CZ2003169A3 - Proteinový komplex jako vehikulum pro orálně použitelné léčivo - Google Patents

Proteinový komplex jako vehikulum pro orálně použitelné léčivo Download PDF

Info

Publication number
CZ2003169A3
CZ2003169A3 CZ2003169A CZ2003169A CZ2003169A3 CZ 2003169 A3 CZ2003169 A3 CZ 2003169A3 CZ 2003169 A CZ2003169 A CZ 2003169A CZ 2003169 A CZ2003169 A CZ 2003169A CZ 2003169 A3 CZ2003169 A3 CZ 2003169A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
complex
protein
molecular weight
proteins
polypeptide
Prior art date
Application number
CZ2003169A
Other languages
English (en)
Inventor
Hans Bigalke
Jürgen FREVERT
Original Assignee
Biotecon Gesellschaft Für Biotechnologische Entwic
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotecon Gesellschaft Für Biotechnologische Entwic filed Critical Biotecon Gesellschaft Für Biotechnologische Entwic
Publication of CZ2003169A3 publication Critical patent/CZ2003169A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Proteinový komplex jako vehikulum pro.orálně, použitelné léčivo
Oblast techniky
Vynález se týká proteinového komplexu, který zahrnuje jeden nebo více proteinových komplexů nebo derivátů z Clostridium botulinum typu A, B, Cx, C2, D, E, F nebo G a zvolený polypeptid nebo nízkomólekulové léčivo.
Dosavadní stav techniky . . ' ' ' S. ' /
Díky úspěchům biotechnologických způsobů jsou vyvinuta četná vysoce účinná léčiva, které obsahují jako účinné látky např. proteiny. Vedle rekbmbinanthího insulinu patří k tomu také vyšší molekulové proteiny, např. růstové faktory, interleukihy a monoklonální antigeny. Některá z těchto léčiv, např. erythropoetin (EPO), patří k léčivům zvyšující, účinek. Počet proteinových léčiv -také kvůli poznatkům z úplného sekvéncování humánního genomu-^ se v budoucnu ještě zvýší. Všechna tato nová léčiva mají podstatnou nevýhodu Oproti nízkomolekulárním léčivům: orálně se neresorbují. Vylíčené nevýhody platí pro očkovací látky pro aktivní imunisací, např. tetanustoxoid.
Převažující počet pízkomolekulárhích účinných, látek nelze orálně podávat. Substance procházejí trávicí mukosou a dostávají se do krevního oběhu, jsou proto systemicky použitelné' a krevním systémem dosahují místo jejich účinku. Této cestě je bráněno proteinovým léčivům, účinným látkám ‘ . labilním v kyselém prostředí.a účinným látkám s nepříznivým nábojem. Řada.mechanismů znemožňuje resorpci proteinů. Právě v žaludku kvůli nízkým hodnotám pH dochází k .deňaturaci φ· φ « φ ·. φφφφφφ • φ φφ φ'· φ· φ ' · · · • · · ♦..'φφφφ φ, ' · φ φ · · φ · · · .φφ φ φ φ· Φ·, φφ ’ ·* ··· ··· ···· ··. ·· · mnoha proteinů a ke ztrátě jejich biologické aktivity. Dále se proteiny rozkládají četnými pankreatickými proteasami (mimo jiné trypsin, chymotrypSin, pepsinj na jejich resorbovatelné podíly aminokyselin. Ale i když protein překoná proteolytické působení a bez újmy by prošel v tenkém střevě,' nemohl by se· dále resorbovat, nebot střevní stěna je pro vysokomolekulární látky nepropustná, ' jinak, by· se tělo zaplavilo antigeny, Je kromě toho mnoho farmaceuticky účinných látek, které se kvůli nepříznivému náboji popř. hydrofobicitě neresorbují.
Z těchto důvodů jsou orálně podávateiná proteinová léčiva nebo proteinové očkovací látky a určitá nízkomolekulbvá farmaka neúčinná. Musejí být aplikovány injekčně nebo např.
dosahují místa účinku nasální aplikací.
/ · \· ’
Řada výzkumů se tímto zabývala, aby byly překonány uvedené bariéry. Aby se ochránily proteiny nebo určité nízkomolekulární léčiva před inaktivací a degradací ’’·... v zažívacím traktu, mohou sě zabalit do kapslí rezistentních v žaludku, které se rozpouštějí v tenkém střevě a uvolňují léčivý protein nebo nízkomolekulární. léčivo. Tento způsob naráží na to,· že se sice nedegraduje protein nebo nízkomolekulární léčivo, ale nemohou procházet střevní stěnou. Další výzkumy zkoušejí použít'systém s, nosičem, který slouží aktivnímu transportu látek střevní mukosou, např. Systém s nosičem'vitaminu B. Tyto.způsoby nejsou sami o sobě úspěšné, nýbrž právě vyžadují, aby se proteiny a v labilní nízkomolekulová léčiva nejprve chránily.
Proto si tento vynález klade za úlohu připravit prostředek, s požadovaným polypeptidem a nízkomolekulárním léčivem, který lze podávat orálně. ' .
Podstata vynálezu
Úloha je řešena předmětem definovaným v.patentových nárocích.
Předmětný vynález je vysvětlen následujícím obrázkem.
Obrázek 1 ukazuje schématicky výsledek SDS-polyakrylamid gelové ělektroforézy (12 %) proteinového komplexu podle vynálezu s toxinem tetanu. .
Zde používaný výraz „proteinový; komplex,, označuje vehikulum, kterým mohou být transportovány další zvolené polypeptidy nebo nízkomolekulární léčiva do lidského a zvířecího krevního systému. Proteinový komplex sestává při tom z nejméně jednoho hemagglutininu a eventuelně netoxického, nehemagglutinujícího proteinu (NTHT) komplexu botulinum\toxinu z alespoň jedné Cl os tridiumbotulinum typu A, B, Cx, C2, D, E, F nebo G.
Zde používaný termín „komplex botulinum-toxin,, znamená proteinový komplex pocházející z přírody typu A, B, Cx, C2,
D, E, F nebo G z Clostridium boťulinum,,zahrnující botulinový toxin, hemagglutinin a netoxický, nehemagglutinující protein (NTHT).
Zde používaný výraz „polypeptid,, nebo „zvolený polypeptid,, znamená peptid z alespoň dvou aminokyselin. Polypeptid může. být lineární, kruhový nebo rozvětvený. Dále může polypeptid obsahovat více než jeden řetězec aminokyselin, kde řetězce mohou být spojeny dohromady např. disulfidovou vazbou. Polypeptidy mohou dále obsahovat modifikované aminokyseliny a obvyklé posttranslační modifikace jako glykosilace.
• · ·· φ · . φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φφ
Polypeptidy mohou být farmakológicky nebo imunologicky aktivní polypeptidy nebo polypěptidy používané pro diagnostické účely, např'. protilátky nebo ligandy·.
Bakterie z rodu Clostridium botulinum nalezly v průběhu evoluce cestu, jak propouštět přes trávicí trakt intaktní protein - Clostridium botulinum toxin - do krevního oběhu savců.
Clostridium botulinum se rozdělují do 8 sérových, skupin, 'které se rozlišují na základě jejich toxinu: typ typu A, B,
Ct, C2, D, E, F, G. U toxinů, které se následně nazývají také botulinové toxiný, se jedná o proteiny s molekulovou hmotností 150 000 Dalton (Da),. Botulinový toxin se přijímá obyčejně kontaminovanými potravinami, enterálně se resorbuje a dosahuje svého místa působení, motorické.koncové desky, kde se přenáší nervový.impuls na svaly. Toxiny se přijímají nervovou buňkou a způsobují v nervových zakončeních sekrečního mechanismu acetylcholinu ztuhlost, takže . postižený.sval se již neaktivuje a ochabuje.
Botulinový toxin se však necernuje z Clostridiumbotulinum v holé formě, nýbrž se získává vě formě komplexu botulintoxin, t j . Clostridie produkují vedle botulinového toxinu další .různé proteiny, které toxin naváží do komplexu o molekulové hmotnosti 700 000 až 900 000 Dalton. Různými pokusy bylo prokázáno, že tvorba komplexu'botulin - toxin je potřebná pro orální toxicitu botulinového komplexu. Tak by mohlo být ukázáno, že botulinový toxin, který je ve formě komplexu botulin- toxin, má 100 000 x vyšší toxicitu než čistí botulinový toxin. Možná k tomu slouží hemagglutininy, hromadit komplex na střevní stěně, aby byl umožněn transport
β· ···· • · · • · · · • · * · · · · · ·· «.· střevní mukosou do krevního oběhu. Proto má komplex sloužit jako ochrana před proteášami v,zažívacím traktu.
U dalších proteinů (komplexních proteinů) se jedná o řadu hemagglitininů a netoxický, nehemagglutinující protein (NTHT),. který má molekulovou hmotnost 120 000 Da.. U komplexu, botulin-toxin typu A byly popsány následující hemagglutininy: Ha2 s 16 900 Da, Ha3 s. 21 000 Da, Ha3b s 52 000 Da a Hal s 35 000 Da.
. Komplexy dalších typů.toxinů B až G jsou tvořeny podle podobného schématu. Jako příklad by mohl být uveden komplex typu B. Vedle NTHT jsou zde popsány Ha-70 s molekulovou hmotností 70 000 Da, Ha-17 s molekulovou.hmotností 17 000 : Da a Ha-33 s molekulovou hmotností Da (srovnej s Bhandari,
M. et „al. (1997) Current Micribiology 35-, str. 207-214).
Dále popsali East, A.K. et al ((1994) Systém Appl.
Microbíol. 17 306-312) sekvenci Ha-33 typu B ve srovnání se sekvencí typu A a C. Pro typ C a typ D jsou popsány vedle Ha-33 (aHa-í) \s. molekulovou hmotností.,33 000 Da právě analogicky typ A - Ha3b s 53 000 Day a Ha3a s 22 000 až .24 000 Da a Ha2 s 17 000 Da (srovnej Inoue, K. et al; (1999) Mocrobiology 145, str. 2533-2542) .
Vytvořené komplexy máji však každý podle svého typu séra rozdílné složení, tj. do komplexu je integrován rozdílný počet hemagglutininů popř. NTHT. Pro komplex typu A mají vypočtené následující složení např. Inoue et al. ((1996) .
Infection and.Immunity 64 (5) , str. 1589-1594) :
• · · ·
• «* • · · ····..
... Protein Molární poměr
Toxin 1
Ha-35 (=Hal) 7,76
Ha-15 (=Ha2) 2,71
Ha-19 (=Ha3a) 3,4
Ha-52 (=Ha3b) 2,24
NTHT 1,41
Jedním aspektem tohoto vynálezu je proto příprava proteinového komplexu, který zahrnuje, jeden nebo více komplexních proteinů nebo jejich derivátů alespoň.jednoho z typů A, B, C./, C2, D, E, F nebo G Clostridium botulinum. Proteinový komplex obsahuje dále jeden zvolený polypeptid nebo jedno nízkomolekulární léčivo, které se chrání podle vynálezu proteinovým komplexem při orálním podávánípřed degradací proteasami nebo kyselinami v zažívacím traktu popř.’ se stává pomocí komplexního proteinu použitelným pro systemické podávání. Zvolený polypeptid může být farmakologicky aktivní, imunologicky aktivní nebo pólypeptid používaný pro diagnostické účely. Zvoleně nízkomolekulové léčivo může být právě tak farmakologicky aktivní, imunologicky aktivní nebo léčivo používané pro diagnostické účely nebo libovolné léčivo. Proteinový komplex podle vynálezu slouží proto jako transportní vehikuium, kterým se přivádí .-zvolené polypeptidy a nízkomolekulová léčiva do oběhového systému živočichů, zvláště savců nebo ptáků, zvláště výhodně lidského a tím se transportuje.k místu účinku. Dalším aspektem tohoto vynálezu je tedy příprava proteinového komplexu jako terapeutického prostředku, očkovací látky nebo diagnostika v humánní a/nebo veterinární ·· 4 444 «44 ·· · · 4 4 .··’·.-· * · · · • '•4 '-4444··
-, 4 » · 4 4 4 4 4 / 4 4 4 44 ·4· 44 4 4 4· .44 medicíně. Další aspekt tohoto vynálezu tkví v použití proteinového komplexu, který zahrnuje jeden nebo více komplexních proteinů alespoň jednoho z typů A, B, C1( C2, D,
E, F nebo G Clostridium botulinum jako transportní vehikulum pro farmakologicky aktivní polypeptidy nebo nízkomolekúlové látky (léčiva), imunologicky aktivní polypeptidy nebo nízkomolekúlové látky (léčiva) nebo polypeptidy nebo nízkomolekúlové látky (léčiva nebo diagnostika) pro diagnostické účely. . .
Proteinový komplex je vytvořen hěmagglutininern a NTHT a může při tom odpovídat komplexům typů A, B, Clf C2, D, E, F nebo G-z Clostridium botulinum, které pocházejí z přírody.. Proteinový komplex může však také obsahovat jiné než své přírodní složení, např. může být zbudován pouze z hemagglutininu bez proteinu NTHT. Dále může být proteinový komplex zbudován z méně. druhů hemagglutininů než komplexy pocházející z přírody, s výhodou ze třech různých druhů hemagglutininů, s výhodou ze dvou, zvláště s výhodou -z jednoho druhu hemagglutininu, přičemž proteinový komplex může obsahovat NTHT-protein riebo ne. Proteinový komplex může být dále zbudován z jedné směsi jednoho nebo více druhů hemagglutininů a/nebo ŇTHT-proteinů různých typů séra.. Výhodně jsou proteinové komplexy, které odpovídají proteinovým komplexům typů A, B, C1, C2, D, E, F nebo G z Clostridium botulinum, které pocházejí z přírody, například proteinový komplex s Hal., Ha2, Ha3a, Ha3b a NTHT z Clostridium botulinum typu.B. Proteinový komplex může být kromě.toho složen z Hal, Ha2, Ha3a a NTHT, z Hal, Ha2, Ha3b a. NTHT, jakož i z Hal a Ha3a, Ha3b a NTHT, dále z Ha2, Ha3a, Ha3b a NTHT, z Hal, Ha2 a NTHT, z Hal, Ha3a a NTHT, z Hal, Ha3b a NTHT, z Ha2, Ha3a a NTHT, z Ha2, Ha3b a NTHT z Ha3a,
· 9 ' 99 99 9999 ‘ * 9 '.9 9 9 9.' *
9 9 9 9
9.9 9 9 9 9 9
9 » 9 9 9
9999999 99 . 99
Ha3b a NTHT nebo z dalších libovolných kombinací uvedených komplexních proteinů. Proteinový komplex může být dále. složen z jednoho z hemagglutininu a NTHT, kromě toho lze proteinový komplex formulovat uvedenými kombinacemi hemagglutininu bez NTHT. Odpovídající příkladům proteinového komplexu typu B jsou dále výhodně proteinové komplexy z hemagglitininů a/nebo NTHT typů A, Clf C2, D, E, F nebo G.
Dále výhodné jsou podle vynálezu proteinově komplexy, kde jsou spojeny jeden nebo více kotnplexních proteinů chemickou vazbou se zvoleným polypeptidem nebo s nízkomolekulovými léčivy. Tato vazba by mohla být.štěpena po.resorpci v krvi, tak že polypeptid nebo. nízkomolekulové léčivo pák by mohly dosáhnout ke svému rnístu účinku. Zvolený polypeptid nebo nízkomolekulové léčivo lze spojit vazbou mezi řetězci (cross-linking agent) na komplexním proteinu. Výhodnými prostředky pro vazbu mezi řetězci jsou např. N-(4azidfenylthio)ftalamid,. 4,4'-dithiobis-fehylazid, dithiobispropionimidat, 3,3'dithiobis(sulphosuccinimidpropionat) ,. ethyl-4-azidfenyl-l,4-dithiopropionat, Nsulfosukcihidyl-(4-azidfenyl)-l,3ý-dithiopřopionat, sulfosukcinidyl-2-(p-azids,álicylamin)-ethyl-1,3/- . dithiopropionať, N-sukcinimid-3-(2-pyridyldithio)propionat nebo bis(2-(sukcinimidyloxykarbonylóxy)-ethyl)sulfon.
Výhodný je jednotlivý komplexní protein, který je spojen chemickou vazbou se zvoleným polypeptidem nebo nízkomolekulovým léčivem.
Další aspekt tohoto vynálezu tkví v přípravě způsobu výroby proteinového, komplexu podle vynálezu, který zahrnuje kroky:
• ·· ·· ···· «· · .* · · · • . · · · · • ♦ · .· · · • « · · · * ···*·*· ·· . «· . 9 ' · ·
a) oddělená izolace alespoň jednoho komplexu botulinum-toxin typu A, C,, C2, D, E, F nebo G z Clostridium botulinum při hodnotě pH 2,0 až 6,5, bj zvýšení hodnoty pH ha 7,0 až.IQ,0.
c) Oddělení každého botulinum-toxinu z komplexních proteinů pomocí chromatografického způsobu,
d) Smícháni komplexního proteinu získaného v kroku c) se zvoleným polypeptidem nebo nízkomolekulovým léčivem, nebo
d)oddělení komplexního proteinu získaného v kroku o) a;
smíchání alespoň jednoho komplexního proteinu se zvoleným polypeptidem nebo nízkomolekulovým léčivem, a
f) dialýza směsi z kroku d) nebo d)'proti pufru při hodnotě pH 2,0 až 6,5, a popřípadě
g) spojení komplexního proteinu se zvoleným polypeptidem nebo nízkomolekulovým léčivem chemickou vazbou.
Výhodný je způsob, kde smíchané alespoň dva komplexní proteiny v kroku d) nebo d)' pocházejí z jednoho nebo z různých typů komplexů botulinum-toxin.
Komplexní proteiny mohou být izolovány z přírodních komplexů botulinum-toxin. Například·způsob izolace je. následující: Nejprve se izoluje komplex botulinum-toxin z Clostridií při hodnotě kyselého pH, s výhodou Ph 2,0 až pH 6,5, zvláště s výhodou pH 4,0 až 6,5, obzvláště s výhodou pH 6. Po zvýšení hodnoty pH na 7,0 až 10,0, s výhodou na pH 7,0'až 8,0 se botulinový toxih oddělí chromatografickým způsobem. Tento způsob je proveditelný, neboť, komplex je stabilní při hodnotách pH < 6,5, při neutrálním popř. alkalickém pH Se rozpadá a uvolňuje se toxin. Komplexní proteiny bez toxinu mohou být pak doplněny jiným pólypeptidem vhodným pro orální podávání a hodnota pH se pak snižuje dialýzou proti púfru., • » · · « · ♦ · · · • · · • · ·. · ·· '·· ·♦ · · ·♦
-·'····· ·· · ♦ • · · · · .·»'·*···.♦ Λ · · · · · který je obvyklý v chemii proteinů, zvláště výhodně proti fosfátovému, acetátovému nebo citátovému pufru na pH 2,0 až 6,5, s výhodou 4,0 až 6,0, zvláště s výhodou na pH 5,5..Při tem se tvoří nový komplex, který zaručuje orální biologickou dostupnost navázaného polypeptidů.
jiné v chemii proteinů obvyklé chromatografické způsoby, způsoby koncentrování a srážení lze rovněž použít pro izolaci komplexních proteinů. ,
Komplexní proteiny lze připravit na základě jejich známé sekvence DNA také rekombinantně pomocí DNA rekombinantních technik ve speciálních mateřských organismech., Takto připravené komplexní proteiny mohou mít další modifikace, tj. mohou být deriváty komplexních, proteinů. Modifikace znamenají při tom nejen eliminací, adicí, vložením nebo substitucí, nýbrž také. další chemické modifikace aminokyselin,.např. methylecej nebo acethyl.ace, jakož i posttranslační modifikace, např. glykosylace nebo f os fóry láce '·. Exprese požadovaných proteinů v různých hostitelích je pro průměrného odborníka v oboru známá a nemusí zde být zvlášť popsána. Při.tom· mohou být pro proteinové komplexy potřebné komplexní proteiny exprimovány v mateřském organismu zvlášť nebo současně. Výhodná je příprava rekombinantních komplexních' proteinů v bakteriích, . např. v E. collí, Bacillus subtilis nebo Clostridium di.fficile, nebo v eukaryotických buňkách, např. v buňkách CHO, v buňkách hmyzu, např. za použití systému Baculovirus, nebo v. buňkách kvasinek. Komplexní proteiny mohou být izoloyány a dřivé popsaným způsobem smíchány se zvoleným polypeptidem nebo nízkomolekulovým léčivem. Dále lze,zvolený polypeptid společně s komplexním proteinem exprimovat
9
9 9999 ·
9
999 9999 ' 99 ‘ 99 současně v mateřském organismu.Zvláště výhodná je současná . nebo oddělená příprava každého·komplexního proteinu společně se zvoleným polypeptidem přes YAC v kvasinkách.
Proteinové komplexy podle vynálezu mohou' být formulovány dále ze směsi komplexních proteinů připravených rekombinantně· a z komplexních proteinů izolovaných z přírodních komplexů bulinum-toxin.
Farmakologicky nebo imunologicky aktivní polypetidy, které pomocí proteinových komplexů podle vynálezu lze podívat ·..· orálně, mohou být všechny terapeuticky nebo preventivně účinnými polypeptidy, které dosud musely být aplikovány parenterálně. Polypeptidy mohou být např. hormony, cýtokiny, enzymy, růstové faktory, antigeny, protilátky, inhibitory, agonisté nebo aňtagonisté receptorů nebo koagulační faktory. Při tom nehraje žádnou roli, zda se polypeptidy připravují rekombinantně nebo se izolují z jejichpřírodních zdrojů. •Výhodnými polypeptidy jsou insulin, erythropoetin, interferon, interleukiny, inhibitory HlV-proteas, GM-CSF (Granulocyte/Makrophagéstimulating factor), NGF (Nerve growth factor), PDGF (Plateled derived growth factor), FGF (fibřoblast growth factor), plasminogen-aktivátory, např.
TPA (Tissue Plasminogěn Activátor), inhibitory reninu, humánní růstový faktor, IGF (Insulin-like Growth Factor), očkovací látky jako např. vakcina tetanu, vakcina hepátitidy B, vakcina záškrtu, protilátky např. heroěpťin (protilátka proti Her2j,, protilátka proti TNF' (Tumor Necrose Factor) , caloitonin, urokinasy, streptokinasy, inhibitory angionese, faktor VIII, faktor antagonistů Xa, inhibitory metallopřoteiňas.
·· • · · • · « • · · ·♦ ·· • · · · · w ♦ · • · · • · · · · · · ·· 99
Polypetidy použité pro diagnostické účely mohou být např. protilátky nebo ligandy, přičemž polypeptidy mohou být opatřeny označením. Jako označení přichází v úvahu každé označení, které může být v lidském nebo zvířecím těle prokázáno. Výhodným označením jsou izotopy, např. C13, nebo radioaktivní označení. Označené protilátky mohou být použity k prokázání, tumorů, k prokázání označených ligandů např. patologických receptorů.
Nízkomolekulová léčiva, která se stávají vhodná pro orální podávání, mohou být např. Neomycin, Salbutamol,
Pyrimethamin, Methicilin, Pethidin, Ketámin nebo Mephenesin.
Následující příklady objasňují vynález a nejsou chápány jako omezuj ící.
Příklady provedéní vynálezu
Příklad 1:. Získávání komplexního proteinu z C. botulinum typu B
C.botulinum typu B se fermentovala podle, publikovaného způsobu ve fermentačním/reaktoru.o objemu 20 1 (srovnej Evans et al. , 1986; European Journal of Bioch. 154, 409416) .Ferman.tační medium se skládalo z 2 % přoteose peptonu č. 2 (DIFCO), 1 % extraktu kvasinek, 1 % glukosy a 0,05 % thíoglykolátu sodného. Po 72 h kultivace při 33 °C se vysrážel toxický komplex přídavkem 3N H2SO4. Precipitát se extrahoval 2 x 250 ml 0,2 M fosfátu sodného pH 6,0. Ze ... spojených extraktů se vysřážely nukleové kyseliny přídavkem 125 ml 2%protaminsulfátu. Hned potom se precipitoval toxický komplex 23 3 g sulfátu amonného (14 h při 2-8 °C)..
·· · · ·· ·· ···· • ♦ ·· ·· · · · · · « » · · · · · ♦
Precipitát se rozpustil ve 125 ml 50 mMtris/Hcl, 1 Mm EDTA a dialyzoval se proti pufru přes noc při 2-8 °C (2x2 1) . Nerozpuštěné části se oddělily centrifugací (15 min x 15 000 rpm). Takto získaný protein 429 mg se chromatografoval Sepharosou sloupec-Q (2,6 x 25 cm). Navázaný protein se eluoval gradientem NaCl (0-500 nM). Volný neurotoxin typu B + se eluoval při' 100' mM NáCl, komplex se oddělil při 250. mM NaCl.Chromatografie prokázala. 151 mg proteinu. . .
Příklad 2 Oddělení zbytků botulinověho toxinu typu B od ' komplexních proteinů mg komplexního proteinu znečištěného botulinovým toxinem (podílové frakce dle Sepharosy Q-chromatograf ie), se dialyzovalo proti 50 mM Tris/HCl pH 7,9, mM EDTA přes noc (2 x 2 1) . Roztok proteinu se chromatografoval přes sloupec Q-hyper-D (2,6 x 8 cm), navázaný protein se eluoval gradientem NaCl (0-400 mM) . Neurotoxin se oddělil při koncentraci NáCl 100 mM, komplexní proteiny se objevily při 190 mM NáCl. Dle gelové elektroforézy SDS-polyakrylamid byl podíl neurotoxinu < 1 % analyzovaného vzorku. .
Příklad 3 Oddělení stop neurotoxinu pomocí afinitní ' chromatografie za získání proteinového komplexu (apokomplexu)
Aby se komplexní protein zbavil stop neurotoxinu, provedla Se afinitní chromatografie. Králíci se imunisovaly detoxikovaným homogenním neurotoxinem. Získaná antiséra,se. čistila vysráženíms sulfátem amonným. Specifické protilátky neurotoxinu mohly být čištěny afinitní chromatografií.K tomu se imobilizovaly 3 mg čistého neurotoxinu na 0,6 g.
• * • · • · • • · 9 ·· ·· · · • · • 9 ···· • 9 •
• • • •
14 • · * • · • • • ·
• * • * · •·· ···· • · • 9 .
rehydratované CNBr-Sepharosy (podle návodu výrobce). Antisérum (po vysráženi se sulfátem amonným), se po dialýze proti 20 mM fosfátu sodnému pH 7,0, podrobilo chromatografii proti neurotoxinu typu B, 0,5 M NaCl přes sloupec (0·,5 x 3 cm) , který byl vyplněn:syntetickou matricí -. Protilátky specifické pro toxin se získaly élucí 0,1 M glyciném pH2,7 (výtěžek 1,57 mg). 1,25 mg vyčištěného protilátky neurotoxinu se imobilizovalo na 1 g CNBr-Sepharosy. Hned potom se 11,6 mg komplexu podrobilo chromatografii (po chromatografii Q-hyper-D) v-50 mM Tris/HCl pH 7,9, 2 mM EDTA pH 7,9 přes. afinitní sloupec protilátky. Při tom cirkuloval roztok přes noc (16 h) s rychlostí proudění 40 ml/h vícekrát přes sloupec. Navázaný komplex obsahující neurotoxin mohl být oddělen 0,1 M glyciném pH 2,7. V afinitně vyčištěném •komplexu (9,8 mg) nemohl být stanoven při biologické detekci žádný neurotoxin (diafragmový test: Goeschel.et al., Experimental Neurology 147, pp. 96-102 (1987)).
Příklad,4 Tvorba proteinového komplexu podle vynálezu s tetanovým toxinem .(A) 1 mg' vyčištěného komplexního proteinu se přemístilo do ml 50mM pufru Tris/HCl, pH 8,0; s 200 pg čistého tetanového toxinu a podrobil se dialýze s. přes noc proti 50 mM pufru citrát/fosfát, pH 6,0. Alikvótní část (25 μΐ) . byla analyzována gelovou filtrací na sloupci. (Bioselect SEC 250-5) . Objevil, se jediný pík, který odpovídal molekulové hmotnosti >500 000 Da. Frakce píku byla zkoumána, gelovou elektrofórézou sps-polyakryíamid. Ukázalo se,.že se prokázaly jak vazby komplexního proteinu, tak • také tetanového toxinu. Vytvořil se tedy nový proteinový komplex-s heterólogním toxinem.
·· * ♦ ·« ·· ··«* • · ·· · · · · · · · • ♦ · . · » · • · · · · '··«.·· ·· ··« ··· ···· ·» »· (B) 6 m tetanového toxinu a 6 mg apokomplexu (příklad 3) ve 3 ml Tris/HCl, pH 7,9, 2 mM ÉDTA.se podrobilo dialýze po dobu 2 dní při 2-8 °C proti 50 mM fosfátu sodného, 2 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7,0 a hned potom se podrobily další, dialýze proti stejnému pufru ale pH 6,0 po dobu 5 dní. Hned potom se 1,5 ml roztoku s 346 μΐ 4M sulfátu amonného (—>0,75 M). převedlo a tím se komplex precipitoval. Peleta se rozpustila v 50 mM fosfátu sodného, 150mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 5,9 a alikvotní část se analyzovala gelovou filtrací. K tomu se použil Biosep SEC 3000 7,8 x 300 mM (Phenomenex)(rychlost proudění 0,5 ml/min). > 90% proteinu se eluovalo ve vysocemolekulový pík (Mr > 500 000) ;. Analýza frakce píku prokázala ve 12% SDS-PAGE, že proteinový komplex obsahoval tetahový toxin. Přítomnost, tetanového toxinu byla určena diafragmovým testem.
Příklad 5 Zkouška proteinového komplexu s.tetanovým toxinem in vivo na myších , .
mg vyčištěného komplexního proteinu se přemístilo do 2,5 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8,0 s 1 mg tetanpvého toxinu a přes noce se podrobilo· dialýze proti 50 mM pufru citrát/fosfát pH 6,0. 25.μΐ roztoku se podrobilo zkoušce: na přítomnost tetanového.toxinu v proteinovém komplexu (viz. příklad 4A) . 5.CDl-myším se podalo vždy 0,5 ml sondou do jícnu. .3 dalším myším (kontrola) se podalo ekvivalentní množstvím, tetanového ' I , toxinu. Myši ošetřené proteinovým komplexem s tetanovým toxiném zemřely po 24 h na tetanus, zatím co kontrolní myši neměly žádné příznaky tetanu. . .
Příklad'6 5 Zkouška proteinového komplexu s tetanovým toxinem in vivo na krysách
4 4. · « 4 44 • '· · ·' ·· «*···· 4 4« 4 4 ' 9 · • · 4 4 4
• · · • · .4 4 4 4
16 ·· *·· 4 4 4 4 4 4· 44 4 4 -
Každé ’2 μΐ proteinového komplexu podle vynálezu (viz.
příklad 4B) v 0,5 ml 50 mM fosfátu sodného, 150 mM NaCl, 2' mM EDTA, 100 pg BSA/ml, pH 6,0 se podaly 5 krysám Wistar(180-200 g)sondou do jícnu. 3 dalším krysám (kontrola) se podalo ekvivalentní množství tetanového toxinu ve stejném pufru. Krysy ošetřené proteinovým komplexem s tetanovým toxinem zemřely během 24 hodin na-tetanus, zatímco kontrolní . skupina krys neměla žádné příznaky tetanu.
Příklad 7 Tvorba proteinového komplexu podle vynálezu s,insulinem (A)10 mg vyčištěného komplexního proteinu : se dialyzovalo š 0,5 mg insulinu přes noc v 50 mM pufru citrát/fosfát. Vzorek byl zkoumán.gelovou filtrací na tvorbu komplexu. Objevil se pík o molekulové hmotnosti > 500 000 Da. 'Alikvot frakce píku byl zkoumán gelovou elektroforézou SDS-polyákrylamid. Frakce píku obsahovala jak vazby . komplexního proteinu tak také vazby insulinu.
(B)3 mg vyčištěného komplexního proteinu se dialyzovalo. s 0,5 mg insulinu po dobu dvou .dní v fosfátovém pufru 50 mM, pH 7,0, následovala dialýza proti 50 mM fosfátu, pH 6,0 po dobu 5 dní. Hned potom se opět vysrážel sulfát amonný. Vzorek byl zkoumán gelovou filtrací na tvorbu komplexu. Objevil se pík ό molekulové hmotnosti >500 000 Da. Alikvot frakce píku byl zkoumán gelovou elektroforézou SDSpólyakrylamid; Frakce píku obsahovala jak vazby komplexního . proteinu tak také vazby insulinu.
Příklad 8' Glukosový zátěžový test na myších ·, · .
Po stanovení cukru v krevním obraze, dostalo 10 CD1 - myší sondou do jícnu 1 ml 10% roztoku sacharosy. Za 1 hodinu se podalo 5 myším pokaždé 1 mg irísulin-proteinového komplexu.
. ·· • · ·· ·· ···· » ·· ·« · · · ·. · · • ·' · . · · · · · ·« · · » · · · • · · · · · · · ··· ··· ···· ·· *· sondou do jícnu. Po půlhodinové prodlevě se stanovil cukr v krevním obraze myší. Ukázalo Se, že cukr v krevním obraze •ošetřených myší ležel o 25-40 % pod střední hodnotou cukru krevního obrazu neošetřených myší . ·.·'·
Příklad 9 Glukosový zátěžový test na krysách Po stanovení cukru v krevním, obraze, dostalo 6 krys Wistar sondou do jícnu 1 ml 10% roztoku sacharosy. Za 1 hodinu se podalo 3 krysám pokaždé 0,5 mg insulin-próteinového komplexu sondou do jícnu. Pó půlhodinové prodlevě se stanovil cukr v krevním obraze krys. Ukázalo se, že cukr v krevním obraze ošetřených krys ležel o 25-40 % pod střední hodnotou cukru krevního obrazu neošetřených krys.
Příklad 10 Orální imunisace proti tetanu (A)30 mg preparátu komplexního proteinu bylo přemístěno se 3 mg tetanového toxoidu (zmutovaný tetanový toxin) a přes -noc se dialyzovalo proti 50 mM pufru citrát/fosfát, pH 5,5.
CDl-myším se podal každé 1 mg tptanovéhotoxoiduproťelnového komplexu. sondou do jícnu. Po 2 a 6 týdnech se podala stejná dávka. 2 týdny po posledním ošetření se : odebrala krev a ELISou se stanovil titr protilátky. Myši měly v porovnání s kontrolní skupinou:5 myší, které dostaly stejnou dávku toxoidu nenavázaného na komplex, vyvinutý titr protilátky proti toxinu (> 1 : 1 000). Neutralizační assay mohl dále prokázat, že séra inaktivují aktivitu toxinu.
(B)10 mg preparátu komplexního· proteinu bylo přemístěno se 3 mg tetanového toxoidu (zmutovaný rekombinantní tetanový toxin) a 2 dny se dialyzovalo proti. 50 mM fosfátovému pufru, pH 7,0 a pak 3 dny při pH 6,0. 5'CDl-myším se podal každé 0,5 mg tetanového· toxoidu-proteinového komplexu sondou do jícnu. Po 2 a 6 týdnech se podala stejná dávka. 2 týdny • · • · ♦ • · · · · · · po posledním ošetření,se odebrala krev a ELISou se stanovil titr protilátky. Myši měly v porovnání s kontrolní skupinou 5 myší., které dostaly stejnou dávku toxoidu nenavázaného na komplex, vyvinutý titr protilátky proti toxinu .(> 1 1
000) .. Neutralizační assay mohl dále prokázat, že séra inaktivují aktivitu toxinu.
Příklad 11 Příprava komplexu s.rekombinantním komplexním . ·· i · proteinem Clostridium botulinum typu A
K přípravě rekombinantního komplexu se' připravily jednotlivé proteinově komponenty v E.coli (srovnej Fujiňaga, Y. et al. (2000)FEBS Letters 467, str.179-183). Způsob se opírá o přípravu hémagglitininu (HA 1: Mr 33 000 Da, HA 2 : Mr 17 000 Da, HA 3a: Mr 21 00.0 Da, HA 3b: Mr 48 000 Da). v E.coli v pGEX-SX-3-expresním vektoru jako GST-fusoaném proteinu. Po vyčištění glutathioňsapharosou 4B se oddělil glutation-Střansferasou s faktorem Xa a po oddělení faktoru Xa a GST se získal čistý rekombinantní protein. Stejným způsobem se připravil také netoxický nehemagglutininující komplexní protein. Rekombinantní komplexní proteiny se dialyzovaly proti 50 mM pufru Tri^/Hcl pH 8,0 přeš noc (koncentrace proteinu 1-1,5 mg/ml).
Pro přípravu komplexu s tetaňovým toxinem sě smíchaly dohromady komponenty v následujících molárních poměrech:
Molární poměr gg .
Hal ... 8 . 264
Ha2 3 51
Ha3a ... 3.. 63
, Ha3b 3 144
Tetanový toxin . i 150 .
• ·
Směs proteinů se dialyzovala 16 hodin proti 50 mM pufru . citrátu sodného, pH 5,5. Vzorek 25 μΐ se zkoumal gelovou filtrací na tvorbu komplexu. Objevil se pík o molekulové hmotnosti 500 000 Da. Analýza frakce píku gelovou elektroforézou SDS-polyakrylamid prokázala' vedle komplexního proteinu právě vazby tetanového toxinu (150 000 Dá).
Příklad 12 Zkouška rekombinantního komplexu na myši V příkladu 10 (A) popsaný komplex se testoval na 3 CD— myších. Myši dostaly sondou do jícnu 50 μg rekombinantního komplexu. Všechny tři myši zemřely -během 48 hodin na tetanus, zatím- co 3 myši, které dostaly ekvivalentní množství Čistého tetanového toxinu (11 μg)., nevykazovaly. žádné příznaky tetanu.

Claims (12)

  1. • ·
    PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Proteinový komplex, zahrnující jeden nebo více komplexních proteinů alespoň,jednoho typu
    A,B, ClzC2rD,E, F nebo Gz Clóstridium botuliniun a jeden zvolený polypeptid nebo nízkomolekulové léčivo, kde zvolený polypeptid není botulinový tóxin. ·
  2. 2. Proteinový komplex podle nároku .1, kde komplexní proteiny jsou směs komplexních proteinů alespoň jednoho
    V .·' typu A, B, Cx, C2<D, E, F nebo Gz Clóstridium botulinum.
  3. 3. Proteinový komplex podle nároku 1 nebo 2, kde zvolený polypeptid je farmakologicky aktivní, imunologicky, aktivní nebo polypeptid používaný pro diagnostické účely.
  4. 4. Proteinový komplex podle .nároku 3, kde farmakologicky nebo imunologicky aktivní polypeptid je hormon, cytokin, enzym, růstový faktor, ántigen, protilátka, inhibitor, agonista nebo ahtagonista receptoru nebo. . koagulační faktor,
  5. 5. Proteinový komplex podle nároku 3, kde polypeptid používaný pro diagnostické účely je označená protilátka nebo označený ligand. ..
  6. 6. Proteinový komplex podle nároku 1 nebo 2, kde nízkomolekulové léčivo je Neomycin, Salbutamol, ř Pyřimethamin, Méthicillin, Ketamin nebo Mephenesin.
  7. 7. Proteinový komplex podle ‘ jednoho z nároků 1 až 6, kde komplexní protein je spojen sě zvoleným polypeptidem nebo ní zkomolekulovým léčivem chemickou vazbou. .
  8. 8. Proteinový komplex podle jednoho z nároků 1 až 7 jako terapeutický prostředek’, očkovací látka nebo diagnostikům v humánní a/nebo veterinární medicíně.
  9. 9. Způsob výroby proteinového komplexu, podle některého • · • · z nároků 1 až 7, zahrnující následující kroky:
    a) Oddělená izolace alespoň jednoho komplexu botulinum-tóxin typu A, C1, C2, D, E, F nebo G z Clostridium botulinum při hodnotě pH 2,0 až 6,5, ' ,
    b) zvýšení hodnoty pH na,7,0 až
  10. 10,0.
    c) Oddělení každého botulinum-toxínu z komplexních proteinů pomocí chromatografického způsobu,
    d) Smíchání komplexního přoteinu získaného v kroku c) se zvoleným polypeptidem nebo nízkomolekulovým léčivem, nebo
    d) oddělení komplexního přoteinu získaného v kroku c) a smíchání alespoň jednoho komplexního proteinu se zvoleným polypeptidem nebo nízkomolekulovým léčivem, a
    e) dialýza směsi z kroku d) nebo d) proti: puf ru při hodnotě pH 2,0 až .6,5, a popřípadě
    i) spojení komplexního proteinu se zvoleným polypeptidem nebo nízkomolekulovým léčivem ’ chemickou vazbou.. . 10.Způsob podle nároku 9, kde smíchané alespoň dva komplexní proteiny v kroku d) nebo-d) pocházejí z jednoho nebo z různých typů komplexů botulinumtoxin. ‘
  11. 11. Způsob výroby proteinového, komplexu podle některého z nároků 1 až 7, kde se každý komplexní protein připraví pomocí technologie rekombinace DNA.
  12. 12. Použití-proteinového komplexu, zahrnující jeden nebo více komplexních proteinů alespoň jednoho typu
    A,B, C1Z C2D,E,.F nebo G z Clostridium botul inum jako transportní vehikulum pro farmakologicky aktivní polypeptidy nebo nízko.molekulové látky nebo polypeptidy nebo nízkomólekulové látky pro diagnostické účely..
CZ2003169A 2000-07-19 2001-07-19 Proteinový komplex jako vehikulum pro orálně použitelné léčivo CZ2003169A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10035156A DE10035156A1 (de) 2000-07-19 2000-07-19 Proteinkomplex als Vehikel für oral verfügbare Protein-Arzneimittel
DE10035155 2000-07-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2003169A3 true CZ2003169A3 (cs) 2004-02-18

Family

ID=26006444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003169A CZ2003169A3 (cs) 2000-07-19 2001-07-19 Proteinový komplex jako vehikulum pro orálně použitelné léčivo

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20040028703A1 (cs)
EP (1) EP1303535A2 (cs)
JP (1) JP2004503600A (cs)
KR (1) KR100822006B1 (cs)
CN (1) CN100497379C (cs)
AU (2) AU2001285688B2 (cs)
BR (1) BR0112515A (cs)
CA (1) CA2415712A1 (cs)
CU (1) CU23381A3 (cs)
CZ (1) CZ2003169A3 (cs)
DE (2) DE10035156A1 (cs)
HU (1) HUP0301644A3 (cs)
IL (1) IL153539A0 (cs)
MX (1) MXPA03000566A (cs)
NO (1) NO20030231L (cs)
PL (1) PL364993A1 (cs)
RU (1) RU2002134755A (cs)
WO (1) WO2002005844A2 (cs)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6346510B1 (en) * 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
JP2003009897A (ja) * 2001-07-03 2003-01-14 Keiji Oguma ボツリヌス毒素の分離・精製法
US7691394B2 (en) * 2002-05-28 2010-04-06 Botulinum Toxin Research Associates, Inc. High-potency botulinum toxin formulations
US20040086532A1 (en) * 2002-11-05 2004-05-06 Allergan, Inc., Botulinum toxin formulations for oral administration
JP2007070225A (ja) * 2003-07-25 2007-03-22 Yukako Fujinaga クロストリジウム属菌由来成分を含む医薬製剤
DE102004035606A1 (de) * 2004-07-22 2006-03-30 Biotecon Therapeutics Gmbh Carrier für Arzneimittel zur Gewinnung der oralen Bioverfügbarkeit
CA2576971A1 (en) * 2004-08-20 2006-03-02 Entremed, Inc. Compositions and methods comprising proteinase activated receptor antagonists
JP2009081997A (ja) * 2007-09-27 2009-04-23 Chemo Sero Therapeut Res Inst ボツリヌス毒素成分ｈａを核酸の細胞内導入キャリアーとして利用する方法
WO2009131435A1 (en) * 2008-04-23 2009-10-29 Erasmus University Medical Center Rotterdam Linker containing bungarotoxin and a binding peptide
WO2010096134A1 (en) 2008-12-04 2010-08-26 Botulinum Toxin Research Associates, Inc. Extended length botulinum toxin formulation for human or mammalian use
US20130085267A1 (en) 2009-12-18 2013-04-04 Allergan, Inc. Stabilization of Therapeutic Agents to Facilitate Administration
KR101134146B1 (ko) 2010-05-31 2012-04-19 메덱스젠 주식회사 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법
US9393291B2 (en) 2012-04-12 2016-07-19 Botulinum Toxin Research Associates, Inc. Use of botulinum toxin for the treatment of cerebrovascular disease, renovascular and retinovascular circulatory beds
US9901627B2 (en) 2014-07-18 2018-02-27 Revance Therapeutics, Inc. Topical ocular preparation of botulinum toxin for use in ocular surface disease
US11484580B2 (en) 2014-07-18 2022-11-01 Revance Therapeutics, Inc. Topical ocular preparation of botulinum toxin for use in ocular surface disease
US11096993B2 (en) 2016-12-08 2021-08-24 Gary E. Borodic Method of treating macular degeneration using botulinum toxin-based pharmaceuticals
US11123411B2 (en) 2016-12-08 2021-09-21 Gary E. Borodic Method of treating macular degeneration using botulinum toxin-based pharmaceuticals
US20210121542A1 (en) * 2019-10-28 2021-04-29 Prime Bio, Inc. Composition for delivery of protein therapeutics through oral, sublingual and buccal route

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ286242A (en) * 1991-03-26 1997-11-24 Csl Ltd Use of veterinary implant as a single dose vaccination system: rupturable polymer film coating around core of active agent and water soluble excipient
GB9120306D0 (en) * 1991-09-24 1991-11-06 Graham Herbert K Method and compositions for the treatment of cerebral palsy
JP3510886B2 (ja) * 1992-06-23 2004-03-29 ボツリヌム トキシン リサーチ アソシエイト インコーポレイテッド ボツリヌスｂ複合体を含有する医薬組成物
AU689772B2 (en) * 1993-03-29 1998-04-09 Zoetis Llc Multicomponent clostridial vaccines using saponin adjuvants
US5562907A (en) * 1993-05-14 1996-10-08 Arnon; Stephen S. Method to prevent side-effects and insensitivity to the therapeutic uses of toxins
DE69432299T2 (de) * 1993-06-10 2003-12-11 Allergan, Inc. Multiple Botulinum Toxine zur Behandlung von neuromuskulären Störungen und Zuständen
WO1995032738A1 (en) * 1994-05-31 1995-12-07 Allergan, Inc. Modification of clostridial toxins for use as transport proteins
US6004583A (en) * 1995-03-22 1999-12-21 Orex Pharmaceutical Development Corp. Protein-containing polymer composition for oral administration
GB9508204D0 (en) * 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
US6699966B1 (en) * 1996-07-08 2004-03-02 University Of Massachusetts Proteins within the type E botulinum neurotoxin complex
DE19735105A1 (de) * 1997-08-13 1999-03-04 Univ Albert Ludwigs Freiburg Transportsystem zur Einbringung von Proteinen in Zielzellen mit Hilfe eines Fusionsproteins, Nucleinsäurekonstrukte kodierend für die Komponenten des Transportsystems und Arzneimittel, die Komponenten des Transportsystems umfassen
US20030082107A1 (en) * 1997-10-01 2003-05-01 Dugger Harry A. Buccal, polar and non-polar spray or capsule containing drugs for treating an infectious disease or cancer
GB9721189D0 (en) * 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
AU2340299A (en) * 1998-01-26 1999-08-09 University Of Massachusetts Biologically active hemagglutinin from type a (clostridium botulinum) and methods of use
US5955368A (en) * 1998-04-06 1999-09-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Expression system for clostridium species
DE19856897A1 (de) * 1998-12-10 2000-06-15 Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh Therapeutikum zur Unterdrückung von Schnarchgeräuschen
US20030118598A1 (en) * 2000-02-08 2003-06-26 Allergan, Inc. Clostridial toxin pharmaceutical compositions
ES2275992T5 (es) * 2000-02-08 2011-05-18 Allergan, Inc. Composiciones farmacéuticas de toxina botulínica.
JP2003009897A (ja) * 2001-07-03 2003-01-14 Keiji Oguma ボツリヌス毒素の分離・精製法
NZ537120A (en) * 2002-05-31 2008-07-31 Univ Jefferson Compositions and methods for transepithelial molecular transport
US20050169942A1 (en) * 2003-10-07 2005-08-04 Allergan, Inc. Novel DNA sequences of the botulinum neurotoxin complex of Clostridium botulinum type A-Hall (Allergan) strain for production of therapeutics
US7172764B2 (en) * 2003-11-17 2007-02-06 Allergan, Inc. Rescue agents for treating botulinum toxin intoxications
US7514088B2 (en) * 2005-03-15 2009-04-07 Allergan, Inc. Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use
US20060073208A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-06 Allergan, Inc. Cosmetic neurotoxin compositions and methods
JP2008535486A (ja) * 2005-03-15 2008-09-04 アラーガン、インコーポレイテッド クロストリジウム毒素標的細胞に対する改変された標的能力を有する修飾クロストリジウム毒素
FR2896693B1 (fr) * 2006-01-27 2008-03-14 Sod Conseils Rech Applic Composition comprenant plusieurs toxines botuliques

Also Published As

Publication number Publication date
EP1303535A2 (de) 2003-04-23
US20040028703A1 (en) 2004-02-12
BR0112515A (pt) 2003-07-01
AU2001285688B2 (en) 2005-09-08
WO2002005844A8 (de) 2002-02-14
NO20030231L (no) 2003-03-18
HUP0301644A2 (hu) 2003-08-28
PL364993A1 (en) 2004-12-27
NO20030231D0 (no) 2003-01-17
IL153539A0 (en) 2003-07-06
CA2415712A1 (en) 2003-01-10
MXPA03000566A (es) 2004-12-13
CU23381A3 (es) 2009-06-25
JP2004503600A (ja) 2004-02-05
AU8568801A (en) 2002-01-30
WO2002005844A2 (de) 2002-01-24
RU2002134755A (ru) 2004-07-10
WO2002005844A3 (de) 2002-06-27
CN1443196A (zh) 2003-09-17
KR100822006B1 (ko) 2008-04-15
HUP0301644A3 (en) 2010-01-28
KR20030045013A (ko) 2003-06-09
CN100497379C (zh) 2009-06-10
DE10192679D2 (de) 2003-06-18
DE10035156A1 (de) 2002-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2003169A3 (cs) Proteinový komplex jako vehikulum pro orálně použitelné léčivo
CN103747797B (zh) 脂质体制剂
US8921529B2 (en) Therapies for preventing or suppressing Clostridium difficile infection
US20040013687A1 (en) Compositions and methods for transepithelial molecular transport
CA2203504A1 (en) Vaccine and antitoxin for treatment and prevention of c. difficile disease
ZA200410287B (en) Compositions and methods for modulating physiologyof epithelial junctional adhesion molecules for e nhanced mucosal delivery of therapeutic compounds.
EP1301605B1 (en) Nk cells activating receptors and their therapeutic and diagnostic uses
TW201625675A (zh) 經調配之受體多肽及相關方法
JP2007238627A (ja) ボツリヌス神経毒を含む治療薬
JP2003524021A (ja) 悪性中皮腫の診断および治療のための組成物および方法
EP2643344B1 (en) Human lactoferrin derived peptide for use as an antigen masking agent
CA2574124A1 (en) Carrier for medicaments for obtaining oral bioavailability
Sanchez et al. Inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli cells expressing F17 fimbriae to small intestinal mucus and brush-border membranes of young calves
US8901070B2 (en) Pharmaceutical compositions comprising pore-forming proaerolysin protein (PRX302)
WO1993007872A1 (en) Lysosomal enzyme inhibitors for the treatment of neurodegenerative diseases
CN107753953A (zh) 聚乙二醇化激肽原酶的制剂及其应用
WO2004096843A1 (ja) 消化器官吸収性ポリペプチド
US20150031617A1 (en) Use of thymosin alpha for treatment of purulent rhinosinusitis
AU2010325764B2 (en) Therapies for preventing or suppressing Clostridium difficile infection
KR100497700B1 (ko) 용해성재조합보툴리누스독소단백질