ES2253887T3 - Anticuerpos agonistas del receptor de g-csf y metodo de cribado de los mismos. - Google Patents
Anticuerpos agonistas del receptor de g-csf y metodo de cribado de los mismos.Info
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Abstract
Un anticuerpo agonista o uno de sus fragmentos de unión que se une específicamente o interacciona con el receptor de G-CSF humano y le dimeriza, en el que dicha dimerización estimula la proliferación y la diferenciación celular.
Description
Anticuerpos agonistas del receptor de
G-CSF y método de cribado de los mismos.
Esta solicitud reivindica prioridad a la
Solicitud Provisional de EE.UU. Serie No. 60/083.575, presentada el
30 de Abril de 1998.
El proceso mediante el cual las células
sanguíneas crecen, se dividen y se diferencian en la médula ósea, se
denomina hematopoyesis (Dexter, T. M., y Spooneer, E., Annu. Rev.
Cell Biol., 3:423,1987). Existen muchos tipos diferentes de células
sanguíneas que pertenecen a distintos linajes celulares. Cada uno de
los diversos tipos de células sanguíneas proceden de células
pluripotentes que son capaces de sufrir
auto-renovación, o dar lugar a células progenitoras
que proporcionan la totalidad de los diferentes tipos de células
maduras. Tres clases generales de células son producidas in
vivo: glóbulos rojos (eritrocitos), plaquetas y glóbulos
blancos (leucocitos), estando implicados la gran mayoría de estos
últimos en la defensa inmunitaria del hospedante.
La proliferación y diferenciación de las células
precursoras hematopoyéticas están reguladas por una familia de
citoquinas que incluyen los factores estimulantes de colonias
(CSFs) y las interleuquinas (Arai, K-I., et
al., Annu. Rev. Biochem. 1990, 59:783-836). Por
lo menos cuatro citoquinas están implicadas en la producción de
neutrófilos y macrófagos, a saber, la
interleuquina-3 (IL-3), el factor
estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos
(GM-CSF), el factor estimulante de colonias de
granulocitos (G-CSF) y el factor estimulante de
macrófagos (M-CSF). Entre ellos, el
G-CSF actúa específicamente sobre células
restringidas al linaje de los granulocitos neutrófilos (Demetri,
G.D., y Griffin, J. D., Blood, 1991, 78:2791-2808).
El principal efecto biológico del G-CSF in
vivo es el aumento de la proliferación y diferenciación de
neutrófilos procedentes de los progenitores comprometidos (Cohen,
A.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987,
84:2484-2488). El G-CSF potencia,
asimismo, la emigración, supervivencia y función de los neutrófilos
maduros, incluyendo el incremento de la actividad fagocítica y la
matanza antimicrobiana (Crawford, J., et al., N. Engl. J.
Med., 1991, 325:164-170, Moore, M.A.S., Annu. Rev.
Immunol., 1991, 9:159). Este proceso fisiológico sirve de fundación
para sistemas críticos de defensa del hospedante y tiene lugar, a
gran escala, in vivo.
La semivida de una forma comercial de
G-CSF humano recombinante (Neupogen®, Amgen. Inc.)
in vivo es solamente 3,5 horas y ha de administrase
diariamente para mantener el nivel umbral de G-CSF
que se requiere para estimular la generación de neutrófilos
(Physician's Desk Reference, 53ª, 1999, 532-537).
Los principales efectos secundarios del tratamiento terapéutico con
el G-CSF humano recombinante
("rhG-CSF"), a dosis mas altas, es dolor óseo,
debido presumiblemente al alto nivel transitorio de
rhG-CSF in vivo que ocurre inmediatamente
después de la inyección; no obstante, es menos frecuente en
pacientes que reciben dosis más bajas de
rhG-CSF.
Se están investigando diversos medios de
prolongar la semivida in vivo del rhG-CSF,
incluyendo la conjugación con polietilenglicol (PEG). Sin embargo,
un informe reciente indica que los conjugados con PEG poseían una
actividad considerablemente inferior a la de las proteínas sin
modificar, con una correlación inversa entre el peso molecular de
los restos de PEG conjugados con la proteína y la actividad in
vitro. Véase la publicación de Bowen S., et al., Exp.
Hemat., 1999, 27:425-432. Además, resultados
obtenidos de estudios en animales indican que el
rhG-CSF conjugado con PEG extiende la semivida a 1 a
3 días, pero no va más allá de esto.
Por contraste con el PEG conjugado con el
rhG-CSF, la semivida in vivo de anticuerpos
monoclonales ("mAbs") es de alrededor de 2-3
semanas, dependiendo del isotipo del anticuerpo. Se ha anticipado
que una inyección única de un anticuerpo agonista contra el receptor
de G-CSF humano puede proporcionar una actividad
semejante a la del G-CSF durante varias semanas. Así
pues, los pacientes sometidos a tratamiento de quimioterapia y con
neutropenia crónica grave, podrían beneficiarse potencialmente de
visitas hospitalarias menos frecuentes debido a la actividad
biológica prolongada de mAbs agonistas. Adicionalmente, los niveles
mantenidos del anticuerpo agonista en la circulación sanguínea
podría continuar estimulando la proliferación y diferenciación de
progenitores de neutrofilos, poniendo de manifiesto, por
consiguiente, mayor potencia, lo que da como resultado el uso de
dosis más bajas y posiblemente, menos efectos secundarios que el
Neupogen® u otros derivados del rhG-CSF.
Diversas acciones del G-CSF son
desencadenadas por la unión de G-CSF, a través de
sus dos sitios discretos de unión, a sus receptores, formando un
complejo de ligando/receptores 1:2. El receptor de
G-CSF, expresado sobre las células progenitoras de
granulocitos neutrófilos y en células comprometidas maduras,
pertenece a la superfamilia de los receptores hematopoyéticos /de
citoquinas. Aun cuando la mayoría de los miembros de la familia,
incluyendo los receptores de las interleuquinas desde la
interleuquina-2 (IL-2) a
IL-7 y el factor estimulante de colonias de
macrófagos-granulocitos (GM-CSF),
son activados mediante la formación de complejos heterómeros que
componen subunidades \alpha, \beta, y frecuentemente, incluso
subunidades \gamma, se opina que la proteína del receptor del
G-CSF, que consiste en un polipéptido de una sola
cadena, forma un complejo homodímero por unión al ligando (Fukunaga,
R., et al., J. Bio. Chem., 1990, 265:14008).
Se ha indicado que la homodimerización del
receptor del G-CSF, es esencial para la transducción
de la señal (Wells, J.A., y Vos, A.M., Annu. Rev. Biochem., 1996,
65:609). El receptor del G-CSF no contiene un
dominio intrínseco de proteína quinasa, aun cuando la actividad de
tirosina quinasa parece ser esencial para la transducción de la
señal del G-CSF. La señal procedente de la
activación del receptor del G-CSF a través de la
homodierización del receptor inducida por el G-CSF
es medida por la unión no covalente de varias tirosina quinasas, por
ejemplo, JAK1 y JAK2 (Barge, R.M. Y., et al., Blood, 1996,
87:2148-2153), y después de ello la fosforilación de
los factores de transcripción Stats tales como Stat3 y Stat5 (Tian,
S-S., et al., Blood, 1994,
84:1760-1762; Watowich, S.S., et al., Annu.
Rev. Cell Dev. Biol., 1996, 12:91; Dong F., et al., J.
Immunol., 1998, 161:6503-6509). Estas tirosina
quinasas desempeñan un papel esencial para la fosforilación del
receptor de G-CSF y la activación de Stats en
respuesta al G-CSF (Tian S-S, et
al., Blood, 1996, 88:4435-4444; Shimoda, K.,
et al., Blood, 1997, 90:597-604).
Excepto para el receptor del
G-CSF, las funciones de los receptores para la
eritropoyetina ("EPO"), la hormona del crecimiento ("GH"),
el receptor de prolactina ("PRL") y la trombopoyetina
("TPO") aparecen también desencadenadas por la homodimerización
del receptor inducida por el ligando, que resulta en la
fosforilación de un conjunto específico de quinasas (Youssoufian,
H., et al., Blood, 1993, 81:2223; Alexander, W.S., et
al., EMBO, 1995, 14:5569; Heldin C.H., Cell, 1995, 83:213). Por
tanto, los métodos de cribado descritos en la invención, se
utilizan para seleccionar agonistas de receptor del de
G-CSF basándose en su aptitud para causar
transducción de la señal sobre la homodimerización y proliferación
de células que llevan el receptor.
Anticuerpos antagonistas han sido descritos en el
documento WO 95/21684 y por Layton et al., Growth Factors,
1997, vol. 14, pp. 117-130. El documento WO 97/12977
describe péptidos como agonistas para el receptor del
G-CSF.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
agonista o uno de sus fragmentos de unión que dimeriza el receptor
de G-CSF humano, en que dicha dimerización estimula
la proliferación y la diferenciación celular.
Por tanto, la invención se refiere a moléculas de
anticuerpos agonistas interactivas con el receptor de
G-CSF humano, que, por unión o interacción con tales
receptores, desempeñan los mismos papeles biológicos que desempeñan
los ligandos. La invención incluye moléculas de anticuerpos
agonísticas capaces de unirse o interaccionar con dos proteínas del
receptor de G-CSF humano. Estas moléculas
agonísticas incluyen moléculas de anticuerpos totales, tanto
policlonales como monoclonales, así como también sus formas
modificadas o derivadas, incluyendo fragmentos de inmunoglobulinas
tales como F(ab') bivalente, capaces de ejercer el mismo
efecto agonista o similar que el G-CSF nativo. Los
anticuerpos agonistas y los fragmentos pueden derivarse de un
animal, ser quiméricos de humano-ratón, humanizados
DeImmunised^{TM} o totalmente procedentes de seres humanos.
Por unión a dos receptores de
G-CSF, los anticuerpos agonistas del receptor de
G-CSF estimulan el crecimiento y/o la diferenciación
de células que expresan el receptor de G-CSF. Esto
se consigue por unión al dominio extracelular del receptor de
G-CSF, y dimerizando el receptor de
G-CSF con lo que ocurre la activación de la
fosforilación de quinasas asociadas con el receptor de
G-CSF. Estas células que expresan el receptor del
G-CSF comprenden, en general, células
hematopoyéticas progenitoras/pluripotentes, primitivas, y por tanto
los agonistas pueden promover que las células hematopoyéticas
primitivas se diferencien y/o proliferen, conduciendo a una
repoblación de las células del linaje de los granulocitos
neutrófilos.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método de cribado de anticuerpos agonistas del receptor del
G-CSF, usando un sistema de análisis in vitro
basado en células. Según se describe más adelante, pueden
transfectarse células con el receptor de G-CSF, o
la parte del receptor de G-CSF que es activada por
unión al agonista, y después las células pueden ser monitorizadas
para determinar su proliferación en presencia de la molécula de
anticuerpo agonista.
La invención incluye también el uso de tales
anticuerpos agonistas, tanto con fines de diagnóstico como para
aplicaciones terapéuticas. Los hibridomas que producen anticuerpos
agonistas ejemplares, designados mAb163-93 y
mAb174-74-1i, han sido depositados
en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.
Manassas, VA 20110-2209 ("ATCC"), bajo los
números de catálogo HB-12699 y
HB-12700, respectivamente.
La Fig 1A muestra que la proliferación de la
célula parental de ratón 32D-c123 es estimulada
solamente por el rmIL-3, pero no por el
rhG-CSF (R and D Byosystems), determinada por un
ensayo MTT.
La Fig 1B muestra que una vez transfectadas las
células 32D-c123 con la longitud total del receptor
de G-CSF humano, la proliferación de las células D4
transfectantes puede ser estimulada por rmIL-3 y
rhG-CSF, por separado, determinada mediante un
ensayo MTT.
La Fig. 1C muestra que la absorción de
^{3}H-timidina por las células D4 transfectantes
aumenta de un modo dependiente de la concentración cuando se hacen
crecer en medios que contienen rmIL-3 o
rhG-CSF, pero no el mAb testigo.
La Fig. 2 muestra la fosforilación de tirosina de
la JAK1 quinasa en las células D4 transfectadas con el receptor del
G-CSF humano de longitud total, inducida por el
rhG-CSF. La misma fosforilación de tirosina de la
JAK1 quinasa no puede ser detectada en las células parentales
32D-c123, incluso en la presencia del
rhG-CSF (R and D Biosystems). Como el testigo
positivo, las células AML-193 respondientes al
G-CSF humano (ATCC No. CRL-9589) que
expresan el receptor de G-CSF humano endógeno,
muestran también que la fosforilación de tirosina de la JAK1 quinasa
es inducida por estimulación del rhG-CSF IP:
Inmunoprecipitación con los anticuerpos como se indica en la
figura. Transferencia: detección con anticuerpos conjugados con HRP
según se indica. Anti-pTyr: anticuerpo 4G10
anti-fosfotirosina (Upstate Biotechnology, Lake
Placid, NY).
La Fig. 3 muestra la unión de
mAb163-93 a la proteína quimérica de receptor de
G-CSF/IgG4(Fc) mediante el método ELISA. La
proteína de receptor de G-CSF humano/IgG4(Fc)
fue captado por el anticuerpo IgG(Fc) de cabra
anti-humano revestido sobre la placa Immulon 2. La
unión del anticuerpo mAb163-93 del ratón a la
proteína quimérica de receptor de G-CSF
humano/IgG4(Fc) se detectó por unión del anticuerpo
IgG(Fc) de cabra anti-ratón conjugado con
peroxidasa de rábano picante.
La Fig. 4A muestra que el porcentaje de unión de
mAb163-93, pero no del testigo mAb
G3-519 igualado en isotipo, a las células D4 del
ratón transfectadas con el receptor de G-CSF humano
de longitud total, aumenta de un modo que depende de la
concentración determinado por análisis FACS. La Fig. 4B muestra que
el mAb163-93 se une específicamente a células D4 del
ratón que expresan el receptor de G-CSF humano de
longitud total, pero no a sus células parentales
32D-c123 como está indicado por los porcentajes de
unión a las células.
La Fig. 5A y 5B muestran la proliferación de
células D4 del ratón transfectadas con el receptor de
G-CSF humano, estimulada por diversos anticuerpos
agonistas monoclonales del ratón, incluyendo el
mAb163-93 y el
mAb174-74-11, medida mediante un
análisis MTT. El mAb G33-519 emparejado en isotipo,
contra HIV-gpt120, y rhG-CSF (R and
D Biosystems) fueron establecidos como los testigos negativo y
positivo.
La Fig. 5C muestra que una serie de anticuerpos
monoclonales, que incluye el mAb163-93 y el
mAb174-74-11, pueden estimular la
proliferación de las células D4 de ratón transfectadas con el
receptor de G-CSF humano, como viene indicado por el
aumento de la incorporación de ^{3}H-timidina.
Las Figs. 6A y 6B muestran la fosforilación de
tirosina de la quinasa JAK2 (Fig. 6A) y el factor de la
transcripción Stat3 (Fig. 6B) en las células D4 de ratón
transfectadas con el receptor de G-CSF humano,
estimulada por las citoquinas rmIL-3,
rhG-CSF, y el anticuerpo agonista
mAb163-93.
Las Figs. 7A y 7B muestran un ensayo cuantitativo
para estimular la formación de colonias de granulocitos a partir de
médula ósea humana. Fig. 7A: rhG-CSF y
mAb163-93 de ratón (El testigo mAb
G3-519 está emparejado en isotipo con el
mAb163-93) y Fig. 7B: otros mAbs agonistas, de
ratón
La Fig. 8 muestra la formación de colonias de
granulocitos neutrófilos a partir de médula ósea humana, estimulada
por: 8A: mAb G3-519 testigo de igual isotipo; 8B:
rhG-CSF (R and D Biosystems; 8C. anticuerpo
monoclonal agonista mAb163-93; 8D: Morfología de
células recogidas desde la colonia de 8C, después de tinción de las
células.
La Fig. 9 muestra que el
mAb163-93 del ratón puede estimular la formación de
colonias de granulocitos procedentes de médula ósea del chimpancé,
de un modo dependiente de la concentración.
La Fig. 10 muestra la formación de colonias de
granulocitos neutrófilos procedentes de médula ósea del chimpancé,
estimulada por: 10A: anticuerpo monoclonal G3-519
de igual isotipo, en la concentración de 50 nM. 10B:
rhG-CSF (R and D Biosystems), en la concentración de
0,5 nM; 10C; anticuerpo monoclonal agonista
mAb163-93 en la concentración de 5 nM; 10D:
Morfología de células recogidas desde la colonia de C, después de
tinción de las células.
La Fig. 11 muestra que el
mAb163-93 agonista frente al receptor de
G-CSF humano, estimula la proliferación de células
NFS60 del ratón que expresan el receptor G-CSF
endógeno del ratón.
Las SEQ ID NOS. 1 a 6 representan diversos
cebadores utilizados para clonar el receptor de
G-CSF.
Las SEQ ID NOS. 7 a 14 representan diversos
cebadores utilizados para clonar regiones variables de dos
anticuerpos agonistas de la invención.
Las SEQ ID NOS. 15 a 26 representan las
secuencias de aminoácidos de las CDRs (ambas cadenas, ligera y
pesada) de dos anticuerpos agonistas de la invención.
La SEQ ID NO. 27 representa la secuencia de
aminoácidos del dominio extracelular del receptor de
G-CSF humano.
Los anticuerpos agonistas del receptor de
G-CSF descritos en esta memoria, preferiblemente
hacen diana en epítopos situados dentro del dominio extracelular del
receptor de G-CSF. Los agonistas ejemplares
incluyen los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas
celulares de hibridomas 163-93 y
174-74-11.
Los anticuerpos monoclonales agonistas de la
invención pueden ser producidos mediante inmunización y fusión
(véase el Ejemplo 4 que figura más adelante), o a partir de
linfocitos aislados, usando la transformación de EBV, o a través de
células de insecto o de mamífero transfectadas con el receptor del
G-CSF humano. Los anticuerpos agonistas son,
preferiblemente, anticuerpos quiméricos, DeImmunised^{TM},
humanizados o humanos, para uso clínico. Tales anticuerpos pueden
reducir la inmunogenicidad y evitan por tanto la respuesta de
anticuerpo humano anti-ratón (HAMA). Es preferible
que el anticuerpo sea IgG4, IgG2 u otra IgG o Ig; mutada
genéticamente que no aumente la citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpos (S.M. Canfield y S.L. Morrison, J. Exp. Med.,
1991:173:1483-1491) ni la citólisis que ocurre con
mediación de complementos (Y.Xu et al., J. Biol.
Chem., 1994:269:3468-3474; V.L. Pulito et
al., J. Immunol. 1996:156:2840-2850).
Se producen anticuerpos quiméricos mediante
procesos de DNA recombinante bien conocidos en la técnica, y poseen
regiones variables animales y regiones constantes humanas. Los
anticuerpos humanizados poseen un mayor grado e secuencias
peptídicas humanas que los anticuerpos quiméricos. En un anticuerpo
humanizado, solamente las regiones de determinación de la
complementariedad (CDRs) que son responsables de la unión y de la
especificidad del antígeno, proceden de animales y poseen una
secuencia de aminoácidos que corresponde al anticuerpo del animal, y
sustancialmente todas las porciones restantes de la molécula
(excepto, en algunos casos, porciones pequeñas de las regiones del
marco de lectura dentro de la región variable) son de procedencia
humana y corresponden en la secuencia de aminoácidos a una
anticuerpo humano. Véase L. Riechmann et al., Nature,
1988; 332:323-327; G. Winter, Patente de Estados
Unidos No. 5.225.539; C. Queen et al., patente de EE.UU.
número 5.530.101.
Los anticuerpos DeImmunised^{TM} son
anticuerpos en los que los epítopos potenciales de los linfocitos T
y B han sido eliminados, según se ha descrito en la solicitud de
patente internacional PCT/GB98/01473. Por consiguiente, es de
esperar que su inmunogenicidad en los seres humanos disminuya
sustancialmente cuando se aplican in vivo.
Pueden prepararse anticuerpos humanos mediante
varios modos diferentes, incluyendo el uso de bibliotecas de
expresión de inmunoglobulinas humanas (Stratagene Corp., La Jolla,
California) para producir fragmentos de anticuerpos humanos
V_{H}, V_{L}, Fv, Fd, Fab o (Fab')_{2}), y usar estos
fragmentos para construir anticuerpos humanos completos usando
técnicas similares a las empleadas para producir anticuerpos
quiméricos. También pueden producirse anticuerpos humanos en ratones
transgénicos con un genoma de inmunoglobulina humana. Tales ratones
pueden obtenerse de Abgenix, Inc., Fremont, California, y Medarex,
Inc., Annandale, New Jersey.
Todos los anticuerpos total y parcialmente
humanos, son menos inmunógenos que los mAbs totalmente murinos. Los
fragmentos bivalentes, asimismo adecuados para usar en la invención,
son también menos inmunógenos. Es menos probable, por tanto, que
todos estos tipos de anticuerpos originen una respuesta inmunógena
en los seres humanos. Por consiguiente, son más adecuados para la
administración in vivo, a seres humanos que los anticuerpos
animales totales. en especial cuando es necesaria una administración
repetida o prolongada, como puede predecirse para los anticuerpos
agonistas de la invención.
Una alternativa a la administración de
anticuerpos al paciente es generar anticuerpo agonistas
endógenamente, mediante técnicas de terapia génica. Secuencias de
DNA que codifican los anticuerpos agonistas o sus fragmentos,
derivados o análogos, pueden distribuirse in vivo usando
vectores estándar en terapia génica, incluyendo los adenovirus,
AAV o un retrovirus, o mediante un sistema de distribución no
vectorial. La expresión mantenida de los anticuerpos agonistas o
sus fragmentos, puede tener ventajas adicionales para el tratamiento
clínico de la neutropenia crónica.
El dominio extracelular del receptor de
G-CSF humano (usado para generar anticuerpos contra
el receptor de G-CSF humano, en la invención) puede
ser generado utilizando tecnología de DNA recombinante molecular
bien conocida en la técnica. El dominio extracelular se extiende
desde los números 1-603 de los restos de aminoácidos
del receptor de G-CSF humano maduro, partiendo desde
su extremo amino terminal (SEQ ID NO:27). Véanse, por ejemplo, las
patentes de EE.UU. Nos. 5.589.456, 5.422.248 y 5.574.136. Sin
embargo, una parte del dominio extracelular del receptor de
G-CSF humano, en forma purificada o parcialmente
purificada, puede usarse también como el inmunógeno.
Este dominio extracelular del receptor de
G-CSF humano puede emplearse directamente como el
inmunógeno para inmunizar animales, por ejemplo, ratones, o
primeramente puede fusionarse con una molécula transportadora para
aumentar su inmunogenicidad antes de llevar a cabo la inmunización.
Las moléculas transportadoras adecuadas incluyen péptidos, por
ejemplo, Tag, Flag, leucina-zip o una proteína, por
ejemplo, glutatión-S-transferasa
(GST), fosfatasa alcalina (AP), interna o una región constante de
una inmunoglobulina (como se utilizó para producir los anticuerpos
agonistas descritos más adelante). La molécula transportadora puede
ser conjugada al G-CSF mediante técnicas de DNA
recombinante. Además de mejorar la inmunogenicidad, tales proteínas
quiméricas de fusión que contienen el dominio extracelular del
receptor de G-CSF pueden facilitar también la
purificación del antígeno, cuando se emplea cromatografía de
afinidad. Los fragmentos de DNA que codifican estos antígenos que
contienen el dominio extracelular del receptor de
G-CSF, pueden colocarse en vectores de expresión que
después son transfectados en células huésped tales como E.
coli, levadura, células de insecto y células de mamífero,
incluyendo células COS de simio, células de ovario de hámster chino
(CHO) o células de mieloma. Los antígenos producidos mediante este
método pueden purificarse luego mediante procedimientos bien
conocidos en la técnica.
Los inmunógenos adecuados incluyen mutantes del
dominio extracelular del receptor de G-.CSF nativo o de tipo
salvaje, con sustituciones, deleciones o inserciones, tanto si han
sido generados artificialmente o son naturales. También pueden
emplearse como inmunógenos células que expresan el receptor de
G-CSF o sus análogos. Tales células incluyen
células humanas primarias y líneas celulares tales como la
AML-193, células humanas o de ratón (u,
opcionalmente, células de insecto, utilizando baculovirus como
vector de expresión) transfectadas con vectores para expresar la
longitud total o una parte del receptor de G-CSF, o
una proteína quimérica que contenga el dominio extracelular del
receptor de G-CSF (Takhashi, T., et al., J.
Biol. Chem., 1996, 271:17555-17560).
Para generar anticuerpos agonistas contra el
receptor de G-CSF (policlonales o monoclonales), los
inmunógenos descritos en esta memoria pueden ser usados para
inmunizar roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsters y cobayas)
u otros mamíferos, con inclusión de conejos, cabras, ovejas,
primates no humanos, o ratones transgénicos, que expresan
inmunoglobulinas humanas, o ratones con inmunodeficiencia grave
combinada (SCID) a los que se han trasplantado linfocitos B humanos
o médula ósea humana, mediante los procedimientos bien conocidos en
la técnica. Pueden generarse hibridomas mediante procedimientos
convencionales por fusión de linfocitos B procedentes de animales
inmunizados con células de mieloma (por ejemplo, Sp2/0 y NSO) según
fue descrito por G. Köhler y C. Milstein (Nature, 1975,
256:495-497). También pueden generarse anticuerpos
contra el receptor de G-CSF rastreando bibliotecas
de Fy o Fab recombinantes, de una sola cadena, procedentes de
linfocitos B humanos o médula ósea humana en sistemas de exposición
de fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 1991, 227:381; Marks
et al. J. Mol. Biol., 1991, 222:581).
La selección de anticuerpos específicos para el
receptor de G-CSF puede llevarse a cabo mediante
ensayo de inmunoabsorbente con enzimas ligadas (ELISA), tales como
ensayos "sándwich" directos o indirectos, en los que el
antígeno o, preferiblemente, una proteína quimérica de receptor de
G-CSF/IgG4(Fc) se deposita, directa o
indirectamente, sobre las placas en forma de capa. Tal unión del
anticuerpo mAb163-93 a la proteína quimérica,
detectada mediante el método ELISA, se muestra en la Fig. 3. Un
ensayo ELISA competitivo puede ser usado para identificar
anticuerpos cuyos epítopos están próximos o están sobrepuestos a los
del ligando (Current protocols in molecular biology, compilador,
Ausubel, F. M. et al., publicado por Wiley Interscience,
1996).
El rhG-CSF (R and D Biosystems,
Minneapolis, MN) puede ser usado en un ensayo ELISA competitivo
después de que la proteína quimérica de receptor de
G-CSF/IgG4(Fc) es depositada en forma de
capa, directa o indirectamente, sobre las placas de ELISA. La unión
de anticuerpos al receptor de G-CSF puede
determinarse por adición del segundo anticuerpo
anti-ratón, tal como el anticuerpo de cabra
anti-ratón. El segundo anticuerpo
anti-ratón puede conjugarse con diversos compuestos
y proteínas para la detección, incluyendo peroxidasa de rábano
picante.
La especificidad de unión de los anticuerpos al
receptor de G-CSF humano expresado sobre la
superficie de células tales como las células D4 del ratón
transfectantes, descritas más adelante en esta memoria, puede
determinarse mediante análisis FACS (Ejemplo 6). Como indica la Fig.
4A, el anticuerpo monoclonal murino mAb163-93 se une
específicamente a las células D4 del ratón transfectantes que
expresan el receptor G-CSF humano, pero no el mAb
testigo. Además, el mAb163-93 se une específicamente
a las células D4 que expresan el receptor G-CSF
humano, pero no sus células parentales 32D-c123
(Fig. 4B)
El método de cribado de anticuerpos agonistas del
receptor de G-CSF mediante ensayos in vitro
de la función biológica de base celular, se incluye también en la
invención. Para cribado a gran escala de agonistas, uno de tales
enfoques implica construir una línea celular que responda al
G-CSF tal como la NFS60, en la que ha sido integrada
una construcción de la casete para expresar un gen informador bajo
el control del promotor de genes que responden a
G-CSF (Schindler, C. y Darnell, J. E., Ann. Rev.
Biochem., 1995, 64:621). El informador usado en esta invención puede
ser la luciferasa o la galactosidasa, proteína de fluorescencia
verde o la dihidrofolato reductasa (Pelletier, J.N., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95:4290). Midiendo las actividades
enzimáticas o las densidades de la fluorescencia de las células
después de estimulación, pueden seleccionarse los agonistas contra
el receptor de G-CSF, mediante cribado de alto
rendimiento.
Los ensayos in vitro de la función
biológica basados en células, para agonistas, con inclusión de
anticuerpos agonistas, deben incluir también un ensayo in
vitro de la proliferación celular. Como una de las realizaciones
preferidas de la invención, se construyó una línea D4 de células del
ratón que expresan el receptor de G-CSF humano de
longitud total, y se utilizó para el cribado a gran escala de
anticuerpos agonistas, que se combinó con ensayo colorimétrico
basado en MTT. El sistema de ensayo colorimétrico usando MTT está
diseñado para la cuantificación espectrofotométrica del crecimiento
celular en respuesta a citoquinas y sus agonistas, sin el uso de
isótopos radiactivos. Las líneas celulares de ratón parentales tales
como la BaF3 y FDC-P1 o, preferiblemente, la
32D-c123 del Ejemplo 7 de la invención, son
dependientes de mIL-3 y adecuadas como células
huésped para la expresión de la longitud total del receptor de
G-CSF humano (Hapel, A.J., et al., Blood,
1984, 64:786-790). Después de la transfección con un
vector en el que la expresión del receptor G-CSF
humano de longitud total está bajo el control del promotor hCMV
constitutivo, y después de selección, los transfectantes, tales como
D4, también se hacen respondientes al G-CSF, como se
demuestra mediante un ensayo MTT y un ensayo de absorción de
^{3}H-timidina, como se describe en el Ejemplo 7
que figura a continuación y se muestra en la Fig. 1.
La fosforilación de la tirosina quinasa JAK1 en
la línea celular D4 transfectante de ratón, es inducida por
rhG-CSF (R and D Biosystems) del mismo modo que la
línea celular AML-193 humana, que expresan el
receptor endógeno de G-CSF humano (Fig. 2). Como se
describe en el Ejemplo 7, el uso de la línea celular D4 de ratón
transfectada con el receptor G-CSF humano, combinado
con el ensayo MTT, facilita en gran manera el proceso de cribado de
anticuerpos agonistas. Este método de cribado puede emplear también
líneas celulares humanas nativas dependientes de
G-CSF, tales como la AML-193,
líneas celulares del ratón que expresan mutantes del receptor de
G-CSF humano, o proteínas quiméricas que incluyen el
dominio extracelular del receptor de G-CSF humano
fusionadas con el dominio intracelular de otro receptor de
citoquina, tal como el receptor de eritropoyetina (Goldsmith, M.A.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998,
95:7006-7011) o el receptor de Fas (Takahashi, T.
et al., J. Biol. Chem., 1996,
271:17555-17560).
Un ensayo de formación de colonias de
granulocitos usando médula ósea humana, puede usarse también para el
cribado de anticuerpos agonistas de la invención. Además, este
ensayo puede utilizarse también para determinar la potencia,
eficacia y especificidad de anticuerpos agonistas para estimular la
proliferación y diferenciación de granulocitos neutrófilos desde
médula ósea humana, y sus especies de reactividad cruzada con
primates no humanos. Los resultados de este ensayo muestran que los
anticuerpos agonistas de la invención actúan como el
G-CSF humano recombinante y estimulan
específicamente la diferenciación y la proliferación de granulocitos
neutrófilos desde médula ósea humana de un modo que depende de la
concentración. Además, el anticuerpo agonista
mAb163-93 muestra eficacia en este ensayo
esencialmente la misma que el rhG-CSF (Fig. 7).
Además, las células recogidas desde las colonias estimuladas por el
mAb agonista procedentes de médula ósea humana, manifiestan una
morfología de los neutrófilos típica (Fig. 8D). Ha de entenderse que
el rhG-CSF, después de inyección, es retirado
rápidamente de la circulación in vivo principalmente por la
vía renal, lo que da como resultado sus efectos farmacológicos de
corta duración (Tanaka, H., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.,
1989, 251:1198-1203; Layton, J.E., et al.,
Blood, 1989, 74:1303-1307). Por otra parte, en el
ensayo de formación de colonias de granulocitos descrito en la
invención, el rhG-CSF pone de manifiesto una
actividad mantenida estimulando la proliferación y diferenciación de
neutrófilos desde médula ósea humana, en comparación con la de in
vivo, debido a la carencia de tal mecanismo de clarificación.
Puede anticiparse que la potencia del anticuerpo agonista
mAb163-93, debida a su larga semivida in
vivo, para estimular la proliferación y diferenciación de
neutrófilos, será igual o incluso mayor que la del
rhG-CSF, como sugiere la comparación de la hormona
de crecimiento humano Pegilada de semivida larga y la hormona de
crecimiento humano (Clark, R., et al., J. Bio. Chem., 1996,
271:21969-21977).
Usando las técnicas de cribado anteriores, se
generó una serie de anticuerpos agonistas monoclonales, incluyendo
el mAb163-93 y
mAb174-74-11, contra el receptor de
G-CSF humano. El anticuerpo agonista
mAb163-93, que actúa como el G-CSF
humano recombinante, activa el receptor de G-CSF,
induce la fosforilación de tirosina de las JAK quinasas (Fig. 6A,
paneles de la mano izquierda en que la fosforilación se detecta
mediante anticuerpo anti-pTyr) y factores de la
transcripción (Fig. 6B, paneles de la mano izquierda en que la
fosforilación es detectada mediante anticuerpo
anti-pTyr). Se puso de manifiesto que varios
anticuerpos agonistas de la serie de anticuerpos generados en la
invención, estimulan la proliferación de células que responden al
G-CSF, in vitro (Fig. 5A-C).
Se puso de manifiesto que el mAb163.93 se une específicamente al
receptor de G-CSF sobre la superficie de la célula
(Figs. 4A y 4B). Además, estos anticuerpos agonistas del receptor
G-CSF humano estimulan la formación de colonias de
granulocitos neutrófilos desde la médula ósea humana, lo que es una
indicación adicional de su eficacia in vivo. (Figs. 7A, 7B
y 8A-C). Este es el primer caso de anticuerpos
monoclonales que estimulan la formación de colonias de granulocitos
neutrófilos desde médula ósea humana.
La reactividad cruzada de especies de los
anticuerpos agonistas del receptor de G-CSF humano
fue determinada también usando un ensayo de formación de colonias de
granulocitos. Se puso de manifiesto que estos anticuerpos agonistas
del receptor de G-CSF humano, tales como el
mAb163-93 estimulan específicamente la proliferación
y diferenciación en grados variables de granulocitos neutrófilos
desde médulas óseas de diversos primates no humanos (Tabla 1, que
figura seguidamente). El número de formación de colonias de
granulocitos estimulado por el anticuerpo agonista
mAb163-93 desde la médula ósea del chimpancé,
aumenta de un modo que depende de la concentración (Fig. 9). Los
resultados de la tinción celular muestran la especificidad de este
mAb agonista para estimular la proliferación y diferenciación de
neutrófilos desde la médula ósea del chimpancé, (Fig. 10). Este tipo
de ensayo de reactividad cruzada de especies puede ser usado para
seleccionar el modelo de animal apropiado para los estudios
preclínicos.
| Primate no humano | rhG-CSF (0,5 nM) | mAb163-93 |
| Chimpancé | 68 | 62 (5 nM) |
| Mono Rhesus | 43 | 41 (50 nM) |
| Mono Cynomolgus | 70 | 40 (50 nM) |
| Babuino | 36 | 3 (50 nM) |
La exposición anterior demuestra que anticuerpos
agonistas bivalentes son capaces de activar el receptor de
G-CSF, es decir, son capaces de unión cruzada de los
receptores de G-CSF de un modo que simula la
capacidad del G-CSF para formar un complejo y
activan el receptor.
El G-CSF humano recombinante ha
estado entre las primeras citoquinas a preparar mediante la
tecnología de DNA recombinante y se emplea con éxito en terapia.
Esta citoquina se utiliza ampliamente para reducir la incidencia de
infecciones asociadas con una diversidad de neutropenias congénicas
e introgénicas. Hasta la fecha, cinco indicaciones de enfermedades
para tratamiento con rhG-CSF han sido aprobadas por
la FDA de los Estados Unidos: (1) pacientes cancerosos que reciben
tratamiento quimioterápico mielosupresor; (2) pacientes con
tratamiento terapéutico de inducción o consolidación de leucemia
mieloide aguda; (3) pacientes cancerosos que reciben trasplantes de
médula ósea; (4) pacientes cancerosos con colección de células
progenitoras de sangre periférica y tratamiento terapéutico; y (5)
pacientes con neutropenia crónica grave (Physican's Desk Reference,
53ª edición, 1999, 532-537). La especificidad
funcional única del rhG-CSF sobre la proliferación y
diferenciación del linaje de granulocitos neutrófilos le hace útil
también en otras indicaciones de enfermedades, que incluyen
pacientes con HIV, pacientes con el síndrome de respuesta
inflamatoria sistémica (SIRS) y sepsis, y pacientes con infección
diabética del pie y otras enfermedades infecciosas (Miles, S.A.,
et al., Blood, 1990, 75:2137-2142;
Kuritzkes, D.R., et al., AIDS 1998, 12:65-74;
Weiss, M. et al., Blood 1999, 93:425-439;
Lancet, 1997, 350:855-859; Deresinski, S.C., et
al., Infect. Med. 1998, 15:856-70).
Los anticuerpos del receptor de
G-CSF humano descritos en esta memoria, actúan como
el rhG-CSF, activan el receptor de
G-CSF y estimulan la proliferación de células que
responden al G-CSF mediante su unión específica al
receptor de G-CSF sobre la superficie de las
células, a través del mecanismo de inducción de fosforilación de
tirosina de las JAK quinasas y factores de la transcripción. Además,
los anticuerpos agonistas del receptor de G-CSF
humano estimulan específicamente la formación de colonias de
granulocitos neutrófilos procedentes de la médula ósea humana, como
lo hace el rhG-CSF. Por tanto, es de esperar, en
general, que los anticuerpos agonistas del G-CSF
humano descritos en esta memoria, sean útiles en las mismas
aplicaciones terapéuticas que el rhG-CSF. Además la
semivida más larga y mayor estabilidad in vivo de los
anticuerpos agonistas proporciona ventajas potenciales importantes
sobre el tratamiento terapéutico empleado con anterioridad, con el
rhG-CSF.
Los anticuerpos agonistas de la invención pueden
ser administrados en una formulación farmacéutica apropiada mediante
diversas vías, que incluyen, aun cuando no se limitan a ellas, la
inyección intramuscular, intraperitoneal y subcutánea. Las dosis
pueden determinarse por extrapolación desde modelos de animales y
mediante experimentación rutinaria durante los ensayos clínicos.
Estos anticuerpos agonistas de la invención son
útiles también para la purificación por afinidad del receptor de
G-CSF a partir de un cultivo celular recombinante o
partiendo de la fuente natural. Las técnicas generales de
purificación por afinidad son bien conocidas en la técnica y
cualquiera de ellas puede usarse para este fin.
Los anticuerpos de la invención reaccionan
inmunológicamente con el dominio extracelular soluble del receptor
de G-CSF y células que expresan el receptor de
G-CSF sobre su superficie. Por tanto, la presente
invención proporciona también un método para detectar y determinar
inmunológicamente la existencia del receptor de
G-CSF en su forma soluble, y/o sobre la superficie
celular, usando métodos inmunológicos bien conocidos en la técnica.
La estructura del receptor normal, anormal o mutada o la expresión
del receptor pueden determinarse también usando los anticuerpos
descritos en esta memoria, mediante estudios de inmunorreactividad.
Los resultados pueden ser útiles con fines de diagnóstico y de
tratamiento.
Ejemplo
1
La clonación de la proteína del receptor de
G-CSF se llevó a cabo como sigue. Se usó como molde
en la PCR un ng de cDNA de médula ósea humana (Clontech, Palo Alto,
CA). Éste se añadió a 100 \mul de una mezcla de reacción, que
incluía los cebadores: AAG TGG TGC TAT GGC AAG GCT G (SEQ ID NO:1);
y CAC TCC AGC TGT GCC CAG GTC TT (SEQ ID NO: 2), en una
concentración final de 500 nM. Se sabe que estos cebadores son
homólogos con los extremos 5' y 3' del cDNA que codifica la parte
extracelular del receptor de G-CSF humano. Las
condiciones de reacción fueron las siguientes: 1 minuto a 94ºC; 30
segundos a 62ºC; 3 minutos a 72ºC; se repite durante 40 ciclos.
Se aisló desde el gel de agarosa un fragmento de
DNA resultante de la PCR (aproximadamente 1,6 kb), según el
protocolo de BIO101 Inc. (Vista, CA). y luego se insertó en un
vector de clonación TA (Invitrogen, Carlsbad, CA), obteniendo el
plásmido recombinante pT1-11. La secuencia de DNA de
esta inserción se determinó secuenciando ambas cadenas de esta
inserción usando un kit de secuenciación de DNA procedente de United
States Biochemical (Cleveland, Ohio). El fragmento de DNA que
codifica la parte extracelular del receptor de G-CSF
humano (usando la secuencia definida por Fukunaga, R., et
al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. Usa, 1990, 87:8702) en el
pTi-11, se sometió a digestión con EcoRI, y los
extremos fueron rellenados por fragmento de Klenow. Después se
insertó en el plásmido pFc1 que contenía IgG4(Fc) codificada
por cDNA, que se sometió a digestión con Xba1. Los extremos fueron
rellenados por fragmento de Klenow, obteniendo el plásmido
pFT1-9. El fragmento de DNA que codifica la parte
extracelular del receptor de G-CSF humano e
IgG4(Fc) en el pFT1-9 se sometió a digestión
con Ase1 e HincII, se rellenó por fragmento de Klenow y luego se
insertó en el vector de expresión de mamífero pcDNA3 (Invitrogen).
Este vector se sometió a digestión con EcoRV e HincII y luego se
rellenó por fragmento de Klenow, obteniendo el plásmido pCGC23, en
el que la expresión de la parte extracelular de
G-CSFR humano/IgG4(Fc) está bajo el control
del promotor hCMV.
Ejemplo
2
Células NSO fueron transfectadas con pCGC23
linearizado, como sigue. 4 x 10^{7} células NSO
fase-log fueron recolectadas y resuspendidas en 0,8
ml de medio IMDM suplementado con FBS al 2%. Después de incubación
con 10 \mug de DNA plasmídico linearizado, durante 10 minutos,
sobre hielo, la mezcla de células se sometió a electroporación a 200
voltios y 960 \muF usando un aparato BioRad. Al cabo de 20 minutos
sobre hielo, se añadió a cada pocillo de aproximadamente veinte
placas de 96 pocillos, 100 \mul de la suspensión celular diluida.
Dos días más tarde, se añadió a cada pocillo otros 100 \mul del
mismo medio IMDM pero que contenía G418 (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD), obteniendo la concentración final de G418 de 0,8 mg/ml. Después
de 10 días, los sobrenadantes del cultivo fueron retirados para
examinar la expresión de la parte extracelular de la proteína de
fusión receptor de G-CSF humano/IgG4(Fc)
mediante el método ELISA, del modo siguiente.
Los pocillos de placas de Immulon 2 (Dynatech
Laboratories, Chantilly, VA) fueron recubiertos con 50 \mul de
anticuerpo IgG(Fc) anti-humano en una
concentración de 1 \mug/ml y se incubó durante la noche a
temperatura ambiente. Después de separar la solución de
revestimiento por vibración de las placas, se añadieron a cada
pocillo, a temperatura ambiente, 200 \mul de BLOTTO (leche en
polvo desnatada al 5% en PBS) para bloquear las uniones
inespecíficas. Una hora después, los pocillos fueron lavados con
tampón PBST (PBS que contenía Twee 20 al 0,05%). Se recogieron
cincuenta microlitro de sobrenadante del cultivo desde cada pocillo
de las placas de transfección, y se mezclaron con 50 \mul de
BLOTTO, y luego se añadieron a pocillos individuales de las
microplacas. Al cabo de una hora de incubación a temperatura
ambiente, los pocillos fueron lavados con PBST. La proteína de
fusión de receptor de G-CSF humano/IgG4(Fc)
extracelular unida fue detectada por reacción con peroxidasa de
rábano picante conjugada con IgG de cabra
anti-humana (H+L) (Jackson ImmunoResearch
Laboratories, West Grove, PA), que se diluyó a 1:2000 en BLOTTO. Se
añadieron a cada pocillo solución de sustrato de peroxidasa, que
contenía 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma, St.
Louis, MO) al 0,1% y peróxido de hidrógeno (Sigma) al 0,0003%, para
desarrollar el color y se dejó durante 30 minutos. La reacción se
terminó mediante adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 0,2 M por
pocillo. Se midió la densidad óptica
(DO_{450-570}) de la mezcla de reacción con un
lector ELISA de BioTek (BioTek Instruments, Winooski, VT).
Los transfectantes con alta lectura de la
DO_{450-570} fueron recogidos y se llevó a cabo
una clonación celular por el método de dilución limitante. El mismo
método ELISA y la misma detección descrita en el párrafo anterior
fueron hechos para identificar adicionalmente la línea celular de
alta producción que expresa la proteína de fusión que comprende la
parte extracelular de la proteína quimérica del receptor de
G-CSF y la IgG4(Fc).
Ejemplo
3
Un litro del sobrenadante del cultivo procedente
de las células transfectantes que expresan la parte extracelular de
la proteína quimérica de G-CSFR
humano/IgG4(Fc) fue recogido y la proteína quimérica de
purificó a partir del sobrenadante mediante cromatografía de
afinidad de Prosep-A, según las indicaciones del
fabricante (Bioprecessing Ing., Princeton, NJ). La proteína se
purificó adicionalmente en una columna de afinidad de
IgG(Fc) anti-humana de cabra. La pureza de
esta proteína quimérica se determinó mediante
SDS-PAGE e inmunotransferencia.
Ejemplo
4
Ratones BALB/c (Harlanm Houston, TX) fueron
inyectados por vía subcutánea con 50 \mug de la proteína de fusión
purificada que consistía en la parte extracelular del receptor de
G-CSF humano e IgG4(Fc) en adyuvante de
Freund completo (Difco Laboratories, Detroit, MI) y en 200 \mul de
solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) Los ratones
recibieron una dosis de refuerzo 2 y 4 semanas después, de la misma
cantidad de la proteína de fusión en adyuvante de Freund incompleto.
Luego dos semanas después y tres días antes de sacrificarlos, los
ratones recibieron una dosis final de refuerzo por vía i.p. Sus
células de bazo fueron fusionadas con células de mieloma Sp2/0 y 5
x 10^{8} de las células Sp2/0 y 5 x 10^{8} células de bazo
fueron fusionadas en un medio que contenía polietilenglicol (PM
1450) al 50% (Kodak, Rochester, NY). y sulfóxido de dimetilo (Sigma,
St. Louis, MO) al 5%. Las células fueron ajustadas luego a la
concentración de 5 x 10^{4} células de bazo por 200 \mul de
suspensión en medio Iscove (Gibco BRL, Gaithersburg, MD),
suplementado con FBS al 5%, 100 unidades/ml de penicilina, 100
\mug/ml de estreptomicina, hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 0,4
\muM y timidina 16 \muM. Doscientos mililitros de la suspensión
de células se añadieron a cada uno de los pocillos de un centenar de
microplacas. Al cabo de diez días, se separaron los sobrenadantes
del cultivo para su exploración usando el ensayo in vitro de
proliferación celular descrito en el Ejemplo 7.
Ejemplo
5
Se preparó el RNA total procedente de la línea
celular humana AML-193 (ATCC, No. de catálogo
CRL-9589) mediante el kit de aislamiento de RNA
Ultraspec-3 según el procedimiento operatorio del
fabricante (Biotex Laboratories Inc., Houston, TX). Se usaron diez
microgramos del RNA total procedente de la línea celular
AML-193 como el molde para la síntesis de la
primera cadena de cDNA en la reacción de transcripción inversa,
según el protocolo del fabricante (Gibco BRL, Gaithersberg, MD).
Para amplificar el cDNA que codifica la mitad del extremo carboxilo
terminal del receptor de G-CSF humano, se
llevó a cabo PCR en 50 \mul de mezcla de reacción que contenía dos
cebadores: Nhe1:CCC CCC CAG CGC TAG CAA TAG CAA CAA GAC CTG GAG G
(SEQ ID NO:3) y R10: GGA ATT CCT AGA AGC TCC CCA GCG CCT CC (SEQ ID
NO:4) usando como molde la primera cadena de cDNA obtenida. Las
condiciones de reacción fueron las siguientes: 94ºC durante 1
minuto; 60ºC durante 1 minuto, y 72ºC durante 3 minutos, para 40
ciclos. El producto de la PCR fue clonado en el vector de clonación
pUC19 y sometido a digestión con Sma1, obteniendo el plásmido pC3.
Para crear un nuevo sitio Nhe1 de segmentación enzimática en el
extremo del fragmento de cDNA que codifica la mitad del extremo
amino terminal del receptor de G-CSF humano, se
usaron dos cebadores en la reacción de PCR, usando el plásmido
pCGC23 DNA como molde. Estos cebadores fueron T7P: AAT ACG ACT CAC
TAT AG (SEQ ID NO: 5); Y Nhe2 AGG TCT TGT TGC TAT TGC TAG CGC TGG
GGG GGC CCA GG (SEQ ID NO: 6). El fragmento de DNA que codifica la
mitad del extremo amino terminal del receptor de
G-CSF humano procedente de esta reacción de PCR, fue
clonado en el vector pCR-Blunt (Invitrogen,
Carlsbad, CA), obteniendo el plásmido pB12. Para ajustar la longitud
total del DNA del receptor de G-CSF humano, el
fragmento de la mitad del extremo amino terminal del receptor de
G-CSF procedente del plásmido pB12 se insertó en el
plásmido pC3 y se sometió a digestión con Nhe1 e HincII, obteniendo
el plásmido pCB1. El fragmento de cDNA que codifica la longitud
total del receptor de G-CSF humano, se insertó en el
plásmido de expresión de mamífero pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA)
obteniendo el plásmido pCGF4.
Ejemplo
6
El receptor de G-CSF humano de
longitud total que expresa el plásmido pCGF4, después de
linearización con digestión con BspC1, fue transfectado en la línea
celular del ratón 32D-c13, o en la línea celular
humana TF-1 (ATCC, VA) mediante electroporación,
según se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Los
transfectantes fueron seleccionados por crecimiento en el medio RPMI
1640 suministrado con FBS al 10%, G418 a 0,8 mg/ml y
mIL-3 a 1 ng/ml, o GM-CSF humano a 1
ng/ml (R and D Systems, Minneapollis, MN), y se seleccionaron
posteriormente mediante un ensayo MTT usando medio RPMI con FBS al
10%, G418 a 0,6 mg/ml y rhG-CSF a 1 ng/ml (R and D
systems) según se describe en el Ejemplo 7. Los transfectantes cuyo
crecimiento había sido estimulado por G-CSF humano
fueron sometidos posteriormente a clonación unicelular mediante el
método de dilución limitante.
La dependencia de la proliferación del
G-CSF humano de ambos transfectantes, humano y del
ratón, que contenían el plásmido de expresión del receptor de
G-CSF humano de longitud total, se determinó
cultivando estos transfectantes en presencia o ausencia de
G-CSF humano, GM-CSF humano o
IL-3 de ratón, según se describe en el Ejemplo 7. La
dependencia de la proliferación de los transfectantes de estas
citoquinas fue verificada usando el ensayo MTT y el ensayo de
absorción de ^{3}H-timidina, según se describe en
el Ejemplo 7.
Los transfectantes que expresan
G-CSFR humano sobre la superficie de la membrana
celular fueron confirmados mediante análisis FACS. Después de lavar
con PBS más BSA al 1%, 50 \mul del anticuerpo monoclonal
purificado se añadieron a las células transfectantes en una
concentración final de 5 \mug/ml. Las mezclas de células fueron
incubadas sobre hielo durante 30 minutos y agitadas cada 15 minutos.
Después de lavar con PBS frío tres veces se añadió a las células
transfectantes IgG[F(ab')_{2}]
anti-ratón de cabra conjugada con FITC, en una
dilución 1:50 y se incubó durante 30 minutos sobre hielo. Después
de lavar tres veces con PBS frío, las células fueron fijadas con
paraformaldehído al 1% durante la noche. El porcentaje de unión
celular de las células transfectantes con estos mAbs fue analizado
mediante análisis FACS.
Ejemplo
7
Se utilizó el ensayo colorimétrico basado en MTT
(Boekhorst P.A., et al., Leukemia 1993,
7:1637-44) para explorar y determinar la aptitud de
anticuerpos agonistas para estimular la proliferación líneas
celulares de ratón o humanas transfectadas con el receptor
G-CSF humano. Las células transfectantes
precultivadas en medio RPMI que contenía FBS al 10% y 1 ng/ml de
mIL-3, fueron lavadas con RPMI con FBS al 10%, tres
veces, para separar la mIL-3, y luego fueron
depositadas en placas a 2-5 x 10^{4}/pocillo en
medio RPMI con FBS al 10%. Se añadieron a cada pocillo los
sobrenadantes de las placas de hibridoma, o anticuerpos purificados.
Después de tres días de incubación, se añadió a cada pocillo diez
microlitros de MTT (2,5 mg/ml en PBS,
Boehringer-Maimheim, Biochemical). Al cabo de seis
horas de incubación, se añadieron 100 \mul de solución
solubilizante que contenía SDS al 10% y HCl 0,01 N, para lisar las
células, y las placas fueron incubadas durante la noche. La
proliferación de estas células dependiente de G-CSF,
estimulada por los anticuerpos agonistas, puede ser verificada por
lectura de la densidad óptica, OD_{540-690}. En el
ensayo MTT para determinar las actividades agonistas de anticuerpos
purificados, el rhG-CSF y los anticuerpos fueron
diluidos, en series de diluciones al doble, por duplicado o
triplicado.
La capacidad de estos anticuerpos agonistas para
estimular células transfectantes del receptor hG-CSF
puede determinarse también usando un ensayo de absorción de
^{3}H-timidina. Después de lavar tres veces con
medio sin citoquina que contenía FBS al 10%, 1-2 x
10^{4} células transfectantes (50 \mul/pocillo) fueron mezcladas
con concentraciones diversas de mIL3, rhG-CSF (R and
D Byosistems), sobrenadantes del cultivo de hibridomas o anticuerpos
purificados, en placas de 96 pocillos que contenían RPMI 1640 y FBS
dializado al 10%. Se añadió luego a cada pocillo 1 \muCi de
^{3}H-timidina (actividad específica: 6,7 Ci/mmol,
New England Nuclear) mezclado con 50 \mul del mismo medio. Al
cabo de 48 horas de incubación las células fueron recolectadas
mediante un recolector de células (Skatron, VA) y se midió la
absorción de ^{3}H-timidina, por triplicado,
mediante un analizador de centelleo líquido (Packard,
IL).
IL).
\newpage
Ejemplo
8
Los anticuerpos generados a partir de los
hibridomas fueron purificados por cromatografía de afinidad de
Prosep-A, según las indicaciones del fabricante
(Bioprocessing Inc., Princepton, NJ). La pureza de los anticuerpos
agonistas del G-CSFR humano fue comprobada usando
SDS-PAGE y transferencia Western. Dos de los Mabs
purificados fueron designados como mAb163-93 y
mAb174-24-11.
Ejemplo
9
Aproximadamente 10 ml de células de médula ósea
humana procedentes de voluntarios sanos fueron recogidos y
sometidos a separación de Ficoll-Paque, según el
método estándar. Las células de la interfase fueron recolectadas
cuidadosamente por aspiración con pipetas Pasteur, suspendidas con
tres volúmenes de IMDM y FBS al 2%, y después sometidas a
centrifugación durante 5 minutos a 400 g. La utilización de este
procedimiento operatorio proporciona una suspensión final de células
de médula que está enriquecido de 2 a 4 veces respecto al contenido
de las células primitivas debido a que las células mieloides, más
maduras y más densas se separan con los glóbulos rojos. Para
determinar la especificidad de estos anticuerpos agonistas de
G-CSFR humano, se llevó a cabo un ensayo de
formación de colonias de granulocitos según el protocolo
proporcionado por el fabricante (StemCell Technologics Inc.,
Vancouver, (Canadá). Para medir cuantitativamente la potencia y
eficacia de anticuerpos agonistas para estimular la formación de
colonias de granulocitos neutrófilos desde médula ósea humana o de
chimpancé, se empleó, por duplicado en este ensayo, una serie de
concentraciones diferentes de anticuerpos agonistas o
rhG-CSF Como muestran las Figs. 7 y 9, el
anticuerpo agonista mAb163-93, a semejanza del
rhG-CSF (R and D Biosystems), estimula la formación
de colonias de granulocitos neutrófilos desde la médula ósea humana
y del chimpancé de un modo que depende de la concentración. Los
resultados de tinción celular ponen de manifiesto la especificidad
de este mAb agonista para estimular la proliferación y
diferenciación de neutrófilos desde la médula ósea humana y del
chimpancé (Figs. 8 y 10).
Ejemplo
10
La fosforilación de tirosina inducida por
citoquinas y los anticuerpos agonistas, se analizó del modo
siguiente. Se recogieron aproximadamente 2 x 10^{7} células en
fase-log. y se privaron de alimento en medio RPMI,
sin suero durante cuatro horas después de lavar tres veces con medio
sin suero. Las células privadas de alimento fueron estimuladas con
mIL-3, rhG-CSF (R and D Biosystems)
o el mAb agonista, en una concentración final de 2,6 nM durante 15
minutos, y después se recolectó por centrifugación. Las células
fueron lisadas en 0,5 ml de tampón de lisis (Tris.HCl 50 mN, pH
7,5/NaCl 150 mM/Tritón X-100 al 1% (vol/vol)/EDTA 1
mM, con la adición de Na_{3}VO_{4} 1 mM, pepsatina 1 \muM
3,4-dicloroisocpunmarina 50 \muM, floruro de
fenilmetilsulfonilo 1 mM, 1,10-fenantrolina 1 mM,
leupeptina (10 \mug/ml) y aprotinina (10 \mug/ml). Después de
incubar sobre hielo durante 30 minutos, los lisados fueron
clarificados por centrifugación 15 minutos a 14.000 rpm. Para
inmunoprecipitación, se añadieron a los lisados claros anticuerpos
policlonales de conejo contra JAK1, JAK2 o Stat 3 (Upstate
Biotechnology, Lake Placid, NY), y se incubó durante dos horas a
4ºC. Después se añadieron a cada lisado 50 \mul de bolas de
proteína A (Gibco BRL) y se continuó la incubación a 4ºC durante dos
horas. Después de la incubación, las bolas se lavaron tres veces con
el tampón de lisis y se suspendieron en 35 \mul de tampón de
muestra de Laemmli (Tris 62,5 mM, pH 7,6, SDS al 2%, glicerina al
10% y 2-mercaptoetanol al 5%). La suspensión se
calentó a 95ºC durante 5 minutos y se sometió a electroforesis sobre
SDS al 4%-7,5%-PAGE. Después de someter a transferencia, los filtros
bloqueados fueron incubados con anticuerpo monoclonal de ratón
anti-fosfotirosina 4G10 (Upstate Biotechnology)
conjugado con HRP, durante la noche, a 4ºC, según el protocolo del
fabricante. Después de lavar con PBS y PBS con Tween 20 al 0,05% los
filtros fueron detectados con el kit SuperSignal Substrate (Pierce,
Rockford, IL), según las indicaciones del fabricante. Los filtros de
nitrocelulosa fuern vueltos a ensayar con los anticuerpos y un
segundo anticuerpo conjugado con la peroxidasa de rábano picante
(HRP) según se ha indicado.
Ejemplo
11
Se preparó RNA total a partir de células de
hibridomas productoras de anticuerpos agonistas y se uso como moldes
en la reacción de RT-PCR según se ha descrito en el
Ejemplo 1. Los cebadores usados en estas reacciones de PCR están
listados en las SEQ ID NOS: 7 a 14 que figuran seguidamente. Los
fragmentos de DNA generados a partir de las reacciones de PCR fueron
clonados en un vector de clonación pCR-Blunt
(Invitrogen), y analizados después usando el secuenciador
automático de DNA Genetic Analyzer 310 (PE Applied Biosystems,
Foster City, CA) según las indicaciones de fabricante. Los plásmidos
recombinantes individuales procedentes de dos reacciones de
RT-PCR separadas, se analizaron para confirmar las
secuencias de DNA de las regiones variables de las cadenas pesadas
y ligeras de los anticuerpos agonistas
Las secuencias de DNA de los cebadores usados
para clonar regiones variables fueron:
Cebadores para clonar regiones variables del
mAb163-93:
- Para la cadena ligera:
- Para la cadena pesada:
Cebadores para clonar el
mAb174-74-11
- Para la cadena ligera:
- Para la cadena pesada:
Se puso de manifiesto que las regiones de
determinación de la complementariedad de las regiones variables de
estos anticuerpos tenían las secuencias siguientes:
mAb163-93 (subclase de IgG1),
secuencias de las CDR de la cadena pesada de la región variable:
- Secuencias de las CDR de la cadena ligera de la región variable del mAb163-93:
\newpage
mAb174-74-11
(subclase de IgG2a), secuencias de las CDR de la cadena pesada de
la región variable:
- Secuencias de las CDR de la cadena ligera de la región variable de mAb174-74-11:
Ha de entenderse que los términos, expresiones,
ejemplos y realizaciones que se han descrito anteriormente en esta
memoria son solamente ejemplares y no limitantes, y que el alcance
de la invención está definido en las reivindicaciones que siguen, e
incluye todos los equivalentes de la invención expuestos en las
reivindicaciones.
<110> Baofu Ni
\hskip1cmBill N.C. Sun
\hskip1cmCecily R.Y. sun
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> G-CSF Anticuerpos
agonistas del receptor G-CSF y método de cribado de
los mismos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 98-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/083,575
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-04-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DMA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtggtgct atggcaaggc tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactccagct gtgcccaggt ctt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccccccagc gctagcaata gcaacaagac ctggagg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattccta gaagctcccc agcgcctcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatacgactc actatag
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtcttgtt gctattgcta gcgctggggg ggcccagg
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgggcwtca agatggagtc acakwyycwg
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactggatggt gggaagatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggmttggg tgtggamctt gctattcctg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtggatag acagatgggg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggatttwc aggtgcagat twtcagcttc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactggatggt gggaagatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgractttg ggytcagctt grttt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtggatag accgatgggg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Tyr Gly Met Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr
Ala Gly Asp Phe Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp
Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr
Arg Lys Asn Tyr Leu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Tyr Ala Met Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr
Pro Gly Thr Leu Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> ratón
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp
Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Val
His}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Thr Ser Asn leu Ala Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
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<400> 26
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\sa{Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 603
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> humana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Un anticuerpo agonista o uno de sus fragmentos
de unión que se une específicamente o interacciona con el receptor
de G-CSF humano y le dimeriza, en el que dicha
dimerización estimula la proliferación y la diferenciación
celular.
2. El anticuerpo agonista o uno de sus fragmentos
de unión, según la reivindicación 1, que estimula la proliferación y
la diferenciación de neutrófilos o sus células progenitoras.
3. El anticuerpo agonista o uno de sus fragmentos
de unión, según la reivindicación 1 ó 2, que interacciona con la
parte extracelular del receptor de G-CSF
humano.
4. El anticuerpo agonista o uno de sus fragmentos
de unión, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque el inmunógeno usado para generar dicho
anticuerpo o su fragmento de unión comprende G-CSF
humano o uno de sus mutantes con sustituciones, inserciones o
deleciones, con tal que el anticuerpo o su fragmento de unión
resultante se una al receptor de G-CSF humano.
5. El anticuerpo agonista o uno de sus fragmentos
de unión, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que
interacciona en un epítopo entre los restos de aminoácidos
1-603 (SEQ ID NO: 27) del receptor de
G-CSF.
6. El anticuerpo agonista o uno de sus fragmentos
de unión, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es
un anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos de unión tal como
el F(ab)'_{2}.
7. El anticuerpo agonista o uno de sus fragmentos
de unión, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el
que las CDRs de la región variable de la cadena pesada del
anticuerpo agonista incluyen las secuencias de aminoácidos
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y en el que las CDRs de la región
variable de la cadena ligera incluyen las secuencias de aminoácidos
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
8. El anticuerpo agonista o uno de sus
fragmentos de unión, según una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 6, en el que las CDRs de la región variable de la cadena pesada
del anticuerpo agonista incluyen las secuencias de aminoácidos
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
y en el que las CDRs de la región
variable de la cadena ligera del anticuerpo agonista incluyen las
secuencias de aminoácidos
siguientes:
9. El anticuerpo agonista o uno de sus fragmentos
de unión, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se
une al mismo epítopo que el anticuerpo agonista según la
reivindicación 7 u 8.
10. El anticuerpo agonista o uno de sus
fragmentos de unión, según una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 9, en el que el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión
estimula la proliferación de células humanas o del ratón que
expresan el receptor de G-CSF humano, determinada en
un ensayo in vitro.
11. Una línea celular de hibridomas que produce
el anticuerpo monoclonal agonista o su fragmento de unión, según se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.
12. Una secuencia de DNA que codifica el
anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos de unión, según se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13.Un sistema de distribución de genes que
incluye la secuencia de DNA según la reivindicación 12.
14. El sistema de distribución de genes según la
reivindicación 13, que incluye las secuencias de DNA que codifican
las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO.: 15 a 20 ó SEQ
ID NO.: 21 a 26, o que codifican uno de sus fragmentos de unión,
según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
15. El sistema de distribución de genes según la
reivindicación 13 ó 14, en el que el sistema de distribución incluye
un vector viral, un plásmido o un sistema de distribución no
vectorial.
16. El uso de la molécula de agonista según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para preparar una
composición farmacéutica para tratar la neutropenia.
17. Un método de cribado de alta productividad
para un anticuerpo que posee actividad de agonista del
G-CSF, que comprende construir una línea celular que
responde al G-CSF, tal como la NFS60, con una
construcción capaz de expresar un gen informador, tal como
luciferasa, b-galactosidasa, proteína de
fluorescencia verde o dihidrofolato reductasa, bajo el control de un
promotor que responde al G-CSF, y medir las
actividades enzimáticas o las densidades de la fluorescencia de las
células después de estimulación por el anticuerpo que ha de ser
ensayado.
18. El método según la reivindicación 17, en el
que el ensayo se usa en combinación con un sistema de análisis
colorimétrico tal como medida de la reducción de bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) o un ensayo de absorción, utilizando células que expresan el
receptor de G-CSF.
19. El método según la reivindicación 17, en el
que la construcción incluye la secuencia del dominio extracelular
del receptor de G-CSF.
20. Un método in vitro para detectar
inmunológicamente el receptor de G-CSF humano por
medio de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 10.
21. Un método in vitro para la detección
inmunológica de una célula que expresa el receptor de
G-CSF humano sobre la superficie de la célula, por
medio de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 10.
22. Un método in vitro para detectar y
determinar inmunológicamente un receptor de G-CSF
humano, soluble, por medio de un anticuerpo según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10.
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