JPH09176198A - 抗肥満タンパク質モノクローナル抗体及びハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 肥満タンパク質又はその一部を含むポリ
ペプチドを抗原として免疫された哺乳動物の抗体産生細
胞とミエローマ細胞との融合によって得られるハイブリ
ドーマから産生され、肥満タンパク質と特異的に反応す
る抗肥満タンパク質モノクローナル抗体、及び抗肥満タ
ンパク質モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ。 【効果】 本発明により、抗肥満タンパク質モノクロー
ナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗肥満タンパク質
モノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマに関する。

【０００２】

【従来の技術】肥満タンパク質は、脂肪組織で特異的に
発現する分泌タンパク質であり、ｏｂ／ｏｂマウスの肥
満に関連する遺伝子として単離されたＯｂｅｓｅ遺伝子
（ｏｂ遺伝子）の産物である（Y. Zhang et al. Natur
e, Vol.372,p425-432,1994)。Y.Zhang等は、ヒトＤＮＡ
ライブラリーからｏｂ遺伝子をクローニングし、該遺伝
子がコードするアミノ酸配列を報告している。

【０００３】最近の研究では、肥満タンパク質はエネル
ギー代謝、食欲などをコントロールすることより、体重
の調節機能を有する事が明らかにされている（M.A. Pel
leymounter et al. Science,Vol.269, p540-543, 1995;
J.L. Halaas et al. Science, Vol.269, p543-546, 19
95; L.A. Campfield et al. Science, Vol.269, p546-5
49,1995）。また、肥満タンパク質の存在はラットでも
確認され、肥満タンパク質が、動物において食欲の制
限、基礎エネルギー代謝量の増加を制御している事が示
唆されている（T. Murakami and K. Shima, Biochemica
l and Biophysical Research Communications, Vol. 20
9, p944-952,1995）。さらには、ヒトｏｂ遺伝子の発現
はインシュリンにより調節されている事が示唆されてい
る（R. Saladin, Nature, Vol.377,p527-529,1995)。

【０００４】従って、肥満症や糖尿病等の疾患を有する
患者において、生体成分、特に血液（血清）中における
肥満タンパク質の含有量を知る事は、その病態又は予後
を知る上で重要である。

【０００５】ところで、肥満タンパク質の検出法として
は、免疫測定法、例えば、免疫沈降法（M.Maffei et a
l, Nature Medicine, Vol.1, p1155-1161,1995）や、ラ
ジオイムノアッセイ（細田公則ら、日本肥満学会講演要
旨集、p110,1995）が知られている。これらの検出法に
おいては、肥満タンパク質又はその１部分からなるペプ
チドを抗原とし、これを動物（ウサギ、マウス等）に免
疫して得られた抗血清（ポリクローナル抗体）を使用し
ている。

【０００６】しかし、ポリクローナル抗体を用いる方法
では、使用する抗体のロット間格差のために測定結果が
一定しないという問題があった。これは、抗原の調製
法、免疫動物の個体差、免疫方法等によって、その都度
抗体価、特異性、サブクラスの異なる抗体が得られるこ
とが原因となっているためである。免疫測定法により肥
満タンパク質を高精度に再現性よく測定するためには、
該タンパク質に対して高い特異性を有し、かつ安定性の
高い抗体を用いる必要がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、肥満タンパ
ク質に特異的に反応するモノクローナル抗体、及び該モ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを提供する
ことを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、肥満タンパク質により
免疫を施した動物より得た抗体産生細胞と、増殖性の高
い細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）から、肥満タン
パク質に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を
産生するクローンを選択することに成功し、本発明を完
成するに致った。

【０００９】すなわち、本発明は、肥満タンパク質又は
その一部を含むポリペプチドを抗原として免疫された哺
乳動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合によっ
て得られるハイブリドーマから産生され、肥満タンパク
質と特異的に反応する抗肥満タンパク質モノクローナル
抗体である。ここで、肥満タンパク質としては、配列番
号１又は９で表されるアミノ酸配列を実質的に含むもの
が挙げられる。

【００１０】ここで、「実質的に含む」とあるのは、配
列番号１又は９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプ
チドが肥満タンパク質抗原として機能する限り、該アミ
ノ酸配列に欠失、置換、挿入等の変異があってもよいこ
とを意味する。さらに、本発明は、肥満タンパク質又は
その一部を含むポリペプチドを抗原として免疫された哺
乳動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる
ことによって得られ、抗肥満タンパク質モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマである。

【００１１】ここで、免疫される哺乳動物としてはマウ
ス、ウサギ、ラット、ヤギ、ニワトリ等が挙げられ、肥
満タンパク質としてはヒト、マウス又はラット由来のも
のが挙げられる。また、「特異的に反応する」とは、本
発明のモノクローナル抗体は、肥満タンパク質のみを認
識し結合することを意味する。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
モノクローナル抗体を得るためには、該抗体の産生能を
有するハイブリドーマを確立する必要がある。ハイブリ
ドーマの確立法は、１．抗原の調製、２．免疫、３．細
胞融合、４．ハイブリドーマの選択とモノクローン化、
の４工程からなる。

【００１３】１．抗原は、天然型肥満タンパク質又は組
換え型肥満タンパク質のいずれでもよく、更にその部分
配列であってもよい。抗原として天然型肥満タンパク質
を用いる場合、該抗原は、マウス、ラット等の血清、脂
肪細胞等から、通常のタンパク質精製法を使用して精製
することができる。具体的には、硫安塩析法、有機溶媒
沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電
気泳動法等が、単独又は適宜組み合わせて用いられる。

【００１４】抗原として組換え型肥満タンパク質を用い
る場合、該抗原は、遺伝子工学的手法により調製するこ
とができる。すなわち、肥満タンパク質をコードする遺
伝子が挿入された組み換え体ＤＮＡにより宿主細胞を形
質転換あるいは形質導入し、次いで、得られた組み換え
微生物を培養し、培養物から組換え型肥満タンパク質を
精製すればよい。

【００１５】肥満タンパク質遺伝子は、染色体ＤＮＡ又
はｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることによ
り得られる。又、肥満タンパク質のアミノ酸配列に基づ
いて合成されたプライマーを使用し、ＰＣＲ法により該
遺伝子を増幅することも可能である。

【００１６】本発明で用いる抗原は、本発明のモノクロ
ーナル抗体が該タンパク質と特異的に反応できるなら
ば、天然型肥満タンパク質の全長である必要はない。す
なわち、抗原は天然型肥満タンパク質の一部であっても
よい。そのような抗原は、肥満タンパク質遺伝子の一部
を含む遺伝子を発現させることによって得ることができ
る。また、通常のペプチド合成法を用いて、天然型肥満
タンパク質の一部に相当するペプチドを生産することも
可能である。

【００１７】組み換え体ＤＮＡを調製する際に用いるベ
クターＤＮＡとしては、宿主細胞で複製可能なものであ
れば如何なるものでもよく、例えば、プラスミドＤＮ
Ａ、バクテリオファージＤＮＡ等が挙げられる。宿主細
胞が大腸菌である場合は、プラスミドpGEX-2T（ファル
マシア社製）、pUC118（宝酒造社製）等が使用できる。

【００１８】宿主細胞としては、真核細胞及び原核細胞
のいずれをも用いることができる。真核細胞としては動
物、植物、昆虫、酵母等の細胞が、原核細胞としては大
腸菌、枯草菌、放線菌等が挙げられるが、具体的には、
大腸菌XL1-Blue（Stratagene社製）、JM109（宝酒造社
製）等が好適に使用できる。また、抗原は、ヒト由来の
ものであってもよく、マウス、ラット等の非ヒト動物由
来のものであってもよい。

【００１９】２．免疫動物及び免疫 免疫動物は、細胞融合に使用する腫瘍細胞株によって適
宜選択されるが、例えば、マウス、ラット等が使用でき
る。マウスの種類の中でも免疫グロブリンを産生しない
腫瘍細胞株の確立されているBALB/c系統が好ましい。

【００２０】上記抗原を、等張緩衝液又は生理食塩水等
に溶解して、マウスの場合１匹当り１回に10〜300μgを
投与する。免疫は数回に分けて行い、初回免疫はアジュ
バンドと共に投与する。アジュバンドとしては、ミョウ
バン、結核死菌、核酸などが使用できる。免疫は２〜４
週間隔で行ない、最終免疫はアジュバンドを使用せずに
行う。投与方法は、マウスの場合、腹腔、皮下等への投
与が一般的であり、又、静脈内投与を行なうこともでき
る。

【００２１】最終免疫２〜４日後にリンパ節又は脾臓を
摘出して細胞懸濁液を得た後、例えばFicoll（シグマ社
製）を用いた密度勾配遠心分離により脾細胞又はリンパ
球等の抗体産生細胞を調製する。得られた抗体産生細胞
を腫瘍細胞株（ミエローマ細胞株）との融合に供する。
融合に用いる腫瘍細胞株としては、P3X63Ag8U.1(U1)、P
3X63Ag8.653(653)、P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1)、SP2/0-Ag14
(SP2)等が使用できる。

【００２２】３．細胞融合 細胞融合は、例えば、公知の方法（G. Kohler and C. M
ilstein, Nature,256,p495-497, 1975 に記載の方
法）、又はこれに準ずる方法によって行なわれる。細胞
融合は、30〜50％ポリエチレングリコール（平均分子量
1,000〜4,000）を用いて行い、30〜40℃で約１〜３分間
ほど反応させることが好ましい。なお、細胞融合後のハ
イブリドーマの増殖を促進させるために、フィーダ細胞
（例えば、BALB/cマウスの胸腺細胞等）を用いることが
できる。フィーダ細胞を用いない場合は、ヒト・インタ
ーロイキン６等の細胞増殖促進成分を使用することがで
きる。

【００２３】４．スクリーニング 細胞融合によって得られた融合細胞は、定法にしたがっ
て、目的とするモノクローナル抗体を産生するクローン
のスクリーニングに供される。即ち、当該融合細胞を、
例えばマイクロプレート（96穴培養プレート等）中で培
養し、増殖の見られた穴の培養上清中の抗体価を、例え
ば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等によって測定す
る。抗体価が認められた上清中から目的とするモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを得る方法として
は、例えば、ＦＡＣＳ（FluoresentActivated Cell Sor
ter）を用いる方法、Soft Agerを用いてコロニーを拾い
上げる方法、限外稀釈法等が挙げられる。

【００２４】得られたクローンからのモノクローナル抗
体の精製は、定法にしたがって行えばよい。すなわち、
あらかじめプリスタンを投与したBALB/cマウス又はヌー
ドマウスの腹腔内に上記ハイブリドーマを移植し、７〜
14日後に腹水を採取する（腹水中にはモノクローナル抗
体が高濃度に含まれる）。又は、無血清培地（例えばエ
スクロンＳＦーＢ培地；三光純薬社製）中でハイブリド
ーマを順化、増殖させ、培養上清を集める。腹水又は培
養上清からのモノクローナル抗体の回収は、免疫グロブ
リンの精製法として従来から既知の方法、すなわち、硫
安分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール
分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。

【００２５】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明をさら
に具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例
に限定されない。

【００２６】〔実施例１〕抗ヒト肥満タンパク質モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び抗体の作製 １．ヒト肥満タンパク質の作製 組換え型ヒト肥満タンパク質は以下の様に調製した。ま
ず、ヒト fat cDNA library（CLONTECH社製）を鋳型と
し、ヒト肥満タンパク質遺伝子に対応する下記のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ヒト肥
満タンパク質遺伝子を増幅した。プライマーの塩基配列
は、ヒト肥満タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配
列（Y. Zhang et al. Nature, Vol.372,p425-432,199
4）に基づいて決定した。 5'側のプライマー：配列番号３ 3'側のプライマー：配列番号４

【００２７】得られたＰＣＲ産物、すなわちヒト肥満タ
ンパク質遺伝子を制限酵素BamHI及びEcoRIで消化した
後、プラスミドpGEX-2T（ファルマシア社製）のBamHI／
EcoRI部位に挿入し、得られた組み換え体ＤＮＡを用い
て、大腸菌ＤＨ５（ファルマシア社製）を形質転換し
た。形質転換体は、ＩＰＴＧの誘導により、ヒト肥満タ
ンパク質とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼからな
る融合タンパク質を発現する。この融合タンパク質をト
ロンビンで切断、精製することによりヒト肥満タンパク
質を得ることができる。形質転換体による融合タンパク
質の発現及び融合タンパク質からのヒト肥満タンパク質
の回収は、GST Gene Fusion System（ファルマシア社
製）を用いて行った。

【００２８】形質転換体を培養後、100ml の培養液か
ら、約40μgのヒト肥満タンパク質を精製した。培養及
び精製操作を数回繰り返す事により必要とするヒト肥満
タンパク質の量を確保し、抗原として用いた。抗原とし
て用いられたヒト肥満タンパク質のアミノ酸配列を配列
番号１に、該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列
を配列番号２に記載した。

【００２９】配列番号１記載のアミノ酸配列において、
Ｎ末端の２つのアミノ酸（Gly-Ser)は、トロンビンの認
識配列の一部である。又、３番目のバリンからＣ末端ま
でのアミノ酸配列は、公知の天然型ヒト肥満タンパク質
（Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.209,No.3,944-95
2,1995)の22番目のバリンからＣ末端（167 番目のシス
テイン）までの配列に対応する。なお、天然型ヒト肥満
タンパク質では、１番目のメチオニンから21番目のアラ
ニンまでの配列は、シグナルペプチドであると考えられ
ている。

【００３０】２．免疫 上記１．で得られたヒト肥満タンパク質を含むＰＢＳ溶
液（50μg タンパク質/100μl）100μlを、フロイント
の完全アジュバント100μlと共に混合してエマルジョン
とし、これをＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、８週齢）に腹腔
内投与した。初回抗原投与から14日、28日、42日後に同
量の抗原をフロイントの不完全アジュバントと共に腹腔
内投与を行ない追加免疫を施した。初回抗原投与から49
日目（細胞融合の３日前）に、上記のＰＢＳ溶液100μl
をアジュバント無しで腹腔内に投与し、最終免疫を行な
った。

【００３１】３．ミエローマ細胞浮遊液の作製 ハイブリドーマ作成に必要とするマウス由来ミエローマ
細胞SP2/0-Ag14(SP2)を調製した。６−チオグアニン、1
0％牛胎児血清を含むイスコフ培地で数日培養した細胞
を10％牛胎児血清を含むイスコフ培地でさらに数日培養
を続ける。細胞融合の前日に２×10⁵個 /mlに調製し炭
酸ガス培養装置内で培養した。細胞融合当日に細胞を補
集し、エスクロンＣＭ−Ｂ培地（三光純薬製）で洗浄後
細胞数を計測した。ついで50mlの遠沈管にミエローマ２
×10⁷個を20mlのエスクロンＣＭ−Ｂ培地（三光純薬
製）に懸濁した。

【００３２】４．細胞融合 最終免疫より３日後、マウスの脾臓を摘出し、10mlの生
細胞洗浄液（ＣＭ−Ｂ培地）を入れたプラスチック・シ
ャーレ中で脾臓リンパ球を注意深く押し出した（マウス
１匹分）。ほぐされた脾臓リンパ球は、メッシュ濾過後
遠心管に移し、さらに生細胞洗浄液を加え全量50mlと
し、遠心操作（1,600回転、５分）を繰り返し２回洗浄
し、１〜２×10⁸個の脾臓リンパ球を含む浮遊液50mlを
得た。先に準備した６−チオグアニン耐性ミエローマ S
p-2/O-Ag14細胞の浮遊液（２×10⁷個の細胞を含む）と
１×10⁸個の脾臓リンパ球を含む浮遊液を混合し1,600回
転、５分間遠心してペレット化した。上清の培地を吸引
除去し、ペレットを丁寧にほぐした。ＰＥＧ溶液（PEG
40g, PBS(-) 50ml, DMSO 10ml, poly A 溶液(1mg/ml)1m
l, pH7.5)１mlを１分間かけてゆっくりと加え、用いた
ピペットで攪拌しながら37℃、１分間融合させた。続け
てＣＭ−Ｂ培地１mlを37℃で１分間かけて加えた。さら
にもう一度同様の操作を繰り返した後、ＣＭ−Ｂ培地８
mlを37℃で３分間かけて加えた。得られた融合細胞浮遊
液を、96穴培養プレート25枚に１穴当り0.1ml分注し、
炭酸ガス培養装置内で培養を行なった。

【００３３】５．ＨＡＴ選択 培養後１日目に、ＨＡＴ溶液（ヒポキサンチン0.1 mM、
アミノプテリン0.4 μM、チミジン0.016mM)を含むＣＭ
−Ｂ培地を１穴当りさらに0.15ml加え、第３日、６日お
よび10日目に培地の半分を吸引除去し、上記の培地を１
穴当り0.1〜0.15ml加えた。10日目でハイブリドーマの
増殖を確認したところ、ほぼ全穴での増殖が観察され
た。

【００３４】６．ハイブリドーマの選択 細胞融合を行って12〜13日後に培養上清を集め、ＥＬＩ
ＳＡ法を用いて抗ヒト肥満タンパク質モノクローナル抗
体陽性穴の選択を行なった。ＥＬＩＳＡ用96穴プレート
に、１穴あたり0.01〜１μg/mlのヒト肥満タンパク質を
含むＰＢＳ溶液を100μl分注し、４℃で一晩または室温
で１時間放置して抗原をプレートに固定した。プレート
中の液を良く取り除き、培養上清中の蛋白質の非特異的
吸着を避ける為に、２％スキムミルクブロッキング液を
100μl各穴に分注し、37℃で２時間放置した。液を良く
取り除いた後、上記の各細胞培養上清を100μl分注し、
室温で１時間静置した。なお、陰性対照としてはＣＭ−
Ｂ培地を100μl分注した。次に、0.02％のTween20を含
むバッファー液（洗浄液）で３〜５回洗浄し、抗マウス
免疫グロブリン抗体−西洋ワサビパーオキシダーゼ複合
体溶液100μlをプレートに分注し室温１時間放置した。
同上洗浄液で３〜５回洗浄後、ＡＢＴＳ(2,2'-Azino-bi
s(3-etylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid)溶液(0.6mg
/ml)を100μlずつ加え、室温で１時間反応後、酵素反応
停止液（Sodium dodecyl aulfate 5％溶液）を100μl加
え反応を停止させ、O.D.405nmを測定して、パーオキシ
ダーゼ活性を定量した。その結果、全1750穴中、11穴に
抗ヒト肥満タンパク質モノクローナル抗体の産生が認め
られた。

【００３５】７．培養のスケール拡大 抗体陽性穴中のハイブリドーマを、96穴プレートから、
ＨＴ溶液（ヒポキサンチン0.1mM 、チミジン0.016mM ）
を含むＣＭ−Ｂ培地が分注された24穴培養プレートに植
え替え、スケールの拡大を行なった。即ち、予め上記の
培地500μlを24穴培養プレート分注し、それぞれの穴に
96穴培養プレートにおける抗体陽性穴の細胞懸濁液を24
穴培養プレートへ移植し、炭酸ガス培養装置内で培養を
行なった。培養２〜３日後、各穴に、更に１mlの上記の
培地を加え、各穴の上清をＥＬＩＳＡ法に供して抗体活
性を調べた。その結果、10穴中に抗体の産生が認められ
たので、穴中の細胞についてモノクローン化を行った。

【００３６】８．モノクローン化 クローニング培地はＣＭ−Ｂ培地を用いた。抗ヒト肥満
タンパク質抗体産生ハイブリドーマを計数し、クローニ
ング培地１ml当りに５個の細胞が含まれるように稀釈し
た。この懸濁液を200μlずつ96穴培養プレートに分注
し、炭酸ガス培養装置内で培養を行なった。約10日目に
増殖をチェックしながら、ＥＬＩＳＡ法により上清の抗
体活性を測定した。コロニーが大きく抗体活性の高い穴
を２穴選択し、穴中の細胞について、上記の方法で再ク
ローニングを行なった。その結果、抗ヒト肥満タンパク
質抗体産生ハイブリドーマのクローン ＡＯ１２、ＡＯ
２６、ＡＯ３６、ＡＯ４２３、ＡＯ５１８、ＡＯ９９及
び、ＡＯ７１９の７株を得た。これらハイブリドーマの
うち、ハイブリドーマＡ５１８は、工業技術院生命工学
工業技術研究所に、FERM P-15373として寄託されてい
る。

【００３７】９．モノクローナル抗体の生産 上記で得られた７株のハイブリドーマクローンの培養細
胞を、それぞれ１×10⁷個でハイブリドーマ増殖培地１m
lに浮遊させ、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（８週齢、
雌）の腹腔内に投与し、約１週後、腹水を回収した。

【００３８】10. モノクローナル抗体のクラスの決定 各ハイブリドーマクローンの産生する免疫グロブリンの
クラスは、マウスモノクローナル抗体のアイソタイプ決
定用キット（アマシャム・ジャパン製、ＲＰＮ29／ウエ
スタン・ブロット法）を用いて行なった。その結果、７
株ともＩｇＭで共にＬ鎖がκであった。

【００３９】11. モノクローナル抗体の精製 「単クローン抗体実験操作入門」（安東民衛、千葉丈
著、講談社）に記載の方法に従い、回収した腹水を、硫
安塩析法及びハイドロキシアパタイトカラムを用いたＨ
ＰＬＣ法に供し、モノクローナル抗体を精製した。

【００４０】〔実施例２〕抗マウス肥満タンパク質モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び抗体の作
成 １．マウス肥満タンパク質の作製 組換え型マウス肥満タンパク質を以下の手法により調製
した。 まず、マウスfat cDNA library（CLONTECH社
製）を鋳型とし、マウス肥満タンパク質遺伝子に対応す
る下記のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ
を行い、マウス肥満タンパク質遺伝子を増幅した。プラ
イマーの塩基配列は以下の通りである。 5'側のプライマー：配列番号５ 3'側のプライマー：配列番号６

【００４１】得られたＰＣＲ産物を、TA cloning kit
(Invitrogen社) を用いてJM109 にサブクローニング
し、プラスミドＤＮＡを調製した。次に、該ＤＮＡを下
記のプライマーを用いてＰＣＲを行った。 5'側のプライマー：配列番号７ 3'側のプライマー：配列番号８

【００４２】得られたＰＣＲ産物を制限酵素BamHI及びE
coRIで消化した後、プラスミドpGEX-2T（ファルマシア
社製）のBamHI／EcoRI部位に挿入し、得られた組み換え
体ＤＮＡを用いて、大腸菌ＤＨ５（ファルマシア社製）
を形質転換した。形質転換体は、ＩＰＴＧの誘導によ
り、マウス肥満タンパク質とグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼからなる融合タンパク質を発現する。この融
合タンパク質をトロンビンで切断、精製することにより
マウス肥満タンパク質を得ることができる。

【００４３】形質転換体による融合タンパク質の発現及
び融合タンパク質からのマウス肥満タンパク質の回収
は、GST Gene Fusion System（ファルマシア社製）を用
いて行った。形質転換体を培養後、100mlの培養液から
約100μgのマウス肥満タンパク質グルタチオントランス
フェラーゼ融合タンパク質を得た。この融合タンパク質
をトロンビンで切断、精製し約40μg のマウス肥満タン
パク質を得た。

【００４４】この培養と精製を数回繰り返す事により必
要とするマウス肥満タンパク質の量を確保した。なお、
抗原として用いられたマウス肥満タンパク質のアミノ酸
配列を配列番号９に、マウス肥満タンパク質ｃＤＮＡの
塩基配列を配列番号10に記載した。

【００４５】配列番号９記載のアミノ酸配列において、
Ｎ末端の２つのアミノ酸（Gly-Ser)は、トロンビンの認
識配列の一部である。３番目のバリンからＣ末端までの
アミノ酸配列は、公知の天然型マウス肥満タンパク質
（Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.209,No.3,944-95
2,1995)の22番目のバリンからＣ末端（167 番目のシス
テイン）までの配列に対応する。なお、天然型マウス肥
満タンパク質では、１番目のメチオニンから21番目のア
ラニンまでの配列は、シグナルペプチドであると考えら
れている。

【００４６】２．免疫 マウス肥満タンパク質を含むＰＢＳ溶液（50μg タンパ
ク質/100μl）100μlを、フロイントの完全アジュバン
ト100μlと混合してエマルジョンとし、それをｏｂ／ｏ
ｂマウス（雌、８週齢）に腹腔内投与した。初回抗原投
与から14日、28日、42日後に同量の抗原をフロイントの
不完全アジュバントと共に腹腔内投与し、追加免疫を施
した。さらに初回抗原投与から49日目（細胞融合の３日
前）に、上記のＰＢＳ溶液100μlをアジュバント無しで
腹腔内に投与し、最終免疫を行なった。

【００４７】以下、実施例１と同様の方法により行い、
抗マウス肥満タンパク質モノクローナル抗体及びそれを
産生するハイブリドーマＡＭＯ−４、ＡＭＯ−13及びＡ
ＭＯ−14を得た。また、実施例１と同様にモノクローナ
ル抗体のクラスの決定を行った結果、各ハイブリドーマ
クローンの産生する免疫グロブリンのクラスはＩｇＭで
あり、Ｌ鎖がκであった。なお、ハイブリドーマＡＭＯ
−14株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P
-15372として寄託されている。

【００４８】〔実施例３〕交差反応性試験 ＥＬＩＳＡ法を用いて、抗ヒト肥満タンパク質モノクロ
ーナル抗体の、マウス肥満タンパク質に対する交差反応
性を調べた。なお、ヒト肥満タンパク質とマウス肥満タ
ンパク質とは、アミノ酸配列上約80％のホモロジーを有
する。

【００４９】測定方法は、実施例１の６. に記載されて
いるハイブリドーマ選択法に準じて行なった。すなわ
ち、ＥＬＩＳＡ用96穴プレートの各穴に、マウス又はヒ
トの肥満タンパク質（抗原）を含むＰＢＳ溶液（0.05μ
ｇタンパク質／ｍｌ）を100μlづつ分注し、４℃で一晩
放置して抗原をプレートに固定した。ＰＢＳ液を良く取
り除いた後、培養上清中の蛋白質の非特異的吸着を避け
る為に、ブロッキング液（２％スキムミルク）を100μl
各穴に分注し、37℃で２時間放置した。ブロッキング液
を良く取り除いた後、ＡＯ１２、ＡＯ４２３、ＡＯ５１
８株の培養上清の原液及び希釈液（４段階）を100μlづ
つ分注し、室温で１時間静置した。プレートに固定され
たモノクローナル抗体は、抗マウス免疫グロブリン−西
洋ワサビパーオキシダーゼ複合体を用いて検出した。な
お、陰性対照としてはＣＭ−Ｂ培地を100 μl分注し交
差性の検討を行なった。

【００５０】その結果、試験に用いた全ての抗ヒト肥満
タンパク質モノクローナル抗体（ＡＯ１２、ＡＯ４２３
及びＡＯ５１８により産生されたもの）は、ヒト肥満タ
ンパク質の類似タンパク質であるマウス肥満タンパク質
との交差反応性を示した（図１）。図１において、白ヌ
キのバーはヒト肥満タンパク質を抗原として、斜線を施
したバーはマウス肥満タンパク質を抗原として、それぞ
れ抗ヒト肥満タンパク質モノクローナル抗体と反応させ
たときの結果を示す。

【００５１】図１より、各ハイブリドーマから産生され
たモノクローナル抗体のマウス肥満タンパク質に対する
反応性は、ヒト肥満タンパク質に対する反応性と同等で
あり、抗ヒト肥満タンパク質モノクローナル抗体は、マ
ウス肥満タンパク質の検出等にも利用可能であることが
わかった。

【００５２】また、上記と同様に抗マウス肥満タンパク
質モノクローナル抗体の、ヒト肥満タンパク質に対する
交差反応性についても調べた。すなわち、抗原としてヒ
ト及びマウスの肥満タンパク質を用いてそれぞれの抗原
の抗マウス肥満タンパク質モノクローナル抗体に対する
結合性について検討した。

【００５３】その結果、抗マウス肥満タンパク質モノク
ローナル抗体（ＡＭＯ−14により産生されたもの）もま
た、ヒト肥満タンパク質との交差反応性を示した（図
２）。なお、図中の白ヌキのバー及び斜線を施したバー
は前記と同様である。

【００５４】〔実施例４〕抗ヒト肥満タンパク質モノク
ローナル抗体の特異性試験 ウエスタンブロット法を用いて、抗ヒト肥満タンパク質
モノクローナル抗体（ＡＯ５１８により産生されたも
の）の特異性を調べた。すなわち、抗原として用いたヒ
ト肥満タンパク質及び各種分子量マーカーをSDS-PAGEに
供した後、ニトロセルロース膜に転写し、その膜を抗ヒ
ト肥満タンパク質モノクローナル抗体と反応させた。次
いで、膜上のタンパク質に結合したモノクローナル抗体
を、抗マウス免疫グロブリン抗体−西洋ワサビパーオキ
シダーゼ複合体を用いて検出した。結果を図３に示す。
レーン１及び４は分子量マーカー（ホスホリラーゼ(11
2.0kDa)、ウシ血清アルブミン(84.0kDa) 、卵白アルブ
ミン(53.2kDa) 、炭酸脱水酵素(34.9kDa) 、大豆トリプ
シンインヒビター(28.7kDa) 及びリソチーム(20.5kDa)
並びにβ- ガラクトシダーゼ(120.0kDa)、ウシ血清アル
ブミン(87.0kDa) 及び卵白アルブミン(48.1kDa))であ
る。また、レーン２及び３は、それぞれヒト肥満タンパ
ク質2.5 μg、５μgを電気泳動したレーンである。ヒト
肥満タンパク質のバンド（レーン２及び３）のみがパー
オキシダーゼによる発色を示したことから、本発明の抗
ヒト肥満タンパク質モノクローナル抗体は、ヒト肥満タ
ンパク質のみを認識し（すなわち、各種の分子量マーカ
ーへの結合は認められない）、ヒト肥満タンパク質に対
して高い特異性を有することがわかった。

【００５５】マウス肥満タンパク質に対するモノクロー
ナル抗体（ＡＭＯ−14から産生されるもの）の特異性に
ついても、前記と同様に調べた。その結果、本発明の抗
マウス肥満タンパク質モノクローナル抗体は、マウス肥
満タンパク質のみを認識し（すなわち、各種の分子量マ
ーカーへの結合は認められない）、マウス肥満タンパク
質に対して高い特異性を有することがわかった。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、抗肥満タンパク質モノク
ローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマが提供される。本発明によれば、ポリクロ
ーナル抗体を利用する際に問題となっていた、動物の個
体差、免疫法の差等に起因する抗体のロット間格差がな
いので、常に安定した品質の抗体を提供することができ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、
肥満タンパク質を高精度かつ再現性よく定量することが
できる。

【００５７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１４８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Ser Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile 1 5 10 15 Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val 20 25 30 Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His 35 40 45 Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln 50 55 60 Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn 65 70 75 80 Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 85 90 95 Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu 100 105 110 Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 115 120 125 Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu 130 135 140 Ser Pro Gly Cys 145

【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：４４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GGA TCC GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC 48 Gly Ser Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile 1 5 10 15 AAG ACA ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG CAG TCA GTC 96 Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val 20 25 30 TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC CAC 144 Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His 35 40 45 CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC CAA 192 Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln 50 55 60 CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC AAC 240 Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn 65 70 75 80 GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT AAG 288 Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 85 90 95 AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC CTG 336 Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu 100 105 110 GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC CTG 384 Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 115 120 125 AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC CTC 432 Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu 130 135 140 AGC CCT GGG TGC 444 Ser Pro Gly Cys １４５

【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTCGGATCCG TGCCCATCCA AAA

【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTCGAATTCT CAGCACCCAG GGC

【００６１】配列番号：５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAGGAAATGT GCTGGAGAG

【００６２】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAAACTTCAG CATTCAGGGC

【００６３】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTCGGATCCG TGCCTATCCA GAA

【００６４】配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAGGAAACAG CTATGAC

【００６５】配列番号：９ 配列の長さ：１４８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Ser Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile 1 5 10 15 Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val 20 25 30 Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His 35 40 45 Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln 50 55 60 Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn 65 70 75 80 Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys 85 90 95 Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu 100 105 110 Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 115 120 125 Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val 130 135 140 Ser Pro Glu Cys 145

【００６６】配列番号：１０ 配列の長さ：４４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GGA TCC GTG CCT ATC CAG AAA GTC CAG GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC 48 Gly Ser Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile 1 5 10 15 AAG ACC ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG CAG TCG GTA 96 Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val 20 25 30 TCC GCC AAG CAG AGG GTC ACT GGC TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTT CAC 144 Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His 35 40 45 CCC ATT CTG AGT TTG TCC AAG ATG GAC CAG ACT CTG GCA GTC TAT CAA 192 Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln 50 55 60 CAG GTC CTC ACC AGC CTG CCT TCC CAA AAT GTG CTG CAG ATA GCC AAT 240 Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn 65 70 75 80 GAC CTG GAG AAT CTC CGA GAC CTC CTC CAT CTG CTG GCC TTC TCC AAG 288 Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys 85 90 95 AGC TGC TCC CTG CCT CAG ACC AGT GGC CTG CAG AAG CCA GAG AGC CTG 336 Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu 100 105 110 GAT GGC GTC CTG GAA GCC TCA CTC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCT TTG 384 Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 115 120 125 AGC AGG CTG CAG GGC TCT CTG CAG GAC ATT CTT CAA CAG TTG GAT GTT 432 Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val 130 135 140 AGC CCT GAA TGC 444 Ser Pro Glu Cys 145

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト肥満タンパク質モノクローナル抗体の交差
反応性を示す図である。

【図２】マウス肥満タンパク質モノクローナル抗体の交
差反応性を示す図である。

【図３】ウエスタンブロットの結果を示す電気泳動の写
真である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 戸辺 一之 東京都文京区本郷７−３−１ 東京大学医 学部第三内科第一研究室内 (72)発明者 門脇 孝 東京都文京区本郷７−３−１ 東京大学医 学部第三内科第一研究室内 (72)発明者 福田 賢 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 菊地 護 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 肥満タンパク質又はその一部を含むポリ
   ペプチドを抗原として免疫された哺乳動物の抗体産生細
   胞とミエローマ細胞との融合によって得られるハイブリ
   ドーマから産生され、肥満タンパク質と特異的に反応す
   る抗肥満タンパク質モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 哺乳動物がマウス、ウサギ、ラット、ヤ
   ギ又はニワトリである請求項１記載の抗肥満タンパク質
   モノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 肥満タンパク質がヒト、マウス又はラッ
   ト由来のものである請求項１記載の抗肥満タンパク質モ
   ノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 肥満タンパク質が配列番号１又は９で表
   されるアミノ酸配列を実質的に含むものである請求項１
   記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 肥満タンパク質又はその一部を含むポリ
   ペプチドを抗原として免疫された哺乳動物の抗体産生細
   胞とミエローマ細胞とを融合させることによって得ら
   れ、抗肥満タンパク質モノクローナル抗体を産生するハ
   イブリドーマ。
6. 【請求項６】 哺乳動物がマウス、ウサギ、ラット、ヤ
   ギ又はニワトリである請求項５記載のハイブリドーマ。
7. 【請求項７】 肥満タンパク質がヒト、マウス又はラッ
   ト由来のものである請求項５記載のハイブリドーマ。