CN118108855A - 一种结构与功能可调节性的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种结构与功能可调节性的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途，所述融合蛋白为等同二聚体，构成所述融合蛋白的单体为包括IL‑15片段、IL‑15Rαsushi和CH2—CH3片段的融合多肽，构成所述融合蛋白的单体从N末端至C末端的结构为：IL‑15片段—第一连接子—IL‑15Rαsushi—第二连接子—CH2—CH3片段，或IL‑15Rαsushi—第一连接子—IL‑15片段—第二连接子—CH2—CH3片段。本发明的融合蛋白降低了系统毒性，减少了对免疫细胞过强激活造成的免疫疲劳；并提高了稳定性，延长在体内的半衰期，保持IL‑15抗肿瘤特异性活性，从而扩大治疗窗口，提高安全性,并可以系统给药。

Description

一种结构与功能可调节性的细胞因子融合蛋白及其制备方法 和用途
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种结构与功能可调节性的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
白细胞介素15(IL-15)是12-14kD的细胞因子，它是T细胞和NK细胞的生长因子，在这些免疫细胞的发育、增殖和激活中发挥重要作用。IL-2是最早被用于肿瘤免疫治疗的细胞因子，但是同时也伴随着多种系统性的毒副作用。IL-15与IL-2具有一些类似的生物学效应，但相对于IL-2，IL-15在肿瘤治疗方面具有以下优势：IL-15可以避免活化诱导的细胞死亡，诱导较长寿命的记忆性T细胞的产生和稳态增殖；IL-15不会扩增Treg细胞；IL-15没有作用于血管内皮细胞而引起系统性毒副作用。国家癌症研究所(NCI)曾将IL-15列为癌症治疗的前20名免疫治疗剂之一。自从IL-15被发现以来，已有6000多篇论文和170多个临床试验涉及这种细胞因子(EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE 22:675,2021)。
临床前试验表明，重组IL-15(rIL-15)能刺激免疫系统产生CD8记忆T细胞和NK细胞，并促进这两类杀伤的长期增殖和激活。IL-15刺激这些细胞毒性效应细胞的能力是支持其潜在抗肿瘤活性的主要机制。给予rIL-15可导致肿瘤消退、转移减少，并提高荷瘤小鼠的生存率(Immunol Lett.190:159–168.2017)。在小鼠体内研究中，增加的抗肿瘤反应与T-CD8+和NK细胞的丰富细胞毒性活性相关。因此，在一些接受IL-15治疗的小鼠中，肿瘤被清除后，治疗过的动物在再次接种肿瘤后仍然没有肿瘤可以生长，这表明产生了长期的免疫保护性能(Expert Rev Clin Immunol.10:1689–1701.2014)。然而，IL-15的临床应用受到极大的阻碍，主要是有以下原因：
1)造成的病人全身的系统性的副作用
与所有的细胞因子的免疫疗法类似，由于细胞因子的多种效应的特点，导致与在非靶细胞上的受体不必要的结合和激活，从而产生毒性，具体如下：白细胞介素-15(IL-15)对NK和CD8+T记忆细胞的增殖和存活至关重要，免疫细胞扩增需要持续暴露在高于阈值浓度的IL-15下一段时间(J Clin Oncol.(2015)33:74–82)(J Immunol.(2003)170:5018–26)。研究表明，在注射IL-15的几分钟内，NK和记忆性CD8 T细胞在循环血液中大量增殖，NK细胞可以增加10倍。由于IL-15对T和NK细胞的有效刺激，多种炎性细胞因子的血清水平也随之增加了50倍(Immunol Lett(2017)190:159–68.)(J Clin Oncol.2015Jan 1；33(1):74–82)。与炎症细胞因子过高相关的毒性和不良事件包括发热、低血压、食欲改变、体重减轻、腹泻、皮疹、暂时性3-4级中性粒细胞减少症和贫血。更多临床实验数据表明，体内长期暴露于超生理浓度的高活性的IL-15与IL-15的超级激动剂复合物是非常有害的。
2)给药途径限制，半衰期不够长等药物动力学问题
天然IL-15体内血液中的半衰期较短(t1/2～2.5小时)，在人体内仅仅持续数小时，治疗窗口很狭窄，疗效很不明显。单次注射需要高剂量才以达到足够的持续暴露，但会产生较高的Cmax，引起剂量相关的毒性。另一种长期保持IL-15恒定水平的方法是持续静脉输注(CIV)。如此，IL-15的5-day或10-day CIV显示CD8+T细胞、NK细胞和特异性激活的NK细胞(CD56brightNK)显著增加。但是，持续静脉输注CIV给药是一种不切实际的给药途径在患者依从性、生活质量和医疗成本方面存在问题。另外一个解决方案就是在不断来开发的高活性及长效的IL-15受体激动剂，努力使单次剂量就能够将激动剂有效浓度长期维持在狭窄的治疗窗口中。增加IL-15半衰期的最常见方法包括增加分子大小以降低肾脏清除率和/或靶向Fc受体(FcRn)，其中包括将IL-15Rα和/或聚乙二醇(PEG)、Fc或血清白蛋白连接到IL-15上，例如，Alt-803(IL-15N72D/IL-15Rα-Fc)、hetIL-15(IL-15/IL-15Rα)、RLI(IL-15和IL-15Rαsushi的单链融合)和NKTR-255(聚乙二醇化IL-15)。但意想不到的是，虽然这些半衰期延长技术通常会将蛋白质在体内的半衰期延长到一周或更长，但所研究的IL-15激动剂的系统消除半衰期的时间不超过1天，通常只有几个小时。例如，人体内静脉注射“长效”ALT-803激动剂具有约0.75到5小时的剂量依赖性消除半衰期，这与静脉注射天然IL-15的2.5小时半衰期并没有显著差异。这是因为，IL-15激动剂的药代动力学和药效学受到靶点介导进行消除(Target-mediated drug disposition，TMDD)的显著影响，也就是说细胞因子会被靶向免疫细胞-“细胞因子陷阱”(Cytokine Sink)消耗和清除。靶点介导的消除(TMDD)，就是当药物分子与相应配体(受体)结合后，通过胞吞作用进入细胞，随后在溶酶体中进行降解。对于IL-15，在初始较高的IL-15浓度下，靶细胞被细胞因子(即容量有限的TMDD)饱和，激动剂的清除主要由肾脏和/或代谢消除决定。随后IL-15引起靶免疫细胞的时间依赖性的增殖，相应地细胞因子被靶免疫细胞消耗和清除也呈现时间依赖性的增加；一旦扩增的靶细胞超过细胞因子浓度，药代动力学表现为TMDD。所以，随着靶免疫细胞增殖，IL-15激动剂清除率也在动态中增加。(Biochem Pharmacol.(2006)72:1–10.10.1016)(Cancer Res.(2019).79(13Suppl):678)。大量的实验研究证明，造成ALT-803较短的半衰期的主要原因就是因为TMDD效应所致，靶细胞消耗了很大比例的药物，并表现为剂量依赖性消除率(Front Immunol.2020；11:1813)。
为了延长ALT-803的半衰期，改变了最初在临床试验中采用静脉注射给药，而进行皮下注射(SC)给药，ALT-803半衰期可以延长至30小时。而且，SC给药，药物吸收缓慢，Cmax大大降低，比IV低了100倍，明显减少了药物治疗所引起的毒副作用。因此，在目前的所有的ALT-803临床研究中大部分都是SC给药。虽然缓慢的SC吸收为延长半衰期提供了一种简单、实用的方法，但它也存在很大的缺点，如非常低的生物利用度。对于天然IL-15，人的SC半衰期接近静脉注射(SC为4小时，静脉注射为2.5小时)，生物利用度接近100％。因此，大多数SC给药的IL-15迅速且完全转移到体循环。然而，在临床实验中，SC ALT-803显示约30小时的长t1/2，但生物利用度仅为3％，表明大多数(约97％)的药物从未到达体循环，可能是激活注射部位附近的免疫细胞并被其消耗。SC注射的ALT-803(IL-15未观察到)产生明显的局部毒性，就是由于在注射部位沉积的超激动剂水平过高，并且其副反应消退很缓慢。由于SC注射ALT-803后明显的副作用，也使治疗时使用的剂量难以进一步增加。(Cytokine.2018Jul；107:105–112.)(Cancer Res.(2019).79(13Suppl):678)(Blood.(2018)131:2515)。
所以，尽管IL-15已连接到其他可以延长半衰期的Fc或IgG片段，但真正能够长效的IL-15激动剂尚未实现。仍然需要一种更加有效的长效IL-15激动剂，使该激动剂具有每周一次或更长时间间隔的单次注射，使用药方式更具有便利性和可接受性。
3)对免疫效应细胞过强与过长时间的刺激，会造成免疫反应的衰退与疲劳
高活性的IL-15与IL-15激动剂对癌症患者的反复超强的刺激对机体免疫系统可能会产生负面影响。研究表明，一次输注rhIL-15会导致患者外周血中NK细胞的扩增和增殖增加，而第二次输注rhIL-15会导致NK细胞反应减少。此外，最近的两项研究也表明，反复注射N-803可能导致SIV+macaque99的NK细胞的生物反应性降低，在1b期试验中，转移性非小细胞肺癌患者的生物反应性降低。(Clin Cancer Res 2018；24:1525–35.10.1158)
另外两项研究分别考察了IL-15/IL-15Rα复合物对NK和CD8+T细胞的瞬时和长期体内刺激的影响，发现用IL-15/IL-15Rα刺激CD8+T细胞数周后，诱导活化表型、强大的T细胞受体刺激和效应器功能。然而，同时也导致成熟NK细胞的积聚，其活化、细胞毒性和增殖活性显著受损。最近，Frutoso等人在体内研究表明，NK细胞对IL-15或IL-15/IL-15Rα复合物的单个刺激周期产生反应，但第二个刺激周期后变得低反应且没有扩增。这些数据强调，IL-15和IL-15/IL-15Rα复合物过度刺激NK细胞可能导致NK低反应性或疲劳。(PNAS.2010；107:21647–52)(J Immunol 2018；201:493–506)(J Immunother Cancer.2020；8(2):e001428)
4)狭窄的治疗窗口
在肿瘤组织中达到治疗水平所需的高剂量药物不可避免地激活全身的免疫细胞，从而产生严重的剂量相关的全身系统性的毒性。而且，尽管IL-15与IL-15激动剂显著增强NK细胞和CD8 T细胞，但所有作为单一疗法在实体瘤癌症患者中使用的IL-15制剂可能由于反向调节免疫过程而变得无效。特别是导致NK低反应性或疲劳，使NK作用常常会受到抑制。因此IL-15激动剂的剂量与暴露时间的适当平衡至关重要，决定了产生的疗效、毒性、免疫细胞的活性状态。但在临床实际的应用中，在狭窄的治疗窗口内长时间维持有效药物浓度与适当暴露时间，可能性很低，这些困难严重地限制了IL-15激动剂的使用剂量。
目前处于临床试验中的两个主要IL-15激动剂为N-803和RO73107291，二者的特点如下：N-803比活高，毒性大，安全窗小，半衰期短，临床使用中不能IV给药；目前疗效明显而且安全的治疗方案是肿瘤局部给药。RO7310729/XmAb24306体外生物学活性降低，半衰期大大延长；虽其比活比N-803降低100倍，仍相当于野生型IL-15。由于野生型重组IL-15在治疗中存在的毒性以及引起NK细胞的疲劳，RO7310729是否能解决现有的安全窗口狭窄的问题，还有待临床观察与验证。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种结构与功能可调节性的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种细胞因子融合蛋白(或简称为融合蛋白)，所述融合蛋白为等同二聚体，构成所述融合蛋白的单体为包括IL-15片段、IL-15Rαsushi和CH2—CH3片段的融合多肽。
优选的，构成所述融合蛋白的单体从N末端至C末端构成所述融合蛋白的单体：IL-15片段—第一连接子—IL-15Rαsushi—第二连接子—CH2—CH3片段，或IL-15Rαsushi—第一连接子—IL-15片段—第二连接子—CH2—CH3片段。
如上所述，本发明的结构与功能可调节性的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途，具有以下有益效果：现有IL-15激动剂都是相较IL-15活性增强的分子，临床试验中表现为半衰期短、易产生毒性，以及过度的激活造成免疫细胞的疲劳，使治疗安全窗口很狭窄。与这些技术相比，本发明降低了IL-15生物学活性，改善对免疫细胞的选择性温和性的激活与扩增，降低了系统性毒性，减少了对免疫细胞过强激活造成的免疫疲劳；并提高稳定性，延长在体内的半衰期，保持IL-15抗肿瘤特异性活性；从而扩大治疗窗口，提高药物的安全性。
对比现在临床试验中的两个主要IL-15激动剂N-803和RO7310729，本发明的FS-0918有许多优势，FS-0918的结构设计中通过连接子将IL-15和IL-15Rαsushi区域共价连接，并在同一条链上与Fc连接，使FS-0918分子表达为等同二聚体。一方面，通过调整IL-15/IL-15Rαsushi的顺序，以及IL-15Rαsushi的大小与连接子的长短，从而降低FS-0918分子与IL-2/15-Rβ和IL-2/15-Rγ受体亲和力，进而减弱了FS-0918分子生物学活性；第二方面，通过降低FS-0918分子与目标免疫细胞的亲和力，减少通过目标细胞内吞清除或靶点介导消除(Target-mediated drug disposition，TMDD)，并通过与Fc的融合，延长体内半衰期；第三方面，将IL-15与IL-15Rαsushi区域共价连接表达在同一条链，可以避免常见的IL-15脱落的问题，使蛋白分子更加稳定。第四方面，等同二聚体的配对可以避免异源二聚体及半抗体的存在，FS-0918分子具有高表达量和良好稳定性，表明了该结构的成药性优势。和RO7310729/XmAb24306相比，FS-0918的生物学活性比野生型的IL-15降低了10-100倍，最大可能地降低IL-15激动剂在治疗中存在的毒性以及引起NK细胞的疲劳；而且保留了IL-15完整的生物学和持续性的抗肿瘤活性，可以进一步提高安全窗口，给系统给药提供了更大的可能性。
附图说明
图1显示为本发明的融合蛋白的结构示意图，左图为FS-0918-151和153的示意图，右图为FS-0918-152和154的结构示意图。
图2显示为本发明的融合蛋白经12％SDS-PAGE还原电泳后的结果。
图3显示为本发明的FS-0918蛋白与IL-2Rβ结合与解离的动力学曲线，每个浓度下的两条线中其中一条为实测曲线，另一条为模拟和拟合后的曲线。
图4显示为本发明的FS-0918融合蛋白与IL-2Rβ的亲和力数据。
图5显示为本发明的FS-0918融合蛋白与IL-2RβγFc二聚体的结合与解离的动力学曲线。
图6显示为本发明的FS-0918融合蛋白与IL-2Rβγ的亲和力数据。
图7显示为本发明的FS-0918融合蛋白对细胞增殖活性影响的测定。
图8显示为本发明的FS-0918-153融合蛋白在SD大鼠体内药代动力学(PK)的曲线。
图9显示为给予FS-0918-153融合蛋白的B16F10小鼠模型的肿瘤体积变化趋势。
图10显示为给予FS-0918-153融合蛋白的B16F10小鼠模型的肿瘤体积。
图11显示为本发明的不同FS-0918融合蛋白的AlphaFold(AF2)对可调节免疫因子空间结构的解析，各个组分(IL-15,IL-15Ra sushi,linker，Fc)通过不同组合形成的融合蛋白，采用AlphaFold(AF2)蛋白结构模拟技术进行分析，表明它们都可以形成稳定的空间结构；同时也观察到IL-15与IL-15Ra sushi之间结合的细微差异。
具体实施方式
本发明利用融合蛋白技术与结构微调，制备具有完整生物学活性的“亚态结构”(sub-optimal structure)的融合蛋白FS-0918，从而降低IL-15生物学活性，并对免疫细胞的激活与扩增有一定的选择性与较温和的过程，降低了系统性毒性，减少了对免疫细胞过强激活造成的免疫疲劳；并延长在体内的稳定性与半衰期，保持IL-15抗肿瘤特异性活性；从而扩大治疗窗口，提高药物临床治疗的安全性。
本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为等同二聚体，构成所述融合蛋白的单体为包括IL-15片段、IL-15Rαsushi和CH2—CH3片段的融合多肽。即所述融合蛋白包括两条多肽链，每条多肽链均包括IL-15片段、IL-15Rαsushi和CH2—CH3片段。两条多肽链通过二硫键连接形成等同二聚体。
所述细胞因子融合蛋白的半衰期为30小时以上。具体的，所述细胞因子融合蛋白在SD大鼠体内的半衰期为35小时。所述细胞因子融合蛋白在SD大鼠体内的半衰期的检测方法如下：按照0.4mg/kg的剂量向雄性Sprague–Dawley大鼠静脉注射FS-0918 153。注射给药后，在以下不同时间取血0.3ml：0,5min,15min,30min,1h,2h,4h,8h,24h,48h,72h,96h和120h。将血液样本分离血清，对血清中药物FS-0918 153进行ELISA检测，计算得到半衰期为35小时。
构成所述融合蛋白的单体从N末端至C末端的结构选自以下任一：
IL-15片段—第一连接子—IL-15Rαsushi—第二连接子—CH2—CH3片段；
IL-15Rαsushi—第一连接子—IL-15片段—第二连接子—CH2—CH3片段。
即每条多肽链从N末端至C末端依次包括IL-15片段—第一连接子—IL-15Rαsushi—第二连接子—CH2—CH3片段，或包括IL-15Rαsushi—第一连接子—IL-15片段—第二连接子—CH2—CH3片段，所述CH2—CH3片段为抗体重链恒定区的一部分。
术语“IL-15”或“白细胞介素15”为其在本领域的一般含义，是指具有与IL-2的结构相似性的细胞因子(GRABSTEIN等，Science，vol.264(5161)，p：965-968，1994)。IL-15与IL-2共用γc受体亚单位，这两种细胞因子均能诱导T细胞、B细胞和自然杀伤细胞(NKcell)的分化以及促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖。
所述白细胞介素15为哺乳动物白细胞介素15，优选地为灵长类动物白细胞介素15，更优选地为人白细胞介素15。
本领域技术人员可以简单地识别哺乳动物白细胞介素15。作为一个实例，可以引用源自野猪(Sus scrofa)(GenBank登录号：ABF82250)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(GenBank登录号：NP_037261)、小家鼠(Mus masculus)(GenBank登录号：NP_032383)、牛(Bos Taurus)(GenBank登录号：NP_776515)、家兔(Oryctolagus cuniculus)(GenBank登录号：NP_001075685)、绵羊(Ovies aries)(GenBank登录号：NP_001009734)、家猫(Feliscatus)(GenBank登录号：NP_001009207)、食蟹猴(Macacafascicularis)(GenBank登录号：BAA19149)、智人(GenBank登录号：NP_000576)、恒河猴(Macaca_Mulatta)(GenBank登录号：NP_001038196)、土拨鼠(Cavia porcellus)(GenBank登录号：NP_001166300)或绿猴(Chlorocebus sabaeus)(GenBank登录号：ACI289)的白细胞介素15。
在一种实施方式中，所述IL-15片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
所述IL-15片段的氨基酸序列还包括与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少90％、优选地至少96％、更优选地至少98％或至少99％相似性，且具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
本文所用术语“IL-15Rαsushi结构域”具有其在本领域的一般含义，是指起始于IL-15Rα的信号肽之后的第一个半胱氨酸残基(C1)，并终止于所述信号肽之后的第四个半胱氨酸残基(C4)的结构域。所述IL-15Rαsushi结构域具有人IL-15Rαsushi结构域对人白细胞介素-15的结合活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少50％。
所述IL-15Rαsushi结构域为哺乳动物IL-15Rαsushi结构域，优选地为灵长类动物IL-15Rαsushi结构域，更优选地为人IL-15Rαsushi结构域。
本领域技术人员可简单地识别哺乳动物IL-15Rαsushi结构域。作为一个实例，可以引用源自褐家鼠(登录号：XP_002728555)、小家鼠(登录号：EDL08026)、牛(登录号：XP_002692113)、家兔(登录号：XP_002723298)、食蟹猴(登录号：ACI42785)、豚尾猴(Macacanemestrina)(登录号：ACI42783)、智人(登录号：CAI41801)、恒河猴(MacacaMula tta)(登录号：N P_0011 66315)、苏门答腊猩猩(Pongoa belii)(登录号：X P_002820541)、白颈白眉猴(Cercocebus torquatus)(登录号：ACI 4 27 84)、普通狨(Callithrix jacchus)(登录号：XP_002750073)或豚鼠(Cavia porcellus)(登录号：NP_001166314)的IL-15Rα的sushi结构域。
在一种实施方式中，所述IL-15Rαsushi结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示，如SEQ ID NO.2所示的序列称为短序列或R-short，如SEQ ID NO.3所示的序列称为长序列或R-long：
在一种实施方式中，R-short用于形成FS-0918-151和152融合蛋白，R-long用于形成FS-0918-153和154融合蛋白。
所述IL-15Rαsushi结构域的氨基酸序列还包括与SEQ ID NO：2～3所示氨基酸序列具有至少90％、优选地至少96％、更优选地至少98％或至少99％相似性，且具有SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
IL-15片段和IL-15Rαsushi通过第一连接子共价连接。
本发明通过第一连接子将IL-15片段和IL-15Rαsushi区域共价连接，并在同一条链上与Fc片段连接，使FS-0918分子表达为等同二聚体。
所述第一连接子可以是本领域中各种适用于形成融合蛋白的连接肽。例如，所述第一连接子可以是G4S3 linker。在一优选的实施方式中，所述第一连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示：
在一种实施方式中，如SEQ ID NO.4所述的第一连接子用于FS-0918-151、152和154中。在一种实施方式中，如SEQ ID NO.5所述的第一连接子用于FS-0918-153中。
在如图1中左图所示的实施方式中，所述抗体重链恒定区通过第二连接子与IL-15片段连接，例如本发明的FS-0918-151和153。
在如图1中右图所示的实施方式中，所述抗体重链恒定区通过第二连接子与IL-15Rαsushi连接，例如本发明的FS-0918-152和154。
所述第二连接子可以是本领域中各种适用于形成融合蛋白的连接肽。例如，所述第二连接子可以是G4S3 linker。在一优选的实施方式中，所述第二连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.6)
所述CH2—CH3片段来源于IgG、IgA、IgM、IgE或IgD。优选的，所述CH2—CH3片段来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。更优选的，所述CH2—CH3片段来源于IgG4。
抗体重链恒定区可以是天然序列的恒定区或其氨基酸序列的变体。天然序列的恒定区例如为哺乳动物天然序列的恒定区。哺乳动物优选地为灵长类动物，更优选地为人。
在一种实施方式中，所述CH2—CH3片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：
在一种实施方式中，所述融合蛋白为FS-0918-151(可简写为151，或0918-151)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示：
在一种实施方式中，所述融合蛋白为FS-0918-152(可简写为152，或0918-152)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：
在一种实施方式中，所述融合蛋白为FS-0918-153(可简写为153，或0918-153)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示：
在一种实施方式中，所述融合蛋白为FS-0918-154(可简写为154，或0918-154)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示：
本发明的第二个方面提供了一种分离的核苷酸，所述核苷酸编码所述融合蛋白。
本发明所述核苷酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如PCR方法等，获得编码上述单克隆抗体的核苷酸，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述单克隆抗体的核苷酸。
本领域技术人员知晓，编码上述融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该融合蛋白基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明的第三个方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上所述核苷酸。
其中所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。
本发明所述表达载体较佳地为pTL-8，pTT5，pDR1，pcDNA3.1，pcDNA3.4，pDHFF，pGM-CSF或pCHO1.0，更佳地为pcDNA3.4，pTT5。
本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如上所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组中整合有所述的核苷酸。
本发明所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞和真核表达细胞。具体的，所述宿主细胞例如为：COS、CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、E.coli TG1、BL21(DE3)细胞或者CHO-K1细胞、293T细胞或TG1。所述宿主细胞更佳地为CHO细胞和/或293T细胞。
本发明的第五个方面提供了所述融合蛋白的制备方法，所述方法包含以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达所述融合蛋白；
(b)分离并纯化(a)所述的融合蛋白。
本发明所述的宿主细胞的培养方法、所述融合蛋白的分离和纯化方法为本领域常规方法具体操作方法请参考相应的细胞培养技术手册以及融合蛋白分离纯化技术手册。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白。本发明的发明人对所得融合蛋白进行了检测实验，实验结果表明该融合蛋白能很好地与IL-2Rβ、IL-2Rβγ结合，表现为一系列不同的亲和力。
本发明的第六个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的融合蛋白和药学上可接受的载体与辅料。
本发明提供融合蛋白可以和药学上可接受的载体或辅料一起组成药物组合物从而更稳定地发挥疗效。
“药学上可接受的”是指当药物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；稀释剂；赋形剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；缓冲液如磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的融合蛋白以及药学上可接受的载体或辅料。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每次约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。优选的，给药方式为静脉注射。药物组合物具有一定的制剂形式可以保证本发明公开的融合蛋白的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
本发明的第七个方面提供了如上所述的融合蛋白或如上所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
根据本发明，所述癌症选自黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、淋巴癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、前列腺癌、骨髓癌及其它赘生性恶性疾病中的一种或多种。
本发明所述融合蛋白可以单独使用或与其它抗肿瘤药物联合使用。
所述的细胞因子融合蛋白与肿瘤放疗药物或肿瘤化疗药物或免疫检查点药物联合在制备肿瘤治疗产品中的用途。所述放疗、化疗及免疫检查点药物例如为PD-1，PD-L1抗体。联用可达到更好的治疗效果。
本发明所称的治疗癌症的药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。
本发明中融合蛋白及其药物组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的第八个方面提供了一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用如上所述的融合蛋白或如上所述的药物组合物。
根据本发明，所述癌症选自黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、淋巴癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、前列腺癌、骨髓癌及其它赘生性恶性疾病中的一种或多种。
所述融合蛋白及其药物组合物在向受试者施用时，给药剂量需为治疗有效量。所述治疗有效量是指在治疗癌症中有效果的量。具体的，所述融合蛋白及其药物组合物在向受试者施用时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。
术语“受试者”包括但不限于哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、大鼠和小鼠等。
本发明治疗治疗癌症的的方法中，所述“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种状态，降低某种状态发生或发展的速度，减少发展出某种状态的风险，预防或延迟与某种状态相关的症状发展，减少或终止与某种状态相关的症状，产生某种状态的完全或部分的逆转，治愈某种状态，或以上的组合。
本发明还提供所述的细胞因子融合蛋白在制备多功能融合蛋白中的用途，所述多功能融合蛋白能够同时结合IL-2受体β、IL-2受体二聚体βγ以及以下中的任一种或多种靶点，例如PD-1、PD-L1、VEGF、TGF-β、NKG2D、NKG2A、LAG3、NKp46等。
本发明的细胞因子融合蛋白能够融合以下中的一种或多种功能性蛋白或抗体形成多功能融合蛋白：抗PD-1抗体，抗PD-L1抗体，抗VEGF抗体，TGF-β受体，抗NKG2D抗体，抗NKG2A抗体，抗LAG3抗体，抗NKp46抗体，等等。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1融合蛋白的制备
对融合蛋白中IL-15/IL-15Ra sushi/Fc/连接子各个关键元件进行氨基酸长度以及排列次序进行不同的调整与组合，设计与制备出了一系列不同生物学活性的FS-0918的IL-15融合蛋白分子，具体制备方法如下：
委托第三方公司基因合成本发明的4个融合蛋白151，152，153，154各自所对应的的基因序列。每个序列的上游设计了分泌蛋白所需的信号肽密码子。合成序列的上下游分别设计了内切酶HindIII和EcoRI位点便于将目标基因克隆到表达载体。
将含有编码FS-0918融合蛋白的表达载体pcDNA 3.1(A mammalian expressionvector,Invitrogen Life Technologies，货号：V79020)转染至CHO-K1表达宿主细胞，用蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)加压筛选高表达克隆，将筛选得到的高表达克隆在EmCD CHO 104培养基(Eminence)中37℃、5％ CO2条件下进行大量培养、诱导表达，培养12-14天后收集细胞培养液。
细胞培养液离心后采用基于Protein A的亲和纯化介质进行纯化，例如Cytiva公司的Mab Select prismA纯化填料，平衡缓冲液为pH7.2的20mM Tris-HCl溶液，平衡5个柱体积后上样，上样载量不大于30mg/ml介质，上样流速控制样品保留时间大于等于1min，上样结束后使用平衡缓冲液继续平衡层析柱至A280数值下降至基线并保持平稳后开始进行洗脱操作，洗脱缓冲液为pH3.0的20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，根据A280的数值进行洗脱峰收集，收集含有目标蛋白151、152、153、154的组分，然后使用1M pH9.0的Tris-HCl调节收集的洗脱组分pH至7.0，进行理化性质和生物学活性的检测和鉴定。
将纯化后的融合蛋白进行常规SDS-PAGE还原电泳鉴定，电泳胶浓度为12％的丙烯酰胺，使用考马斯亮蓝R250染色后2小时，脱色液脱色后使用凝胶成像系统扫描。
图2是纯化后融合蛋白151、152、153、154的SDS-PAGE还原电泳鉴定照片，如图2所示融合蛋白经过还原剂还原后均为一条条带，表观分子量与设计分子的理论分子量接近，一步纯化后SDS-PAGE电泳纯度均大于95％，满足后续生物学活性检测要求。
实施例2受体亲和力测定
1.1.利用表面等离子体共振(SPR)检测FS-0918融合蛋白与IL-2受体β(IL-2Rβ)的结合能力
在Biacore T200上，通过表面等离子体共振(Biacore T-200)测量两种FS-0918IL-15融合蛋白153和154对IL-2Rβ的亲和力，并与对照IL-15融合蛋白540(序列与P22339相同，Discovery of a novel IL-15based protein with improveddevelopability and efficacy for cancer immunotherapy.Sci Rep.2018,8,7675)的亲和力进行比较。使用表面含有固定化anti-His Tag抗体的CM-5的传感器芯片(Cytiva,Sensor Chip CM5,BR100530)，将人IL-2Rβ-His蛋白捕获于传感器芯片表面上，作为测定的受体。在pH 7.4的测定缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.1％ BSA和0.05％吐温20)中，0-180s分别持续加入不同浓度(10nM和40nM)的IL-15样品，与固定的IL-2Rβ-His结合，产生结合曲线；在180s之后，停止加样，用缓冲液持续冲洗芯片，产生40nM和10nM两个稀释度的FS-0918蛋白和对照蛋白540与受体解离的动力学曲线(图3)。通过曲线拟合计算各浓度下的Ka和Kd，计算平衡解离常数(KD)，结果如图4所示。计算每种融合蛋白对IL-2Rβ的亲和力相对于对照品(540)对IL-2Rβ的亲合力的倍数变化。
结果如图4所示，与540蛋白相比，两种不同亚结构的IL-15融合蛋白153和154对IL-2Rβ的亲和力都显著减少，分别减少了2.3倍。
1.2.利用生物膜干涉技术(biolayer interferomeory，BLI)检测FS-0918融合蛋白与IL-2受体二聚体βγ(IL-2Rβγ)的结合能力
在Octet RED96上，通过生物膜干涉技术(biolayer interferomeory，BLI)测定FS-0918融合蛋白与IL-2受体二聚体βγ(IL-2Rβγ)的结合能力，并与对照IL-15融合蛋白540的亲和力进行比较。使用表面含有固定化Streptavidin(SA)传感器芯片，将Biotinylated的FS-0918IL-15融合蛋白捕获于传感器芯片表面上。在pH 7.4的测定缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.1％ BSA和0.05％吐温20)中，于0-96s分别持续加入不同浓度(10nM和20nM)的IL-2Rβγ，与固定的IL-15样品结合，产生结合曲线；在96s之后，停止加样，用缓冲液持续冲洗芯片，产生40nM和10nM两个稀释度的human IL-2RβγFc二聚体的解离的动力学曲线(图5)。通过曲线拟合计算各浓度下的Ka和Kd，计算平衡解离常数(KD)。计算每种融合蛋白对IL-2Rβγ的亲和力和相对于对照品(540)对IL-2Rβγ的亲合力的倍数变化。
如图6所示，与540蛋白相比，具有两种不同亚结构的IL-15融合蛋白153和154对IL-2Rβγ的亲和力都显著减少，分别减少了3倍和10倍左右。结果说明，通过对融合蛋白中IL-15,IL-15Rαsushi，连接子(linker)在连接顺序以及序列长短进行调整，可以调节IL-15与IL-15Rαsushi结合的亲和力大小以及空间构象，从而调节IL-15/IL-15Rαsushi复合物(153和154)与IL-2Rβ和IL-2Rβγ的结合。
实施例3细胞增殖活性测定
Mo7e细胞人巨细胞白血病细胞株仅仅表达IL-2Rβγ受体二聚体，不表达IL-2Rα。Mo7e细胞在添加了10％胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸(NEAA)和15ng/ml GM-CSF的RPMI1640中培养。为了测量细胞因子依赖性细胞增殖，在对数生长期收获Mo7e细胞，并用PBS洗涤两次。将90μl细胞悬液(不含GM-CSF)按照2×104个细胞/孔接种到96孔板中，并在测定培养基(RPMI 1640，添加了10％ FBS和1％ NEAA)中孵育4小时，在37℃和5％ CO2条件下用于细胞因子饥饿。
测定中采用rhIL-15作为对照品：R&D System(Cat.No.:BT-015-AFL)和NovoProtein(Cat.No.:C016)两个公司的IL-15。IL-15对照品与FS-0918蛋白质样品在测定培养基中制备至初始浓度为300nM，随后进行1/3梯度稀释。将10μl稀释的蛋白质加入相应的孔中并在37℃和5％ CO2下孵育72小时。加入细胞计数试剂盒(CCK-8,Dojindo,CK04)进行比色测定(OD450)以获得活细胞的数量。
测定所设计的FS-0918的4个不同融合蛋白样品(151，152，153和154)对Mo7e细胞增殖活性，结果如图7所示，所有测试IL-15样品以剂量依赖性方式诱导Mo7e细胞的生长。对比IL-15(EC50:0.03nM)，FS-0918分子的活性都有不同程度的降低(EC50:0.105-0.648nM)，为对照组IL-15的3-20倍。而且活性测定结果与IL-2Rβγ受体亲和力测定结果是一致的，154比153细胞生物学活性进一步降低了6倍，受体亲和力仅降低了3.3倍。
实施例4FS-0918药物153在SD大鼠体内药代动力学(PK)试验
3只雄性Sprague–Dawley大鼠(体重～200g)，静脉注射给药FS-0918 153，0.4mg/kg。给药后，在不同时间取血0.3ml：0,5min,15min,30min,1,2,4,8,24,48,72,96和120h。分离血清(>100μl)，保存在-80℃。对血清中药物153进行ELISA分析。ELISA采用pH7.4的PBS缓冲液将一抗rabbit anti-hIL-15抗体(SinoBio,#10360-RP01)包被在ELISA板上。测定中二抗用biotinylated mouse anti-hIgG4 Fc抗体(Thermofisher,#A10663)。在多功能酶标仪上测定450nm吸光度。
图8是153在SD大鼠体内药代动力学(PK)的曲线，体内半衰期为35小时，对比Altor公司的N-803的半衰期7.5小时(Evaluation of the biological activities of the IL-15superagonist complex,ALT-803,following intravenous versus subcutaneousadministration in murine models.Cytokine.2018,107,105)，恒瑞公司的P22339半衰期13.7小时(Discovery of a novel IL-15based protein with improved developabilityand efficacy for cancer immunotherapy.Sci Rep.2018,8,7675)，153在体内的有效的血药浓度得到有效地延长。153半衰期的明显延长，证明通过减弱IL-15分子与受体的亲和力，降低了在血液中IL-15效应细胞(T细胞和NK细胞)内吞清除IL-15药物的速率，证实了本申请中分子设计的原理与技术路线，即通过降低FS-0918分子与目标免疫细胞的亲和力，减少通过目标细胞内吞清除或靶点介导消除(Target-mediated drug disposition，TMDD)，并通过与Fc的融合，延长体内半衰期。
实施例5FS-0918融合蛋白的体内治疗作用
用小鼠黑色素瘤细胞B16-F10构建C57BL/6小鼠移植瘤模型来评价FS-0918Protein 153和对照品540的体内抗肿瘤活性。每组含7只动物，总共4组，分别为阴性对照组(溶媒PBS组)，IL-15实验组，540实验组，153实验组。当肿瘤体积至100mm2时记为第1天，开始给药。实验组按照15μg/mouse的剂量，在第1天和第5天分别给药一次；腹腔(IP)注射给药。实验期间每两天测定一次动物体重和肿瘤大小。每日观察记录临床症状。根据肿瘤抑制与生长情况，以及动物状态，试验观察至10天。实验结束时，取瘤称重并拍照记录。数据分析时，以时间点为X轴，肿瘤体积为Y轴绘制肿瘤生长曲线。
由于接种的B16F10细胞肿瘤在小鼠体内生长非常快，实验在第10天停止。IL-15蛋白对B16F110肿瘤的生长抑制作用如图9所示。分别在第1天和第5天给药一次后，IL-15对B16F10细胞瘤生长的抑制效果不明显。对应的153与540两个测试组都有非常显著的抑制肿瘤生长的效果。
如图10所示，从肿瘤的大小看，对照溶媒PBS组，IL-15组抑制肿瘤生长不明显，153组和540组都有明显的抑制肿瘤生长效果。而且对比153组与540组，分析组中不同动物肿瘤大小的分布，153组分布非常均匀，每只动物的肿瘤都有相类似的减小，而540组动物之间的差异性非常大，有两只动物的肿瘤减小很多，但有一只动物的肿瘤相对于PBS组没有明显减小；而且当第二次给药后，对照药物540组有一只小鼠死亡。这个结果表明，作为IL-15Superagonist类似物的540，由于过度激活系统的免疫细胞，会产生超强的刺激免疫反应，诱发系统性毒性。而且由于动物之间的差异化及肿瘤的异质性，不同动物之间在治疗效果与毒性上也会产生更大的差别。而153是细胞生物学活性减弱的IL-15分子，与对应的免疫细胞的相互作用是温和的，因此降低了治疗中在系统中对免疫系统的过度激活，产生的毒性就会减弱；而且由于受体介导的Cytokine Sink造成的细胞因子的清除率也相应降低，从而延长了体内半衰期，提高了153在肿瘤组织内的持续性的分布，结果就提高了153的抑制肿瘤生长的疗效，同时降低了因动物之间的差异化及肿瘤的异质性造成的治疗效果在动物之间的差异化。
本发明建立了一种有效调节IL-15活性的方法，并产生了一系列“可调”的IL-15候选药物；与目前的IL-15候选物相比，这些IL-15变体的体外生物学比活较低(相对于野生型IL-15降低10～100倍)，但保持体内100％的最大抗肿瘤的生物活性；经过体外和体内检查细胞因子与受体的相互作用，结合亲和力和对免疫细胞类型的影响，如Teff and NK，啮齿类动物和非人灵长类动物中的探索性毒理评估，从而在这一系列的“活性调节术(Tuner)”的细胞因子中挑选出具有最强的抗肿瘤活性和最小的甚至没有药物毒性的分子作为候选药物，以产生更宽的治疗窗口；本发明的“可调”技术可以应用于所有其他细胞因子，以实现其技术平台输送和临床应用。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (17)

1.一种细胞因子融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为等同二聚体，构成所述融合蛋白的单体为包括IL-15片段、IL-15Rαsushi和CH2—CH3片段的融合多肽。
2.根据权利要求1所述的细胞因子融合蛋白，其特征在于，所述细胞因子融合蛋白的半衰期为30小时以上。
3.根据权利要求1所述的细胞因子融合蛋白，其特征在于，构成所述融合蛋白的单体从N末端至C末端的结构选自以下任一：
IL-15片段—第一连接子—IL-15Rαsushi—第二连接子—CH2—CH3片段；IL-15Rαsushi—第一连接子—IL-15片段—第二连接子—CH2—CH3片段。
4.根据权利要求1所述的细胞因子融合蛋白，其特征在于，所述IL-15片段为：
A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽片段；或
A2)氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列一致性，且具有A1)限定的多肽片段的功能的多肽片段。
5.根据权利要求1所述的细胞因子融合蛋白，其特征在于，所述IL-15Rαsushi结构域为：B1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的多肽片段；或；
2)氨基酸序列与SEQ ID NO.2～3种任一具有90％以上序列一致性，且具有B1)限定的多肽片段的功能的多肽片段。
6.根据权利要求1所述的细胞因子融合蛋白，其特征在于，所述第一连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，和/或，所述第二连接子的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
7.根据权利要求1所述的细胞因子融合蛋白，其特征在于，所述CH2—CH3片段来源于IgG、IgA、IgM、IgE或IgD的抗体重链恒定区；优选的，所述CH2—CH3片段来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；更优选的，所述CH2—CH3片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
8.根据权利要求1所述的细胞因子融合蛋白，其特征在于，所述细胞因子融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8～11任一所示。
9.根据权利要求1所述的细胞因子融合蛋白，其特征在于，构成所述融合蛋白的单体经二硫键连接形成等同二聚体。
10.一种分离的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸编码权利要求1-9任一所述的细胞因子融合蛋白。
11.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求10所述的核苷酸。
12.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求11所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求10所述的核苷酸。
13.权利要求1-9任一所述的细胞因子融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达所述融合蛋白；
(b)分离并纯化(a)所述的细胞因子融合蛋白。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1-9任一所述的细胞因子融合蛋白和药学上可接受的载体与辅料。
15.权利要求1-9任一所述的细胞因子融合蛋白或权利要求14所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
16.权利要求1-9任一所述的细胞因子融合蛋白在制备多功能融合蛋白中的用途，所述多功能融合蛋白能够同时结合IL-2受体β、IL-2受体二聚体βγ以及以下中的任一种或多种靶点：PD-1、PD-L1、VEGF、TGF-β、NKG2D、NKG2A、LAG3、NKp46。
17.权利要求1-9任一所述的细胞因子融合蛋白与肿瘤放疗药物或肿瘤化疗药物或免疫检查点药物联合在制备肿瘤治疗产品中的用途。
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