys263 e Asp265 são deletados.

• Uma variação correspondente, em que um ou mais resíduos correspondentes a Lys263, Lys264, Asp 265 e Arg266 são deletados.

• Uma variação correspondente, que compreende ainda uma ou mais das substituições selecionadas do grupo que consiste em:

Lys263, Lys264, Asp 265 e Arg266, em que o resíduo de aminoá- cido original correspondente é substituído por um aminoácido que não é básico.

· Uma variação correspondente que compreende .ainda uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: Lys258, Ser259, Arg261, Lys263 e Lys264.

• Uma variação correspondente, em que as substituições são Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln e Arg261Asp.

• Uma variação correspondente, que compreende ainda as subs- tituições Lys263Ser e Lys264Gly.

• Uma variação correspondente, que compreende especificamente (i) as substituições a seguir: Ser259Asp, Lvs260Asn e Arq261Thr e

(ii) as deleções a seguir: Lys263, Lys264 e Asp265, em que as ditas posições estão relacionadas com a molécula do tipo selvagem não modificada, formando assim a linha de seqüência Lys - Asq - Asn - Thr - Glu - Arg nas posições 258 - 263 da variação.

• Uma variação correspondente, que compreende especificamente

(i) as substituições a seguir: Ser259Asp, Lys260Asn, Arq261Thr e

Lvs264Glv e

(ii) as deleções a seguir: Lys263 e Asp265, em que as ditas po- sições estão relacionadas com a molécula do tipo selvagem não modificada, formando assim a linha de seqüência: Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Gjy - Arg nas posições 258 - 264 da variação.

• Uma variação correspondente, que compreende as substitui- ções a seguir: Lys258Gln, Ser259Asp. Lvs260Gln. Arq261Asp, formando assim a linha de seqüência: Gln - Asp - Gln - Asp -Glu- Lys - Lys - Arg nas posições 258 - 265 da variação.

• Uma variação correspondente, que compreende as substitui- ções a seguir: Lys258Gln, Ser259Asp, Lvs260Gln, Arg261Ase, Lvs263Ser. Lvs264Glv. formando assim a linha de seqüência: Gln - Asp - Gln - Asp - Glu - Ser- Gly - Arg nas posições 258 - 265 da variação.

• Uma proteína IL-12 ou um fragmento da mesma, contendo a variação que é descrita acima e abaixo.

• Uma proteína IL-23 ou um fragmento da mesma, contendo a variação que é descrita acima e abaixo.

• Uma proteína de fusão que compreende uma variação ou uma proteína IL-12 oü IL-23 como descrito e um anticorpo ou uma parte ativa do mesmo.

• Uma proteína de fusão correspondente, em que a dita variação ou a dita proteína é fundida ao terminal C do dito anticorpo ou parte do anti- corpo, preferencialmente na parte Fc do dito anticorpo, em que o dito anti- corpo se direciona a antígenos tumorais, tal como KS (EpCam) ou 14.18 ou receptores que são superexpressos no tecido tumoral, tal como HER2 ou EGFR ou VEGFR.

• Uma molécula de ácido nucléico ou de DNA que codifica uma variação ou uma proteína IL-12 ou IL-23 ou uma proteína de fusão como descrito acima ou abaixo.

• Um vetor de expressão que compreende o dito ácido nucléico.

• Uma célula hospedeira que produz uma variação ou uma prote- ína IL-12 ou IL-23 ou uma proteína de fusão como descrito.

• Uma composição farmacêutica adequada para o tratamento de doenças ativadas por IL-12 ou IL-23 que compreende em uma quantidade farmacologicamente ativa uma variação, uma proteína IL-12 ou IL-23 ou uma proteína de fusão que compreende tal variação ou proteína IL-12 ou IL-23, opcionalmente junto com um diluente ou um excipiente veículo farmaceuti- camente aceitável com outros fármacos farmacologicamente eficientes em um regime de terapia de combinação.

Um uso da dita composição farmacêutica ou de seus compo- nentes eficientes para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer ou de uma doença auto-imune.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 representa a seqüência de aminoácidos madura da cadeia a, isto é, da subunidade p35, de uma IL-12 humana madura (do tipo selvagem) (SEQ ID NO: 1).

A figura 2 representa a seqüência de aminoácidos madura da cadeia β, isto é, da subunidade p40, de uma IL-12 humana madura (do tipo selvagem) (SEQ ID NO: 2). O domínio D3, correspondente às posições 211- 306 (SEQ ID NO: 26), está em itálico e o fragmento peptídico corresponden- te às posições 258-266 está sublinhado (SEQ ID NO: 5), com Lys260 e Arg261 evidenciados em negrito.

A figura 3 representa a seqüência de aminoácidos madura da cadeia a, isto é, da subunidade p19, de uma IL-23 humana madura (do tipo selvagem) (SEQ ID NO: 3).

A figura 4A mostra o gel de SDS-PAGE para várias bateladas purificadas de IL-12 humana produzida na forma de proteínas de fusão com anticorpo (faixas 1 - 8), enquanto a figura 4B mostra o gel de SDS-PAGE para várias bateladas purificadas de IL-23 humana produzida na forma de proteínas de fusão com anticorpo (faixas 1 - 3). As subunidades IL-12p35 e IL-23p19 estão covalentemente ligadas à cadeia pesada do anticorpo. A banda de 6 kD é indicada por uma seta. Os pesos moleculares (kD) são in- dicados para os marcadores (faixa M).

A figura 5 representa a seqüência de aminoácidos do fragmento peptídico C-terminal da subunidade IL-12p40 humana madura (do tipo sel- vagem). O fragmento começa na Arg261 (SEQ ID NO: 4).

A figura 6 representa a seqüência de aminoácidos de um frag- mento peptídico correspondente às posições 258-266 de uma subunidade IL-12p40 humana madura (do tipo selvagem) (SEQ ID NO: 5).

As figuras 7.1 e 7.2 representam um alinhamento de seqüências de aminoácidos das subunidades IL-12p40 de vários mamíferos incluindo seres humanos, babuíno (Papio anubis), macaco rhesus (Macaca mulattá), mangabei (Cercocebus torquatos), cachorro (Canis familiaris), gato (Felis catus), cavalo (Equus caballus), porco (Sus scrofa), vaca (Bos Taurus), ca- bra (Capra hircus), ovelha (Ows aries), cervo (Cervus elaphus), búfalo d'água (Bubalus bubalis), hamster (Mesocricetus auratus), porquinho-da- índia (Cawa porcellus), rato do algodão (Sigmodon hispidus), rato (Rattus norvegicus) e camundongo (Mus musculus). Os dois aminoácidos em negrito indicam o sítio de clivagem proteolítica.

A figura 8 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V1, de uma subunidade IL-12p40 humana madu- ra (SEQ ID NO: 6). A seqüência engenheirada está sublinhada.

A figura 9 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V2, de uma subunidade IL-12p40 humana madu- ra (SEQ ID NO: 7). A seqüência engenheirada está sublinhada.

A figura 10 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V3, de uma subunidade IL-12p40 humana madu- ra (SEQ ID NO: 8). A seqüência engenheirada está sublinhada.

A figura 11 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V4, de uma subunidade IL-12p40 humana madu- ra (SEQ ID NO: 9). A seqüência engenheirada está sublinhada.

A figura 12 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V5, de uma subunidade IL-12p40 humana madu- ra (SEQ ID NO: 10). A alteração está sublinhada.

A figura 13 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V6, de uma subunidade IL-12p40 humana madu- ra (SEQ ID NO: 11). As alterações estão sublinhadas.

A figura 14 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V7, de uma subunidade IL-12p40 humana madu- ra (SEQ ID NO: 12). A alteração está sublinhada.

A figura 15 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V8, de uma subunidade IL-12p40 humana madu- ra (SEQ ID NO: 13). A alteração está sublinhada.

A figura 16 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V9, de uma subunidade IL-12p40 humana madu- ra (SEQ ID NO: 14). A alteração está sublinhada.

A figura 17 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V10, de uma subunidade IL-12p40 humana ma- dura (SEQ ID NO: 15). A alteração está sublinhada.

A figura 18 representa a seqüência de aminoácido de uma varia- ção, referida aqui como p40V11, de uma subunidade IL-12p40 humana ma- dura (SEQ ID NO: 16). As alterações estão sublinhadas.

A figura 19 representa a seqüência de ácido nucléico que codifi- ca a subunidade IL-12p40 humana de comprimento completo (do tipo selva- gem) (SEQ ID NO: 21).

A figura 20 representa a seqüência de ácido nucléico de um fragmento de nucleotídeos sintético, referida aqui como V1V2, que codifica partes de variações de p40 p40V1 e p40V2. O fragmento V1V2 abrange um fragmento V1 incluindo uma região (sublinhada) que codifica a SEQ ID NO: 17. Este é seguido por uma seqüência ligante (letra minúscula) e substanci- almente, um fragmento V2 incluindo uma região (sublinhada) que codifica a SEQ ID NO: 18.

A figura 21 representa a seqüência de ácido nucléico de um fragmento de nucleotídeos sintético, referida aqui como V3V4, que codifica partes de variações de p40 p40V3 e p40V4. O fragmento V3V4 abrange um fragmento V3 incluindo uma região (sublinhada) que codifica a SEQ ID NO: 19. Este é seguido por uma seqüência ligante (letra minúscula) e subse- qüentemente, um fragmento V4 incluindo uma região (sublinhada) que codi- fica a SEQ ID NO: 20.

A figura 22 representa a seqüência de ácido nucléico de um fragmento de nucleotídeos sintético, referida aqui como V5V6, que codifica partes de variações de p40 p40V5 e p40V6. O fragmento V5V6 abrange um fragmento V5 incluindo uma substituição de códon (sublinhada) que codifica Arg261Ala. Este é seguido por uma seqüência ligante (letra minúscula) e subseqüentemente, um fragmento V6 incluindo substituições de códons (sublinhadas) que codificam Lys260Ala e Arg261Ala.

A figura 23 representa a seqüência de ácido nucléico de um fragmento de nucleotídeos sintético, referida aqui como V7V8, que codifica partes de variações de p40 p40V7 e p40V8. O fragmento V7V8 abrange um fragmento V7 incluindo uma substituição de códon (sublinhada) que codifica Lys260Ala. Este é seguido por uma seqüência Iigante (letra minúscula) e subseqüentemente, um fragmento V8 incluindo uma substituição de códon (sublinhada) que codifica Lys260Gly.

A figura 24 é um Western blot com um anticorpo anti-hu-p40 po- liclonal. Os sobrenadantes de células transfectadas com IL-12p40 do tipo selvagem e Variações de IL-12p40 (V1-V4) foram coletados e processados em um gel de SDS-PAGE. Dois clones independentes (a, b) de cada Varia- ção de IL-12p40 p40V1, p40V2, p40V3 e p40V4 foram testados. A seta a- ponta para a banda de IL12p40 clivada que não possui o fragmento C- terminal (faixa p40 wt).

A figura 25 mostra o gel de SDS-PAGE para as proteínas de fu- são anticorpo-IL12 contendo as variações de p40 p40V1, p40V2, p40V3, p40V4, p40V5, p40V6, p40V7, p40V8 e p40 do tipo selvagem (faixas 1-9). A banda principal mais acima representa a proteína de fusão entre a cadeia pesada do anticorpo e a subunidade p35 e a banda principal inferior repre- senta a cadeia pesada do anticorpo. A banda de 6 kDa não era detectada em qualquer uma das faixas das proteínas variantes, exceto na faixa 5. Os pesos moleculares (kD) são indicados para os marcadores (faixa M).

A figura 26 mostra os dados farmacocinéticos das proteínas de fusão anticorpo-IL12 contendo as variações de p40 p40V1 - p40V8 compa- radas com as proteínas de fusão anticorpo-(do tipo selvagem)-IL12, adminis- tradas de forma intravenosa.

A figura 27A mostra os dados farmacocinéticos das proteínas de fusão anticorpo-IL12 contendo as variações de p40 p40V1 - p40V4 compa- radas com as proteínas de fusão anticorpo-(do tipo selvagem)-IL12 (painel A) e a figura 27B mostra os dados farmacocinéticos das proteínas de fusão anticorpo-IL12 contendo as variações de p40 p40V5 - p40V8 comparadas com as proteínas de fusão anticorpo-(do tipo selvagem)-!L12 (painel B), ad- ministradas de forma subcutânea.

A figura 28 é uma variação de IL-12p40 que possui mutações fora da região D3 da proteína.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção descreve variações da subunidade p40 da citocina interleucina-12 (IL-12) que possui maior estabilidade comparada com a pro- teína do tipo selvagem. Nestas variações, uma região da subunidade p40 que normalmente não é estruturada e é sensível à clivagem proteolítica é mutada para ser mais resistente à clivagem proteolítica. Esta região, no do- mínio D3, fica próxima ao terminal C da subunidade p40, abrangendo um filamento de polipeptídeos que corresponde aos aminoácidos 258-266 na p40 humana madura (p40(258-266)).

A subunidade IL-12p40 é também uma subunidade de compo- nente da citocina interleucina-23 (IL-23). A IL-23 possui duas subunidades, a subunidade α "p19" e a subunidade β "p40". A subunidade p40 da IL-23 é a mesma que a da IL-12p40. Portanto, as variações da subunidade IL-12p40 são similarmente variações da subunidade IL-23p40.

Em uma classe geral de modalidades, uma ou mais mutações são introduzidas na região de p40 correspondente aos resíduos de aminoá- cidos 258-266 para eliminar o sítio de clivagem, que na p40 humana corres- ponde ao sítio entre Lys260 e Arg261. Em modalidades adicionais, são in- troduzidas nesta região mutações específicas que através de modelagem geram uma estrutura mais firmemente dobrada. Em um outro aspecto da invenção, é previsto que as mutações introduzidas adicionalmente evitam a obtenção da região engenheirada da subunidade p40 imunogênica. Por e- xemplo, as substituições de aminoácidos na região engenheirada da subuni- dade p40 são escolhidas para evitar a criação de peptídeos que podem ser reconhecidos como epitopos potenciais de células T em seres humanos.

As mutações podem ser introduzidas na região de p40 corres- pondente aos resíduos de aminoácidos 258-266 através de uma variedade de mecanismos. Por exemplo, em uma modalidade, uma mutação ou muta- ções são introduzidas através da substituição de um resíduo de aminoácido por um outro. Em uma modalidade adicional, uma mutação ou mutações são introduzidas através da deleção de um ou mais resíduos da subunidade p40.

Ainda em uma outra modalidade, uma mutação ou mutações são introduzi- das através da inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da subunidade p40.

Em uma modalidade, as variações de p40 da invenção ficam conti- das em composições protéicas tais como proteínas IL-12, proteínas de fusão de IL-12, proteínas IL-23, proteínas de fusão de IL-23 ou homodímeros de p40. Por exemplo, em uma modalidade, uma proteína IL-12 contém uma subunida- de p35 e uma variação de p40 de acordo com a invenção. Em uma outra moda- lidade, uma proteína IL-23 contém uma subunidade p19 e uma variação de p40 de acordo com a invenção. Em uma modalidade adicional, uma proteína de fusão contém uma parte de anticorpo fundida com IL-12 contendo uma varia- ção de IL-12p40. Ainda em uma modalidade adicional, uma proteína de fusão contém uma parte de anticorpo fundida com IL-23 contendo uma variação de IL-12p40. Em uma modalidade adicional, a parte de anticorpo da proteína de fusão é um anticorpo intacto, uma região Fc, um sc-Fv, uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo ou um fragmento ativo de um anticorpo. Ainda em uma outra modalidade, uma proteína de fusão de acordo com a invenção inclui uma variação de IL-12p40 fundida com uma citocina sem ser IL-12 ou sem ser IL-23 ou uma parte ativa da mesma.

Em um aspecto adicional da invenção, as composições de prote- ína que contêm uma das variações de p40 da invenção possuem uma meia- vida circulante mais longa que as da proteína do tipo selvagem correspon- dente. Assim, em comparação com as proteínas IL-12 ou IL-23 que contêm a subunidade p40 do tipo selvagem, as variações de IL-12 ou as variações de IL-23 que incluem uma subunidade p40 engenheirada da invenção pos- suem propriedades melhoradas como agentes terapêuticos em relação a sua produção, formulação e farmacocinética.

Em uma modalidade adicional, as mutações na seqüência de aminoácidos de IL-12p40 são introduzidas fora da região de IL-12p40(258- 266) e opcionalmente fora do domínio IL-12p40 D3 de IL-12p40. Tais muta- ções podem ser introduzidas em outro lugar no domínio D3 de IL-12p40 e podem ser introduzidas em outros domínios. Por exemplo, a figura 28, re- presenta uma seqüência de uma subunidade p40 de IL-12 que possui alte- rações em uma seqüência de aminoácidos fora dos resíduos 258-266. Le- ong e outros, (2003), Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 100: 1163-1168, cujo con- teúdo é incorporado aqui como referência, ensinam vários resíduos que po- dem ser mutados na seqüência de aminoácidos de IL-12 p40 além da região 258-266. Ainda, devido ao fato de que a estrutura em cristal tridimensional de IL-12p40 é conhecida (Yoon e outros, (2000), EMBO J., 19: 3530-3541, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência) e que os resíduos essen- ciais à interação da subunidade p40 com a subunidade p35 de IL-12 são conhecidos, a seleção de outras mutações que não destruirão a funcionali- dade da subunidade p40 pode ser determinada por um versado na técnica. Determinação do produto de clivagem

A invenção se baseia em parte na observação de que a subuni- dade IL-12p40 é susceptível a um evento de clivagem proteolítica específica e nos novos resultados experimentais que definem o sítio de clivagem. Foi observado que uma proteína IL-12 recombinante purificada, produzida em células NS/0 como descrito no Exemplo 2, exibia coerentemente um grau de heterogeneidade quando a proteína recombinante era separada por eletrofo- rese em um gel de SDS-PAGE sob condições redutoras, claramente visíveis na forma de uma banda de proteína adicional de peso molecular de aproxi- madamente 6 kD. Uma observação similar foi feita para a proteína IL-23 re- combinante. Isto é ilustrado na figura 4 que mostra o gel de SDS-PAGE para várias bateladas purificadas de composições protéicas de IL-12 humana (Painel A) e de IL-23 humana (Painel B) produzidas na forma de proteínas de fusão com anticorpo.

O contaminante foi purificado e sua seqüência de aminoácidos foi determinada, como descrito no Exemplo 3 e foi descoberto que corres- ponde à seqüência do fragmento de 46 aminoácidos C-terminal da própria subunidade IL-12p40, gerado através da clivagem proteolítica entre Lys260 e Arg261 (figura 5-SEQ ID NO: 4). A clivagem entre Lys260 e Arg261 parece ser altamente favorecida apesar de uma prevalência de aminoácidos básicos na região que circunda o sítio de clivagem (...KSKREKKDR... (figura 6-SEQ ID NO: 5) em que Lys260 e Arg261 estão indicados em negrito). Entretanto, apesar ser clivado partindo da subunidade p40, o fragmento peptídico C- terminal permanece não covalentemente associado com o resto da subuni- dade p40, tornando difícil remover a heterogeneidade resultante através da purificação adicional da proteína recombinante.

Proteína L-12p40

A subunidade p40 humana madura é uma proteína de 306 ami- noácidos que se assemelha a um receptor α de citocina de classe I solúvel, composto dos domínios D1, D2 e D3. O sítio de clivagem (entre Lys260 e Arg261) fica dentro de D3, um domínio de fibronectina do tipo Ill de 96 ami- noácidos abrangendo a região de 1211 até S306. A seqüência para a subu- nidade IL-12 p40 humana madura é mostrada na figura 2. A seqüência de aminoácidos para D3 é mostrada na figura 2 em itálico. Na estrutura crista- lográfica por raio X publicada do heterodímero de IL-12 humana (Yoon e ou- tros (2000), EMBO J., 19: 3530-41) uma parte de uma alça dentro da região de p40 humana (258 - 266) do domínio D3 não é resolvida. Sem desejar ficar ligado à teoria, as regiões não resolvidas nas estruturas em cristal cons- tituem freqüentemente uma indicação de alças não estruturadas flexíveis e podem constituir sítios-alvo para a proteólise.

Um alinhamento estrutural primário da subunidade p40 madura de uma variedade de espécies de mamíferos é mostrado nas figuras 7.1 e 7.2, incluindo ser humano; os primatas babuíno, macaco rhesus e mangabei; cachorro; gato, cavalo; porco; os ruminantes vaca, cabra, ovelha, cervo, bú- falo d'água; e os roedores hamster, porquinho-da-índia, rato do algodão, rato e camundongo. No alinhamento a região próxima a p40 (258 - 266) exibe 30 variabilidade de seqüência, particularmente em relação ao seu comprimento. Particularmente, em algumas espécies, notavelmente ruminantes, a seqüên- cia é mais curta e em outras, tais como em roedores, a seqüência, em al- guns casos, podem conter um inserto adicional. Em muitas espécies, o moti- vo dipeptídico correspondente à p40 K260R261 humana é conservado, iden- ticamente ou exibindo dois aminoácidos básicos. Estas espécies incluem espécies importantes na agricultura e comercialmente incluindo, mas não limitadas ao cavalo, à vaca, à cabra, ao porco e à ovelha. Conseqüentemen- te, a introdução de uma ou mais mutações na região da IL-12p40 sem ser humana correspondentes aos resíduos 258-266 da IL-12p40 humana que são análogas às mutações ensinadas aqui em relação à IL-12p40 humana pode provar ser útil na redução ou na eliminação da clivagem proteolítica da IL-12p40 não humana no sítio de clivagem K260R261.

Em princípio, de acordo com a invenção, é possível utilizar uma variação de IL-12p40 de uma espécie que não possui um motivo dipeptídico carregado positivamente correspondente a K260R261 da IL-12p40 humana em um ser humano ou em outro organismo heterólogo. Entretanto, na práti- ca da invenção, é importante observar que as formas não humanas de IL- 12p40 levarão geralmente a anticorpos anti-p40 quando administradas a se- res humanos. De forma mais ampla, não é ótimo administrar p40 de uma espécie a uma outra. Em adição, o potencial de várias subunidades p40 não humanas de serem proteoliticamente clivadas é geralmente desconhecido. Em adição, as subunidades p40 de uma espécie pode não funcionar em uma outra espécie, na etapa de montagem com subunidades tal como p35 ou p19 ou na etapa de interação com as subunidades receptoras.

Proteínas IL-12p40 variantes

A invenção fornece proteínas IL-12p40 variantes com mutações no domínio D3 que aumentam a estabilidade. Como utilizado aqui, o termo "variação D3" refere-se a um domínio D3 de uma subunidade p40 humana, por exemplo, de IL-12 ou de IL-23, que possui uma ou mais alterações de aminoácidos quando comparado com D3 do tipo selvagem. O termo "varia- ção de p40" é utilizado aqui para se referir a uma subunidade p40 humana, por exemplo, de IL-12 ou de IL-23, com mutações no domínio D3, isto é, uma subunidade p40 contendo uma variação D3. O termo "variação de IL- 12" é utilizado aqui para se referir a uma proteína IL-12 humana contendo uma variação de p40, O termo "variação de IL-23" é utilizado aqui para se referir a uma proteína IL-23 humana contendo uma variação de p40,

De acordo com uma modalidade da invenção, o domínio D3 de uma variação de p40 possui pelo menos 70% ou mais de identidade de se- qüência com o domínio D3 da IL-12p40 do tipo selvagem. Em uma modalidade adicional, o domínio D3 de uma variação de p40 possui pelo menos 75% ou mais de identidade de seqüência com o domínio D3 da IL-12p40 do tipo selva- gem. Ainda em uma outra modalidade, o domínio D3 de uma variação de p40 possui pelo menos 80% ou mais de identidade de seqüência com o domínio D3 da IL-12p40 do tipo selvagem, enquanto que em modalidades adicionais, o domínio D3 de uma variação de p40 possui pelo menos 81% ou mais ou pelo menos 82% ou mais ou pelo menos 83% ou mais ou pelo menos 84% ou mais ou pelo menos 85% ou mais ou pelo menos 86% ou mais ou pelo menos 87% ou mais ou pelo menos 88% ou mais ou pelo menos 89% ou mais ou pelo me- nos 90% ou mais ou pelo menos 91 % ou mais ou pelo menos 92% ou mais ou pelo menos 93% ou mais ou pelo menos 94% ou mais ou pelo menos 95% ou mais ou pelo menos 96% ou mais ou pelo menos 97% ou mais ou pelo menos 98% ou mais ou pelo menos 99% ou mais de identidade com o domínio D3 da IL- 12p40 do tipo selvagem.

De acordo com uma outra modalidade da invenção, a seqüência de aminoácidos de uma variação de p40 possui pelo menos 70% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da p40 de IL-12 do tipo selvagem madura. Em uma modalidade adicional, a seqüência de aminoá- cidos de uma variação de p40 possui pelo menos 75% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da IL-12p40 do tipo selvagem madura. Ainda em uma outra modalidade, a seqüência de aminoácidos de uma variação de p40 possui pelo menos 80% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da IL-12p40 do tipo selvagem madura, en- quanto em modalidades adicionais, a seqüência de aminoácidos de uma varia- ção de p40 possui pelo menos 81% ou mais ou pelo menos 82% ou mais ou pelo menos 83% ou mais ou pelo menos 84% ou mais ou pelo menos 85% ou mais ou pelo menos 86% ou mais ou pelo menos 87% ou mais ou pelo menos 88% ou mais ou pelo menos 89% ou mais ou pelo menos 90% ou mais ou pelo menos 91% ou mais ou pelo menos 92% ou mais ou pelo menos 93% ou mais ou pelo menos 94% ou mais ou pelo menos 95% ou mais ou pelo menos 96% ou mais ou pelo menos 97% ou mais ou pelo menos 98% ou mais ou pelo me- nos 99% ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos de IL-12p40 do tipo selvagem madura.

Para determinar a porcentagem de identidade entre duas se- qüências de aminoácidos, as seqüências são alinhadas com a finalidade de comparação ótima (por exemplo, podem ser introduzidos espaços ná se- qüência de uma primeira seqüência de aminoácidos para o alinhamento óti- mo com uma segunda seqüência de aminoácidos). A porcentagem de iden- tidade entre as duas seqüências é uma função do número de posições idên- ticas compartilhadas pelas seqüências (isto é,% de identidade = (n° de posi- ções idênticas/n° total de posições) vezes 100). Se as seqüências que estão sendo comparadas tiverem tamanho desigual, a mais curta das seqüências é utilizada para determinar o número total de posições. A determinação da porcentagem de identidade entre duas seqüências também pode ser reali- zada utilizando um algoritmo matemático.

Um exemplo não Iimitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin e Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87: 2264-68, modificado como em Karlin e Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90: 5873-77. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul e outros, (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-10, As buscas de nucleotídeos por BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, comprimento de palavra = 12. As buscas de proteínas por BLAST podem ser realizadas com o pro- grama XBLAST, escore = 50, comprimento de palavra = 3. Para a obtenção de alinhamentos com espaços com a finalidade de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul e outros, (1997) Nucleic Acids Research, 25(17): 3389-3402. Quando são utilizados os programas BLAST e Gapped BLAST1 os parâmetros pré-estabelecidos dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser utilizados. Em uma modalidade, a invenção fornece variações de D3 con- tendo uma alteração que remove o sítio de clivagem proteolítica entre Lys260 e Arg261. Em uma modalidade, o aminoácido na posição Lys260 é mutado. Em uma modalidade mais específica, a Lys260 é substituída por um aminoácido que não é básico. Os aminoácidos que não são básicos incluem, por exemplo, Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, lle, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val. Por exemplo, a Lys 260 é substituída por Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, lle, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val. Em uma modalidade alternativa, a Lys260 é substituída por selenocisteína. Os exem- pios de variações de D3 em que a Lys260 foi substituída por um outro ami- noácido são mostrados nas figuras 12, 13, 14, 15, 16 e 18.

Em uma outra modalidade, a Arg261 é mutada. Por exemplo, em uma modalidade, a Arg 261 é substituída por qualquer aminoácido que não é básico. Por exemplo, em uma modalidade, a Arg261 é substituída por Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, lle, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val. Em uma modalidade alternativa, a Arg261 é substituída por selenociste- ína. Os exemplos de variações de D3 em que a Arg261 foi substituída por um outro aminoácido são mostrados nas figuras 12, 13, 17 e 18. Em uma modalidade adicional, a Lys260 e a Arg261 são mutadas. Por exemplo, em uma modalidade, a Lys260 e a Arg261 são cada uma substituídas por um outro aminoácido. Por exemplo, a Lys260 é substituída por Gln, Ala, Asn ou Gly e a Arg261 é substituída por Ala, Asp ou Thr. Os exemplos de variações de D3 em que tanto a Lys260 quanto a Arg261 foram substituídas por outros aminoácidos são mostrados nas figuras 13 e 18.

Em adição, a Lys260 e a Arg261 são deletadas em uma modali- dade, enquanto que em uma modalidade adicional, um aminoácido é inseri- do entre Lys260 e Arg261.

Em uma modalidade adicional, uma variação de D3 é criada em que uma ou mais de Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys264 ou Arg266 é cada uma substituída por um outro aminoácido. Em uma modali- dade, uma ou mais de Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys264 ou Arg266 é cada uma substituída por um aminoácido que não é básico. Por exemplo, em uma modalidade, a Lys258 é substituída por Gln. Em uma ou- tra modalidade, a Ser259 é substituída por Asp. Em uma outra modalidade, a Lys260 é substituída por Ala, Gly, Asn ou Gln. Em uma modalidade adicio- nal, a Arg261 é substituída por Ala, Thr ou Asp. Ainda em uma outra modali- dade,, a Lys263 é substituída por Ser. Em uma modalidade adicional, a Lys264 é substituída por Gly. Em uma modalidade, a Arg266 é substituída por Gln, Asp, Asn ou Thr. Em uma modalidade adicional, a Lys263 e a Lys264 são cada uma substituídas por um outro aminoácido. Por exemplo, em uma modalidade a Lys263 e a Lys264 são cada uma substituídas por Ser e Gly, respectivamente. Ainda em uma outra modalidade, a Lys258, a Ser259, a Lys260, a Arg261, a Lys263 e a Lys264 são substituídas por Gln, Asp, Gln, Asp, Ser e Gly, respectivamente.

Em uma modalidade adicional, é criada uma variação de D3 em que uma ou mais de Ser259, Lys260 e Arg261 são cada uma substituídas por um outro aminoácido. Em uma modalidade adicional, uma ou mais de Ser259, Lys260 e Arg261 são cada uma substituídas por um aminoácido que não é básico. Por exemplo, em uma modalidade, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 são substituídas por Asp, Asn e Thr, respectivamente.

Em uma outra modalidade, a Lys258, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 são cada uma substituídas por um outro aminoácido. Por exemplo, em uma modalidade, a Lys258, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 são cada uma substituídas por um aminoácido que não é básico. Em uma modalidade, a Lys258, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 são cada uma substituídas por Gln, Asp, Gln e Asp, respectivamente. Em uma modalidade adicional, a Ser259, a Lys260, a Arg261 e a Lys264 são substituídas por Asp, Asn, Thr e Gly, respectivamente. Ainda em uma modalidade adicional, a Ser259, a Lys260, a Arg261 e a Lys264 são substituídas por Asp, Asn, Thr e Gly, res- pectivamente, enquanto a Lys263 e o Asp265 são deletados. Ainda em uma outra modalidade, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 são cada uma substituí- das por Asp, Asn e Thr, respectivamente, enquanto a Lys263, a Lys264 e o Asp265 são deletados.

Sem desejar ficar ligado à teoria, acredita-se que as deleções possuam o efeito de reduzir a flexibilidade conformacional da região p40(258-266), reduzindo assim a capacidade do motivo Lys260-Arg261 de adotar uma conformação que permite a clivagem pela protease relevante. Portanto, em uma modalidade, um ou mais de Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys264, Asp265 ou Arg266 é deletado.

Em uma modalidade adicional, é criada uma variação de D3 em que um ou mais de Lys263, Lys264, Asp265 ou Arg266 é deletado. Por e- xemplo, em uma modalidade, a Lys263 e o Asp265 são deletados, enquanto que em uma outra modalidade, a Lys263, a Lys264 e o Asp265 são deleta- dos. Em uma outra modalidade, a Lys263, a Lys264 e o Asp265 são deleta- dos e substituídos por um ou mais aminoácidos que não são básicos. Em uma modalidade adicional, a Lys263, a Lys264, o Asp265 e a Arg266 são deletados. Em uma modalidade adicional, um ou mais de Lys263, Lys264, Asp265 ou Arg266 é deletado, enquanto um ou mais de Ser259, Lys260 ou Arg261 é substituído por um outro aminoácido. Por exemplo, em uma moda- lidade, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 são substituídas por Asp, Asn e Thr, respectivamente, enquanto que a Lys263, a Lys264 e o Asp265 são deleta- dos. Em uma modalidade adicional, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 são substituídas por Asp, Asn e Thr, respectivamente, enquanto que a Lys263, a Lys264, o Asp265 e a Arg266 são deletados.

Em outras modalidades, as substituições de aminoácidos são selecionadas de forma que evitem a criação de novos epitopos de células T. Os métodos para analisar as seqüências peptídicas em relação ao seu po- tencial de criar epitopos de células T são bem-conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente U.S. N2 2003/0153043; a Publicação Internacional N2 WO 00/034317; e Sturniolo e outros (1999), Na- ture Biotech., 17: 555-61). Em uma modalidade, a seqüência da IL- 12p40(258-266) humana é substituída pela seqüência KDNTER (SEQ ID NO: 17). Em outras palavras, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 foram substitu- idas por Asp, Asn e Thr, respectivamente, enquanto a Lys263, a Lys264 e o Asp265 foram deletados de forma que a seqüência resultante dos resíduos 258-263 na variação é KDNTER. A variação de IL-12p40 resultante é mos- trada na figura 8.

Em uma outra modalidade, a seqüência da IL-12p40(258-266) humana é substituída pela seqüência KDNTEGR (SEQ ID NO: 18). Em ou- tras palavras, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 foram substituídas por Asp1 Asn e Thr, respectivamente, enquanto que a Lys263, a Lys264 e o Asp265 foram deletados e substituídos apenas por um resíduo de Gly de forma que a seqüência resultante dos resíduos 258-264 na variação é KDNTEGR. A variação de IL-12p40 resultante é mostrada na figura 9.

Ainda em uma outra modalidade, a seqüência da IL-12p40(258- 266) humana é substituída pela seqüência QDQDEKKDR (SEQ ID NO: 19). Em outras palavras, a Lys258, a Ser259, a Lys260 e a Arg261 foram substi- tuídas por Gln, Asp, Gln e Asp, respectivamente, de forma que a seqüência resultante dos resíduos 258-266 na variação é QDQDEKKDR. A variação de IL-12p40 resultante é mostrada na figura 10,

Em uma modalidade adicional, a seqüência da IL-12p40(258- 266) humana é substituída pela seqüência QDQDESGDR (SEQ ID NO: 20). Em outras palavras, a Lys258, a Ser259, a Lys260, a Arg261, a Lys263 e a Lys264 foram substituídas por Gln, Asp, Gln, Asp, Ser e Gly, respectivamen- te, de forma que a seqüência resultante dos resíduos 258-266 é QDQ- DESGDR. A vairação resultante da IL-12p40 é mostrada na figura 11.

Em uma modalidade adicional, uma variação de D3 está contida dentro de uma subunidade IL-12p40 ou de uma parte ativa da mesma. Por parte ativa, entende-se que uma subunidade IL-12p40 contendo uma varia- ção de D3 possui pelo menos 10% de atividade em uma modalidade, pelo menos 20% em uma outra modalidade, pelo menos 30% em uma outra mo- dalidade, pelo menos 50% de atividade em uma outra modalidade, pelo me- nos 70% de atividade em uma outra modalidade, pelo menos 75% de ativi- dade em uma outra modalidade, pelo menos 80% de atividade em uma outra modalidade, pelo menos 90% de atividade em uma outra modalidade, pelo menos 95% de atividade em uma outra modalidade, pelo menos 99% de atividade em uma modalidade adicional, pelo menos 100% de atividade em uma outra modalidade, pelo menos 150% de atividade em uma modalidade adicional, pelo menos 200% de atividade em uma outra modalidade, pelo menos 300% de atividade em uma modalidade adicional, pelo menos 400% de atividade em uma outra modalidade, pelo menos 500% de atividade em uma outra modalidade ou pelo menos 1000% de atividade em uma outra modalidade, em comparação com a atividade biológica de uma porção IL- 12p40 do tipo selvagem. Proteínas contendo variações de IL-12p40

As variações de IL-12p40 podem ser introduzidas dentro de composições protéicas no lugar da IL-12p40 do tipo selvagem. Os exemplos de composições proteíncas biologicamente ativas que incluem IL-12p40 são homodímeros de p40, IL-12 e proteínas de fusão de IL-12 e IL-23 e proteí- nas de fusão de IL-23. Em um aspecto da invenção, o heterodímero IL-12 p35/variação de p40 consiste em cadeias polipeptídicas separadas. Alterna- tivamente, o heterodímero IL-12 p35/variação de p40 consiste em uma única cadeia polipeptídica. Em um outro aspecto da invenção, o heterodímero IL- 23 p19/variação de p40 consiste em cadeias polipeptídicas separadas. Al- ternativamente, o heterodímero IL-23 p19/variação de p40 consiste em uma única cadeia polipeptídica.

Em um outro aspecto da invenção, como parte de uma proteína de fusão de IL-12, o parceiro de fusão de IL-12 pode ser uma porção de an- ticorpo ou parte de uma porção de anticorpo. As porções de anticorpo úteis incluem aqueles que se direcionam a proteína de fusão de IL-12 para o am- biente de tumor, por exemplo, para as próprias células tumorais ou para o cerne necrótico de um tumor ou para o estroma de suporte. Em uma outra modalidade da invenção, o parceiro de fusão é uma outra citocina. As citoci- nas úteis incluem, mas não estão limitadas a IL-2, IL-7 e IL-15.

Em um outro aspecto da invenção, como parte de uma proteína de fusão de IL-23, o parceiro de fusão de IL-23 pode ser uma porção de an- ticorpo ou parte de uma porção de anticorpo. As porções de anticorpo úteis incluem aqueles que direcionam a proteína de fusão de IL-23 para o ambien- te de tumor, por exemplo, para as próprias células tumorais ou para o cerne necrótico de um tumor ou para o estroma de suporte. Em uma outra modali- dade da invenção, o parceiro de fusão é uma outra citocina. As citocinas Ci- teis incluem, mas não estão limitadas a IL-2, IL-7 e IL-15. Ácidos nucléicos que codificam variações de p40

Em um aspecto adicional da invenção, são considerados os áci- dos nucléicos que codificam os polipeptídeos que contêm as variações de p40 da invenção. Podem ser construídos os ácidos nucléicos que codificam as variações de p40 da invenção, por exemplo, utilizando técnicas de DNA familiares aos versados na técnica. Os exemplos de procedimentos podem ser encontrados no Exemplo 1.

A figura 19 representa a seqüência de ácido nucléico que codifi- ca a subunidade IL-12p40 humana madura. As figuras 20-22 representam fragmentos de nucleotídeos sintéticos para codificar os exemplos de muta- ções encontrados nas variações de p40 da invenção. Métodos de Tratamento Utilizando Variações de p40

As variações de p40, incluindo as proteínas de fusão e as prote- ínas IL-12 ou as proteínas IL-23 contendo uma variação de p40, da invenção são úteis como agentes imunoterapêuticos, tais como para o tratamento de uma ampla variedade de cânceres, com base na atividade antitumor de- monstrada das proteínas IL-12. Por exemplo, as variações de p40 da inven- ção podem ser utilizadas, preferencialmente como um heterodímero com p35, no tratamento de cânceres incluindo, mas não limitados a câncer renal, câncer de cólon, câncer ovariano, melanoma e Iinfoma de células T e como um adjuvante para vacinas para câncer. As variações de p40 também po- dem ser utilizadas como parte de um homodímero p40/p40 para reduzir uma resposta de TH 1 (por exemplo, uma resposta de TH 1 associada com uma doença auto-imune). Administração

Todas as variações» de IL-12, as variações de IL-23 e as varia- ções de p40 da invenção podem ser incorporadas em uma composição far- macêutica adequada para administração. Tais composições compreendem tipicamente uma variação de IL-12 ou uma proteína de fusão contendo uma variação de IL-12 e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como utilizado aqui, é pretendido que o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" inclua qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção e similares, compatíveis com a administração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem- conhecido na técnica.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com sua rota pretendida de administração. Os exemplos de rotas de administração incluem a administração parenteral, por exemplo, intrave- nosa, intradermàl, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdermal (tópica), transmucosa e retal. As soluções ou as suspensões utilizadas para a aplicação parenteral, intradermal ou subcutânea podem incluir os compo- nentes a seguir: um diluente esterilizado tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros sol- ventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tal como o ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tal como o ácido etilenodiaminatetraacético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação paren- teral pode ser preenchida em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou de plástico.

Os medicamentos que contêm as variações de IL-12, as varia- ções de IL-23 ou as variações de p40 da invenção podem ter uma concen- tração de 0,01 ou menor que 100% (p/p), embora a quantidade varie de a- cordo com a forma de dosagem dos medicamentos.

A dose de administração depende do peso corporal dos pacien- tes, da gravidade da doença, do tipo particular de variação de IL-12p40 que será utilizado e da opinião do médico. Por exemplo, para uma variação de IL-12 da invenção, é geralmente aconselhável administrar entre aproxima- damente 0,01 até aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal ao dia, apro- ximadamente 0,02 até aproximadamente 2 mg/kg/dia no caso de injeção ou aproximadamente 0,5 mg/kg/dia. A dose pode ser administrada uma vez ou várias vezes ao dia de acordo com a gravidade da doença e da opinião do médico. Para uma proteína de fusão anticorpo-IL-12 ou uma proteína de fu- são anticorpo-IL23 contendo uma variação de IL-12p40 da invenção, é ge- ralmente aconselhável administrar entre aproximadamente 0,001 até apro- ximadamente 1 mg/kg de peso corporal por dia, aproximadamente 0,002 até aproximadamente 0,5 mg/kg/dia no caso de injeção ou aproximadamente 0,1 mg/kg/dia. A dose pode ser administrada uma vez ou duas vezes durante um período de 2, 3 ou 4 semanas, de acordo com a natureza e a gravidade da doença e com a opinião do médico.

Os aspectos da invenção são adicionalmente ilustrados pelos exemplos a seguir.

Exemplos

Exemplo 1: Clonagem das variações das subunidades de IL-12p40 humana

Os ácidos nucléicos que codificam as variações de p40 da in- venção, em particular, p40V1 até p40V8 (SEQ ID NOS: 6-13), foram constru- ídos utilizando técnicas de DNA padronizadas familiares aos versados na técnica. Em essência, um cassete de DNA, que codifica um fragmento que compreende a região que abrange os resíduos de aminoácidos mutados e que fica entre sítios de restrição convenientes, foi sintetizado de novo (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA) e substituído pelo fragmento correspon- dente da seqüência do tipo selvagem contida em um plasmídeo de expres- são carregando a seqüência de p40 (ver, por exemplo, pNC-p40 na Patente U.S. N°6.838.260). A seqüência de ácido nucléico que codifica a subunida- de de IL-12p40 humana madura (do tipo selvagem) é mostrada na figura 19. Os plasmídeos de expressão que codificam as variações de p40 foram obti- dos dessa maneira.

Em particular, os ácidos nucléicos que codificam p40V1 e p40V2 foram gerados como a seguir. Um vetor de clonagem carregando os casse- tes de DNA de p40V1 e p40V2 (pBHV1 V2), sintetizado na forma de um frag- mento contíguo como mostrado na figura 20, foi digerido com Bpu10 I e Eco RI/Sca I ou Bbs I, gerando um cassete EcoR I/Bpu10 I (para V1) e Bbs I/Bpu10 I (para V2) com extremidades compatíveis EcoR I/Bpu10 I, respecti- vamente. A digestão com Scal foi incluída para eliminar o fragmento de V2 com tamanho similar. Estes fragmentos purificados foram clonados em um vetor de expressão pNC-p40 em uma ligação tripla com os fragmentos apro- priados de BpuIO l/Pvu I e Pvu l/Eco Rl obtidos partindo de NC-p40.

Uma abordagem idêntica foi utilizada para gerar ácidos nucléi- cos que codificam p40V5 e p40V6, partindo da seqüência sintetizada mos- trada na figura 21 e para gerar ácidos nucléicos que codificam p40V7 e p40V8, partindo da seqüência sintetizada mostrada na figura 23.

Similarmente, para gerar ácidos nucléicos que codificam p40V3 e p40V4, o plasmídeo (pBHV3V4) carregando a seqüência sintetizada mostrada na figura 22, foi digerido com EcoR l/Bbs l/Sca I (a digestão com Sca I foi inclu- ída para eliminar o fragmento V4 com tamanho similar) ou com Bbs I isolada- mente, gerando um cassete EcoR l/Bbs I (para V3) e Bbs I (para V4), respecti- vãmente, cada um com extremidades compatíveis com o plasmídeo de expres- são pNC-p40 digerido com EcoR l/Bbs I. Observar que para a enzima de restri- ção Bbs I as seqüências de reconhecimento e de clivagem são separadas e assim as seqüências contendo vários sítios de reconhecimento de Bbs I podem gerar pontas penduradas diferentes específicas à seqüência. Os cassetes V3 e V4 foram então purificados do gel e ligados, respectivamente, no plasmídeo de expressão pNC-p40 em uma ligação tripla utilizando os fragmentos Bbs l/Pvu I e Pvu l/Eco Rl apropriados obtidos partindo de pNC-p40.

A mesma abordagem geral pode ser utilizada para gerar molécu- las de ácidos nucléicos adicionais que codificam outras variações de p40 consideradas pela invenção.

Exemplo 2: Expressão de variações de p40 e de anticorpo-IL12: proteínas de fusão contendo variações de p40

Foram utilizados métodos padronizados para gerar linhagens de células expressando as variações de p40 da invenção (ver a Patente U.S. N2 6.838.260). Os plasmídeos de expressão pNC-p40 que codificam as variações de p40 foram eletroporados nas células, por exemplo, células NS/0. As células foram plaqueadas e as células transfectadas foram selecionadas em um meio contendo G418. Os sobrenadantes de cultura dos clones resistentes ao fárma- co foram analisados em relação à produção de p40 por ELISA e os maiores produtores foram subclonados e testados em relação à expressão estável.

Para gerar linhagens de células que expressam a proteína de fu- são anticorpo-IL-12 com as variações de p40 da invenção, foi seguida a abor- dagem de transfecção descrita na Patente U.S. N2 6.838.360. Por exemplo, a proteína de fusão DI-NHS-IL12p40V1 foi obtida através da transfecção adicio- nal da linhagem de células expressando p40V1 com um segundo plasmídeo, pdHL10lambdaDI-NHS-p35, que codifica o anticorpo NHS76, em que o Ο- terminal da região constante da cadeia pesada fica conectado com o N-terminal da subunídade p35 de IL-12. O plasmídeo de expressão pdHLIOIambda é um derivado de pdHL7, em que o domínio constante da cadeia leve codificada é uma cadeia lâmbda. As células foram selecionadas em um meio contendo me- totrexato e os transfectantes estáveis expressando as proteínas de fusão com anticorpo foram clonados através de métodos padronizados. Exemplo 3: Purificação e caracterização de variações de p40

Para caracterizar a integridade das variações de p40 p40V1, p40V2, p40V3 e p40V4 (SEQ ID NOs: 6-9), os meios de cultura de células gastos de células NS-O transfectadas de forma transitória em duplicata ex- pressando estas variações foram coletados para um Western blot com um anticorpo anti-hu-p40 policlonal, mostrado na figura 24. A subunidade p40 do tipo selvagem controle foi incluída como um controle (faixa 1). Foi observado que a espécies clivada não possuindo o fragmento de 6 kDa C-terminal, que é normalmente bem-resolvido partindo das espécies de p40 intactas pelas condições eletroforéticas (ver a seta que aponta para a banda na faixa 1), não estava presente em qualquer uma das variações testadas (faixas 2-9) e apenas a p40 intacta podia ser detectada. Assim, as variações de p40 testa- das eram resistentes a uma atividade proteolítica presente durante a expres- são de proteína.

As proteínas de fusão com anticorpo contendo as variações de IL-12p40 foram purificadas partindo do sobrenadante da cultura de células utilizando técnicas padronizadas baseadas na captura da Proteína A (ver a Patente U.S. N° 6.838.260).

O gel de SDS-PAGE das proteínas de fusão com anticorpo puri- ficadas de clones estáveis de NS-0 das variações de p40 fornecidas nas SEQ ID NOS: 6-13 (faixas 1 - 8) e do controle não mutado (faixa 9) é mos- trado na figura 25. A banda central das três bandas principais representa a subunidade p40 não clivada, com a banda desbotada ligeiramente acima indicando espécies mais glicosiladas. A banda principal mais acima repre- senta a proteína de fusão entre a cadeia pesada do anticorpo e a subunida- de p35 e a banda principal inferior representa a cadeia leve do anticorpo. Foi observado que, com a exceção da amostra da proteína de fusão com anti- corpo contendo IL-12p40V5, a banda de 6 kDa não estava presente. Para IL- 12p40V5, foi observada uma banda residual de 6 kDa (faixa 5).

Exemplo 4: Caracterização de um sítio de clivaqem proteolítica na unidade IL-12p40 do tipo selvagem

A identidade do fragmento de proteína de aproximadamente 6 kDa contaminante foi determinada através de métodos padronizados. Sucintamente, a proteína DI-NHS-IL12 purificada foi desnaturada e reduzida em uma solução de guanidina a 6 IW DTT a 1 mM tamponada a 55°C e submetida à separação por HPLC em fase inversa ao longo de uma coluna Vydac C4 com um gradien- te de acetonitrila de 10% até 90%. A fração correspondente à espécie de peptí- deo não identificada foi coletada, seca e ressuspensa para a corrida em um gel de SDS-PAGE confirmando que correspondia ao fragmento de 6 kDa e para determinar a seqüência do peptídeo através do seqüenciamento N-terminal. A análise de seqüenciamento revelou um peptídeo com a seqüência REKK- DRVFTD, que corresponde a uma seqüência na subunidade IL-12p40 humana madura (do tipo selvagem) começando na Arg261.

Exemplo 5: Atividade biológica de proteínas IL-12 contendo variações de p40

A atividade biológica de proteínas IL-12 contendo variações de p40 foi medida através da indução de IFNy partindo de PBMCs humanas. As proteínas de fusão com anticorpo Ab-IL-12 contendo as variações p40V1 até p40V8 foram comparadas com Ab-IL-12 com p40 do tipo selvagem e uma proteína IL-12 humana recombinante. O ensaio de indução de IFNy foi realizado essencialmente como descrito em Gately e outros (1995), Current Protocols in Immunology, Seção 6.16.4 e Kobayashi e outros (1989), J. Exp Med., 170: 827-845. As PBMCs foram cultivadas com PHA-P durante 3 dias e então 25 lll/mL de hu IL-2 (R&D Systems, Minneapolis MN) foram adicionadas durante 24 horas adi- cionais. As células foram lavadas, 20 lU/mL de IL-2 foram adicionadas em todas as células, seguidas pela adição de proteínas de fusão IL-12, com uma série de diluição de duas vezes começando em 20 ng/mL (em termos de contribuição de massa relativa de IL-12 para a molécula). Vinte e quatro horas depois, a concentração de IFNy foi medida por ELISA utilizando pares de anticorpos obtidos na R&D Systems.

Os resultados destes dois experimentos separados utilizando PBMCs de doadores diferentes estão resumidos na Tabela 1.

Tabela 1: Atividade biológica de variações de Ab-ILI2 em um ensaio de in- dução de IFNy.

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*(n=2)

Comparada com hu IL-12 recombinante, a atividade de Ab-IL12 com p40 do tipo selvagem era aproximadamente 10 vezes menor. Foi ob- servado que as proteínas variantes de anticorpo-IL12 testadas não afetavam significativamente de forma adicional a atividade da proteína. Ab-IL12p40V1 até Ab-IL12p40V8 tinham de alguma maneira a atividade reduzida (aproxi- madamente 1,5-3 vezes menor) comparadas com a proteína de fusão anti- corpo-IL-12 do tipo selvagem correspondente.

Exemplo 6: Farmacocinética das proteínas IL-12 contendo as variações de p40

Foi determinada a farmacocinética das proteínas de fusão com anticorpo contendo as variações de p40. Os experimentos foram realizados utilizando técnicas padronizadas familiares aos versados na técnica. Sucin- tamente, camundongos BALB/c (n=3 por grupo de tratamento) receberam injeção com 25 pg de Ab-IL12 ou variações de Ab-IL12 contando as varia- ções p40V1, p40V2, p40V3, p40V4, p40V5, p40V6, p40V7 e p40V8 em um volume de 0,2 mL, de forma intravenosa na veia caudal ou de forma subcu- tânea. Em vários pontos de tempo até 24 horas e até 96 horas, respectiva- mente, pequenos volumes de sangue foram tirados através do sangramento retro-orbital e coletados em tubos revestidos com heparina para prevenir a coagulação. Após a centrifugação para remover as células, o plasma foi ana- lisado através da captura com anti-soro anti-IgG humana H&L e da detecção com um anticorpo anti-IL-12 humana. Os resultados foram normalizados com a concentração inicial no plasma de cada camundongo tirado dentro do período de 30 segundos após a injeção (t=0). A figura 26 é uma compilação de experimentos representativos que avaliam a farmacocinética da proteína administrada de forma intravenosa. Foi descoberto que comparada com a proteína de controle do tipo selvagem, as proteínas de fusão anticorpo-1L-12 contendo as variações p40V1 e p40V2, p40V3, p40V4, assim como p40V6, tinham valores farmacocinéticos significativamente melhorados. Particular- mente, foi observado que a meia-vida da fase de distribuição (fase alfa) a - proximadamente duplicou e de forma correspondente a AUC das proteínas variantes aproximadamente duplicou também. Entretanto, a fase de elimina- ção (fase beta) de todas as proteínas de fusão Ab-IL-12 permaneceu subs- tancialmente similar. Estes resultados eram coerentes com a farmacocinéti- ca destas proteínas quando administradas ao camundongo de forma subcu- tânea. A figura 27, painel A, mostra uma comparação de Ab-IL12 do tipo sel- vagem com variações de Ab-IL12 contendo p40 V1, p40 V2, p40 V3 e p40 V4 e o painel B mostra uma comparação de Ab-IL12 do tipo selvagem com variações de Ab-ILI2 contendo p40 V5, p40 V6, p40 V7 e p40 V8.

Exemplo 7. Tratamento de um paciente humano com variações de IL-12p40 As variações de IL-12p40 da invenção são utilizadas para pre- venir e tratar doenças e distúrbios humanos como a seguir. Em geral, o mé- todo preferido de administração é através de infusão i.v. ou de injeção i.v. ou através de injeção subcutânea, inalação, embora o fornecimento oral e ou- tros métodos também sejam possíveis.

Um paciente com câncer de próstata metastásico avançado, com um histórico de tratamento por quimioterapia convencional, é tratado como a seguir com uma proteína de fusão anticorpo-IL12 contendo uma va- riação de IL-12p40. A dose da proteína de fusão anticorpo-IL12 por ciclo de tratamento é de aproximadamente 150 microgramas por kg de peso corporal e pode ser fornecida em um único dia ou dois ou três dias adjacentes, com administração através de infusão por gotejamento. O tratamento pode ser combinado com um tratamento de padrão-de-cuidado para câncer de prósta- ta que é determinado por um médico como sendo apropriado para o pacien- te. Fármacos antiinflamatóriòs não esteroidais, por exemplo, Naproxen®, também são prescritos. Os ciclos de tratamento são repetidos aproximada- mente uma vez a cada três semanas.

Um paciente com câncer de mama refratário a hormônios é tra- tado por infusão por gotejamento com uma proteína de fusão anticorpo-IL12 contando uma variação de IL-12p40. Fármacos antiinflamatóriòs não este- roidais, por exemplo, Naproxen® também são prescritos.

Em uma estratégia de tratamento alternativa, um paciente com câncer de próstata refratário a hormônios avançado ou câncer de mama re- fratário a hormônios avançado é tratado com a proteína de fusão anticorpo- IL12 contendo uma variação de IL-12p40 aproximadamente uma vez a cada três semanas, em combinação com uma imunocitocina contendo IL-2 tal como KS-IL2. Estes dois agentes podem ser co-administrados através de infusão por gotejamento. Antes do tratamento, o paciente recebe doses com uma quantidade imunoestimuladora de ciclofosfamida. Fármacos antiinfla- matórios não esteroidais, por exemplo, Naproxen® também são prescritos.

Um paciente com artrite reumatóide é tratado com uma proteína de fusão Fc-p40, em que a subunidade p40 é uma variação de IL-12p40, aproximadamente uma vez a cada duas semanas a uma dose de aproxima- damente 8 mg/kg, com administração através de infusão por gotejamento. É observado que a progressão da destruição de juntas é significativamente inibida pela monoterapia, mesmo quando comparada com fármacos anti- reumáticos que modificam a doença.

Claims

1. Variação de um domínio D3 da IL-12p40, caracterizada pelo fato de que a variação possui pelo menos 85% de identidade de seqüência com um domínio D3 da IL-12 p40 humana do tipo selvagem e compreende uma alteração de aminoácido em uma ou mais posições correspondentes aos resíduos nas posições 258-266 da IL-12 p40 humana madura parental.

2. Variação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a alteração elimina o sítio de protease entre Lys260 e Arg261.

3. Variação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a alteração é uma substituição ou uma deleção.

4. Variação de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a alteração é uma substituição selecionada do grupo que consis- te em Lys258, Lys260, Lys263 e Lys264.

5. Variação de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que uma ou mais das substituições a seguir de aminoácidos são se- lecionadas: Lys258Gln, Lys260Ala, Lys260Asn, Lys260Gln, Lys260Gly, Lys263Gly, Lys263Ser e Lys264Gly.

6. Variação de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que a substituição ocorre pelo menos na posição Lys260.

7. Variação de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a -6, caracterizada pelo fato de que a substituição repõe um aminoácido básico com um aminoácido que não é básico, selecionado do grupo que consiste em Ala, Asn, Gln ou Gly.

8. Variação de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que a variação compreende ainda uma ou mais substituições nas posições Ser259, Arg261 ou Arg 266.

9. Variação de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que as substituições são Ser259 e Arg261.

10. Variação de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pe- lo fato de que as substituições são Ser259Asp, Lys260Asn e Arg261Thr.

11. Variação de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda a substituição Lys264Gly.

12.'Variação de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que adicionalmente um ou ambos os resíduos Lys263 e Asp265 são deletados.

13. Variação de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteri- zada pelo fato de que um ou mais resíduos correspondentes a Lys263, Lys264, Asp 265 e Arg266 são deletados.

14. Variação de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteri- zada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais das substituições se- lecionadas do grupo que consiste em: Lys263, Lys264, Asp 265 e Arg266, em que o resíduo de aminoácido original correspondente é substituído por um aminoácido que não é básico.

15. Variação de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracteriza- da pelo fato de que compreende ainda uma ou mais substituições seleciona- das do grupo que consiste em: Lys258, Ser259, Arg261, Lys263 e Lys264.

16. Variação de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que as substituições são Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln e Arg261Asp.

17. Variação de acordo com a reivindicação 16, caracterizada peio fato de que compreende ainda as substituições Lys263Ser e Lys264Gly.

18. Variação de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pe- lo fato de que compreende (i) as substituições a seguir: Ser259Asp, Lys260Asn e Arg261Thre (ii) as deleções a seguir: Lys263, Lys264 e Asp265, em que as ditas posições são relacionadas à molécula do tipo selvagem não modifica- da, formando assim a linha de seqüência Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Arg nas posições 258 - 263 da variação.

19. Variação de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pe- lo fato de que compreende (i) as substituições a seguir: Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr e Lys264Gly e (ii) as deleções a seguir: Lys263 e Asp265, em que as ditas posições são relacionadas à molécula do tipo sel- vagem não modificada, formando assim a linha de seqüência: Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Gly - Arg nas posições 258 - 264 da variação.

20. Variação dé acordo com a reivindicação 3, caracterizada pe- lo fato de que compreende as substituições a seguir: Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp5, formando as- sim a linha de seqüência: Gln - Asp - Gln - Asp - Glu - Lys - Lys - Arg nas posições 258 - 265 da variação.

21. Variação de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pe- lo fâto de que compreende as substituições a seguir: Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp, Lys263Ser, Lys264Gly, formando assim a linha de seqüência: Gln - Asp - Gln - Asp - Glu - Ser- Gly - Arg nas posições 258 - -265 da variação.

22. Proteína IL-12 ou um fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de que contém a variação como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21.

23. Proteína IL-23 ou um fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de que contém a variação como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21.

24. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreen- de uma variação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou uma proteína como definida na reivindicação 22 ou 23, e um anticorpo ou uma parte ativa do mesmo.

25. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que a dita vari- ação ou a dita proteína é fundida com o C-terminal do dito anticorpo ou da parte do anticorpo.

26. Ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que codifica uma variação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou uma proteína como definida na reivindicação 22 ou 23, ou uma proteína de fusão como definida na reivindicação 24 ou 25.

27. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compre- ende o ácido nucléico como definido na reivindicação 26.

28. Célula hospedeira que produz uma variação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, uma proteína como definida na reivindicação 22 ou 23, ou uma proteína de fusão como definida na reivindi- cação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de ex- pressão como definido na reivindicação 27.

29. Composição farmacêutica adequada para o tratamento de doenças ativadas por IL-12 ou IL-23, caracterizada pelo fato de que compre- ende uma quantidade farmacologicamente ativa uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 25, opcionalmente junto com um diluente ou excipiente veículo farmaceuticamente aceitável.

30. Uso de uma composição farmacêutica como definida na rei- vindicação 29, caracterizado pelo fato de que é para a produção de um me- dicamento para o tratamento de câncer ou de uma doença auto-imune.