KR20010043112A - 항체에 대한 ｇ-ｃｓｆ 수용체 및 이를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

항체에 대한 ｇ-ｃｓｆ 수용체 및 이를 스크리닝하는 방법 Download PDF

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KR20010043112A
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Abstract

본 발명은 세포 증식 및 분화를 촉진시키는 수용체와 관련된 카이나제의 인산화반응을 활성화시키거나 수용체를 이량체시키고, 사람 G-CSF 수용체에 특이적으로 결합하거나 상호작용할 수 있는 작용 분자에 관계한다. 이와 같은 작용 분자에는 단클론 항체, 이의 단편, 동사체 또는 유사체 또는 펩티드 또는 유기 화합물이 포함된다. 생쥐 단클론 작용 항체의 두가지 예를 들어 mAb163-93 및 mAb174-74-11을 설명하고 있다.

Description

항체에 대한 Ｇ-ＣＳＦ 수용체 및 이를 스크리닝하는 방법{G-CSF receptor agonist antibodies and screening method therefor}
SEQUENCE LISTING
＜110＞ Baufu Ni
Bill N.C. Sun
Cedily R.Y. Sun
＜120＞ G-CSF Receptor Agonist Antibodies and
Screening Method Therefor
＜130＞ 98-3
＜140＞ 09/303,155
＜141＞ 1998-04-30
＜150＞ 60/083,575
＜151＞ 1998-04-30
＜160＞ 27
＜170＞ FastSEQ for Windows Version 4.0
＜210＞ 1
＜211＞ 22
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 1
aagtggtgct atggcaaggc tg 22
＜210＞ 2
＜211＞ 23
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 2
cactccagct gtgcccaggt ctt 23
＜210＞ 3
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 3
cccccccagc gctagcaata gcaacaagac ctggagg 37
＜210＞ 4
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 4
ggaattccta gaagctcccc agcgcctcc 29
＜210＞ 5
＜211＞ 17
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 5
aatacgactc actatag 17
＜210＞ 6
＜211＞ 38
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 6
aggtcttgtt gctattgcta gcgctggggg ggcccagg 38
＜210＞ 7
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ mouse
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 7
atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 31
＜210＞ 8
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 8
actggatggt gggaagatgg 20
＜210＞ 9
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 9
atggmttggg tgtggamctt gctattcctg 30
＜210＞ 10
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 10
cagtggatag acagatgggg g 21
＜210＞ 11
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 11
atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 30
＜210＞ 12
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 12
actggatggt gggaagatgg 20
＜210＞ 13
＜211＞ 25
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 13
atgractttg ggytcagctt grttt 25
＜210＞ 14
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial primer sequence
＜400＞ 14
cagtggatag accgatgggg c 21
＜210＞ 15
＜211＞ 5
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 15
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
＜210＞ 16
＜211＞ 17
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 16
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gly Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
＜210＞ 17
＜211＞ 12
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 17
Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
＜210＞ 18
＜211＞ 16
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 18
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
＜210＞ 19
＜211＞ 7
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 19
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
＜210＞ 20
＜211＞ 8
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 20
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr
1 5
＜210＞ 21
＜211＞ 5
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 21
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
＜210＞ 22
＜211＞ 16
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 22
Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Gly Thr Leu Lys
1 5 10 15
＜210＞ 23
＜211＞ 11
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 23
Glu Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
＜210＞ 24
＜211＞ 10
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 24
Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Val His
1 5 10
＜210＞ 25
＜211＞ 7
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 25
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
＜210＞ 26
＜211＞ 9
＜212＞ PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 26
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr
1 5
＜210＞ 27
＜211＞ 603
＜212＞ PRT
＜213＞ human
＜400＞ 27
Glu Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser Ala Pro Ile Val His Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ile Thr Ala Ser Cys Ile Ile Lys Gln Asn Cys Ser His Leu
20 25 30
Asp Pro Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg Leu Gly Ala Glu Leu Gly Pro
35 40 45
Gly Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ile
50 55 60
Thr Leu Pro His Leu Asn His Thr Gln Ala Phe Leu Ser Cys Cys Leu
65 70 75 80
Asn Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala
85 90 95
Gly Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu
100 105 110
Thr Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His
115 120 125
Leu Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys
130 135 140
Gln Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln
145 150 155 160
Ser His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met
165 170 175
Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro
180 185 190
Gln Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met
195 200 205
Leu Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly
210 215 220
Cys Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp Gln Pro Gly Leu His Ile Asn
225 230 235 240
Gln Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp
245 250 255
Ala Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys
260 265 270
Gly Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg
275 280 285
Trp Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu
290 295 300
Arg Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr Val Arg Leu Asp Thr Trp Trp Arg
305 310 315 320
Gln Arg Gln Leu Asp Pro Arg Thr Val Gln Leu Phe Trp Lys Pro Val
325 330 335
Pro Leu Glu Glu Asp Ser Gly Arg Ile Gln Gly Tyr Val Val Ser Trp
340 345 350
Arg Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ile Leu Pro Leu Cys Asn Thr Thr
355 360 365
Glu Leu Ser Cys Thr Phe His Leu Pro Ser Glu Ala Gln Glu Val Ala
370 375 380
Leu Val Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr Ser Arg Pro Thr Pro Val Val
385 390 395 400
Phe Ser Glu Ser Arg Gly Pro Ala Leu Thr Arg Leu His Ala Met Ala
405 410 415
Arg Asp Pro His Ser Leu Trp Val Gly Trp Glu Pro Pro Asn Pro Trp
420 425 430
Pro Gln Gly Tyr Val Ile Glu Trp Gly Leu Gly Pro Pro Ser Ala Ser
435 440 445
Asn Ser Asn Lys Thr Trp Arg Met Glu Gln Asn Gly Arg Ala Thr Gly
450 455 460
Phe Leu Leu Lys Glu Asn Ile Arg Pro Phe Gln Leu Tyr Glu Ile Ile
465 470 475 480
Val Thr Pro Leu Tyr Gln Asp Thr Met Gly Pro Ser Gln His Val Tyr
485 490 495
Ala Tyr Ser Gln Glu Met Ala Pro Ser His Ala Pro Glu Leu His Leu
500 505 510
Lys His Ile Gly Lys Thr Trp Ala Gln Leu Glu Trp Val Pro Glu Pro
515 520 525
Pro Glu Leu Gly Lys Ser Pro Leu Thr His Tyr Thr Ile Phe Trp Thr
530 535 540
Asn Ala Gln Asn Gln Ser Phe Ser Ala Ile Leu Asn Ala Ser Ser Arg
545 550 555 560
Gly Phe Val Leu His Gly Leu Glu Pro Ala Ser Leu Tyr His Ile His
565 570 575
Leu Met Ala Ala Ser Gln Ala Gly Ala Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr
580 585 590
Leu Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser Glu Leu
595 600
골수에서 혈액세포가 생장, 분열, 분화하는 공정을 조혈작용이라고 한다(Dexter, T. M., and Spooneer, E., Annu. Rev. Cell Biol., 3:423, 1987). 별개의 세포 계통에 속하는 여러 가지 많은 혈액 세포 형태가 있다. 다양한 혈액 세포 각 형은 자생을 하거나 다른 모든 성숙한 세포 형태를 만들 수 있는 조상 세포를 만들 수 있는 다능성 간 세포에서 발생된다. in vivo에서는 일반적으로 적혈구 세포, 혈소판, 백혈구로 나뉘는 세 가지 종류가 생성되는데; 백혈구의 대부분은 숙주 면역 방어에 관계한다.
콜로니 자극 인자(CSFs) 및 인터루킨(Arai, K-I., et al., Annu. Rev. Biochem. 1990, 59;783-836)을 포함하는 사이토킨 족들이 조혈성 전구 세포의 증식 및 분화를 조절한다. 호중구 및 대식세포를 만드는데 적어도 4가지 사이토킨이 관련되는데, 인터루킨-3(IL-3), 과립세포/대식세포 콜로니-자극인자(GM-CSF), 과립세포 자극 인자(G-CSF), 대식세포 자극인자(M-CSF)가 이것이다. 이들 가운데, G-CSF는 호중구 과립세포 계통에 한정된 세포에만 특이적으로 작용한다(Demetri, G. D., and Griffin, J. D., Blood, 1991, 78:2791-2808). in vivo에서 G-CSF의 주요 생물학적 효과는 관련된 조상세포로부터 호중구의 증식 및 분화를 증가시키는데 있다(Cohen, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 87:2484-2488). G-CSF는 또한, 성숙한 호중구의 이동, 생존 및 식작용 활성 및 항균성 죽임의 증가등을 포함하는 기능을 강화시킨다(Crawford, J., et al., n. Engl., J. Med., 1991, 325: 164-170, Moore, M.A.S., Annu. Rev. Immunol. 1991, 9:159). 이와 같은 생리학적 과정은 주요 숙주 방어 기작으로 작용하고, in vivo에서 대규모로 발생된다.
시판되는 사람의 G-CSF(Neupogen?, Amgen, Inc.) in vivo에서 반감기는 불관 3.5시간으로, 호중구 생성을 자극하는데 요구되는 기저수준의 G-CSF을 유지하기 위해서는 매일 투여해야만 한다(Physician's Desk Reference, 53rd, 1999, 532-537). 이와 같은 높은 약량에서 재조합 사람 G-CSF("rhG-CSF")의 주요 부작용은 뼈 통증으로 아마도 주사후에 바로 in vivo에서 일시적으로 rhG-CSF가 높은 수준이 되기 때문인 것으로써, 낮은 약량의 rhG-CSF를 제공받은 환자에서는 그 빈도가 적다.
in vivo에서 rhG-CSF의 반감기를 연장시키기 위한 여러 가지 방법이 연구중인데, 그 중에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 결합시키는 것도 포함된다. 그러나, 최근 보고에 따르면, PEG 접합물질은 PEG 부분의 분자량과 in vitro에서의 활성간에 서로 역관계가 있어, 변형안된 단백질보다는 활성이 낮다(Bowen S., et al., Exp. Hemat., 1999, 27:425-432). 또한, 동물 연구 결과 자료에 따르면, rhG-CSF에 PEG를 접합시킨 경우에 이들의 반감기가 1~3일로 연장되나, 이를 넘기지는 못한다는 것이다.
PEG가 접합된 rhG-CSF것과는 대조적으로, 단클론성 항체("mAbs")의 in vivo 반감기는 약 2~3주로, 항체의 이소타입에 따라 달라진다. 사람의 G-CSF 수용체에 대한 작용 항체를 1회 주사하게 되면, 수주일간 G-CSF-유사 활성을 제공할 수 있는 것으로 본다. 따라서, 화학요법 및 심각한 호중구감소증을 앓고 있는 환자는 작용 mAbs의 생물학적 활성이 연장되었기 때문에 병원을 자주 오지 않아도 되는 강한 잇점이 있다. 또한, 혈액 순환에서 작용 항체의 일정한 수준이 유지되어, 호중구 조상세포의 증식 및 분화를 자극시켜, 더 높은 효과를 나타내고, 이 결과로 더 적은 약령을 사용할 수 있게 되고, Neupogen?또는 다른 rhG-CSF 유도체보다 부작용이 훨씬 적다.
두 개의 별개 결합 부위를 통하여, 이들 수용체에 G-CSF가 결합하여, 1:2 리간드/수용체 복합체를 형성함으로써, 다양한 G-CSF 작용이 개시된다. 호중구 과립세포의 조상세포 및 성숙한 관련 세포상에서 발현되는 G-CSF 수용체는 사이토킨/조혈 수용체 상과(上科;superfamily)에 속한다. 인터루킨-2(IL-2)에서 IL-7에 대한 수용체 및 과립세포-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)를 포함하는 과 구성원의 대부분이 α, β소단위 및 간혹 gamma 소단위로 구성된 이형 복합체 형성을 통하여 활성화되지만, 단일 쇄 폴리펩티드로 구성된 G-CSF 수용체 단백질은 리간드 결합시에 동형이량성 복합체를 만드는 것으로 보인다(Fukunaga, R., et al., J. Bio. Chem., 1990, 265:14008).
G-CSF 수용체의 동형 이량체 형성은 시그날 변환이 필수적인 것으로 보인다(Wells, J.A., and Vos, A.M., Annu. Rev. Biochem., 1996, 65:609). G-CSF 수용체는 고유 단백질 카이나제 도메인을 포함하지는 않지만, 티로신 카이나제 활성이 G-CSF 시그날 변환에 필수적인 것으로 보인다. G-CSF에 유도된 수용체 동종이량체 형성를 통하여 G-CSF 수용체 활성으로 인한 시그날은 JAK1 및 JAK2와 같은 다양한 티로신 카이나제의 비-공유 결합과(Barge, R. M. Y., et al., Blood, 1996, 87:2148-2153), 그 다음 Stat3 및 Stat5와 같은 전사 인자 Stats의 인산화에 의해 중개된다(Tian, S-S., et al., Blood, 1994, 84:1760-1764; Watowich, S. S., et al., Annu. Rev Cell Dev. Biol., 1996, 12: 91; Dong F., et al., J. Immunol., 1998, 161:6503-6509). 이와 같은 티로신 카이나제는 G-CSF에 반응하여, G-CSF 수용체 인산화반응 및 Stat 활성화에 필수적인 역할을 한다(Tian S-S. et al blood, 1996, 88:4435-4444; Shimoda, K.,et al., Blood, 1997, 90:597-604).
G-CSF 수용체를 제외하고는, 에리트로포에틴("EPO"), 생장인자("GH"), 프로락틴 수용체("PRL"), 트롬보포에틴("TPO")에 대한 수용체의 기능은 리간드에 의해 유도된 수용체의 동종이량체 형성에 의해 개시되고, 특정 카이나제 세트가 인산화된다(Youssoufian, H., et al. Blood, 1993, 81:2223; Alexander, W.S., et al EMBO, 1995, 14: 5569; Heldin C.H., Cell, 1995, 83:213). 따라서, 동종이량체 형성시에 시그날 변환을 일으키고, 수용체를 포함하는 세포의 증식시키는 이들의 능력을 기초하여 G-CSF 수용체 작용체를 스크리닝하는데 이용되는 본 발명에서 설명하는 스크리닝 방법을 다른 수용체에 대한 작용물질을 스크리닝하는데에도 이용할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 G-CSF 수용체 및 다른 동종이량체성 사이토킨 수용체에 상호작용성 작용 분자에 관한 것으로써 리간드와 같은 방식으로 수용체에 결합하거나 수용체와 상호작용함으로써 동일한 생물학적 기능을 한다. 본 발명에는 두 개 사이토킨 수용체 단백질에 결합하거나 상호작용할 수 있는 작용 분자를 포함하는데, 좀더 적절하게는 두 개 G-CSF 수용체 단백질과 같은 두 개 동일한 사이토킨 수용체 단백질에 결합하거나 상호작용할 수 있는 작용 분자를 포함한다. 이와 같은 작용 분자에는 다클론 및 단클론성 항체를 포함하는 전체 항체 분자 및 Fab, scFv, 이가 F(ab')2등의 면역학적 단편을 포함하는 변형된 또는 유도된 형, 고유 G-CSF와 동일한 또는 유사한 작용 효과를 발휘할 수 있는 동사체 또는 유사체가 포함된다. 작용 항체 및 단편은 동물에서 유도되거나, 사람-생쥐 키메라된, 체액화된, DeImmunisedTM또는 사람의 것이 될 수 있다.
적절한 구체예에서, G-CSF 수용체 작용분자는 G-CSF 수용체를 발현시키는 세포의 분화 및 생장을 촉진시킨다. G-CSF 수용체의 세포외 도메인에 결합하여, G-CSF 수용체를 이량체화시키고, G-CSF 수용체와 연합된 카이나제의 인산화반응을 활성화시켜서 이루어진다. G-CSF 수용체를 발현시키는 이와 같은 세포는 일반적으로 원시 간/조상세포 조혈성 세포로 구성되어, 작용 분자는 원시 조혈성 세포의 분화 및 증식을 자극시켜, 호중구 과립세포 계통 세포가 자리를 잡도록 유도한다.
본 발명의 또 다른 측면은 in vitro 세포계 검사 시스템을 이용하여, G-CSF 수용체 작용 항체와 같은 동종이량체성 사이토킨 수용체 작용물질을 스크리닝하는 방법에 관계한다. 하기에서 설명하는 것과 같이, 세포에 G-CSF 수용체 또는 작용분자가 결합시에 활성화되는 G-CSF 수용체의 일부분으로 트랜스펙션시키고, 작용 분자 존재하에 세포의 증식을 모니터한다.
본 발명에는 진단 및 치료 목적의 작용 분자 항체를 포함하는 작용분자의 용도가 포함된다. mAbl63-93 및 mAbl74-24-11으로 지정된 예시적인 작용 분자 항체를 만드는 하이브리도마를 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209("ATCC")에 기탁하고, 수탁번호를 각각 "HB-12699" 및 "HB-12700"으로 받았다. G-CSF 수용체 작용 활성을 가지는 단클론성 항체를 만드는 하이브리도마 세포주를 ATCC에 기탁하여, 수탁번호 HB-12524를 부여받았다.
본 출원은 1998년 4월 30일자로 출원된 미국 예비 출원 60/083,575을 우선권으로 주장합니다.
도 1A는 부계 생쥐 세포 32D-c123의 증식이 rhG-CSF(R＆D Biosystems)가 아닌 rmIL-3에 의해서만 자극을 받는다는 것을 보여주는데, 이 실험은 MTT 검사를 이용하여 측정한 것이다.
도 1B는 32D-c123에 전장 사람 G-CSF 수용체를 트랜스펙션시킨 후에, 트렌스펙션된 D4 세포의 증식이 각 별도로 rmIL-3 및 rhG-CSF에 의해 자극을 받을 수 있다는 것을 MTT 검사를 통하여 보여준다.
도 1C는 트랜스펙션된 D4 세포가 취하는3H-티미딘의 양이 rmIL-3 또는 rhG-CSF를 포함한 배지에서 생장시켰을 경우에 농도에 따른 방식으로 증가된다는 것을 보여주는데, 기준 mAb에서는 그렇지 않았다.
도 2는 rhG-CSF에 의해 유도된 전장 G-CSF 수용체가 트랜스펙션된 D4 세포에서 JAK1 카이나제의 티로신 인산화반응을 보여준자. 부계 세포 32D-c123에서는 rhG-CSF(R＆D Biosystems) 존재하에서도 JAK1 카이나제의 동일한 티로신 인산화반응이 감지되지 않았다. 포지티브 콘트롤로는 내생 사람의 G-CSF 수용체를 발현하는 사람의 G-CSF 반응 세포 AML-193(ATCC No. CRL-9589)에서도 rhG-CSF의 자극에 의해 JAK1 카이나제의 티로신 인산화반응이 유도될 수 있다는 것을 보여준다. IP: 도면에서 나타낸 바와 같이 항체를 이용한 면역침전을 나타낸다. Blot: 지적한 바와 같은 HRP-결합된 항체를 이용하여 감지한다. Anti-pTyr: 항-포스포티로신 항체 4G10(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).
도 3은 ELISA에 의한 mAb163-93의 G-CSF 수용체/IgG4(Fc) 키메라 단백질에 결합하는 것을 보여준다. 사람의 G-CSF 수용체/IgG4(Fc)는 Immulon 2 플레이트에 피복된 염소 항-사람 IgG(Fc) 항체를 이용하여 찾을 수 있다. 생쥐 항체 mAb163-93가 사람 G-CSF 수용체/IgG4(Fc) 키메라 단백질에 결합하는 것은 양고추냉이 과산화효소에 결합된 염소 항-생쥐 IgG(Fc) 항체를 결합시켜 찾을 수 있다.
도 4A에서는 전장 사람 G-CSF 수용체가 트랜스펙션된 생쥐 세포 D4에 이소타입이 일치된 mAb G3-519의 결합비율이 아닌 mAb163-93의 결합 비율이 농도에 따른 방식으로 증가된다는 것을 보여준다(FACS 분석을 통하여).
도 4B에서는 mAb163-93가 사람의 전장 G-CSF 수용체를 발현시키는 생쥐 D4에 특이적으로 결합하나, 세포 결합 비율로 알 수 있는 것과 같이 이의 부계 세포 32D-c123에는 특이적으로 결합하지 않는다는 것을 보여준다.
도 5A 및 5B에서는 MTT 검사로 알 수 있는 바와 같이, mAb163-93 및 mAb174-74-11를 포함하는 다양한 생쥐 단클론성 작용 항체에 의해 사람의 G-CSF 수용체로 트랜스펙션된 생쥐 세포 D4의 증식이 자극을 받는다는 것을 보여준다(MTT 검사를 통하여 확인). 네가티브 및 포지티브 기준으로는 HIV-gpt120에 대한 이소타입이 일치하는 mAb G3-519 및 rhG-CSF(R＆D Biosystems)를 이용하였다.
도 5C에서는 mAb163-93 및 mAb174-74-11를 포함하는 단클론성 항체 패널이 사람의 G-CSF 수용체로 트랜스펙션된 생쥐 세포 D4의 증식을 자극할 수 있다는 것을 보여주는데, 이는3H-티미딘 결합이 증가되는 것으로 알 수 있다.
도 6A 및 6B에서는 사이토킨 rmIL-3, rhG-CSF 및 작용 항체 mAb163-93에 의해 자극을 받은 사람의 G-CSF 수용체로 트랜스펙션된 생쥐 세포 D4에서 카이나제 JAK2(도 6A) 및 전사 인자 Stat3(도 6B)의 티로신 인산화 반응을 보여준다.
도 7A 및 7B에서는 사람의 골수로부터 과립세포-형성을 자극하는 정량 검사를 나타내는데; 7A는 rhG-CSF 및 생쥐 mAb163-93(기준 mAb G3-519은 mAb163-93와 이소타입이 일치한다); 도 7B는 다른 생쥐 mAbs이다.
도 8은 다음의 물질에 의해 자극을 받은 사람의 골수로부터 호중구 과립세포 콜로니 형성을 나타낸다; 8A: 이소타입이 일치하는 기준 mAb G3-519; 8B: rhG-CSF(R＆D Biosystems); 8C: 단클론성 작용 항체 mAb163-93; 8D: 세포 착색후에 8C에 콜로니로부터 취한 세포의 형태.
도 9는 농도에 의존하는 방식으로 생쥐 mAb163-93가 침팬지 골수에서 과립세포 콜로니 형성을 자극할 수 있다는 것을 보여준다.
도 10은 다음에 m이해 자극을 받은 침팬지 골수로부터 호중구 과립세포 콜리니 형성을 나타내는데; 10A: 50nM 농도에서 이소타입이 일치하는 단클론성 항체 G3-519; 10B: 0.5nM농도에서 rhG-CSF(R＆D Biosystems); 10C: 5nM농도에서 단클론성 작용 항체 mAb163-93; 10D: 세포 착색후에 C에 콜로니로부터 취한 세포의 모양.
도 11은 사람의 G-CSF 수용체에 대한 작용 항체 mAb163-93가 내생 생쥐 G-CSF 수용체를 발현시키는 생쥐 세포 NFS60를 자극할 수 있다는 것을 보여준다.
서열 리스트의 설명
서열 1~6은 G-CSF 수용체 클로닝에 이용된 다양한 프라이머를 나타낸다.
서열 1~7은 본 발명의 두 개 작용 항체의 다양한 부분을 클로닝하는데 이용되는 다양한 프라이머를 나타낸다.
서열 15~26은 본 발명의 두 개 작용 항체의 CDRs(경쇄 및 중쇄)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 27은 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
1. 본 발명의 작용물질 생산
여기에서 설명하는 G-CSF 수용체 작용물질은 G-CSF 수용체의 세포외 도메인내에 에피토프를 표적으로 한다. 작용물질로는 하이브리도마 세포주 163-93 및 174-74-11에 의해 만들어지는 단클론 항체가 포함된다.
본 발명의 단클론성 작용 항체는 면역화 및 융합(하기 실시예 4 참고)에 의해 만들거나 EBV 형질변환을 이용하여 분리된 임파세포에서 만들거나 사람의 G-CSF 수용체 트랜스펙션된 곤충 또는 포유류 세포를 통하여 만들 수 있다. 작용 항체는 임상적으로 이용하기 위해 적적하게는 키메라, DeImmunisdTM, 인체에 적응시킨 EH는 사람의 항체가 된다. 이와 같은 항체는 면역원성을 감소시킬 수 있어, 사람의 항-생쥐 항체(HAMA) 반응을 피할 수 있다. 바람직하게는 항체는 IgG4, IgG2 또는 항체의 따른 세포의 세포독성(S.M. Canfield and S.L. Morrison, J. Exp. Med., 1991: 173: 1483-1491) 또는 보체에 의해 중개된 세포용혈(Y. Xu et al., J. Bio. Chem., 1994: 269: 3468-3474; V.L. Pulito et al., J. Immunol. 1996; 156: 2840-2850)을 증가시키지 않은 다른 유전학적으로 돌연변이된 IgG 또는 IgM등이 될 수 있다.
당분야에 공지된 재조합 DNA 과정에 의해 키메라 항체를 만들 수 있는데, 키메라 항체는 동물의 가변성 부분 및 사람의 항상성 부분을 가진다. 인체에 적응된 항체는 키메라 항체보다 사람의 펩티드 서열을 더 많이 가진다. 인체에 적응된 항체에서, 항원 결합 및 특이성을 결정하는 상보성 결정 부분(CDRs)만 동물로부터 유도되고, 동물 항체에 상응하는 아미노산 서열을 가지며, 실제 분자의 나머지 모든 부분(일부의 경우에, 가변성 부분내에 있는 구조 부분에서 일부 작은 부분 제외)은 사람에서 유도되며, 이는 사람 항체의 아미노산 서열에 상응한다(참고: L. Riechmann et al., Nature, 1988; 332: 323-327; G. Winter, United States Patent No. 5,225,539; C. Queen et al., U.S. Patent number 5,530,101).
DeImmunisedTM항체는 PCT/GB98/01473에서 설명하고 있는 것과 같이, 가능한 T 및 B 세포 에피토프가 제거된 항체이다. 따라서, 사람에서의 이들의 면역원성은 in vivo로 공급되었을 때, 실제 감소되는 것으로 기대된다.
사람 항체는 몇 가지 다른 방법으로 만들 수 있는데, 예를 들면 사람의 면역 글로블린 라이브러리를 이용하여(Stratagene Corp., La Jolla, California), 사람 항체의 단편을 만들거나(VH, VL, FV, Fd, Fab, (Fab')2) 또는 이와 같은 단편을 이용하여, 키메라 항체를 만들기 위해 이와 유사한 기술을 사용하여 전체 사람 항체를 작제하는 등의 방법이 포함된다. 사람 항체를 사람의 면역 글로블린 게놈으로 형질변환된 동물에서도 만들 수 있다. 이와 같은 생쥐는 Abgenix, Inc., Fremont, California, and Medarex, Inc., Annandale, New Jersey로부터 구할 수 있다.
전체 뮤린 mAbs보다는 전체 및 부분적인 사람 항체 모두다 면역원성이 떨어진다. 본 발명에 이용할 수 있는 이가 단편 또한 면역원성이 떨어진다. 이와 같은 모든 형태의 항체는 사람에서 면역원성 반응을 잘 일으키지 못한다. 결과적으로, 본 발명의 작용 항체로 예측되는 것과 같이, 사람에게 in vivo 투여하고자 할 경우에 반복된 또는 장기간 투여를 해야 할 경우에, 전체 동물의 항체보다는 이와 같은 항체를 이용하는 것이 바람직하다.
환자에게 항체를 투여하는 또 다른 방법은 유전자 요법 기술을 통하여 내생적으로 작용 항체를 만드는 것이다. 작용 항체 또는 이들의 단편, 유도체, 유사체를 인코드하는 DNA 서열을 유전자 요법에 이용되는 표준 벡터를 이용하여(아데노바이러스, AAV, 레트로바이러스) 또는 비-벡터 운반 시스템을 이용하여 in vivo 운반할 수 있다. 만성 호중구감소증을 임상적으로 치료를 하는데 작용 항체 또는 이들의 단편, 유도체 또는 유사체가 지속적으로 발현되는 경우에 추가 장점을 가진다.
여기에서 설명하는 것과 같이 작용 분자는 G-CSF 수용체에 특이적으로 결합하거나 상호작용하여, 동종이량체 형성 및 활성화되는 펩티드 및 유기 화합물과 같은 작은 분자가 포함된다. 이와 같은 소분자는 감소된 면역원성을 가진다.
사람의 G-CSF 수용체의 세포외 도메인(본 발명에서 사람의 G-CSF 수용체에 대한 항체를 만드는데 이용된)은 당분야에 공지된 분자 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있다. 세포외 도메인은 N-말단에서 시작하는 성숙한 사람의 G-CSF 수용체의 아미노산 잔기 1-163(서열:27)가 된다(참고 U.S. Patent Nos. 5,589,456; 5,422,248; 5,574,136). 그러나, 정제된 또는 일부 정제된 형태의 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 도메인의 일부를 면역원으로 이용할 수 있다.
사람 G-CSF 수용체의 세포외 도메인을 생쥐와 같은 동물을 면역화시키는 면역원으로 직접 이용하거나 담체 분자에 우선 융합시켜, 면역화시키기전에 면역원성을 증가시킬 수 있다. 적절한 담체 분자로는 Tag, Flag, 루이신-zip와 같은 펩티드 또는 글루타티온-S-전이효소(GST), 알칼리 포스포타제(AP), 인테인과 같은 단백질 또는 면역 글로블린의 항상성 부분(하기에서 설명하는 것과 같은 작용 항체를 만드는데 이용되는 것과 같은)이 포함된다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 담체 분자를 G-CSF에 결합시킬 수 있다. 면역원성을 강화시키는데 추가하여, G-CSF 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질은 친화력 크로마토그래피를 이용할 경우에 항원을 정제할 수 있다. G-CSF 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 이와 같은 항원을 인코드하는 DNA 단편을 발현 벡터에 넣고, 이 발현 벡터를 대장균(E. coli), 효모, 곤충 세포 및 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 포유류 세포에 트랜스펙션시킨다. 이와 같은 과정에 의해 만들어지는 항원은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 정제할 수 있다.
고유 또는 야생형 G-CSF 수용체 세포외 도메인이 치환, 결손 또는 삽입에 의해 돌연변이된 돌연변이체도 면역원에 포함되는데, 이때 돌연변이체는 인공적으로 또는 자연발생적으로 만들어진 것이다. G-CSF 수용체 또는 이의 유사체를 발현시키는 세포를 면역원으로 이용할 수도 있다. 이와 같은 세포에는 전장 G-CSF 수용체 또는 G-CSF 일부 또는 G-CSF 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 발현시키는 벡터로 트랜스펙션된 AML-193와 같은 세포주 또는 생쥐 세포(선택적으로 발현 벡터로 베큘러바이러스를 이용할 경우에 곤충 세포)가 포함된다(Takhashi, T., et al., J. Biol Chem. 1996, 271: 17555-17560).
G-CSF 수용체에 대한 작용 항체(다클론성 또는 단클론성)를 만들기 위해, 여기에서 설명하는 면역원을 이용하여, 설치류(가령, 생쥐, 들쥐, 햄스터, 기니아 피그) 또는 토끼, 염소, 사람이 아닌 영장류를 포함하는 다른 포유류 또는 사람의 면역 글로블린을 발현시키는 형질변환된 생쥐 또는 당분야에 공지의 기술을 통하여 사람의 B 임파세포 또는 사람의 골수를 이식받은 심각한 복합 면역 결핍(SCID) 생쥐를 포함하는 다른 포유류를 면역화시킨다. G. Kohler and C. Milstein(Nature, 1975, 256L 495-497)에서 설명하는 것과 같이, 골수종 세포(가령, Sp2/0 및 NS0)로 면역화된 동물의 B 임파세포를 융합시켜 통상적인 기술을 이용하여 하이브리도마를 만들 수 있다. G-CSF 수용체에 대한 항체는 사람의 B 임파세포 또는 파아지 디스플레이 시스템에서 사람의 골수로부터 재조합된 단일 사슬 Fv 또는 Fab 라이브러리를 스크리닝하여 만들 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 1991, 227:381; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581).
통상의 효소-연결된 면역 흡착 검사(ELISA) 방법 가령, 직간접적인 샌드위치 검사를 통하여, G-CSF 수용체에 특이적인 항체를 선별할 수 있는데, 이때 항원 또는 적절하게는 G-CSF 수용체/IgG4(Fc) 키메라 단백질을 플레이트상에 직간접적으로 피복시킨다. 도 3에서는 ELISA에 의해 감지되는 것과 같이 키메라 단백질에 항체 mAb163-93가 결합하는 것을 보여준다. 경쟁성 ELISA를 이용하여, 리간드의 에피토프에 가까운 또는 겹쳐지는 에피토프를 가지는 항체를 확인할 수 있다(Current protocols in molecular biology, ed. Ausubel, F. M. et al., published by Wiley Intersciecne, 1996).
G-CSF 수용체/IgG4(Fc) 키메라 단백질을 ELISA 플레이트에 직간접적으로 피복한 후에 경쟁 ELISA에 rhG-CSF(R＆D Biosystems, Minneapolis, MN)를 이용할 수 있다. 염소 항-생쥐 항체와 같은 제2 항-생쥐 항체를 첨가하여, G-CSF 수용체에 항체의 결합을 확인할 수 있다. 제2 항-생쥐 항체는 양고추 냉이 과산화효소를 포함하여, 감지에 이용되는 다양한 화합물 및 단백질을 결합시킬 수 있다.
하기에서 설명하는 것과 같은 트랜스펙턴트 생쥐 세포 D4와 같은 세포의 표면에서 발현되는 사람의 G-CSF 수용체에 항체가 특이적으로 결합하는 지는 FACS 분석(실시예 6)을 통하여 확인할 수 있다. 도 4A에서 볼 수 있는 것과 같이, 뮤린 단클론 항체 mAb163-93는 사람의 G-CSF 수용체를 발현시키는 생쥐 트랜스펙턴트 세포 D4에 특이적으로 결합하나 기준 mAb에는 결합하지 않는다. 또한, mAb163-93는 사람의 G-CSF 수용체를 발현시키는 D4 세포에는 특이적으로 결합하지만, 부계 세포 32D-c123에는 결합하지 않는다(도 4B).
본 발명에는 in vitro 세포계 생물학적 기능 검사를 이용하여 G-CSF 수용체 작용물질을 스크리닝 방법이 포함된다. 작용 물질을 대규모로 스크리닝할 경우에, 한 가지 방법은 G-CSF-반응성 유전자의 프로모터 제어하에서 리포터 유전자를 발현시키는 카세트 구조가 결합된 NFS60와 같은 G-CSF-반응성 세포주를 작제해야 한다(Schindler, C. and Darnell, J. E., Annu. Rev. Biochem., 1995, 64:621). 여기에 이용되는 리포터는 루시페라제 또는 갈락토시다제, 그린 형광 단백질 또는 디하이드로폴레이트 환원효소(Pelletier, J.N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 4290)등이 될 수 있다. 자극후에 세포에서 효소 활성 또는 세포에서 형광 밀도를 측정함으로써, G-CSF 수용체에 대한 작용물질을 고속 스크리닝으로 선별할 수 있다.
작용 항체를 포함하는 작용물질에 대해 in vitro -세포를 기준으로한 생물학적 기능에 대한 검사에는 in vitro 세포 증식 검사가 포함된다. 본 발명의 적절한 구체예중에 하나는 사람의 전장 G-CSF 수용체를 발현시키는 생쥐 세포 주 D4를 작에하고, 대규모로 작용 항체를 스크리닝하는데 이용하는데, 이때 MTT 기초한 발색 검사를 함께 한다. MTT를 이용하는 발색 검사 시스템은 방사능활성 동위원소를 이용하지 않고, 사이토킨 및 이들의 작용물질에 반응하여 세포의 생장을 분광광도를 이용하여 정량분석하는 것이다. 부계 세포주 가령, BaF3, FDC-P1, 바람직하게는 본 발명의 실시예 7에서 설명하는 32D-c123는 mIL-3 의존성으로, 사람의 전장 G-CSF 수용체 발현을 위한 숙주세포로 적합하다(Hapel, A. J., et al., Blood, 1984, 64: 786-790). 구성 hCMV 프로모터의 제어하에 사람의 전장 G-CSF 수용체를 발현시키는 벡터로 트랜스펙션시킨 후에, 선별하여, D4와 같은 트랜스펙턴트는 MTT 검사 및 하기 실시예 7과 도1에서 설명하는 것과 같은3H-티미딘 수용 검사에서 설명되는 것과 같이 G-CSF에 반응을 하게 된다.
생쥐 트랜스펙턴트 세포 주 D4에서 티로신 카이나제 JAK1의 인사노하 반응은 내생 사람의 G-CSF 수용체를 발현시키는 사람 세포 주 AML-193와 동일한 방식으로 rhG-CSF(R＆D Biosystems)에 의해 유도할 수 있다. 실시예 7에서 설명하는 것과 같이, 사람의 G-CSF 수용체로 트랜스펙션된 생쥐 세포 주 D4와 MTT 검사를 이용하여 작용 물질, 특히 작용물질 항체에 대한 스크리닝 과정을 실시한다. 이와 같은 스크리닝 방법에는 사람의 G-CSF 수용체 돌연변이체 또는 에리트로포에틴 수용체(Goldsmith, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 7006-7011) 또는 Fas 수용체(Takahashi, T. et al., J. Biol Chem., 1996, 271: 17555-17560)와 같은 또 다른 사이토킨 수용체의 세포내 도메인과 사람의 G-CSF 수용체d,; 세포외 도메인이 융합된 것을 포함하는 키메라성 단백질을 발현시키는 생쥐 세포주, 고유 G-CSF 의존성 사람 세포 주 가령, AML-193를 이용할 수 있다.
본 발명의 작용 항체를 스크리닝하는데 있어서, 사람 골수를 이용하는 과립세포 콜로니-형성 검사도 이용할 수 있다. 또한, 이와 같은 검사를 이용하여, 작용 항체가 사람 골수로부터 호중구 과립세포의 증식 및 분화를 자극시키는 능력, 효과 및 특이성을 결정하고, 사람이 아닌 영장류에 이들종의 교차 반응성에 대해서도 결정할 수 있다. 이 검사 결과를 보면, 본 발명의 작용 항체는 재조합 사람 G-CSF으로 작용하여, 농도에 따른 방식으로 사람 골수의 호중구 과립세포의 분화 및 증식을 특이적으로 자극한다. 또한, 작용 항체 mAb163-93는 rhG-CSF의 것과 동일하게 이 검사에서 기본적으로 효과를 가진다(도 7). 또한, 사람의 골수로부터 취한 작용 mAb에 의해 자극을 받은 콜로니에서 취한 세포는 전형적인 호중구 모양을 나타낸다(도 8D). 주사후에, rhG-CSF는 신장을 주로 통하여, in vivo 순환계로부터 신속하게 제거되어 생리학적 효과가 상당히 짧다는 것을 알아야 한다(Tanaka, H., et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989, 251: 1198-1203; Layton, J.E., et al., Blood, 1989, 74: 1303-1307). 한편, 본 발명에서 설명하는 과립세포 콜로니 형성 검사에서, rhG-CSF는 상기의 제거 기작이 부족하기 때문에 in vivo 와 비교하였을 때, 사람의 골수로부터 호중구의증식 및 분화를 자극하는 활성이 지속되었다. 반감기가 긴 Pegylated 사람 골수 호르몬 및 사람의 생장 호르몬과 비교하면, in vivo에서의 반감기가 상당히 길기 때문에 작용 항체 mAb163-93가 호중구 증식 및 분화를 자극시키는 능력은 rhG-CSF와 거의 동일하거나 그 이상일 것으로 예측할 수 있다(Clark, R., et al, J. Bio. Che., 1996, 271:21969-21977).
전술한 기술을 이용하여, 사람의 G-CSF 수용체에 대해 mAb163-93 및 mAb174-74-11을 포함하는 단클론 작용 항체 패널을 만든다. 재조합 사람의 G-CSF로 작용하는 작용 항체 mAb163-93는 G-CSF 수용체를 활성화시키고, JAK 카이나제 (도 6A의 좌측 패널, 인산화반응은 항-pTyr 항체로 확인) 및 전사 인자(도 6B의 좌측 패널, 인산화반응은 항-pTyr 항체로 확인)의 인산화반응을 유도시킨다. 본 발명에서 만든 항체 패널에서 몇 가지 작용 항체는 in vitro 상에서 G-CSF 반응 세포의 증식을 자극하는 것으로 나타났다(도 5A-C). mAb163-93는 세포 표면에 있는 G-CSF 수용체에 특이적으로 결합하였다(도 4A, 4B). 또한, 이와 같은 사람의 G-CSF 수용체 작용 항체는 사람의 골수로부터 호중구 과립세포 콜로니 형성을 자극하는데, 이는 이들의 in vivo 효과를 나타낸다(도 7A, 7B, 8A-C). 이는 사람의 골수로부터 호중구 과립세포 콜로니 형성을 자극할 수 있는 단클론성 항체의 첫 사례이다.
과립세포 콜로니-형성 감사를 이용하여 사람의 G-CSF 수용체 작용 항체의 종간 교차 반응성을 측정할 수도 있다. mAb163-93와 같은 사람의 G-CSF 수용체 작용 항체는 다양한 종류의 사람이 아닌 영장류 골수로부터 다양한 정도로 호중구 과립세포의 증식 및 분화를 특이적으로 자극한다는 것을 볼 수 있다(하기 표 1). 침팬지 골수로부터 작용 항체 mAb163-93에 의해 자극을 받은 과립세포 콜로니 형성 수는 농도에 따른 방식으로 증가되었다(도 9). 세포 착색 결과로 이와 같은 단클론 항체 mAb는 침팬지 골수로부터 호중구의 증식 및 분화를 자극하는 특이성이 있다는 것을 알 수 있다(도 10). 이와 같은 종간 교차 반응성 검사를 이용하여 임상전 연구를 위한 적절한 동물 모델을 선별할 수 있다.
표 1
사람이 아닌 영장류 골수로부터 호중구 과립세포 콜로니 형성
상기에서는 이가 작용 항체가 G-CSF 수용체를 활성화시킬 수 있다고 설명하는데, 즉, 이들은 G-CSF가 복합체를 형성하여 수용체를 활성화시키는 능력과 닮은 방식으로 G-CSF 수용체에 교차 연결될 수 있다는 것이다. 또한, 한 개의 수용체 분자에만 결합하는 scFv 및 Fab와 같은 항체의 1가 부분을 하기에서 설명하는 부분에 G-CSF와 경쟁하는 길항물질로 이용할 수 있다.
2. 본 발명 작용물질의 용도
우선 사이토킨가운에 재조합 사람 G-CSF를 재조합 DNA 기술을 이용하여 준비하고, 치료에 성공적으로 이용하였다. 이와 같은 사이토킨을 광범위하게 이용하여, 다양한 선천성 및 의사에 원인하는 호중구감소증과 연관된 감염 발행을 감소시켰다. 현재까지, G-CSF 치료에 대한 5가지 질병의 조치에 대해 United States FDA의 승인을 받았는데; (1) 골수억제 치료를 받은 암 환자; (2) 급성 골수 백혈병 유도 또는 강화 요법 환자; (3) 골수 이식을 받은 암 환자; (4) 말초 혈액 조상 세포 수집 및 치료를 받은 암 환자; (5) 심각한 만성 호증구감소증 환자(Physican's Desk Reference, 53rdedition, 1999, 532-537). 호중구 과립세포계의 증식 및 분화에서 rhG-CSF의 독특한 기능상 특이성을 이용하여, HIV 환자, 전신 염증성 반응 증후군, 폐혈증 환자, 당뇨성 발 감염, 다른 감염성 질환 환자를 포함하는 다른 질환 치료에도 유용하다(Miles, S. A., et al, Blood 1990, 75: 2137-2142; Kuritzkes, D. R., et al, AIDS 1998, 12:65-74; Weiss, M. et al, Bloob 1999, 93: 425-439; Lancet 1997, 350: 855-859; Deresinski, S. C., et al, Infect. Med. 1998, 15:856-70).
여기에서 설명하는 것과 같이 rhG-CSF로 작용하는 사람의 G-CSF 수용체 작용물질 및 항체는 G-CSF 수용체를 활성화시키고, 세포 표면에서 G-CSF 수용체에 특이적으로 결합함으로써, 그리고 JAK 카이나제의 티로신 인산화반응 및 전사인자의 인산화 반응기작을 통하여, G-CSF 반응성 세포의 증식을 자극한다. 또한, 사람의 G-CSF 수용체 작용물질은 rhG-CSF처럼, 사람 골수로부터 호중구 과립세포 콜로니 형성을 특이적으로 자극한다. 따라서, 여기에서 설명하는 사람 G-CSF 수용체 작용 물질 및 항체는 일반적으로 rhG-CSF와 동일한 치료 분야에서 유용할 것으로 본다. 또한, 작용 물질이 in vivo 상에서 안정적이고, 반감기가 길어져, 치료요법상 rhG-CSF보다 더 유익한 장점을 제공한다.
본 발명의 작용물질 및 작용 물질 항체는 점막내, 복막내, 피하 주사증을 토함하나 이에 국한되지 않는 다양한 경로를 통하여 적절한 제약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 약량은 동물 모델의 경우를 외삽하고, 임상 시도동안에 실험을 통하여 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 이와 같은 작용 물질 및 항체를 이용하여 재조합 세포 배양물 또는 천연 원료로부터 얻은 G-CSF 수용체를 친화력에 의해 정제할 수 있다. 일반적인 친화력 정제기술은 당분야에 공지의 것으로 이들중 임의의 것을 본 목적에 이용할 수 있다.
본 발명의 항체는 G-CSF 수용체의 가용성 세포외 도메인 및 세포 표면에서 G-CSF 수용체를 발현시키는 세포외 면역학적으로 반응할 수 있다. 여기에서, 본 발명은 가용성 형으로 G-CSF 수용체에 대해 세포 표면상에서 면역학적으로 감지하거나 존재를 확인하는데, 이때는 당분야에 공지의 면역학적 방법을 이용한다. 또한, Fab, scFv와 같은 작용 항체의 1가 단편 및 이들의 유도체를 길항물질로 이용하여, 경쟁에 의해 CSF가 G-CSF 수용체와 상호작용하는 것을 방해하여, G-CSF의 생물학적 기능을 방해할 수 있고, 이는 특정 종양 및 암을 치료하는데 유용할 것이다. 정상적인, 비정상 또는 돌연변이된 수용체 구조 또는 수용체의 발현은 면역활성 연구를 통하여 여기에서 설명하는 항체를 이용하여 결정할 수 있다. 이 결과는 진단 및 치료 목적으로 이용할 수 있다.
실시예 1: 사람의 G-CSF 단백질의 세포외 부분의 클로닝
다음과 같이 G-CSF 수용체 단백질의 클로닝을 실시하였다. 1g 사람 골수 cDNA(Clontech, Palo Alto, CA)를 PCR에서 주형으로 이용하였다. 100㎕ 반응 혼합물(프라이머로는 AAG TGG TGC TAT GGC AAG GCT G(서열:1) 및 CAC TCC AGC TGT GCC CAG GTC TT(서열:2)를 첨가하여, 최종 농도가 500nM이 되도록 한다. 이와 같은 프라이머는 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 부분을 인코드하는 5' 및 3' 말단에 상동성이 있는 것으로 알려져 있다. 반응 조건은 다음과 같다; 94℃에서 1분; 62℃에서 30초; 72℃에서 3분; 이 과정을 40회 반복.
BIO101 Inc.(Vista, CA)의 프로토콜에 따라, PCR에서 생성된 DNA 단편(약1.6 kb)를 아가로즈 겔로부터 분리하여, TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝시켜, 재조합 플라스미드 pT1-11를 만든다. 이 삽입체의 DNA 서열은 United States Biochemical(Cleveland, Ohio)의 DNA 서열 키트를 이용하여 이 삽입체의 두 가닥을 서열화시켜 얻는다. pT1-11에 있는 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 부분을 인코드하는 DNA 단편은 Fukunaga, R. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1990, 87:8702)에 따라, EcoR1으로 절단시키고, 말단은 Klenow 단편으로 채운다. 그 다음 IgG4(Fc)을 인코드하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 pFcl에 삽압한 다음, 이를 Xbal으로 절단한다. 말단은 Klenow 단편으로 채우면, 플라스미드 pFT1-9가 만들어진다. pFT1-9에서 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 부분 및 IgG4(Fc)을 인코드하는 DNA 단편을 Asel 및 HincII으로 절단하고, Klenow 단편으로 채운다음, 포유류 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen)에 삽입한다. 이 벡터를 EcoRV, HincII으로 절단시키고, 말단을 Klenow으로 채우면, 플라스미드 pCGC23가 만들어지는데, 사람 G-CSFR/IgG4(Fc)의 세포외 부분은 hCMV 프로모터의 제어하에서 발현된다.
실시예 2. 포유류 세포에서 hG-CSFR/IgG4(Fc) 키메라 단백질의 세포외 부분 발현
NSO 세포를 다음과 같이 선형화된 pCGC23로 트랜스펙션시켰다. 4 x 107로그상 NSO 세포를 수득하고, 이를 2% FBS가 보충된 0.8㎖ IMDM 배지에 재현탁시킨다. 10㎍의 선형화된 플라스미드 DNA와 얼음위에서 10분간 배양시킨 후에, 세포 혼합물을 200볼트, 960㎌에서 BioRad 장치를 이용하여 전기천공시킨다. 얼음상에서 20분 후에, 100㎕ 희석된 세포 현탁액을 약 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 2일 후에, 100㎕의 또 다른 IMDM(단, G418을 포함(Gibco BRL, Gatihersburg, MD))을 각 웰에 첨가하여, G418의 최종 농도가 0.8mg/㎖이 되도록 한다. 10일 후에, 배양 상청액을 빼내어, ELISA를 이용하여, 사람의 G-CSF 수용체/IgG4(Fc) 융합 단백질의 세포외 부분이 발현되었는 지를 다음과 같이 스크리닝한다.
Immulon 2 플레이트(Dynatech Laboratories, Chantilly, VA)의 웰은 50㎕ 항-사람 IgG(Fc) 항체를 1㎍/㎖ 농도로 피복시키고, 실온에서 하룻밤동안 배양한다. 플레이트를 가볍게 쳐서 피복 용액을 제거한 후에, 200㎕ BLOTTO(5% 비-지방 건유/PBS)를 각 웰에 실온에서 첨가하여 비-특이적인 결합을 차단시킨다. 1시간 후에, 웰은 PBST 완충액(0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)으로 세척한다. 트랜스펙션 플레이트의 각 웰로부터 배양 상청액 50㎕을 모으고, 50㎕ BLOTTO과 혼합한 다음 미량적정 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 실온에서 1시간 배양 후에, 웰은 PBST로 씻어낸다. 결합된 세포외 사람 G-CSF 수용체/IgG4(Fc) 융합 단백질은 BLOTTO로 1:2000으로 희석된 염소 항-사람 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)에 결합된 양고추냉이 과산화효소와의 반응으로 감지한다. 0.1% 3,3' 5,5' 테트라메틸벤지딘(Sigma, St. Louis, MO) 및 0.0003% 과산화수소(Sigma)를 포함하는 과산화효소 기질 용액을 각 웰에 첨가하여, 발색 반응을 시키는데, 30분간 방치한다. 웰당 50㎕ 0.2 M H2SO4을 첨가하여 반응을 종료시킨다. 반응 혼합물의 OD450-570는 BioTek ELISA 판독기(BioTek Instriments, Winooski, VT)를 이용하여 측정한다.
OD450-570값이 높은 트랜스펙턴트를 선택하여, 제한된 희석 방법을 이용하여 단일 세포 클로닝을 실시한다. 상기 단락에서 설명한 것과 같은 동일한 ELISA 및 감지를 이용하여 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 부분 및 IgG4(Fc) 키메라 단백질을 발현시키는 융합 단백질을 발현하는 생산성이 높은 세포주를 추가 확인한다.
실시예 3: 사람의 G-CSFR 세포외 부분/IgG4(Fc) 키메라 단백질의 정제
사람의 G-CSFR 세포외 부분/IgG(Fc) 키메라 단백질을 발현시키는 트랜스펙턴트 세포로부터 배양 상청액 1ℓ를 수득하고, 키메라 단백질을 제조업자의 지시에 따라 Prosep-A(Bioprecessing Inc., Princeton, NJ) 친화력 크로마토그래피를 이용하여 상청액으로부터 정제한다. 단백질은 염소 항-사람 IgG(Fc) 친화력 컬럼상에서 추가 정제한다. 이와 같은 키메라 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 면역블랏을 이용하여 측정한다.
실시예 4; 하이브리도마 생성
BALB/c 생쥐(Harlan, Houstom, TX)에 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 부분 및 IgG4(Fc)으로 구성된 50㎍ 정제된 융합 단백질/컴플리트 Freund's 어쥬번트(Difico Laboratories, Detroit, MI), 200㎕ 인산완충염(PBS, pH7.4)을 피하로 주사하였다. 생쥐는 2주 및 4주후에, 동일한 양의 융합 단백질/인컴플리트 Freind's 어쥬번트로 부스터시킨다. 죽이기 2주 및 3일 전에 생쥐의 i.p로 최종 브스트시킨다. 이들의 비장 세포에 Sp2/0 골수 세포를 주입하였다. 5 x 108Sp2/0 및 5 x 108세포에는 50% 폴리에틸렌 글리콜(MW 1450)(Kodak, Rochester, NY) 및 5% 디메틸설폭시드(Sigma, St, Louis, MO)를 포함하는 배지를 주입시킨다. 그 다음, 5% FBS, 100 units/㎖ 페니실린, 100㎕/㎖ 스트렙토마이신, 0.1mM 하이포산틴, 0.4 μM 아미노프테린, 16μM 티미딘이 보충된 Iscove 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에서 5 x 104/200㎕ 현탁액 농도로 세포를 조절한다. 세포 현탁액 200㎕를 100개 미량적정 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 약 10일 후에, 세포 현탁액을 빼내어, 실시예 7에서 설명하는 것과 같이 in vitro 세포 증식 검사를 이용하여 스크리닝한다.
실시예 5; 사람의 전장 G-CSF 수용체를 인코드하는 cDNA 클로닝
제조업자의 지시에 따라(Biotex Laboratories Inc., Houston, TX), Ultraspec-3 RNA 분리 키트를 이용하여 사람의 세포주 AML-193(ATCC catalog No. CRL-9589)으로부터 tRNA를 준비하였다. AML-193 세포주의 10㎍ tRNA를 제조업자의 프로토콜에 따라(Gibco BRL, Gaithersberg,MD), 역전사 반응에서 cDNA의 제 1 가닥을 합성하는데 주형으로 이용한다. 사람의 G-CSF 수용체의 C-말단을 인코드하는 cDNA를 증폭시키기 위해, 주형으로 수득한 cDNA의 제 1 가닥을 이용하여, 다음의 두 개 프라이머를 포함하는 50㎕ 반응 혼합물에서 PCR을 실행하였다;
Nhel: CCC CCC CAG CGC TAG CAA TAG CAA CAA GAC CTG GAG G(서열:3)
R10: GGA ATT CCT ACA AGC TCC CCA GCG CCT CC(서열: 4).
반응 조건은 다음과 같다; 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 3분간의 과정을 40회 반복. PCR 생성물은 Smal으로 절단된 플라스미드 pUC19에 클론시켜, 플라스미드 pC3를 얻는다. 사람의 G-CSF 수용체의 N-말단을 인코드하는 cDNA 단편의 말단에서 새로운 Ntel 절단 부위를 만들기 위해, PCR 반응에서는 주형으로는 pCGC23 DNA를 이용하고, 프라어미로는 다음의 두 개가 이용되었다;
T7P: AAT ACG ACT CAC TAT AG(서열: 5)
Nhe2: AGG TCT TGT TGC TAT TGC TAG CGC TGG GGG GGC CCA GG(서열: 6)
이들 PCR 반응으로부터 사람의 G-CSF 수용체의 N-말단을 인코드하는 DNA 단편을 벡터 pCR-Blunt(Invitrogen, carlsbad, CA)에 클론하여, 플라스미드 pB12를 만든다. 사람의 전장 G-CSF 수용체를 어셈블리하기 위해, 플라스미드 pB12로부터 G-CSF 수용체 N-말단의 절반인 DNA 단편을 pC3(Nhel 및 HincII으로 절단됨)에 삽입하여, 플라스미드 pCB1를 얻는다. 사람의 전장 G-CSF 수용체를 인코드하는 cDNA 단편은 포유류의 발현 플라스미드인 pcDNA3에 삽입하여(Invitrogen, Carlsbad, CA), 플라스미드 pCGF4를 얻는다.
실시예 6; G-CSF 의존성 생쥐 및 사람 세포주의 확립 및 특징 조사
사람의 전장 G-CSF 수용체 발현 플라스미드인 pCGF4를 BspC1으로 절단하여 선형화시킨후에, 생쥐 세포주 32D-cl23 또는 사람 세포 주 TF-1(ATCC, VA)에 실시예 2에서 설명하는 것과 같은 전기천공을 이용하여 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션된 것은 실시예 7에서 설명하는 것과 같이, 10% FBS, G418 0.8mg/㎖, mIL-3 1ng/㎖, 사람 GM-CSF 1ng/㎖(R＆D Systems, Minneapollis. MN)이 보충된 RPMI 1640에서 생장시키고, 10% FBS, G418 0.6mg/㎖, rhG-CSF 1ng/㎖(R＆D Syetems)을 포함하는 RPMI 배지를 이용하여 MTT 검사에서 선별한다. 사람의 G-CSF에 의해 자극을 받아 생장한 트랜스펙션된 것은 제한 희석 방법을 이용하여 세포 클로닝을 선별한다.
사람의 전장 G-CSF 수용체 발현 플라스미드를 포함하는 사람 및 생쥐의 트랜스펙턴트의 사람 G-CSF의 증식 의존성은 실시예 7에서 설명하는 것과 같은 사람 G-CSF, 사람 GM-CSF 또는 생쥐 IL-3 유무하에서 이들 트랜스펙턴트를 생장시킴으로써 측정할 수 있다. 이와 같은 사이토킨에서 트랜스펙턴트의 증식 의존성은 실시예 7에서 설명하는 것과 같은 MTT 검사 및3H-티미딘 취입 검사를 이용하여 모니터할 수 있다.
세포 막 표면상에서 사람의 G-CSFR를 발현시키는 트랜스펙턴트는 FACS를 이용하여 확인할 수 있다. PBS+1% BSA로 씻은 후에, 1ℓ 정제된 단클론 항체를 최종 농도 5㎍/㎖가 되도록 트랜트펙턴트 세포에 첨가한다. 세포 혼합물은 얼음상에서 30분간 배양시키고, 매 15분마다 교반시킨다. 차가운 PBS로 세포를 3회 세척한 후에, FITC가 결합된 염소 항-생쥐 IgG[F(ab')2]를 1:50의 비율로 트랜스펙턴트 세포에 희석하여, 얼음위에서 30분간 배양시킨다. 차가운 PBS로 3회 세척한 후에, 세포는 1% 파라포름알데히드로 하룻밤동안 고정시킨다. 이와 같은 mAbs가 트랜스펙턴트 세포에 세포 결합 비율은 FACS 분석으로 알 수 있다.
실시예 7; in vitro 세포 증식 검사
MTT 기초한 발색 검사(te Boekhorst P.A., et al., Leukemia 1993, 7:1637-44)를 이용하여, 사람의 G-CSF 수용체로 트랜스텍션된 생쥐 또는 사람 세포주의 증식을 작용 항체가 자극하는 능력을 스크리닝하고, 이를 결정한다. 10% FBS및 1ng/㎖ mIL-3을 포함하는 RPMI 배지에 사전 생장시킨 트랜스펙션된 세포는 RPMI 및 10% FBS로 3회 세척하여, mIL-3을 제거하고, 그 다음, 2-5x 104/well 농도로 RPMI/10% FBS으로 도말한다. 하이브리도마 플레이트의 상청액 또는 정제된 항체를 각 웰에 첨가한다. 배양 3일 후에, 10㎕ MTT(2.5mg/㎖ PBS, Boehringer-Maimheim Biochemical)를 각 웰에 첨가한다. 배양 6시간 후에, 10% SDS 및 0.01N HCl을 포함하는 100㎕ 용해성 용액을 첨가하여, 세포를 용혈시키고, 플레이트는 하룻밤동안 배양시킨다. 작용 항체에 의해 자극을 받은 이와 같은 G-CSF-의존성 세포는 OD540-690에서 판독하여 모니터하고, 정제된 항체의 작용 활성을 검사하기 위한 MTT 검사에서, rhG-CSF 및 항체는 이중 또는 삼중으로 2배 희석한다.
hG-CSF 수용체 트랜스펙션된 세포를 자극하는 이와 같은 작용 항체의 능력은3H-티미딘 취입 검사를 이용하여 결정할 수 있다. 10% FBS를 포함하는 사이토킨이 없는 배지로 3회 세척한 후에, 1-2 x 104트랜스펙션된 세포(50㎕/well)는 다양한 농도의 mIL-3, rhG-CSF(R＆B Biosystems), 하이브리도마 세포 배양물 또는 정제된 항체와 96웰상에서 혼합하는데, 이때 웰에는 RPMI 1640 및 10% 투석된 FBS를 포함한다. 1μCi3H-티미딘(특이 활성; 6.7Ci/mmol, New England Nuclear)을 동일한 배지 50㎕와 혼합시켜, 각 웰에 첨가한다. 48시간 배양 후에, 세포는 세포 수득기(Skatron, VA)를 이용하여 수득하고, 액체 신틸레이션 분석기(Packard, IL)를 이용하여3H-티미딘 취입을 3중으로 측정하였다.
실시예 8; 단클론 항체에 대한 사람의 G-CSF 수용체의 정제
하이브리도마로부터 만든 항체는 제조업자의 지시에 따라 Prosep-A 친화력 크로마토그래피(Bioprocessing Inc., Princeton, NJ)을 이용하여 정제하였다. 항체에 대한 G-CSF의 순도는 SDS-PAGE 및 Western blot을 이용하여 점검하였다. 두 개의 정제된 Mabs를 mAb163-93 및 mAb174-24-11이라고 하였다.
실시예 9; 골수 콜로니 형성 검사
건강한 지원자로부터 약 10㎖ 골수를 취하여, 표준 방법에 따라 Ficoll-Paque 분리하였다. 인터페이트에 있는 세포를 파스퇴르 피펫을 이용하여 조심스레 수득하여, 3배 용적의 IMDM 및 2% FBS로 재현탁시키고, 5분간 400g에서 원심분리시킨다. 이과정을 이용하여, 적혈구 세포와 함께 좀더 성숙하고 조밀한 골수 세포가 제거되기 때문에 원시 세포 함량이 2-4배 풍부한 최종 골수 현탁액을 얻는다. 이와 같은 사람의 G-CSFR 작용 항체의 특이성을 결정하기 위해, 과립세포 콜로니 형성 검사를 제조업자의 프로토콜에 따라 실행하였다(StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canada). 사람 또는 침팬지 골수로부터 호중구 과립세포 콜로니 형성을 자극하는 작용 항체의 능력 및 효과를 측정하기 위해, 상이한 농도의 작용 항체 또는 rhG-CSF를 이 검사에 2중으로 적용하였다. 도 7과 9에서 볼 수 있는 것과 같이, 작용 항체 mAb163-93는 rhG-CSF(R＆D Biosystems)와 유사하게, 농도에 따른 방식으로 사람 및 침팬지 골수로부터 호중구 과립세포 콜로니 형성을 자극한다. 세포 착색 결과를 보면, 이와 같은 작용 물질은 사람 및 침팬지 골수의 호중구 증식 및 분화를 자극하는 것을 알 수 있다(도 8, 도 10).
실시예 10; 티로신 인산화 검사
다음에 기술된 것에 따라 사이토킨 및 작용 항체에 의해 유도된 티로신 인산화반응을 분석하였다. 로그 상에 있는 약 2 x 107세포를 수집하여, 무혈청 RPMI 배지에 4시간 동안 굶기고, 무혈청 배지로 3회 세척한다. 굶은 세포는 mIL-3, rhG-CSF(R＆D Biosystems) 또는 작용 mAb을 최종 농도가 2.6nM되도록 하여 15 분간 자극시키고, 원심분리를 이용하여 수득하였다. 세포는 0.5㎖ 용혈 완충액(50mM 트리스 HCl, pH 7.5/150mM Nacl/1%(vol/vol) Triton X-100/1mM EDTA 및 1mM Na3VO4, 1μM 펩스타틴, 50μM 3,4 디클로로이소퓨마린, 1mM 페닐메틸설포닐 플로라이드, 1mM 1, 10-페난트롤린, 루페틴(10㎍/㎖), 파르로티닌(10㎍/㎖)에서 용혈시킨다. 얼음상에서 30분간 배양시킨 후에, 용혈질은 15분간 14,000rpm에서 원심분리로 맑게 한다음, 면역 침전을 위해, JAK1, JAK2, Stat3(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)에 대한 토끼 다클론성 항체를 맑은 용혈질에 첨가하여, 2시간 4℃상에서 배양시킨다. 그 다음 50㎕ 단백질 A 비드(Gibco BRL)를 각 용혈질에 첨가하여, 2시간동안 4℃에서 배양을 지속하였다. 배양 후에, 비드는 용혈 완충액으로 3회 씻은 후에, 35㎕ Laemmli 샘플 완충액(62.5mM Tris: pH 7.6, 2% SDS, 10% 글리세롤, 5% 2-멀캄토에탄올)에 현탁시킨다. 현탁액을 95℃에서 5분간 가열시키고, 4%-7.5% SDS-PAGE에서 전기영동한다. 블랏팅 후에, 차단된 필터는 HRP-결합된 생쥐 단클론 항-포스포로티로신 항체 4G10(Upstate Biotechnology)와 4℃에서 하룻밤동안 배양한다. PBS 및 PBS와 0.05% Tween 20으로 세척한 후에, 필터에서 제조업자의 지시에 따라 SuperSignal Substrate kit(Pierc. Rockford, IL)로 감지하였다. 니트로셀룰로오즈 필터에 항체 및 지시한 바와 같은 양고추냉이 과산화효소(HRP)가 결합된 제 2 항체로 재프로브시킨다.
실시예 11; 하이브리도마 세포로부터 다양한 부분의 작용 항체를 인코드하는 DNA 단편의 클로닝 및 분석
작용 항체를 만드는 하이브리도마 세포로부터 tRNA를 준비하여, 실시예 1에서 설명하는 것과 같은 RT-PCR에서 주형으로 이용한다. 이와 같은 PCR 반응에서 이용된 프라이머는 서열 7~14에서 설명하고 있다. PCR 반응에서 생성된 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(Invitrogen)에 클론시키고, 자동화된 DNA 서열화기 Genetic Analyzer 310(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 분석하였다. 두 개의 별도 RT-PCR 반응으로부터 개별 재조합 플라스미드를 분석하여, 작용항체로 부터 중쇄및 경쇄가 변성부분의 DNA라는것을 확인하였다.
상기에서 설명하는 용어, 실시예 및 구체예는 예시일뿐이면, 본 발명을 이에 한정시키고자 함이 아니며, 본 발명의 범위는 다음의 청구범위 및 이에 등가인 것이 포함된다는 것을 인지할 것이다.

Claims (30)

  1. 세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 사람의 G-CSF 수용체에 특이적으로 결합하거나 상호작용할 수 있는 것을 특징으로 하는 작용 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 호중구 또는 이의 조상 세포의 증식 및 분화를 자극할 수 있는 것을 특징으로 하는 작용 분자.
  3. 사람의 G-CSF 수용체에 특이적으로 결합하거나 상호작용할 수 있고, 세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 수용체와 연관된 카이나제의 인산화반응을 활성화시키거나 또는 수용체와 이량체를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 작용 분자.
  4. 제 1 항에 있어서, 고유의 사람 G-CSF 수용체 또는 이의 치환, 삽입 또는 결손으로 인한 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 사람의 G-CSF 수용체.
  5. 제 1 항 또는 3 항에 있어서, 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 부분과 상호작용할 수 있는 것을 특징으로 하는 작용 분자.
  6. 제 5 항에 있어서, G-CSF 수용체의 아미노산 잔기 1-603(서열:27)의 부분에서 상호작용하는 것을 특징으로 하는 작용 분자.
  7. 제 5 항에 있어서, 제 4 항에 따른 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 부분인 것을 특징으로 하는 사람의 G-CSF 수용체의 세포외 부분.
  8. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 단클론 항체 또는 이의 단편, 동사체, 또는 유사체, 또는 펩티드 또는 유기 화합물인 것을 특징으로 하는 작용 분자.
  9. 제 6 항에 있어서, 단편은 F(ab')2, Fab, scFv인 것을 특징으로 하는 단편.
  10. 제 8 항에 있어서, mAb163-93 및 mAb174-74-11을 포함하는 단클론 작용 항체.
  11. 단클론 항체 mAb163-93 또는 mAb174-74-11의 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 작용 분자.
  12. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, in vitro 증식 검사로 특정하였을 때 사람의 G-CSF 수용체를 발현시키는 사람 또는 생쥐 세포의 증식을 촉진시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 작용 분자.
  13. 제 10항에 있어서, IgG1 서브클래스에 속하고, 가변성 부분의 CDR은 다음의 아미노산 서열중에 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 작용 항체mAb163-93.
    또는 다음의 아미노산 서열중 한 개 이상을 포함하는 가변성 부분의 경쇄 CDR
  14. 제 10 항에 있어서, IgG2a 서브클래스에 속하고, 가변성 부분의 CDR은 다음의 아미노산 서열중에 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 작용 항체mAb174-74-11.
    또는 다음의 아미노산 서열중 한 개 이상을 포함하는 가변성 부분의 경쇄 CDR
  15. 제 8 항에 따른 단클론 작용 항체, 단편, 동사체, 유사체 또는 펩티드를 생성시키는 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주.
  16. 제 13 항에 있어서, 하이브리도마 세포주 163-93 또는 174-74-11인 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주.
  17. 제 8 항에 따른 단클론 작용 항체, 단편, 동사체, 유사체 또는 펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
  18. 제 8 항에 따른 단클론 작용 항체, 단편, 동사체, 유사체 또는 펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 운반 시스템.
  19. 서열 15 내지 26에서 나타낸 한 개 이상의 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 운반 시스템.
  20. 제 16 항에 있어서, 시스템에는 바이러스성 벡터, 플라스미드, 또는 비-벡터 운반 시스템이 포함되는 것을 특징으로 하는 유전자 운반 시스템.
  21. 제 1~13항중 어느 한 항에 따른 분자를 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 호중구 감소증 치료 방법.
  22. 제 5 항에 따른 분자를 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 호중구 감소증 치료 방법.
  23. 제 8 항에 따른 분자를 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 호중구 감소증 치료 방법.
  24. G-CSF 작용 활성에 대한 분자를 스크리닝하는 방법에 있어서, 분자가 G-CSF 의존성 세포의 증식을 자극시키는지를 확인하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 평가는 in vitro 검사를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 검사 방법은 G-CSF 수용체를 발현하는 세포를 이용한 MTT-계 발색 검사 또는3H-티미딘 취입 검사인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서, 세포의 막 표면상에 G-CSF 수용체의 일부분 또는 세포외 도메인의 서열을 가지는 단백질 또는 이의 단편을 발현시키는 것을 특징으로 하는 G-CSF 의존성 세포.
  28. 제 8 항에 따른 항체를 이용하여 사람의 G-CSF 수용체를 면역학적으로 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 8 항에 따른 항체를 이용하여 세포 표면상에서 사람의 G-CSF 수용체를 발현시키는 세포를 면역학적으로 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 8 항에 따른 항체를 이용하여 사람의 가용성 G-CSF 수용체를 면역학적으로 감지하고, 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002240197A1 (en) * 2001-02-01 2002-08-12 Tanox, Inc. Methods to generate and identify monoclonal antibodies to a large number of human antigens
JP5043008B2 (ja) 2006-06-08 2012-10-10 中外製薬株式会社 炎症性疾患の予防または治療剤
CN101720355A (zh) * 2007-06-07 2010-06-02 福田惠一 使用g-csf分化诱导成心肌细胞的方法
CN101939424B (zh) 2007-12-05 2016-12-28 中外制药株式会社 抗nr10抗体及其应用
GB0812277D0 (en) * 2008-07-04 2008-08-13 Fusion Antibodies Ltd Antibody and uses thereof
RU2013141079A (ru) 2011-03-01 2015-04-10 Ново Нордиск А/С Антагонические лиганды dr3
CA2980992C (en) 2015-04-14 2024-01-23 Akihisa Kaneko Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis containing il-31 antagonist as active ingredient
CN107810420B (zh) * 2015-06-25 2020-08-14 豪夫迈·罗氏有限公司 用于测定抗体或配体结合和功能的基于细胞的测定
AR120512A1 (es) 2019-11-20 2022-02-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulaciones que contienen anticuerpos
CN114292843B (zh) * 2021-12-03 2023-07-21 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JP3417558B2 (ja) * 1991-05-10 2003-06-16 ジェネンテク，インコーポレイテッド 配位子作用薬および拮抗薬の選択
FR2686900B1 (fr) * 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
AUPM375094A0 (en) * 1994-02-08 1994-03-03 Ludwig Institute For Cancer Research Cytokine receptor interactive molecules and methods for assaying cytokine function
WO1995029690A1 (en) * 1994-04-29 1995-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Biologically active peptides and methods of identifying the same
AU717733B2 (en) * 1995-10-05 2000-03-30 G.D. Searle & Co. Novel G-CSF receptor agonists

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