KR100497700B1 - 용해성재조합보툴리누스독소단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 용해성 형태로 생산되는 재조합 보툴리누스 독소 단백질을 포함한다. 본 발명은 보툴리누스 독소 단백질 및 비독소 단백질 서열을 포함할 수 있는 용해성 융합 단백질을 또한 포함한다.
Description
본 발명은 용해성 형태로 생성되는 재조합 클로스트리듐 보툴리누스 독소 단백질에 관한 것이다.
클로스트리듐속은 그람 양성, 혐기성, 포자 형성 바실러스로 이루어진다. 상기 균의 천연 생육지는 사람 및 기타 동물의 거주 환경 및 장관이다. 사실, 클로스트리듐은 어디에나 있고, 보통 토양, 먼지, 하수 오물, 바다 퇴적물, 부패 식물 및 진흙에서 발견된다. [참조, 예컨대 P.H.A. Seneath et al., "클로스트리듐", Bergey's Manual(등록상표) of Systematic Bacteriology, 2권, 1141-1200페이지, Williams & Wilkins (1986)]. 대략 100개 종의 클로스트리듐이 동정되었지만, 단지 소수만이 의학 및 수의학적으로 중요한 병인제로서 인식되었다. 그럼에도 불구하고, 상기 종은 보툴리누스 중독, 파상풍, 혐기성 봉와직염, 가스 괴저, 균혈증, 가막성 대장염, 및 클로스트리듐 위장염을 포함하는 매우 심각한 질병과 관련이 있다. 표 1은 의학 및 수의학적 중요성을 갖는 몇몇 종 및 이 종과 관련된 질병의 목록을 나열하고 있다. 실제적으로 모든 하기 종들은 외관상으로 건강한 사람의 배설물 시료로부터 단리했고, 이 단리물중 몇몇은 결장내 세균총의 영구 거주자라기 보다는 일시적 거주자일 것이다.
| 종 | 질병 |
| 클로스트리듐 아미노발레리큠(C. aminovalericum) | 세균뇨 (임신 여성) |
| 클로스트리듐 알젠티넨스(C. argentinense) | 감염된 창상; 균혈증; 보툴리누스 중독; 양막 체액 감염 |
| 클로스트리듐 바라티(C. baratii) | 감염된 전쟁 창상; 복막염; 눈, 귀 및 전립선의 전염 과정 |
| 클로스트리듐 베이제린키키(C. beijerinckikii) | 감염된 창상 |
| 클로스트리듐 비퍼르멘탄스(C. bifermentans) | 감염된 창상; 종기; 가스 괴저; 균혈증 |
| 클로스트리듐 보툴리누스(C. botulinum) | 식중독; 보툴리누스 중독(창상, 식품, 유아) |
| 낙산클로스트리듐(C. butyricum) | 비뇨관, 하측 호흡관, 흉강, 및 복부 감염; 감염된 창상; 종기; 균혈증 |
| 클로스트리듐 카다베리스(C. caraveris) | 종기; 감염된 창상 |
| 클로스트리듐 카니스(C. carnis) | 연조직 감염; 균혈증 |
| 클로스트리듐 쵸보(C. chauvoei) | 기종저 |
| 클로스트리듐 클로스트리디오포르메(C. clostridioforme) | 복부, 경부, 음낭, 복막 및 기타 감염; 패혈증; 복막염; 충수염 |
| 클로스트리듐 코클레아륨(C. cochlearium) | 사람 질병 과정으로부터 단리되었으나 질병내 역할은 알려지지 않음 |
| 클로스트리듐 다이피셀(C. difficile) | 항미생물 관련 설사증; 가성막 소장결장염; 균혈증; 화농 감염 |
| 클로스트리듐 팰랙스(C. fallax) | 연조직 감염 |
| 클로스트리듐 고노이(C. ghnoii) | 연조직 감염 |
| 클로스트리듐 글리코리큠(C. glycolicum) | 창상 감염; 종기; 복막염 |
| 클로스트리듐 하스티포르메(C. hastiforme) | 감염된 전쟁 창상; 균혈증; 종기 |
| 클로스트리듐 히스톨리티큠(C. hsitolyticum) | 감염된 전쟁 창상; 가스 괴저; 잇몸 플라그 단리물 |
| 클로스트리듐 인도리스(C. indolis) | 위장관 감염 |
| 클로스트리듐 이노큐움(C. innocuum) | 위장관 감염; 축농증 |
| 클로스트리듐 일레규라레(C. irregulare) | 음경 병변 |
| 클로스트리듐 레프튬(C. leptum) | 사람 질병 과정으로부터 단리되었으나 질병내 역할은 알려지지 않음 |
| 클로스트리듐 리모섬(C. limosum) | 균혈증; 복막염; 폐 감염 |
| 클로스트리듐 말레노미나튬(C. malenominatum) | 다양한 감염 과정 |
| 클로스트리듐 노비(C. novyi) | 감염된 창상; 가스 괴저; 기저증, 대두병 (양); 세균성혈색소뇨증 (소) |
| 클로스트리듐 오로티큠(C. oroticum) | 비뇨관 감염; 직장 종기 |
| 클로스트리듐 파라푸트리피큠(C. paraputrificum) | 균혈증; 복막염; 감염된 창상; 충수염 |
| 클로스트리듐 페르프린젠스(C. perfringens) | 가스 괴저; 혐기성 봉와직염; 복부내 종기; 연조직 감염; 식중독; 회사 폐렴; 축농증; 뇌막염; 균혈증; 자궁 감염; 장염 회사; 램 데스티니; 스트럭; 양 장중독증 |
| 클로스트리듐 퍼트리파시엔스(C. putrefaciens) | 세균뇨 (균혈증에 결린 임신 여성) |
| 클로스트리듐 퍼트리피큠(C. putrificum) | 종기; 감염된 창상; 균혈증 |
| 클로스트리듐 라모숨(C. ramosum) | 복강, 생식관, 폐 , 및 담즙관의 감염; 균혈증 |
| 클로스트리듐 살타고포르메(C. sartagoforme) | 사람 질병 과정으로부터 단리되었으나 질병내 역할은 알려지지 않음 |
| 클로스트리듐 셉티큠(C. septicum) | 가스 괴저; 균혈증; 화농성 감염; 회사 폐렴; 비탈저 |
| 클로스트리듐 솔델리이(C. sordellii) | 가스 괴저; 창상 감염; 음경 변병; 균혈증; 종기; 복부 및 생식기 감염 |
| 클로스트리듐 스페노이데스(C. sphenoides) | 충수염; 균혈증; 골 및 연조직 감염; 복강내 감염; 감염된 전쟁 창상; 내장 가스 괴저; 신장 종기 |
| 클로스트리듐 스포로제네스(C. sporogenes) | 가스 괴저; 균혈증; 심장 내막염; 중추신경계 및 폐신경 감염; 음경 병변; 감염된 전쟁 창상; 기타 발열원 감염 |
| 클로스트리듐 섭테르미날레(C. subterminale) | 균혈증; 축농증; 담즙관, 연조직 및 골 감염 |
| 클로스트리듐 심바이오섬(C. symbiosum) | 간 종기; 균혈증; 창자 세균총으로 인해 초래된 감염 |
| 클로스트리듐 테르튬(C. tertium | 가스 괴저; 충수염; 뇌종기; 장관 및 연조직 감염; 감염된 전쟁 창상; 치근막염; 균혈증 |
| 파상풍균(C. tetani) | 파상풍; 감염된 치육 및 치아; 각막 궤양; 유도 및 중이 감염; 복강내 감염; 파상풍 신생아병; 산후 자궁 감염; 연조직 감염, 특히 외상 관련 감염 (찰과상 및 열상 포함); 감염된 바늘의 사용과 관련된 감염 |
| 클로스트리듐 더모사카로릴티큠(C. thermosaccharolyticum) | 사람 질병 과정으로부터 단리되었으나 질병내 역할은 알려지지 않음 |
* P.G. Engelkirk et al.의 "분류", 임상적 혐기성 세균학의 원리와 실제, 22-23페이지, Star Publishing Co., 캘리포니주 벨몬트 소재 (1992); J. Stephen 및 R.A.Petrowski, 세균 독소 중 "막 횡단 및 세포 해제 독소", 2판, 66-67페이지, American socity for Micorbiology (1986); R. Berkow 및 A.J. Fletcher (편집), "세균 질병", 진단 및 치료의 머크 매뉴얼, 16판, 116-126페이지, Merck Research Laboratories, 뉴저지주 레흐웨이 소재 (1992); 및 O.H. Sigmund 및 C.M. Fraser (편집), "클로스트리듐 감염" 머크 수의학 매뉴얼, 5판, 396-409페이지. Merck & Co., 뉴저지주 레흐웨이 소재 (1979).
대부분으로의 증례에서, 상기 균의 병원성은 강력한 외독소 또는 고 파괴성 효소의 방출에 관련된다. 사실, 상기 클로스트리듐속 중 몇몇 종은 큰 의학 및 수의학적 중요성을 갖는 독소 및 기타 효소를 생산한다. [C.L. Hatheway, Clin. Microbiol. Rev. 3:66-98 (1990)].
아마도 사람 및 수의학에 있어서의 중요성 때문에, 상기 독소, 특히 씨. 보툴리누스 및 씨. 다이피셀의 독소에 대한 많은 연구가 수행되었다.
씨. 보툴리누스 (C. botulinum)
클로스트리듐 보툴리누스 중 몇몇 균주는 사람 및 동물 건강에 중요한 독소를 생산한다 [C.L. Hatheway, Clin, Microbiol. Rev. 3:66-98 (1990)]. 상기 독소의 효과는 결장의 파괴를 야기할수 있는 설사병으로부터 사망을 야기할수 있는 마비 효과에 이른다. 특히, 클로스트리듐 질병에 걸릴 위험은 신생아 및 건강이 불량한 사람 및 동물(예컨대, 고령 또는 면역결함 질병과 관련된 질병으로 고통을 겪는 사람 및 동물)에게 있다.
클로스트리듐 보툴리누스는 공지된 가장 독성인 생물학적 독소를 생산한다. 사람 치사량은 혈류내 독소에 대해 단지 10-9mg/체중kg이다. 보툴리누스 독소는 근육에로의 신경 전달을 차단하여 이완성 마비를 야기한다. 독소가 기도 및 호흡 근육에 도달하면, 치사를 야기할수 있는 호흡 부전을 초래한다. [S. Arnon, J. Infect. Dis. 154:201-206 (1986)].
씨. 보툴리누스 포자는 먼지에 의해 운반되고 토양으로부터 얻은 야채, 신선환 과일 및 꿀과 같은 농업 생산물에서 발견된다. 상기 균에게 우호적인 조건하에서 포자는 영양 세포로 발아하여 독소를 생산한다. [S. Arnon. Ann. Rev, Med. 31:541 (1980)].
보툴리누스 중독 질병은 독소의 혈류내 도입 방법에 근거하여 4가지 유형으로 분류할수 있다. 식품으로 인해 발생되는 보툴리누스 중독은 보툴리누스 독소를 함유하는 부적당하게 보존되고 부적절하게 조리된 음식을 섭취함으로써 초래된다. 1976년과 1984년 사이에 미국에서 식품으로 인해 발생된 보툴리누스 중독이 355개 증례가 있었다. [K.L. MacDonald et al., Am, J. Epidemiol. 124:794 (1986)]. 보툴리누스 독소로 인한 치사율은 12%이고 특정 위험군에서는 더 높을수 있다. [C.O. Tacket et al., Am., J. Med. 76:794 (1984)]. 상처에서 유발된 보툴리누스 중독은 외상을 입은 조직에 침투하여 혈류내로 흡수되는 독소를 생산하는 씨. 보툴리누스으로부터 야기된다. 1950년으로부터, 30개 증례의 창상으로 인한 보툴리누스 중독이 보고되었다. [M.N. Swartz. "혐기성 포자 형성 바실러스. 클로스트리듐", 633-646페이지, B.D. Davis et al., (편집), 미생물학, 4판, J.B. Lippincott Co. (1990)]. 흡입 보툴리누스 중독은 독소를 흡입할 경우 발생한다. 흡입 보툴리누스 중독은 실험실에서 우연한 노출의 결과로 보고되었고 [E. Holzer, Med. Klin, 41:1735 (1962)], 독소가 생물학 전쟁의 약제로서 사용된다면 발생할수 있을 것이다 [D.R. Franz et al. in Botulinum and Tetanus Neurotoxins, B.R. DasGupta, ed., Plenum Press, New York (1993), 473-476페이지]. 전염성 유아 보툴리누스 중독은 독소의 생산 및 혈류내로의 흡수를 동반하는 유아 장내의 씨. 보툴리누스 집락 형성으로부터 초래된다. 상기 세균은 포자로 섭취된 후에 발아되는 경우에 침입성을 얻는 것 같다. [S. Arnon, J. Infect. Dis. 154:210 (1986)]. 1976년에 처음으로 알려진 후에 500개 증례가 보고되었다. [M.N. Swartz. 앞의 책]
유아 보툴리누스 중독은 3주 내지 11개월된 유아 (증례의 90% 이상이 6개월 미만의 유아임)를 공격한다. [S. Arnon. J. Infect. Dis. 154:201 (1986)]. 유아는 대부분 장내 소세균총에 대한 완전한 성인 보체가 부재하기 때문에 감염되기 쉽다고 생각된다. 성인 장내에 존재하는 양성 소세균총은 씨. 보툴리누스에 의한 집락 형성에 우호적이지 않은 산성 환경을 제공한다. 유아는 무균의 창자로부터 인생을 시작하여 점차적으로 소세균총에 의해 집락화된다. 초기 유아에게 존재하는 제한된 소세균총 때문에, 장내 환경이 산성이 아니어서, 씨. 보툴리누스 포자 발아, 증식 및 독소 생산을 허용한다. 이에 관련하여, 장내 소세균총을 변경시키는 항생치료를 받은 몇몇 성인은 보툴리누스 중독에 보다 감염되기 쉽다.
감염성 보툴리누스 중독에 대한 유아 감염성의 또다른 부가적인 요인은 유아 면역계의 미성숙이다. 성숙 면역계는 세균 항원에 감작하여 방어 항체를 생산한다. 성인 장내에서 생산되는 분비성 IgA는 씨. 보툴리누스의 영양 세포를 접합시키는 능력을 갖는다. [S. Arnon, J. Infect. Dis 154:201 (1986)]. 분비성 IgA는 또한 장내 세균 및 그의 생산물의 장세포 교차를 막음으로써 작용할 것이다. [S. Arnon, Epidemiol. Rev. 3:45 (1981)]. 유아 면역계는 이를 수행하도록 하지 못한다.
유아 보툴리누스 중독의 임상 증상은 온화한 마비로부터 중간 및 입원이 필요한 심각한 마비, 갑작스런 치사에 이르는 급성 마비에 이른다. [S. Arnon. Epidermiol. Rev. 3:45 (1981)].
심각한 유아 보툴리누스 중독의 주요 치료법은 기계적 호흡기를 사용하는 호흡 보조법 및 하제, 관장제, 및 위세척을 사용한 독소 및 세균의 역류 제거법이다. 한 해에 유아 보툴리누스 중독으로 캘리포니아에서 68명이 입원했으며 치료에 4백만 달러 이상의 총비용이 들었다. [T.L. Frankovich 및 S, Arnon. West. J. Med. 154:103 (1991)].
클로스트리듐 보툴리누스의 상이한 균주 각각은 항원학적으로 별개인 A-G로 명명된 독소를 생산한다. 혈청형 A 독소는 식품 보툴리누스 중독 증례의 26%를 차지하고, B, E 및 F 유형은 또한 식품 보툴리누스 중독 증례의 더 작은 퍼센트를 차지한다 [H. Sugiyama, Microbiol. Rev. 44:419 (1980)]. 창상 보툴리누스 중독은 전하는 바에 따르면 단지 A 또는 B유형 독소에 의해서만 야기되었다. [H. Sugiyama. 앞의 책]. 거의 모든 증례의 유아 보툴리누스 중독는 A유형 또는 B유형 독소를 생산하는 세균에 의해 야기되었다. (예외적으로, 뉴 멕시코 증례는 F유형 독소를 생산하는 클로스트리듐 보툴리누스에 의해 야기되었고, 또다른 증례는 B유형-F유형 하이브리드를 생산하는 클로스트리듐 보툴리누스에 의해 야기되었다) [S. Arnon, Epidemiol. Rev. 3:45 (1981)]. C유형 독소는 물새, 가축, 말 및 밍크에게 영향을 미친다. D유형 독소는 가축에게 영향을 미치고 E유형 독소는 사람 및 새에게 영향을 미친다.
말 혈장으로부터 유래된 3가 항독소는 A, B 및 E유형 독소에 대한 치료법으로서 콘나우트 인더스트리즈 엘티디에서 시판중이다. 그러나, 상기 항독소는 몇가지 단점이 있다. 먼저, 극히 다량이 정맥내 및(또는) 근육내로 주사되어야만 한다. 둘째, 상기 항독소는 치사에 이를 수 있는 급성 아나필락시스, 및 혈청 질병과 같은 심각한 부작용을 갖는다. 마지막으로, 상기 항독소는 효율이 불확실하고 치료 비용이 많이 든다. [C.O. Tacket et al., Am., J. Med. 76:794 (1984)].
항체 분자의 F(ab')2 부분만을 사용하는 6가 말 보툴리누스 항독소는 미 육군에 의해 시험되었다. [M. Balady, USAMRDC 뉴스레터, 6페이지 (1991)]. 이는 다수 동물내에서 불순한 독소에 대항하여 발생되었고 고 역가 제제가 아니었다.
유아 보툴리누스 중독에 대한 치료법으로서 사용하기 위해 면역된 사람 피검 대상으로부터 5가 사람 항독소가 수집되었다. 상기 항독소는 공급이 제한되고 보툴리누스 중독 질병에 걸린 모든 개체의 요구에 부합하는지를 에측할수 없다. 게다가, 사람 혈청의 수집은 HIV 및 기타 잠재적으로 심각한 사람 병원체의 선별을 수반해야만 한다. [P.J. Schwarz 및 S.S. Arnon. Western J. Med. 156:197 (1992)].
유아 보툴리누스 중독은 급성 유아 사망 증후군 (SIDS, 또한 크리브 사망)의 몇몇 증례에서 사망의 원인에 관련된다. SIDS는 완전한 사후 검사에도 불구하고 여전히 해명되지 못한 갑작스럽고 예기치 못한 유아 사망으로 공식적으로 인지되어 있다. 유아 보툴리누스 중독에 대한 SIDS의 관련성은 SIDS 유아로부터 검시시에 취한 배설물 또는 혈액 표본이 분석된 증례 중의 3-4%가 씨. 보툴리누스 균 및(또는) 독성을 함유한다는 것이 발견되었을 때 나타났다. [D.R. Peterson et al., Rev. Infect. Dis. 1:630 (1979)]. 반면에, 160명의 건강한 유아 중 1명 만이(0.6%) 배설물에 씨. 보툴리누스 균을 함유했고 보툴리누스 독소는 없었다. (S. Arnon et al., Lancet. 1274-76페이지, 1978년 6월 17일). 선진국에서 SIDS는 1개월과 1년 사이의 어린이 사망의 첫 번째 이유이다. (S. Arnon et al., Lancet. 1273-77페이지, 1978년 6월 17일). 생애의 처음 14년 동안 임의 다른 단일한 사망 원인 보다 첫해에 SIDS로 더 많은 아동이 사망한다. 미국에서, 매년 8,000-10,000 SIDS 피해자가 있다.
위험한 부작용이 없고, 타당한 가격으로 대량 공급이 가능하며, 유아에 대한 예방 용도가 가능하게 안전하고 온화하게 전달될 수 있는 유아 보툴리누스 중독에 대항한 효과적인 치료법이 필요하다.
보툴리누스 독소에 대항한 면역성을 유발하기 위한 시도로 독소 제제를 사용한 피검 대상의 면역법을 수행하였다. 화학적으로 실활된 (즉, 포름알데히드 처리된) A, B. C, D 및 E유형 독소로 이루어진 씨. 보툴리누스 백신은 사람 용도로 시판되고 있다. 그러나, 이 백신 제제는 몇가지 단점이 있다. 먼저, 이 백신의 효율이 가변적이다 (구체적으로, 수용자의 78%만이 1차 시리즈의 투여 후에 방어 수준의 항 B유형 항체를 생산하였다). 둘째로, 면역법이 고통스러우며 (투여를 위해 깊은 피하 접종이 필요하다), 역반응이 일반적이다 (초기 주사 시에 중간 내지 심각한 국부 반응이 수용자 중의 약 6%에서 발생하고; 이 수는 추가자극 주사를 받은 개체의 약 11%로 상응한다) [5가 (ABCDE) 보툴리누스 톡소이드에 대한 정보 브로숴, Center for Disease Control]. 셋째로, 활성 독소를 실험실 작업자들이 취급해야만 하기 때문에 백신의 제조가 위험하다.
씨. 보툴리누스 독소에 노출되는 위험에 놓인 개체에 투여하기 위한 안전하고 효과적인 백신 제제가 필요하다.
씨. 다이피셀
단리 시의 어려움 때문에 이름을 얻게 된 균인 씨. 다이피셀은 최근에 설사 질병의 병인제임이 입증되었다. (Sneath et al., 1165페이지). 씨. 다이피셀은 건강한 성인 중의 약 3%의 위장관에 존재하고, 역효과 없이 신생아의 10 내지 30%에 존재한다 (Swartz, 644페이지); 다른 계산으로는 씨. 다이피셀은 사람의 2-10%의 정상 위장관 세균총의 부분이다. [G.F. Brooks et al., (편집) "혐기성 박테리아에 의해 야기된 감염", Jawetz, Melnick, & Adelberg's Medical Microbiology, 19판, 257-262페이지, Appleton & Lange, 캘리포니주 산 마테오 소재 (1991)]. 이들 균은 대부분의 일반적으로 사용된 항미생물제에 대해 비교적 내성이기 때문에, 환자를 항미생물제로 치료할 경우에, 정상 위장 세균총의 나머지 구성원들이 억제되고 씨. 다이피셀이 번성하여, 세포 병원성 독소 및 장독소를 생산한다. 항생제, 특히 세팔로스포린, 클린다마이신 및 암피실린을 사용한 처리로부터 25% 증례에서 온화한 설사증이 발견되었다. [M.N. Swartz, 644페이지].
중요하게, 씨. 다이피셀은 보통 병원에서의 감염과 연관된다. 상기 균은 종종 병원 및 간호실 환경내에 존재하고, 쇠약하고 면역이 손상된 환자를 돌보는 병원 사람의 손 및 의복을 통해 운반될수 있다. 이들 환자의 다수는 항미생물제 또는 기타 화학치료제로 치료되고 있기 때문에, 이러한 씨. 다이피셀의 전염은 질병의 중대한 위험 요인을 나타낸다. (Engelkirk et al., 64-67페이지).
씨. 다이피셀은 설사증만으로부터 두드러진 설사증 질병 및 영향을 받은 면내에 가성막을 형성하는 염증 세포 및 섬유질의 누적과 함께 위장 점막의 회저에 이르는 범위의 설사증과 연관이 있다. (Brooks et al.). 가막성 소장결장염 증례 중의 95% 이상에서 발견되었다. (Swartz, 644페이지). 이 때때로 치명적인 질병은 설사, 다수의 소결장내 페스트, 및 중독성 거대결장증을 특징으로 한다. (Swartz, 644페이지). 대변 배양물이 때때로 진단에 사용될지라도, 씨. 다이피셀로 인한 소장결장염에 걸린 환자로부터 배설 여과물내에 존재하는 열 불안정성 독소의 탐지에 의해 최상으로 진단된다. (Swartz, 644-645페이지; 및 Brooks et al., 260페이지). 씨. 다이피셀 독소는 조직/세포 배양물에 대해 세포독성이고, 햄스터에게 맹장내 주사할 때 소장결장염을 야기한다. (Swartz, 644페이지).
씨. 다이피셀의 장관독성은 주로 A 및 B로 명명된 두가지 독소의 작용에 기인하며, 각각 분자량은 약 300,000 이다. 둘다 강력한 세포독소이며, 독소 A는 직접 장관 세포독성 활성을 조작한다. [Lyerly et al., Infect. Immun, 60:4633 (1992)]. 항미생물제 관련 설사와 거의 관련이 없는 균인 씨. 페르프린젠스의 독소 A와는 달리, 씨. 다이피셀의 독소는 포자 코트 구성체가 아니고 포자 형성 중에 생산되지 않는다. (Swartz, 644페이지). 씨. 다이피셀 독소 A는 토끼 회장관내 출혈, 체액 누적 및 점막 손상을 야기하고 장관 점막에 의한 독소 B 흡수를 증가시키는 듯한다. 독소 B는 위장관 체액 누적을 야기하지 않지만, 조직 배양 세포에 대해 독소 A 보다 1000배 더 독성이고 막 손상을 야기한다. 상기 독소가 액틴 분해와 같이 유사한 세포내 효과를 유발할지라도 세포 특이성에서 차이가 발생한다.
두 독소 모두 질병에서 중요하다. [Borriello et al., Rev, Infect. Dis., 12(suppl.2):S185 (1990); Lyerly et al., Infect. Immun.. 47:349 (1985); 및 Rolfe. Infect. Immun., 59:1223 (1990)]. 독소 A는 먼저 블러시 보더 수용체에로의 결합, 외부 점막층의 파괴, 그다음 하면 조직에로 독소 B의 접근을 가능하게 함으로써 작용한다고 생각된다. 상기 발병 단계는 독소 A에 대항한 중화 항체의 생산이 CDCA의 예방 치료법으로 충분할 것임을 나타내는 것이다. 그러나, 독소 B에 대항한 항체는 후기 단계 결장염 질병에 대항한 효과적인 치료를 위한 부가적인 필수 성분일 것이다. 사실, 동물은 상기 질병에 대항해 완전히 방어되는 독소 A 및 독소 B 모두에 대한 항체를 필요로 한다고 보고되었다. [Kim and Rofe, abstr. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol., 69:62(1987)].
씨. 다이피셀은 또한 독소 A 및 B와 상이한 장독소과 같은 기타 독소 [Banno et al., Rev. Infect. Dis., 6(Suppl. 1:S11-S20(1984)], 저분자량 독소 [Rihn et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 124:690-695 (1984)], 운동성 변경 인자 [Justus et al., Gastroenterol., 83:836-843(1982)] 및 아마도 기타 독소를 생산한다고 보고되었다. 이와 무관하게, 씨. 다이피셀 위장 질병이 주 관심사이다.
가장 일반적으로 사용되는 항미생물제에 대한 내성으로 인해 (가장 일반적인 암피실린, 클린다마이신 및 세팔로스포린에도 불구하고), 씨. 다이피셀은 사실상 모든 미생물제를 사용하는 항미생물제 치료법과 연관이 있다. 또한 메토트레사이트, 5-플루오로우라실, 시클로포스파미드 및 독소루비신과 같은 화합물을 사용하여 화학치료법을 수행한 환자에서의 질병과 연관이 있다. [S.M. Finegold et al., 혐기성 감염에 대한 임상 가이드, 88-89페이지, Star Publishing Co., 캘리포니아주 벨몬트 소재 (1992)].
씨. 다이피셀의 높은 내성을 고려하면 씨. 다이피셀 질병의 치료는 문제이다. 오랄 메트로니다졸, 바키트라신 및 반코마이신이 효과적이라고 보고되었다. (Finegold et al., 89페이지). 그러나, 이들 화합물을 사용하는 치료법과 연관된 문제점이 있다. 반코마이신은 매우 고가이고, 몇몇 환자들은 경구 약물치료가 가능하지 않으며, 몇 주 동안은 발생하지 않을 지라도 재발율이 높다 (20-25%).
씨. 다이피셀 질병은 위장관내 상기 독소의 효과를 중화시킴으로써 예방 또는 치료될수 있다. 따라서, 위험한 역효과가 없고, 타당한 가격으로 대량 공급이 가능하고, 가막성 소장결장염의 위험에 있는 환자를 예방 용도로 효과적으로 치료할수 있도록 안전하게 전달가능한 씨, 다이피셀에 대항한 효과있는 치료법이 필요하다.
도 1은 웨스턴 블롯에 의한 항-씨. 보툴리누스 IgY의 반응성을 나타낸다.
도 2는 ELISA에 의해 측정된 달걀내 씨. 보툴리누스 A유형 독소에 대한 IgY 항체 역가를 나타낸다.
도 3은 씨. 다이피셀 독소 A 중화 검정의 결과를 나타낸다.
도 4는 씨. 다이피셀 독소 B 중화 검정의 결과를 나타낸다.
도 5는 씨. 다이피셀 독소 B 중화 검정의 결과를 나타낸다.
도 6은 프라이머 1-4 (SEQ ID NOS:1-4)의 서열을 도시한 씨. 다이피셀 독소 A 유전자의 제한 지도이다.
도 7은 씨. 다이피셀 독소 A 반응성 단백질의 웨스텐 블롯이다.
도 8은 씨. 다이피셀 독소 A 발현 구성체를 나타낸다.
도 9는 씨. 다이피셀 독소 A 발현 구성체를 나타낸다.
도 10은 재조합 씨. 다이피셀 독소 A의 정제를 도시한다.
도 11은 재조합 독소 A에 대해 반응성인 항체를 사용한 씨. 다이피셀 독소 A 중화 검정의 결과를 도시한다.
도 12는 씨. 다이피셀 독소 A 중화 플레이트에 대한 결과를 나타낸다.
도 13은 씨. 다이피셀 독소 A 중화 플레이트에 대한 결과를 나타낸다.
도 14는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 중화 검정의 결과는 나타낸다.
도 15는 씨. 다이피셀 독소 A 발현 구성체를 나타낸다.
도 16은 pMA1870-680 IgY PEG 제제에 대한 체류 시간에 대항한 280nm에서의 크로마토그래피 플롯팅 흡광도를 나타낸다.
도 17은 두 개의 재조합 씨. 다이피셀 독소 B 발현 구성체를 나타낸다.
도 18은 씨. 다이피셀 독소 B 발현 구성체를 나타낸다.
도 19는 씨. 다이피셀 독소 B 발현 구성체를 나타낸다.
도 20은 씨. 다이피셀 독소 B 발현 구성체를 나타낸다.
도 21은 재조합 씨. 다이피셀 독소 B 융합 단백질의 정제를 도시하는 SDS-PAGE 겔이다.
도 22는 두 개의 히스티딘-표지된 재조합 씨. 다이피셀 독소 B 단백질의 정제를 도시하는 SDS-PAGE 겔이다.
도 23은 씨. 다이피셀 독소 B 발현 구성체를 나타낸다.
도 24는 씨. 다이피셀 독소 B 반응성 단백질의 웨스턴 블롯이다.
도 25는 씨. 보툴리누스 A유형 독소 발현 구성체를 나타낸다; 씨. 보툴리누스 또는 씨. 다이피셀 서열을 제공하는 데 사용된 구성체도 또한 도시되어 있다.
도 26은 재조합 씨. 보툴리누스 A유형 독소 융합 단백질의 정제를 도시하는 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔이다.
도 27은 씨. 보툴리누스 A유형 독소 발현 구성체를 나타낸다; 씨. 보툴리누스 서열을 제공하는 데 사용된 구성체도 또한 도시되어 있다.
도 28은 Ni-NTA 수지를 사용한 pHisBot 단백질의 정제를 도시하는 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔이다.
도 29는 BL23(DE3) 및 BL21(DE3)pLysS 숙주 세포내 pHisBot 단백질의 정제를 도시하는 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔이다.
도 30은 뱃치 흡수 절차를 사용한 pHisBot 단백질의 정제를 도시하는 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔이다.
도 31은 씨. 다이피셀 A유형 독소 발현 구성체를 나타낸다.
도 32는 이. 콜라이 (E. coli) 숙주 세포 내에서 pUC1960-2680의 발현을 도시하는 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔 및 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 33은 이. 콜라이 숙주 세포내 몇몇 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 융합 단백질의 발현을 도시하는 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔 및 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 34는 이. 콜라이 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 융합 단백질의 정제를 도시하는 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 35는 햄스터의 예방 치료 연구 결과를 나타낸다.
도 36은 햄스터의 치료법 치료 연구 결과를 나타낸다.
도 37은 햄스터의 치료법 치료 연구 결과를 나타낸다.
도 38은 햄스터의 치료법 치료 연구 결과를 나타낸다.
도 39는 씨. 다이피셀 감염된 햄스터에게 반코마이신의 투여 결과를 나타낸다.
도 40은 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질 pMA1870-2680 및 4개의 상이한 보조제으로 면역된 암탉으로부터 단리된 IgY의 ELISA 분석 결과를 나타낸다.
도 41은 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질 pPA1870-2680 (N/C)및 4개의 상이한 보조제으로 면역된 암탉으로부터 단리된 IgY의 ELISA 분석 결과를 나타낸다.
도 42는 아쿠아테릭(Aquateric)-코팅된 IgY에 대한 용해 프로파일을 나타낸다.
도 43은 유드라기트(Eudragit)(등록상표)-코팅된 IgY에 대한 용해 프로파일을 나타낸다.
도 44는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질로 면역된 햄스터로부터 단리된 IgY의 ELISA 분석 결과fmf 나타낸다.
도 45는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 단백질로 백신 접종된 햄스터로부터 단리된 IgY의 ELISA 분석 결과는 나타낸다; 재조합 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 반응성이 도시되어 있다.
도 46은 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 단백질로 면역된 햄스터로부터 단리된 IgY의 ELISA 분석 결과는 나타낸다; 씨. 다이피셀 독소 B에 대한 반응성이 도시되어 있다.
도 47은 햄스터의 치료법 치료 연구 결과를 나타낸다.
도 48은 설사증 햄스터의 치료법 치료 연구 결과를 나타낸다.
도 49는 햄스터의 치료법 치료 연구 결과를 나타낸다.
도 50은 배지 상등액, 칼럼 유출액 및 친화성 정제 칼럼으로부터의 칼럼 용리액으로부터의 씨. 다이피셀 독소 A 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 51은 배지 상등액, 칼럼 유출액 및 친화성 정제 칼럼으로부터의 칼럼 용출액으로부터의 씨. 다이피셀 독소 A 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 52는 액상 배지 상등액내 씨. 다이피셀 독소 B 수준을 나타내는 쿠마시 블루로 염색된 천연 PAGE 겔이다.
도 53은 투석 백 배지내 시, 다이피셀 독소 B 수분을 나타내는 웨스턴 블롯 및 쿠마시 블루로 염색된 천연 PAGE 겔이다.
도 54는 시판되는 독소 B 제제 및 친화성 정제 칼럼으로부터의 칼럼 유출물 및 칼럼 용리물내 씨. 다이피셀 독소 B 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 및 쿠마시 블루로 염색된 천연 PAGE 겔이다.
도 55는 pH-민감성 장용막으로 코팅된 IgY 정제의 용해 프로파일을 나타낸다.
도 56은 정제 형성 및 장용피 코팅 공정 후에 씨. 다이피셀 독소 A IgY 반응도의 안정성을 나타낸다.
도 57은 IgY로 예방 처리된 햄스터 및 씨. 다이피셀 독소 A로 감염된 햄스터의 치사율을 나타낸다.
도 58은 IgY로 예방 처리된 햄스터 및 씨. 다이피셀 독소 A로 감염된 햄스터의 치사율을 나타낸다.
정의
본발명의 이해를 쉽게 하기 위하여 다수의 용어가 아래에 정의된다.
본원에서 사용된 바의 "중화"란 용어는 항독소, 구체적으로 대항하여 항독소가 지시되는 독소의 병리학적 작용을 막는 능력을 가진 항체로 이루어진 항독소에 관련하여 사용된다.
본원에서 사용된 바의 "과잉생산"이란 용어는 숙주 세포내에서 클로스트리듐 독소 폴리펩티드의 생산에 관련하여 사용되고, 숙주 세포가 상기 클로스트리듐 독소 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 도입이 없는 상기 숙주 세포에 의해 발현될수 있는 것보다 상기 핵산 서열의 도입에 의해 클로스트리듐 독소를 더 많이 생산하는 것은 의미한다. 숙주 세포내 생산된 독소 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 숙주 세포가 숙주 세포 배지 리터 당 1mg 이상의 수준으로 상기 독소 폴리펩티드를 발현하거나 과잉생산하는 것이 바람직히다.
본원에서 사용된 바의, "융합 단백질"이란 용어는 외인성 단백질 단편(비독성 단백질로 이루어진 융합 파트너)에 연결된 관심있는 단백질 (예컨대, 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B 및 그의 단편)을 함유하는 키메라 단백질을 말한다. 융합 파트너는 숙주 세포 내에서 발현하는 씨. 다이피셀 단백질의 용해도를 증진시키고, 친화성 표지(tag)를 제공하여 숙주 세포 또는 배지 상등액, 또는 둘다로부터 재조합 융합 단백질의 정제를 허용할 것이다. 원한다면, 융합 단백질은 당업계에 공지된 다양한 효소 또는 화학적 수단에 의해 면역법 전에 관심있는 단백질 (예컨대, 독소 단백질 또는 그의 단편)으로부터 제거될수 있다.
본원에 사용된 바의 "비독성 단백질" 또는 "비독성 단백질 서열"이란 용어는 세포 독성 단백질로부터 유래하지 않은 단백질 또는 단백질 서열로 이루어진 융합 단백질의 부분을 말한다.
본원에 사용된 바의 "관심있는 단백질"이란 용어는 발현되기 원하는 융합 단백질내 단백질을 말한다. 융합 단백질에 있어, 관심있는 단백질은 또다른 단백질 또는 단백질 영역, 융합 단백질 파트너와 결합하거나 융합되어 관심있는 단백질의 안정성 증진시키고, 또는 융합 단백질 정제를 용이하게 할 것이다.
본원에서 사용된 바의 "말토오즈 결합 단백질"이란 용어는 이. 콜라이의 말토오즈 결합 단백질을 말한다. 말토오즈 결합 단백질의 부분을 관심있는 단백질에 첨가하여 융합 단백질을 생성할수 있고; 말토오즈 결합 단백질의 부분은 세균 숙주내에서 발현될 때 생산되는 융합 단백질의 용해도를 단지 증진시킬 것이다. 한편, 말토오즈 결합 단백질의 부분은 아밀로스 수지 상에서 융합 단백질의 친화성 정제를 허용한다.
본원에서 사용된 바의 "폴리-히스티딘 트랙"이란 용어는 융합 단백질과 관련하여 사용될 때, 관심있는 단백질 또는 융합 파트너의 아미노 또는 카르복시 말단 또는 양 말단에 2 내지 10개 히스티딘 잔기가 존재하는 것을 말한다. 6 내지 10개의 잔기의 폴리-히스티딘 트랙이 바람직하다. 폴리-히스티딘 트랙은 또한 니켈-킬레이트 칼럼 상에서 생성된 융합 단백질의 친화성 정제를 허용하는 관심있는 단백질에 첨가된 다수의 일관성(consecutive) 히스티딘 잔기로서 기능적으로 정의된다.
"티오레독신 단백질"이란 용어는 융합 단백질과 관련하여 사용되는 경우에, 이. 콜라이의 티오레독신 단백질을 말한다. 본발명은 티오레독신 단백질의 원천에 제한되지 않으나, 이. 콜라이 티오레독신 단백질이 특히 바람직하고, 티오레독신 단백질은 여러가지 원천으로부터 얻을 수 있다. 티오레독신 단백질의 부분을 관심있는 단백질에 첨가하여 융합 단백질을 생성할 수 있고; 티오레독신 단백질의 부분은 세균 숙주내에서 발현될 때 생성되는 융합 단백질의 용해도를 증진시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바의 "정제된" 또는 "정제하는"이란 용어는 시료로부터 오염물의 제거를 말한다. 예컨대, 항독소는 오염 비면역글로불린 단백질의 제거에 의해 정제되며; 또한 독소와 결합하지 않은 면역글로불린의 제거에 의해 정제된다. 비면역글로불린 단백질 및(또는) 독소에 결합하지 않은 면역글로불린을 제거하면 시료내 독소 반응성 면역글로불린의 퍼센트가 증가한다. 항독소는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 달걀로부터 조류 항독소의 추출 및 침강을 포함하는 다양한 수단에 의해 정제시킬 수 있다. 항클로스트리듐 항독소는 또한 클로스트리듐 독소 단백질의 부분을 포함하는 수지 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할수 있다. 또다른 예로, 재조합 독소 폴리펩티드를 세균 숙주 세포에서 발현시키고, 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 독소 폴리펩티드를 정제시키고; 이로써 시료 내의 재조합 독소 폴리펩티드의 퍼세트를 증가시킨다. 더욱이, 재조합 독소 폴리펩티드는 리포다당류 (예컨대, 내독소)와 같은 숙주 세포 성분을 제거함으로써 정제된다.
본원에서 사용된 바의 "재조합 DNA 분자"라는 용어는 분자 생물학 기술에 의해 함께 결합된 DNA의 세그먼트로 이루어진 DNA 분자를 말한다.
본원에서 사용된 바의 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩티드"라는 용어는 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 단백질 분자를 말한다.
본원에서 사용된 바의 "천연 단백질"이란 용어는 재조합 수단에 의한 단백질 생산에 반하여 천연 원천으로부터 단리된 단백질을 말한다.
본원에서 사용된 바의 "부분"이란 용어는 단백질과 관련되는 경우에 ("주어진 단백질의 부분"과 같이) 그 단백질의 단편을 말한다. 이 단편은 크기가 4개 아미노산 잔기로부터 1개의 아미노산이 빠진 전체 아미노산 서열에 이르는 범위일 수 있다.
본원에서 사용된 바의 "용해성"은 숙주 세포내에서 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 단백질과 관련되는 경우에 숙주 세포의 세포질내 용액에 존재하는 단백질이고; 이 단백질이 시그날 서열을 함유한다면, 용해성 단백질은 세균 숙주내 세포질 공간에로 밖으로 나와, 적당한 유전자 (즉, kil 유전자)를 갖는 세균 숙주에 의하거나 또는 분비가능한 원핵 세포에서는 배양 배지내로 분비된다. 반면에, 불용성 단백질은 숙주 세포내 세포질 과립 (봉입체로 불림) 내측에 변성 형태로 존재하는 것이다. 재조합 단백질의 고도의 발현율 (즉, 세균 배지 리터 당 재조합 단백질 10 내지 20 mg)은 종종 세균 숙주 세포내 봉입체 내에서 발견되는 발현 단백질을 야기한다. 용해성 단백질은 숙주 세포 내측에 봉입체로서 발견되지 않거나, 또는 세포질내 및 봉입체내 모두에서 발견되고, 이 경우에 단백질이 세포질내에 높거나 낮은 수준으로 존재할수 있는 단백질이다.
용해성 단백질 (즉, 숙주 세포 내에 발현될 때 용해성 형태로 생산되는 단백질)과 "용해된" 단백질 사이에는 차이가 있다. 봉입체 내측에서 발견된 불용성 재조합 단백질은 구아니딘 염산염, 우레아 또는 황산도데실나트륨 (SDS)와 같은 변성제로써 정제 봉입체를 처리함으로써 용해될수 있다 (즉, 용해성 형태로 만들 수 있다). 이러한 변성제는 회수된 단백질이 재변성 (다시 접힘)되도록 용해된 단백질로부터 제거되어야만 한다. 모든 단백질이 변성제내 용해 및 변성제 제거 후에 활성 형태로 다시 접히는 것은 아니다. 변성제의 제거시에 많은 단백질이 침강한다. SDS를 사용하여 봉입체 용해시킬수 있고 저농도로 단백질을 용액 중에 유지시킬 수 있다. 그러나, 투석에 의해 모든 SDS가 제거되는 것은 아니므로 (SDS는 투석되지 않는 미셀을 형성할 수 있다); 따라서, SDS-용해된 봉입체 단백질은 용해성이지만 다시 접히지는 않는다.
유의량의 이온성 세정제 (예컨대, SDS) 또는 변성제 (예컨대, 우레아, 구아니딘 염산염)가 결여된 용액 중에 용해성인 (즉, 용해된) 단백질과, 상기 용액 중에 분산된 불용성 단백질 분자의 현탁액으로서 존재하는 단백질 사이에는 차이가 있다. 용해성 단백질은 액상 배지내에 존재하는 세균을 제거하기에 충분한 조건을 사용하여 원심분리에 의해 상기 단백질을 함유하는 용액으로부터 제거되지 않을 것이다. (즉, 5,000xg에서 4 내지 5 분간 원심분리). 예컨대, 두 개의 단백질인 단백질 A 및 단백질 B이 용액 중에 용해성인지를 시험하기 위하여, 두 개의 단백질을 PBH-NaCl (0.5M NaCl을 함유하는 PBS), 0.2% 트윈 20을 함유하는 PBS-NaCl, PBS, 0.2% 트윈 20을 함유하는 PBS, PBS-C (2mM CaCl2를 함유하는 PBS), 0.1 또는 0.5% 트윈 20을 함유하는 PBS-C, 0.1 또는 0.5% NP-40을 함유하는 PBS-C, 0.1 또는 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS-C, 0.1% 나트륨 데옥시콜레이트를 함유하는 PBS-C로 구성되는 군으로부터 선택된 용액내에 놓는다. 단백질 A 및 B를 함유하는 혼합물을 5000 xg에서 5분 동안 원심분리시켰다. 원심분리에 의해 형성된 상등액 및 펠렛을 단백질 A 및 B의 존재 여부에 대해 검정했다. 단백질 A가 상등액에서 발견되고, 펠렛에서는 발견되지 않는다면 [트랩핑의 결과로서의 소량 (즉 10% 미만)은 제외하고], 단백질이 시험 용액내에서 용해성이라고 칭한다. 단백질 B의 대부분이 펠렛으로 발견된다면 (즉, 90%이상), 단백질 B는 시험 용액내에 현탁액으로 존재한다고 칭한다.
본원에서 사용된 바의, "치료량"이란 용어는 피검 대상체에서 하나이상의 클로스트리듐 독소의 병리학적 작용을 중화하는데 필요한 항독소의 양을 말한다.
"치료 혼합물"이란 용어는 항독소 혼합물에 관련하여 사용되는 경우에 피검 대상에서 하나이상의 클로스트리듐 독소의 병리학적 작용을 중화하는 데 필요한 항독소의 양을 말한다.
"치료 백신"이란 용어는 하나이상의 재조합 클로스트리듐 독소 융합 단백질로 이루어진 백신에 관련하여 사용되는 경우에 백신이 면역학적으로 유효한 양의 융합 단백질 (즉, 면역원)을 함유함을 의미한다.
본원에서 사용된 바의 "면역학적 유효량"이란 용어는 백신 접종시에 숙주 (즉, 피검 대상)에서 방어 수준의 항체 생산을 유발하는데 필요한 면역원의 양을 말한다.
본원에서 사용된 바의 "발열원"이란 용어는 발열 물질을 말한다. 발열원은 숙주에 대하여 내인성일 수 있거나 (예컨대, 프로스타글라딘), 또는 외인성 화합물 일 수 있다 (예컨대, 세균 내독소 및 외독소, 항원 및 특정 스테로이드 화합물 등과 같은 비세균성 화합물 등)일수 있다. 제약 용액내 발열원의 존재는 U.S. 약전 (USP) 토끼 열 시험 (미국 약전, XXII권 (1990) 미국 약전 콘벤션, 메매랜드주 록빌시 소재, 151페이지)을 사용하여 탐지할수 있다.
본원에서 사용된 바의 "내독소"란 용어는 그람 음성 세균의 외막과 관련된 고분자량 복합체를 말한다. 미정제 내독소는 지질, 단백질 및 탄수화물을 함유한다. 고정제 내독소는 단백질을 함유하지 않으며, 리포다당류 (LPS)를 말한다. 미정제 내독소가 제약 화합물 (예컨대, 재조합 DNA 기술를 사용하여 이. 콜라이 내에서 생산된 단백질)의 생산에서 관심사이기 때문에, 본원에서 사용된 바의 내독소란 용어는 미정제 내독소를 말한다. 세균성 내독소는 널리 공지된 발열원이다.
본원에서 사용된 바의, "내독소가 없는"이란 용어는 숙주에게 비경구로 (초내 투여를 제외하고) 투여되는 조성물에 관련하여 사용되는 경우에, 전달되는 투여량이 체중 kg 당 5EU 미만을 함유하는 것을 의미한다 [비경구 약제에 대한 FDA 기준 (1087년 12월)]. 성인 사람의 경우, 체중을 70 kg으로 가정하면, 투여량은 비경구 투여에 대한 FDA 기준에 부합하도록 350EU 미만을 함유해야 한다. 본원에서 내독소 수준은 리뮬러스 아메보사이트 라이사이트 (LAL) 시험을 사용하여 측정한다 (리뮬러스 아메보사이트 라이사이트 피로크롬(등록상표), 어소시에이트 오브 케이프 코드, 인크. 매사추세츠주 우즈 홀시 소재). 재조합 단백질의 제조시 내독소 수준을 측정하기 위하여, 50mM NaPO4, pH 7.0, 0.3M NaCl 및 10% 글리세롤 중에 정제된 재조합 단백질 0.5 mg을 함유하는 용액 0.5ml를 디아조 커플링 방법 없이 종말점 색소생산성에 대한 제조업자의 지시에 따라 LAL 검정에 사용한다. 본원에서 450 이하 내독소 유니트 (EU)/mg의 정제된 재조합 단백질을 함유하는 조성물은 "실질적으로 내독소가 없는"으로 정의된다. 전형적으로, 백신 접종을 위한 목적으로 성인에 대한 세균 독소 또는 톡소이드의 투여는 약 10-500㎍ 단백질/투여의 투여량을 포함한다. 따라서, 70kg 사람에게 정제된 재조합 단백질 10-500㎍의 투여하면 (상기 정제된 재조합 단백질 제제는 450EU/mg 단백질을 함유한다), 단지 4.5 내지 225 EU (즉, 비경구 투여 당 최대 허용 내독소 적재량의 1.3 내지 64.5%)를 도입시킨다.
LAL 시험은 세균 내독소 탐지 수단으로서 미국 FDA에서 승인되었다 (21 C.F.R. §§ 660.100-105). 연구는 LAL 시험이 내독소 탐지를 위한 USP 토끼 발열원 시험과 동등하거나 우수함을 입증했고 따라서 LAL 시험을 동물내에서 발열원성 연구를 위한 대용물로서 사용할수 있다 [F.C. 펄슨, 발열원:내독소, LAL 시험 및 발열원 제거. Marcel Dekker, New York (1985), 150-155페이지]. FDA 생물학 사무국은 사용된 LAL 검정이 토끼 시험과 동일한 또는 보다 민감하다는 것이 입증되는 한 USP 토끼 발열원 시험 대신에 LAL 검정을 수용한다 (Fed. Reg., 38. 26130 (1980)].
"1가의"라는 용어는 클로스트리듐 백신과 관련하여 사용되는 경우에 한 유형의 클로스트리듐 독소에 대항해 지시되는 숙주 (즉, 피검 대상) 동물내 면역 반응을 야기할수 있는 백신을 말한다. 예컨대, 씨. 다이피셀 A유형 독소 백신으로써 숙주의 면역법이 A유형 독소의 공격에 대항하여서는 방어하나, B유형 독소의 공격에 대항해서는 방어하지 않는 면역된 숙주내 항체를 유발한다면, A유형 백신은 1가라고 칭한다. 반면에, "다가" 백신은 몇 개의 (즉, 1개가 넘는) 클로스트리듐 독소에 대항해 지시되는 숙주 동물내 면역 반응을 유발한다. 예컨대, 씨. 다이피셀 A 및 B유형 독소로 이루어진 백신으로써 숙주를 면역시켜 A 및 B 독소 모두의 공격에 대항해 숙주를 방어하는 항체의 생산을 유발한다면, 이 백신을 다가 (구체적으로, 가정된 백신은 이가이다)라고 칭한다.
본원에서 사용된 바의. "응집물" 및 "응집"은 물질의 클럼프, 그룹핑 또는 매쓰의 생산을 말한다. 이는 상기 용어를 특정 유형의 클럼핑에 제한하고자 하는 것은 아니다. 오히려, 이 용어는 다수의 항목이 밀접하게 접촉된 임의 상황을 포괄하는 광의의 의미로 사용하고자 하는 것이다. 따라서, 상기 용어는 임의 유형의 응집을 포괄한다 (라텍스 응집, 적혈구 응집 반응, 또는 응집물을 생산하는데 면역학적 반응이 사용된 임의 기타 방법을 포함하나 이에 제한되지 않음). 또한 상기 용어는 비면역학적 방법에 적용되며, 또한 다수의 성분들 사이의 비특이 관계들을 포괄하며, 모든 필요한 것은 개개 성분을 함께 클럼핑하는 것이다.
"피검 대상"이란 용어는 항독소 또는 백신으로 이루어진 조성물의 투여와 관련하여 사용되는 경우에, 상기 항독소 또는 백신이 투여되는 수용체 동물을 말한다. 상기 피검 대상은 상기 조성물을 투여하기 원하는 포유동물 및 보다 구체적으로 사람을 포함하는 임의 동물일수 있다. 상기 조성물을 투여하기 전에 하나 이상의 씨. 다이피셀 독소에 피검 대상이 이미 노출되었을 수 있다 (이는 피검 대상에 대한 치료 투여이다). 또는, 상기 조성물을 투여하기 전에 씨. 다이피셀 독소에 미리 피검 대상이 노출되지 않았을 수 있다. 이는 피검 대상의 예방 투여이다).
본 명세서 및 청구범위에서 "시료"란 용어는 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로는 표본 또는 배양물 (예컨대, 미생물학적 배양물)을 포함하는 것을 의미한다. 다른 한편으로는, 생물학적 및 환경적 시료 모두를 포함하는 것을 의미한다.
생물학적 시료는 사람을 포함하는 동물, 체액, 고형물 (예컨대, 대변) 또는 조직 뿐만아니라 액상 및 고형 식품 및 낙농 항목, 야채, 육류 및 육류 부산물, 및 폐기물과 같은 성분들일수 있다. 생물학적 시료는 모든 다양한 군의 가축, 뿐만아니라 유제 동물, 곰, 어류, 라가몰핀, 설치 동물 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 에랄 또는 야생 동물로부터 얻을수 있다.
환경적 시료는 표면 물질, 토양, 물 및 산업상 시료, 뿐만아니라 식품 및 낙농 가공 도구, 장치, 장비, 용구, 일회용 및 비일회용 항목으로부터 얻어진 시료와 같은 환경적 물질을 포함한다. 상기 예는 본발명에 해당하는 시료형을 제한하는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바의 "배양물"이란 용어는 세균을 포함하나 그에 제한되지 않는 균의 생체내 또는 생체외 증식에 관련하여 사용된다. 상기 용어는 임의 형태의 미생물 배양물을 포괄한다. 상기 용어는 증식에 도움이 되는 배지 및 환경에서 미생물 또는 기타 생 세포의 전파를 포괄하는 용어로 쓰인다. 상기 배양물은 한천판, 브로쓰 및 반고형 배지를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의 형태에서 증식될 수 있고, 배양되는 균에 적당한 임의 환경 (즉, 호기성, 혐기성, 미호기성 등)에서 증식될수 있다.
본원에서 사용된 바의 "상등액"이란 용어는 임의 액상 또는 유체상 용액에 관련하여 사용된다. 상기 액체 또는 유체는 단백질 (예컨대, 항체 또는 독소 분자)와 같은 용해성 입자를 함유하거나 함유하지 않을수 있다. 상기 용어는 침강된 불용성 물질 위에 놓인 임의 액체, 뿐만아니라 미생물 또는 세포 배양물로부터 수집된 액상 배양 배지와 같은 액체를 포괄한다. 또한, 원심분리 중에 용액내에 잔류할 수 있는 입자로부터 원심분리 중에 용액내에 잔류할 수 없는 불용성 입자를 원심분리하여 분리한 시료의 액상 부분을 포괄한다. 그러나, 이 용어가 원심분리를 사용하는 상황으로 제한되도록 사용되는 것은 아니다.
"방어 수준"이란 용어는 세균 독소로 이루어진 면역원으로 숙주를 면역시킬 때 유발된 항체의 수준에 관련하여 사용되는 경우에, 치사량의 독소에 의한 공격으로부터 숙주를 방어하기에 충분한 항체를 계산한 수준을 의미한다.
본원에서 사용된 바의 "단백질" 및 "폴리펩티드"란 용어는 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 이루어진 화합물을 말하고 상호 교환가능하게 사용된다.
"독소"란 용어는 클로스트리듐속의 구성원 (즉, 종 및 균주)에 의해 생산된 독소에 관련하여 사용되는 경우에, 조직(들)에 대하여 독성인 단백질을 말한다. 예컨대, 씨. 다이피셀에 의해 생산된 독소는 위장 조직에 대해 독성이고; 씨. 보툴리누스에 의해 생산된 독소는 신경 조직에 대해 독성이다.
"캡슐화" 또는 "캡슐형성한"이란 용어는 항독소의 고형 (예컨대, 동결건조된) 형태의 피복을 말한다. 상기 피복은 장용피 또는 캡슐로 이루어질수 있다. "장용피" 또는 "장용막"이라 용어는 서로 교환가능하게 사용되고, 위내에서 존재할 수 있도록 산 pH에 대해 내성인 물질 또는 화합물 (즉, 내산성 화합물)을 말한다. 고형물에 도포하는 경우에 장용피는 위내에서 고형물의 분해를 억제한다.
고형 조성물의 캡슐화에 대한 표준 기술은 당업계에 공지되어 있다. 상기 기술은 장용피를 고형 조성물에 도포하는 고형 조성물의 마이크로캡슐화를 포함한다. 코팅된 물질은 당업계에 공지된 제약학적 현탁액내 마이크로캡슐화된 입자를 현탁시켜 피검 대상에게 경구로 전달할수 있다.
고형 장용피를 사용하여 고형 항독소를 캡슐화하는 경우에, 장용피는 장용막이 직접 고형 항독소에 도포되는 일단계 코팅 공정을 사용하여 도포할수 있고; 코팅된 항독소는 장용막으로 오버코팅되었다고 칭한다. 별법으로, 고형 항독소를 먼저 사용하여 논-패리엘 (즉, 약 40 내지 60 메쉬 크기의 당 입자)를 오버코팅한 다음 항독소 코팅된 논-패리엘을 장용막으로 오버코팅한다. 원하는 항독소 전달용의 장용피는 유드라기트 (등록상표) L30D (롬 테크, 인크.)와 같은 폴리메타크릴레이트를 포함한다.
고형 항독소는 원하는 양의 항독소를 캡슐내로 삽입하여 경구 전달용으로 배합할 수 있고; 위내에서의 용해에는 내성이나 장내에서는 용해될 수 있는 특성을 갖는 캡슐이 바람직하다. 무수한 적당한 캡슐 배합물이 당업계에 시판되고 있고; 게다가, 고형 형태의 치료 조성물을 포함하는 충분한 체적의 캡슐 충전물을 제공하는 불활성 충전제 물질의 사용을 포함하는 캡슐 충전에 대한 표준 기술이 유용하다. 캡슐화된 항독소 및 캡슐 내에 함유된 항독소의 사용에 더하여, 고형 항독소를 정제 또는 환제 형태로 경구 전달할 수 있다. 고형 항독소는 정제 또는 환제의 압착을 위해 충분한 체적을 제공하는 불활성 물질과 병용될수 있다. 일단 형성되면, 정제 또는 환제를 장용막으로 코팅하여 위 내에서의 용해를 방지하고 장 내에서의 용해를 증진시킨다.
"경구 투여"란 용어는 입을 통하여 항독소를 포함하는 조성물과 같은 조성물의 전달을 말한다.
"비경구 투여"란 용어는 식도 (예컨대, 경구 전달) 또는 폐를 통한 경로 외의 경로에 의해 항독소 또는 백신으로 이루어진 조성물과 같은 조성물의 전달을 말한다. 구체적으로 비경구 투여는 정맥내, 피하, 근육내 또는 골수내 (즉, 초내) 주사일 수 있다.
"증상" 및 "중독 증상"이란 용어는 씨. 다이피셀 독소에 노출된 또는 노출 위험하에 있는 피검 대상에 관련하여 사용되는 경우에, 하기 현상: 설사, 소장결장염, 가막성 결장염, 출혈, 궤양 및(또는) 장 내 점막 염증, 맹장염 (즉, 맹장의 염증) 중 어느 것의 존재를 말한다.
본원에서 사용된 바의 "증상의 발현을 멈추는"이란 용어는 피검 대상이 씨. 다이피셀 질병 및(또는) 감염과 관련된 신호 및(또는) 증상을 나타내는 것을 멈춘 상황을 말한다.
씨. 다이피셀 질병에 의한 중독 증상의 "실질적인 제거"라는 용어는 중독 증상에 노출되거나 그로 인해 고통을 겪는 피검 대상의 증상이 경감, 약화 또는 제거되는 것을 의미한다. 예컨대, 중독된 피검 대상이 심각한 설사증 (즉, 대량의 수분이 많은 설사)가 있다면, 적어도 느슨하게 형성된 대변으로 돌아가는 것이 이 증상의 실질적인 제거일 것이다.
"치료 기간을 넘어선"이란 용어는 씨. 다이피셀 독소에 노출된 피검 대상을 치료하는 방법에 관련하여 사용되는 경우에, 피검 대상에게 치료 화합물 (예컨대, 항독소)의 투여를 멈춘 후에 약 7일 이상 및 보다 바람직하게 14일 이상의 동안의 기간을 의미한다. 치료 기간을 넘어선 중독 증상의 실질적인 제거를 야기하는 치료 화합물은 재발병을 막거나 (증상이 제거된 경우), 또는 치료 화합물의 투여를 철회한 후 적어도 7일 동안 상기 증상의 심각도의 증가를 막는다 (증상이 경감된 경우). 달리 말하면, 치료 중단 후에 적어도 7일 동안 피검 대상 중 대부분에서 [즉, 통계학적으로 상당한 수 (예컨대, 75%)] 재발 (즉, 재발병 또는 심각도의 증가)이 없다.
본발명의 항독소에 반하여, 설정된 씨. 다이피셀 감염용의 현존하는 치료 화합물 [즉, 반코마이신 또는 메트로니다졸과 같은 항생 물질] 또는 씨. 다이피셀 톡소이드 A 및 B로써 면역된 소로부터의 소 IgG 농축물 [Lyerly et al., (1991) Infect. Immun, 59:2215]은 치료된 피검 대상의 상당 수에서 재발을 막지 못한다. 예컨대, 반코마이신 또는 메트로니다졸로써 치료된 씨. 다이피셀 관련 질병으로 고통을 겪는 햄스터 중의 100% 까지 및 사람의 약25%가 재발한다 (즉, 중독 증상 재발).
씨. 다이피셀에 의한 감염 전에 씨. 다이피셀 톡소이드 A 및 B로써 면역된 소로부터의 소 IgG 농축물 (BIC)이 투여된 햄스터(즉, 예방 치료)는 반드시 재발하고 (즉, 설사증으로 돌아김), BIC 가 철회되는 경우에 죽는다. [Lyerly et al., (1991), 앞의 책]. 발병된 씨. 다이피셀 감염을 갖는 햄스터를 BIC로써 치료할 때 치료 효과가 관찰되지 않는다. (즉, BIC의 투여가 설사증을 제거하지 않거나 치사를 막지 못한다) [Lyerly et al., (1991), 앞의 책].
반면에, 본발명의 항독소는 발병된 씨. 다이피셀 감염을 치료하는 데 사용되는 경우에, 설사증을 포함한 중독 증상을 실질적으로 제거하고 치사를 막는다. 항 씨. 다이피셀 독소로 치료된 동물 중 대부분은 재발하지 않으며, 적어도 14일 동안 항독소 치료의 중단 후에도 건강하다 [동물은 장기간 동안 (예컨대, 약 5개월) 건강하다].
발명의 요약
본발명은 독소로부터 유래된 폴리펩티드의 생산에 관한 것이다. 한 실시양태로, 본발명은 폴리-히스티딘 트랙 및 독소의 부분으로 이루어진 융합 단백질에 관한 것이다. 본발명은 독소의 유형 또는 성질에 의해 제한되는 것은 아니다. 예로서, 클로스트리듐 속의 구성원에 의해 생산된 독소의 부분들이 폴리-히스티딘 트랙을 포함하는 융합 단백질로서 발현된다.
바람직한 실시양태로, 독소 폴리펩티드는 클로스트리듐 보툴리누스 신경독소로 이루어진다. 본발명은 백신 및 항독소의 생산을 위한 씨. 보툴리누스 백신으로부터 유래된 폴리펩티드의 사용을 고려한다. 씨. 보툴리누스 백신 및 항독소는 사람 및 기타 동물에게 사용된다. 한 실시양태에서, 본발명은 비독소 단백질 서열 및 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소의 부분으로 이루어진 융합 단백질을 고려한다. 바람직한 실시양태로, 씨. 보툴리누스 A유형 독소 서열은 SEQ ID NO:28의 서열의 부분으로 이루어진다. 또다른 실시양태에서, 씨. 보툴리누스 A유형 독소 서열은 SEQ ID NO:23의 부분으로 이루어진다. 본발명은 융합 단백질의 성질에 의해 제한되지 않는다. 예컨대, 융합 단백질은 폴리-히스티딘 트랙과 함께 SEQ ID NO:23에 나열된 바의 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 서열로 이루어질수 있다.
본발명은 또한 벡터가 비독소 단백질 서열 및 SEQ ID NO:28의 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 서열의 부분으로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 코려한다. 이 실시양태에서, 숙주 세포는 코딩된 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 단백질을 용해성 단백질로서 총 세포 단백질의 0.23 내지 10% 이상의 수준으로 및 바람직하게 총 세포질 단백질의 0.75% 이상의 수준으로 발현시킬수 있다. 본발명은 숙주 세포내 재조합 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 성질에 제한되지 않는다. 예컨대, 융합 단백질은 폴리-히스티딘 트랙과 함께 SEQ ID SNO:23에 나열된 클로스트리듐 보툴리누스 A형 독소 서열로 이루어질수 있다.
본발명은 또한 벡터가 SEQ ID NO:28의 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 서열로부터 유래된 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 고려한다. 이 실시양태에서, 숙주 세포는 코딩된 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 단백질을 총 세포 단백질의 10 내지 40% 이상의 수준으로 및 바람직하게 총 세포질 단백질의 20% 이상의 수준으로 발현시킬 수 있다. 본발명은 숙주 세포내 재조합 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 성질에 의해 제한되지 않는다. 예컨대, 융합 단백질은 폴리-히스티딘 트랙과 함께 SEQ ID SNO:23에 나열된 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 서열로 이루어질수 있다.
한 실시양태에서, 본발명은 (임의 순서로) 비독성 단백질 서열 및 SEQ ID NO:28의 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 서열의 부분으로 이루어진 정제된 용해성 융합 단백질로 이루어진 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소에 대항해 지시된 중화 항독소를 발생하고, 뿐만아니라 숙주는 천연 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소를 중화할수 있는 항체를 생성하도록 정제된 융합 단백질로써 면역시키는 방법에 관한 것이다. 단지 예시로써, 융합 단백질은 SEQ ID NO:23에 나열된 바의 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 서열의 부분 및 폴리-히스티딘 트랙으로 이루어질수 있다. 본 방법은 더 나아가 숙주로부터 항체를 수집하는 부가적인 단계를 포함할수 있다. 또한 수집된 항체를 정제하는 것도 고려한다. 본발명은 상기 서술된 방법에 따라 발생된 물질의 조성물로서의 항체를 고려한다.
본발명은 더나아가 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소로부터 유래된 재조합 융합 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다. 이 실시양태에서, 재조합 융합 단백질은 폴리-히스티딘 트랙을 포함하여, (임의 순서로) 폴리-히스티딘 트랙 및 SEQ ID NO:28의 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 서열의 부분으로 이루어진 융합 단백질, 및 고형 지지체에 공유 결합된 2가 양이온으로 이루어진 크로마토그래피 수지로 이루어진 용액으로 이루어진다. 이 실시양태에서, 용액을 크로마토그래피 수지에 첨가하여 융합 단백질을 크로마토그래피 수지에 결합시킨다. 또한 이 실시양태는 부가적으로 상기 결합된 융합 단백질을 함유하는 크로마토그래피 수지를 세척하여 크로마토그래피 수지로부터 비융합 단백질을 제거하고, 결합된 융합 단백질을 세척된 크로마토그래피 수지로부터 용리시키는 단계를 더 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 고형 지지체 상에 고정된 니켈 이온을 포함한다. 시판되는 니켈 이온 칼럼의 예로는 히스-바인드(His-Bind)(등록상표) 수지 (노바겐) 및 Ni-NTA 아가로스 수지 (퀴아겐)을 포함한다. Ni-NTA 아가로스 수지가 폴리-히스티딘 트랙을 함유하는 결합 단백질에 대해 매우 높은 친화성을 갖기 때문에 바람직한 크로마토그래피 수지이다.
본발명은 폴리-히스티딘 트랙 및 SEQ ID NO:28의 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 서열의 부분으로 이루어진 융합 단백질로 이루어진 용액의 성질에 의해 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 상기 용액은 재조합 융합 단백질을 포함하는 숙주 세포로 이루어진 세포 펠렛으로부터 유래된 용해성 추출물로 이루어진다. 또다른 실시양태로, 용해성 추출물은 결합 완충액 중에 세포 펠렛을 현탁하고, 현탁액을 분쇄시켜 숙주 세포의 막을 붕괴시켜 용해성 단백질 및 불용성 세포질 디브리스로 이루어진 혼합물을 생성함으로써 세포 펠렛으로부터 생성된다. 또다른 실시양태에서, 재조합 융합 단백질이 폴리-히스티딘 트랙을 포함하는, 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소로부터 유래된 재조합 융합 단백질을 정제하는 방법은 추가로 분쇄된 세포 현탁액으로부터 불용성 세포질 디브리스를 제거하여 정화된 용해성 용해물을 생성하는 부가적인 단계를 포함한다. 또다른 실시양태로, 재조합 융합 단백질의 정제 방법은 정화된 용해성 용해물에로 비이온성 세정제의 첨가를 사용한다. 바람직한 비이온성 세정제는 노니데트 P-40 이다. 또다른 바람직한 실시양태로, 재조합 융합 단백질의 정제 방법은 4℃에서 1 시간 이상 동안 크로마토그래피 수지와 함께 상기 비온성 세정제를 함유하는 정화된 용해성 용해질을 인큐베이션하여 융합 단백질을 크로마토그래피 수지에 결합시키는 부가적인 단계를 포함한다. 약 3시간의 인큐베이션 단계가 특히 바람직하다.
본발명은 사람 및 기타 동물용의 클로스트리듐 항독소 치료법에 관한 것이다. 클로스트리듐 독소의 병리학적 작용을 중화하는 항독소는 재조합 독소 단편으로 조류 숙주를 면역시켜 발생된다. 한 실시양태에서, 본발명은 비독소 단백질 서열 및 SEQ ID NO:10의 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 서열의 부분으로 이루어진 융합 단백질을 고려한다. 본발명은 융합 단백질의 성질에 의해 제한되지 않는다. 예컨대, 융합 단백질은 SEQ ID NO:20에 나열된 바의 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 서열의 부분 및 말토오즈 결합 단백질 (또는 그의 부분)로 이루어질수 있다. 한편, 융합 단백질은 폴리-히스티딘 트랙과 함께 SEQ ID NO:21에 나열된 바의 클로스트리듐 다이피셀 독소 B로 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 본발명은 임의 순서로 i) 비독소 단백질 서열 및 SEQ ID NO:10의 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 서열의 부분으로 이루어진 정제된 융합 단백질, 및 ii) 조류 숙주를 제공하고; b) 천연 클로스트리듐 다이피셀 독소 B를 중화할 수 있는 항독소를 생성하도록 상기 정제 융합 단백질로 상기 숙주를 면역시키는 것으로 이루어진, 클로스트리듐 다이피셀 독소 B에 대항하여 지시되는 중화 항독소의 생성 방법을 고려한다. 단지 예시로서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:20에 나열된 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 서열의 부분 및 말토오즈 결합 단백질 (또는 그의 부분)로 이루어질 수 있다. 한편으로, 융합 단백질은 폴리-히스티딘 트랙과 함께 SEQ ID NO:21에 나열된 바의 클로스트리듐 다이피셀 독소 B로 이루어질 수 있다. 상기 방법은 추가로 상기 숙주로부터 상기 항독소는 수집하는 단계 (c), 및 더 부가적으로 상기 항독소의 정제 단계 d)를 포함할수 있다. 본발명은 상기 서술된 방법에 따라 생성된 물질의 조성물로서 항체를 고려한다.
본발명은 추가로 a) i) 피검 대상, 및 ii) 비독소 단백질 서열 및 SEQ ID NO:10의 클로스트리듐 다이피셀 독소 B의 부분으로 이루어진 융합 단백질에 대항해 지시되는 하나 이상의 중화 항독소를 제공하고; 및 b) 상기 항독소를 상기 피검 대상에게 투여하는 것으로 이루어진 치료 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본발명은 경구 투여에 의한 투여를 고려한다. 추가로, 본발명은 치료된 피검 대상이 클로스트리듐 다이피셀 및 그의 독소에 노출되었을 수도 또는 되지 않았을 수도 있음을 고려한다. 즉, 한 예로서, 항독소를 투여하기 전에 클로스트리듐 디이피셀 독소 B에 대한 노출이 일어났었을 수도 있다. 또다른 예로, 피검 대상이 항독소의 투여 전에 클로스트리듐 다이피셀 독소 B에 노출된 적이 없을 수도 있다.
본발명은 또한 독소 A 단편을 포함하는 융합 단백질을 고려한다. 한 실시양태에서, 본발명은 비독소 단백질 서열 및 SEQ ID NO:7로 구성되는 클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 부분으로 이루어진 융합 단백질을 고려한다. 또다른 실시양태로, 본발명은 비독소 단백질 서열 및 SEQ ID NO:8의 클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 부분으로 이루어진 융합 단백질을 고려한다. 상기 실시양태에서, 융합 단백질의 비독소 부분은 다양한 비독소 단백질 서열 유형으로부터 선택될수 있다. 바람직한 실시양태로, 비독소 서열은 말토오즈 결합 단백질 서열 (또는 그의 부분)이다.
본발명은 a) 임의 순서로 i) 비독성 단백질 서열 (예컨대, 말토오즈 결합 단백질 서열 또는 그의 부분) 및 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 서열 (예컨대, SEQ ID NO:7에 나열된 바의 독소 A 서열)의 부분으로 이루어진 정제된 융합 단백질, 및 ii) 조류 숙주를 제공하고; 및 b) 상기 클로스트리듐 다이피셀 독소 A를 중화할수 있는 항독소를 생성하도록 상기 숙주를 상기 정제된 융합 단백질로써 면역시키는 것으로 이루어진, 클로스트리듐 다이피셀 독소 A에 대항해 지시되는 중화 항독소의 생산 방법을 고려한다. 상기 방법은 추가로 상기 숙주로부터 상기 항독소는 수집하는 단계 (c), 및 더 부가적으로 상기 항독소의 정제 단계 d)를 포함할수 있다.
본발명은 또한 백신 및 진단 검정법에서 독소 단편용으로의 사용을 고려한다. 상기 단편은 정제된, 용해성 항원 또는 대안적으로 혼합물 또는 "칵테일"로서 별도로 사용할 수 있다.
본발명은 씨. 다이피셀 독소 A의 부분 및 씨. 다이피셀 독소 B의 부분에 대항하여 지시되는 조류 중화 항독소로 이루어진 조성물을 제공한다. 상기 항독소는 씨. 다이피셀에 노출되었거나 노출될 위험하에 있는 사람 및 기타 동물에 사용할 수 있다. 한 실시양태로, 씨. 다이피셀 독소 A의 부분에 대항해 지시되는 조류 중화 항독소의 성분은 씨. 다이피셀 독소 A의 부분을 포함하는 제1 융합 단백질 및 씨. 다이피셀 독소 B의 부분을 포함하는 제2 융합 단백질에 대항해 지시된다. 또다른 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질 모두는 부가적으로 적어도 하나의 비독소 단백질 서열을 포함한다. 부가적인 실시양태로, 항독소는 SEQ ID NO:6의 부분으로 이루어진 씨. 다이피셀 독소 A의 부분에 대항해 지시된다. 또다른 실시양태에서, 항독소는 SEQ ID NO:6의 부분이 SEQ ID NO:7, 8 및 29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 씨. 다이피셀 독소 A의 부분에 대항해 지시된다. 또다른 실시양태로, 제1 및 제2 융합 단백질은 적어도 하나 이상의 비독소 단백질 서열을 함유한다. 본발명은 비독소 단백질 서열의 성질에 의해 제한되지 않는다. 한 실시양태로, 비독성 단백질 서열은 폴리-히스티딘 트랙으로 이루어진다. 또다른 실시양태로, 비독성 단백질 서열은 말로오즈 결합 단백질로 이루어진다. 또다른 실시양태로 비독성 단백질 서열은 티오레독신 단백질로 이루어진다. 또다른 실시양태에서, 항독소는 SEQ ID NO:10의 부분으로 이루어진 씨. 다이피셀 독소 B의 부분에 대항해 지시된다. 또다른 실시양태에서, 항독소는 SEQ ID NO:10의 부분이 SEQ ID NO:11, 12, 21, 21 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 씨. 다이피셀 독소 B의 부분에 대항해 지시된다. 또다른 실시양태로, 조류 항독소로 이루어진 조성물은 추가로 장용피를 포함할수 있다.
또한, 본발명은 a) 임의 순서로 i) 피검 대상, ii) 클로스트리듐 디아피셀 독소 A 서열 SEQ ID NO:6의 부분에 대항해 지시되는 제1 조류 중화 항독소 및 iii) 클로스트리듐 디아피셀 독소 B 서열 SEQ ID NO:10의 부분에 대항해 지시되는 제2 조류 중화 항독소를 제공하고; b) 상기 제1 및 제2 항독소를 혼합하여 치료 혼합물을 제조하고; 및 c) 치료 혼합물을 피검 대상에게 치료 기간 동안 투여하는 것으로 이루어진 치료 방법을 고려한다. 본발명은 추가로 단계 c) 전에 치료 혼합물을 가공하여 그의 장용피 안정성을 향상시키는 단계를 포함하는 치료법을 고려한다. 바람직한 실시양태로, 이 치료법은 치료 혼합물의 항독소를 캡슐화하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태로, 캡슐화 단계를 치료 혼합물 내 항독소를 장용막으로 오버코팅하는 것으로 이루어진다.
본발명은 추가로 피검 대상이 항독소의 투여 전에 적어도 하나의 클로스트리듐 다이피셀 독소에 노출되었던 적이 있는 경우의 치료 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 상기 노출된 피검 대상은 중독 증상으로 고통을 겪고, 항독소 투여는 치료 기간을 넘어선 증상의 실질적인 제거를 결과한다. 또다른 실시양태로, 중독 증상은 설사증이다.
본발명은 또한 피검 대상이 항독소의 투여 전에 클로스트리듐 다이피셀 독소에 노출되지 않은 경우의 치료 방법을 고려한다.
한 실시양태에서, 치료 방법은 SEQ ID NOS: 7, 8 및 29로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 서열로 이루어진 클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 부분에 대항해 지시되는 제1 조류 항독소를 제공한다. 또다른 실시양태로, 치료 방법은 SEQ ID NOS:11, 12, 20, 21 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 서열로 이루어진 클로스트리듐 다이피셀 독소 B의 부분에 대항해 지시되는 제2 조류 항독소를 제공한다.
치료 방법은 항독소의 투여 방법에 의해 제한되지 않는다. 한 실시양태로, 치료 방법은 경구 투여에 의한 항독소 투여로 이루어진다. 또다른 실시양태로, 치료 방법은 비경구 투여에 의한 항독소의 투여로 이루어진다.
본발명은 추가로 a) 임의 순서로 i) 피검 대상, ii) 클로스트리듐 디아피셀 독소 A 서열 SEQ ID NO:6의 부분으로 이루어지며, 정제된 용해성이고 실질적으로 내독소가 없는 제1 단백질 및 iii) 클로스트리듐 디아피셀 독소 B 서열 SEQ ID NO:10의 부분으로 이루어지며, 정제된 용해성이고 실질적으로 내독소가 없는 제2 단백질을 제공하고; b) 상기 제1 및 제2 단백질을 혼합하여 치료 백신을 제조하고; 및 c) 중화 항독소를 생성하도록 치료 백신을 피검 대상에게 치료 기간 동안 백신 접종하는 것으로 이루어진, 피검 대상에게 백신 접종하여 씨. 다이피셀 독소에 대항하여 지시되는 중화 항독소를 생산하는 방법을 고려한다 백신 접종 방법은 피검 대상의 성질 또는 종에 의해 제한되지 않는다. 한 실시양태에서 피검 대상은 새이다. 또다른 실시양태로, 피검 대상은 포유동물이다. 또다른 실시양태에서 피검 대상은 사람이다. 여전히 부가적인 실시양태에서, 백신 접종 방법에서 제1 및 제2 독소 단백질은 추가로 적어도 하나의 비독소 단백질 서열을 포함한다. 본발명은 비독소 단백질 서열의 성질에 의해 제한되지 않는다. 한 실시양태로, 비독성 단백질 서열은 폴리-히스티딘 트랙으로 이루어진다. 또다른 실시양태로, 비독성 단백질 서열은 말토오즈 결합 단백질로 이루어진다. 또다른 실시양태로, 비독성 단백질 서열은 티오레독신 단백질로 이루어진다.
한 실시양태로, 백신 접종 방법은 SEQ ID NO:29로 이루어지며, 정제되고 실질적으로 내독소가 없는 제1 단백질을 사용한다. 또다른 실시양태로, 백신 접종 방법은 SEQ ID NO:30으로 이루어진 정제되고 실질적으로 내독소가 없는 제2 단백질을 사용한다. 본발명은 추가로 하나 이상의 비독소 단백질 서열 및 SEQ ID NO:29로 이루어진 클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 부분으로 이루어진 융합 단백질을 제공한다. 또다른 실시양태로, 비독성 단백질 서열은 추가로 폴리-히스티딘 트랙을 포함할 수 있다.
본발명은 임의 순서로 클로스트리듐 다이피셀 항체를 함유한다고 생각되는 시료, 고형 지지체에 결합된 클로스트리듐 다이피셀 항원과 반응성인 항체로 이루어진 고형 지지체 접합체를 제공하고; 시료 및 고형 지지체 접합체를 접합체가 클로스트리듐 다이피셀 항원에 결합할수 있는 그러한 조건 하에 혼합하고; 및 결합을 탐지하는 것으로 이루어진, 시료 내에서 클로스트리듐 다이피셀 항원의 탐지 방법을 제공한다. 한 실시양태로, 클로스트리듐 다이피셀 항원과 반응성인 항체는 조류 항체이다. 바람직한 실시양태로, 조류 항체는 클로스트리듐 다이피셀의 독소 A와 반응한다. 특히 바람직한 실시양태로, 조류 항체는 독소 A의 A-6 인터벌과 반응한다. 대안적인 바람직한 실시양태로, 조류 항체는 클로스트리듐 다이피셀의 독소 B와 반응한다. 바람직한 실시양태로, 조류 항체는 독소 B의 B-3 인터벌과 반응한다. 또다른 바람직한 실시양태로, 조류 항체는 독소 A 및 독소 B와 반응한다. 또한 상기 방법에 사용된 고형 지지체가 폴리스티렌 입자로 이루어지는 것으로 고려한다. 한 바람직한 실시양태로, 혼합 단계는 가시적인 응집물을 형성시킨다. 바람직한 실시양태로, 시료는 사람 대변이다.
대안적인 실시양태로, 본발명은 설사증을 포함하는 증상을 나타내는 클로스트리듐 다이피셀에 노출된 피검 대상, 및 투여가능한 치료량으로 존재하는 클로스트리듐 다이피셀과 반응성인 항체를 제공하고, 상기 항체를 상기 피검 대상이 증상을 나타내는 것이 멈추고 치료가 완료되는 조건하에 피검 대상에게 투여하는 것으로 이루어진 치료 방법으로 이루어진다. 특히 바람직한 실시양태로, 피검 대상은 치료 기간을 넘어선 장기간 생존성을 나타낸다. 한 바람직한 실시양태로, 클로스트리듐 다이피셀 항원과 반응성인 항체는 조류 항체이다. 이 항체가 클로스트리듐 다이피셀의 독소 A, 독소 A의 A-6 인터벌, 클로스트리듐 다이피셀의 독소 B, 독소 B의 B-3 인터벌, 및 독소 A 및 독소 B의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 잔기 또는 항원에 대항해 반응성일 것이라고 생각한다.
본발명은 또한 임의 순서로 클로스트리듐 다이피셀 균 및 용액 중에 독소를 함유하는 상등액으로 이루어진 배양물, 고형 지지체 상에 고정된 클로스트리듐 다이피셀 독소와 반응성인 항체를 제공하고, 독소를 함유하는 배양물로부터 상등액을 수집하고, 항체가 독소와 결합할수 있는 조건하에서 고정된 항체에 상등액을 첨가하고, 고정된 항체로부터 독소를 용리시키고, 임의의 용리된 독소를 탐지하는 것으로 이루어진, 배양물로부터 클로스트리듐 다이피셀 독소의 정제 방법을 제공한다. 한 바람직한 실시양태로, 클로스트리듐 다이피셀 항원과 반응성인 항체가 조류 항체이다. 클로스트리듐 다이피셀의 독소 A, 독소 A의 A-6 인터벌, 클로스트리듐 다이피셀의 독소 B, 독소 B의 B-3 인터벌, 및 독소 A 및 독소 B의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항원 또는 잔기에 대항해 반응성인 항체를 포함하는 다양한 항체가 이 방법에 사용될수 있다.
본발명은 클로스트리듐 독소 단백질에 대항해 지시된 조류 항독소로 이루어진 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태로, 이 조성물은 고형 투여 형태이다. "고형 투여 형태"란 용어는 정제, 환제, 캡슐 (예컨대 제약 산업에 보통 사용되는 용어로서 겔-캡을 포함) 및 그의 모든 방출 연장형 변형물 (예컨대, 방출 조절형, 지효성, 예정시간 방출형, 작용 연장형 등)을 포함하는 투여 형태를 의미한다. 또한, "고형 투여 형태"란 용어는 경구로 전달될수 있는 현탁액 (즉, 액상 부형제내 현탁된 조류 항독소로 이루어진 고형 입자: 고형 입자는 부가적으로 장용피를 포함할수 있다)을 포함한다.
한 실시양태에서, 조류 항독소의 고형 투여 형태는 추가로 장용피를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태로, 장용피는 약 pH 7.0에서 용해한다. "pH 약 7.0" 및 "약 pH 7.0"는 상호 교환가능하게 사용되고 6.5 내지 7.5의 pH 범위를 말한다. 특히 바람직한 장용피는 위 (pH 약 0-2.0) 및 소장 (pH 약 5.0-6.5)를 통한 장용피 코팅된 정제 (환제, 캡슐 등)의 통과 중에 근본적으로 원래대로 남았으나 대장 (pH 약 7.0)에 이르면 용해되는 것들이다. 용해성 장용피의 예로는 메타크릴산 공중합체 [예컨대, 유드라지트 L 또는 S (롬 테크사, 매사추세츠주 마들렌시 소재)], 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 (CAP) [예컨대, pH 6.5에서 용해되는 아쿠아테릭 (FMC사, 펜실베니아주 필라델피아시 소재)], 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트 (HPMCAS) [예컨대, pH 7.0에서 용해되는 아코아트 그레이드(Aqoat Grade) 3 (신에스타 케미칼사, 일본)] 및 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP)[예컨대, 서레터릭 (Sureteric) (콜록카온사, 펜실베니아주 웨스트 포인트시 소재)]가 있다. "근본적으로 원래의"란 용어는 장용피 코팅된 정제 (환제, 캘슐 등)에 관련하여 사용되는 경우에 코팅된 정제 내에 존재하는 단백질 (즉, 조류 항독소)의 10% 미만이 약 7.0 미만의 pH에서 방출되는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 고형 투여 형태로 존재하는 조류 항독소는 정제로 이루어진다. "정제"란 용어는 적당한 희석제, 부형제, 충전제 등과 함께 또는 없이 의학 물질 (예컨대, 조류 항독소)를 함유하는 고형 투여 형태를 말한다. 정제는 형상, 크기 및 중량이 변할수 있고, 제조 방법에 따라 분류될 수 있다 (예컨대, 성형 정제, 압형 정제 등). 정제란 용어는 환제를 포괄한다.
또다른 실시양태에서, 고형 투여물 내에 조류 항독소를 함유하는 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 함유한다. PEG를 함유하는 고형 투여 형태(예컨대, 동결건조된 조류 항체 (즉, 항독소)로 이루어진 정제) 제제는 (정제의 총 중량의) 0-60% 및 보다 바람직하게 20-40% PEG를 함유할수 있다. 정제는 또한 물 (뿐만아니라 충전제, 결합제, 증점제, 착색제 등)을 함유할수 있다. 물 함량은 변할수 있으며, 정제내 물의 존재는 정제의 형성 전에 또는 중에 동결 건조된 조류 항체 제제를 취급하는 도중에 대기로부터 물의 흡수에 기인할 것이다. 정제의 형성에 바람직하다면, 물을 고형 항체 제제에 고의로 첨가할수 있다.
본발명은 또한 a) 클로스트리듐 독소 단백질에 대항해 지시된 조류 항독소로 이루어진 건조 형태의 조성물을 제공하고; 및 b) 상기 건조 조류 항독소를 정제로 조형하는 것으로 이루어진 클로스트리듐 독소 단백질에 대항하여 지시된 조류 항독소의 고형 투여 형태를 생성하는 방법을 제공한다. 정제로 건조 항독소를 조형하는 방법은 고형 항독소 제제를 정제 형태로 만들 수 있는, 항독소의 압형 또는 성형을 포함하는 임의 절차를 포괄한다. 이 기술은 건조 물질로부터 정제 형성 방법으로 널리 알려져 있다. 바람직한 실시양태로, 정제로 건조 항독소의 조형은 정제 압착을 사용한 건조 항독소의 압형에 의해 성취된다.
부가적인 실시양태에서, 조류 항독소로 이루어진 고형 투여 형태의 생성 방법은 장용피를 정제에 도포하는 단계를 추가로 포함한다. 부가적인 바람직한 실시양태로, 조류 항독소로 이루어진 고형 투여 형태를 생성하는 방법은 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 건조 항독소로 이루어진 조성물을 사용한다.
발명의 설명
본발명은 실질적으로 내독소가 없는 씨. 보툴리누스 신경독소로부터 유래된 폴리펩티드로 사람 및 기타 동물을 백신 접종하는 것을 고려한다. 상기 보툴리누스 펩티드는 또한 항독소의 생산에 유용하다. 항 보툴리누스 독소 항독소는 씨. 보툴리누스 독소의 작용으로 인한 증상에 의해 영향을 받거나 그의 위험이 있는 환자의 치료에 유용하다. 본발명의 균, 독소 및 개별 단계는 하기에 별도로 서술된다.
1. 클로스트리듐 종, 클로스트리듐 질병 및 관련 독소
본발명의 방법의 바람직한 실시양태는 클로스트리듐 종, 그의 독소, 효소 또는 기타 신진대사 산물, 세포벽 성분, 또는 이들 화합물중 임의 것의 합성 또는 재조합 변형체 대항해 항체를 얻는 것에 관한 것이다. 상기 항체들은 사람 또는 기타 동물의 면역법에 의해 생산될 것이라고 생각된다. 본발명의 특정 독소 또는 임의 종의 균으로 제한되지 않는다. 한 실시양태로, 모든 클로스트리듐 종으로부터의 독소를 면역원으로서 고려한다. 상기 독소의 실례는 낙산클로스트리듐, 씨. 솔델리이 독소 HT 및 LT의 뉴라미니다제 독소, 씨. 보툴리누스의 독소 A, B, C, D, E, F 및 G 및 다수의 씨. 페르프린젠스 독소를 포함한다. 한 바람직한 실시양태로, 씨. 다이피셀의 독소 A 및 B를 면역원으로서 고려한다. 표 2는 하기에 다양한 클로스트리듐 종, 그의 독소 및 질병과 관련된 몇몇 항원을 기재한다.
| 균 | 독소 및 질병 관련 항원 |
| 씨. 보툴리늄 | A, B, C1, C2, D, E, F, G |
| 낙산클로스트리듐 | 뉴라미니다제 |
| 씨. 다이피셀 | A, B 엔테로톡신 (A가 아니라 B임). 운동성 변경 인자. 저분자량 독소. 기타 |
| 씨. 페르프린젠스 | α, β, ε, ι, γ, δ, ν, θ, κ, λ, μ, υ |
| 씨. 솔델리이/씨, 비페르멘탄스 | HT, LT, α, β, γ |
| 씨. 노비 | α, β, γ, δ, ε, ζ, ν, θ |
| 씨. 셉티큠 | α, β, γ, δ |
| 씨. 히스토리티큠 | α, β, γ, δ, ε + 부가적인 효소 |
| 씨. 쵸비 | α, β, γ, δ |
하나의 독소에 대항해 생산된 항체는 그 독소에 대항해서만 사용되는 것은 아니다. 하나의 독소 (예컨대, 씨. 페르프린젠스 A유형 장독소)를 클로스트리듐 속의 다른 구성원 또는 기타 독소 생산 균 (예컨대, 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Strptococcus mutans), 악시네토박터 칼코아세티커스 (Acinetobacter calcoaceticus), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 기타 슈도모나스 종 등)에 의해 생산된 하나 이상의 독소(들)에 대항하여 유효 치료량으로 사용할수 있다고 생각된다. 추가로 포유 동물 막에 결합된 독소 (예컨대, 씨. 페르프린젠스 장독소 A)의 부분에 대항해 지시된 항체도 또한 기타 균에 대항해 사용될수 있음을 고려한다. 상기 막결합 영역은 합성에 의해 생산되고 면역원으로서 사용될수 있다.
II. 비포유동물 내에서 항체 수득
항체를 얻기 위한 본발명의 방법 중 바람직한 실시양태는 면역법을 포함한다. 그러나, 또한 항체가 면역법 없이 비포유동물로부터 얻어질수 있음을 고려한다. 면역법이 고려되지 않는 경우에, 독소에 대해 미리 존재하는 항체를 갖는 비포유동물 뿐만아니라 본발명은 투여된 항원과의 반응에 의해 전체 균에 대한 항체를 갖는 비포유동물을 사용할수 있다. 후자의 실례로는 전체 균 성분과 에피토프를 공유하는 합성 펩티드 또는 재조합 단백질을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본발명의 방법은 세균 독소을 사용한 비포유동물의 면역법을 고려한다. 본발명은 임의 특정 독소에 제한되지 않는다. 한 실시양태로, 모든 클로스트리듐 원천으로부터의 독소 (표 2 참조)를 면역원으로서 고려할수 있다. 상기 독소의 실례는 낙산클로스트리듐 뉴라미니다제 독소, 씨. 보툴리누스의 독소 A, B, C, D, E, F 및 G, 씨. 페르프린젠스 독소 α, β, ε 및 ι, 및 씨. 솔델리이 독소 HT 및 LT를 포함한다. 바람직한 실시양태로, 씨. 다이피셀 독소 A 및 B가 면역원으로 고려된다.
특히 바람직한 실시양태는 분자 생물학적 수단 (즉, 재조합 독소 단백질)에 의해 생산된 세균 독소 단백질 또는 독소 단백질의 단편의 사용을 포함한다. 바람직한 실시양태로, 면역원은 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 씨. 다이피셀 독소 A의 인터벌 6으로 이루어진다. 또다른 바람직한 실시양태로, 면역원은 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 씨. 다이피셀 독소 B의 인터벌 3으로 이루어진다. 재조합 씨. 다이피셀 독소 단백질은 별도의 면역원으로서 또는 병용하여 씨. 다이피셀 독소 A, 씨. 다이피셀 독소 B 또는 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 모두에 대한 특이 항체를 생산할수 있다. 특히, 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 단백질은 함께 혼합될수 있고 단일한 면역원으로 사용될 수 있다. 별법으로, 씨. 다이피셀 독소 A 단백질은 제1 피검 대상에서 면역원으로서 별도로 사용될 수 있다. 유사하게, 씨. 다이피셀 독소 B 단백질은 제2 피검 대상에서 면역원으로서 별도로 사용될 수 있다. 씨. 다이피셀 독소 A 단백질 또는 씨. 다이피셀 독소 B 단백질로써 두 개의 별개 피검 대상을 별개로 면역시켜 생산된 항독소를 병용하여 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 모두에 대항해 지시된 항독소를 생성할 수 있다.
본원에 제공된 재조합 씨. 다이피셀 독소 단백질은 단일 씨. 다이피셀 독소에 대한 특이 항체 (즉, 단특이 항체)를 생산할 수 있게 한다. 이는 천연 원천으로부터의 씨. 다이피셀 독소 A의 생화학적 정제가 면역학적으로 유의한 양의 독소 B로써 오염된 독소 A 제제의 단리를 변함없이 결과하는 반면에; 유사하게 천원 원천으로부터의 씨. 다이피셀 독소 B의 생화학적 정제는 면역학적으로 유의한 양의 독소 A로 오염된 독소 B 제제의 단리를 결과한다는 것이다. 비재조합 독소 A 및(또는) 독소 B의 제제가 독소 B 또는 A로 교차 오염되기 때문에, 동물의 면역법은 두 독소 A 및 B에 대항해 반응성인 폴리클론성 항체의 생산을 결과할 것이다.
섹션 VI에서 하기에 논의되는 바와 같이, 시료내 씨. 다이피셀 독소 A 및(또는) B의 존재에 대한 정확한 탐지는 독소 A 및 B의 순수한 제제의 이용성 및 단특이적 항체의 이용성을 필요로 한다. 따라서 재조합 씨. 다이피셀 독소 단백질을 사용하면 개개의 씨. 다이피셀 독소 뿐만아니라 씨. 다이피셀 균의 정확한 탐지에 사용될수 있는 폴리클론성 항체 제제의 생산이 가능하게 된다.
면역법을 사용하는 경우에, 바람직한 비포유동물은 조류로부터이다. 모든 새가 고려된다 (예컨대, 오리, 타조, 에뮤, 칠면조 등). 바람직한 새는 닭이다. 중요하게, 닭 항체는 포유동물의 보체를 고정하지 않는다. [참조, H.N. Benson et al., J. Immunol. 87:616(1961).]. 따라서, 닭 항체는 보통 보체 의존성 반응을 야기하지 않을 것이다. [A.A. Benedict and K. Yamaga, 비교 면역학 중의 "조류 종 내 면역글로불린 및 항체 생산" (J.J. Marchalony, ed.), 335-375페이지, 옥스포드 블랙웰 소재 (1966)]. 따라서, 본발명의 바람직한 항독소는 현재 공지된 항독소에서 관찰되는 보체 관련 부작용이 나타나지 않을 것이다.
새가 사용되는 경우에, 항체는 새 혈청 또는 달걀로부터 얻어질 것이라고 생각된다. 바람직한 실시양태는 달걀로부터 항체의 수집을 포함한다. 알을 낳는 암탉은 면역글로불린을 혈청에서 발견되는 것과 동일하거나 초과하는 농도로 달걀 노른자 ("IgY")에 운송한다. [참조, R. Patterson et al., J. Immunol. 89:272 (1962); 및 S.B. Carroll 및 B.D. Stollar, J. Biol. Chem. 258:24 (1983)]. 게다가, 대량 생산된 달걀 노른자의 큰 용적이 임의 주어진 기간에 걸쳐 새로부터 안전하게 얻어질 수 있는 혈청의 용적을 초과한다. 마지막으로, 달걀로부터의 항체는 더 순수하고 보다 균질하다; (혈청에 비하여) 훨씬 더 적은 비면역글로불린 단백질이 있고 단지 한 부류의 면역글로불린이 노른자에 운송된다.
독소에 의한 면역법를 고려한다면, 독성을 감소시키기 위한 독소의 변성을 고려할 수 있다. 이에 관련하여, 본발명은 변성 독소에 의한 면역법에 제한되지 않는다. 비변성 ("천연") 독소도 또한 면역원으로서 고려된다.
또한 본발명은 변성이 사용된다면, 변성 유형에 의해 제한되지 않는다. 본발명은 독소의 화학처리 및 열처리를 포함하는 모든 유형의 독소 변성을 고려한다. 그러나, 바람직한 변성은 포름알데히드 처리이다.
본발명은 특정 면역법 방식에 제한되지 않으며; 본발명은 피하, 근육내, 복강내 및 정맥내 또는 동맥내 주사, 뿐만아니라 면역원의 경구 투여를 포함하는 모든 면역법 방식을 고려한다.
본발명은 추가로 보조제를 사용한 또는 사용하지 않는 면역법을 고려한다. (보조제는 다른 항원과 함께 투여될 때 다른 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 것으로 공지된 물질로서 정의된다). 보조제가 사용된다면, 본발명은 임의 특정 유형의 보조제에 제한되지 않으며, 또는 한번 사용되면 항상 동일한 보조제가 사용되는 것도 아니다. 본발명은 모든 유형의 보조제를 고려하며, 별도로 또는 병용하여 사용할 수 있고, 바람직한 보조제의 사용법은 불완전 프로인트 보조제와 함께 때때로 나중에 이어지는 완전 프로인트 보조제의 사용이다. 또다른 바람직한 보조제의 사용은 게르부 보조제(Gerbu Adjuvant)의 사용이다. 본발명은 또한 RIBI 조류 보조제 및 퀴일 (Quil) A 보조제의 사용을 고려한다.
면역법이 사용되는 경우에, 본발명은 매우 다양한 면역법 스케줄을 고려한다. 한 실시양태로, 닭에게 0일째에 독소(들)을 투여하고 이어서 그후에 간격을 두고 독소(들)을 투여한다. 본발명은 특정 간격 또는 투여량에 제한되지 않는다. 유사하게, 본발명은 임의 항체 수집 스케줄에 제한되지 않는다. 바람직한 수집 시간은 100일 후 때때로 이다.
새를 사용하고 달걀 수집에 의해 항체 수집을 수행하는 경우에, 달걀은 항체 가공처리 전에 저장될수 있다. 달걀을 4℃에서 1년 미만 동안 저장하는 것이 바람직하다.
이 방식으로 생산된 닭 항체는 완충액으로 추출되어 분석에 사용될수 있다. 미정제된 동안, 이 제제는 부가적인 조작 (예컨대, 면역친화성 정제) 전에 항체의 활성에 대한 기준으로 사용될 수 있다.
III. 항체의 효과 증가
정제를 사용하는 경우에, 본발명은 비포유동물 항독소 및 포유동물 항독소 모두의 효과를 증가시키기 위한 정제를 고려한다. 특히, 본발명은 독소 반응성 면역글로불린의 퍼센트 증가를 고려한다. 바람직한 조류 항체에 대한 정제법은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분리이다.
본발명은 조류 항체를 먼저 간단하고 값싼 절차를 사용하여 정제하는 것을 고려한다. 한 실시양태로, 달걀로부터의 닭 항체는 추출 및 PEG에 의한 침강에 의해 정제시킬 수 있다. PEG 정제는 고농도 PEG 8000 중에서 지질 (달걀 노른자에 풍부) 및 노른자 단백질의 상이한 용해도를 이용한다. [Polson et al., Immunol. Comm. 9:495 (1980)]. 이 기술이 신속하고, 간단하고 비교적 값싸며 포유동물 혈청 및 말 항체로부터의 필적하는 황산암모늄 분획 보다 비면역글로불린 단백질의 면에서 상당히 더 순수한 면역글로불린 분획을 생성한다. 대부분의 PEG는 에탄올로 처리하여 침강된 닭 면역글로불린으로부터 제거된다. 사실, PEG-정제된 항체는 본발명에서 중독된 사람 및 동물의 수동 면역법에 상기 PEG-정제된 항독소의 사용을 고려하기에 충분할 정도로 순수하다.
본발명은 추가로 고형 형태의 항독소를 장용피 코팅하여 항독소로 이루어진 조성물의 효과를 증가시켜 하기 섹션 IV(C)에 더 논의되는 바와 같이 위장관 내에서 항독소의 생존성 (즉, 장 안전성)을 향상시키는 것을 고려한다.
IV. 치료
본발명은 세균 독소에 의해 중독된 사람 및 기타 동물에 대한 항독소 치료법에 관한 것이다. 바람직한 치료 방법은 항독소의 경구 투여에 의한 것이다. 또다른 바람직한 치료 방법은 항독소의 비경구 투여에 의한 것이다.
A. 치료 제제 및 조합물
본발명은 항독소의 치료 조성물을 사용하는 것을 고려한다. 본발명의 항독소 조성물은 고형 또는 액상 형태의 항독소로 이루어질수 있다.
본발명은 치료 제제의 특정 성질에 의해 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 조성물은 약리학적 허용 액체, 겔 또는 고형 담체, 희석제, 보조제 및 부형제와 함께 제공될수 있다. 게다가, 항독소는 항생물질을 포함하는 기타 치료 제제와 함께 사용될수 있다.
상기 주의된 바와 같이, 상기 치료 제제는 가축과 같은 수의학적 용도로 포유동물에게, 및 기타 치료 제제와 유사한 방식으로 사람에게 임상적 용도로 투여될수 있다. 일반적으로, 치료 효과에 필요한 투여량은 사용 유형 및 투여 방식 뿐만아니라 개별 숙주의 특정 요구사항에 따라 변할 것이다.
투여 방식에 대해서는, 항독소는 경구, 정맥내, 복강내, 근육내 또는 초내 투여에 사용될수 있다. 상기 투여를 위한 배합물은 무균수 또는 생리염수 중 유효량의 항독소로 이루어질수 있다.
한편, 배합물은 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토오즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등의 결합제, 충전제, 담체, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제 및 부형제와 같이 보통 사용되는 첨가제를 함유할수 있다. 상기 조성물의 전형적으로 활성 성분을 1% 내지 95%, 바람직하게 2% 내지 70%를 함유한다.
상기 조성물은 바람직하게 액상 용액 또는 현탁액으로서 경구 투여용으로 제조되는 것이 바람직하고; 투여 전에 액상의 용액 또는 현탁액으로 하기에 적당한 고형 형태를 포함하는 고형 형태도 또한 제조될수 있다. 항독소의 고형 형태는 추가로 장용피를 포함할수 있다. 또한 조성물은 바람직하게 주사가능한 액상 용액 또는 현탁액으로 제조하는 것이 바람직하고; 투여 전에 액상의 용액 또는 현탁액으로 하기에 적당한 고형 형태로도 제조될수 있다.
본발명의 항독소는 종종 약리학적으로 허용되고 사용가능한 희석제 또는 부형제와 함께 혼합된다. 적당한 희석제 및 부형제는 예컨대 물, 염수, 영양 배합물 (예컨대, 인슈어(Ensure)(등록상표), 엔파밀(Enfamil)(등록상표) 등) 덱스트로스, 글리세롤 등 및 그의 조합물이다. 게다가, 원한다면, 조성물은 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충 제와 같은 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다.
B. 항독소의 투여
배경으로부터 말과 같은 큰 동물에게서 보통 생산된 현재 시판 중인 항독소를 투여할 때 균형이 맞아야만 하고; 독소를 중화하기에 충분한 항독소가 투여되나, 부적당한 부작용의 위험을 증가시킬 만큼 많은 항독소가 투여되지 않아야만 함이 주지되었다. 이러한 부작용은 i) 외래 (예컨대, 말) 단백질에 대한 환자의 감작; ii) 비면역글로불린 단백질의 과민증 또는 면역원 성질; iii) 포유동물 항체의 보체 고정 성질; 및(또는) iv) 투여된 외래 단백질의 전체 적재량에 의해 야기된다. 상기 지적된 바와 같이 중독 정도 (및 따라서 필요한 항독소 치료의 수준)이 단지 대략적일 경우에 이러한 균형을 맞추기가 극히 어렵다.
본발명은 이 균형이 보다 용이하게 성취되도록 부작용을 상당히 감소시키는 것을 고려한다. 본발명에 따른 치료는 새로부터의 PEG-정제된 항독소를 사용하여 부작용을 감소시키는 것을 고려한다.
한 실시양태로, 본발명의 치료는 새로부터의 PEG-정제된 항독소의 사용을 고려한다. 노른자-유래의 PEG-정제된 항체를 항독소로서 사용하면 1) 비(포유동물)-보체-고정 조류 항체; 2) 비-면역글로불린 단백질의 더 적은 이질적 혼합물; 및 3) 현재 시판 중인 항독소내에 존재하는 활성 항체의 동등량을 전달하는데 더 적은 총 단백질의 투여를 허용한다. 항독소의 비포유동물원은 말 또는 기타 포유동물 형청에 민감한 환자를 치료하는데 사용될수 있다.
보툴리누스 중독의 경우에 사실인 것처럼, 씨. 다이피셀 독소에 대한 개체의 노출 정도 및 예측은 종종 추정하기 어렵고, 다수의 요인 (예컨대, 접종량, 수반된 씨. 다이피셀 균주의 독성 및 혈청형 등)에 좌우된다. 따라서, 환자의 임상적 표현이 보통 항독소 투여시 투여량의 결정을 위한 정량 진단 시험 보다 더 중요하게 고려된다. 사실, 많은 독소 관련 질병 (예컨대, 보툴리누스 중독, 파상풍, 설사증 등)의 경우에, 독소 또는 균의 존재를 탐지하는 신속하고, 정량적인 시험법이 없다. 오히려, 이 독소 관련 질병은 급한 치료를 필요로 하는 의학적인 응급상황이다. 병에 걸린 환자의 상태가 신속하게 악화되기 때문에, 병인원의 확인 및 치료법의 설정이 지연되지 않아야 한다. 항독소를 사용한 초기 치료에 더하여, 환자의 질병이 진전되면 후속의 투여가 지시될수 있다. 후속 투여의 투여량 및 시기는 각 개별 환자의 질병의 신호 및 증상에 따라 좌우된다.
항독소가 비경구로 투여되는 경우에, 병에 걸린 개인에게 항독소의 투여가 면역글로불린 약 10ml 투여량 (총 단백질의 약 1그램 미만)의 초기 주사를 수반하는 것을 고려한다. 한 바람직한 실시양태에서, 초기 주사의 50% 이상이 면역 글로불린으로 이루어지는 것을 고려한다. 또한 초기 주사의 약 90%가 면역 글로불린으로 이루어진 보다 정제된 면역 글로불린을 치료에 사용하는 것을 고려한다. 보다 정제된 면역글로불린 (예컨대, 정제 IgY)를 사용하는 경우에, 총 단백질이 약 100 밀리그램 미만일 것을 고려한다. 또한, 씨. 다이피셀 관련 질병과 관련된 신호 및 증상 진전에 따라 부가적인 투여가 주어짐을 고려한다.
항독소가 경구로 투여되는 경우에, 병에 걸린 개체에게 항독소의 투여가 약 50 gm의 항독소 및 바람직하게 약 4-5 gm의 항독소로 이루어진 치료 조성물의 투여로 이루어진 치료 과정 (즉, 초기 및 후속 투여)를 수반함을 고려한다.
C. 항독소의 전달
전달 경로를 제한하고자 하는 것을 아니나, 본발명은 항독소의 전달이 비경구 또는 경구인 세균 중독의 항독소 치료 방법을 고려한다.
한 실시양태에서, 항독소는 수용액으로 피검 대상에게 비경구 투여된다. 이는 비경구 투여를 특정 경로로 제한하고자하는 것은 아니다. 사실, 모든 비경구 투여 경로를 사용할수 있음을 고려한다. 한 실시양태로, 비경구 투여는 근육 주사에 의해 성취된다. 또다른 실시양태로, 비경구 투여는 정맥 주사에 의해 성취된다.
한 실시양태로, 항독소는 고형 형태 (예컨대, 정제, 캡슐)로 전달된다. 대안적인 실시양태로, 항독소는 수용액으로 전달된다. 수용액이 사용되는 경우에, 용액은 항체 단백질을 용해시키기에 충분한 이온 강도를 가지며, 여전히 경구 투여에 적당하게 된다. 또한 전달 용액은 항체가 경구 투여되는 경우에 위산을 중화할수 있고 항체를 안정화할수 있도록 완충될수 있다 (예컨대, 탄산염 완충액 pH 9.5). 한 실시양태에서, 전달 용액은 수용액이다. 또다른 실시양태에서, 전달 용액은 음식물 제형이다. 바람직하게, 전달 용액은 유아용 제형이다. 또다른 실시양태로 내측에 내산성 화합물로 캡슐화 또는 마이크로캡슐화된 동결건조 항체의 전달을 고려한다.
제약 화합물에로 장용피를 코팅하는 방법은 당업게에 널리 공지되어 있다 [제약 화합물의 코팅에서 특수한 동반물이 이용가능함; 예컨대 더 코팅 플레이스 (위스콘신주 버로나 소재) 및 AAI (뉴캐슬주 윌밍톤 소재)]. 위액에 내성이고 pH에 의존하여 방출되는 (즉, 제약 화합물을 방출하도록 코팅이 용해되는) 장용피는 시판중이다 [예컨대, 폴리메타크릴레이트 유드라기트(등록상표) L 및 유드라기트(등록상표) S (롬 게엠베하)]. 유드라기트(등록상표) S는 pH 7.0으로부터의 장액에 용해성이고; 이 코팅을 사용하여 동결건조된 항독소 항체를 마이크로캡슐화할수 있고, 경구 투여를 위하여 입자를 pH 7.0 초과 또는 미만의 용액 중에 현탁시킨다. 미세입자는 원래대로 남아있고 장내 pH가 미세입자를 용해시켜 이로써 항독소를 방출하는 장에 도달할 때까지 용해되지 않는다.
본발명은 치료 항독소의 장내 안정성의 개선에 관한 것이다 [장내 안정성은 위장관을 통한 통과 중에 항독소의 안정도로서 정의되고; 장내 안정도는 기능성 또는 활성 형태로 원하는 부위 (즉, 장)에 전달되는 경구 투여된 항독소의 양을 증가시킴으로서 개선된다]. 항체, 및 구체적으로 조류 항체는 산성 용액 (예컨대, 위액)에 노출된 때 상당히 변성되는 것으로 알려져 있다. 항체의 변성은 기능의 손실 (즉, 특정 부위에 결합하는 능력의 손실)을 초래한다. 위장관의 부분에서 발견되는 낮은 pH로 인한 항체의 변성에 더하여, 항독소의 단백질 분해 붕괴가 효소의 소화에 의해 발생할수 있다. 본발명은 항독소를 장용피로 코팅함으로써 치료 항독소의 장내 안정성을 개선한다. 장용피는 항독소의 산-유발성 변성을 막고 위장관의 상부에 존재하는 효소에 항독소가 노출되는 것을 막는다.
여기서는 자극받은 장내 용액에서의 방출을 허용하는 한편, 자극받은 위내 용액에 마이크로캡슐화된 항독소 (예컨대, 장용피 코팅된 항독소)의 방출을 막기 위해 내산성 장용피의 도포가 제시된다. 또한 치료 항독소의 장내 생존은 부형제 (희서제로서 치료 화합물에 첨가되거나 화합물이 정제 형태로 제공되는 경우에 형태 또는 점조도를 부여하는 다소 불활성인 물질)의 사용을 통하여 개선될수 있다. 약 pH 9.5의 탄화물 완충액 또는 영양 배합물 (예컨대, 인슈어(등록상표), 엔파밀 (등록상표) 등)과 같은 부형제는 위 pH를 상승시키거나 위 효소에 의한 변성을 길항하는 부가적인 단백질을 제공하여 항독소의 변성을 간접적으로 감소시킬 수 있다. 반면에, 항독소 조성물 상에 장용피의 사용은 입자가 염기성 pH를 갖는 장액에 도달할 때까지 장용피로 코팅된 입자로부터 항독소가 방출하는 것을 막음으로써 위내에서 항독소의 변성 또는 소화를 직접적으로 막는다. 장용피를 사용하는 것이 본발명의 치료 항독소의 산 안정성을 개선시키는 특히 바람직한 수단이다.
본발명은 급성 중독의 치료용으로 투여될수 있는 치료 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 항독소는 치료 투여량의 전달 용액으로 또는 정제 형태로, 항독소에 대한 면역원으로서 작용하는 세균 독소에 의해 중독된 피검 대상에게 경구 투여된다.
본발명은 또한 예방 투여될수 있는 치료 방법을 고려한다. 한 실시양태로, 항독소는 항독소의 생산을 위한 면역원으로서 작용하는 세균 독소에 의해 개체의 중독을 예방하기 위해 피검 대상에게 치료 투여량의 전달용액으로 경구 투여된다. 또다른 실시양태로, 항독소는 정제 또는 마이크로캡슐화된 입자와 같이 고형 형태로 경구 투여된다. 넓은 범위의 pH 단위에서 용해하는 유드라기트(등록상표) (롬 테크, 인크)와 같은 화합물 또는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 동결건조된 항체를 마이크로캡슐화하면 정제 투여를 견딜수 없는 수용자 (예컨대, 어린이 또는 급식 튜브를 한 환자)에게 고형 항독소를 액상 형태 (즉, 현탁액)로 경구 투여할 수 있게 된다. 바람직한 실시양태로, 동결건조된 항체는 유드라기트(등록상표 L30D (롬 테크, 인크)로 코팅된다. 한 바람직한 실시양태로, 피검 대상은 어린이이다. 또다른 실시양태로, 전체 세균 균에 대항해 발생된 항체가 치료학적 투여량의 전달 용액으로 피검 대상에게 경구 투여된다.
V. 클로스트리듐 종에 대항한 백신
본발명은 몇몇의 클로스트리듐 종에 대항하여 동물 (특히 사람)의 방어를 위한 일가 및 다가 백신의 생성을 고려한다. 사람에게서 씨. 다이피셀, 파상풍균 및 씨. 보툴리누스에 대한 액소성 면역 반응의 생산을 자극하는 백신이 특히 관심이 있다. 백신 제제를 구성하는 항원은 상기 기재된 클로스트리듐 종으로부터의 천연 또는 재조합 생산된 독소일 수 있다. 독소 단백질이 면역원으로서 사용되는 경우에 일반적으로 독성을 감소시키도록 변성된다. 이러한 변성은 화학적 또는 유전학적 (즉, 재조합 DNA 기술) 수단에 의해서 일 수 있다. 일반적으로, 유전학적 독성제거 (즉, 숙주 세포내 비독성 단편의 발현)가 바람직한 데, 이는 비독성 단편의 숙주 세포내 발현이 최종 제제내 원래의 활성 독소의 존재를 배제하기 때문이다. 그러나, 화학적 변성을 원하는 경우에, 바람직한 독소 변성법은 포름알데히드 처리이다.
본발명은 재조합 씨. 다이피셀 독소 단백질이 일가 및 다가 백신 제제에서 항원으로서 사용되는 것을 고려한다. 용해성의 실질적으로 내독소가 없는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 또는 독소 B 단백질은, 단독으로 또는 상기 일가 및 다가 백신의 제조를 위한 항원으로서 씨. 보툴리누스, 씨. 다이피셀 및 파상풍균으로부터의 재조합 또는 천연 독소 또는 톡소이드와 함께 사용될 수 있다. 씨. 보툴리누스 및 파상풍균 독소 단백질의 구조적 상동성 때문에 씨. 다이피셀 및 보툴리누스 독소 단백질 (천연 또는 재조합 또는 그의 혼합물)로 이루어진 백신을 사용하여 씨. 보툴리누스, 파상풍균 및 씨. 다이피셀에 대항한 면역 반응을 자극하는 것을 고려한다.
화학적 또는 유전학적으로 독성제거된 독소와 같이 면역성을 부여하는 비독성 제제로써 씨. 다이피셀 독소에 노출될 위험이 있는 피검 대상을 면역시켜 상기 독소의 해로운 결과를 피할 수 있다.
하나 이상의 A 및 B유형 독소에 대항해 면역을 부여하는 백신은 씨. 다이피셀 독소의 유해 작용으로부터 사람을 포함하는 동물을 방어하는 수단으로서 유용할 것이다. 피검 대상 내에서 중화 항체를 생성하는 하나 이상의 씨. 다이피셀 독소로 이루어진 조성물로 피검 대상을 면역시킬 수 있다. 씨. 다이피셀 독소 A 및 B에 대항해 지시된 중화 항체를 생산하도록, 씨. 다이피셀 독소 A 단백질로 이루어진 제1 면역원으로 피검 대상을 면역시킨 후에, 씨. 다이피셀 B 독소 단백질로 이루어진 제2 면역원을 별도로 면역시킬 수 있다. 대안적으로, 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 단백질로 이루어진 단일 면역원으로 피검 대상을 면역시킬 수 있다.
일반적으로, 포름알데히드, 글루타르알데히드 또는 과산화수소와 같은 제제를 사용하여 세균 독소를 화학적으로 독성제거하는 것은 백신 또는 항독소의 생성에 최적은 아니다. 지나치게 많거나 지나치게 적은 화학적 변성 사이의 섬세한 균형이 맞아야 한다. 처리가 불충분하면, 백신은 잔류 독성을 보유할 것이다. 처리가 지나치게 과도하면, 백신은 천연 면역원 결정 인자의 파괴로 인해 효능이 감소할 것이다. 항독소 또는 백신의 생성을 위해 보툴리누스 톡소이드를 사용하는데 대한 또다른 주요한 제한 요인은 높은 생산 비용이다. 상기 이유 때문에, 비독성이나 면역원인 씨. 다이피셀 독소 단백질의 생산 방법의 개발이 필요하다.
재조합 씨. 다이피셀 독소 단백질은 이. 콜라이와 같은 숙주 세포 내에서 용해성 또는 불용성 형태로 생산된다. 불용성 재조합 단백질은 봉입체 내에서 발견된다. 봉입체 단백질은 정제 및(또는) 숙주에로의 투여 전에 용해성이 되어야 한다. 이 용해도를 성취하기 위해 필요한 봉입체 단백질의 가혹한 처리는 정제 단백질의 면역원성을 감소시킬수 있다. 이상적으로, 백신으로서 사용되는 재조합 단백질은 이. 콜라이 또는 기타 숙주 세포내에서 고 수준 (즉, 총 세포질 단백질의 약 0.75% 이상)으로 용해성 단백질로서 발현된다. 이는 고정제 형태 (즉, 실질적으로 내독소 또는 기타 발열물 오염이 없는) 면역원의 충분한 양의 생산 및 단리를 용이하게 한다. 이러한 이. 콜라이 내에서 용해성 단백질로서 재조합 독소 단백질을 발현하는 능력은 곤충 또는 포유동물 조직 배양 세포에 비하여 증식 비용이 저가이므로 이롭다.
본발명은 경제적인 숙주 세포 (예컨대, 이. 콜라이)에서 생산된 용해성 씨. 디이피셀 독소 단백질을 제공한다. 추가로, 사람 및 기타 동물의 면역에 적당한 정제된 용해성 씨. 다이피셀 독소 단백질의 단리 방법이 제공된다. 씨. 다이피셀 독소 단백질의 이러한 용해성의 정제된 제제는 개선된 백신 제제의 기초를 제공하고 항독소의 생산을 용이하게 한다.
그람 음성 세균 (예컨대, 이. 콜라이)에서 생산된 재조합 클로스트리듐 독소 단백질을 백신으로서 사용하는 경우에, 숙주 동물에 투여하기 전에 정제하여 내독소를 제거한다. 숙주에게 백신 접종하기 위하여, 면역원으로 유효량의 정제된 실질적으로 내독소가 없는 재조합 클로스트리듐 독소 단백질은 당업계에 공지된 다수의 약리학적으로 허용가능한 담체 중에 투여된다. 백신 접종을 목적으로 투여하는 경우에, 정제된 실질적으로 내독소가 없는 재조합 클로스트리듐 독소 단백질은 칼륨 명반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 게르부 보조제 (GMDP; C.C. 바이오테크 코포레이션), RIBI 보조제 (MPL:RIBI 임뮤노케미칼 리서치, 인크.), QS21 (캠브리지 바이오테크)를 포함하는 공지의 보조제와 함께 또는 단독으로 사용될수 있다. 백신을 사람에게 투여하는 경우에 명반 및 알루미늄 기재 보조제가 특히 바람직하다. 면역법 경로는 코로, 경구로, 근육내로, 복강내로 또는 피하로 일수 있다.
본발명은 백신으로서 씨. 다이피셀 독소 A 및 B의 부분으로 이루어진 용해성의, 실질적으로 내독소가 없는 융합 단백질 제제의 사용을 고려한다. 한 실시양태에서, 백신은 씨. 다이피셀 독소의 부분 및 폴리-히스티딘 트랙 (또한 히스티딘 표지로 불림)로 이루어진다. 특히 바람직한 실시양태로, 씨. 다이피셀 독소의 부분 및 폴리-히스티딘 트랙으로 이루어진 융합 단백질은 발현 벡터의 pET 시리즈 (노바겐)을 사용하여 발현시킨다. pET 발현계는 융합 단백질을 코딩하는 T7 프로모터를 함유하는 벡터 및 T7 DNA 폴리머라제를 발현하도록 유도될 수 있는 숙주세포 (즉, DE3 숙주 균주)를 사용한다. 히스티딘 트랙을 함유하는 씨. 다이피셀 독소 융합 단백질의 생산은 특정 발현 벡터 및 숙주 균주의 사용에 제한되지 않는다. 몇몇 시판되는 발현 벡터 및 숙주 균주를 사용하여 히스티딘 트랙을 함유하는 융합 단백질로써 씨. 디이피셀 단백질 서열을 발현할 수 있다 (예컨대, 숙주 균주 M15[pREP4] (퀴아겐) 및 SG13009[pREP4] (퀴아겐)과 함께 사용되는 발현 벡터들의 pQE 시리즈 (pQE-8, 12, 16, 17, 18, 30, 31, 32, 40, 41, 50, 51, 52, 60 및 70) (퀴아겐)를 사용하여 융합 단백질의 아미노 말단에 6개 히스티딘 잔기를 갖는 융합 단백질을 발현할수 있다.
VI. 독소의 탐지
본발명은 시료내 세균 독소의 탐지법에 관한 것이다. 본 명세서 및 청구범위에서 "시료"란 용어는 넓은 의미로 사용된다. 한편, 이는 표본 또는 배양물을 포함하여 의미한다. 다른 한편으로, 이는 생물학적 및 환경적 시료 모두를 포함하여 의미한다.
생물학적 시료는 사람을 포함하는 동물, 체액, 고형물 (예컨대, 대변) 또는 조직 뿐만아니라 액상 및 고형 식품 및 낙농 항목, 야채, 육류 및 육류 부산물, 및 폐기물과 같은 성분들일수 있다. 환경적 시료는 표면 물질, 토양, 물 및 산업상 시료, 뿐만아니라 식품 및 낙농 가공 도구, 장치, 장비, 용구, 일회용 및 비일회용 항목으로부터 얻어진 시료와 같은 환경적 물질을 포함한다. 상기 예는 본발명에 해당하는 시료형을 제한하는 것은 아니다.
상기 섹션 IV에서 논의된 바와 같이, 독소 관련 질병은 급한 치료를 필요로하는 의학 응급 상아황이다. 현존하는 방법이 씨. 다이피셀 독소 또는 균의 존재에 대한 신속하고 정량적인 시험을 제공하지 못하기 때문에, 존재하는 독소 또는 균의 양 또는 성질을 측정하기 전에 씨. 다이피셀 관련 질병으로 추정되는 피검 대상을 치료하기 시작한다. 씨. 다이피셀 독소 또는 균에 대한 신속하고 정량적인 시험이 이용가능하다면, 치료 화합물의 투여량을 중독된 피검 대상에게 최대의 효과를 제공하도록 조정할수 있을 것이다. 본발명의 특이성 항-씨. 다이피셀 독소 A 및 B 항체 및 정제된 재조합 씨.다이피셀 독소 A 및 B 단백질은 씨. 다이피셀 독소 또는 균에 대한 신속하고 정량적인 시험을 가능하게 한다.
본발명은 재조합 독소 A 및 독소 B 단백질, 재조합 세균 독소 단백질에 대항해 발생된 항체를 사용하는 길항 면역검정 방법에 의해 세균 독소를 탐지하는 것을 고려한다. 재조합 독소 단백질의 특정 고정량을 고형 지지체 (예컨대, 마이크로타이터 플레이트)에 고정시키고, 이어서 세균 독소를 함유하는 것으로 추정되는 생물학적 시료를 첨가한다. 생물학적 시료를 먼저 재조합 독소 단백질에 대항해 지시된 친화성 정제 또는 PEG 분획된 항체와 혼합한다. 그 다음, 고정된 독소 단백질에 결합된 항체의 존재를 탐지할 수 있는 레포터 시약을 첨가한다. 레포터 물질은 레포터 물질의 존재를 확인하는데 사용되는 분자에 부착된 항독소에 대한 결합 특이성을 갖는 항체로 이루어질수 있다. 독소가 시료내에 존재한다면, 이 독소는 항-재조합 항체에 결합하기 위한 고정된 재조합 독소 단백질과 길항하여 레포터 시약의 첨가 후에 얻어진 시그날을 감소시킬 것이다. 항체가 시료와 혼합되지 않은 대조를 사용한다. 이는 최고 또는 (기준) 시그날을 제공한다.
본발명은 또한 재조합 세균 독소 단백질에 대항해 지시되는 항체를 사용하는 "샌드위치" 면역검정법에 의한 세균 독소의 탐지를 고려한다. 재조합 세균 독소 단백질에 대항해 지시된 친화성 정제된 항체는 고형 지지체 (예컨대, 마이크로타이터 플레이트)에 고정된다. 세균 독소를 함유하는 것으로 추정되는 생물학적 시료를 첨가한 다음 실질적으로 모든 비결합 항독소를 제거하는 세척 단계가 있다. 그 다음 생물학적 시료를 레포터 물질에 노출시키는 데, 상기 레포터 물질은 항독소에 결합되고, 그 다음 실질적으로 모든 비결합 레포터 물질이 없도록 세척한다. 레포터 물질은 레포터 물질의 존재를 확인하는 데 사용되는 분자에 부착된 항독소에 대한 결합 특이성을 갖는 항체로 이루어진다. 생물학적 조직내 레포터 물질의 확인은 세포 독소의 존재를 나타낸다.
또한, 세균 독소에 대항해 지시된 고정 항체 상에 액체 (예컨대, 수프 및 기타 유체 식품 및 사람 및 기타 동물에 대한 영양 보충물을 포함하는 공급물)을 부음으로써 세균 독소를 탐지하는 것을 고려한다. 고정 항체가 카트리지, 칼럼, 비드 또는 임의 기타 고형 지지체 매체로서 지지체내에 또는 상에 존재할 것이라고 생각된다. 한 실시양태로, 상기 액체를 고정 항체에 노출시킨 후에, 비결합 독소는 세척에 의해 실질적으로 제거된다. 그다음 액체의 노출물을 결합 독소의 존재를 탐지하는 레포터 물질에 노출시킨다. 바람직한 실시양태로, 레포트 물질은 효소, 형광 염료, 또는 독소에 대항해 지시되는 항체에 부착되는 방사성활성 화합물(즉, "샌드위치" 면역검정에서)이다. 또한 탐지 시스템이 필요에 따라 (예컨대, 효소계내 효소 기질의 첨가; 형광 염료계에 대한 형광성 광을 사용하는 관찰; 및 방사성활성계에 대한 방사성활성의 정량화) 개발될 것임을 고려한다.
실험
하기 실시예는 본발명의 특정 바람직한 실시양태 및 측면을 예시하며 그의 범위를 제한하는 것은 아니다.
하기 기재 사항에서, 하기 약자는 다음의 의미이다: ℃ (섭씨); rpm (분 당 회전수); BBS-트윈(Tween) (트윈을 함유하는 보론산염 완충 염수); BSA (소 혈청 알부민); ELISA (효소결합 면역흡착 검정); CFA (완전 프로인트 보조제); IFA (불완전 프로인트 보조제); IgG (면역글로불린 G); IgY (면역글로불린 Y); IM (근육내); IP (복강내); IV (정맥내 또는 동맥내); SC (피하내); H2O (물); HCl (염산); LD100 (실험 동물의 100% 치사 투여량); aa (아미노산); HPLC (고성능 액상 크로마토그래피); kD (킬로달톤); gm (그램); ㎍ (마이크로그램); mg (밀리그램); ng (나노그램); ㎕ (마이크로리터); ㎖ (밀리리터); ㎜ (밀리미터); ㎚ (나노미터); ㎛ (마이크로미터); M (몰); mM (밀리몰); MW (분자량); sec (초); min(s) (분/분들); hr(s) (시/시간들); MgCl2 (염화마그네슘); NaCl (염화나트륨); Na2CO3 (탄산나트늄); OD280 (280㎚에서의 광학 밀도); OD600 (600㎚에서의 광학 밀도); PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동); PBS [인산염 완충 염수 (150 mM NaCl, 10 mM 황산나트륨 완충액, pH 7.2]; PEG (폴리에틸렌 글리콜); PMSF (페닐메틸술포닐 불화물); SDS (황산도데실나트륨); 트리스 (Tris) (트리스(히드록시메틸)아미노메탄); 인슈어(Ensure)(등록상표) (인슈어(등록상표), 로스 연구소(Ross lab), 오하이오주 콜럼부스 소재); 엔파밀(Enfamil)(등록상표) (엔파밀(등록상표), 매드 존슨); w/v (중량 대 용적); v/v (용적 대 용적); 어큐레이트 케미칼(Accurate Chemical) (어큐레이트 케미칼 앤드 사이언티픽 코포레이션, 뉴욕주 웨스버리 소재); 아미콘(Amicon) (아미콘, 인크., 매사추세츠주 버버리시 소재); 암레스코(Amresco) (암레스코, 인크., 오하이오주 솔론시 소재); ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 매릴랜드주 록빌시 소재); BBL (발트모어 생물학 연구소, (벡톤 디킨슨부), 매릴랜드주 콕키스빌 소재); 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) (벡톤 디킨슨 랩웨어, 뉴저지주 링컨파크 소재); 바이오라드(BioRad) (바이오라드, 캘리포니아주 리치몬드 소재); 바이오텍(Biotech) (C-C 바이오텍 코포레이션, 캘리포니아주 포웨이 소재); 찰스 리버(Charles River) (찰스 리버 연구소, 매사추세츠주 윌밍톤 소재); 코칼리코(Cocalico) (코칼리코 바이올로지칼스 인크., 펜실베니아주 림스톤시 소재); CytRx (CytRx 코포레이션, GA 노르크로스시 소재); 팔콘(Falcon) (예컨대, 백스터 헬스케어 코포레이션, 일리노이주 맥그라우 파크시 소재 및 벡톤 디킨슨); FDA (연방 식품 및 약품국); 피숴 바이오텍(Fisher Biotech) (피숴 바이오텍, 뉴저지주 스프링필드시 소재); GIBCO (그랜드 아일랜드 바이올로직 캄퍼니/BRL, 뉴저지주 그랜드 아일랜드 소재); 기브코-BRL (라이프 테크놀로지스, 인크., 매릴랜드 게이츠버그시 소재); 할란 스프라그 다우레이(Harlan Sprague Dawley) (할란 스프라그 다우레이, 인크., 위스콘신주 매디슨시 소재); 말린크로트(Mallinckrodt) (백스터 헬스케어 코포레이션의 부, 일리노이주 맥가우 파크시 소재); 밀리포어(Millipore) (밀리포어 코포레이션, 매사추세츠주 말보로시 소재); 뉴 잉글랜드 비이오랩스(New Ingland Biolabs) (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크., 매사추세츠주 버버리시 소재); 노바겐(Novagen) (노바겐, 인크., 위스콘신주 매디슨 소재); 파마시아(Pharmacia) (파마시아, 인크., 뉴저지주 피스케터웨이시 소재); 퀴아겐(Qiagen) (퀴아겐, 캘리포니아주 캐츠워스시 소재); RIBI (RIBI 임뮤노케미칼 리서치, 인크., 캘리포니아주 해밀턴시 소재); 사스코(Sasco) (사스코, 뉴잉글랜드 유마하 소재); 쇼우덱스(Showdex) (쇼와 덴꼬 아메리카 인크., 뉴욕주 뉴욕시 소재); 시그마(Sigma) (시그마 케미칼 코., 미조리주 세인트 루이스시 소재); 스테로젠(Sterogene) (스테로젠 인크., 캘리포니아주 알카디아시 소재); 테크 랩(Tech Lab) (테크 랩, 인크., 버지니아주 블랙스버그시 소재); 및 백스셀(Vaxcell) (백스셀, 인크., CytRX 코포레이션의 자회사, 조지아주 노크로스시 소재).
재조합 단백질이 명세서상에 서술되는 경우에, 이는 가장 근접한 10 단위로 반올림한 재조합 단백질에 존재하는 독소 서열내 아미노산에 의해 약어 방식으로 언급된다. 예컨대, 재조합 단백질 pMB1850-2360은 씨. 다이피셀 독소 B 단백질의 아미노산 1852에서 2362를 함유한다. 본 명세서는 당업자가 아미노산이 주어진 재조합 단백질내에 존재하는 것을 정확하게 알수 있도록 모든 재조합 단백질에 대한 상세한 구성 설명을 제공한다.
실시예 1
암탉에서의 클로스트리듐 다이피셀 균에 대한 고역가 항체의 생산
특정 병원성 균에 대한 항체는 상기 균에 의해 야기된 질병을 치료하는데 효과적임이 입증되었다. 클로스트리듐 다이피셀에 대항하여 이 균에 의한 감염을 치료하는 데 효과적일수 있는 항체가 생성될 수 있는지가 입증되지 않았다. 따라서, 암탉 항체의 생산을 위한 면역원으로서 씨. 다이피셀을 시험했다.
전체 씨. 다이피셀 균에 대항한 고역가 달걀 항체를 발생하기 위한 최상의 과정을 결정하기 위하여, 상이한 면역 균주 및 상이한 면역 농도를 시험했다. 실시예는 (a) 세균 면역원의 제조, (b) 면역법, (c) 항-세균 닭 항체의 정제; 및 (d) 정제된 IgY 제제내 항 세균 항체의 탐지를 포함한다.
a) 세균 면역원의 제조
씨. 다이피셀 균주 43594 (혈청군 A) 및 43596 (혈청군 C)를 원래 ATCC로부터 얻었다. 이들 두 개의 균주는 이 균주가 항생물질 관련 가막성 결장염에 걸린 환자로부터 단리된 가장 일반적으로 발생하는 혈청군 중 두 개를 대표하기 때문에 선택했다. [Delmee et al., J. Clin. Microbiol., 28(10):2210 (1990)]. 게다가, 상기 균주 모두는 씨. 다이피셀 감염에 대한 시리안 햄스터 모델에서 병독성에 대하여 미리 특성화되었다. [Delmee et al., J. Med. Microbiol., 33:85 (1990)].
세균 균주를 따로따로 가스 팩 플러스 혐기성 엔벨롭프 (BBL)가 장치된 가스 팩 100 자아(BBL, 매릴랜드주 콕키스빌시 소재) 내에서 37℃에서 48시간 동안 뇌 심장 융합 한천 상에서 배양시켰다. 48시간 배양이 더 우수한 증식을 제공하고 균이 표면 항원 표현과 관련하여 보다 교차 반응성이라고 밝혀졌기 때문에 48시간 배양을 사용했다. 본발명의 IgY 제제의 교차 반응성 정도가 높을수록 상이한 균주/혈청군에 대항한 광범위한 범위의 활성의 가능성이 더 높아진다. [Tama et al., J. Clin. Microbiol., 26(3):426(1988)].
생성된 균을 멸균 데이크론-팁 스왑을 사용하여 한천 표면으로부터 제거하고, pH 7.2의 PBS 중 0.4% 포름알데히드를 함유하는 용액 중에 현탁시켰다. 상기 농도의 포름알데히드는 토끼에서 폴리클론성 항-씨. 다이피셀 항혈청의 생성을 위한 전체 균 면역원 현탁액의 제조 목적을 위해 우수한 결과를 생산하는 것으로 보고되었다. [Delmee et al., J. Clin. Microbiol., 21:323 (1985); Davies et al., Microbial Path., 9:141 (1990)]. 이러한 방식으로, 각각 하나의 균주인 두 개의 분리된 현탁액을 제조했다. 두 개 현탁액을 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 이러한 포르말린 처리 기간 후에, 현탁액을 4,200xg에서 20 분 동안 원심분리시키고 생성된 펠렛을 정상 염수에서 두 번 세척시켰다. 포르말린 처리된 전체 균이 함유된, 세척된 펠렛을 각각의 현탁액의 가시적 혼탁도가 #7 맥팔랜드 표준에 상응하도록 새로운 정상 염수내에 재현탁시켰다. [M.A.C. Edelstein. "혐기성 세균에 대한 임상 표본 처리; 단리 및 동정 절차", in S. M. Finegold et al (편집), 베알리 앤드 스콧의 진단 미생물학, 477-507페이지, C.V. Mosby Co., (1990). 맥팔랜드 탁도계 기준의 제조 및 각 튜브에 대한 균의 상응하는 대략 숫자가 상기 권의 172-173페이지에 상세히 서술된어 있다]. 각각의 두 #7 현탁액을 두 개 별도의 용적으로 나누었다. 각 현탁액 중 1 용적을 염수의 첨가에 의해 용적이 #1 맥프랜드 표준의 가시적 탁도에 상응하도록 조정했다. #1 현탁액은 약 3x108 균/ml를 함유했고, #7 현탁액은 약 2x109 균/ml를 함유했다. 제조된 4개의 농도 조정된 포르말린 처리 씨. 다이피셀 균의 현탁액은 "세균 면역원 현탁액"으로 가정했다. 상기 현탁액은 제조 후에 초기 면역법에 바로 사용했다. [참조 섹션 (b)].
폴리말린 처리 절차가 면역원 현탁액내 100% 비생존 세균을 결과하지는 않았다. 치사율을 증가시키기 위하여, 포르말린 농도 및 처리 기간을 표 3에 하기 서술되는 바와 같이 후속 면역원 제제에 대해 모두 증가시켰다. (더 강한 포르말린 처리로써 생존율을 감소시킬수 있지만, 세균 면역원 현탁액의 100% 생존불가능성에 도달하지 않았다). 또한, 후속 면역원 제제에서, 포르말린 용액을 PBS 대신에 정상 염수 중에 제조했다. 5번째 면역법 후 49 일째에, 4개의 상기 세균 면역원 현탁액을 -70℃에서 모든 후속 면역법 중에 사용하기 위하여 저장했다.
b) 면역법
초기 면역법를 위하여, 상기 서술된 4개의 세균 면역원 현탁액 중 각각의 1.0 ml 용적을 따로따로 CFA (GIBCO)의 1.2 ml 용적 중에 유화시켰다. 각각의 4개의 유화된 면역원 현탁액에 대해, 2 4개월된 화이트 레그혼 암탉 (이전에 알을 낳은)을 면역시켰다. (이전에 알을 낳은 암탉을 반드시 사용해야 하는 것은 아니며; 알을 낳을수 있는 암탉도 또한 사용가능하다). 각각의 암탉에 부위 마다 약 250㎕의 4번 주사 (2번 피하 및 2번 근육내)에 의해 하나의 유화된 면역원 현탁액 약 1.0 ml의 총 용적을 수용시켰다. 이러한 방식으로, 총 4개의 상이한 면역 조합물을 조합물 당 2개의 암탉을 사용하여 달걀 노른자 항체 (IgY) 생산 및 이질 균주에 대항해 발생된 IgY의 균주간 교차반응성에 대한 면역 농도의 효과를 모두 평가하기 위한 목적으로 개시했다. 상기 4개의 면역법 군을 표 3에 요약했다.
| 군 명칭 | 면역 균주 | 대략적인 면역 투여량 |
| CD 43594, #1 | 씨. 다이피셀 균주 43594 | 1.5x108 균/암탉 |
| CD 43594, #7 | 씨. 다이피셀 균주 43594 | 1.0x109 균암탉 |
| CD 43596, #1 | 씨. 다이피셀 균주 43596 | 1.5x108 균/암탉 |
| CD 43596, #7 | 씨. 다이피셀 균주 43596 | 1.0x109 균/암탉 |
첫 번째 면역법 시리즈의 시점을 "0 일"로 표시했다. 모든 후속 면역법을 상기 서술된 바와 같이 수행했으나 세균 면역원 현탁액을 CFA 대신에 IFA (GIBCO)를 사용하여 유화시키고 면역법 후기 시점에 새로이 제조된 현탁액 대신에 저장된 동결 현탁액을 사용했다. 사용된 면역법 스케줄을 표 4에 기재되어 있다.
| 면역 일수 | 포르말린 처리 | 사용된 면역원 제제 |
| 0 | 1%, 1시간 | 새로이 제조 |
| 14 | 1%, 하룻밤 | 새로이 제조 |
| 21 | 1%, 하룻밤 | 새로이 제조 |
| 35 | 1%, 48시간 | 새로이 제조 |
| 49 | 1%, 72시간 | 새로이 제조 |
| 70 | 1%, 72시간 | 저장된 동결물 |
| 85 | 1%, 72시간 | 저장된 동결물 |
| 105 | 1%, 72시간 | 저장된 동결물 |
c) 항-세균 닭 항체의 정제
초기 면역법 후 80 및 84일 사이에 면역 군 마다 4개의 달걀 군을 수집하고, 닭 면역글로불린 (IgY)를 에이. 폴슨 일행의 Immunol. Comm., 9:495 (1980)의 절차의 변형에 따라 추출했다. 분사병으로부터 온화한 증류수 흐름을 사용하여 흰자와 노른자를 분리시키고, 깔대기를 통하여 눈금을 새긴 실린더내로 적가함으로써 노른자를 분쇄했다. 합하고 분쇄된 노른자를 달걀 추출 완충액 4배 용적과 블렌딩하여 항체 수율을 개선시키고 (달걀 추출 완충액은 0.005% 티머로살을 함유하는 pH 7.5의 0.01 M 황산나트륨, 0.1 M NaCl임), PEG 8000 (암레스코)를 3.5% 농도로 첨가시켰다. 모든 PEG가 용해되면, 형성된 단백질 침강물을 13,000xg에서 10분 동안 원심분리에 의해 펠렛화했다. 상등액을 기울여 따르고 무명천을 통하여 여과시켜 지질층을 제거하고, PEG를 12%의 최종 농도로 상등액 (상등액은 3.5% PEG를 함유한다고 추정했음)에 첨가했다. 두 번째 원심분리 후에, 상등액을 따라 버리고 펠렛을 최종 원심분리하여 잔류 PEG를 배출했다. 상기 미정제 IgY 펠렛을 원래 노른자 용적의 달걀 추출 완충액에 용해시키고, 4℃에서 저장시켰다. 부가적인 대조로서, 면역전 IgY 용액을 비면역된 암탉으로부터 수집된 달걀을 사용하여 상기 서술된 바와 같이 제조했다.
d) 정제된 IgY 제제 내에서 항-세균 항체의 탐지
상기 서술된 IgY 제제 내에서 특이 항-씨. 다이피셀 활성의 상대 수준을 평가하기 위하여, 문헌 [N.V. Padhye et al., J. Clin, Microbiol. 29:99-103(1990]의 전체 균 ELISA 절차의 변형법을 사용했다. 상기 서술된 두 씨. 다이피셀 균주의 동결 균을 해동시키고 pH 7.2의 PBS를 사용하여 약 1x107균/ml의 농도로 희석했다. 이 방식으로, 하나씩 각각의 면역 균주로서 두 개의 분리된 코팅 현탁액을 제조했다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (팔콘, Pro-Bind 검정 플레이트)의 웰 내에 100㎕ 용적의 코팅 현탁액을 놓았다. 이 방식으로, 각각의 플레이트 웰에 한 균주 또는 다른 균주의 총 약 1x106 균을 제공했다. 이 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 다음 아침에, 코팅 현탁액을 가만히 따르고, 모든 웰을 PBS를 사용하여 세 번 세척했다. 비특이적 결합 부위를 블로킹하기 위하여, PBS 중 0.5% BSA (시그마) 100㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 이 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 블로킹된 용액을 가만히 따르고, 상기 서술된 100㎕ 용적의 IgY 제제를 초기에 PBS 중 0.1% BSA 용액으로 1:500배 희석한 다음 시리즈로 1:5 단계로 희석했다. 하기 희석액을 웰내에 놓았다 : 1:500, 1:2,500, 1:62,500, 1:312,500 및 1:1,562,500. 플레이트를 실온에서 다시 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 후에, IgY 함유액을 가만히 따르고, BBS-트윈 (0.1M 보론산, 0.025M 보론산나트륨, 0.1 M NaCl, 0.1% 트윈-20)을 사용하여 3회 세척하고, 이어서 PBS-트윈 (0.1% 트윈-20)을 사용하여 두 번의 세척하고, 마지막으로 PBS만을 사용하여 2회 세척했다. 각각의 웰에, 토끼 항-닭 IgG (전체 분자) 알카리성 포스파티제 접합체 (시그마)의 1:750 희석액 100㎕ (PBS 중 0.1% BSA 중에 희석)를 첨가했다. 플레이트를 다시 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 접합체 용액을 가만히 따르고, 플레이트를 최종 세척에서 PBS를 pH 9.5의 50 mM Na2CO3로 치환하여 상기 서술된 바대로 세척했다. 이 플레이트를 각각의 웰이 pH 9.5의 50 mM Na2CO3, 10mM MgCl2 중 용해된 1mg/ml파라-니트로페닐 포스페이트 (시그마)를 함유하는 용액 100㎕를 첨가하여 현상시키고, 플레이트를 실온에서 어두운 곳에서 45 분 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 웰의 흡광도를 다이나테크 MR 700 플레이트 판독기를 사용하여 410nm에서 측정했다. 이 방식으로, 상기 서술된 각각의 4개 IgY 제제를 면역 시키는 씨. 다이피셀 균주 모두에 대항한 반응성 대해 시험하고; 균주 특이 활성, 뿐만아니라 교차 반응 활성을 평가했다.
| IgY 제제 | IgY제제의 희석율 | 43594 코팅된 웰 | 43596 코팅된 웰 |
| CD 43594, #1 | 1:5001:2,5001:12,5001:62,5001:312,5001:1,562,500 | 1.7461.0920.2020.1360.0120.002 | 1.8011.6700.8120.1790.0800.020 |
| CD 43594, #7 | 1:5001:2,5001:12,5001:62,5001:312,5001:1,562,500 | 1.7801.0250.1880.0520.0220.005 | 1.77110780.3820.1320.0430.024 |
| CD 43596, #1 | 1:5001:2,5001:12,5001:62,5001:312,5001:1,562,500 | 1.5260.8320.2470.0500.0100.000 | 1.7901.4770.4520.2420.0670.036 |
| CD 43596, #7 | 1:5001:2,5001:12,5001:62,5001:312,5001:1,562,500 | 1.7020.7060.2500.0390.0020.000 | 1.5050.8660.2820.0780.0170.010 |
| 면역전 IgY | 1:5001:2,5001:12,5001:62,5001:312,5001:1,562,500 | 0.1420.0320.0060.0020.0040.002 | 0.3090.0770.0240.0120.0100.014 |
표 5는 전체 균 ELISA의 결과를 나타낸다. 모든 4개의 IgY 제제는 면역시키는 균 균주 모두에 대항하여 1:62,500 이상의 희석액에 대해 유의한 활성 수준을 나타낸다. 따라서, 하나의 균주에 대항하여 발생된 항체는 나머지 균주와 매우 교차 반응성이었고, 반대도 마찬가지 였다. 균의 면역 농도는 두 농도가 대략 동등한 반응을 야기하기 때문에, 균-특이 IgY 생산에 대한 유의한 효과는 갖지 않았다. 따라서, 약 1.5x108 균/암탉의 더 낮은 면역 농도가 두 개의 시험된 것 중 바람직한 면역 농도이다. 면역전 IgY 제제는 아마도 환경의 클로스트리듐에 동물이 노출되기 전이기 때문에 1:500의 희석액에 대해 상대적으로 저 수준의 씨. 다이피셀 반응성 활성을 갖는 듯하다.
50일 경에 수집한 하나의 CD 45594, #1 및 CD 43596, #1로부터 제조된 IgY 제제를 사용하여 초기 전체 균 ELISA를 수행했다 (자료는 제시되지 않음). 특이 역가는 표 5에 보고된 것보다 5 내지 10 배 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 달걀을 낳기 시작하기 전에 암탉을 면역시키기 시작하여 낳은 첫 번째 달걀로부터 높은 특이적 IgY를 얻는 것이 가능함을 증명한다. 달리 말하면, 면역법 스케줄이 시작되기 전에 알을 낳기 시작한 암탉을 기다릴 필요가 없다.
실시예 2
항-씨. 다이피셀 항체로써 씨. 다이피셀 감염의 치료
전체 씨. 다이피셀 균에 대항해 발생된 면역 IgY 항체가 씨. 다이피셀에 의한 햄스터 감염을 억제할수 있는지 여부에 대하여 결정하기 위하여, 상기 세균을 감염된 햄스터를 사용했다. [Lyerly et al., Infect. Immun., 59:2215-2218(1991)]. 이 실시예는 (a) 씨. 다이피셀 균의 치사량 측정; 및 (b) 영양액 중의 면역 항체 또는 대조 항체로써 감염된 동물의 치료.
a) 씨. 다이피셀 균의 치사량의 측정
씨. 다이피셀 균의 치사량 측정은 하기 문헌에 의해 서술된 모델에 따라 수행했다 [D.M. Lyerly et al., Infect. Immun., 59:2215-2218 (1991)]. 씨. 다이피셀 균주 ATCC 43596 (혈청군 C, ATCC)를 BHI 한천 상에 놓고 37℃에서 42 시간 동안 혐기적으로 (BBL 가스 팍 100 시스템)에서 증식시켰다. 균을 멸균 데이크론 팁 스왑을 사용하여 한천 표면으로부터 떼어내고, 108 균/ml의 밀도로 무균 0.9% NaCl 용액에 현탁시켰다.
대조 항체 및 영양 배합물의 존재하에 씨. 다이피셀의 치사량을 측정하기 위하여, 비면역 암탉으로부터 비면역 달걀을 얻고 12% PEG 제제를 실시예 (c)에 서술된 바대로 제조했다. 이 제제를 원래 노른자 용적의 1/4의 바닐라향 인슈어(등록상표) 에 용해시켰다.
하루에 시작하여, 8-9주 되고 약 100그램 체중의 암컷 골든 시리안 햄스터 (할란 스파그 다우레이)의 군들에게 0시간, 2시간, 6시간 및 10시간에 면역전/인슈어 (등록상표) 제제 1ml를 경구 투여했다. 1시간째에, 물 1ml 중 3.0 mg 클린다마이신 HCl (시그마)를 경구 투여했다. 이 약제는 정상 장내 세균총을 변형함으로써 햄스터를 씨. 다이피셀 감염에 걸리기 쉽게 한다. 2일째에, 0시간, 2시간, 6시간, 및 10시간째에 면역전 IgY/인슈어(등록상표) 배합물 1ml를 동무에게 제공했다. 2일째 1시간째에, 1 ml 염수내 염수(대조), 또는 102, 104, 106 또는 108 씨. 다이피셀 균로 상이한 군들의 동물을 경구 접종했다. 3-12일째로부터, 면역전 IgY/인슈어(등록상표) 배합물 1ml를 동물에게 매일 3회 제공하고 설사증 및 사망의 징후를 관찰했다. 각각의 동물을 개별 우리에 넣고 음식 및 물을 수시로 주었다.
106-108 균의 투여는 3-4일째에 사망을 초래한 한편, 102-104 균의 더 낮은 투여량은 5일째에 사망을 야기했다. 사망한 독물로부터 취한 맹장 스왑은 씨. 다이피셀의 존재를 나타냈다. 102 투여량의 효과를 가정하여, 이러한 수의 균을 초면역 항-씨. 다이피셀 항체가 감염을 차단할수 있는지를 보기 위한 하기 실험에 선댁하였다.
b) 영양 배합물 내에서 면역 항체 또는 대조 항체로써 감염된 동물의 치료
(a)에서의 실험을 7마리 햄스터 각각의 3 군을 사용하여 반복했다. A군에는 클린다마이신 또는 씨. 다이피셀을 제공했고, 이는 생존 대조였다. B군에는 클린다마이신, 102 씨. 다이피셀 균 및 면역전 IgY를 상기 (a)에서의 동물과 동일한 스케줄로 제공했다. C군에는 클린다마이신, 102 씨. 다이피셀 균 및 초면역 항-씨 다이피셀 IgY를 상기 B군에서의 동물과 동일한 스케줄로 제공했다. 12% PEG 제제를 원래 노른자 용적의 1/4의 인슈어(등록상표)에 용해시킨 것으로 제외하고 실시예 1에 서술된 바대로 항-씨. 디이피셀 IgY를 제조했다.
모든 동물을 설사증 또는 기타 질병 증후 및 사망의 징후에 대해 관찰했다. 각각의 동물을 개별 우리에 넣고 음식 및 물을 수시로 주었다. 결과는 표 6에 제시되어 있다.
| 동물군 | 설사증a 시간 | 치사 시간 |
| A 면역전 IgY만 | 설사증 없음 | 죽지않음 |
| B 클린다마이신, 씨. 다이피셀, 면역전 IgY | 30시간 | 49시간 |
| C 클린다마이신, 씨. 다이피셀, 면역 IgY | 33시간 | 56시간 |
a 7마리 동물의 평균
대조군 A에서의 햄스터는 설사증을 나타내지 않았고 실험 기간 동안 건강하게 유지되었다. B 및 C군의 햄스터는 설사병을 나타내었. 항-씨. 다이피셀 IgY는 동물을 설사병 또는 치사로부터 방어하지 않았고, 모든 동물은 동물을 면역전 IgY로 처리한 바와 동일한 시간 간격에 죽었다. 따라서, 전체 균로써의 면역법이 특정 세균에 의한 아치사 증후군을 명백히 개선시킬수 있는 한편 (참조, H. Tokoro의 미국 특허 제5,080,895호), 이러한 방법이 씨. 다이피셀의 치사 효과에 대항하여 방어하는데 생산적임이 임증되지 않았다.
실시예 3
암탉 내에서 씨. 보툴리누스 A 유형 항독소의 생산
클로스트리듐 질병을 치료하는 데 효과적일 수 있는, 클로스트리듐 병원체에 의해 생산된 독소에 대항하여 항체가 발생될수 있는지를 판단하기 위하여, 씨. 보툴리누스 A 유형 독소에 대한 항독소를 생산했다. 이 실시예는 (a) 독소 변성; (b) 면역법; (c) 항독소 수집; (d) 항원성 평가; 및 (e) 항독소 역가의 검정을 포함한다.
a) 독소 변성
씨. 보툴리누스 A 유형 톡소이드를 B.R. 다스굽타로부터 얻었다. 이로부터, 활성 A 유형 신경독소 (분자량, 약 150kD)를 공지의 방법에 따라 순도 99% 이상으로 정제했다. [B.R. DasGupta & V. Sathyamoorty. Toxicon, 22:415 (1984)]. 신경독소를 공지의 방법에 따라 포름알데히드로써 독성제거하였다. [B.R. Singh & B.R. DasGupta, Toxicon, 27:403 (1989)].
b) 면역법
면역법을 위한 씨. 보툴리누스 톡소이드를 PBS (1mg/ml) 중에 용해시키고 초기 면역법의 경우 CFA (GIBCO) 또는 추가자극 면역법의 경우 IFA의 대략 동일 용적으로 유화시켰다. 0 일째에, 지방 사육자로부터 얻은 두 마리의 화이트 레그혼 암탉에게 각각 여러 부위 (근육내 및 피하)에 1ml CFA 중에 유화된 1ml 실활 톡소이드를 주사했다. 주사일 및 톡소이드량에 대한 하기 스케줄에 따라 후속 추가자극 면역을 수행했다 : 14 및 21일-0.5mg; 171일-0.75mg; 394, 401, 409일-0.25mg. 한 마리의 암탉에게 544 일째에 0.150mg의 부가적인 추가자극을 제공했다.
c) 항독소 수집
전체 노른자 면역글로불린 (IgY)를 실시예 1(c)에 서술된 바와 같이 추출하고 IgY 펠렛을 티머로살과 함께 원래 노른자 용적의 PBS 중에 용해시켰다.
d) 항원성 평가
톡소이드가 항체를 발생하기에 충분하게 면역원성인지 여부를 평가하기 위하여 409 내지 423일로부터 달걀을 수집했다. 2마리의 암탉으로부터의 달걀을 모으고 항체를 표준 PEG 프로토콜에 서술된 바대로 수집했다. [실시예 1(c)]. 보툴리누스 독소의 항원성을 웨스턴 블롯으로 평가했다. 150 kD 독성제거 A 유형 신경독소 및 비변성 독성 300kD 보툴리누스 A 유형 복합체 (동물 소화관 중화 실험을 위한 위내 경로 투여를 위해 사용된 독소; 실시예 6 참조)를 SDS-폴리아크릴아미드 환원 겔 상에 분리시켰다. 웨스턴 블롯 기술을 토우빈의 방법에 따라 수행했다. [H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:4350 (1979)]. 씨. 보툴리누스 복합체 및 톡소이드의 10㎍ 시료들을 SDS 환원 시료 완충액 (1% SDS, 0.5% 2-메르캅토에탄올, 50mM 트리스, pH6.8, 10% 글리세롤, 0.025% w/v 브롬페놀 블루, 10% β-메트캅토에탄올) 중에 용해시키고, 95℃에서 10 분 동안 가열시키고 1mm 두께 5% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리시켰다. [K. Weber 및 M. Osborn. "단백질 및 황산도데실나트륨: 폴리아크릴아미드 겔 상의 분자량 측정 및 관련 절차" in The Proteins, 3판 편집 (H. Neurath & R.L. Hill 편집), 179-223페이지, (아카데믹 프레스 , 뉴욕 소재 1975)]. 상기 겔의 부분을 잘라내고 단백질을 쿠마시 블루로 염색했다. 겔의 나머지 내의 단백질을 제조업자의 지시에 따라 밀리블롯-SDE 일렉트로 블롯팅 시스템 (밀리포어)을 사용하여 니크로셀룰로스에 전이시켰다. 니트로셀룰로스를 10% 폰카우 S로써 일시적으로 염색하여 [S.B. Carroll and A. Laughon, "β-갈락토시다제 융합 단백질의 외래 세그먼트에 대한 폴리클론성 항체의 생산 및 정제" in DNA Cloning: A Practical Approach. III권 (D., Glover 편집), 89-111페이지, IRL 프레스, 옥스퍼드 소재 (1987)] 레인을 가시화한 다음 몇분 동안 블롯 상에 증류수의 온화한 흐름을 주행시켜 오물을 제거시켰다. 니트로셀룰로스를 4℃에서 밤새도록 3% BSA를 함유하는 PBS 중에 침지시켜 임의 잔류하는 단백질 결합 부위를 블로킹시켰다.
블롯을 스트립으로 절단하고 각각의 스트립을 적당한 제1 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 조류 항-씨. 보툴리누스 항체 [(c)에서 서술] 및 면역전 닭 항체 (대조)을 실온에서 2시간 동안 1mg/ml BSA를 함유하는 PBS 중에 1:125로 희석했다. 블롯을 큰 용적의 PBS, BBS-트윈 및 PBS 각각을 두 번 바꾸어 연속적으로 (10분/세척)세척했다. 염소 항-닭 IgG 알카리성 포스파타제 접합된 2차 항체 (피숴 바이오테크)를 1mg/ml BSA를 함유하는 PBA 중에 1:500으로 희석시키고 실온에서 2시간 동안 상기 블롯과 함께 인큐베이션시켰다. 블롯을 큰 용적의 PBS 및 BBS-트윈 각각을 두 번 바꾸어 세척하고, 이어서 PBS 및 pH 9.5의 0.1M 트리스-HCl 중의 한 가지를 바꾸어 세척했다. 블롯을 새로이 제조된 알카리성 포스파타제 기질 완충액 (pH 9.5의 50mM Na2CO3 중 100㎍/ml 니트로블루 테트라졸륨 (시그마), 50㎍/ml 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염 (시그마), 5mM MgCl2) 중에서 전개시켰다.
웨스턴 블롯은 도 1에 도시되어 있다. 항-씨. 보툴리누스 IgY는 상기 톡소이드와 반응하여 환원 겔 상에서 약 145-150 kD의 광범위한 면역반응성 밴드를 제공한다. 이 톡소이드는 포르말린 가교로 인해 환원제에 의한 이황화물 분해로 굴절된다. 상기 면역 IgY는 활성 독소 복합체, 97kD 씨. 보툴리누스 A 유형 헤비 체인 및 53 kD 라이트 체인과 반응한다. 면역전 IgY는 씨. 보툴리누스 복합체 또는 웨스텐 블롯에서의 씨. 보툴리누스 복합체 또는 톡소이드와 비반응성이다.
e) 항독소 항체 역가
409 및 423 일 사이에 수확된 달걀의 씨. 보툴리누스 A 유형 톡소이드에 대한 IgY 항체 역가를 하기와 같이 제조된 ELISA에 의해 평가했다. 96 웰 팔콘 프로-바인드 플레이트에 하룻밤 동안 4℃에서 0.005% 티머로살을 함유하는 pH 7.5의 PBS 중 2.5㎍/ml의 톡소이드를 100㎕/웰로 코팅했다 [B.R. Singh & B.R. DasGupta. Toxicon, 27:403 (1989)]. 다음날 웰을 1% BSA를 함유하는 PBS로 1시간 동안 37℃에서 블로킹시켰다. 면역 또는 면역전 달걀로부터의 IgY를 1% BSA 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS 중에 희석시키고 플레이트를 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 및 PBS 만으로 3회 세척했다. 알카리성 포스파타제-접합된 염소-항-닭 IgG (피숴 바이오테크)를 1% BSA 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS 중에 1:750으로 희석하고, 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이 플레이트를 전과 같이 세척하고, 0.05 M Na2CO3, pH 9.5, 10mM MgCl2 중 1mg/ml의 p-니트로페닐 인산염 (시그마)를 첨가했다.
결과는 도 2에 도시되어 있다. 상기 톡소이드로 면역된 닭은 면역원에 대한 고역가의 항체를 생성했다. 중요하게, 두 면역된 암탉으로부터의 달걀은 면역전 대조 달걀에 비하여 상당한 항 면역원 항체 역가를 가졌다. 항-씨. 보툴리누스 IgY 는 1:93,750 이상의 희석율에 대해 유의한 활성을 가졌다.
실시예 4
경구 투여 형태의 조류 노른자 면역글로불린의 제조
실험 마우스에게 조류 IgY 항체를 경구 투여하기 위하여, IgY에 대한 유효한 전달 제형을 결정해야 했다. 관심사는 미정제 IgY가 PBS 중에 용해된다면, PBS 중의 염수가 마우스를 탈수시켜, 연구 기간 동안 해로울수 있다는 것이다. 따라서, 대안적인 IgY 경구 투여 방법을 시험했다. 이 실시예는 (a) 면역 IgY의 단리; (b) 완충액 중의 염 (염 및 인산염)을 제거하거나 감소시키기 위해 물로써 IgY-PBS 의 후속 투석을 포함하는, 물 또는 PBS 중 IgY의 용해; 및 (c) 280nm 에서의 흡광도 및 효소 결합 면역 검정 (ELISA)에 의해 회수된 IgY의 양 및 활성 비교를 포함한다.
a) 면역 IgY의 단리
IgY에 대한 가장 효과적인 전달 제형을 검사하기 위하여, 우리는 클로타루스 듈리서스 테리피커스(Crotalus durissus terrificus) 독에 대항해 발생된 IgY를 사용했다. 씨. 듈리서스 테리피커스 독으로써 면역된 암탉으로부터 3개의 달걀을 수집하고, 실시예 1(c)에 서술된 바와 같이 IgY를 탈레이 및 캐롤에 의해 서술된 변형 폴슨 절차를 사용하여 노른자로부터 추출했다 [바이오/테크놀로지, 8:934-938 (1990)].
달걀 노른자를 흰자로부터 분리하고, 풀링하고, 4배 용적의 PBS와 블렌딩했다. 분말상 PEG 8000을 3.5% 농도로 첨가시켰다. 혼합물을 10,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 침강된 단백질을 펠렛화하고, 상등액을 무명천을 통하여 여과시켜 지질층을 제거했다. 분말상 PEG 8000을 상등액에 첨가하여 최종 PEG 농도를 12%로 만들었다 (상등액 중 PEG 농도는 3.5%로 가정). 12% PEG/IgY 혼합물을 두 개의 동일 용적으로 나누고 원심분리하여 IgY를 펠렛화했다.
b) 물 또는 PBS 중에 IgY의 용해
하나의 펠렛을 원래 노른자 용적의 1/2의 PBS에 재현탁시키고, 나머지 펠렛을 원래 노른자 용적의 1/2의 물에 재현탁시켰다. 그 다음 펠렛을 원심분리하여 임의 입자 또는 불용성 물질을 제거했다. IgY는 PBS 용액 중에 쉽게 용해되나 물에 재현탁된 분획은 탁한 채로 남아 있었다.
경구 투여된 항체의 예상 살균도 요구사항을 만족하기 위하여, 항체 용액을 여과 살균 (항체를 파과하는 가열 살균에 대한 대안으로서)할 필요가 있다. 물 중에 재현탁된 IgY의 제제는 0.2 또는 0.45㎛ 막 필터를 통과하기에는 지나치게 탁하여, PBS 재현탁된 분획 10ml를 물 250ml에 대항해 실온에서 밤새도록 투석시켰다. 다음날 아침 투석 챔버는 비었고 제2 투석을 위해 새로운 H2O 250ml로 재충전했다. 그 후에, 용해성 항체의 수율을 OD280에서 측정하였고 표 7에 비교되어 있다.
| 분획 | 280nm에서 1:10 희석액의 흡광도 | 회수율 |
| PBS 용해 | 1.149 | 100% |
| H2O 용해 | 0.706 | 61% |
| PBS 용해/H2O 투석 분획 | 0.885 | 77% |
상기 펠렛을 PBS 중에 재현탁시키고 물에 대항해 투석시키면, 물 중에 펠렛을 직접 재현탁한 경우 보다 더 많은 항체가 회수되었다 (77% 대 61%). PBS 또는 물 중의 동등 용적의 IgY 제제를 PAGE에 의해 비교하고, 이들 결과는 흡광도 값에 따랐다 (자료는 제시되지 않음).
c) 상이한 용매로써 제조된 IgY의 활성
ELISA를 수행하여 상기 서술된 각각의 절차에 의해 추출된 IgY의 결합 활성을 비교했다. PBS 중 2.5㎍/ml의 씨. 듈리서스 텔리피커스 (C.d.t) 독액을 사용하여 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰을 코팅했다. 나머지 단백질 결합 부위를 BSA 5mg/ml를 함유하는 PBS로써 블로킹했다. 제1 항체 희석액 (BSA 1mg/ml를 함유하는 PBS 중)을 두 번 첨가했다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에, 미결합 제1 항체를 PBS, BBS-트윈 및 PBS로 웰을 세척하여 제거했다. 종 특이적 제2 항체 (염소 항-닭 면역글로불린 알카리성-포스파타제 접합체 (시그마)를 BSA 1mg/ml를 함유하는 PBS 중에 1:750배로 희석하고, 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 첨가시켰다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 상기와 같이 세척하여 미결합 제2 항체를 제거하고, pH 9.5의 50mM Na2CO3, 10mM MgCl2 중 1mg/ml의 새로 제조된 알카리성 포스파타제 기질 (시그마)를 각각의 웰에 첨가했다. 412 nm 필터를 사용하여 다이테크 MR 700 마이크로타이터 판독기 상에서 색 전개를 측정했다. 결과는 표 8에 제시되어 있다.
| 희석율 | 면역전 | PBS 용해 | H2O 용해 | PBS/H2O |
| 1:500 | 0.005 | 1.748 | 1.577 | 1.742 |
| 1:2,500 | 0.004 | 0.644 | 0.349 | 0.606 |
| 1:12,500 | 0.001 | 0.144 | 0.054 | 0.090 |
| 1:62,500 | 0.001 | 0.025 | 0.007 | 0.016 |
| 1:312,500 | 0.010 | 0.000 | 0.000 | 0.002 |
결합 검정은 표 7에서의 회수치와 비슷한 결과로, PBS-용해 IgY는 PBS-용해/H2O 투석 항체 보다 약간 더 많은 활성을 나타낸다. 물-용해 항체는 다른 제제 보다 상당히 더 적은 결합 활성을 가졌다.
실시예 5
위장관을 통한 통과 후 항체 활성의 생존
항체의 경구 투여의 실용성을 판단하기 위하여, 위장관을 통한 통과에서 경구 투여된 IgY가 생존하는지 여부를 측정하는 것이 관심사다. 이 실시예는 (a) 영양 배합물과 혼합된 특이 면역 항체의 경구 투여; 및 (b) 배설물로부터 추출된 항체 활성의 검정을 포함한다.
a) 항체의 경구 투여
이 실시예에서 사용된 IgY 제제는 상기 실시예 4에서 얻어진 상기 PBS-용해/H2O 투석 항독액 물질이었고, 상기 제제를 동일 용적의 엔파밀(등록상표)과 혼합했다. 두 마리의 마우스를 이 실험에서 사용했고, 각각은 상이한 식이요법을 하기와 같이 받았다:
1) 보통의 물 및 음식;
2) 물에 대항해 투석되고 엔파밀(등록상표)와 1:1 혼합된 면역 IgY 제제.
(상기 마우스에게 음식 및 물의 원천만으로서 상응하는 혼합물을 제공했다).
b) 섭취 후의 항체 활성
두 마리 마우스가 각각의 유체를 섭취한 후에, 각각의 튜브를 아침에 약 10ml의 적당한 유체로 재충전시켰다. 오전 중반까지 각각의 튜브에 약 4 내지 5 ml의 액체가 있었다. 이 시점에 대변 시료를 각각의 마우스로부터 수집하고, 계량하고, 100mg 대변 시료 당 약 500㎕ PBS에 용해시켰다. 1.5ml 원심분리 튜브 내에 대조 대변 (항체 없음) 160mg 및 실험용 대변 99mg (특이적 항체)를 각각 800 및 500㎕의 PBS 중에 용해시켰다. 시료를 37℃에서 10분 동안 가열하고, 강력하게 교반시켰다. 실험 대변을 또한 좁은 압설기로 분쇄시켰다. 각각의 시료를 원심분리기 내에서 5 분간 원심분리시키고, 항체 추출물을 함유한다고 추정되는 상등액을 수집했다. 미래에 추출물이 필요한 경우를 위해 펠렛을 2-8℃에서 모아두었다. 상등액이 옅은 색이기 때문에, 효소 면역검정 (ELISA)에서 초기 희석액에 대해 BSA 1mg/ml를 함유하는 PBS 중에 5배로 희석시켰다. 제1 추출물을 이 초기 용액으로부터 시리즈로 5배 희석시켰다. 각각의 웰에 첨가된 제1 추출물의 용적은 190㎕였다. ELISA를 실시예 4에 서술된 바와 정확하게 동일하게 수행했다.
| 희석율 | 면역전 IgY | 대조 배설물 추출물 | 실험 배설물 추출물 |
| 1:5 | <0 | 0.000 | 0.032 |
| 1:25 | 0.016 | <0 | 0.016 |
| 1:125 | <0 | <0 | 0.009 |
| 1:625 | <0 | 0.003 | 0.001 |
| 1:3125 | <0 | <0 | 0.000 |
엔파밀(등록상표) 배합물 중 특이 항체를 받은 마우스로부터의 배설물 추출물 내에 몇몇 활성 항체가 있었으나, 이는 매우 낮은 수준으로 존재했다. 시료가 초기 1:5 희석율로 검정되었기 때문에, 관찰된 결합은 덜 희석된 시료에서는 더 높았을수 있다. 결론적으로, 마우스가 정규식 및 물 또는 엔파밀(등록상표) 중 특이 IgY 배합물를 계속 섭취하도록 하여, 적절하게 검정을 재반복할수 있다. 또다른 ELISA 플레이트를 PBS 중 C.d.t. 독액 5㎍/ml로 하룻밤 코팅시켰다.
다음날 아침, ELISA 플레이트를 BSA 5mg/ml로 블로킹하고, 추출물을 37℃로 가열한 대신에, 단백질 분해를 제한하기 위해 시료를 얼음 상에 유지한 것을 제외하고 배설물 시료를 전과 같이 추출시켰다. 초기의 미희석된 시료를 검정하고, 그후에 5배 시리즈 희석 시료로 검정했다. 그렇지않으면 이전과 같이 검정을 수행했다.
| 희석율 | 면역전 IgY | 대조 추출물 | 실험 추출물 |
| 미희석 | 0.003 | <0 | 0.379 |
| 1:5 | <0 | <0 | 0.071 |
| 1:25 | 0.000 | <0 | 0.027 |
| 1:125 | 0.003 | <0 | 0.017 |
| 1:625 | 0.000 | <0 | 0.008 |
| 1:3125 | 0.002 | <0 | 0.002 |
이 실험은 본실험의 항체 활성이 현저히 더 높다는 앞선 결과를 확인했다. 대조 배설물 추출물은 미희석의 경우에도 항-C.d.t. 활성을 나타내지 않은 한편, 항-C.d.t. IgY/엔파밀(등록상표)를 급식한 마우스로부터의 배설물 추출물은 상당한 항-C.d.t. 활성을 나타냈다. 이 실험 (및 앞선 실험)은 마우스 소화관을 통한 통과에서 본실험의 활성 IgY 항체가 생존함을 명확하게 입증하며, 이는 치료 또는 예방용으로 경구 투여된 IgY 항체의 성공에 대한 우호적인 의미를 갖는 발견이다.
실시예 6
조류 항독소 항체에 대한 유형 씨. 보툴리누스 A 유형 신경독소의 생체내 중화
이 실시예는 마우스 내에서 씨. 보툴리누스 신경독소 A 유형의 치사 효과를 중화하는, 실시예 3에서 서술된 바대로 수득된 PEG-정제된 항독소의 능력을 입증했다. 독소 A의 경구 치사량 (LD100)을 결정하기 위하여 BALB/c 마우스의 군에 단위 체중 당 상이한 투여량의 독소를 주었다 (평균 체중 24그램). 경구 투여를 위하여, 기타 비독소 단백질과 관련된 신경독소를 함유한 독소 A 복합체를 사용했다. 이 복합체는 경구 경로에 의해 제공된 경우에 정제된 신경독소 보다 현저하게 더 독성이다. [I. Ohishi et al., Infect. Immun., 16:106(1977)]. 에릭 존슨 (위스콘신 대학, 매디슨 소재)로부터 얻은 씨. 보툴리누스 독소 A 유형 복합체는 비경구 투여에 의해 특이 독성 3x107 마우스 LD50/mg, pH 5.5의, 구연산나트륨 50mM 중 250㎍/ml였다. 보통 통상의 식품 및 물로 유지된 마우스에 있서 40 시간 내에 약 40 내지 50 ng/체중 그램이 치명적이었다. 마우스에게 수시로 엔파밀(등록상표) 만을 주는 경우에, 치사능을 생성하는 데 필요한 농도는 약 2.5배 (125ng/체중 그램) 더 높다. 약 200ng/체중 그램의 보툴리누스 독소 농도가 면역전 IgY를 함유하는 엔파밀(등록상표)(원래 노른자 용적의 엔파밀 (등록상표)으로 재현탁됨)이 급식된 마우스에게 치명적이었다.
또한 급식 바늘을 통하여 경구로 전달된 면역전 IgY-엔파밀(등록상표)의 공지량의 혼합물을 받은 마우스에게서 씨. 보툴리누스 독소의 경구 LD100을 측정했다. 22 게이지 급식 바늘을 사용하여, 마우스에게 보툴리누스 독소 투여 전 1 시간에 및 투여후 1/2 및 5 시간에 각각의 면역전 IgY-인슈어(등록상표) 혼합물 (원래 노른자 용적의 1/4에 용해된 면역전 IgY) 250㎕를 제공했다. 경구로 주어진 독소 농도는 약 12 내지 312ng/체중 그램 (마우스당 0.3 내지 7.5 ㎍) 범위였다. 체중 그램 당 약 40ng의 보툴리누스 독소 복합체 농도(마우스당 1㎍)가 36 시간 이내에 모든 마우스에게 치사량이었다.
군 당 10 마리의 BALB/c 마우스의 2개 군에게 각각 pH 5.5의 50 mM 구연산나트륨 100㎕ 중 각각의 보툴리누스 독소 복합체 1㎍의 단일 투여량을 경구로 주었다. 엔파밀(등록상표) 중 면역전 또는 면역 IgY의 혼합물 250㎕로 처리를 보툴리누스 독소 투여 1시간 전에 및 투여 1/2시간, 4시간 및 8시간 후에 마우스를 처리했다. 2일 이상 동안 매일 마우스를 세 번 처리했다. 이 마우스를 96 시간 동안 관찰했다. 생존율 및 치사율이 표 11에 제시되어 있다.
| 독소 투여량ng/그램 | 항체 유형 | 생존 마우스 수 | 치사 마우스 수 |
| 41.6 | 비면역 | 0 | 10 |
| 41.6 | 항보툴리늄 독소 | 10 | 0 |
면역전 IgY-엔파밀(등록상표)로 처리된 모든 마우스는 독소 투여 후 46 시간 내에 죽었다. 마우스의 평균 치사 시간은 독소 투여 32 시간 후였다. 면역전 IgY-엔파밀(등록상표) 혼합물의 처리는 이 군의 마우스에서 구강의 마비 확대로 인해 24 시간 이상 계속하지 않았다. 반면에, 면역 항-보툴리누스 독소 IgY-엔파밀(등록상표) 혼합물로 처리된 모든 10 마리 마우스는 96시간 후에 생존했다. 이 군에서 4 마리의 마우스만이 보툴리누스 중독 독성의 증상을 나타냈다 (독소 투여 후 2 마리의 마우스는 약 2일 후에 및 2마리의 마우스는 4일 후에 나타냈다). 상기 마우스는 결국 5 및 6일 후에 사망했다. 이 면역 군내 마우스 중 6 마리는 독소에 대해 역작용을 나타내지 않았고, 생존하고 건강하게 장기간 유지되었다. 따라서, 조류 항-보툴리누스 독소 항체는 실험 마우스 내에서 독소의 치사 효과로부터 매우 우수한 방어능를 나타냈다.
실시예 7
클로스트리듐 다이피셀 독소 A에 대항한 조류 항독소의 생산
독소 A는 위장 조직의 손상에 직접적인 역할을 하는 씨. 다이피셀의 병원성 균주에 의해 분비되는 강력한 세포독소이다. 씨. 다이피셀 중독의 보다 심각한 증례로, 치명적일수 있는 가막성 결장염이 나타날 수 있다. 이는 위장관 내에서 이 독소의 효과를 중화시킴으로써 에방될 것이다. 제1 단계로서, 독소의 부분에 대항해 항체를 생산했다. 이 실시예는 (a) 소 혈청 알부민에 독소 A의 합성 펩티드 접합; (b) 펩티드-BSA 접합체로써 암탉의 면역법; 및 (c) ELISA에 의한 항독소 펩티드 항체의 탐지를 포함한다.
a) 소 혈청 알부민에 대한 독소 A의 합성 펩티드의 접합
합성 펩티드 CQTIDGKKYYFN-NH2를 구입하고 (멀티 펩티드 시스템, 캘리포니아주 샌 디에고 소재), 고압 액상 크로마토그래피에 의해 순도 80% 미만임을 확인했다. 시스테인 잔기 다음의 11개 아미노산은 독소 A 내에서 발견된 반복 아미노산 서열의 보존 서열을 나타낸다. [Wren et al., Infect. Immun., 59:3151-3155(1991)]. 시스테인은 캐리어 단백질에로의 접합을 용이하게 하기 위해 첨가했다.
접합을 위한 캐리어를 제조하기 위하여, BSA (시그마)를 20mg/ml의 최종 농도로 pH 7.0의 0.01M NaPO4에 용해시키고, n-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS:피어스)를 5mg/ml의 농도로 N,N-디메틸 포름아미드 중에 용해시켰다. MBS 용액 0.51ml를 BSA 용액 3.25ml에 첨가하고, 매 5분 마다 교반하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. MBS-활성화된 BSA를 pH 7.0의 50mM NaPO4 완충액으로 평형상태가 된 바이오-겔 P-10 칼럼 (바이로-라드; 40 ml 층 용적) 상에서 크로마토크래피에 의해 정제시켰다. 피크 분획을 풀링했다 (6.0ml).
동결건조된 독소 A 펩티드 (20mg)을 활성 BSA 혼합물에 첨가하고, 펩티드가 용해될 때까지 교반시키고 실온에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 20분 내에 반응 혼합물이 탁해지기 시작하고 침강물이 형성되었다. 3시간 후에, 반응 혼합물을 10,000xg에서 10 분 동안 원심분리시키고 상등액의 단백질 함량을 분석했다. 280nm에서 유의한 단백질을 탐지할수 없었다. 접합체 침강물을 PBS로써 3회 세척하고 4℃에서 저장했다. 활성화된 BSA 15mg 및 펩티드 5mg으로써 제2 접합을 수행하고, 접합체를 풀링하고, pH 7.2의 10mM NaPO4 중 10mg/ml의 펩티드 농도로 현탁시켰다.
b) 펩티드 접합체로써 암탉의 면역법
두 마리의 암탉을 CFA (GIBCO) 중에 유화된 펩티드 접합체 1mg으로써 두 개의 피하 및 두 개의 근육내 부위에 주사하여 0일째에 초기 면역시켰다. 암탉을 IFA (GIBCO) 중에 유화된 펩티드 접합체 1mg으로서 14 및 21일째에 추가 자극 주사를 하였다.
c) ELISA에 의한 항독소 펩티드 항체의 탐지
면역법 전에 얻어진 두 개의 달걀로부터 (면역전), 및 실시예 1에 서술된 바의 PEG 분별을 사용하여 초기 면역법 후 31 및 32일에 얻은 두 개의 달걀로부터 IgY를 정제했다.
96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 (팔콘 프로-바인드 검정 플레이트)를 H2O 1.0ml 중에 펩티드 1mg을 용해시키고 PBS로 희석함으로써 제조된 pH 7.2의 PBS 중 독소 A 합성 펩티드의 100㎍/ml 용액으로 4℃에서 하룻밤 코팅시켰다. 면역전 및 면역 IgY 제제를 pH 7.2의 PBS 중 1% PEG 8000 및 0.1% 트윈-20 (v/v)를 함유하는 완충액 중에 5배 시리즈로 희석했다. 웰을 pH 7.2의 PBS 중 5% (v/v) 칼네이션(등록상표) 비지방 건조 우유 및 1% PEG 8000을 함유하는 용액 150㎕로써 실온에서 2 시간 동안 블로킹시켰다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에, 웰을 세척하고, 2차 토끼 항-닭 IgG-알카리성 포스파타제 (1:750)을 첨가하고, 웰을 다시 세척하고 색 전개를 실시예 1에 서술된 바대로 얻었다. 결과는 표 12에 제시되어 있다.
| PEG 제제의 희석율 | 410nm에서의 흡광도 | |
| 면역전 | 면역 항-펩티드 | |
| 1:100 | 0.013 | 0.253 |
| 1:50 | 0.004 | 0.039 |
| 1:2500 | 0.004 | 0.005 |
명확하게, 면역 항체는 독소 A의 상기 반복된 에피토프에 대항한 역가를 갖는다.
실시예 8
클로스트리듐 다이피셀 천연 독소 A 및 B에 대항한 조류 항독소의 생산
조류 항체가 씨. 다이피셀 독소의 중화에 효과적인지를 결정하기 위하여, 암탉을 천연 씨. 다이피셀 독소 A 및 B를 사용하여 면역시켰다. 생성된 달걀 노른자 항체를 추출하고 생체외에서 독소 A 및 B를 중화하는 능력에 대해 평가했다. 이 실시예는 (a) 독소 면역원의 제조, (b) 면역법, (c) 항독소의 정제, 및 (d) 독소 중화 활성의 검정을 포함한다.
a) 독소 면역원의 제조
씨. 다이피셀 천연독소 A 및 B 및 포름알데히드로써 천연 독소를 처리하여 제조된 씨. 다이피셀 톡소이드를 면역원으로서 사용했다. 씨. 다이피셀 톡소이드 A 및 B를 공지된 방법으로부터 변형된 절차에 의해 제조했다 (Ehrich et al., Infect. Immun, 28:1041 (1980). 천연 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B (테크 랩)의 별개 용액 (PBS 중 용액)을 각각 0.2mg/ml의 농도로 조정하고, 포름알데히드를 0.4%의 최종 농도로 첨가했다. 독소/포름알데히드 용액을 37℃에서 40시간 동안 인큐베이션시켰다. 자유 포름알데히드를 생성된 톡소이드 용액으로부터 4℃에서 PBS에 대항한 투석에 의해 제거했다. 앞서 공개된 보고서에서, 이 투석 단계를 수행되지 않았다. 따라서, 자유 포름알데히드는 톡소이드 제제내에 존재해야만 했다. 톡소이드 용액은 센트리프렙 농축기 유니트 (아미콘)을 사용하여 4.0mg/ml의 최종 톡소이드 농도로 농축시켰다. 두 개의 생성된 제제를 톡소이드 A 및 톡소이드 B롤 명명했다.
씨. 다이피셀 천연 독소는 독소 A 및 독소 B(테크 랩, 인크)의 원액을 센트리프렙 농축기 유니트 (아미콘)을 사용하여 4.0mg/ml의 최종 톡소이드 농도로 농축시켜 제조했다.
b) 면역법
상기 서술된 톡소이드 A 및 톡소이드 B를 사용하여 첫 번째 두 개의 면역법를 수행했다. 총 3개의 상이한 면역법을 병용했다. 첫 번째 면역군의 경우, 톡소이드 A 0.2 ml를 동량의 타이터 맥스 보조제 (CytRx) 중에 유화시켰다. 사용된 면역원의 양을 유지하고, 면역법 절차를 간소화하기 위하여 타이터 맥스를 사용했다. 이 면역군을 "CTA"로 명명했다. 두 번째 면역군의 경우에는, 톡소이드 B 0.1ml를 같은 용적의 타이터 맥스 보조제 중에 유화시켰다. 이 군은 "CTB"로 명명했다. 세 번째 면역군의 경우에는, 톡소이드 A 0.2ml와 톡소이드 B 0.2ml를 먼저 혼합하고, 결과의 혼합물을 타이터 맥스 보조제 0.4ml 중에 유화시켰다. 이 군은 "CTAB"로 명명했다. 이러한 방식으로, 3개의 별도의 면역원 유탁액을 제조하였고, 각각의 유탁액은 톡소이드 A (CTA) 또는 톡소이드 B (CTB) 2.0mg/ml의 최종 농도 또는 톡소이드 A 2.0 mg/ml 및 톡소이드 B 2.0mg/ml의 혼합물 (CTBA)을 함유했다.
0일째 날에, 지방 사육자로부터 얻은 화이트 레그혼 암탉을 하기와 같이 면역시켰다: CTA군. 각각의 암탉의 가슴 부위에 CTA 유탁액 50㎕의 두 번의 근육내 (I.M.) 주사에 의해 톡소이드 A 200㎍을 제공하여 4마리의 암탉을 면역시켰다. CTB군. 가슴 부위에 CTB 유탁액 50㎕의 두 번의 I.M. 주사에 의해 톡소이드 B 200㎍으로 한 마리의 암탉을 면역시켰다. CTAB군. 각각의 암탉의 가슴 부위에 CTAB 유탁액 100㎕의 두 번의 I.M. 주사에 의해 톡소이드 A 200㎍ 및 톡소이드 B 200㎍을 제공하여 4마리의 암탉을 면역시켰다. 두 번째 면역은 5주 후에, 상기 첫 번째 면역에 대해 정확하게 서술된 바대로 35일째에 수행했다.
미리 씨. 다이피셀 톡소이드로 면역된 암탉이 천연 독소를 사용한 후속 추가자극 면역법을 견뎌낼수 있는지를 결정하기 위하여, CTAB 군으로부터 한 마리의 암탉을 세 번째 면역시켰다. 이번에서 상기 섹션 (a)에 서술된 천연 독소 A 및 천연 독소 B의 혼합물을 사용했다 (상기 독소는 포름알데히드 처리하지 않았고 활성 형태로 사용했다). 이는 톡소이드만으로 면역시켜 성취된 것을 능가하도록 암탉에 의해 생산된 특이적 항독소 항체의 양 (역가) 및 친화성을 증가시키기 위해 수행되었다. 62 일째에, 천연 독소 A 200㎍ 및 천연 독소 B 200㎍를 함유한 독소 혼합물 0.1ml를 제조했다. 이 독소 혼합물을 타이터 맥스 보조제 0.1 ml 중에 유탁시켰다. 한 마리의 CTAB 암탉의 가슴 영역내로 각각 100㎕의 두 번의 근육내 주사에 의해 상기 면역원 유탁액으로 면역시켰다. 이 암탉을 날개 밴드로 표시히고, 약 1주의 기간 동안 역 효과에 대해 관찰하여, 이 기간 후에 암탉은 우수한 건강상태를 나타내었다.
상기 서술된 CTAB 암탉이 부작용 없이 천연 독소 A 및 B로써의 추가자극 면역법을 견뎠기 때문에, 나머지 암탉을 마찬가지로 천연 독소로써 추가 자극 주사하기로 결정했다. 70일째에, 추가자극 면역을 하기와 같이 수행했다: CTA 군. 4mg/ml 천연 독소 A 용액 0.2 ml를 동등 용적의 타이터 맥스 보조제 중에 유화시켰다. 4 마리의 암탉 중 각각을 상기 톡소이드 A 면역법에 대해 서술된 바대로 천연 독소 A 200㎍으로 면역시켰다. CTB군. 4mg/ml 천연 독소 B 용액 50㎕ 용적을 동등 용적의 타이터 맥스 보조제 중에 유화시켰다. 암탉을 상기 톡소이드 B 면역법에 대해 서술된 바대로 천연 독소 B 200㎍으로 면역시켰다. CTAB군. 4mg/ml 천연 독소 A 용액 0.15 ml 용적을 먼저 4mg/ml 천연 독소 B 용액 0.15ml 용적과 혼합시켰다. 그다음 결과의 독소 혼합물을 타이터 맥스 보조제 0.3ml 중에 유화시켰다. 3마리의 남은 암탉 (날개 밴드를 한 암탉은 이번에 면역시키지 않았다)을 상기 톡소이드 A+톡소이드 B 면역법(CATB)에 대해 서술된 바대로 천연 독소 A 200㎍ 및 천연 독소 B 200㎍으로 면역시켰다. 85 일째에, 모든 암탉에 상기 천연 독소를 사용한 첫 번째 추가자극을 위해 서술된 바대로 정확하게 수행된, 천연 독소를 사용한 두 번째 추가자극 면역을 제공했다.
모든 암탉이 부작용 없이 천연 독소로써의 추가 자극 면역를 견뎠다. 앞선 참고문헌에서는 포름알데히드-처리된 톡소이드의 사용을 서술하고 있으므로, 이는 명백히 처음으로 임의 면역법이 천연 씨. 다이피셀 독소를 사용하여 수행된 것이다.
c) 항독소의 정제
톡소이드로써 두 번째 면역법 후에 10 내지 12일째에 CTB 군내 암탉으로부
터, 및 톡소이드로써 두 번째 면역법 후에 20 내지 21일째에 CTA 및 CTAB 군내 암탉으로부터 달걀을 수집했다. 면역전 (음성) 대조로서 사용하기 위해, 동일한 무리로부터의 비면역 암탉으로부터도 달걀을 수집했다. 실시예 1(c)에 서술된 바의 4군의 달걀로부터 달걀 노른자 면역글로불린 (IgY)를 추출했다. 최종 IgY 펠렛을 티머로살 없이 원래 노른자 용적의 PBS 중에 용해시켰다. 하기 섹션 (d)에 서술된 독소 중화 검정에 사용된 CHO 세포에 대해 독성이므로 티모로살을 배제하는 것이 중요하다.
d) 독소 중화 활성의 검정
상기 섹션 (c)에서 제조된 IgY 용액의 독소 중화 활성을 공지된 방법으로부터 변형된 검정 시스템을 사용하여 평가했다. [Ehrich et al., Infect. Immun. 28:1041-1043 (1992); 및 McGee et al., Microb. Path. 12:333-341 (1992)]. 부가적인 대조로서, 친화성-정제된 염소 항-씨. 다이피셀 독소 A (테크 랩) 및 친화성-정제된 염소 항-씨. 다이피셀 독소 B (테크 랩)의 독소 중화 활성도 또한 검정했다.
IgY 용액 및 염소 항체를 2% FCS (GIBCO)가 보충된 F 12 배지 (GIBCO)(이 용액은 또한 이 실시예의 나머지 부분에서 "배지"로서 언급된다)를 사용하여 시리즈로 희석했다. 그 다음 결과의 항체 용액과 표준화된 농도의 천연 씨. 다이피셀 독소 A (테크 랩) 또는 천연 씨. 다이피셀 독소 B (테크 랩)을 하기 지시된 농도로 혼합했다. 37℃에서 60 분 동안 인큐베이션한 후에, 100㎕ 용적의 독소+항체 혼합물을 웰 당 2.5x104 차이니즈 햄스터 난소 (CHO)세포를 함유하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (팔콘 마이크로테스트 III)의 웰에 첨가했다 (CHO 세포는 플레이트 웰에 접착시키기 위해 하루 전에 이식시켰다). 하기에 나타낸 독소의 최종 농도 또는 항체의 희석율은 각각의 마이크로타이터 플레이트 웰내에 존재하는 각각의 시약의 최종 시험 농도를 말한다. 독소와 항체 혼합물에 대해 사용된 동일 농도의 CHO 세포 및 독소 A 및 독소 B를 함유하는 독소 기준 웰을 제조했다 (이 웰은 항체를 함유하지 않음). CHO 세포 및 배지만을 함유하는 별도의 대조 웰을 또한 제조했다. 그 다음, 검정 플레이트를 37℃의 가습시킨 5% CO2 인큐베이터에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션했다. 다음날, 플레이트 웰 내에 잔류한 접착 (생존) 세포를 2% 에탄올 중에 용해된 0.2% 크리스탈 바이올렛 (말린크로트)을 사용하여 10 분 동안 염색시켰다. 과량의 염료를 물로 헹궈 제거하고, 각각의 웰에 (물 중에 용해된) 1% SDS 100㎕을 사용하여 염색된 세포를 용해시켰다. 각각의 웰의 흡광도를 570nm에서 측정하고, 각각의 시험 시료 또는 혼합물의 세포독성 퍼센트를 하기 수학식을 사용하여 계산했다:
CHO 세포 세포 독성%=[1-(-------------)]×100
대조 흡광도
현미경에 의해 둘러싸인 세포를 계수하여 가시적으로 결과를 정량한 이전의 보고와는 달리, 이 실시예는 씨. 다이피셀 독소 생검정을 정량하기 위하여 분광계를 사용했다. CTA, CTAB, 및 면역전 IgY 제제, 뿐만아니라 친화성-정제된 염소 항독소 A 대조의 독소 A 중화 활성을 측정하기 위하여, 이들 항체의 희석액을 0.1㎍/ml의 천연 독소 A에 대항해 반응시켰다 (이는 검정계에서 독소 A의 약 50% 세포독소 투여량이다). 이 결과는 도 3에 도시되어 있다.
1:80 이하의 희석액에서도 독소 A의 완전한 중화가 CTA IgY 에 의해 발생한 한편, 유의한 중화가 1:320 희석액에서 발생했다 (상기 항독소 A). CTAB IgY (상기 항독소 A+독소 B)는 1:320 - 1:160 및 더 낮은 희석액에서도 완전한 중화를 나타내었고, 유의한 중화는 1:1280 희석액에서 발생했다. 시판되는 친화성-정제된 염소 항독소 A는 시험된 어떤 희석액에서도 독소 A를 완전히 중화하지 않았으나, 1:1,280의 희석액에서는 유의한 중화를 나타내었다. 면역전 IgY는 시험된 어떤 농도에서도 어떠한 독소 A 중화 활성을 나타내지 않았다. 이 결과는 독소 A 만으로, 또는 독소 A 및 독소 B로써 동시에 면역된 암탉이 낳은 달걀로부터 정제된 IgY가 효과적인 독소 A 항독소임을 입증한다.
CTAB 및 면역전 IgY 제제, 및 또한 친화성-정제된 염소 항독소 B 대조의 독소 B 중화 활성은 0.1ng/ml 농도의 천연 독소 B (검정계내 독소 B의 약 50% 세포독성 투여량)에 대항하여 이들 항체의 희석액을 반응시켜 측정했다. 결과는 도 4에 제시되어 있다.
CTAB IgY (상기 항독소 A+독소 B)는 1:40 및 더 낮은 희석액에서 독소 B의 완전한 중화를 발생하였고, 1:320 희석액에서 유의한 중화를 발생했다. 친화성-정제된 염소 항독소 B는 1:640 및 더 낮은 희석액에서 완전한 중화를 나타내었고, 유의한 중화는 1:2,560의 희석액에서 발생되었다. 면역전 IgY는 시험된 어떠한 농도에서도 어떠한 독소 B 중화 활성을 나타내지 않았다. 이 결과는 독소 A 및 독소 B로써 동시에 면역된 암탉이 낳은 달걀로부터 정제된 IgY 가 효과적인 독소 B 항독소임을 입증한다.
별도의 연구로, CTB, CTAB, 및 면역전 IgY 제제의 독소 B 중화 활성을 이들 항체의 희석액을 0.1㎍/ml 농도의 천연 독소 B (이 검정계에서 독소 B의 약 100% 세포독성 투여량)에 대항하여 반응시킴으로써 측정했다. 결과는 도 5에 제시되어 있다.
CTAB IgY (항독소 A+독소 B, 상기)가 1:40 및 더 낮은 희석액에서 독소 B의 완전한 중화 활성을 가짐이 밝혀진 한편, CTB IgY (독소 B, 상기)는 1:80 및 더 낮은 희석액에서 독소 B의 유의한 중화를 발생했다. 면역전 IgY는 시험된 어떠한 농도에서도 어떠한 독소 B 중화 활성을 나타내지 않았다. 이 결과는 독소 B만으로, 또는 독소 A 및 독소 B로써 동시에 면역된 암탉이 낳은 달걀로부터 정제된 IgY 가 효과적인 독소 B 항독소임을 입증한다.
실시예 9
씨. 다이피셀 독소 A 및 B에 대항한 조류 항독소에 의한 씨. 다이피셀 질병으로부터 골든 시리안 햄스터의 생체내 방어
씨. 다이피셀 질병을 연구하기 위한 동물 모델로서 가장 광범위하게 사용되는 것은 햄스터이다. [Lyerly et al., Infect. Immun, 47:349-352(1992)]. 몇가지 다른 항생물질 유발 설사병용 동물 모델이 있으나, 햄스터 모델 만큼 밀접하게 사람의 질병 형태를 모방하는 것은 없다. [R. Fekety. "항생물질 유발된 결장염의 동물 모델" in O. Zkd 및 M. Sande (편집), 항미생물 화학치료에서 실험 모델, 2권, 61-72페이지 (1986)]. 이 모델에서, 먼저 동물에게서 정상적으로 발생하는 위장내 세균총의 집단을 변화시키는 클린다마이신과 같은 항생물질을 경구 투여하여 질병에 대해 걸리기 쉽게 했다 (Fekety, 61-72페이지). 생존 씨. 다이피셀 균으로써 상기 동물을 경구 공격한 후에, 햄스터는 맹장염을 나타내었고, 출혈, 궤양 및 염증이 장내 점막에 분명히 나타난다 [Lyerly et al., Infect. Immun, 47:349-352(1985)]. 동물은 기면성이 되고, 심각한 설사증이 나타나고, 높은 퍼센트가 이 질병으로 죽었다. [Lyerly et al., Infect. Immun, 47:349-352(1985)]. 따라서, 이 모델은 씨. 다이피셀 질병의 치료 또는 예방을 위해 설계된 치료제의 평가에 이상적으로 적당하다.
상기 실시예 1에 서술된 조류 씨. 다이피셀 항독소의, 씨. 다이피셀 질병으로부터 햄스터를 방어하는 능력을 씨. 다이피셀 감염의 골든 시리안 햄스터 모델을 사용하여 평가했다. 이 실시예는 (a) 조류 씨. 다이피셀 항독소의 제조, (b) 조류 항독소로써 치료하여 씨. 다이피셀 질병으로부터 햄스터의 생체내 방어; 및 (c) 치료된 햄스터의 장기간 생존을 포함한다.
a) 조류 씨. 다이피셀 항독소의 제조
상기 실시예 1(b)에 서술된 CTA 및 CTAB 군의 암탉으로부터 달걀을 수집했다. 또한 면역전 (음성) 대조로서 사용하기 위하여, 지방 슈퍼마켓에서 달걀을 구입했다. 달걀 노른자 면역글로불린 (IgY)를 실시예 1(c)에 서술된 바의 3개 군의 달걀로부터 추출하고, 최종 IgY 펠렛을 원래 노른자 용적의 1/4의 인슈어(등록상표) 영양 배합물에 용해시켰다.
b) 조류 항독소로써 처리하여 씨. 다이피셀 질병에 대항한 햄스터의 생체내방어
상기 섹션 (a)에서 제조된 조류 씨. 다이피셀 항독소를 공지된 절차로부터 변형된 동물 모델 시스템을 사용하여 씨. 다이피셀 질병으로부터 햄스터를 방어하는 능력에 대해 평가했다 [Fekety, 61-72에서; Borrello et al., J. Med. Microbiol., 24:53-64 (1987); Kim et al., Infect. Immun., 55:2984-2992(1987); Borrello et al., J. Med. Microbiol., 25:191-196(1988); Delmee 및 Avesani, J. Med. Microbiol., 33:85-90(1990); 및 Lyerly et al., Infect. Immun., 59:2215-2218 (1991)]. 연구를 위하여, 세 개의 분리된 실험 군을 사용했다. 각각의 군은 약 10주 되고 약 100 그램 중량의 7 마리 암컷 골든 시리안 햄스터 (찰스 리버)로 구성했다. 세 개의 군을 "CTA", "CTAB" 및 "면역전"으로 명명했다. 이러한 명명은 각각의 군내 동물이 처리되는 항독소 제제에 상응한다. 각각의 독물을 개별 우리에 넣고, 수시로 전체 연구 기간 동안 음식 및 물을 공급했다. 1 일째에, 각각의 동물에게 세 개의 항독소 제제 (상기 섹션 (a)에서 제조) 중 하나의 1.0ml를 하기 시점에 경구 투여했다 : 0시간, 4시간, 및 8시간. 2 일째에, 1일째의 처리를 반복했다. 3 일째에, 0시간 시점에 각각의 동물에게 다시 상기 서술된 바의 항독소를 투여했다. 1시간 째에, 각각의 동물에게 물 1ml 중 클린다마이신-HCl (시그마) 3.0mg을 투여했다. 이 처리는 동물이 씨. 다이피셀로 감염되기 쉽게 했다. 가능한 내인성 씨. 다이피셀 집락 형성을 위한 대조로서, 동일한 무리(미처리)로부터의 부가적인 동물에게 동일한 방식으로 클린다마이신-HCl 3.0 mg을 투여했다. 클린다마이신 대조 동물은 나머지 연구 동안 미처리 (및 미감염)인 채로 남아있었다. 4시간 및 8시간 시점에 동물에게 상기 서술된 바와 같이 항독소를 투여했다. 4 일째에 0시간의 시점에 각각의 동물에게 다시 상기 서술된 바와 같이 항독소를 투여했다. 1시간 째에, 각각의 동물을 무균 염수 중에 약 100의 씨. 다이피셀 균주 43596 균이 함유된 씨. 다이피셀 접종물 1ml으로 경구 공격했다. 혈청군 C 균주인 씨. 다이피셀 균주 43596가 항생물질 관련 가막성 결장염에 걸린 환자로부터 단리된 가장 빈번하게 발생되는 혈청군 중 하나의 대표적인 것이므로 이 균주를 선택했다. [Delmee et al., J. Clin. Microbiol., 28:2210-2214 (1985)]. 게다가, 이 균주는 햄스터 감염 모델 내에서 독성임이 앞서 입증되었다. [Delmee 및 Avesani, J. Med. Microbiol., 33:85-90 (1990)]. 4시간 및 8시간 째의 시점에, 동물에게 상기 서술된 바와 같이 항독소를 투여했다. 5 내지 13 일째에, 상기 1 일째에 대해 서술된 바와 같이 매일 항독소를 3회 동물에게 투여하고, 설사증 및 치사의 징후를 관찰했다. 14 일째 아침에, 연구의 최종 결과를 표로 만들었다. 이 결과는 표 13에 제시되어 있다.
| 처리 군 | 생존 동물 수 | 치사 동물 수 |
| 면역전 | 1 | 6 |
| CTA (항독소 A만) | 5 | 2 |
| CTAB (항독소 A+항독소 B) | 7 | 0 |
면역전 및 CTA 군에서 치사 동물로부터의 대표 동물을 검시했다. 생존 씨. 다이피셀 균을 이들 동물의 맹장으로부터 배양했고, 이들 동물의 위장관의 심한 병의 상태는 씨. 다이피셀 질병에 대해 예측된 바 (묽은 설사 같은 물질로 채워진, 염증, 팽창, 출혈된 맹장)와 일치했다. 게다가, 클린다마이신 대조 동물은 전체 연구 기간 동안에 걸쳐 건강했고, 따라서 이는 이 연구에 사용된 햄스터가 연구의 시작 전에 내인성 씨. 다이피셀 균로써 앞서 집락 형성된 적이 없었음을 나타낸다. 13 일째에 최종 항독소 처리 후에, CTA 군으로부터, 및 또한 CTAB 군으로부터의 한 마리의 생존 동물을 죽여 검시했다. 어떤 동물도 병리 상태가 나타나지 않았다.
독소 A 및 독소 B 항독소 (CTAB 군)를 경구 투여한 햄스터 처리는 성공적으로 씨. 다이피셀 질병으로부터 동물 7마리 중 7마리(100%)를 방어했다. 독소 A 항독소 (CTA 군)를 경구 투여한 햄스터 처리는 씨. 다이피셀 질병으로부터 동물 7마리 중 5마리(71%)를 방어했다. 면역전 IgY를 사용한 처리는 이들 동물 7마리 중 1마리 (14%) 만이 생존하였으므로, 씨. 다이피셀 질병에 대항해 방어성이 아니었다. 이 결과는 조류 독소 A 항독소 및 조류 독소 A+독소 B 항독소가 씨. 다이피셀 질병으로부터 햄스터를 효과적으로 방어함을 입증한다. 이 결과는 또한 독소 A만의 중화가 씨. 다이피셀 질병에 대항해 적은 약간의 방어를 제공하지만, 최대 방어를 성취하기 위하여서는 동시 항독소 A 및 항독소 B 활성이 필요함을 시사한다.
c) 처리된 햄스터의 장기간 생존
소 항독소 IgG 농축물로 경투 투여 처리된 햄스터가 이 처리가 계속되는 한 씨. 다이피셀 질병으로부터 방어되나, 처리가 중단될 때 동물은 설사증이 나타나고 이후에 72시간 내에 치사한다고 앞서 문헌에 보고되었다. [Lyerly et al., Infect. Immun., 59(6):2215-2218 (1991)].
조류 항독소를 사용한 씨. 다이피셀 질병의 처리가 처리의 중단 후에 장기간 생존을 촉진시키는지를 결정하기 위하여, CTA 군 내의 4마리의 생존 동물, 및 CTAB 군 내의 6 마리 생존 동물을 상기 섹션 (b)에 서술된 항독소 처리의 중단 후에 11일 (264시간)의 기간동안 관찰했다. 모든 햄스터는 전체 처리후 기간 동안 건강했다. 이 결과는 조류 항독소가 씨. 다이피셀 질병의 징후에 대항하여 방어할 뿐만아니라 (즉, 예방용으로 효과적임), 또한 처리 기간을 넘어서 장기간 생존을 촉진하여 지속적인 치료를 제공함을 입증한다.
실시예 10
씨. 다이피셀 독소 A 및 B에 대항한 조류 항독소로써 골든 시리안 햄스터 내에서 발병된 씨. 다이피셀 감염의 생체내 처리
상기 실시예 8에 서술된 조류 씨. 다이피셀 항독소의 발병된 씨. 다이피셀 감염을 치료하는 능력을 골든 시리안 햄스터 모델을 사용하여 평가했다. 이 실시예는 (a) 조류 씨. 다이피셀 항독소의 제조, (b) 발병된 씨. 다이피셀 감염된 햄스터의 생체내 치료, 및 (c) 맹장 조직의 조직학 평가를 포함한다.
a) 조류 씨. 다이피셀 항독소의 제조
상기 실시예 8(b)에서 서술된 CTAB군 내의 암탉으로부터 씨. 다이피셀 톡소이드 및 천연 독소 A 및 B로써 면역된 달걀을 수집했다. 면역전 (음성) 대조로서 달걀을 지방 수퍼마켓에서 구입했다. 달걀 노른자 면역글로불린 (IgY)를 실시예 1(c)에 서술된 바의 달걀 2개 군으로부터 추출하고, 최종 IgY 펠렛을 원래 노른자 용적의 1.4의 인슈어(등록상표) 영양 배합물 중에 용해시켰다.
b) 씨. 다이피셀 감염된 햄스터의 생체내 처리
상기 섹션 (a)에서 제조된 조류 씨. 다이피셀 항독소를 상기 실시예 8 (b)에서의 햄스터 방어 연구를 위해 서술된 절차로부터 변형된 동물 모델계를 사용하여 햄스터 내에서 발병된 씨. 다이피셀 감염을 치료하는 능력에 대해 평가했다.
이 연구를 위하여 별도의 실험 군을 사용했다. 각각의 군은 각각 약 10주 되고, 약 100그램 중량의 7 마리의 암컷 골든 시리안 햄스터 (찰스 리버)로 구성했다. 각각의 동물을 따로따로 우리에 넣고, 전 연구 기간에 거쳐 수시로 음식 및 물을 제공했다.
연구 1 일째에, 모든 4개의 군내 동물에게 각각 물 1ml 중 클린다마이신-HCl 3.0mg (시그마)을 경구 투여하여 씨. 다이피셀 감염에 걸리기 쉽게 했다.
2 일째에, 모든 4개 군 내 각각의 동물을 무균 염수 중 약 100의 씨. 다이피셀 균주 43596 균이 함유된 씨. 다이피셀 접종물 1ml로 경구 공격했다. 씨. 다이피셀 균주 43596가 항생물질 관련 가막성 결장염에 걸린 환자로부터 단리된 가장 빈번하게 발생되는 혈청군 중 하나의 대표적인 것이므로 이 균주를 선택했다. [Delmee et al., J. Clin. Microbiol., 28:2210-2214 (1990)]. 게다가, 이것이 모든 상기 실시예에서 사용된 씨. 다이피셀 균주와 동일하므로 실험을 연속성을 제공하기 위하여 이를 다시 사용했다.
연구 3 일째에 (감염 후 24시간), 4개의 동물군 중 2개에 대해 처리를 시작했다. 한 군의 각각의 동물에게 하기 시점: 0시간, 4시간, 및 8시간 째에 CTAB IgY 제제 (상기 섹션 (a)에서 제조) 1.0ml를 경구 투여했다. 이 군내의 동물을 "CTAB-24"로 명명했다. 제2군 내의 동물에게 각각 면역전 IgY 제제 1.0ml로 (또한 상기 섹션 (a)에서 제조) CTAB군에 대해서와 동일한 시점에 경구 투여했다. 이들 동물을 "Pre-24"로 명명했다. 3 일째에 나머지 2개 군의 동물에 대해서는 아무것도 수행하지 않았다.
4 일째날에, 면역후 48시간 후에, 상기 3 일째에 대해 서술된 처리를 CTAB-24 및 Pre-24 군들에 대해 반복하고, 동일 시점에 나머지 2개 군에 대해 개시했다. 최종 2개 군의 동물을 "CTAB-48" 및 "Pre-48"로 각각 명명했다.
5 내지 9 일째에, 모든 4개 군 내의 동물에게 상기 4 일째에 대해 서술된 바와 같이 매일 항독소 또는 면역전 IgY를 3회 투여했다. 4개의 실험군을 표 14에 요약했다.
| 군 명칭 | 실험 처리 |
| CTAB-24 | 감염, 감염 후 24시간 째부터 w/항독소 IgY 처리 |
| Pre-24 | 감염, 감염 후 24시간 째부터 w/면역전 IgY 처리 |
| CTAB-48 | 감염, 감염 후 48시간 째부터 w/항독소 IgY 처리 |
| Pre-48 | 감염, 감염 후 48시간 째부터 w/면역전 IgY 처리 |
모든 동물을 10 일째의 아침에 연구 결과를 통하여 설사증 및 치사의 징후에 대해 관찰했다. 이 연구 결과는 표 15에 제시되어 있다.
| 처리군 | 생존 동물수 | 치사 동물수 |
| CTAB-24 | 6 | 1 |
| Pre-24 | 0 | 7 |
| CATB-48 | 4 | 3 |
| Pre-48 | 2 | 5 |
감염후 24시간 째에 항독소 IgY로 처리를 받기 시작한 동물(상기 CTAB-24)의 86%가 생존한 한편, 감염후에 48시간 째에 출발하여 항독소 IgY로 처리된 동물(상기 CTAB-48)의 57%가 생존했다. 반면에, 감염후 24시간 째에 출발하여 면역전 IgY를 받은 동물(상기 Pre-24) 중 어느 동물도 생존하지 않았고, 감염후 48시간 째에 면역전 IgY로 처리를 받기 시작한 동물(상기 Pre-48) 중 29% 만이 연구 결과를 통해 생존했다. 이 결과는 씨. 다이피셀 독소 A 및 B에 대항하여 발생된 조류 항독소가 생체내 발병된 씨. 다이피셀 감염을 성공적으로 치료할수 있음을 입증한다.
c) 맹장 조직의 조직학 평가
이 연구에서 시험된 IgY 제제의 발병된 씨. 다이피셀 감염을 치료하는 능력을 더 평가하기 위하여, 상기 섹션 (b)에 서술된 연구로부터의 대표 동물로부터 얻어진 맹장 조직 표본에 대한 조직학 평가를 수행했다.
치사후 바로, Pre-24 및 Pre-48군에서 치사된 동물로부터 맹장 조직 표본을 떼어냈다. 연구를 완료한 후에, 대표 생존 동물을 죽여 맹장 조직 표본을 CTAB-24 및 CTAB-48군으로부터 떼어냈다. 이 연구에 사용된 것으로 동일한 무리로부터의 한 마리 미처리된 동물을 죽여 정상 대조로서 맹장 조직 표본을 떼어내었다. 모든 조직 표본을 10% 완충 포르말린 중에 4℃에서 하룻밤 고정시켰다. 고정된 조직을 파라핀에 끼워넣고, 구획하여 현미경 유리 슬라이드 상에 올려 놓았다. 조직 섹션을 헤마독실린 및 에오신 (H 및 E 염료)를 사용하여 염색하고, 광 현미경으로 관찰했다.
관찰시에, CTAB-24 및 CTAB-48 동물로부터 얻어진 조직은 병리 상태를 나타내지 않았고, 정상 대조와 구별되지 않았다. 이 관찰은 발병된 씨. 다이피셀 감염을 효과적으로 치료하고, 씨. 다이피셀 질병의 결과로서 보통 발생하는 병리학적 결과를 막는, 씨. 다이피셀 독소 A 및 B에 대항해 발생된 조류 항독소의 능력에 대한 부가적인 증거를 제공한다.
반면에, 씨. 다이피셀 질병으로 치사된 Pre-24 및 Pre-48 군으로부터의 동물 조직에서 특징적인 실질적인 점막 손상 및 파괴가 관찰되었다. 점액층의 대부분이 벗겨져 없어졌으므로, 이들 두 개의 제제에서는 정상 세포 구조가 말소되었고, 대량의 적혈구를 함유하는 무수한 큰 출혈 면이 있었다.
실시예 11
씨. 다이피셀 독소 A 단편의 클로닝 및 발현
독소 A 유전자를 클로닝하여 서열화하고, 308kd의 예상 분자량의 단백질을 코딩함을 입증했다. [Dove et al. Infect. Immun., 58:480-488(1990)]. 천연 독소 A 단백질의 단리 비용 및 어려움을 가정하면, 면역법 목적을 위해 고 수준의 재조합 독소 A 단백질을 생산하고 정제하는 간단하고 값싼 원핵세포 발현계를 사용하는 것이 이로울 것이다. 이상적으로, 단리된 재조합 단백질은 용해성이 된 봉입체 단백질이 종종 천연 형태로 폴딩(fold)되지 않으므로, 천연 항원성을 보존하기 위해서는 용해성일 것이다. 정제를 용이하게 하기 위하여, 재조합 단백질은 이. 콜라이 배양물의 리터 당 1mg 이상의 수준으로 발현되어야 한다.
고수준의 재조합 독소 A 단백질이 이. 콜라이 내에서 생산될수 있는지를 결정하기 위하여, 독소 A 유전자의 단편을 다양한 원핵 발현 벡터내로 클로닝시키고, 이. 콜라이 내에서 재조합 독소 A 단백질을 발현하는 능력에 대해 평가했다. 3개의 원핵 발현계를 사용했다. 이. 콜라이 내에서 융합 (pMALc 및 pGEX2T) 또는 천연 (pET23a-c) 단백질을 고수준으로 발현하고, 리간드 함유 칼럼 상에서 발현된 단백질의 친화성 정제가 가능하기 때문에, 상기 계를 선택했다. pGEX 벡터로부터 발현된 융합 단백질은 글루타티온 아가로스 비드에 결합하고, 환원된 글루타티온으로 용리된다. pMAL 융합 단백질은 아밀로즈 수지에 결합하고, 말토오즈로써 용리된다. 폴리-히스티딘 표지가 pET 융합 단백질의 N-말단 (pET16b) 또는 C-말단 (pET23a-c) 끝에 존재한다. 이 서열은 특이적으로 Ni2 - 킬레이트 칼럼에 결합하고 이미다졸 염으로 용리된다. 이 벡터에 대한 광범위한 서술이 있으며 (Williams et al., (1994) DNA 클로닝, 발현계), 본원에서는 상세히 논의하지 않을 것이다. 이 실시예는 (a) 독소 A 유전자의 클로닝, (b) 다양한 원핵 발현계 내에서 독소 A의 대형 단편의 발현 (c) 이. 콜라이 내에서 효율적으로 발현하는 독소 A 유전자 소단편의 동정, (d) 친화성 크로마토그래피에 의한 재조합 독소 A 단백질의 정제 및 (e) 독소 A 유전자의 재조합 단편의 작용 활성의 입증을 포함한다.
a) 독소 A 유전자의 클로닝
독소 A 유전자의 제한 지도는 도 6에 도시되어 있다. 코딩된 단백질은 탄수화물 결합 영역의 다수 반복체를 함유하는 카르복시 말단 리간드 결합 영역을 함유한다. [von Eichel-Streiber and Sauerborn, Gene 96:107-113 (1990)]. 특이 영역 (영역 1 및 2, 도 6)을 증폭시키는 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하거나, 또는 특이 독소 A 유전자 단편 (영역 3, 도 6)에 대해 구성된 게놈성 라이브러리를 스크리닝함으로써 독소 A 유전자를 세 조각으로 클로닝시켰다. 사용된 PCR 프라이머의 서열은 다음과 같다:
P1: 5' GGAAATT TAGCTGCAGCATCTGAC 3' (SEQ ID NO:1);
P2: 5' TCTAGCAAATTCGCTTGT GTTGAA 3' (SEQ ID NO:2);
P3: 5' CTCGCATATAGCATTAGACC 3' (SEQ ID NO:3); 및
P4: 5' CTATCTAGGCCTAAAGTAT 3' (SEQ ID NO:4).
이들 영역은 이. 콜라이 내에서 고수준으로 융합 (pMALc 및 pGEX2T) 또는 천연 (pET23a-c) 단백질을 발현하는 원핵 세포 발현 벡터 내로 클로닝되어, 리간드 함유 칼럼 상에서 발현 단백질의 친화성 정제를 가능하게 한다.
클로스트리듐 다이피셀 VPI 균주 10463을 ATCC (ATCC #43255)로부터 얻고 뇌 심장 융합 배지 (BBL)내에서 혐기성 조건하에 증식시켰다. 고분자량 씨. 다이피셀 DNA를, 세균을 붕괴시키는 데 프로테이나제 K 및 황산도데실나트륨 (SDS)를 사용하고, 문헌[Ausubel et al., 분자 생물학에서 최근 프로토콜 (1989)]에 서술된 바대로 세틸트리메틸암모늄 브롬화물 제제를 사용하여 깨끗하게 된 용해물로부터 탄수화물을 제거하는 것을 제외하고, 하기 문헌에 서술된 바대로 근본적으로 단리시켰다: 문헌[Wren 및 Tabaqchali (1987), J. Clin. Microbiol., 25:2402]. 게놈성 DNA의 완결성 (integrity) 및 수율은 아카로스 겔 상에서 전기영동시킨 후에 미절단 람다 DNA의 시리즈 희석액과 비교하여 평가하였다.
교정 열안정성 DNA 폴리머라제 (천연 pfu 폴리머라제:스트라타젠)를 사용하여 단편 1 및 2를 PCR에 의해 클로닝시켰다. 이 폴리머라제의 높은 연합성은 에러 프론 폴리머라제 (예컨대, Taq 폴리머라제)에 의한 증폭과 관련된 변이 문제를 감소시킨다. PCR 증폭은 지시된 PCR 프라이머 (도 6)를 사용하여 10mM 트리스-HCl (8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 각각의 dNTP 200μM, 각각의 프라이머 0.2μM, 및 씨. 다이피셀 게놈성 DNA 50ng을 함유하는 50㎕ 반응액 내에서 수행했다. 반응물을 100㎕의 광유로 씌우고, 4 분동안 94℃에서 가열하고, 0.5㎕ 천연 pfu 폴리머라제 (스트라타젠)을 첨가시키고, 반응을 94℃에서 1분 동안, 50℃에서 1분 동안, 72℃에서 4분 동안, 이어서 72℃에서 10분 동안 30회 순환시켰다. 두 개의 반응물을 풀링하고, 클로로포름 추출시키고 에탄올 침강시켰다. 70% 에탄올 중에 세척한 후에, 펠렛을 50㎕ TE 완충액 [10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA pH 8.0] 중에 재현탁시켰다. 10㎕의 각각의 부분시료를 EcoRI/HincII (단편 1) 또는 EcoRI/PstI (단편 2)로 제한 소화시키고, Prep-A유전자 키트 (바이오라드)를 사용하여 적당한 제한 단편을 겔 정제시키고, EcoRI/SmaI-제한된 pGEX2T (파마시아) 벡터 (단편 1) 또는 EcoRI/PstI pMAlc (뉴 잉글랜드 바이오랩스) 벡터 (단편 2)에 리게이션시켰다. 두 개의 클론 모두 글루타티온-S-트랜스퍼라제 단백질 (pGEX 벡터) 또는 말토오즈 결합 단백질 (pMAL 벡터)와 인-프레임 (in-frame) 융합체를 생산한다고 예측된다. 재조합 클론이 단리되었고, 제한 소화에 의해, 표준 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 동정하였다. [Sanbrook et al., 분자 클로닝, 실험실 매뉴얼 (1989) 및 각각 pGA30-660 및 pMA660-1100으로 명명 (클론 명명에 대한 서술은 도 6 참조)].
단편 3을 표준 분자 생물학 기술 (Sambrook et al.)을 사용하여 크기 선택된 PstI 소화된 씨. 다이피셀 게놈성 DNA의 게놈성 라이브러리로부터 클로닝시켰다. 단편 3 내부 PstI 부위가 씨. 다이피셀 게놈성 DNA 내에서 분열로부터 방어된다는 가정하에 [Price et al., Curr. Microbiol., 16:55-60 (1987)], PstI 제한된 씨. 다이피셀 게놈성 DNA로부터의 4.7 kb 단편을 겔 정제하고, PstI 제한된, 포스파타제 처리된 pUC9 DNA에 리게이션시켰다. 생성된 게놈성 라이브러리를 단편 3에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머로 스크리닝시키고, 다수의 독립적인 클론을 단리시켰다. 이들 클론 중 몇몇에서 단편 3의 존재를 제한 소화에 의해 확인했고, 지시된 배향의 클론(도 6)을 BamHI/HindIII로써 제한시키고, 방출된 단편을 겔 전기영동에 의해 정제시키고, 유사하게 제한된 pET23c 발현 벡터 DNA (노바겐) 내로 리게이션시켰다. 재조합 클론을 단리하고, 제한 소화에 의해 확인했다. 이 구성체는 예측된 pET 단백질 선단 서열을 갖는 인 프레임 융합체, 뿐만아니라 예측된 C-말단 폴리-히스티딘 친화성 표지를 창출한다고 예측되며, 이를 pPA1100-2680으로 명명했다 (클로닝 명명법에 대해서는 도 6 참조).
b) 이. 콜라이 내에서 독소 A의 대형 단편의 발현
(a)에서 제조된 3개의 발현 구성체로부터의 단백질 발현을 유발하고, 친화성 정제된, 독소 A 톡소이드에 대항해 지시된 염소 폴리클론성 항혈청으로 웨스턴 불롯 분석에 의해 이를 분석했다. 단백질 유발에 사용된 절차, SDS-PAGE, 및 웨스턴 블롯 분석은 문헌 [Williams et al (1994), 앞의 책]에 상세히 서술되어 있다. 간략히, 4ml 2X YT (리터 당 pH 7.5의 16g 트립톤, 10g 효모 추출물, 5g NaCl+암피실린 100㎍/ml)를, IPTG를 1mM로 첨가함으로써 재조합 단백질의 발현이 유발되는 적당한 재조합 클론을 함유하는 세균의 배양물에 (pMA1 및 pGEX 플라즈미드의 경우 BL21 및 pET 플라즈미드의 경우는 BL21(DE3)LysS) 첨가했다. 배양물을 37℃에서 증식시키고, 세포 밀도가 0.5OD600에 도달할 때까지 유발시켰다. 유발된 단백질을 유발 후에 2시간 동안 축적시켰다. 원심분리에 의해 세균의 1ml 부분시료를 펠렛화하고, 펠렛화된 세균을 150㎕의 2x SDS-PAGE 시료 완충액 중에 재현탁시켜 단백질 시료를 제조했다. [Williams et al., (1994) 앞의 책]. 상기 시료를 95℃에서 5분 동안 가열하고 5 또는 10㎕ 부분시료를 7.5% SDS-PAGE 겔 상에 로딩(load)시켰다. 바이오라드 고분자량 단백질 마커도 또한 로딩하여 동정된 융합 단백질의 분자량을 측정했다. 전기영동 후에, 단백질을 일반적으로 쿠마시 블루로 겔 염색하거나, 또는 특이적으로 특이 면역반응 단백질의 웨스턴 블롯 탐지를 위한 니트로셀룰로오스에로의 블롯팅에 의해 탐지했다. 3개의 발현 구성체로부터 유발된 단백질의 세포 용해물 내 반응성 단백질을 탐지한 웨스턴 블롯 (실시예 3에 서술된 바대로 수행)이 도 7에 도시되어 있다. 이 도면에서, 레인 1-3은 B121(DE3)lysE 세포내 pPA1100-2860을 함유하는 이. 콜라이 균주로부터 제조된 세포 용해물을 함유하고; 레인 4-6은 B121(DE3)lysE 세포내 pPA1100-2860을 함유하는 이. 콜라이 균주로부터 제조된 세포 용해물을 함유하고; 레인 7-9는 pMA30-660을 함유하는 이. 콜라이 균주로부터 제조된 세포 용해물을 함유하고; 레인 10-12는 pMA660-1100을 함유하는 이. 콜라이 균주로부터 제조된 세포 용해물을 함유한다. 이 레인들을 친화성 정제된 염소 항독소 A 폴리클론성 항체로써 프로빙(probe)했다 (테크 랩). 미유발 세포로부터의 대조 용해물 (레인 1, 7 및 10)은 나머지 레인 내에 유발된 시료에 비하여 매우 적은 면역 반응성 물질을 함유한다. 최고 분자량 밴드를 각각의 클론이 전체 길이 용합 단백질의 예측 크기와 일치하는지에 대해 관찰하였다.
각각의 구성체는 독소 A 항체와 반응성인 고분자량 (HMW) 단백질의 발현을 지시한다. 각각의 시료로부터의 최대 면역반응성 밴드의 크기는 원래 융합 단백질의 예상 분자량의 예측치와 일치한다. 이는 3개의 융합물이 인-프레임이고, 클론 중 어느 것도 코딩된 융합 단백질의 완결성을 방해하는 클로닝 인위 구조를 함유하지 않음을 입증한다. 그러나, 웨스턴 블롯은 두 개의 대형 구성체 (pGA30-660 및 pPA1100-2680)으로부터의 융합 단백질이 매우 붕괴됨을 나타낸다. 또한, 유발된 단백질 밴드가 쿠마시 염색 (제시되지 않음)에 의해 가시적이지 않으므로 이들 2개의 구성체로부터의 독소 A 단백질 발현 수준이 낮다. pMALc 또는 pET23a-c 발현 벡터 중 하나에 독소 A 유전자의 대형 아영역을 융합시킨 몇 개의 기타 발현 구성체를 구성하여 단백질 유발을 시험했다. 이들 구성체는 적절하게 분리된 발현 벡터와 도 6에 도시된 발현 구성체로부터 유래된 겔 정제된 제한 단편을 혼합하고, 리게이션시키고, 인-프레임 용합체로 예측되는 바의 발현 벡터내로 및 독소 A 제한 단편이 함께 리게이션된 재조합 클론을 선택하여 제조했다. 상기 구성체 내의 발현된 독소 A 인터벌은 도 8에 도시되어 있고, 뿐만아니라 사용된 인터벌 제한 부위도 이들 구성체에 표시되어 있다.
본원에 사용된 바의 "인터벌(interval)"이란 용어는 클로스트리듐 독소의 임의 부분 (즉, 전체 독소 분자 보다 적은 독소의 임의 세그먼트)를 말한다. 바람직한 실시양태로, "인터벌"은 독소 A 또는 독소 B와 같은 씨. 다이피셀 독소의 부분들을 말한다. 또한 이들 인터벌은 대항하여 중화 항체 반응이 수행되는 항원 또는 면역원과 같은 면역학적으로 중요한 에피토프에 대응할 것이라고 생각된다. 본발명은 이 실시예에 서술된 특정 인터벌 또는 서열에 제한되지 않는다. 또한, 인터벌의 아부분들 (예컨대, 하나의 인터벌 내에 함유된 또는 다수의 인터벌을 연결한 에피토프)가 조성물로서 및 본발명의 방법에 사용되는 것을 고려한다.
모든 경우에, 염소 항독소 A 항체 (테크 랩)를 사용한 이들 구성체 각각의 웨스턴 블롯 분석은 예상된 크기의 고분자량 융합 단백질을 탐지했다(도시되지 않음). 이는 상기 클론 각각의 리딩 프레임이 조기에 종료되지 않고, 융합 파트너와 정확한 프레임내에 융합됨을 입증한다. 그러나, 웨스턴 블롯 분석은 모든 경우에, 유발된 단백질이 매우 붕괴되고, 쿠마시 블루 염색에 의해 동정가능하게 유발된 단백질 밴드의 부재에 의해 추정되는 바와 같이 단지 낮은 수준으로 발현됨을 밝혔다. 이 결과는 높은 수준의 원래의 독소 A 재조합 단백질 발현이, 독소 A 유전자의 대형 영역이 이. 콜라이내에서 이들 발현 벡터를 사용하여 발현되는 경우에 가능하지 않음을 시사한다.
c) 이. 콜라이 내에서 소형 독소 A 단백질 융합체의 고수준 발현
경험은 대형 (100kd 이상) 단편이 이. 콜라이 내에서 발현될 때 종종 발현의 어려움을 만나게 됨을 나타낸다. 독소 A 유전자의 더 소단편을 함유하는 다수의 발현 구성체를 구성하여 유전자의 소영역이 광범위한 단백질 붕괴없이 고수준으로 발현될수 있는지를 평가했다. 이들 발현 구성체에 대한 요약이 도 9에 도시되어 있다. 모두 pMALc 또는 pET23a-c 벡터에 통상의 독소 A 제한 단편의 인-프레임 융합에 의해 구성했다. 각각의 상기 구성체의 유발된 배양물로부터의 단백질 제제를 쿠마시 블루 염색 및 상기 (b)에서의 웨스턴 분석에 의해 분석했다. 모든 경우에, 섹션 (b)로부터의 더 대형 재조합체에서 보다, 원래의 전체 길이 융합 단백질이 더높은 수준임이 관찰되었다.
d) 재조합 독소 A 단백질의 정제
(c)로부터의 각각의 재조합체의 대규모 (500ml) 배양물을 증식시키고, 유발시키고, 융해성 및 불용성 단백질 분획을 단리시켰다. 용해성 단백질 추출물을 친화성 크로마토그래피시켜 상기 서술된 바대로 재조합 융합 단백질을 단리시켰다. [Williams, et al., (1994) 앞의 책]. 간략하게, 표지된 pET 융합체를 함유하는 추출물을 니켈 킬레이트 칼럼 상에 크로마토그래피시키고, 이미다졸 염을 사용하여 공급자가 서술한 바대로 용리시켰다 (노비겐). 용해성 pMAL 융합 단백질을 함유하는 추출물을 제조하고 아밀로즈 수지 칼럼 (뉴 잉글랜드 바이오랩스) 상의 칼럼 완충액 (10 mM NaPO4, 0.5M NaCl, 10mM β-메르캅토에탄올, pH7.2) 내에서 크로마토그래피시키고 상기 서술된 10mM 말토오즈를 함유하는 칼럼 완충액으로 용리시켰다 [Williams, et al., (1994) 앞의 책]. 발현된 단백질이 거의 불용성인 경우에, 불용성 단백질 추출물을 하기 실시예 17에 서술된 방법에 의해 제조했다. 결과는 표 16에 요약되어 있다. 도 10은 재조합 독소 A 단백질의 시료 정제를 도시한다. 이 도면에서, 레인 1 및 2는 용해성 단백질의 친화성 정제에 의해 정제된 MBP 융합 단백질을 함유한다.
| 클론(a) | 단백질 용해도 | 친화성 정제된 용해성 단백질의 수율(b) | 원래의 용해성 융합 단백질%(c) | 원래의 불용성 융합 단백질 수율 |
| pMA30-270 | 용해성 | 4mg/500ml | 10% | NA |
| pMA30-300 | 용해성 | 4mg/500ml | 5-10% | NA |
| pMA30-660 | 불용성 | - | NA | 10mg/500ml |
| pMA660-1100 | 용해성 | 4.5mg/500ml | 50% | NA |
| pMA1100-1610 | 용해성 | 18mg/500ml | 10% | NA |
| pMA1610-1870 | 모두 | 22mg/500ml | 90% | 20mg/500ml |
| pMA1450-1870 | 불용성 | - | NA | 0.2mg/500ml |
| pMA1100-1450 | 용해성 | 0.1mg/500ml | 90% | NA |
| pMA1100-1870 | 용해성 | 0.02mg/500ml | 90% | NA |
| pMA1871-2680 | 모두 | 12mg/500ml | 80% | NA |
| pMA1870-2680 | 불용성 | - | NA | 10mg/500ml |
(a) pP=pET23 벡터, pM=pMALc 벡터, A=독소 A
(b) 1.5OD280 기준 = 1mg/ml (MBP의 소멸 계수)
(c) SDS PAGE 겔의 쿠마시 염색에 의한 측정
레인 3 및 4는 불용성 봉입체의 용해도에 의해 정제된 MBP 용합 단백질을 함유한다. 정제된 융합 단백질은 pMA1870-2680 (레인 1), pMA660-1100 (레인 2), pMA300-600 (레인 3) 및 pMA1450-1870 (레인4)이다.
폴리-히스티딘 표지된 pET 벡터를 사용하여 발현을 시키는 경우에(pPA1100-1450, pP1100-1870) 친화성 정제된 단백질의 불량한 수율이 얻어졌다. 그러나, 전체 독소 A 유전자를 연결한 pMAL 발현 구성체로부터는 유의한 단백질이 얻어졌고, 전체 길이 용해성 융합 단백질의 수율은 예상된 200-400㎍/500ml 배양물 (pMA30-300) 내지 20mg/500ml 이상 배양물 (pMA1610-1870)의 범위였다. 엄격한 불용성 단백질 (pMA300-600)으로서 단지 하나의 인터벌이 고수준으로 발현되었다. 따라서, 고수준 발현이 관찰되지 않지만, 독소 A 유전자로부터 대형 발현 구성체를 사용한 경우에 전체 독소 A 유전자를 연결하는 일련의 pMAL 발현 소구성체로부터 유발된 단백질을 단리함으로써 전체 독소 A 유전자를 연결한 사용가능한 수준의 재조합 단백질을 얻을 수 있었다. 이는 이. 콜라이 내에서 고수준으로 재조합 독소 A 단백질을 발현하는 실행능력에 대한 첫 번째 증명이다.
e) 독소 A 재조합 단백질을 사용한 혈구응집 검정
반복 단위로 이루어진 카르복시 말단 끝은 씨. 다이피셀 독소 A의 응집 활성 또는 결합 영역을 함유한다. 발현된 독소 A 재조합체가 작용 활성을 보유하는지를 결정하기 위하여, 응집 검정을 수행했다. 용해성 친화성 정제된 단백질 (pMA1870-2680) 또는 SDS 용해된 봉입체 단백질 (pPA1870-2680)으로서 결합 영역 및 상기 영역 외의 한 영역으로부터의 용해성 단백질 (pMA1100-1610)을 함유하는 것인 2개의 독소 A 재조합 단백질을 상기 서술된 절차를 사용하여 시험했다. [H.C. Krivan et al., Infect. Immun., 53:573 (1986)]. 시트레이티드 토끼 적혈 세포 (RRBC) (코칼리코)를 트리스 완충액 (0.1M 트리스 및 50mM NaCl)로써 대여섯 회 4℃에서 10 분 동안 450xg에서 원심분리에 의해 세척했다. 1% RRBC 현탁액을 상기 충전된 세포로부터 제조하고 트리스-완충액 중에 재현탁시켰다. 재조합 단백질 및 천연 독소 A (테크 랩)의 희석액을 트리스-완충액 중에 제조했고 100㎕의 최종 용적으로 둥근 바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 두 번 첨가시켰다. 각각의 웰에 1% RRBC 현탁액 50㎕를 첨가하고, 온화한 탭핑하에 혼합하고 4℃에서 3-4시간 동안 인큐베이션시켰다. 유의한 혈구 응집은 결합 영역 (pMA 1870-2680) 및 천연 독소 A를 함유하는 재조합 단백질에서만 발생했다. 결합 영역 (pMA 1100-1610) 외측의 재조합 단백질은 혈구 응집 활성을 나타내지 않았다. 동등한 단백질 농도를 사용하여, 독소 A에 대한 혈구 응집 역가는 1:256이고, 한편 결합 영역의 용해성 및 불용성 재조합 단백질에 대한 역가는 1:256 및 약 1:5000이었다. 명확하게, 시험된 재조합 단백질은 작용 활성을 보유했고 RRBC에 결합할 수 있었다.
실시예 12
독소 A 재조합체에 대항해 반응성인 IgY의 작용 활성
이. 콜라이 내에서 다수의 단편으로서 재조합 독소 A 단백질의 발현은 재조합 방법의 사용을 통해 독소 A 항원을 발생하는 실행 능력을 입증한다 (실시예 11). 상기 재조합 단백질의 단리로 인해 독소 A 단백질의 각각 개별 아영역의 면역반응성을 결정할 수 있게 된다 (즉, 천연 독소 A 단백질에 대항해 탐지된 항체 풀 내에서). 이는 전체 단백질을 면역원으로 사용하는 경우에, (있다면) 거의 또는 전혀 항체 반응이 야기되지 않는 영역을 동정한다. 독소 A 단백질의 특이 단편에 대항해 지시된 항체는 재조합 독소 A 단백질에 대항한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될수 있으며, 중화 능력에 대해 시험했다. 이는 중화 항체를 생산하는 데 임의 독소 A의 필수적인 아영역을 동정한다. 천연 독소를 면역원으로서 사용하는 경우에 상기 인터벌에 대항해 지시된 면역 반응 수준들과의 비교는 강력하게 더높은 중화 항체 역가가 전체 단백질 보다는 개별 영역에 대항해 지시된 재조합 단백질을 사용하여 생산될수 있는지를 예측한다. 마지막으로, 실시예 11에서 생산된 재조합 독소 A 단백질에 반응성인 항체가 천연 독소 A에 대항해 발생된 항체 (실시예 9 및 10) 만큼 효과적으로 독소 A를 중화하는 지가 알려지지 않았기 때문에, 재조합 독소 A 단편에 대항해 친화성 정제된 항체의 풀의 방어 능력은 독소 A를 중화하는 능력으로 평가했다.
이 실시예는 (a) 천연 독소 A 단백질을 면역원으로 사용하는 경우에 독소 A 단백질의 개별 아영역에 대항해 지시된 특이 항체의 역가를 판단하는 독소 A 단백질의 에피토프 맵핑, (b) 독소 A 유전자를 연결한 재조합 단백질에 대항하여 반응성인 IgY의 친화성 정제, (c) 중화 항체의 생산을 유발하는 독소 A 단백질의 아영역을 동정하기 위해 재조합 독소 A에 반응성인 친화성 정제된 IgY로써 독소 A 중화 검정, 및 독소 A의 완전한 중화가 재조합 독소 A 단백질에 반응성인 항체의 혼합물로써 야기될수 있는지의 판단을 포함한다.
a) 독소 A 유전자의 에피토프 맵핑
독소 A 단백질의 정의된 인터벌에 대해 특이성인 재조합 독소 A 단백질의 친화성 정제를 통해 천연 독소 A에 대항해 지시된 항체 풀의 에피토프 맵핑이 가능하다. 이전에는 독소 A 재조합체의 발현이 단백질의 발현 수준에 대한 지식 없이 웨스턴 블롯 분석에 의해서만 평가되었기 때문에 [예컨대, von Eichel-Streiber et al., J. Gen. Microbiol., 135:55-64 (1989)], 이것이 이전에는 가능하지 않았다. 따라서, 웨스턴 블롯 상에 재조합 독소 A 단백질의 고반응성 또는 저반응성은 면역반응성의 차이가 아니라 단백질 발현 수준 차이를 반영할 것이다. 실시예 11에서 생성된 정제된 재조합 단백질이 정량 분석되었다고 가정하면, 독소 A 단백질의 개별 영역의 상대 면역반응도의 문제가 정확하게 처리되었다.
이 실시예의 목적을 위해, 독소 A 단백질을 아미노 (인터벌 1) 으로부터 카르복실 (인터벌 6) 말단에로 번호를 매긴 6개 인터벌로 2차 분할하였다.
이들 인터벌에 대응하는 재조합 단백질은 발현 클론 (클론 명칭에 대해서는 실시예 11(d) 참조) pMA30-300 (인터벌 1), pMA300-660 (인터벌 2), pMA660-1100 (인터벌 3), pPA1100-1450 (인터벌 4), pMA1450-1870 (인터벌 5) 및 pMA1870-2680 (인터벌 6)로부터 이다. 상기 6개 클론이 아미노산 번호 30 내지 2680으로부터의 전체 단백질을 연결하고, 상기 단백질을 6개 소형 인터벌로 2차 분할하기 때문에 상기 6개 클론을 선택했다. 또한, 탄수화물 결합 반복 인터벌은 특이적으로 하나의 인터벌 (인터벌 6)에 함유되어, 이 영역에 대항해 특이적으로 지시된 면역 반응의 평가가 가능하게 한다. 각각의 재조합 단백질의 정의된 양을 로딩하고 전기영동한, 7.5% SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯을 염소 항독소 A 폴리클론성 항체 (테크 랩) 또는 닭 항독소 A 폴리클론성 항체 [pCTA IgY, 실시예 8(c)]로써 프로빙했다. 이 블롯을 앞서 서술된 바대로 제조하고 알카리성 포스파타제로써 현상시켰다 [Williams et al., (1994), 앞의 책]. 염소 또는 닭 항체 풀 내에서 모든 반응도의 90% 이상이 리간드 결합 영역 (인터벌 6)에 대항해 지시됨이 밝혀졌다. 나머지 면역반응성은 모든 5개의 나머지 인터벌에 대항해 지시되었고, 이는 닭 항체가 염소 항체 보다 인터벌 2에 대항해 훨씬 더 낮은 반응도를 나타내는 것을 제외하고 두 항체 풀이 유사했다.
이는 천연 독소 A가 염소 또는 닭 내에서 면역원으로서 사용되는 경우에, 면역 반응의 크기는 상기 단백질의 리간드 결합 영역에 대항해 지시되며, 나머지 반응은 단백질의 나머지 2/3에 전체적으로 분포되어 있음을 명확하게 입증한다.
b) 재조합 독소 A 단백질에 대항하여 반응성인 IgY의 친화성 정제
상기 (a)에서 정의된 6개의 인터벌로부터의 재조합 독소 A 단백질을 함유하는 친화성 칼럼을 제조하고, 이를 사용하여 (i) CTA IgY 제제로부터의 각각의 개별 인터벌에 대해 반응성인 항체를 친화성 정제하고 [실시예 8(c)], 및 (ii) CTA IgY 제제로부터의 인터벌 특이 항체를 소모시켰다. 친화성 칼럼을 영역 특이 단백질과 PBS-세척된 악티겔 수지 1ml (스테로젠) 및 1/10 최종 용적의 Ald-커플링 용액(1M 시아노보로수소화나트륨)을 커플링하여 제조했다. 각각의 반응 혼합물에 첨가된 총 영역 특이 단백질은 2.7mg (인터벌 1), 3mg (인터벌 2 및 3), 0.1mg (인터벌 4), 0.2mg (인터벌 5), 및 4mg (인터벌 6)이었다. 인터벌 1, 3 및 6에 대한 단백질은 칼럼 완충액 중에 친화성 정제된 pMA1 융합 단백질이었다 (실시예 11). 인터벌 4는 PBS 중 pET 융합체를 함유하는 친화성 정제된 폴리-히스티딘이었고; 인터벌 2 및 5는 PBS 내 광범위하게 투석된 불용성 pMAL 융합 단백질의 봉입체 제제로부터였다. 커플링 전후에, 커플링 반응으로부터의 상등액 부분시료를 7.5% SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색에 의해 평가했다. 단백질 결합 강도에 근거하여, 모든 경우에 50% 이상의 커플링 효율이 평가되었다. 수지를 5ml 바이오라드 칼럼 내로 붓고 PBS로 강력하게 세척하고, 4℃에서 저장했다.
각각의 개별 영역에 대한 CTA IgY 폴리클론성 항체 제제의 부분시료를 하기 서술되는 바와 같이 소모시켰다. CTA IgY 제제의 20ml 시료 [실시예 8(c)]를 PBS를 세 번 바꾸어 광범위하게 투석시키고 (각각의 투여 당 1리터), OD280에서 흡광도에 의해 정량하고, 4℃에서 저장했다. 투석된 IgY 제제의 6개 1ml 부분시료를 제거하고, 6개 인터벌 중 각각에 대해 개별적으로 소모시켰다. 각각의 1ml 부분시료를 적당한 친화성 칼럼 상에 통과시키고, 용리액을 두 번 칼럼에 재적용시켰다. 이 용리액을 수집하고, 1ml PBS 세척액과 함께 풀링했다. (10mM 트리스 HCl, pH8.0 중) 4M 구아니딘-HCl의 5배 칼럼 용적으로 세척하여 칼럼으로부터 결합 항체를 용리시켰다. 칼럼을 PBS 중에 다시 평형상태로 만들고 소모된 항체 원료를 상기 서술된 바와 같이 재적용했다. 용리액을 수집하고, 1ml PBS 세척액과 풀링하고, OD280에서의 흡광도에 의해 정량하고, 4℃에서 저장했다. 이 방식으로, CTA IgY 제제의 6개 부분시료를 2회의 친화성 소모에 의해 6개 독소 A 인터벌의 각각에 대해 개별적으로 소모시켰다. 각각의 소모된 원료의 특이성은 웨스터 블롯 분석에 의해 시험했다. 다수의 7.5% SDS-PAGE 겔에 모든 6개의 독소 A 아영역에 상응하는 단백질 시료를 로딩했다. 전기영동 후에, 겔을 블롯팅하고, 폰소 S 염색 [Williams et al., (1994), 앞의 책에 서술된 프로토콜]에 의해 단백질 전이를 확인했다. 5% 우유 (블로킹 완충액으로서)를 함유하는 PBS+0.1% 트윈 20 (PBST) 중에 상기 블롯을 20℃에서 1 시간 동안 블로킹시킨 후에, 블로킹 완충액내 투석된 CTA IgY 제제의 1/500 희석액 4ml 또는 동등량의 6개 소모된 항체 원료 (항체 농도를 표준화하기 위해 OD280 사용)를 첨가하고 블롯을 실온에서 1시간 동안 더 인큐베이션시켰다. 이 블롯을 세척하고 앞서 서술된 바와 같이 [Williams et al., (1994), 앞의책], 알카리성 포스파타제 (제2 항체로서 토끼 항-닭 알카리성 포스파타제 접합체 사용)로써 현상시켰다. 모든 경우에, 표적 인터벌이 항체 반응성에 대해 소모되었고, 표적 인터벌에 대해 반응도의 90% 이상이 특이적으로 소모되었다.
영역 특이 항체 풀을 하기 서술된 바대로 친화성 크로마토그래피에 의해 단리시켰다. 투석된 CTA IgY 제제 10ml를 이후에 각각의 친화성 칼럼에 적용하여, 단일한 10ml 부분시료를 사용하여 각각 6개 아영역에 특이성인 영역 특이 항체를 단리했다. 칼럼을 이어서 10배 용적의 PBS, 6배 용적의 BBS-트윈, 10배 용적의 TBS로 세척하고, 4ml 악티셉 용리액 매체 (스테로젠)으로 용리시켰다. 용리액을 몇몇번 PBS를 바꾸어 대항해 광범위하게 투석시키고, 친화성 정제된 항체를 수집하고 4℃에서 저장시켰다. 이 경우에 고점도의 악티셉 용리 매체로 인하여 투석 중에 10ml 이상으로 용리액의 용적이 증가했다. 각각의 시료의 부분시료를 센트리콘 30 미세농축기 (아미콘)을 사용하여 20배 농축하고 4℃에서 저장시켰다. 소모된 CTA IgY 제제 대신에 100㎕ 영역 특이 항체 (미농축)을 함유하는 블로킹 완충액 4ml 시료를 사용하는 것을 제외하고, 상기 서술된 바와 정확하게 같이 각각의 영역 특이 항체 풀의 특이성을 투석된 CTA IgY 제제에 대하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험했다. 각각의 친화성 정제 항체 제제는 인터벌 1-5에 대항해 정제된 시료가 인터벌 6과 반응하는 것을 제외하고 정의된 인터벌에 대해 특이성이다. 이는 상기 단백질이 비특이적으로 항체를 결합시키는 것을 보여준 반복 리간드 결합 영역을 함유하기 때문에, 인터벌 6 단백질에 대한 비특이 결합 때문일 것이다. [Lyerly et al., Curr. Microbiol., 19:303-306(1989)].
대응하는 단백질에 대한 각각의 친화성 정제된 항체 제제의 반응성은 1/500 희석된 투석된 CTA IgY 제제 표준의 반응도와 대략 동일했다. 특이 항체 원료가 1:40배 희석된 것으로 가정하면, 이는 미농축 친화성 정제된 항체 원료가 출발 CTA IgY 제제에 대하여 특이 항체의 1/10-1/20의 농도를 함유함을 의미할 것이다.
c) 재조합 독소 A 단백질에 대해 반응성인 항독소를 사용한 독소 A 중화 검정
상기 (b)에서 생성된 소모 또는 강화된 시료의 CHO 독소 중화 검정 [실시예 8(d)]를 사용하여 독소 A의 세포독성을 중화하는 능력을 평가했다. 독소 A를 중화하는 친화성 정제된 항체의 일반 능력은 상기 (b)에서 생성된 6개 친화성 정제된 시료의 모든 6개 농축 원료의 부분시료를 함께 혼합하고, 0.1㎍/ml 농도의 독소 A를 중화하는 상기 혼합물의 능력을 시험함으로서 평가했다. 도 11에 도시된 결과는 친화성 정제된 (AP)혼합물을 사용한 거의 완전한 독소 A의 중화를 나타낸다. 친화성 정제에 사용된 재조합 단백질 내의 몇몇 에피토프는 아마도 상기 단백질이 [상기 (b)에서 구아니딘-HCl 처리에 의해] 미리 변성된 경우에 손실되었다. 따라서, 재조합 단백질에 대항해 지시된 항체의 중화 능력은 아마도 상기 친화성 정제된 항체 풀을 사용해서는 측정되지 않는다. 이 실험은 재조합 독소 A에 대해 반응성인 항체는 세포독성을 중화할수 있음을 나타내고, 이는 중화 항체가 면역원으로서 재조합 독소 A 단백질을 사용하여 생성될 수 있음을 시사한다.
독소 A 유전자의 재조합 발현 클론이 6개 아영역으로 단백질을 분할한 관찰에 비추어서, 각각의 개별 영역에 대항해 지시된 항체의 중화 능력을 평가했다. 독소 A의 리간드 결합 영역에 대항해 지시된 항체의 중화 능력을 먼저 평가했다.
도 11에 도시된 독소 중화 시험에서, 인터벌 6 특이 항체 (인터벌 6는 리간드 결합 영역을 함유한다)를 투석된 PEG 제제로부터 소모시켰고, 독소 중화에 대한 효과를 검정했다. 인터벌 6 항체는 상기 (b)로부터의 인터벌 6 소모된 CTA IgY 제제 (도 11에서 "-6 aff. 소모된")을 사용하거나, 또는 CTA IgY 제제에 인터벌 6 단백질을 첨가하여 (이 제제내에 존재하는 항-인터벌 6 면역글로불린 이상의 10배 몰 초과량이라고 추정됨) 인터벌 6 단백질을 경쟁적으로 경쟁시킴으로써 (도 11에서 "-6 prot 소모됨") 소모시켰다. 두가지 경우에, 인터벌 6 특이 항체를 제거하면 출발 CTA IgY 제제에 비례해 중화 효율을 감소시킨다. 이는 인터발 6에 대항해 지시된 항체가 독소 중화에 기여함을 입증한다. 인터벌 6이 단백질의 리간드 결합 영역에 대응하기 때문에, 이 결과는 PEG 제제내 이 영역에 대항해 지시된 항체가 이 검정에서 독소 A의 중화에 기여함을 입증한다. 그러나, 상기 항체를 제거한 후에, PEG 제제가 독소 A에 대한 유의한 중화 능력을 보유한다는 것은 의미가 있다 (도 11). 리간드 결합 영역 반응성 항체의 90%가 상기 (b)에서 제조된 소모 시료에서 제거되었기 때문에, 이 중화는 아마도 독소 A 단백질의 기타 영역에 대해 특이성인 항체의 작용에 기인하는 듯하다. 이 결론은 친화성 정제된 인터벌 6 항체 만에 필적하는 친화성 정제된 (AP) 혼합물의 독소 중화의 비교에 의해 지지되었다. 몇몇 중화 능력이 AP 인터벌 6 항체만으로 관찰되었지만, 이 중화는 모든 6 AP 항체 원료 (제시안됨)의 혼합물에서 관찰된 것보다 상당히 적다.
모든 6개의 친화성 정제된 시료의 혼합물이 거의 완전히 독소 A의 세포독성을 중화했다고 가정하여 (도 11), 혼합물 내의 독소 A 인터벌 1-5에 대항해 지시된 항체의 상대적 중요성을 측정했다. 이는 두가지 방식으로 평가되었다. 먼저, 6개 인터벌 중 5개를 대표하는 친화성 정제된 항체를 함유하는 시료들을 각각의 개별 영역이 하나의 시료로부터 소모되도록 제조했다. 도 12는 모든 6개 친화성 정제된 항체 원료의 혼합물 (양성 대조)에 대해 인터벌 4 (-4) 또는 5 (-5) 특이 항체가 없는 친화성 정제된 항체 혼합물의 중화 능력을 비교한 시료 중화 곡선을 나타낸다. 인터벌 5 특이 항체 (또는 인터벌 1-3, 제시안됨)를 제거하면 독소 중화에 영향이 없는 한편, 인터벌 4 특이 항체의 손실은 독소 중화를 유의하게 감소시켰다 (도 12).
단일 영역에 대항해 지시된 친화성 정제된 항체가 인터벌 6 특이 항체에 첨가된 두번째 실험에서 유사한 결과가 나타났고, 독소 중화에 대한 효과를 평가했다. 인터벌 4 특이 항체 만이 인터벌 6 특이 항체에 첨가되는 경우에 중화를 유의하게 증진시켰다 (도 13). 이 결과는 인터벌 4 (도 9에서 클론 pPA1100-1450에 대응)에 대항해 지시된 항체가 이 검정에서의 세포독성 중화에 중요함을 입증한다. 에피토프 맵핑은 천연 독소 A를 면역원으로 사용한 경우에 이 영역에 반응성인 항체가 단지 저수준으로 발생됨을 보였다 [실시예 12(a)]. 상기 인터벌에 특이성인 재조합 단백질을 사용한 면역법이 더 높은 역가의 중화 항체를 유발할 것임이 중요하다. 간략히, 이 분석은 CHO 중화 검정에 의해 검정된 바와 같이, 대항하여 중화 항체가 생산되는 독소 A 단백질의 두 개의 중요 영역을 동정했다.
실시예 13
씨. 다이피셀 재조합 독소 A 폴리펩티드에 대항한 조류 항독소의 생산 및 평가
실시예 12에서, 재조합 독소 A 단백질에 대해 반응성인 친화성 정제된 항체에 의한 독소 A 매개 세포독성의 중화가 입증되었다. 항체가 씨. 다이피셀 독소 A의 재조합 폴리펩티드 단편에 대항해 발생된 항체가 클로스트리듐 질병 치료에 효과적일수 있는지를 판단하기 위하여, 결합 영역을 대표하는 재조합 독소 A 단백질에 대한 항체를 생성했다. pMALc (pMA1870-2680) 또는 pET 23(pPA1870-2680) 벡터 내에서 결합 영역을 발현하는 두 개의 독소 A 결합 영역 재조합 폴리펩티드를 면역원으로서 사용했다. pMAL 단백질은 용해성 생산물로서 친화성 정제시켰고 [실시예12(d)], pET 단백질은 불용성 봉입체로서 단리시켰고 [실시예 12(d)], 계류중인 특허 출원 (미국 특허 출원 제08/129,027호)에 서술된 독점 방법을 사용하여 면역학적으로 활성인 단백질로 용해시켰다. 이 실시예는 (a) 면역법, (b) 항독소 수집, (c) 항독소 항체 역가의 결정, (d) 생체외 독소 A 혈구응집 활성의 항재조합 독소 A 중화, 및 (e) 생체외 독소 A 중화 활성의 검정을 포함한다.
a) 면역법
용해성 제제 및 봉입체 제제 각각을 따로따로 사용하여 암탉을 면역시켰다 두 개의 정제된 독소 A 폴리펩티드 모두를 PBS 중에 희석시키고 대략 동일 용적의, 초기 면역의 경우 CFA 또는 후속 추가자극 면역의 경우 IFA로써 유화시켰다. 1 일째에, 각각의 재조합 제제에 대해, (지방 사육자로부터 얻은) 두 마리의 알을 낳은 화이트 레그혼 암탉의 각각 여러 부위에 (근육내 및 피하) 재조합 독소 A 약 0.5 내지 1.5 mg을 함유하는 재조합 보조제 혼합물 1ml를 주사했다. 14 및 28 일째에 1.0 mg의 추가자극 면역시켰다.
b) 항독소 수집
총 노른자 면역 IgY를 표준 PEG 프로토콜에 서술된 바대로(실시예 1에서 처럼) 추출하고 최종 IgY 펠렛을 원래 노른자 용적의 무균 PBS에 용해시켰다. 이 물질은 "면역 재조합 IgY" 또는 "면역 IgY"로 명명했다.
c) 항독소 항체 역가
재조합 독소 A 단백질이 암탉 내에서 항체를 발생하기에 충분하게 면역원성인지를 판단하기 위하여, 재조합 독소 A 폴리펩티드의 항체 역가를 ELISA에 의해 측정했다. 두 마리 암탉으로부터 달걀을 32 일째에 수집하고, 노른자를 풀링하고 서술된 바의 PEG를 사용하여 항체를 단리시켰다. 면역 재조합 IgY 항체 역가를 p-Mal (pMA1870-2680)에서 생성된 말토오즈 결합 단백질 융합체를 함유하는 용해성 재조합 단백질에 대해 측정했다. 96웰 팔콘 프로-바인드 플레이트를 0.05% 티머로살을 함유하는 PBS 중 2.5㎍/㎕의 독소 A 재조합체 100㎕/웰로써 하룻밤 4℃에서 코팅시켰다. 융합 파트너에 대한 항체 반응성을 비교하기 위하여, 또다른 플레이트를 동일 농도의 말토오즈 결합 단백질 (MBP)로써 코팅시켰다. 다음날, 웰을 1 시간 동안 37℃에서 1% 소 혈청 알부민 (BSA)를 함유하는 PBS로 블로킹시켰다. 면역 또는 면역전 달걀로부터 단리된 IgY를 항체 희석액 (1% BSA 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS) 중에 희석시키고, 블로킹된 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 다음, PBS로 3회 세척했다. 항체 희석액 중에 1:1000으로 희석된 알카리성 포스파타제 접합된 토끼 항-닭 IgY (시그마)을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 플레이트를 앞과 같이 세척하고, 기질 0.05 M Na2CO3, pH 9.5 및 10mM MgCl 2중 1 mg/ml의 [p-니트로페닐 포스페이트(시그마)]을 첨가했다. 이 플레이트를 기질 첨가시킨지 약 10분 후에 410 nm에서 다이테크 MR 300 마이크로 EPA 플레이트 판독기 상에서 정량적으로 평가했다.
이 ELISA 결과에 기초하여, 고항체 역가가 독소 A 재조합 폴리펩티드로써 면역된 닭에서 발생되었다. 재조합체는 적은 면역법으로써 상대적으로 신속하게 고항체 역가를 생성할수 있기 때문에 매우 면역원성이다. 재조합체의 독소 A 부분에 대해 특이적으로 지시된 면역 IgY 항체는 융합 파트너, 말토오즈 결합 단백질에 대한 면역 IgY 역가 보다 더 높고, 면역전 IgY 보다 상당히 더 높다. MBP 또는 재조합체에 대한 면역전 IgY 중 ELISA 역가 (신호를 발생하는 IgY의 최고 희석율의 역수)가 1:30 미만인 한편, MBP 및 독소 A 재조합체에 대한 면역 IgY 역가는 각각 1:18750 및 1:93750 이상이었다. 중요하게, 재조합 폴리펩티드에 대항하여 암탉내에서 생성된 항-재조합 항체 역가는 천연 독소 A를 사용하여 발생된 영역에 대한 항체에 비교하여 훨씬 더 높다. CTA 항체 제제에서 영역 1870-2680에 대한 재조합 항체 역가는 재조합체 생성 항체에 비하여 적어도 5배 더 낮다 (1:18750 대 1:193750 이상). 따라서, 천연 독소 A에 비하여 면역원으로서 재조합체를 사용한 특이 재조합체에 대항하여 더 우수한 면역 반응이 발생될수 있는 듯하다.
이 관찰은 재조합체 부분이 항체의 생산을 자극하기 때문에 항독소 제제를 생산하는데 천연 독소 분자를 사용하는 것이 필수적이지 않음을 보여주므로 의미가 있다. 따라서, 천연 독소의 독성과 관련된 문제점들을 피할수 있으며 대규모 생산이 용이하게 된다.
d) 생체외 독소 A 혈구응집 활성에 대한 항-재조합 독소 A의 중화
독소 A는 세포독성 및 장독소 성질 외에 혈구응집 활성을 갖는다. 구체적으로, 독소 A는 세포 표면 상에서 트리사카라이드 (gal 1-3B1-4GlcNAc)에 결합함으로써 토끼 적혈구를 응집시킨다. [H. Krivan et al., Infect. Immun., 53:573-581 (1986)]. 항-재조합체 독소 A (면역 IgY, pET 내에서 발현된 불용성 생산물에 대항해 생성된 항체)가 생체내에서 독소 A의 혈구응집 활성을 중화할 수 있는 지를 관찰했다. 사용된 혈구응집 검정 절차는 H.C. Krivan et al에 의해 서술되었다. 폴리에틸렌 글리콜-분획된 면역 또는 면역전 IgY를 혈구응집 검정을 수행하기 전에 시트레이티드 토끼 적혈구로써 미리흡수시켰다. 이는 IgY만이 적혈 세포를 응집시킬수 있음을 발견했기 때문이다. 시트레이티드 토끼 적혈 세포 (RRBC) (코칼리코)를 등장 완충액(0.1M 트리스-HCl, 0.05M NaCl, pH7.2)으로 450xg에서 원심분리에 의해 두 번 세척했다. (면역 또는 면역전 IgY에 충전된 세포를 첨가하여 제조된) 10% RRBC 현탁액을 제조하고 이 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켜 IgY 중의 RRBC-반응성 항체를 제조했다. 그 다음, RRBC를 원심분리에 의해 제거했다. 항체에 의한 독소 A의 혈구응집 활성 중화를 둥근 바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내에서 시험했다. 등장 완충액 중 25㎕의 독소 A (36㎍/ml) (테크 랩)를 동일 용적의 다른 면역 또는 면역전 IgY 희석액과 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 등장 완충액 중 1% RRBC 현탁액 50㎕를 첨가하고 4℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. IgY가 없이 희석한 후의 독소 A 9㎍/ml의 최종 농도를 함유하는 양성 대조 웰도 또한 포함되었다. 양성 혈구응집 반응을 나타내는 웰의 바닥을 코팅한 RRBC의 확산 매트릭스 및 음성 반응을 나타내는 웰의 바닥에서 RRBC의 밀폐 버튼으로써 혈구응집 활성을 가시적으로 평가했다. 항재조합 면역 IgY는 독소 A 혈구응집 활성을 중화하여, 1:8의 중화 역가는 제공했다. 그러나, 면역전 IgY는 독소 A의 혈구응집 활성을 중화할수 없었다.
e) 생체외 독소 A의 중화 활성 검정
항-재조합 독소 A IgY (pMA1870-2680에 대항해 발생된 면역 IgY 항체, pMAl 내에서 발현된 용해성 재조합 결합 영역 단백질로서, 도 14에서 Anti-tox, A-2로 명명되었고, 또한 재조합체 영역 6를 나타냄) 및 상기 실시예 8(c)에서 서술된 바대로 제조된 면역전 IgY의 독소 A 세포독성을 중화하는 능력을, 상기 실시예 8(d)에 서술된 바와 같이 CHO 세포 세포독성 검정, 및 0.1㎍/ml 농도의 독소 A (테크 랩)을 사용하여 평가했다. 부가적인 대조로서, 상기 실시예 8(c)에 서술된 항-천연 독소 A IgY (CTA) 및 면역전 IgY 제제를 또한 시험했다. 결과는 도 14에 제시되어 있다.
항-재조합 독소 A IgY는 독소 A의 세포독성 활성의 부분적인 중화만을 나타내는 한편, 면역전 IgY는 임의 유의한 중화 활성을 나타내지 않았다.
실시예 14
씨. 다이피셀 독소 A의 생체내 중화
재조합 독소 A 결합 영역에 대항하여 발생된 조류 항체 (IgY)의 씨. 다이피셀 IgY의 장독소 활성을 중화하는 능력을 골든 시리안 햄스터를 사용하여 생체내에서 평가했다. 이 실시예는 (a) 경구 투여를 위한 조류 항-재조합 독소 A IgY의 제조; (b) 조류 항-재조합 독소 A IgY로써 독소 A의 처리에 의해 씨. 다이피셀 독소 A 장독성으로부터 햄스터의 생체내 방어; 및 (c) 햄스터 맹장의 조직 평가를 포함한다.
a) 경구 투여를 위한 조류 항-재조합 독소 A IgY의 제조
(상기 실시예 13에 서술된) 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단편 pMA1870-2680으로 면역된 암탉으로부터 달걀을 수집했다. 지방 슈퍼마켓에서 구입한 달걀의 제2 군을 면역전 (음성) 대조로 사용했다. 달걀 노른자 면역글로불린 (IgY)를 실시예 8(c)에 서술된 바대로 2개 군의 달걀로부터 PEG에 의해 추출하고, 최종 IgY 펠렛을 pH 9.5의 0.1M 탄산염 완충액 (NaHCO3 및 Na2CO3의 혼합물)을 사용하여 원래 노른자 용적의 1/4에 용해시켰다. 위장 환경의 산성 pH로부터 독소 A를 방어하기 위해 염기성 탄산염 완충액을 사용했다.
b) 조류 항-재조합 독소 A IgY로써 독소 A의 처리에 의해 씨. 다이피셀 독소 A 장독성으로부터 햄스터의 생체내 방어
상기 섹션 (a)에서 제조된 조류 항-재조합 독소 A IgY의 독소 A의 생체내 장독소 활성을 중화하는 능력을 평가하기 위하여, 생체내 독소 중화 모델을 골든 시리안 햄스터를 사용하여 개발했다. 이 모델은 경구 투여할 경우에 햄스터 내에서 설사증을 유발시키는 데 필요한 독소 A의 최소량 (독소 A 0.08mg/체중 kg)에 대한 공지 값에 근거한다 (Lyerly et al. Infect. Immun., 47:349-352 (1985).
연구를 위하여, 각각 약 3과 1/2 주 되고, 각각 약 50그램 중량의 7마리 암컷 골든 시리안 햄스터로 이루어진 4개의 별도의 실험군을 사용했다. 동물을 3 및 4의 군으로 가두고 연구의 전 기간 동안 수시로 음식물 및 물을 제공했다.
각각의 동물에 있어, 10㎍의 독소 A (0.2mg/Kg) 또는 30㎍의 독소 A (0.6mg/Kg) (씨. 다이피셀 독소 A는 테크 랩으로부터 얻음) 및 1ml의 항-재조합 독소 A IgY 또는 면역전 IgY (상기 섹션 (a)로부터)를 함유하는 혼합물을 제조했다. 이 혼합물을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨 다음, 동물에게 경구 경로로 투여했다. 그 다음 동물을 독소 A+IgY 혼합물을 투여 후에, 24 시간 동안 설사 및 치사의 징후를 관찰하였고, 이 시간의 말렵에 하기 결과를 표로 만들고 표 17로 나타내었다:
| 실험군 | 24시간 연구 결과 | ||
| 건강1 | 설사증2 | 치사3 | |
| 10㎍ 독소 A+인터벌 6에 대항한 항독소 | 7 | 0 | 0 |
| 30㎍ 독소 A+인터벌 6에 대항한 항독소 | 7 | 0 | 0 |
| 10㎍ 독소 A+면역전 혈청 | 0 | 5 | 2 |
| 30㎍ 독소 A+면역전 | 0 | 5 | 2 |
1: 동물이 전체 24시간 연구 기간 동안 건강하게 유지되었다.
2: 동물이 설사증을 나타내었으나 치사되지 않았다.
3: 동물이 설사증을 나타내고 이후에 치사되었다..
햄스터 내에서 모든 질병의 명백한 증후를 예방하는 항-재조합 독소 A IgY를 사용하여 2가지 투여량으로 독소 A의 예비 처리 시험을 했다. 따라서, 항-재조합 독소 A IgY를 사용한 씨. 다이피셀의 예비 처리는 독소 A의 생체내 장독소 활성을 중화시켰다. 반면에, 면역전 IgY를 사용하여 예비 처리된 독소 A를 받은 2개의 군으로부터의 모든 동물은 설사증 내지 치사에 이르는 범위의 질병 증후군을 나타냈다. 각각의 2개 면역전 군에서 치사되지 않은 5 마리 동물 내에서 발병된 설사증은 24시간 연구 기간의 말렵에 자동적으로 해결되었다.
c) 햄스터 맹장의 조직 평가
독소 A의 장독소 활성으로부터 햄스터를 방어하는 항-재조합 독소 A IgY의 능력을 더 평가하기 위하여, 상기 섹션 (b)에 서술된 연구로부터 햄스터의 맹장에 대한 조직 평가를 수행했다.
조직 표본을 제조하기 위하여 동물의 3개 군을 희생시켰다. 첫 번째 군은 상기 섹션 (b)에서 서술된 연구의 결과로 생존한 햄스터 4 군의 각각으로부터 취해진 하나의 대표 동물로 이루어졌다. 이들 동물은 연구의 24시간 시점을 대표했다.
두 번째 군은 상기 서술된 연구의 일부는 아니나, 상기 섹션 (b)에서 동물에 대해 서술된 바와 동일한 독소 A+면역전 IgY 혼합물로 별도로 처리한 두 마리의 동물로 구성됐다. 이들 햄스터 두 마리는 모두 독소 A+면역전 IgY 혼합물의 투여 후 8시간 째에 설사증을 나타냈고, 죽였다. 죽일 때, 두 마리 동물은 설사증의 증후를 나타내고 있었다. 이들 동물은 연구의 급성 상태를 대표한다.
최종 군은 두 개의 앞선 군에서 사용된 바와 동일한 동물의 동일한 무리로부터의 한 마리의 미처리 햄스터로 이루어진다. 이 동물은 정상 대조로 사용된다.
상기 서술된 7마리 동물로부터 맹장 조직의 시료를 떼어내고 10% 완충 포르말린을 사용하여 4℃에서 하룻밤 고정시켰다. 고정된 조직을 파라핀으로 끼워넣고, 절단하고, 현미경 유리 슬라이드 상에 놓았다. 그다음 조직 섹션을 헤마톡실린 및 에오신 (H 및 E 염료)를 사용하여 염색시키고, 광 현미경에 의해 관찰했다.
10㎍ 또는 30㎍의 독소 A 및 항-재조합 독소 A IgY를 함유하는 혼합물을 받은 2마리의 24 시간후 동물로부터 얻어진 조직은 정상 대조와 대략적인 병리성의 면에서 및 현미경 수준으로는 구별할 수 없었다. 이들 관찰은 추가로 씨. 다이피셀 독소 A의 생체내 장독소 활성을 효과적으로 중화하는 항-재조합 독소 A IgY의 능력 및 따라서 급성 및 지속적인 독소 A-유발 병리 상태를 예방하는 능력을 제공한다.
반면에, 독소 A+면역전 IgY 혼합물로부터의 두 마리의 24시간 후 동물로부터의 조직은 유의한 병리 상태를 나타내었다. 이들 두 군에서, 점액층이 정상 대조 조직에서 보다 덜 유기화되어 있는 것으로 관찰되었다. 상피 세포의 세포질은 액포가 있는 외관을 가지며, 상피 조직과 하면 세포층들 사이에 간격이 존재한다. 람다 프로프리아는 대부분 부재했다. 장내 융모 및 음와가 상당히 제거되고, 상피 세포 및 섬유아세포의 평면층이 과성장한 것이 나타났다. 따라서, 상기 동물들이 명백하게 독소 A 중독의 급성 증후로부터 회복하는 듯하나, 맹장 점막에 대한 지속적인 병리 상태 변형이 발생했다.
독소 A+면역전 IgY 혼합물을 받은 2 마리의 급성 동물로부터 얻은 조직은 가장 큰 병리 상태를 나타내었다. 대략의 병리학적 수준으로, 두 마리 동물 모두는 물같은 설사 물질로 채워진 심각하게 팽창된 맹장을 갖는 것으로 관찰되었다. 현미경 수준에서, 10㎍의 독소 A+면역전 IgY 혼합물을 받은 동물은 헤지고, 손상된 외관을 가지며, 분해되고, 압축된 특성을 갖는 점액층을 갖는 것이 밝혀졌다. 음와는 대부분 부재했고, 상피 세포내에 무수한 파손이 발생했다. 또한 상피층과 하면 조직 사이의 공간내로 적혈구의 유출이 있었다. 30㎍의 독소 A+면역전 IgY 혼합물을 받은 동물은 가장 심각한 병리 상태를 나타내었다. 이 동물의 맹장 조직은 씨. 다이피셀 질병으로 치사된 동물 내에서 관찰된 것과 매우 유사한 외관을 가졌다. 점막의 광범위한 파괴가 나타났고, 상피증이 탈피되었다. 대수의 적혈구를 함유하는 출혈 면이 매우 널리 퍼졌다. 정상 조직 구조의 모든 외형이 이 표본에서는 부재했다. 병리 상태의 존재라는 면에서, 이 독소 A 중독된 모델은 햄스터 내에서 씨. 다이피셀 질병의 병리학적 결과와 매우 근접하게 관련있다. 이 실시예에 나타난 결과는 항-재조합 독소 A (인터벌 6) IgY는 씨. 다이피셀 독소 A의 세포독성 활성을 부분적으로만 중화할수 있는 한편, 상기 항체는 독소의 생체내 장독소 활성을 100% 효과적으로 중화할수 있음을 입증한다. 본발명은 이 메카니즘에 제한되지 않으며, 이는 두 개의 별개의 및 분명한 생물학적 작용으로서 씨. 다이피셀 독소 A의 세포독성 및 장독성으로 인한 것일 것이다.
실시예 15
재조합 독소 A 폴리펩티드에 대항한 항체에 의한 씨. 다이피셀 독소 A의 생체내 중화
독소 A의 장독성 활성을 중화하는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단편 1870-2680 (pMA1870-2680에 의해 발현됨, 실시예 13 참조)에 대항해 지시된 조류 항체의 능력은 실시예 14에서 입증되었다. 생체내에서 천연 독소 A를 중화하는 기타 재조합 독소 A 에피토프에 대항하여 지시된 조류 항체 (IgY)의 능력을 평가했다. 이 실시예는 (a) 재조합 독소 A 폴리펩티드에 대항한 IgY 의 제조; (b) 항-재조합 독소 A IgY로써 처리에 의한 독소 A에 대항한 햄스터의 생체내 방어 및 (c) CTA 및 인터벌 6 IgY PEG 제제 내에서 특이 항체 농도의 정량 분석을 포함한다.
전체 독소 A 단백질의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:5에 나열되어 있다. 전체 독소 A 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6에 기재되어 있다. 독소 A의 아미노산 잔기 1870 내지 2680으로 이루어진 아미노산 서열은 SEQ ID NO:7에 기재되어 있다. 독소 A의 아미노산 잔기 1870 내지 1960으로 이루어진 아미노산 서열은 SEQ ID NO:8에 기재되어 있다. 독소 A의 아미노산 잔기 1873 내지 2684으로 이루어진 아미노산 서열은 SEQ ID NO:29에 기재되어 있다.
a) 재조합 독소 A 폴리펩티드에 대항한 IgY의 제조
전체 독소 A 단백질을 포괄하는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 폴리펩티드 단편으로 면역된 레그혼 암탉으로부터 달걀을 수집했다. 면역원으로서 사용된 폴리펩티드 단편은 다음과 같다: 1) pMA1870-2680 (인터벌 6), 2) pPA1100-1450 (인터벌 4), 및 3) pMA30-300 (인터벌 1), pMA300-660 (인터벌 2), pMA660-1100 (인터벌 3) 및 pMA1450-1870 (인터벌 5)로 이루어진 단편 혼합물이다. 면역원의 상기 혼합물은 인터벌 1235로 불린다. 독소 A 분자 내에 각각의 인터벌의 위치는 도 15A에 도시되어 있다. 도 15A에서는 하기의 약자가 사용되었다 : pP는 pET23 벡터 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 말하고; pM는 pMALTM-c 벡터를 말하고; A는 독소 A를 말하고; 숫자는 클론내에서 발현된 아미노산 인터벌을 말한다. (예컨대, 명칭 pMA30-300은 독소 A의 아미노산 30-300을 코딩하는 재조합 클론을 나타내고 사용 벡터는 pMALTM-c있었다).
재조합 단백질은 실시예 11에 서술된 바대로 제조했다. IgY를 추출하고 실시예 14(a)에 서술된 바대로 경구 투여용으로 pH 9.5의 0.1M 탄산염 완충액 내에 용해시켰다. 각각의 개별 재조합 인터벌에 대항한 IgY 반응성을 실시예 13(c)에 서술된 바의 ELISA에 의해 평가했다.
b) 항-재조합 독소 A IgY로써 처리에 의한 독소 A에 대항한 햄스터의 생체내 방어
독소 A의 장독성 활성에 대항하여 생체내 방어를 제공하는 재조합 독소 A 폴리펩티드에 대항해 발생된 항체의 능력을 햄스터 모델계 내에서 시험했다. 이 검정은 실시예 14(b)에 서술된 바대로 수행했다. 간략하게, 각각 40-50 그램의 암컷 골든 시리안 햄스터 (찰스 리버)에 있어, 인터벌 6, 인터벌 4 또는 인터벌 1235에 대항하는 1ml 의 IgY 4X (즉, 원래 노른자 용적의 1/4 중에 재현탁된) PEG 제제를 30㎍ (경구 투여시의 LD100)의 씨. 다이피셀 독소 A (테크 랩)과 혼합했다. 독소 A와 혼합된 면역전 IgY는 음성 대조로 사용된다. 독소 A와 혼합된 씨. 다이피셀 톡소이드 A (실시예 8)에 대항해 생성된 항체 (CTA)는 양성 대조로 사용된다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 18G 공급용 바늘을 사용하여 약간 에테르 마취된 햄스터에게 투여시켰다. 그 다음 동물을 약 24시간의 기간 동안 설사증 및 치사의 징후에 대해 관찰했다. 결과는 표 18에 제시되어 있다.
| 처리군 | 건강1 | 설사증2 | 치사3 |
| 면역전 | 0 | 0 | 7 |
| CTA | 5 | 0 | 0 |
| 인터벌 6 | 6 | 1 | 0 |
| 인터벌 4 | 0 | 1 | 6 |
| 인터벌 1235 | 0 | 0 | 7 |
1 동물이 질병의 신호를 나타내지 않았다.
2 동물이 설사증을 나타냈으나 치사되지 않았다.
3 동물이 설사증을 나타내고 치사되었다.
인터벌 6에 대항하여 IgY로써 독소 A의 예비 처리는 7마리 햄스터 중 6마리의 설사증을 방어했고 모든 7 마리의 치사를 완전히 방어했다. 반면에, 면역전 IgY, 인터벌 4 및 인터벌 1235에 대항한 IgYs에 대해서는 햄스터 내에서 설사증 및 치사의 징후에 대해 영향이 없었다.
c) CTA 및 인터벌 6 IgY PEG 제제 내에서 특이 항체 농도의 정량 분석
IgY PEG 제제의 순도를 측정하기 위하여, pMA1870-2680 (인터벌 6) IgY PEG 제제의 부분시료를 HPLC 및 KW-803 사이징 칼럼 (쇼텍스)를 사용하여 크로마토그래피시켰다. 280nm에서의 생성된 흡광도 프로파일이 도 16에 도시되어 있다. 하나의 큰 피크는 IgY의 예상 분자량에 상응한다. 하나의 큰 피크 아래의 면적의 적분치는 칼럼으로부터 용리된 단백질의 95%가 이 하나의 피크에 존재함을 나타낸다. 이 결과는 PEG 제제내에서 280nm에서 흡수하는 물질의 대부분 (>95%)이 IgY에 대응함을 입증했다. 따라서, 280nm에서의 흡광도는 PEG 제제 내에서의 총 항체 농도를 측정하는데 사용될 수 있다.
CTA 및 pMA1870-2680 (인터벌 6) PEG 제제 내 인터벌 6-특이 항체의 농도 (총 항체의 퍼센트로 표현)를 측정하기 위하여, 소정량의 항체 제제를 pPA1870-2680(H) (도 15B에 도식적으로 도시됨) 친화성 칼럼 상에서 친화성 정제시키고 특이 항체를 정량했다. 도 15B에서는, 하기의 약자가 사용되었다 : pP는 pET23 벡터 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 말하고; pM는 pMALTM-c 벡터를 말하고; pG는 pGEX 벡터 (파마시아)를 말하고; pB는 핀포인트(상표명) (PinPointTM) ZXa 벡터 (프로메가)를 말하고; A는 독소 A를 말하고; 숫자는 클론내에서 발현된 아미노산 인터벌을 말한다. 실선의 검은 타원은 MBP를 나타내고; 음영이 있는 타원은 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 타나내고; 음영이 있는 원은 비오틴 표지를 나타내고; 및 HHH는 폴리-히스티딘 표지를 나타낸다.
재조합 독소 A 반복 단백질을 함유하는 친화성 칼럼은 하기와 같이 제조했다. 4ml의 PBS 세척된 악티겔 수지 (스테로젠)을 [실시예 (17)에 서술된 바대로 제조되고 PBS 내로 투석된] pPA1870-2680 봉입체 5-10mg과, 1/10 최종 용적의 Ald-커플링 용액 (1M 사아노보로수소화나트륨)을 함유하는 15ml 튜브 (팔콘) 내에서 커플링시켰다. 커플링 전후에, 커플링 반응으로부터의 상등액의 부분 시료를 7.5% SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색에 의해 평가했다. 단백질 밴드 강도에 근거하여, 6mg 이상의 재조합 단백질을 수지에 커플링시켰다. 수지를 10ml 칼럼 (바이오라드) 내로 붓고, PBS로 광범위하게 세척하고, 4M 구아니딘-HCl (10 mM 트리스-HCl, pH 8.0; 0.005% 티로머살)로써 예비 용리시키고 PBS로 다시 평형을 맞추었다. 칼럼을 4℃에서 저장했다.
pMA1870-2680 (인터벌 6) 또는 CTA IgY 폴리클론성 항체 제제 (PEG 제제)의 부분시료를 하기와 같이 상기 친화성 칼럼 상에서 친화성 정제시켰다. 칼럼을 UV 모니터 (ISCO)에 부착시키고, PBS로 세척시켰다. pMA1870-2680 IgY 정제의 경우에, 2X PEG 제제 (0.45μ필터를 사용하여 멸균된 필터, 약 500mg의 총 IgY)를 적용시켰다. 칼럼을 기준선이 다시 형성될 때까지 (칼럼 통과가 유지됨) PBS로 세척하고, BBS트윈으로 세척하여 특이적으로 결합한 항체를 용리시키고 PBS로 다시 평형 상태로 만들었다. 결합된 항체를 4M 구아니딘-HCl (10 mM 트리스-HCl, pH 8.0; 0.005% 티머로살)로 칼럼으로부터 용리시켰다. 전체 용리 피크를 15ml 튜브 (팔콘) 내에 수집했다. 칼럼은 다시 평형 상태로 만들고 칼럼 용리물을 상기 서술된 바대로 다시 크로마토그래피 시켰다. 항체 제제를 UV 흡광도에 의해 정량했다 (용리 완충액은 분광계를 0으로 하기 위해 사용된다). 총 정제 항체는 대략 9mg이었고 제1 및 제2 크로마토그래피 통과로부터 각각 9mg 및 1mg이었다. 제2 통과로부터의 저수율은 가장 특이인 항체가 1회의 크로마토그래피에 의해 제거되었음을 의미한다. pMA1870-2680 PEG 제제 내 인터벌 6 특이 항체의 예상 퍼센트는 약 2%였다.
CTA PEG 제제 내 인터벌 6 특이 항체의 퍼센트는 총 IgY의 약 0.5%로 측정되었다 (상기 서술된 동일한 칼럼 및 방법을 사용).
4X PEG 제제는 약 20mg/ml IgY를 함유한다. 이리하여 상기 b)에서 인터벌 6 PEG 제제 내 약 400㎍ 특이 항체로 생체내에서 30㎍ 독소 A를 중화시켰다.
실시예 16
재조합 인터벌 6 항체에 의한 햄스터의 클로스트리듐 다이피셀 질병의 생체내 치료
독소 A의 재조합 인터벌 6에 대항해 지시된 항체의 햄스터가 클로스트리듐 다이피셀 질병에 걸리는 것을 생체내에서 방어하는 능력을 조사하였다. 이 실시예는 (a) 클로스트리듐 다이피셀 질병의 예방 처리 및 (b) 클로스트리듐 다이피셀 질병의 치료를 포함한다.
a) 클로스트리듐 다이피셀 질병의 예방 처리
이 실험은 실시예 9(b)에서 설명하는 방법에 따라 행하였다. 각각 100 그램 중량의 시리안 햄스터(찰스 리버) 암컷 7 마리로 구성된 세 군은 면역전 IgY들, 천연 독소 A 및 B에 대한 IgY들 [CTAB: 실시예 8(a) 및 (b)를 참조] 또는 인터벌 6에 대한 IgY들로 예방 처리를 하였다. IgY들은 실시예 9(a)에 설명된 4 x PEG 제제로서 제조하였다.
인슈어(등록상표)로 희석한 항체 제제 1 ㎖을 매일 3 회, 약 4 시간 간격으로 12 일 동안 이 동물에 경구 투여 하였다. 실시예 15(c)로부터의 특이 항체 농도의 추정치를 사용하여 인터벌 6 항체 제제의 각각의 투여분은 약 400 ㎍의 특이 항체를 함유했다. 2 일째에 물 1 ㎖에 용해된 클린다마이신-HCl(시그마) 3.0 ㎎을 경구 투여하여 각각의 햄스터가 클로스트리듐 다이피셀에 감염되도록 하였다. 3 일째에 약 100 개의 클로스트리듐 다이피셀 접종 균주 ATCC 43596 균이 포함된 무균 염수 1 ㎖을 햄스터에 경구 투여하였다. 이 동물은 처리 기간 동안에 설사로 시작하여, 이어서 죽게 되는 것이 관찰되었다. 그 결과는 표 19에 나타내었다.
| 처리 군 | 생존 동물 수 | 치사 동물 수 |
| 면역전 | 0 | 7 |
| CTAB | 6 | 1 |
| 인터벌 6 | 7 | 0 |
인터벌 6에 대한 IgY를 햄스터에 경구 투여하였을 때, 7 마리의 동물 가운데 7 마리가 (100%) 클로스트리듐 다이피셀 질병을 성공적으로 방어했다. 이 군의 한 햄스터는 설사를 하였으나 처리 기간 중에 곧 치유되었다. 실시예 9에서 이미 보인 바와 같이, 천연 독소 A 및 독소 B에 대한 항체는 방어 효과가 매우 뛰어 났다. 이 실시예 6에서, CTAB 처리 군의 7 마리 중 6 마리의 동물이 생존하였다. 면역전 혈청으로 처리한 모든 햄스터는 설사증으로 쓰러지고 죽었다. CTAB 및 인터벌 6 군에서 생존한 햄스터는 12 일의 후처리 기간 동안에 건강한 상태를 유지하였다. 특히, 인터벌 6로 처리한 햄스터 7 마리 중에서 6 마리는 처리를 마친 후 적어도 2 주 후에까지 생존하였는데, 이를 통하여 이 항체는 오래 지속되는 치료 효과를 제공한다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는, 무엇보다도 독소 A의 재조합 영역에 대항하여 생성된 항체를 동물에 수동 투여하였을 때 CDAD를 예방할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 예방의 차원에서 투여할 때에도 클로스트리듐 다이피셀 질병을 예방하는 데에는 인터벌 6에 대항하여 생성된 항체만으로도 충분하다는 것을 나타낸다.
이전에는 햄스터를 인터벌 6 영역에 위치한 재조합 폴리펩티드를 능동적으로 면역시켜 독소 A에 대한 항체를 생산하였다 [Lyerly, D.M., et al.(1990) Curr. Microbiol. 21:29]. 도 17은 독소 A에 대항해 지시되는 중화 항체를 생산하기 위하여 본 발명에 사용되는 완전한 인터벌 6 구성체(pMA1870-2680)와 비교하여 리엘리 등의 (Lyerly et al.) 인터벌 6 재조합 단백질 내부(pUC 벡터에 클로닝 되어 있음)의 위치를 도식적으로 나타낸다. 도 17에서, 검은 타원은 pMA1870-2680에 있는 독소 A 인터벌 6에 융합된 MBP를 나타낸다.
리엘리 등의 항체(인트라-인터벌 6)는 햄스터가 클로스트리듐 다이피셀 감염에 걸리는 것을 생존 측면에서 부분적으로 예방할 수 있으나, 이 항체는 동물의 설사증을 예방하지는 못했다. 또한, 인트라 인터벌 6 항체 [Lyerly, et al.(1990), supra]로 처리한 동물들은 처리가 중단되었을 때에 죽었다.
이와는 대조적으로, 위에서 보여준 실험은 항-인터벌 6 항체를 수동 투여하였을 때 7 마리의 동물 중에서 6 마리의 설사를 예방하고 CDAD에 의한 치사를 완전히 예방하였다. 또한, 위에서 언급한 바와 같이, 인터벌 6 에 대한 항체의 수동 투여는 오래 지속되는 예방 효과를 제공하였다(즉, 부작용 없이 처리가 중단 될 수 있었다).
b) 클로스트리듐 다이피셀 질병 치료: 클로스트리듐 다이피셀에 감염된 햄스터에 재조합 인터벌 6 항체의 생체내 처리
독소 A의 재조합 인터벌 6에 대항한 항체의 클로스트리듐 다이피셀 질병 치료능을 조사하였다. 이 실험은 기본적으로는 실시예 10(b)에서 설명하는 바에 따라 행하였다. 골든 시리안 햄스터 암컷(각각 100 g: 찰스리버) 7 내지 8 마리를 각각 포함하는 세 군에 면역전 IgY, 천연 독소 A 및 독소 B (CTAB)에 대한 IgY 및 인터벌 6에 대한 IgY를 각각 처리하였다. 항체는 위에서 설명한 4 x PEG 제제로 조제하였다.
먼저, 물 1 ㎖에 용해된 클린다마이신-HCl(시그마) 3 ㎎을 경구 투여 하여 씨. 다이피셀을 햄스터에 감염 시켰다. 약 24 시간 후에, 약 200의 균을 함유하는 무균 염수 중 씨. 다이피셀 균주 ATCC 43596 균 1 ㎖로 이 동물에 경구 공격하였다. 감염시킨 후 1 일이 지나서, 햅스터의 배설물을 시판 면역 분석 키트 (사이토클론 A+B EPA, 캠브리지 바이오테크)로 사용하여 감염 여부를 판단하였다. 각 군으로부터 4 마리를 무작위로 선택하여 시험하였다. 감염 시키지 않은 햄스터의 배설물은 음성 대조로서 시험하였다. 시험 장비 제조 업자가 제시하는 방법에 따라 행하여진 시험에서, 감염된 모든 동물은 독소 존재에 대하여 양성 반응을 보였다. 그 다음, 감염 시킨 후 약 24 시간이 지난 후에 처리를 시작하였다.
이 동물들에 인슈어R(로스 랩스 (Ross Labs))로 희석한 항체 제제 1 ㎖을 약 4 시간 간격으로 매일 투여하였다. 투여량 당 주어지는 특이 항체의 양(친화성 정제로 결정됨)은 항-인터벌 6 IgY 약 400 ㎍ (인터벌 6 군의 동물에 해당), 및 CTAB 제제에 대해 각각 항 독소 A 항체 (인터벌 6-특이) 100 ㎍ 및 항 독소 B(인터벌 3-특이: 실시예 19를 참조) 70 ㎍인 것으로 추정된다. 이 동물들을 9 일 동안 처리하고 이후의 4 일 동안은 설사 및 치사를 관찰하였다. 감염후 4 일 동안에 생존한 동물의 수 및 치사 동물의 수를 나타내는 결과는 표 20에 표시하였다.
| 처리 군 | 생존 동물 수 | 치사 동물 수 |
| 면역전 | 4 | 3 |
| CTAB | 8 | 0 |
| 인터벌 6 | 8 | 0 |
감염후 24 시간 지나서 인터벌 6 및 CTAB 모두에 대한 항체를 치료의 목적으로 투여하여 씨. 다이피셀로 인한 치사를 성공적으로 예방하였다. 많은 연구자들이 감염 후 8 시간이 지나서 존재하는 약물 (예, 반코마이신, 페넬파마이신이, 티아쿠미신, 등)로 햄스터를 치료하였으므로 이 결과는 중요하다[Swanson, et al.(1991) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 35:1108 및 (1989) J. Antibiotics 42:94].
면역전 IgY로 처리한 햄스터의 42%는 CDAD로 인하여 죽었다. 항-인터벌 6 항체는 처리된 햄스터의 치사는 방어하지만, CDAD의 모든 증상을 제거하지는 못하여 3 마리의 동물이 약간의 설사증을 보였다. 또한 CTAB를 처리한 동물 1 마리와 면역전을 처리한 동물 1 마리도 감염후 14 일이 지난 후에 설사증을 보였다. 이러한 결과로부터 항-인터벌 6 항체는 CDAD의 치료법으로서 효과적인 방법을 제공한다는 것을 알 수 있다.
실시예 17
독소 A 중화 항체 유발에는 용해성 인터벌 6 단백질이 필요하다
실시예 11(d) 및 15에 나타나 있듯이, 재조합 단백질을 이. 콜라이에서 발현시키게 되면 용해성 또는 불용성 단백질이 생성될 수 있다. 불용성 단백질이 생성되는 경우에는 동물에 면역시키기 전에 재조합 단백질을 용해시킨다. 용해성 또는 불용성 단백질 모두 또는 이들중 하나가 독소 A 중화 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는지 알아보기 위하여, 다음의 실험을 행하였다. 이 실시예는 a) 다양한 발현 벡터를 사용하여 이. 콜라이에서 독소 A 반복 서열 및 이러한 반복 서열의 아단편의 발현; b) 중화 항체가 결합하는 재조합 독소 A의 반복 서열 및 아영역의 동정; 및 c) 용해성 및 불용성 독소 A 반복 서열 면역원에 의하여 생성된 항체의 중화 능력의 측정을 포함한다.
a) 이. 콜라이의 다양한 발현 벡터를 사용하여 독소 A의 반복 서열 및 이 반복 서열의 아단편의 발현
실시예 15 및 16에서 사용된 인터벌 6 면역원은, 독소 A 반복 서열이 용해성 MBP 융합 단백질로 발현되는(실시예 11에 설명되어 있음) pMA1870-2680 단백질이었다. 흥미있게도, 이 부위(SpeI 위치부터 반복 서열이 끝나는 부위 까지. 도 15 B를 참조)에서 천연(pPA 1870-2680), 폴리-His로 표지된 [pPA 1870-2860 (H)] 또는 비오틴으로 표지된 (pBA 1870-2680) 단백질은 세균 숙주에서 완전 불용성 단백질로 발현된다(도 15 B를 참조). pBA 1870-2680의 발현에는 숙주 균주 BL21(노바겐)이 사용되었고 pPA1870-2680 및 pPA1870-2680(H)의 발현에는 숙주 균주 BL21(DE3)(노바겐)가 사용되었다. 이러한 과량의 불용성 단백질은 봉입체에 축척되었다. 문헌 [Wiliams, et al. (1994), supra]에서 설명된 바에 따라 2X YT 배지에서 키운 이. 콜라이 숙주 세포에서의 재조합 플라즈미드를 발현시켰다.
도 16B에 요약된 바와 같이, pGEX(pGA1870-2190), 핀포인트(Pinpoint)TM-Xa(pBA1870-2190 및 pBA 2250-2680) 및 pET 발현 시스템(pPA1870-2190)을 사용한 독소 A의 반복 서열 단편의 발현(N-말단 SpeI-EcoRI 단편 또는 C-말단 EcoRI-말단 단편)도 또한 불용성 단백질을 과량 생성시켰다. pGEX 및 pET 발현 시스템은 실시예 11에 설명되어있다. 핀포인트TM-Xa 발현 시스템은 이. 콜라이에서 융합 단백질의 발현을 유발한다. 핀포인트TM-Xa 벡터로부터 생성된 융합 단백질은 아미노-말단에 비오틴으로 표지되어있고 온화한 변성 조건 (5 mM 비오틴)하에서 소프트링크(SoftLink)TM 소프트 릴리스 아비딘 수지(프로메가)로 친화성 정제가 가능하다.
재조합 단백질의 발현이 유발된 후에, 단백질의 용해도를 향상시킨다고 보고된 조건 [이러한 조건에는 낮은 온도(30 ℃)에서의 숙주 배양 및 높은(1 mM IPTG) 또는 낮은(0.1 mM IPTG) 농도의 인듀서 (inducer) [Williams et al. (1994), supra]의 사용이 포함된다]하에서 pPG1870-2190 및 pPA1870-2190 발현 구성체로부터 발현된 단백질의 용해도를 결정하였다. 이러한 조건에서 발현된 모든 발현 재조합 독소 A 단백질은 불용성이었다. 따라서, 숙주 세포를 낮은 온도에서 배양하고 낮은 농도의 인듀서를 사용하는 경우에도 pET 및 pGEX 발현 벡터에 삽입된 독소 A 반복 서열의 이러한 단편의 발현으로 불용성 재조합 단백질이 발현된다. pMal 벡터에 삽입된 이러한 단편은 친화 정제가 가능한 용해성 융합 단백질로 발현되지만, 이 단백질은 상당히 불용성(pMA1870-2190) 또는 불안정(pMA2250-2650)하였다. 낮은 온도 또는 낮은 농도(위에서 언급된 농도)의 인듀서로 pMA1870-2190 발현 구성체로부터 발현된 단백질을 용해시키려는 시도는 융합 단백질의 용해도를 향상시키지 않았다.
종합하여 볼때, 이러한 결과는, 독소 A 반복 서열 부분이 다양한 발현 벡터(천연 또는 폴리-his로 표지된 pET, pGEX 또는 핀포인트 TM-Xa 벡터)에서 이. 콜라이에서 대형 단편(aa 1870-2680) 또는 소단편(aa 1870-2190 또는 2250-2680)으로 발현될 때, 단백질의 용해도를 증가시킨다고 입증된 증식 조건을 사용하여도 불용성 재조합 단백질로 생성된다는 것을 나타낸다. (pMA1870-2190)의 경우에는 단백질의 용해도를 약간 향상시키고 또는 (pMA1870-2680)의 경우에는 충분히 향상시키는 MBG와의 융합체는 예외이다.
b) 중화 항체가 결합하는 재조합 독소 A 반복 서열 및 아영역의 동정
용해성 또는 불용성 단백질로 발현되는 재조합 독소 A 반복 서열 영역 단백질을 사용하여, 중화 항체가 결합하는 독소 A 반복 서열 영역은 천연 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 항체의 폴리클론성 풀로부터 유래한 방어 작용 항체를 소모시킨다는 것을 밝혔다. 중화 항체와 결합하는 단백질 기능을 평가하기 위한 생체내 검정을 개발하였다.
이 검정의 원리은 다음과 같다. 먼저, 천연 독소 A (CTA 항체: 실시예 8에서 생성된 것임)에 대한 항체와 재조합 단백질을 혼합하고 반응 시켰다. 이어서 햄스터에 치사량의 씨. 다이피셀 독소 A를 첨가하고 이 혼합물을 IP 주사를 통하여 햄스터에 투여하였다. 재조합 단백질에 중화 에피토프가 있다면, CTA 항체는 독소 A와의 결합력을 잃게 되어 설사 및(또는) 햄스터의 치사를 초래한다.
이 분석은 다음과 같이 행하였다. 40 내지 50 g의 골든 시리안 햄스터(사스코) 9 마리에 경구 투여할 때의 독소 A의 치사량은 10 내지 30 ㎍으로 결정되었다. PEG로 정제한 CTA 항체 제제는 pH 9.5인 0.1 M 탄산염 완충액으로 0.5 x 의 농도(즉, 항체는 처음의 노른자 용적의 2 배로 희석하였음)로 희석하였다. 항체가 위에서 산에 의해 분해되는 것을 방어하기 위하여 탄산염 완충액로 희석하였다. 0.5 x 농도가 독소 A에 가장 덜 영향을 미치는 것으로 밝혀졌으므로 이 농도로 사용하였다. 0.5 x CTA 제제의 인터벌 6 특이 항체 농도는 10 내지 15 ㎍/㎖로 추정하였다(실시예 15에서 설명한 방법을 사용하여 추정된 것임).
봉입체 제제 [불용성 인터벌 6 단백질: pPA1870-2680(H)] 및 용해성 인터벌 6 단백질 [pMA1870-2680: 도 15를 참조]의 씨. 다이피셀 독소 A (CTA)에 대항하는 중화 항체 결합력을 비교하였다. 엄밀히 말하자면, 1 내지 2 ㎎의 재조합 단백질을 0.5 x CTA 항체 제제(60 내지 70 ㎍의 인터벌 6 특이 항체를 포함하고 있다고 추정됨) 5 ㎖과 혼합하였다. 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후에, 최종 농도가 30 ㎍/㎖이 되도록 CTA(테크 랩)을 첨가하고 37 ℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 독소 A 30 ㎍ (및 10 내지 15 ㎍의 인터벌 6 특이 항체)을 포함하는 혼합물 1 ㎖을 40 내지 50 g 중량의 골든 시리안 햄스터(사스코)에 경구 투여하였다. 재조합 단백질이 CTA 항체의 중화력을 소실시킨다는 것은 재조합 단백질에 중화 에피토프를 포함하고 있다는 것을 의미한다. 재조합 단백질을 첨가하지 않고 면역전 및 CTA 항체(모두 0.5 x 농도에서)는 음성 및 양성의 대조군으로 각각 사용하였다.
pET 벡터에서 불용성 단백질로 발현되는 다른 두 개의 봉입체를 시험하였다: 하나는 pPB1850-2070 (도 18을 참조)으로 불리는 인터벌 6가 아닌 불용성 인터벌 6에 대한 대조군으로 사용되는 다른 삽입 서열(독소 B 단편)을 포함하고, 다른 하나는 pPA 1870-2190으로 불리는 인터벌 6 부위가 잘린 이형이었다. 이 실험의 결과는 표 21에 나타내었다.
| 처리 군 | 건강2 | 설사증3 | 치사4 |
| 면역전 Ab | 0 | 3 | 2 |
| CTA Ab | 4 | 1 | 0 |
| CTA Ab + 인터벌 6 (용해성) | 1 | 2 | 2 |
| CTA Ab + 인터벌 6 (불용성) | 5 | 0 | 0 |
| CTA Ab + pPB1850-2070 | 5 | 0 | 0 |
| CTA Ab + pPA1870-2190 | 5 | 0 | 0 |
| 1. 씨. 다이피셀 독소 A(CTA)를 각 군에 첨가하였다.2. 동물이 질병 증세를 나타내지 않았다.3. 동물이 설사증을 나타냈으나 치사되지 않았다.4. 동물이 설사증을 나타내고 치사되었다. | |||
면역전 항체는 독소 A에는 효과가 없었으나, 0.5 x 농도로 희석된 항-CTA 항체는 CTA의 장독소 효과로부터 햄스터를 거의 완전하게 방어한다. 항-CTA 항체에 재조합 단백질 pPB 1850-2070 또는 pPA 1870-2190을 첨가하는 것은 항-CTA 항체의 방어력에 영향을 미치지 못한다. 다른 한편으로는, 재조합 인터벌 6 단백질도 또한 결합을 통하여 항-CTA 항체를 중화할 수 있고 항-CTA 항체의 생체내 방어 효과를 중화시켰다. 용해성 인터벌 6 단백질 독소와 혼합된 항-CTA 항체를 처리한 군의 5 마리중 4 마리의 동물은 독성에 영향을 받았다(설사증 및 치사). 또한, 불용성 인터벌 6 단백질을 첨가하는 것은 CTA 항체 제제의 중화 능력에 영향을 미치지 못하기 때문에 이 결과를 통하여 인터벌 6 단백질이 용해성 생성물로 발현되어 항-CTA 항체와 결합하여 중화하는 것을 알 수 있다.
c) 용해성 및 불용성 독소 A 반복 서열 면역원에 의해 생성된 항체의 중화력 측정
용해성 봉입체에 대하여 중화 항체가 유발되는지 알아보기 위하여, 불용성 독소 A 반복 서열 단백질을 용해시켜 닭에서 특이 항체를 생성시켰다. 불용성 pPA 1870-2680 단백질은 문헌 [Wiliams et al.(1994). supra.]에 설명되어 있는 바에 따라 용해시켰다. 간단히 말하자면, 배양물(500 ㎖)을 4 ℃에서 3,000 x g로 원심 분리하여 침강시켰다. 봉입체 초음파 분해 처리 완충액(25 mM HEPES pH 7.7. 100 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 20% 글리세롤, 0.1%(v/v) 노니데트(Nonidet) P-40, 1 mM DTT)에 세포 침강물을 완전히 재현탁 시켰다. 이 현탁액을 유리가 아닌 30 ㎖ 짜리 원심 분리용 튜브로 옮겼다. 10 ㎎/㎖의 라이소자임 500 ㎕를 첨가하고 튜브를 얼음에 30 분간 인큐베이션하였다. -70 ℃에서 적어도 1 시간 동안 이 현탁액을 동결시켰다. 이 현탁액은 가끔씩 얼음에서 식히면서 마이크로프로브(Branson Sonicator Model No. 450)의 적어도 8 회의 15 초 분기로 초음파 분해 처리를 하였다.
초음파 분해처리 한 현탁액을 35 ㎖ 짜리 오크리지(Oakridge) 튜브에 옮기고6,000 x g에서 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 봉입체를 침강시켰다. 빙냉한 신선한 RIPA 완충액(0.1% SDS, 1% 트리톤 X-100, TBS(25 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl)에 용해된 1% 데옥시콜레이트 나트륨]으로 피펫팅 및 볼텍싱하여 2 회 세척하였다. 매번 세척이 끝나면 봉입체를 다시 원심 분리 하였다. 봉입체를 건조시키고 작은 금속 수저를 사용하여 15 ㎖ 짜리 튜브(Falcon)으로 옮겼다. 10 % SDS 1 ㎖을 첨가하고 1 ㎖ 짜리 마이크로피페터를 사용하여 용액을 빨아올리고 내리기를 가만히 하여 침강물을 용해시켰다. 필요한 경우에, 시료를 95 ℃까지 가열함으로써 용해를 용이하게 할 수 있다.
봉입체가 용액에 있을 때 9 배 용적의 PBS로 시료를 희석하였다. 단백질 용액은 0.05% SDS를 포함하는 100 배 용적의 PBS에서 실온에서 밤새도록 투석하였다. 다음에 0.01% SDS를 포함하는 PBS로 투석 완충액으로 갈아주고, 시료를 수 시간 내지는 밤새도록 실온에서 투석하였다. 시료는 사용할 때 까지 4 ℃에 보관하였다. 사용하기 전에는 시료를 실온까지 온도를 높여서 침강된 SDS가 용액에 잘 용해되도록 하였다.
봉입체 제제를 암탉을 면역 시키는데 사용하였다. 단백질을 PBS에 투석시키고 대략 같은 용적의 초기 면역의 경우 CFA 또는 후속 추가 자극 면역의 경우 IFA로 유화시켰다. 바로 그날에 각각의 재조합 제제의 경우, 재조합 단백질 약 0.5 내지 1.5 ㎎을 포함하는 재조합 단백질-보조제 혼합물 1 ㎖을 흰 레그혼 암탉이 낳은 2 개의 달걀 각각에 여러 군데(IM 및 SC) 주사하였다. 제 14일 및 제 28 일째에 추가 자극 면역을 시켰다. 제 32 일째에 달걀을 모아, 실시예 14(a)에서 설명된 바와 같이 PEG를 사용하여 항체를 분리하였다. 독소 A 특이 항체가 높은 농도로 존재하였다(실시예 13에서 설명한 방법을 따라 ELISA에 의하여 분석). 재조합 폴리펩티드 pPA 1870-2680 및 pMA 1870-2680에 대한 항체 각각의 농도를 측정하여 > 1:62,5000에 필적하는 것으로 발견하였다.
실시예 15(b)에서 설명된 생체내 분석에 의하여 독소 A에 대한 중화 능력을 알아보기 위하여 용해성 인터벌 6(pMA1870-2680) 및 불용성 인터벌 6에 대한 항체 [(봉입체), pPA 1870-2690}을 시험하였다. 면역전 항체 및 독소 A(CTA)에 대한 항체는 각각 음성 또는 양의 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 표 22에 나타내었다.
| 항체 처리 군 | 건강1 | 설사증2 | 치사3 |
| 면역전 Ab | 1 | 0 | 4 |
| CTA | 5 | 0 | 0 |
| 인터벌 6 (용해성)4 | 5 | 0 | 0 |
| 인터벌 6 ( 불용성) | 0 | 2 | 3 |
| 1. 동물이 질병 증세를 나타내지 않았다.2. 동물이 설사증을 나타냈으나 치사되지 않았다.3. 동물이 설사증을 나타내고 치사되었다.4. 400 ㎍/㎖ | |||
면역전 항체는 효과가 적은 반면에, 천연 독소 A에 의해 생성된 항체는 방어력이 있다. 용해성 인터벌 6에 대하여 생성된 항체가 독소 A의 효과를 부분 적으로 중화할 수 있는 생체 CHO 분석 [실시예 8(d)에 설명되어 있음]을 사용하여 발견된 바와 같이, 본 발명에서는 이들 항체가 독소 A를 생체내에서 완전하게 중화할 수 있었다. 이와는 대조적으로, 위 (표 22) 및 생체외 CHO 분석[실시예 8(d)에 설명되어 있음]이 보여주듯이, 항체가 불용성 인터벌 6에 대하여 생성된 항체는 독소 A를 행체내에서 중화할 수 없었다.
이러한 결과는 닭에 있어서 용해성 독소 A 반복 서열 면역원이 중화 항체를 유발하는 데에 필수적임을 보여주고 이러한 용해성 면역원의 생성은 aa 1870-2680에 위치한 독소 A 부위를 포함하는 특정 발현 벡터(pMal)로만 얻을 수 있다. 이것은, 이어서 안정화된 불용성 단백질이 중화 항체를 제거할 독소 A 항원을 생성시키지 않는다는 것이다.
실시예 18
씨. 다이피셀 독소 B 유전자의 클로닝 및 발현
독소 B의 유전자를 클로닝 하였고 염기 서열을 분석하였다: 클로닝된 염기 서열로부터 아미노산 서열을 추정하여 분자량 269.7 kD인 독소 B로 예상하였[Barroso et al. Nucl. Acids Res. 18:4004(1990)]. 독소 B 유전자의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:9에 나타내었다. 전체 독소 B 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10에 나타내었다. 독소 B의 아미노산 잔기 1850에서 2360으로 구성되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:11에 나타내었다. 독소 B의 아미노산 잔기 1750에서 2360으로 구성되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12에 나타내었다. 독소 B의 아미노산 잔기 1754 내지 2362로 구성되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:30에 나타내었다.
천연 독소 단백질을 분리하는데 드는 비용 및 어려움을 고려하면, 면역 목적으로 간단하고 비용이 덜 드는 원핵 생물 발현 시스템을 사용하여 재조합 독소 B 단백질을 높은 농도로 생성 시키고 분리하는 것은 유리하다. 용해된 봉입체 단백질이 자주 천연 구조로 폴딩이 되지 않으므로, 이상적으로는, 천연 항원성을 보존하기 위해서 분리한 재조합 단백질은 용해성이어야할 것이다. 실시예 17이 나타나 있는 바와 같이, 사실상, 재조합 독소 A에 대한 중화 항체는 용해성 재조합 독소 A 폴리펩티드가 면역원으로서 사용될 때만이 얻을 수 있다. 정제를 용이케 하기 위해서, 재조합 단백질이 이. 콜라이 배양물 1 ℓ당 1 ㎎ 이상의 농도로 발현되어야 한다.
재조합 독소 B 단백질을 이. 콜라이에서 높은 농도로 생성시킬 수 있는지 알아보기 위하여, 독소 B 유전자 단편을 다양한 원행 생물 발현 벡터에 클로닝하여 이. 콜라이에서의 재조합 독소 B 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 이 실시예는 (a) 독소 B유전자의 클로닝 및 (B) 독소 B 유전자의 이. 콜라이에서의 발현을 포함한다.
a) 독소 B 유전자의 클로닝
씨. 다이피셀의 게놈 DNA를 PCR로 증폭하여 독소 B 유전자를 클로닝하였다. 먼저, P5/P6 및 P7/P8을 각각 프라이머로 사용하여 서로 겹치는 2 개의 단편으로 유전자를 클로닝하였다. 독소 B 유전자 상에서의 이들 프라이머의 위치는 도 18에 도식화 하였다. 이 프라이머의 각각의 염기서열은 다음과 같다:
P5: 5' TAGAAAAAATGGCAAATGT 3'(SEQ ID NO:11)
P6: 5' TTTCATCTTGTA GAGTCAAAG 3'(SEQ ID NO:12)
P7: 5' GATGCCACAAGATGATTTAGTG 3'(SEQ ID NO:13); 및
P8: 5' CTAATTGAGCTGTATCAGGATC 3'(SEQ ID NO:14)
도 18은 독소 B 단백질에서의 다음의 프라이머의 위치도 보이고 있다: 5' CGGAATTCCTAGAAAAAATGGCAAATG 3'(SEQ ID NO:15) 서열의 P9; 5' GCTCTAGAATGACCATAAGCTAGCCA 3'(SEQ ID NO:16) 서열의 P10; 5' CGGAATTCGAGTTGGTAGAAAGGTGGA 3'(SEQ ID NO:17) 서열의 P11; 5' CGGAATTCGGTTATTATCTTAAGGATG 3'(SEQ ID NO:18) 서열의 P13; 5' CGGAATTCTTGATAACTGGATTTGTGAC 3'(SEQ ID NO:19) 서열의 P14. 독소 B의 아미노산 잔기 1852 내지 2362를 포함하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:20에 나타냈다. 독소 B의 아미노산 잔기 1755 내지 2362를 포함하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:21에 나타냈다. 독소 B의 아미노산 잔기 1754 내지 2362를 포함하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:30에 나타냈다.
클로스트리듐 다이피셀 VPI 균주 10463은 아메리칸 타입 켤쳐 콜렉션(ATCC 43255)에서 분양받았고, 뇌-심장 융합 배지(Becton Dickison)에서 혐기적인 조건으로 증식시켰다. 분자량이 높은 씨. 다이피셀 DNA은, 1) 세균을 붕괴하기 위해 0.5% SDS에 용해된 100 ㎍/㎖의 프로티나제 K를 사용하였고, 2) 맑은 용해물에서 탄화 수소물을 제거하기 위하여 세티트리메틸암모늄 브롬화물(CTAB) 침강법 [Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2(1989) Current Protocols에 설명되어 있는 방법 대로]을 사용한 점을 제외하고는 기본적으로 문헌 [Wren and Tabaqchli(1987) J. Clin. Microbiol., 25:2402]에서 설명된 방법을 따라 분리하였다. 간략하게 설명하자면, 프로테이나제 K 및 SDS를 사용하여 세균을 붕괴시키고, 5 M NaCl을 1/7의 용적로 첨가하여 약 0.7 M NaCl이 되도록 하였다. CTAB/NaCl(0.7 M NaCl에 용해된 10% CTAB)를 1/10의 용적로 첨가하고 용액을 완전히 혼합한 후, 65 ℃에서 10 분간 인큐베이션하였다. 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)을 동량 첨가하고 충분히 혼합하였다. 5분간 원심 분리하여 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층은 제거하여 버리고 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1)로 추출하였다. 5분간 원심 분리하여 충을 분리시켰다. 상등액을 새 튜브로 옮긴 후 이소프로판올로 DNA를 침강시켰다. DNA 침강물은 마이크로퓨즈에서 간단히 원심 분리하여 펠렛으로 만들었다. DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하여 잔류 CTAB를 제거하였다. DNA 침강물을 건조시키고 TE 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)에 녹였다. 단계적으로 희석한 완전한 람다(lambda) DNA를 아가로즈 겔상에서 전기 영동한 것과 비교하여 분리한 게놈 DNA의 순도 및 수율을 결정하였다.
독소 B 단편은 판독 효율이 높은 열에 강한 DNA 폴리머라제 [천연 pfu 폴리머라제(스트라타젠)]를 사용한 PCR을 통하여 클로닝 하였다. 이 폴리머라제의 높은 효율은 판독 효율이 낮은 폴리머라제(예, Taq 폴리머라제)로 증폭할 때에 나타나는 돌연변이를 줄일 수 있다. PCR 프라이머로는 P5(SEQ ID NO:11)와 P6(SEQ ID NO:12) 및 P7(SEQ ID NO: 13)과 P8(SEQ ID NO:14)가 사용되었고, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 0.2 μM의 각각의 프라이머 및 씨. 다이피셀 게놈 DNA 50 ng이 포함된 50 ㎕의 반응물에서 PCR 증폭을 행하였다. 반응물에 미네랄 오일 100 ㎕을 떨어뜨리고, 94 ℃에서 4 분간 가열한후, 천연 pfu 폴리머라제(스트라타젠) 0.5 ㎕를 첨가하고, 94 ℃에서 1 분, 50 ℃에서 1 분, 72 ℃ (증폭될 서열 1 kb당 2 분)를 30 회 반복한후, 72 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 증폭된 반응물을 모아서 클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침강시켰다. 70% 에탄올로 세척한후, 침강물을 50 ㎕의 TE 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0. 1 mM EDTA)에 재현탁 시켰다.
P5/P6 증폭 산물은 다음의 방법으로 pUC19에 클로닝시켰다. 프렙-a-진 키트 (Prep-a-Gene kit, BioRad)를 사용하여 10 ㎕ DNA를 겔에서 정제하고, pUC19 벡터의 SmaI 제한 효소 위치에 리게이션시켰다. 재조합 클론을 분리하여 통상적인 재조합 분자 생물학적인 기술(Sambrook et al., 1989)로 제한 효소 부위를 잘라서 확인하였다. 따로 분리된 두 개의 삽입물 각각에는 독소 B 삽입체가 벡터 BamHI에서 SacI 까지의 위치에서 5' 에서 3'의 방향으로 향하고 있는 것으로 밝혀졌다(pUCB10-1530). BamHI/SacI 단편을 포함하는 삽입체를 BamHI/SacI으로 절단된 pET23a-c 벡터 DNA에 클로닝한후, 확인된 클론의 소규모의 배양물(5 ㎖)에서 단백질의 발현을 유발하였다.
전체 단백질을 분리하여 SDS-PAGE 겔에서 전개시킨 후, 친화성에 근거하여 정제한 염소 항-독소 B 항체(테크 랩.)를 사용하여 웨스턴 분석을 통해 독소 B 단백질을 확인하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 분석은 문헌 [Wiliams et al.(1994), supra.]에서 설명된 바에 따라 행하였다. 간단히 설명하자면, 100 ㎍/㎖ 암피실린이 포함된 2X YT에서 배양한, 적합한 재조합 클론의 세균 배양물 5 ㎖에 IPTG를 1 ㎖까지 첨가하여 발현을 유발하였다. 숙주로 사용된 이. 콜라이는 pET 플라즈미드의 경우 BL21(DE3) 또는 BL21(DE3)LysS(노바겐)이다.
세포 농도가 0.5 OD600에 도달할 때 IPTG를 최종 농도 1.0 mM이 되도록 첨가하여 발현을 유발하고 발현된 단백질은 유발된 후 2 시간 동안 축척시켰다. 1 ㎖의 세균 배양물의 원심 분리(마이크로퓨즈에서 1 분간) 및 펠렛화된 세균을 2 X SDS-PAGE 시료 완충액(0.125 mM Tris-HCl pH 6.8, 2 mM EDTA, 6% SDS, 20% 글리세롤, 0.025% 브로모페놀 블루: 사용하기 전에 5% 까지 β-메르캅토에탄올을 첨가하였음). 150 ㎕의 재현탁으로 단백질 시료를 준비하였다. 시료를 95 ℃에서 5 분간 가열하고 냉각시켜 5 또는 10 ㎕를 7.5% SDS-PAGE 겔에 걸었다. 동정 융합 단백질의 분자량을 예상하기 위하여 분자량이 높은 단백질 마커(BioRad)도 함께 걸었다. 전기 영동한 후에, 통상적으로는 쿠마시 블루로 겔을 염색하거나 또는 특별하게는 웨스턴 블롯으로 특이 면역 반응 단백질을 탐지하기 위해 니트로셀룰로스에 블롯팅시켜 목적 단백질을 탐지하였다. 유발된 독소 B 반응성 단백질의 분자량을 통해 측정될 독소 B의 리딩 프레임(reading frame)이 완결성을 알 수 있었다.
pET23b 재조합 (pPB10-1530)은 고분자 재조합 독소 B 반응성 단백질을 예상되는 값으로 일정하게 발현시켰다. 이러한 사실은 PCR 증폭 과정에서 프레임이 중단되는 오류가 일어나지 않았다는 것을 뒷받침한다. P7/P8 증폭 생성물의 EcoRI-SpeI 단편을 pPB10-1530에 삽입된 P5/P6 증폭 생성물(도 18을 참조)의 P5-EcoRV 사이로 융합시켜 독소 B 유전자의 10-1750 aa 인터벌을 포함하는 pET236 발현 클론을 구성하였다. 이 클론(pBP10-1750)의 완결성은 제한 맵핑 및 발현된 재조합 독소 B 단백질의 웨스턴 블롯을 통하여 탐지하여 확인하였다. 사용할 만한 양의 재조합 독소 B 단백질을 분리하는 것을 용이케 하기에는 pPB10-1530 및 pPB10-1750에서 발현된 단백질의 농도는 너무 낮다. 나머지 1750-2360 aa 인터벌은 아래에서 설명한 바와 같이 P7/P8 증폭 생성물로부터 pMAL 또는 pET 발현 벡터로 바로 클로닝 하였다.
b) 독소 B 유전자의 발현
i) 발현 방법의 개요
독소 B 유전자의 단편을 천연 또는 융합 단백질로서 이. 콜라이에서 발현시켰다. 천연 단백질을 pET23a-c 또는 pET16b 발현 벡터(노바겐)에서 발현시켰다. pET23 벡터에는 세 가지 판독 프레임 모두(a-c 벡터)에 넓은 다중 연결 서열 및 이어서 C-말단 폴리-히스티딘 반복 서열을 함유한다. pET16b 벡터는 5'의 작은 폴리링커의 바로 5'에 N-말단 폴리-히스티딘 서열을 가지고 있다. 폴리-히스티딘 서열은 Ni-킬레이트 칼럼에 결합하여 표지한 목적 단백질을 친화성 정제 할 수 있다[Williams et al. (1994). supra]. 제한된 크기의 외부 서열을 포함한 천연 단백질의 발현 및 친화성 정제를 가능케 하는 친화성 표지는 크기가 작다(pET16b의 경우에는 10 개의 아미노산, pET23의 경우에는 6 개의 아미노산).
N-말단 폴리-히스티딘으로 표지한 독소 B 발현 구성체의 클로닝이 유리하도록 넓은 클로닝 카세트를 포함하는 N-말단 히스티딘-표지한 pET16b 인듀서를 제조하였다. 이것은 pET23a 및 b 벡터 부분의 프로모터 부분을 pET16b 발현 벡터의 프로모터로 바꿈으로써 가능하였다. 각각의 벡터는 BglII 및 NdeI으로 자르고 1.2% 아가로즈 겔에서 결과를 분석하였다. pET16b의 프로모터 부분(200 bp BglII-NdeI 단편에 포함되어 있음) 및 프로모터가 없는 pET23 a 또는 b 벡터를 겔에서 잘라 혼합한 후 프렙-A-진(BioRad)으로 정제하였다. 분리한 DNA를 리게이션시키고, 정제한 플라즈미드 DNA를 NcoI으로 잘라서 프로모터가 치환된 형질 전환체를 스크리닝 하였다(pET16b 프로모터는 이 부분을 포함하나, pET23 프로모터는 포함하지 않는다). 이러한 클론(pETHisa 또는 b로 표시)는 넓은 pET23 폴리 링커의 NdeI 부위에 융합되어 있는 pET16b 프로모터(pT7-lac 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 폴리-히스티딘(10 aa) 서열)를 포함한다.
모든 MBP 융합 단백질은 목적 단백질의 C-말단 부분이 MBP와 융합되어 발현되는 pMALTM-c 또는 pMALTM-p2 벡터(뉴 잉글랜드 Biolab)로 제조하고 발현시켰다. pMal 플라즈미드는 BL21 숙주에서 발현시키고, 모든 pET 플라즈미드는 BL21(DE3) 또는 BL21(DE3)LysS 발현 숙주에서 발현시켰다.
2 X YT 액체 배지에서 배양한 각각의 재조합체의 대규모(500 ㎖ 내지 1ℓ)배양물 및 용해성 단백질 분획을 문헌 [Wiliams, et al. (1994). supra]에서 설명하는 바에 따라 정제하였다. 이 용해성 단백질 추출물은 문헌 [Williams et al. (1994) supra]에서 설명하는 방법에 따라 친화성 크로마토그래피로 재조합 융합 단백질을 분리하였다. 간단히 설명하자면, 표지한 pET 융합체를 포함한 추출물은 공급자(노바겐 또는 Qiagen)의 지침에 따라 니켈 킬레이트 칼럼 크로마토그래피로 분리하고 이미다졸 염 또는 낮은 pH(pH 4.0)으로 용리하였다. 문헌 [Wiliams et al. (1994). supra)에서 설명하는 바에 따라 용해성 pMAL 용합 단백질을 포함하는 추출물을 제조하고 PBS 완충액에 있는 아밀로스 수지(뉴 잉글랜드 바이오랩) 칼럼 크로마토그래피로 분리하고 10 mM 말토오즈를 포함하는 PBS로 용리하였다.
ii) 독소 B 발현의 개요
위(a)에서 설명된 큰 발현 구조물 모두에서 오직 낮은 농도(원래의 또는 미붕괴 단백질 1 ㎎/ℓ이하)의 재조합 단백질의 발현이 관찰되었다. 독소 B 유전자의 소단편을 포함하는 다수의 발현 구조물을 제조하여 유전자의 작은 부분이 높은 농도(즉, 천연 단백질 1 ㎎/ℓ이상)로 발현할 수 있을 지 결정하였다. 이들 모두는 사용하기에 편리한 독소 B 절단 단편을 pMAL-c, pET23a-c, pET16b 또는 pETHisa-b 발현 벡터에 프레임 융합하거나 PCR 증폭으로 특정 위치의 절단 부위를 조작함으로써 제조하였다 (위(a)에서 설명한 동일한 조건에서 행하였다). 이 모든 경우에, 클론을 제한 맵핑으로 검증하였고, 표지한 부분의 DNA 서열을 밝혔다.
단백질의 안정도(쿠마시 블루 염색) 및 독소 B 특이 항혈청에 대한 면역 반응(웨스턴 블롯)을 알아보기 위하여 SDS-PAGE를 통해 이러한 각각의 구조물에서 유발된 단백질 제조품을 분석하였다. 큰 제조합체와 비교하였을 때 작은 구성체에서 전체 길이의 원래의 (즉, 미붕괴) 융합 단백질이 높은 농도로 관찰되었고 모든 독소 B 유전자를 포함하는 발현 구조물의 시리즈를 제조하였다(도 18, 19 및 20 및 표 23).
재조합 독소 B 단백질이 이. 콜라이에서 유의한 수준 (원래의 재조합 단백질 1 ㎎/ℓ이상) 발현되는 구조물을 발견하였고, 독소 B 유전자를 포함하는 이러한 클론의 시리즈는 도 19에 나타냈으며 표 23에 요약하였다. 이러한 클론은 전체 독소 B 유전자로부터 순수한 독소 B 재조합 단백질을 분리하는데 사용하였다. 전체 독소 B 유전자를 포함하는 pMAL 발현 구조물로부터 유의한 수준의 단백질 수율을 얻었고, 전체 길이의 용해성 단백질 수율은 약 1 ㎎/ℓ배양물(pMB 1100-1530) 내지 20 ㎎/ℓ 배양물(pMB1750-2360)의 범위이다.
MBP 및 폴리-히스티딘으로 표지된 독소 B 재조합의 대표적인 정제는 도 21 및 22에 나타냈다. 도 21은 pMB1850-2360을 가진 세균으로 부터 추출한 다양한 단백질 시료를 전기 영동한 후, 쿠마시 블루로 염색시킨 7.5% SDS-PAGE 겔을 보여준다. 단백질 시료는, 제 1 레인에는 유발되지 않은 배양물으로 부터 추출한 단백질; 제 2 레인에는 유발된 배양물 단백질; 제 3 레인에는 초음파 처리 이후 유발된 배양물의 전체 단백질; 제 4 레인에는 용해성 단백질; 및 제 5 레인에는 친화성에 근거하여 정제한 용리된 단백질의 순으로 걸었다. 도 22는 pPB1850-2360(레인 1-3) 또는 pPB1750-2360(레인 4-6)을 포함하는 세균에서 발현하는 재조합 단백질의 정제를 나타낸다. 시료는, 제 1 내지 4 레인에는 유발되지 않은 전체 단백질; 제 2 내지 5 레인에는 유발된 전체 단백질; 및 제 3 내지 6 레인에는 친화성에 근거하여 용리하여 정제한 단백질의 순으로 걸었다. 넓은 범위의 분자량 단백질 마커(Biorad)는 제 7 레인에 걸었다.
따라서, 큰 발현 구성체를 사용하여 독소 B 유전자를 높은 농도로 발현시키지 못하였으나, 전체 독소 B 유전자를 포함하는 작은 pMAL 발현 구조물의 시리즈로부터 유발된 단백질을 분리함으로써 사용할 만한 양의 재조합 단백질을 얻었다.
이러한 결과는, 높은 농도의 재조합 독소 B 단백질을 이. 콜라이에서 발현시킬 수 있는 가능성을 처음으로 나타내는 것이다. 또한, 큰 구조물, 또는 MBP와의 융합체는 용해성(도 19)임에 반하여, 천연 단백질로서 독소 B의 추정되는 리간드 결합 영역(반복 부위)의 발현으로 천연 단백질로 불용성 단백질이 생성됨은 이러한 인터벌로부터 용해성 융합 단백질을 생산하는 데에는 특정한 방법이 필요함을 나타낸다.
iii) 클론 구성 및 발현의 상세한 설명
독소 B 반복 부위 [독소 B(SEQ ID NO:20)의 아미노산 잔기 1852 - 2362]를 포함하는 독소 B 유전자의 부분은 씨. 다이피셀의 게놈 DNA로부터 독소 B 유전자의 이 인터벌을 PCR로 증폭하여 분리하였다. 이 부위를 증폭하기 위하여 사용한 두개의 PCR 프라이머 [P7 (SEQ ID NO:13) 및 P8 (SEQ ID NO:14)의 독소 B 유전자 내에서의 위치 및 서열은 도 18에 나타내었다.
PCR 증폭으로 생성된 DNA는 위에서 설명된 바에 따라 클로로포름 추출 및 에탄올 침강으로 정제하였다. 이 DNA를 SpeI으로 절단하고, 잘려진 DNA는 아가로즈 겔에서 전기영동하여 결과를 분석하였다. 3.6 kb 증폭 생성물을 SpeI으로 잘라서 1.8 kb 짜리 두 조각으로 만들었다. 이 두 조각을 겔에서 잘라내어 젤에서 정제한 적당히 절단된 pMAL 또는 pET23b 벡터와 혼합하였다. 이러한 벡터는 HindIII로 자른 후에 클레노우 효소로 돌출한 부분을 채운후, XbaI 또는 NheI(pET23b)로 잘라서 제작하였다. 겔에서 정제한 DNA 단편은 프렙-A-진 키트(BioRad)를 사용하여 정제하였고, 이 DNA를 리게이션시키고 형질 전환 시켜 생성된 추정 재조합 클론은 제한 맵핑의 방법으로 검증하였다.
독소 B 반복 서열 삽입체 (독소 B의 아미노산 인터벌 1750-2360)을 포함하는 pET 및 pMal 클론은 독소 B의 특정 부위를 절단하는 효소를 사용한 제한 맵핑으로 검증하였다. 두 가지 경우 모두, 독소 B SpeI 부위를 상용성의 XbaI 부위(pMal) 또는 상용성의 NheI 부위(pET)로의 융합은 프레임 융합을 생성시키는 것으로 예측되었다. 이러한 사실은, pMB 1750-2360 클론의 경우에 클론 접합 부위 및 독소 B 삽입체의 5' 말단 부위를 MBP 특이 프라이머(New England Biolabs)를 사용한 DNA 염기 서열 분석을 통하여 확인하였다. pET 구조물의 경우에는, 평활 말단의 독소 B의 3' 말단을 채워진 HindIII 부위에 융합함으로써 이 벡터 내에서 C-말단 폴리-히스티딘 서열을 가진 프레임 내 융합체가 형성된다. 선택된 pPB1750-2360 클론은 예상하였던 대로, 클론 연결 부위의 HindIII 자리가 소실 되었다. 이러한 사실로 Pfu 폴리머라제의 터미날 트렌스퍼라제 효과로 인하여 아데노신 잔기가 PCR 생성물의 3' 위치에 첨가되는 가능성이 배제되었다.
각각의 발현 구성체의 배양물 1 ℓ를 배양시키고, 문헌 [Williams et al. (1994). supra]에서 설명하는 바에 따라 아밀로즈 수지 칼럼(pMAL 구성체; New England Biolabs에서 구입한 수지) 또는 Ni-킬레이트 칼럼(pET 구조물; Qiagen 또는 노바겐에서 구입한 수지)의 친화성 크로마토그래피로 융합 단백질을 정제하였다. 실시예 8에서 설명된 바에 따라 SDS-PAGE 단백질 겔의 쿠마시로의 염색 및 친화성에 근거하여 정제한 염소의 폴리클론성 항혈청(테크 랩.) 또는 독소 B 단백질(CTB)에 의하여 생성된 닭의 폴리클론성 PEG 제제로의 웨스턴 블롯 분석을 통하여 융합 단백질의 완결성 및 순도를 결정하였다. 두 경우에서, 전체 길이의 재조합 단백질로 판단되는 90% 이상의 단백질이 배양물 1 ℓ당 단백질 20 ㎎의 수율로 친화성에 근거하여 정제되었다. 폴리-히스티딘 친화성으로 표지된 단백질은 낮은 이미다졸 농도(60 mM)에서 퀴아젠(Quiagen) Ni-NTA 수지로부터 용리되므로, 정제하는 동안에는 60 mM 이미다졸보다 40 mM 이미다졸로 세척하는 것이 필요하다.
세포질로 분비되는 pMB1750-2360의 변형체는 이 구성체의 프로모터 및 MBP를 코딩하는 부위를 MBP의 N-말단에 존재하는 시그날 서열이 있는 관계된 벡터(pMALTM-p2; New England Biolabs)의 프로모터 및 MBP를 코딩하는 부위과 교체하여 제작하여, 융합 단백질이 분비되도록 하였다. 이것은 pMAL-p2의 BglII-EcoRV 프로모터 단편을 pMB1750-2360에 치환하여 넣음으로써 가능하다. 분비되는, 친화성 정제 단백질(문헌 [Riggs, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2. Ausubel, et al., Eds. (1989). Current Protocols, pp. 16.6.1 - 16.6.14]에 설명된 바에 따라 삼투압 쇼크 추출물로부터 회수함)의 수율은 배양물 1 ℓ당 6.5 ㎎이었고 이들의 50%가 전체 길이의 융합 단백질로 추정되었다.
이 인터벌은 겹치지 않는 2 개의 단편에서도 또한 발현되었다. pMB1750-1970은 pMB1750-2360에 프레임 시프트를 도입하고, HindII로 절단하고 돌출된 말단 부분을 채우고 플라즈미드와 다시 리게이션시켜서 제작하였다. 재조합 클론은 HindIII 자리가 소실된 것에 근거한 제한 맵 분석을 통하여 선택하였다. 이 벡터로부터 발현된 재조합 단백질은 20 ㎎/ℓ이상이었으며 90% 이상이 순수 단백질이었다.
상보적인 영역은 pMB1970-2360에서 발현시켰다. 이 구조물은 pMB1750-2360의 1750-1970 인터벌을 제거하여 제작하였다. 이것은, 이 플라즈미드를 EcoRI(pMalc 폴리링커에서 삽입체의 5'쪽에) 및 III로 자른 후, 돌출 말단을 채우고 플라즈미드에 리게이션시켜 제작한 것이다. 이와 같이 하여 생성시킨 플라즈미드인 pMB1970-2360 벡터는 pMB1750-2360의 세포내 및 분비성 이체를 사용하여 제작하였다.
융합 단백질이 분비되는 것을 방해하는 구조적인 문제점으로 인하여pMB1970-2360 이체로 부터는 융합 단백질이 분비되지 않았다. 그러나, 세포내에서 벡터로부터 40 ㎎/ℓ이상의 단백질이 발현되었고 이들의 90%가 전체 길이의 융합 단백질이었다.
pMalc(pMB1850-2360) 또는 pET16b(pPB1850-2360)에서 독소 B의 반복 서열을 정확하게 발현시키기 위한 구조물은 다음의 방법으로 제작하였다. 독소 B 반복 서열을 포함하는 DNA 인터벌은 PCR 프라이머 P14(SEQ ID NO:19) 및 P8 (SEQ ID NO:14)를 사용하여 위에서 설명된 방법으로 PCR로 증폭하였다. 프라이머 P14는 독소 B 반복 서열의 출발 부분에 바로 이웃하여 EcoRI 자리를 생성시켰다.
증폭된 단편은 pT7 블루 T-벡터(노바겐)에 클로닝 하고, PCR 단편 1개가 방향에 상관 없이 삽입된 재조합 클론(pT71850-2360)을 선택한후, 제한 맵핑으로 확인하였다. 삽입체는 따로 분리한 적당한 방향의 두 개의 pT71850-2360 플라즈미드로부터 EcoRI(반복 서열의 5') 및 PstI(벡터의 폴리링커에 이웃한 곳)을 사용하여 잘라내고 EcoRI/PstI으로 자른 pMalc 벡터에 클로닝하였다. 생성된 구성체(pMB1850-2360)은 제한 맵핑으로 확인 하였고, 친화성 크로마토그래피의 정제로 용해성 융합 단백질[90% 이상이 천연(즉, 미붕괴)] 20 ㎎/ℓ가 생성되었다. 이 플라즈미드를 HindIII로 절단하고 다시 리게이션시켜 1790-2360 인터벌을 제거하였다. 생성된 구조물 (pMB1850-1970)로부터 70 ㎎/ℓ이상의 단백질이 발현되었으며, 이들의 90%이상이 전체 길이의 융합 단백질이었다.
pT71850-2360 벡터의 EcoRI(클레나우로 채워짐)-BamHI 단편(pMB1850-2360 구성체에서 사용된 것에 반대 방향)을 NdeI(채워짐)/BamHI으로 절단된 pET16b 벡터에 클로닝 하여 pPB1850-2360 구성체를 제작하였다. 친화성에 근거하여 정제한 용해성 단백질의 수율은 15 ㎎/ℓ이었고 이들중 90% 이상이 전체 길이의 융합 단백질이었다.
1750-2070 인터벌로부터의 몇 가지 작은 발현 구성체는 His로 표지한 pET 벡터에 제작하였으나 이들 플라즈미드는 BL21(DE3) 숙주에서 거의 불용성인 단백질을 높은 농도로 발현하였다(표 23 및 도 19를 참조). 이들 구조물은 다음과 같이 제작하였다.
pPB1850-1970은 pPB 1850-2360의 BglII-HindIII 단편을 BglII-HindIII로 잘린 pET23b 벡터에 클로닝 함으로써 제작하였다. pPB1850-2070은 pPB1850-2360의 BglII-PvuII 단편을 BglII/HincII로 절단된 pEG236 벡터에 클로닝함으로써 제작하였다. pPB1750-1970(c)는 클로닝 동안에 벡터의 HindIII 자리가 다시 생겨나는 (Pfu 폴리머라제의 터미널 트랜스퍼라제 작용으로 증폭된 PCR 생성물에 A 잔기를 첨가함으로써) pPB1750-2360의 내부 HindIII 단편을 제거함으로써 제작하였다. pPB1750-1970(n)은 pPB1750-2360의 NdeI-HindIII 단편을 NdeI-HindIII으로 절단한 pETHisb 벡터에 삽입함으로써 제작하였다. 모든 구성체는 제한 절단으로 확인하였다.
독소 B의 10-470 아미노산 사이의 발현을 조절하는 발현 구성체는 다음의 방법으로 pMalc 벡터에 제작하였다. pPB10-1530의 독소 B 유전자의 NheI(pET23 벡터 삽입체의 5' 부위)-AfiII(채워짐) 단편을 XbaI(NheI과 상용적임)/HindIII(채워짐) pMalc 벡터에 클로닝 시켰다. 구조물(pMB10-470)의 완결성은 제한 맵핑 및MBP 특이 DNA 프라이머(New England Biolabs)를 사용하여 5' 클론 연결 부위의 DNA 염기 서열 분석을 통해 검증하였다. 그러나, 발현된 모든 단백질은 MBP 단량체 분자량으로 분해되었다.
이 인터벌(아미노산 10-470)을 포함하는 두 번째 구성체는 P9(SEQ ID NO:15) 및 P10(SEQ ID NO:16) 프라이머 (도 18)을 포함하는 반응물의 PCR 증폭 생성물을 pETHisa 벡터에 클로닝함으로써 제작하였다. 이것은 EcoRI 평활 단편의 PCR 생성물을 EcoRI/HindIII로 절단한 벡터 DNA에 클로닝함으로써 가능하였다; 재조합 클론은 제한 맵핑으로 검증하였다. 이 구성체(pPB10-520)로부터 천연 융합 단백질이 발현 및 정제(N-말단 폴리히스티딘 친화성 표지)되고, 수율은 배양물 1 ℓ당 500 ㎍이하로 추정되었다.
두 개의 겹치는 클론의 인터벌 발현으로 이 인터벌(aa 10-520)로 부터 재조합 단백질을 높은 수율로 얻었다. 10-330 아미노산 사이는 인터벌은 pPB10-520의 BamHI-AflIII(채워짐) DNA 단편으로 pETHisa 및 pMalc 벡터에 클로닝하였다. 이단편은 BamHI-HindIII(채워짐)으로 절단된 pMalc 또는 BamHI-HincIII로 절단한 pETHisa 벡터에 클로닝 하였다. 재조합 클론은 제한 맵핑으로 검증하였다. 불용성(pET) 또는 용해성(pMal) 융합 단백질은 높은 농도로 얻었다. pMB10-330 구성체(도 18)로부터의 융합 단백질의 전제 수율은 배양물 1 ℓ당 20 ㎎이었고 이 융합 단백질의 10%가 전체 길이의 융합 단백질로 추정되었다. 이 인터벌은 pET 구성체로부터 발현될 때 수율이 높고 90% 이상이 전체 길이의 재조합 단백질이 생성되지만, 발현된 단백질은 용해성이고 따라서 천연 구조를 보다 쉽게 취할 수 있는pMal 융합체를 사용하였다.
P11(SEQ ID NO:17) 및 P10(SEQ ID NO:16) DNA 프라이머(도 18)가 포함된 PCR 반응물로부터 증폭된 DNA를 EcoRI-XbaI으로 절단하여 EcoRI-XbaI으로절단한 pMalc 벡터에 클로닝 함으로써 pMB260-520 클론을 제작하였다. 친화성에 근거하여 정제한 단백질의 수율은 10 ㎎/ℓ였는데, 정제 단백질의 약 50%가 전체 길이의 재조합 단백질로 추정되었다.
아미노산 510-1110 인터벌은 아래에서 설명하는 방법으로 발현시켰다. 이러한 완전한 인터벌은 pUCB10-1530의 NheI-HindIII 단편을 XbaI-HindIII로 자른 pMalc 벡터에 클로닝 함으로써 pMal 융합체로 발현시켰다. 이 구조물(pMB510-1110)의 완결성은 제한 맵핑 및 5' 클론의 연결 부위를 MBP 특이 DNA 프라이머를 사용하여 DNA 염기 서열을 분석으로 검증하였다. 친화성 정제한 단백질의 수율은 배양물 1 ℓ당 25 ㎎이었는데, 이들의 5%가 전체 길이의 융합 단백질(1 ㎎/ℓ)로 추정되었다.
보다 높은 수율로 얻기 위하여 이 부분을 pMalc 벡터에서 두 개의 단편(아미노산 510-820 및 820-1110)으로 나누어 발현시켰다. pMB510-820 클론은 pMB510-1110의 SacI(pMalc 폴리링커에서 삽입체의 5'쪽)-HpaI DNA 단편을 SacI/StuI으로 절단한 pMale 벡터에 삽입하여 제작하였다. pMB820-1110 벡터는 pUC10-1530의 HpaI-HindIII 단편을 BamHI(채워짐)-HindIII로 절단된 pMalc 벡터에 삽입함으로써 제작하였다. 이러한 제제의 완결성은 제한 맵핑 및 5' 클론의 연결 부위를 MBP 특이 DNA 프라이머를 사용하여 DNA 염기 서열 분석을 통해 검증하였다.
pMB510-820 벡터에서 발현되는 재조합 단백질은 상당히 불안정하다. 그러나 pMB820-1105 구조물로부터 전체 길이의 융합 단백질이 90%이상으로 높은 농도(20 ㎎/ℓ)로 얻을 수 있었다. 부분적으로 분해된 pMB510-1110 단백질(510-820 인터벌로 주로 이루어져있음)는 pMB820-1110 단백질과 함께 이 인터벌로 부터 사용할 만한 양의 재조합 항원을 제공한다.
아미노산 1100-1750 인터벌은 아래에 설명하는 방법에 따라 발현되었다. 전테 인터벌은 pPB10-1750의 AccI(채워짐)-SpeI 단편이 StuI/XbaI(XbaI은 SpeI과 상용성이고; StuI 및 채워진 AccI 자리는 모두 평활 말단이다)으로 절단한 pMalc에 삽입되어 있는 pMalc 벡터에서 발현시켰다. 이 구성체(pMB1100-1750)의 완결성은 제한 맵핑 및 클론의 연결 부위를 MBP 특이 프라이머를 사용한 DNA의 염기 서열 분석으로 검증하였다. 이 구성체를 포함한 세포로부터 친화성에 근거하여 단백질 15 ㎎/ℓ를 정제하였으나, 99% 이상의 단백질이 MBP 단량체 크기로 분해되었다. pMB1100-1750의 작은 인듀서는 pMB1100-1750을 AflII 및 SalI(pMalc 폴리링커의 삽입체 3' 쪽)으로 자른 후 돌출된 말단을 채우고 플라즈미드를 다시 리게이션시켜서 제작하였다. 생성된 클론은(제한 절단 및 DNA 염기 서열 분석으로 검증함) 1530-1750 사이가 소실되었고, pMB1100-1530으로 명명하였다. pMB1100-1530은 재조합 단백질을 40 ㎎/ℓ이상의 수율로 발현시켰는데, 이 재조합 단백질의 5%는 전체 길이의 융합 단백질로 추정되었다.
세가지의 구조물을 제작하여 나머지 인터벌을 발현시켰다. 먼저, pPB10-1750의 BspHI(채워짐)-SpeI 단편을 EcoRI(채워짐)/XbaI으로 절단한 pMalc 벡터에 클로닝 하였다. 이러한 구조cp(pMB1570-1750)의 완결성은 제한 맵핑 및 클론의 연결 부위를 MBP 특이 프라이머를 사용한 DNA의 염기 서열 분석으로 검증하였다. 이 플라즈미드로 부터의 재조합 단백질을 발현시키면 정제 단백질 1 ℓ당 약 3 ㎎으로 매우 낮은 농도로 생성되고 대부분이 MBP 단량체 크기로 분해되었다. 따라서, 이 부위는 PCR로 증폭된 DNA 단편으로부터 발현시켰다. 프라이머 P13 [SEQ ID NO:18; 증폭된 독소 B 서열의 5' 부위에 EcoRI 자리가 도입되도록 P13을 조작하였음] 및 P8 (SEQ ID NO:14)을 사용하고 씨. 다이피셀 게놈 DNA를 주형으로 하여 위에서 설명된 방법으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 단편은 EcoRI 및 SpeI으로 절단하고, EcoRI/XhaI로 절단한 pMalc 벡터에 클로닝 하였다. 생성된 클론(pMB1530-1750)은 제한 맵핑 분석으로 검증하고 재조합 단백질을 발현시켜 정제하였다. 수율은 배양물 1 ℓ당 단백질 20 ㎎ 이상이었고 이 단백질의 25% 이상이 전체 길이의 융합 단백질로 추정되었다. 이것은 천연 pMB1570-1750 클론에서 보다 상당히 높은 수율이었다. pMB1530-1750의 삽입체(EcoRI-SalI 단편내에 존재)를 pETHisa 벡터(EcoRI/XhoI으로 절단되었음. XhoI 및 SalI 단편의 말단은 상용성이다)로 옮겼다. 이 구성체에서 융합 단백질이 발현하도록 유발된 세포의 용해성 용해물로부터 탐지할 만큼의 융합 단백질은 Ni-킬레이트 칼럼으로 정제되지 않았다.
| 클론 | 친화성 표지 | 수율(㎎/ℓ) | 전체 길이% |
| pPB10-1750 | 없음 | 낮음(웨스턴 블롯 하이브리다이제이션으로부터 추정함) | ? |
| pPB10-1530 | 없음 | 낮음(위와 같음) | ? |
| pMB10-470 | MBP | 15 ㎎/ℓ | 0% |
| pPB10-520 | 폴리-히스 | 0.5 ㎎/ℓ | 20% |
| pPB10-330 | 폴리-히스 | >20 ㎎/ℓ(불용성) | 90% |
| pMB10-330 | MBP | 20 ㎎/ℓ | 10% |
| pMB260-520 | MBP | 10 ㎎/ℓ | 50% |
| pMB510-1110 | MBP | 25 ㎎/ℓ | 5% |
| pMB510-820 | MBP | 붕괴됨(웨스턴 블롯 하이브리다이제이션으로부터 추정함) | |
| pMB820-1110 | MBP | 20 ㎎/ℓ | 90% |
| pMB1100-1750 | MBP | 15 ㎎/ℓ | 0% |
| pMB1100-1530 | MBP | 40 ㎎/ℓ | 5% |
| pMB1530-1750 | MBP | 3 ㎎/ℓ | <5% |
| pMB1530-1750 | 폴리-히스 | 정제된 단백질이 감지되지 않음 | ? |
| pMB1530-1750 | MBP | 20 ㎎/ℓ | 25% |
| pMBp1750-2360 | MBP | >20 ㎎/ℓ | >90% |
| pMBp1750-2360 | MBP | 6.5 ㎎/ℓ(분비됨) | 50% |
| pMB1750-2360 | 폴리-히스 | >20 ㎎/ℓ | >90% |
| pMB1950-1790 | MBP | >20 ㎎/ℓ | >90% |
| pMB1970-2360 | MBP | 40 ㎎/ℓ | >90% |
| pMBp1970-2360 | MBP | (분비되지 않음) | NA |
| pMB1850-2360 | MBP | 20 ㎎/ℓ | >90% |
| pPB1850-2360 | 폴리-히스 | 15 ㎎/ℓ | >90% |
| pMB1850-1970 | MBP | 70 ㎎/ℓ | >90% |
| pPB1850-1970 | 폴리-히스 | >10 ㎎/ℓ(불용성) | >90% |
| pPB1850-2070 | 폴리-히스 | >10 ㎎/ℓ(불용성) | >90% |
| pPB1750-1970(c) | 폴리-히스 | >10 ㎎/ℓ(불용성) | >90% |
| pPB1750-1970(n) | 폴리-히스 | >10 ㎎/ℓ(불용성) | >90% |
| a 이탤릭체의 클론은 선택된 인터벌로 각각으로부터 재조합 단백질을 정제하는데 널리 사용되는 클론이다. | |||
실시예 19
재조합 씨. 다이피셀 독소 B 단백질에 대한 중화 항체의 동정, 정제 및 유발
재조합 독소 B 폴리펩티드 단편이 중화 항체를 생성시킬 수 있는지 알아보기 위하여, 전형적으로 먼저 동물을 재조합 단백질로 면역 시켜 항-재조합 단백질항체를 생성시켰다. 이러한 항-재조합 단백질 항체의 생체내 및 생체외에서의 중화력을 시험하였다. 재조합 폴리펩티드의 면역원의 성질에 따라 다르겠으나, 이 단백질에 대한 항체의 높은 농도로의 생성은 수 개월이 지나서 가능하다. 이 기작의 촉진시키고 중화 항체를 생성시키기에 가장 적합한 재조합 단백질을 선택하기 위하여 소모 연구를 행하였다. 특히, 재조합 독소 B 폴리펩티드는 CTB 항체 제제의 방어성 항체와 결합할 수 있는 능력이 있는지에 대한 시험으로 전단계 스크리닝을 한 후, 중화력 있는 항체를 소모시켰다. 이러한 재조합 폴리펩티드는 CTB와 결합하는 것으로 발견되었고, 중화 항체를 생성시키는데에 사용되었다. 이 실시예는 a) 중화 항체가 결합하는 독소 B내의 재조합 아영역; b) 생체내에서 독소 B를 중화하는, 독소 B 아영역 특이 항체의 동정; 및 c) 재조합 독소 B 폴리펩티드에 반응하는 항체의 생성 및 평가가 포함된다.
a) 중화 항체가 결합하는 독소 B내의 재조합 아영역의 동정
재조합 독소 B 단백질을 사용하여 천연 씨. 다이피셀 독소 B에 대한 항체의 폴리클론성 풀에서 방어성 항체를 소모시킴으로써 중화 항체가 결합하는 독소 B내에서의 아영역을 동정하였다. 단백질 제제의 중화 항체에 결합하는 능력을 평가하기 위하여 생체내 분석을 하였다. 재조합 단백질은 먼저 독소 B(CTB 항체: 실시예 8을 참조)에 의하여 조절되는 항체와 혼합하고 37 ℃에서 1 시간 동안 반응 시켰다. 이어서, 씨 다이피셀 독소 B(CTB: 테크 랩)을 햄스터의 치사량의 농도로 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 더 반응시켰다. 인큐베이션 후에 이 혼합물을 복강내(IP)를 통하여 햄스터에 주사하였다. 재조합 폴리펩티드가 중화 에피토프를 포함한다면, CTB 항체는 CTB로 인해 햄스터가 죽는 것을 방어하는 능력을 잃게 될 것이다. CTB 항체-재조합 혼합물로 부분적 또는 완전한 방어가 가능하다면 이 재조합체는 약하거나 중화시키지 않는 독소 B의 에피토프만을 포함한다. 이 분석은 다음과 같이 행하였다.
실시예 8에서 설명한 방법에 따라, 레그혼 암탉이 낳은 알에 CTB에 대한 항체를 생성시켰다. 40 g짜리 암컷 골든 시리안 햄스터(Charles River)에 복강으로 투여할 때의 씨. 다이피셀 독소 B의 치사량(LD100)은 2.5 내지 5 ㎍으로 측정되었다. CTB에 대하여 생성되고 PEG 침강법에 의하여 정제된 항체는 위에서 측정된 I.P. 용량으로 햄스터를 완전하게 방어할 수 있었다. 햄스터에 복강을 통하여(I.P) 주사할 때에 CTB 5 ㎍에 대하여 양호하게 방어할 수 있는 CTB 항체의 최소량도 결정하였다(1 X PEG 제제) 이러한 실험을 통하여 주어진 재조합 단백질이 방어 CTB 항체를 소모시킬 수 있는지를 시험하는데 필요한 변수를 결정하였다.
클로닝된 부분에 전체 독소 B 유전자를 포함하는 중화력이 있는지 시험하였고 이들은 인터벌(INT) 1 내지 5(도 19를 참조)로 디자인 하였다. 각각의 재조합 폴리펩티드의 거의 등가의 최종 농도를 시험하였다. 재조합 폴리펩티드로는 1) 인터벌 1 내지 2(INT-1,2)의 혼합물; 2) 인터벌 4 내지 5 (INT-4,5)의 혼합물 및 3) 인터벌 3(INT-3)을 사용하였다. 먼저, 재조합 단백질(각각 약 1 ㎎의 전제 단백질)을 최종 농도 1 X(즉, 실시예 1(c)에서 설명한 방법에 다른 천연 노른자 용적에 녹아 있는 침강물)의 CTB 항체와 함께 최종 용적 5 ㎖에서 37 ℃에서 1 시간 동안 예비 인큐베이션하였다. 5 마리의 햄스터를 죽이기에 충분한 CTB(5 ㎍/㎖의 농도로) 25 ㎍를 첨가하고 이 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 처리 군의 40 g짜리의 암컷 햄스터(Charles River) 5 마리에 27 가우지 침이 달린 투베르쿨린 주사를 사용하여 I.P.로 혼합물 1 ㎖씩 투여하였다. 이 실험의 결과는 표 24에 나타내었다.
| 처리군1 | 생존 동물 수 | 치사 동물 수 |
| CTB 항체 | 3 | 2 |
| CTB 항체 + INT1.2 | 3 | 2 |
| CTB 항체 + INT4.5 | 3 | 2 |
| CTB 항체 + INT3 | 0 | 5 |
| 1 씨. 다이피셀 독소 B(CTB)를 각 군에 첨가하였다. | ||
표 24에서 알 수 있듯이, INT-1,2 또는 INT-4, 5의 재조합 단백질을 첨가하는 것은 CTB 항체 제제 단독일 때와 비교해서 생체내에서의 CTB 항체 제제의 방어력에 영향을 미치지 않았다. 이와는 대조적으로, INT-3 재조합 폴리펩티드는 CTB 항체의 모든 독소 B 중화력을 제거할 수 있는데, 이는 그 군의 모든 햄스터의 치사를 통해서 알 수 있다.
INT-3 영역을 형성하는 두 개의 발현 소단편 (pMB1750-1970 및 pMB1970-2360, 도 19를 참조)을 사용하여 이 영역을 더 작은 중화 에피토프로 나눌 수 있는지 알아보기 위하여 위의 실험을 반복하였다. 또한, 니켈로 표지된 단백질(pPB1750-2360)로 발현되는 전체 길이의 INT-3 폴리펩티드의 중화력을 시험하였고 원래의 INT-3 가 발현하는 MBP 융합체(pMB1750-2360)와 비교하였다. 결과는 표 25에 나타내었다.
| 처리군1 | 생존 동물 수 | 치사 동물 수 |
| CTB 항체 | 5 | 0 |
| CTB 항체 + pPB1750-2360 | 0 | 5 |
| CTB 항체 + pMB1750-2360 | 0 | 5 |
| CTB 항체 + pMB1970-2360 | 3 | 2 |
| CTB 항체 + pMB1750-1970 | 2 | 3 |
| 1 씨. 다이피셀 독소 B(CTB)를 각 군에 첨가하였다. | ||
표 25에 정리된 결과는, INT-3 영역 내의 작은 폴리펩티드인 pMB1750-1970 및 pMB1750-1970은 중화 항체에 대한 결합력을 부분적으로 상실하고 CTB 항체 풀로부터 중화 항체를 제거함을 나타낸다. 이러한 결과를 통하여 중화 항체의 CTB 항체 풀을 완전히 소모시키는 데에는 전체 길이의 INT-3 폴리펩티드가 요구된다는 것을 나타낸다. 이 실험은 INT-3의 중화 에피토프가 다른 벡터 시스템에서도 발현될 수 있고 그 결과는 사용하는 벡터 또는 사용하는 융합 상대와는 무관함을 보여준다.
이어서, 위에서 설명한 방법에 따라 다른 인터벌 3 특이 단백질이 CTB 항체 풀 내에서 중화 항체를 제거하는 능력을 시험하였다. 이 연구에 사용된 인터벌 3 특이 단백질은 도 23에 요약하였다. 도 23에는 다음과 같은 약어를 사용하였다. pP는 pET23 벡터를 나타내고; pM은 pMALc 벡터를 나타내고; B는 독소 B를 나타내고; 숫자는 클론에서 발현된 아미노산 인터벌을 나타낸다. 검은 타원은 MBP를 나타내고; 및 HHH는 폴리-히스티딘 표지를 나타낸다.
전체 독소 B 반복 서열 영역(pMB1750-2360, pPB1750-2360 및 pPB1850-2360)으로 이루어진 재조합 단백질만이 CTB 항체 풀에서 중화 항체와 결합하여 완전하게 제거할 수 있다. 독소 B 반복 서열의 일부분 만을 포함하는 재조합 단백질은 CTB 항체 풀에서 중화 항체를 완전히 제거하지 못한다(pMB1750-1970 및 pMB1970-2360은 부분적으로 중화 항체를 제거할 수 있으나, pMB1850-1970 및 pPB1850-2070은 CTB 항체 풀에서 중화 항체를 전혀 제거하지 못한다).
위의 결과는 독소 B 유전자의 완전한 리간드 결합 영역(반복 서열 부분)만이 CTB 항체 풀의 중화 항체와 결합하여 완전하게 제거할 수 있다. 이러한 결과는 전체 독소 B 반복 서열 부분에 의하여 조절되는 항체는 생체내 독소 중화에 필요하다는 것을 나타낸다 (도 23을 참고; pMB1750-2360, pPB1750-2360 및 pPB1850-2360 벡터에서 발현되는 재조합 단백질만이 CTB 항체 풀에서 중화 항체를 완전하게 제거할 수 있다).
이러한 결과는 독소 B의 전체 반복 서열이 독소 B를 중화할 수 있는 항체의 생성에 필수적이고 아영역은 중화 항체를 최대 농도로 생성시키는 데에는 불충함을 나타낸다.
b) 독소 B을 생체내에서 중화하는 독소 B 아영역 특이 항체의 동정
항-독소 B 반복 서열 항체가 중화에 충분한지 알아보기 위하여, CTB 항체 제제내에 있는 부위 특이 항체를 친화성에 근거하여 정제하여, 생체 중화를 시험하였다. 재조합 독소 B 반복 단백질을 포함하는 친화성 칼럼은 아래에서 설명하는 바와 같이 만들었다. 개별적인 친화성 칼럼은 pPB1750-2360, pPB1850-2360, pMB1750-1970 및 pMB1970-2360과 같은 재조합 독소 B 반복 단백질을 각각 사용하여 제작하였다.
각각의 친화성 칼럼을 만들기 위하여, PBS로 세척한 악티겔) 수지(스테로젠) 4 ㎖을 친화도로 분리한 재조합 단백질(먼저 PBS에 대하여 대량 투석됨) 5-10 ㎎과 함께 Ald-커플링 용액(1 M 시아노보로히드라이드 나트륨)을 최종 용적의 1/10만큼을 포함하는 15 ㎖ 짜리 튜브(Falcon)에서 실온에서 밤새도록 커플시켰다. 커플링 전후에, 커플링 반응의 상등액의 소량은 7.5% SDS-PAGE 겔에 건 다음, 쿠마시 염색을 통하여 분석하였다. 단백질 밴드의 강도에 근거하여, 30% 이상의 커플링 효율을 보이는 경우를 추정하였다. 수지를 10 ㎖용 칼럼에 부어 넣고(BioRad), PBS로 과량 세척한 후, 4 M 구아니딘-HCl (10 mM 트리스-HCl, pH 8.0)으로 먼저 용리 시킨 후에 PBS로 재평형을 유발하였다. 칼럼은 4 ℃에 보관하였다.
CTB IgY 폴리클론성 항체 제제(PEG 제제)의 일부는 다음에 설명하는 4 개의 각각의 칼럼에서 친화성 정제를 하였다. 칼럼을 UV 모니터(ISCO)에 연결하고, PBS로 세척한후 2 x PEG 제제(0.45 μ 짜리 필터로 필터 멸균한 것임) 40 ㎖을 로딩하였다. PBS로 칼럼을 세척하여 기준선 값에 다시 달하도록 하였다. 이 칼럼을 BBS트윈(BBStween)으로 세척하여 비특이적으로 결합된 항체를 용리하고 PBS로 재평형 시켰다. 결합된 항체는 4 M 구아니딘-HCl(10 mM 트리스-HCl, pH 8.0)로 칼럼으로부터 용리시켰다. 용리된 항체는 곧 100 배 이상의 PBS에 대하여 4 ℃에서 2 시간 동안 투석하였다. 적어도 2 회 갈아준 PBS에 대하여 시료를 과도하게 투석하고 친화성으로 분리한 항체를 모아서 4 ℃에서 보관하였다. 항체 제제는 UV 흡광도로 정량하였다. 용리된 용적은 4 내지 8 ㎖의 범위였다. 전체 단백질의 0.25-0.35%인 범위로 비슷한 전체 항체 농도를 포함하는 친화성 정제 저장물 모두를 칼럼에 로딩하였다.
위의 a)에서 요약한 분석을 통하여 친화성 정제 항체 제제의 독소 B의 생체내 중화력을 결정하였다. 친화성 정체 항체는 시험에 사용하기 전에 PBS로 1:1로 희석하였다. 결과는 표 26에 나타내었다.
| 처리군3 | 생존 동물 수b | 치사 동물 수b |
| 면역전1 | 0 | 5 |
| CTB1; 400 ㎍ | 5 | 0 |
| CTB(pPB1750-2360에 있는 AP):2 875 ㎍ | 5 | 0 |
| CTB(pMB1750-1970에 있는 AP):2 875 ㎍ | 5 | 0 |
| CTB(pMB1970-2360에 있는 AP):2 500 ㎍ | 5 | 5 |
| a 햄스터 치사량의 씨. 다이피셀 독소 B(CTB)(테크 랩; 5 ㎍/㎖의 농도로, 전체 25 ㎍)를 항체에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 이 혼합물을 햄스터에 복강내로(IP) 주사하였다. 항체와 혼합된 독소가 투여된 각각의 처리군은 지시 단백질에 대하여 1 4 x 항체 PEG 제제 또는 2 친화성 정제(AP) 항체(지시된 칼럼의 CTB PEG 조성물로부터)를 생성시켰다. 각 조성물의 특이 항체량을 표시하였다. 친화성 정제 제제의 경우에는 직접적으로 양을 측정하였고 4 x CTB의 경우에는 실시예 15에서 설명하는 방법에 따라 평가하였다.b 숫자는 독소/항체 혼합물을 IP 투여하였을 때 살거나 죽은 햄스터의 수를 나타낸다. | ||
면역전 대조군에 비교하였을 때 모든 군에서는 치사가 연기되는 것과 같이 독소 중화 정도가 비슷한 것으로 관찰되었다. 이 결과는 독소 B 유전자의 반복 서열 부분에 반응하는 항체는 생체내에서 독소 B를 중화하는데 충분하다는 것을 보여준다. 모든 군의 햄스터는 결국에는 치사되지만, 이 치사는 CTB PEG 제제 항체로 인하여 최대로 연기되었다. 따라서 친화성 정제(AP) 항체의 중화는 친화 크로마토그래피 이전의 CTB 제제에서 관찰되는 것 만큼 완전하지는 않다. 이 결과는 구아니딘 변성 동안(친화성 칼럼에서 항체를 용리하는 동안)의 활성의 소실 또는 독소 중화(CTB PEG 제제에 존재)에 기여할 수 있는 다른 부분의 독소 B 유전자에 특이적인 항체의 존재로 인한 것일 것이다.
겹치지 않는 pMB1750-1970 및 pMB1970-2360 단백질에 대한 친화성 정제 항체가 독소 B를 중화하는 것은 1) 반복 아영역에 특이한 항체는 독소 B를 중화하는데 충분하거나 2) 아영역 특이 단백질은 CTB 폴리클론성 풀에 존재하는 반복 서열에 특이한 항체 대부분 또는 모두와 결합할 수 있다는 가능성을 제시한다. 이러한 사실은, 다른 반복 서열 사이의 1 차 아미노산 서열의 유사성이 오직 25-75%의 범위임을 감안하면, 반복 서열 사이의 구조상 유사함에 기인한 것으로 보인다 [Eichel-Streiber, et al. (1992) Molec. Gen. Genetics 233:260]. 이러한 가능성은 친화성 크로마토그래피로 시험하였다.
이어서, pMB1750-1970 칼럼에서 CTB PEG 제제를 2 배로 소모시켰다. 두 번째 크로마토그래피를 한 후에 오직 작은 용리 피크만이 관찰되는 사실은 반응성 항체가 거의 제거되었다는 것을 나타낸다. 인터벌이 제거된 CTB 제제는 pPB1850-2360 칼럼으로 크로마토그래피를 하였는데, 칼럼에 결합하는 항체가 없었다. CTB 및 CTB(pMB1750-1970이 제거됨) 제제의 pPB1750-2360, pPB1850-2360, pMB1750-1970 및 pMB1970-2360 단백질에 대한 반응성은 실시예 13(c)에서 설명하는 프로토콜을 따라 ELSA를 통하여 결정하였다. 간단히 설명하자면, 96 개의 웰이 있는 마이크로타이터 플레이트(Falcon, Pro-Bind Assay Plate)을 티머로살 0.005% 포함하는 PBS에 용해된 1-2 ㎍/㎖의 단백질 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가함으로써 재조합 단백질로 입힌 후 4 ℃에 인큐베이션하였다. 다음날 아침에 코팅 현탁액을 버리고 웰을 PBS를 사용하여 3 회 세척하였다. 비특이적 결합 부위를 블로킹하기 위하여, PBS에 용해된 1.0%의 BSA 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 이 플레이트는 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 블로킹 용액을 버리고 희석된 항체 150 ㎕의 2 벌 시료를 희석 시리즈의 첫 번째 웰에 첨가하였다. 0.5%의 트윈 20을 포함하는 블로킹 용액의 첫 번째 시험용 혈청 희석 정도는 CTB 제제의 1/200(소모된 CTB의 농도는 OD280에 의하여 표준화되었다)이고 이어서 이 용액에서 5 배로 희석되었다. 이것은 120 ㎕의 완충액에 30 ㎕의 소량을 계속적으로 첨가하고 혼합한 후에 새 웰에 다시 희석하기를 반복하여 가능하다. 희석하기를 마친 후에 각각의 웰이 120 ㎕의 최종 용적 만큼을 포함하도록 30 ㎕씩 제거하였다. 모두 5 벌을 이와 같이 희석 하였다(전체 4 개의 웰) 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후에, 연속적으로 희석한 시료를 버리고 각 웰을 0.5%의 트윈20(PBST)를 포함하는 PBS로 3 회 세척하고 BBS-트윈으로 5 분간 2 회 세척하고 PBST를 사용하여 마지막으로 3 회 세척하였다. 각각의 웰에 1/1000로 희석한 2 차 항체 [0.5%의 트위20을 포함하는 블로킹 용액에 희석되어 있는 토끼 항-닭 IgG 알카리성 포스파타제(Sigma) 항체] 100 ㎕를 첨가하고 이 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합된 용액을 제거하고 플레이트를 PBST로 6 회 세척하고 50 mM Na2CO3, 10 mM MgCl2, pH 9.5로 1 회 세척하였다. 50 mM Na2CO3, 10 mM MgCl2, pH 9.5에 용해된 1 ㎎/㎖의 파라-니트로 페닐 포스페이트(Sigma)를 포함하는 용액 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 이 플레이트를 어두운 곳에서 5 내지 45 분동안 실온에서 인큐베이션하였다. 각 웰의 흡광도는 디나테크(Dynatch) MR 700 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 410 mM에서 측정하였다.
친화성 크로마토그래피에서 예측했던 바와 같이, pMB1750-1970 칼럼의 CTB 제제의 소모는 pMB1970-2360 단백질에 대한 탐지할 수 있는 모든 반응성을 제거하였다. pMB1750-1970 칼럼에서 크로마토그래피를 하였을 때 CTB 제제의 역상 정제에서 결합된 항체가 분리되지 않았다. 이러한 결과는 CTB 폴리클론성 풀의 반복 서열에 반응하는 모든 항체는 겹치지 않는 반복 서열에 나타나는 보존 구조를 인지함을 나타낸다. 이 보존 구조가 드문 직선상 보존 에피토프를 나타내는 것도 가능하지만, 중화 항체가 특이 단백질 구조를 인지한다는 것이 더 가능하게 보인다. 이 결과는 이러한 재조합 단백질에 대한 CTB 반응성의 웨스턴 블롯 하이브리다이제이션 분석의 결과로 뒷받침된다.
각각의 재조합 단백질의 일정량을 7.5% SDS-PAGE에 걸고 전기영동하여 만든 웨스턴 블롯에 CTB 폴리클론성 항체 제제를 프로브로 사용하였다. 이 블롯은 실시예 3에서 설명하는 바에 따라 준비하고 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. 결과는 도 24에 나타내었다.
도 24는 천연 또는 재조합 독소 B 항원에 대하여 생성된 IgY 항체의 면역반응을 비교하여 나타낸 것이다. 동량의 pMB1750-1970(제 1 레인), pMB1970-2360(제 2 레인), pPB1850-2360(제 3 레인) 및 연속적으로 희석한 pPB1750-2360(각각 I x, 1/10 x, 1/100 x를 포함하는 제 4 내지 6 레인)을 7.5% SDS-PAGE 겔에 두 벌씩 걸어서 분석하였다. 이 겔을 막에다 블롯팅하여 천연 CTB 또는 pPB1750-2360 단백질로 면역시킨 닭으로부터 생성된 PEG로 제조한 Ig Y 항체로 각각의 반을 하이브리다이제이션 시켰다. 전체 길이의 pMB1750-1970 단백질은 재조합 단백질(화살표)에 반응하는 항체에 의하여서만 동정된다.
CTB 제제는 pPB1750-2360, pPB1850-2360, 및 pMB1970-2360 단백질과 반응하나, pMB1750-1970 단백질에 대하여는 활성을 보이지 않았다(도 24). 친화성 크로마토그래피 동안에 반복 서열에 반응하는 모든 항체가 이 단백질과 결합한다면, 이 결과는 이 단백질은 웨스턴 블롯 시에 적당하게 폴딩되지 못했다는 것을 나타낸다. 이것은 모든 항체의 반응성을 제거하므로 CTB 제제에서 반복 서열 반응성 항체가 직선상의 에피토프를 인지한다는 것은 가능성있게 보이지 않는다. 이러한 사실은 방어성 항체를 유발하기 위하여, 재조합 독소 B 단백질이 적당하게 폴드되어야할 필요가 있을 것임을 나타내는 것으로 보인다.
c) 재조합 독소 B 폴리펩티드에 반응하는 항체의 생성 및 분석
i) 재조합 독소 B 단백질에 반응하는 항체의 생성
실시예 13에서 설명하는 방법에 따라 레그혼 암탉이 낳은 달걀에서 재조합 단백질에 대한 항체를 형성시켰다. 1) 인터벌 1+2 단백질의 혼합물(도 18을 참조); 2) 인터벌 4 내지 5 단백질의 혼합물(도 18을 참조); 3) pMB1970-2360 단백질; 4) pPB1750-2360 단백질; 4) pPB1750-2360 단백질; 5) pMB1750-2360; 6) pMB1750-2360 [타이터맥스(Titermax) 보조제 (Vaxcell)]; 7) pMB1750-2360 [게르부(Gerbu) 보조제(Biotech)]; 8) pMBp1750-2360 단백질; 9) pPB1850-2360; 10) pMB1850-2360 같은 재조합 단백질에 대한 항체를 생성시켰다.
폴리클론성 PEG 제제의 ELISA 활성[플레이트가 pPB1750-2360 단백질로 코팅된 것만을 제외하고 b)에서 설명된 프로토콜에 따라]이 CTB 폴리클론성 항체 PEG 제제의 활성과 적어도 동등하여질 때까지 재조합 단백질을 적어도 3 회 닭에 투여하였다. 위의 모든 면역원의 PEG 제제의 ELISA 역가를 측정하였고 그 역가는 1:12500 내지 1:62500의 범위에 상당하는 것으로 발견하였다. 타이터맥스 보조제를 사용하여도 높은 역가를 보이지 않는 pMB1750-2360의 경우를 제외한 모든 경우에서 높은 역가가 관찰되었고 이들의 제제를 시험하였다.
ii) 재조합 단백질에 반응하는 항체의 웨스턴 블롯 하이브리다이제이션에 의한 분석
일정량의 재조합 단백질(pMB1750-1970, pPB1850-2360, 및 pMB1970-2360 단백질 및 pPB1750-2360의 반응 정량용 연속 희석액)을 7.5% SDS-PAGE 겔에 걸어 전기영동한 웨스턴 블롯에 CTB, pPB1750-2360, pMB1750-2360 및 pMB1970-2360 폴리클론성 항체 제제 [프로인트(Freund)의 보조제]을 사용하여 면역시킨 닭에서 분리하였음)을 프로브로 사용하였다. 블롯은 b)에서 설명하는 방법에 따라 알카리성 포스파타제로 준비하고 처리하였다.
도 24에서 알 수 있듯이, CTB 및 pMB1970-2360 제제는 pPB1750-2360, pPB1850-2360, 및 pMB 1970-2360 단백질과 강하게 반응하는 반면에, pPB1750-2360 및 pMB1970-2360(Gerbu) 제제는 4 개의 모든 단백질과 강하게 반응하였다. pPB1750-2360 및 pMB1970-2360(Gerbu) 제제의 웨스턴 블롯 반응도는 CTB 제제의 웨스턴 블롯 반응에 상당하였으나, pMB1970-2360 제제의 활성은 CTB 제제의 <10%의 활성을 보였다. 동일한 ELISA 반응성에도 불구하고 pMB1750-2360 제제로 면역시킨 서로 다른 두 개의 군 및 프로인트 보조제를 사용하여 pMB1750-2360 제제를 면역시킨 한 개의 군에서 분리한 PEG 제제는 재조합 단백질에 대하여 약한 반응성(약 1%)만을 보였다.
친화성 정제 및 웨스턴 블롯 분석에 의한 면역 반응의 차이가 항체 역가의 차이를 나타내는지 알아보았다. pMB1750-2360 또는 pMB1970-2360 단백질로 면역시킨 닭으로부터 분리한 2 x PEG 제제 50 ㎖을 pPB1750-2360 친화성 칼럼에서 b)에서 설명한 방법에 따라 크로마토그래피를 하였다. 친화성 정제한 항체의 수율은 b)의 CTB PEG 제제로부터 분리하였을 때의 수율에 상당하였다. 따라서 웨스턴 반응성은 항체 풀에서 양의 차이가 아닌, 질의 차이를 보여준다. 이러한 결과는 임의의 재조합 단백질은 친화성이 높은 항체를 생성시키는데 더 효과적임을 나타낸다(웨스턴 블롯 하이브리다이제이션을 통하여 분석하였을 때).
iii) 재조합 단백질에 반응하는 항체로 독소 B의 생체내 중화
재조합 독소 B 단백질에 의하여 생성된 항체의 중화력을 특정하기 위하여 햄스터의 생체 모델 [실시예 9 및 14(b)에서 설명되었음)을 사용하였다. 세가지 실험의 결과를 표 27-29에 나타내었다.
각각의 면역원의 독소 B를 생체내에서의 중화력을 조사하였고 표 30에 나타내었다. 재조합 단백질 CTB 전혼합체 연구에서 예측된 바와 같이(표 24), 독소 B의 다른 부위(즉, 인터벌 1-5)가 아닌, 인터벌 3(1750-2366)에 대한 항체만이 방어능이 있다. 예기치 않게도, pMAL 벡터에서 발현되는 INT-3 부위에 대하여 프로인트 보조제를 사용하여 생성시킨 항체는 중화력이 없다. pMB1750-2360으로의 서로 다른 하나의 면역법 및 pMpB1750-2360으로의 하나의 면역법은 중화력을 나타내지 않으므로 이러한 현상은 재현될 수 있다. pMB1750-2360 PEG 제제로부터 친화성 분리한 5 x 양의 독소 B 반복 서열 특이 항체는 독소 B를 중화할 수 없다는 사실은 친화성 분리한 I x 양의 CTB에 대한 항체는 서로 다른 CTB 항체의 독소 B 중화력은 이러한 항체 제제의 양적 차이라기보다 질적 차이에 기인한다는 것을 의미한다. 이 부위가 다른 벡터(pPB1750-2360)에서 발현되거나 pMB1750-2360과 함께 다른 보조제가 사용될 때 중화 항체가 생성된다. 중요하게는, 재조합 pPB1750-2360보다 작은 100 개의 아미노산 만으로 이루어진 단편을 포함하는 pPB1850-2360에 프로인트 보조제를 사용하여 생성된 항체는 독소 B를 생체내에서 중화시킬 수 없다(표 27); pPB1850-2360 및 pPB1750-2360에 모두 동일한 벡터가 사용되었다는 것에 또한 주목하라.
| 처리군a | 생존 동물 수b | 치사 동물 수b |
| 면역전 | 0 | 5 |
| CTB | 5 | 0 |
| INT1+2 | 0 | 5 |
| INT4+5 | 0 | 5 |
| pMB1750-2360 | 0 | 5 |
| pMB1970-2360 | 0 | 5 |
| pPB1750-2360 | 5 | 0 |
| a 햄스터 치사량의 씨. 다이피셀 독소 B(CTB)(테크 랩; 5 ㎍/㎖의 농도로, 전체 25 ㎍)를 항체에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 이 혼합물을 햄스터에 복강내로(IP) 주사하였다. 항체와 혼합된 독소가 투여된 각각의 처리군은 지시 단백질에 대하여 4 x 항체 PEG 제제를 생성시켰다. b 숫자는 독소/항체 혼합물을 IP 투여하였을 때 생존 또는 치사 햄스터의 수를 나타낸다. | ||
| 처리군a | 생존 동물 수b | 치사 동물 수b |
| 면역전(1) | 0 | 5 |
| CTB(1) | 5 | 0 |
| pPB1750-2360(1) | 5 | 0 |
| 항-pMB1750-2360(2) 1.5 ㎎ | 1 | 4 |
| 항 pMB1970-2360(2) 1.5 ㎎ | 0 | 5 |
| 항 CTB(2) 300 ㎍ | 5 | 0 |
| a 햄스터 치사량의 씨. 다이피셀 독소 B(CTB)(테크 랩; 5 ㎍/㎖의 농도로, 전제 25 ㎍)를 항체에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 이 혼합물 1 ㎖을 햄스터에 복강내(IP)로 주사하였다. 항체와 혼합된 독소가 투여된 각각의 처리군은 지시 단백질에 대하여 (1) 4 x 항체 PEG 제제 또는 (2) 친화성 정제(AP) 항체(pPB1750-2360 수지에서)를 1.5 ㎎씩 (항-pMB1750-2360 및 항-pMB1750-2360; 희석하지 않은 친화성 정제 항체를 사용하였음) 또는 350 ㎍씩(항-CTP, 반복 서열에 특이; 1/5로 희석한 항-CTB 항체를 사용하였음) 생성되었다. b 숫자는 독소/항체 혼합물을 IP 투여하였을 때 생존 또는 치사 햄스터의 수를 나타낸다. | ||
| 처리군a | 생존 동물 수b | 치사 동물 수b |
| 면역전 | 0 | 5 |
| CTB | 5 | 0 |
| pMB1970-2360 | 0 | 5 |
| pMB1850-2360 | 0 | 5 |
| pMB1850-2360 | 0 | 5 |
| pMB1750-2360(게르부 보조제) | 5 | 0 |
| a 햄스터 치사량의 씨. 다이피셀 독소 B(CTB)(테크 랩)를 항체에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 이 혼합물을 햄스터에 복강내(IP)로 주사하였다. 항체와 혼합된 독소가 투여된 각각의 처리군은 지시 단백질에 대하여 4 x 항체 PEG 제제가 생성되었다. b 숫자는 독소/항체 혼합물을 IP 투여하고 2 시간 후에 생존 또는 치사 햄스터의 수를 나타낸다. | ||
| 면역원 | 보조제 | 시험 조성물a | AP에 사용되는 항원 | 생체내 중화b |
| 면역전 | NA1 | PEG | NA | 안됨 |
| CTB(천연) | 타이터맥스 | PEG | NA | 됨 |
| CTB(천연) | 타이터맥스 | AP | pPB1750-2360 | 됨 |
| CTB(천연) | 타이터맥스 | AP | pPB1850-2360 | 됨 |
| CTB(천연) | 타이터맥스 | AP | pPB1750-1970 | 됨 |
| CTB(천연) | 타이터맥스 | AP | pPB1970-1970 | 됨 |
| pMB1750-2360 | 프로인트 | PEG | pPB1970-2360 | 안됨 |
| pMB1750-2360 | 프로인트 | AP | NA | 안됨 |
| pMB1750-2360 | 게르부 | PEG | pPB1750-2360 | 됨 |
| pMB1970-2360 | 프로인트 | PEG | NA | 안됨 |
| pMB1970-2360 | 프로인트 | AP | NA | 안됨 |
| pMB1750-2360 | 프로인트 | PEG | pPB1750-2360 | 됨 |
| pPB1850-2360 | 프로인트 | PEG | NA | 안됨 |
| pMB1850-2360 | 프로인트 | PEG | NA | 안됨 |
| INT 1+2 | 프로인트 | PEG | NA | 안됨 |
| INT 4+5 | 프로인트 | PEG | NA | 안됨 |
| a PEG 제제(PEG) 또는 친화성 정제 항체(AP)b 혼합물을 투여한지 2 시간 후에, '됨'은 완전한 중화(0/5 치사)를 의미하고 '안됨'은 독소 B가 중화되지 않음(5/5 치사)을 나타낸다.1 'NA'는 해당되지 않음을 의미한다. | ||||
pPB1750-2360 항체 풀은 친화성 정제 CTB 항체로 얻을 수 있는 것에 상당하는 중요한 생체 방어를 부여하였다. 이것은 웨스턴 블롯 분석(도 24)으로 분석하였을 때 이 항체 풀(pMB1750-2360 또는 pMB1970-2360 풀과 관련있음)에서 관찰되는 높은 친화도와 관련된다. 이러한 결과는 먼저 생체내 중화 항체는 재조합 독소 B 단백질을 면역원으로 사용하여 유발시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
게르부 보조제 및 pMB1750-2360 단백질은 중화 반응을 일으키나, pMB1750-2360 단백질에 대하여 생성된 높은 농도의 항체는 중화시키지 못하는 것은 이 단백질의 구조 또는 존재가 중화 항체를 유발시키는데에 필요하다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 천연 CTB를 항원으로 사용할 때 생성되는 중화 항체는 구조적인 에피토프 [섹션 b)를 참조]를 인지한다는 사실과 일치한다. 이것은 먼저 재조합 독소 B 단백질의 구조 및 존재가 높은 농도의 중화 항체를 생성시키는 데에 필수적임을 나타낸다.
실시예 20
pMB1750-2360, pMB1750-2360(게르부) 또는 pPB1750-2360 IgY 폴리클론성 항체 제제의 양적 및 질적인 차잇점의 측정
실시예 19에서, 독소 B 중화 항체는 특이 재조합 독소 B 단백질(pPB1750-2360) 또는 특이 보조제를 사용하여 생성시킬 수 있음을 보였다. 프로인트 보조제가 아닌 게르부 보조제와 함께 재조합 단백질이 암탉을 면역시키는 데 사용될 경우에 pMB1750-2360에 대하여 생성된 항체는 장독소 효과를 중화시킬 수 있다. 중화 및 비중화 PEG 제제에 존재하는 독소 B 특이 항체를 친화성 크로마토그래피로 분리하고 질적인 또는 양적인 차이를 시험하여 이들 항원 및 보조제 제한 사항의 원리를 알아보았다. 이 실시예는 a) pMB1750-2360 및 pPB1750-2360 PEG 제제에서 항-독소 B 특이 항체의 분리 및 b) 친화성 정제 항체를 사용한 독소 B의 생체내 중화를 포함한다.
a) pMB1750-2360 및 pPB1750-2360 PEG 제제로부터 특이 항체의 분리
pPB1750-2360(프로인트 및 게르부) 및 pPB1750-2360 PEG 제제에 존재하는 특이 항체를 분리하고 이들의 농도(전제 항체에 대한 백분율로 표시)를 결정하기 위하여, 이 항체 제제의 일정량을 전체 독소 B 반복 서열 부위(pPB1750-2360)을 포함하는 친화성 칼럼에 크로마토그래피를 하였다. 친화성 정제한 항체를 정량하였다.
재조합 독소 B 반복 단백질인 pPB1750-2360을 포함하는 친화성 칼럼은 다음의 방법으로 제작하였다. 알드커플링 용액(1 M 시아노보로하이드라이드 나트륨)을 최종 용적의 1/10 만큼 포함하는 15 ㎖짜리 튜브(Falcon)에서 PBS로 세척한 악티겔 (Actigel) 수지(Sterogene) 4 ㎖을 pPB1750-2360 친화성 정제 단백질 5 ㎎과 커플링시켰다. 커플링 전후에 커플링 반응물의 상등액의 소량을 7.5% SDS-PAGE 겔에 건 후 쿠마시 염색으로 분석하였다. 단백질 밴드의 강도를 근거로하여, 재조합 단백질의 95% 이상을 수지에 커플링시켰다. 커플링이 된 수지를 10 ㎖ 짜리 칼럼(BioRad)에 부어 넣고, PBS로 과량 세척한 후, 4M 구아니딘-HCl(10 mM 트리스-HCl, pH 8.0; 0.005% 티머로살에 용해되어있음)으로 예비 용리시키고, PBS로 재 평형을 유발한 후 4 ℃에 보관하였다.
pMB1750-2360, pMB1750-2360(게르부) 또는 pPB1750-2360 IgY 폴리클론성 항체 제제(PEG 제제)의 소량을 위에서 설명한 칼럼에 다음의 방법으로 친화성 정제를 하였다. 칼럼을 UV 모니터(ISCO)에 연결하고, PBS로 세척하였다. 2 x PEG 제제(0.45 μ짜리 필터로 필터 멸균하였고 크로마토그래피하기 전에 OD280으로 정량하였음) 4 ㎖을 걸었다. 기준선이 다시 결정될 때까지 칼럼을 PBS로 세척(칼럼 유속은 일정하게 하였음)하고, BBS트윈으로 세척하여 비특이 결합 항체를 용리하고 PBS로 재평형시켰다. 결합된 항체는 4 M 구아니딘-HCl(10 mM 트리스-HCl, pH 8.0; 0.005% 티머로살에 용해되어있음)으로 용리시키고, 전체 용리 피크는 15 ㎖짜리 튜브(Falcon)에 모았다. 칼럼을 재평형시킨 후, 위에서 설명된 바에 따라 칼럼에서 용리된 물질을 크로마토그래피를 다시 하였다. 항체 제제는 UV 흡광도(용리 완충액은 분광계에서 0으로 하였음) 정량하였다. 크로마토그래피로 처음 통과시킬때에 두 번째 통과에 비교하여 약 10 배로 높은 농도로 전체 정제 항체를 얻었다. 두 번째 크로마토그래피에서의 낮은 수율은 대부분의 특이 항체가 첫 번째로 행하여진 크로마토그래피에 의하여 제거되었음을 의미한다.
pMB1750-2360, pMB1750-2360(게르부) 또는 pPB1750-2360 IgY 폴리클론성 항체 제제(PEG 제제)의 첫 번째 그로마토그래피시에 칼럼으로부터의 용리물을 투석하여 친화성 정제 특이 항체 풀을 조성하였다. 용리물을 얼음에서 수집하고, 곧 100 배 용적의 PBS에 대하여 4 ℃에서 2 시간 동안 투석하였다. 이 시료는 65 배 용적의 PBS를 3 회 갈아주며 4 ℃에서 투석하였다. PBS를 갈아줄 때마다 적어도 8 시간동안 투석하였다. 투석한 시료를 모아 원심분리하여 불용성 파편을 제거한 후, OD280에서 정량하고 4 ℃에서 보관하였다.
각각의 제제에 존재하는 독소 B 반복 서열 특이 항체의 백분율은 첫 번째 칼럼 통과(전체 단백질을 첫 번째 칼럼에 로딩한 후에 얻은 특이 항체의 량)의 수율을 통하여 결정하였다. 반복 서열 특이 친화성 정제 항체의 수율(제제에 존재하는 전체 단백질에 대한 백분율로 표시)은 1) pMB1750-2360 PEG 제제는 약 0.5%, 2) pMB1750-2360(게르부) 제제는 약 2.3%, 및 3) pPB1750-2360 제제는 약 0.4%이었다. 동일한 칼럼으로의 CTB IgY 폴리클론성 항체 제제를 분리하였을 때 CTB 제제에 존재하는 독소 B 반복 서열 특이 항체의 농도는 0.35%이었다.
이러한 결과는 1) 게르부 보조제의 사용은 프로인트 보조제로 면역시켰을 때와 비교하였을 때 pMB1750-2360 단백질에 대하여 생성된 특이 항체의 농도를 5 배 증가시키고, 2) 실시예 19에서 볼수 있는 pMB1750-2360(비중화) 및 pPB1750-2360(중화) 및 CTB(중화) PEG 제제의 생체내 중화력의 차잇점은, 반복 서열 특이 항체의 농도는 다른 세가지 제제에서 서로 유사하므로, 세가지 제제내에 존재하는 반복 서열 특이 항체 농도의 차이 때문은 아니다. 따라서 세가지 항체 조성물의 독소 B 중화력의 차이는 유발된 독소 B 반복 서열 특이 항체의 양적인 차이를 나타냈다. 다른 제제에서 분리한 동일한 량의 친화성 정제 항-독소 B 반복 서열(독소 B의 1870-2360 아미노산) 항체를 아래에 설명된 방법에 따라 생체 햄스터 모델에 투여하여 다른 재조합 단백질 및(또는) 다른 보조제로 암탉을 면역시켜 생성시킨 항체간의 양적인 차이를 확인하였다.
b) 친화성 정제 항체를 사용하여 독소 B의 생체내 중화
위(a)에서 정제한 재조합 독소 B 단백질에 대하여 생성된 친화성 정제 항체의 중화력을 측정하고자 생체 햄스터 모델을 사용하였다. 또한, pPB1750-2360 항원과 프로인트 보조제를 사용하여 두 번째 서로 다른 면역법으로부터 분리한 4 x IgY PEG 제제는 이들의 생체내 중화력을 시험하였다. 그 결과는 표 31에 나타내었다.
| 처리군3 | 생존 동물 수b | 치사 동물 수b |
| 면역전1 | 0 | 5 |
| CTB (300 μg)2 | 5 | 0 |
| CTB (100 μg)2 | 1 | 4 |
| pMB1750-2360 (G) (5 mg)2 | 5 | 0 |
| pMB1750-2360 (G) (1.5 mg)2 | 5 | 0 |
| pMB1750-2360 (G) (300 μg)2 | 5 | 0 |
| pMB1750-2360 (F) (1.5 mg)2 | 0 | 5 |
| pPB1750-2360 (F) (1.5 mg)2 | 5 | 0 |
| pPB1750-2360 (F) (300 μg)2 | 1 | 4 |
| CTB (100 μg)3 | 2 | 3 |
| pPB1750-2360 (F) (500 μg)1 | 5 | 0 |
a 햄스터 치사량(25 ㎍)의 씨. 다이피셀 독소 B(CTB)(테크 랩)를 항체(특이 항체량을 표시하였음)에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 이 혼합물을 햄스터에 복강내(IP)로 주사하였다. 지시 단백질에 대하여 생성된 항체와 혼합된 독소가 투여된 각각의 처리군(G=게르부 보조제, F=프로인트 보조제)은, 항체가 14 x IgY PEG 제제임을 나타내고; 2항체는 pPB1850-2360 수지에 의하여 친화성 정제됨을 나타내고; 3 항체는 1 x IgY PEG 제제임을 나타낸다.
b 숫자는 독소/항체 혼합물을 IP 투여하고 2 시간 후에 살거나 죽은 햄스터의 수를 나타낸다.
표 31에 나타난 결과는
1) 실시예 19에서 보이고, 본 실시예에서 재생시킨, 프로인트 보조제를 사용하여 pMB1750-2360으로 면역시킨 암탉에서 분리한 친화성 항체 1.5 ㎎은 생체내에서 독소 B를 중화시키지 않았다. 그러나, 게르부 보조제를 사용하여 유사하게 면역시킨 친화성 정제 항체 300 ㎍은 생체내에서 독소 B를 완전히 중화시켰다. 이러한 사실은 프로인트 보조제(위 (a)에서 설명하였음)와 비교하였을 때 pMB1750-2360 항원에 반응하는 항체의 농도를 높을 뿐만 아니라, 중화 항체의 수율을 5 배 이상으로 증가시키는 것을 의미한다.
2) 독소 B의 완전한 생체내 중화는 pPB1750-2360 항원으로부터 친화성 분리한 항체 1.5 ㎎을 사용할 때 관찰되지만, pMB1750-2360 항원을 사용할 때는 관찰되지 않는다. 이러한 사실은, 표준 독소 B 반복 서열 항체 농도를 통하여, pMB1750-2360이 아닌, pPB1750-2360이 프로인트 보조제와 함께 항원으로 사용될 때에 중화 항체가 생성됨을 의미한다.
3) pMB1750-2360(게르부) 항체 300 ㎍을 사용할 때에는 완전한 생체내 중화가 관찰되지만, pPB1750-2360(프헌드)항체 300 ㎍을 사용하였을 때에는 관찰되지 않았다. 따라서, pMB1750-2360(게르부) 항체는 pPB1750-2360(프로인트) 항체보다 높은 농도의 중화 항체를 포함한다.
4) CTB 항체 300 ㎍(친화성 정제(AP))를 사용하였을 때 독소 B의 완전한 중화가 관찰되었으나, CTB 항체 100 ㎍(AP 또는 PEG 제제)을 사용하였을 때는 관찰되지 않았다. 이러한 사실은 생체내 분석에서 독소 B 반복 서열 특이 항체(항-CTB) 100 ㎍ 이상이 독소 B 25 ㎍을 중화하는데 필수적임을 나타내고 독소 B 반복 서열 독소 B 반복 인터벌에 특이한 친화성 정제 항체는 전체 CTB 단백질에 대한 IgY의 PEG 제제에서와 같은 효율로 독소 B를 중화한다는 것을 나타낸다(이 분석에서 보여줌).
5) 초기 pPB1750-2360 (IgY) PEG 제제(실시예 19)에서 관찰되듯이 pPB1750-2360(프로인트)로 면역시킨 암탉의 서로다늘 두 번째 군에서 분리한 IgY PEG 제제로 완전히 중화된다. 이러한 사실은 프로인트 보조제를 사용하여 pPB1750-2360으로 암탉으로 면역시키는 경우에 재생적으로 생성시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 21
씨. 다이피셀 독소 A 및 B의 진단 효소 면역 분석
이러한 재조합 단백질에 대하여(위의 실시예에서 설명되어 있음) 생성된 재조합 독소 단백질 및 항체의 시료내 클로스트리듐 독소 탐지용 진단 분석의 기본을 형성할 수 있는 능력을 조사하였다. 생물 시료로 부터 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B를 정량적으로 탐지하기 위하여 두 가지 면역 분석 체제를 시험하였다. 첫 번째 체제는 재조합 독소 A 또는 B가 고형 지지체(예, 마이크로타이터 플레이트의 웰)에 고정화 되어있는 경쟁적 분석을 포함하고 재조합 독소 A 또는 B에 대한 친화성 정제 또는 PEG 분리 항체와 혼합된 독소 함유 생물 시료를 첨가하였다. 시료에 독소가 존재하는 경우에 항 재조합 항체와 결합하기 위하여 이 독소는 고정화된 독소 단백질과 경쟁하여 레포터 시약의 첨가로 얻는 시그날을 감소시킬 것이다. 이 레포터 시약은 고정 독소 단백질에 결합된 항체의 존재를 탐지한다.
두 번째 제제에는, 독소 A 및 B에 대한 친화성 정제 항체를 사용하여 샌드위치형 면역 분석이 행하여졌다. 재조합 폴리펩티드(경쟁 분석 체제에서 사용하였음)대신 재조합 독소 A 및 B에 대한 친화성 정제 항체는 마이크로타이터 웰을 코팅하는데 사용하였다. 독소 A 및 B를 포함하는 생물 시료를 웰에 첨가하고, 웰에 결합된 독소를 탐지하기 위하여 보고 지시약을 첨가하였다.
a) 씨. 다이피셀 독소 탐지용 경쟁적 면역 분석
재조합 독소 A 및 B를 고형 96 개의 웰이 있는 마이크로타이터 플레이트를 PBS에 1 ㎍/㎖의 농도로 용해된 독소 단백질로 코팅 함으로써 지지체에 붙였다. 이 플레이트를 2-8 ℃인 곳에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 다음날 아침에, 코팅 용액을 제거하고 웰상의 잔류 단백질 결합 자리를 0.5% BSA 및 0.05% 트윈-20을 포함하는 PBS로 각각의 웰을 채움으로써 블로킹시켰다. 천연 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B(테크 랩)은 건강한 시리안 햄스터(사스코)의 배설 추출물에 4 ㎍/㎖의 농도로 희석시켰다. 배설 추출물은 배설 침강물을 15 ㎖짜리 원심 분리 튜브에 넣어 만들었다; 여기에 PBS를 침강물당 2 ㎖로 첨가하고 볼텍싱하여 균질한 현탁액을 만들었다. 튜브를 실온에서 2000 rpm으로 5 분간 원심 분리하였다. 배설 추출물은 상등액을 제거한 것으로 이루어져있다. 4 ㎍/㎖의 독소 시료를 연속적으로 희석하는데 사용하기 위하여 햄스터 배설 추출물을 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 피펫을 통하여 첨가하였다. 4 ㎍/㎖의 독소 시료 100 ㎕를 마이크로타이터 플레이트의 첫 번째 줄의 웰에 피펫팅하여 첨가하하여 넣고 50 ㎕씩 제거하여 플레이트에서 연속적으로 2 벌씩 희석하였다. 동일한 용적의 친화성 정제 항-재조합 독소 항체 [독소 A를 탐지하는데 각 웰당 1 ng의 항-pMA1870-2680 항체를 사용하였다; 독소 B를 탐지하는데 각 웰당 0.5 ng의 항-pMB1750-2360(게르부)를 사용하였다]를 적당한 웰에 첨가하고 이 플레이트를 교반하며 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 음의 대조군으로 사용되는 웰은 결합하는 독소를 포함하지 않았다.
미결합 독소 및 항체를 0.05% 트윈-20이 포함된 PBS로 3 내지 5 회 세척함으로써 플레이트로부터 제거하였다. 세척한 후에, 알카리성 포스파타제(Sigma)가 붙어 있는 항-닭 IgG 토끼 항체 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 이 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합하지 않은 2 차 항체를 제거하기 위하여 이 플레이트를 세척하였다. 방금 준비한 알카리성 포스파타제의 기질(50 mM Na2CO3, pH 9.5; 10 mM MgCl2에 용해되어 있는 1 ㎎/㎖의 p-니트로페닐 포스페이트(Sigma))을 각각의 웰에 첨가하였다. 색깔이 충분히 변하게 되면, 410 nm 필터를 사용하여 디나테크(Dynatech) MR700 마이트로타이터 플레이트 판독기로 플레이트를 읽었다.
그 결과는 표 32 및 33에 나타내었다. 표 32에 보인 결과를 위해서 각각의 웰을 재조합 독소 A 단백질(pMA1870-2680)으로 코팅하였다. 주어진 웰에 첨가되는 천연 독소 A의 량(용해된 햄스터 배설물에 추가적으로 존재)을 표시하였다(0 내지 200 ng). 재조합 독소 A 단백질인 pMA1870-2680에 대하여 생성된 항체를 pPA1870-2680을 포함하는 칼럼을 통하여(실시예 20에 설명되어있음) 친화성 정제 하였다. 표 32가 보여주듯이, 재조합 독소 A 단백질 및 친화성 정제 항독소는 생물 시료내에 있는 독소 A 탐지용 경쟁적 면역 분석의 근거로 사용될 수 있다.
재조합 독소 B인 pPB1750-2360 및 pMB1750-2360(게르부)에 대하여 생성된 항체를 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 주어진 웰에 첨가되는 천연 독소 B의 량(용해된 햄스터의 배설물에 추가적으로 존재)을 표시하였다(0 내지 200 ng). 재조합 독소 B 단백질인 pMB1750-2360(게르부)에 대하여 생성된 항체를 pPB1850-2360(실시예 20에서 설명됨)을 포함하는 친화성 칼럼을 사용하여 친화성 정제를 하였다. 표 33이 보여주듯이, 재조합 독소 B 단백질 및 친화성 정제 항독소는 생물 시료내의 독소 B 탐지용 경쟁적 면역 분석의 근거로 사용될 수 있다.
이러한 경쟁적 분석에서, 모든 부분에 있어서 주위 수준에 비교하여 감소가 중요시된다. 그러므로, 이 분석은 웰당 12.5 ng이하의 독소 A 및 50-100 ng 만큼 적은 량의 독소 B를 포함하는 시료를 탐지하는데 사용될 수 있다.
| ng 독소 A/웰 | OD410 결과 |
| 200 | 0.176 |
| 100 | 0.253 |
| 50 | 0.240 |
| 25 | 0.259 |
| 12.5 | 0.309 |
| 6.25 | 0.367 |
| 3.125 | 0.417 |
| 0 | 0.590 |
| ng 독소 A/웰 | OD410 결과 |
| 200 | 0.392 |
| 100 | 0.566 |
| 50 | 0.607 |
| 25 | 0.778 |
| 12.5 | 0.970 |
| 6.25 | 0.902 |
| 3.125 | 1.040 |
| 0 | 1.055 |
이러한 경쟁적 저해 분석은 천연 씨. 다이피셀 독소 및 재조합 씨. 다이피셀 독소 단백질은 재조합 씨. 다이피셀 독소에 대하여 생성된 항체에 결합하는 것을 경쟁할 수 있으며, 이러한 항-재조합 독소 항체는 효과적인 진단 시약을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.
b) 씨. 다이피셀 독소 탐지용 샌드위치형 면역 분석
재조합 독소 A 또는 독소 B에 대한 친화성 정제 항체를 96 개의 웰이 있는 마이크로타이터 플레이트에 다음의 방법으로 고정하였다. pMA1870-2680(독소A) 또는 pMB1750-2360(게르부)(독소 B)에 대하여 생성된 친화성 정제 항체로 4 ℃에서 밤새도록 코팅하였다. 항체는 실시예 20에서 설명하는 방법에 따라 친화성 정제 하였다. 1 ㎍/㎖ 농도의 항체를 사용하였고 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 각각의 웰은 PBS에 용해된 0.5%로 실온에서 2 시간동안 블로킹 시켰고, 블로킹 용액을 제거하였다. 건강한 시리안 햄스터로부터 채취한 배설물 시료를 pH7.4의 PBS(침강물을 재현탁 시키기 위해서 배설물 침강물당 2㎖의 PBS를 사용하였고 위에서 설명된 방법에 따라 시료를 원심분리 하였음)에 현탁하였다. 독소를 포함하는 이 배설물 현탁액(독소 A 또는 독소 B)을 독소 없는 배설물 현탁액에 단계적으로 1 배로 희석하고 코팅된 마이크로타이터 웰에 50 ㎍를 두 벌씩 첨가하였다. 독소 없는 배설물 현탁액을 포함하는 웰을 음의 대조군으로 사용하였다.
이 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였고 PBS로 3 회 세척하였다. 1% BSA 또는 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS로 1:1000으로 희석된 염소 항-천연 독소 A 또는 염소 항-천연 독소 B(테크 랩) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 이 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이 플레이트를 전과 같은 방법으로 세척하고 알카리성 포스파타제가 결합된 토끼 항-염소 IgG(Cappel, Durham, N.C.) 100 ㎕를 1:1000으로 희석하여 첨가하였다. 이 플레이트를 실온에서 2 시간 더 인큐베이션하였다. 이 플레이트를 전의 방법으로 세척한 후 50 mM Na2CO3, pH 9.5; 10 mM MgCl2에 용해된 1 ㎎/㎖의 p-니트로페닐 포스페이트(Sigma)를 첨가하였다. 각 웰의 흡광도는 판독기(Dynatech)를 사용하여 410 nm에서 측정하였다. 이 분석의 결과는 표 34 및 35에 나타냈다.
| ng 독소 A/웰 | OD410 결과 |
| 200 | 0.9 |
| 100 | 0.8 |
| 50 | 0.73 |
| 25 | 0.71 |
| 12.5 | 0.59 |
| 6.25 | 0.421 |
| 0 | 0 |
| ng 독소 A/웰 | OD410 결과 |
| 200 | 1.2 |
| 100 | 0.973 |
| 50 | 0.887 |
| 25 | 0.846 |
| 12.5 | 0.651 |
| 6.25 | 0.431 |
| 0 | 0.004 |
표 34 및 35가 보여주는 결과는 재조합 독소 A 및 독소 B 단편에 대하여 생성된 항체는 배설물 시료내의 씨. 독소의 존재를 탐지하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 이러한 항체는 배설물 시료 50 ㎕내의 독소 A 또는 B 6.25 ng 만큼 적은 양을 탐지할 수 있는 샌드위치형의 민감성 면역 분석의 근거를 형성할 수 있다. 표 34 및 35에에서 보여준 바와 같이, 이 샌드위치형 면역 분석의 배경은 극도로 낮다. 따라서, 이 분석의 민감도는 각 웰당 6.25 ng 보다 더 예민하다. 웰당 0.5 내지 1.0 pg 농도의 독소가 이 분석에서 탐지될 수 있다.
표 32-35에 나타난 결과는 씨. 다이피셀 독소 탐지계에 있어서 재조합 약제의 유용성을 나타낸다.
실시예 22
씨. 보툴리누스 단편 융합 단백질의 제조 및 발현
씨. 보툴리누스 A유형 신경독소 유전자를 클로닝 하였고 염기서열을 분석하였다 [Thompson, et al., Eur. J. Biochem. 189:73 (1990)]. 독소 유전자의 염기 서열은 EMBL/GenBank 유전자 데이터 뱅크의 에세션 번호 X52066인 것으로 사용할 수 있다; 코딩 부분의 염기 서열은 SEQ ID NO:27에 나타내었다. 씨. 보툴리누스 A유형 신경독의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:28에 나타내었다. A유형 신경독소 유전자는 이황화 결합으로 연결된 헤비 및 라이트 체인으로 구성된 이량체를 형성하게되는 한 가닥의 폴리펩티드 체인으로 합성된다. 헤비 체인의 50 kD 카르복시 말단 부분은 C 단편 또는 Hc 영역으로 불린다.
씨. 보툴리누스 A유형의 C 단편을 구성하는 폴리펩티드를 이. 콜라이에서 발현하고자하는 노력은 성공하지 못했다 [H. F. Lapenotiere, et al. in Botulinum and Tetanus Neurotoxin, DasGupta, Ed., Plenum Press, New York (1993), pp. 463-466]. C 단편을 이. 콜라이 MBP와의 융합체로서 발현시키면 불용성 단백질이 생성된다{H. F. Lapenotiere. et al., supra).
이. 콜라이에서 용해성 재조합 C 단편 단백질을 생산하기 위해, 씨. 보툴리누스 A유형 독소로부터 유래된 합성 C 단편 유전자 및 씨. 다이피셀 독소 단백질의 일부 또는 MBP를 포함하는 융합 단백질를 구성하였다. 이 실험에는 a) C 단편 융합 단백질을 코딩하는 플라즈미드의 구성 및 b) 씨. 보툴리누스 C 단편의 융합 단백질을 이. 콜라이에서 발현시키는 것이 포함된다.
a) C 단편 융합 단백질을 코딩하는 플라즈미드의 구성
실시예 11에서 씨. 다이피셀 독소 A 반복 서열 영역은 천연(pPA1870-2680 클론의 pET 23a 벡터에서 발현됨) 또는 융합체(pMA1870-2680 클론에서 이. 콜라이 MBP와의 융합체로서 pMALc 벡터에서 발현됨)로서 효율적으로 발현될 수 있고 정제될 수 있다. MBP, 씨. 다이피셀 독소 A 반복 서열 영역(용해성 융합 단백질로서 발현되는 것을 보임) 및 씨. 보툴리누스 A유형 독소의 단편간의 융합체를 포함하는 융합 단백질을 구성하였다. 씨. 보툴리누스 A유형 독소의 C 단편 및 MBP를 포함하는 융합 단백질도 구성하였다.
도 25는 씨. 보툴리누스 독소 A 서열 또는 보툴리날 융합 단백질을 생성시기 위하여 사용되는 씨. 보툴리누스 C 단편 서열을 포함하는 도너 구성체와 보툴리누스 융합 단백질을 도식적으로 나타내었다. 도 25에서, 검은색 상자는 씨. 다이피셀 독소 A 유전자 서열을 나타내고, 흰색 상자는 씨. 보툴리누스의 C 단편 서열을 나타내고, 검은 색의 입체 타원은 이. 콜라이 MBP를 나타낸다. 제한 효소의 명칭이 괄호 안에 있는 것은 구성하는 동안에 제한 효소 자리가 소실됨을 의미한다. 제한 효소 명칭에 별표가 있는 경우에, 이 제한효소 자리는 클로닝 연결시에 생겨난 것을 나타낸다.
도 25에서는, 씨. 다이피셀 독소 A 반복 서열 단백질을 포함하는 pMA1870-2680 및 pPA1100-2680 구조물의 제한 맵(실시예 11에 설명되었음)을 보여준다. 이러한 구성체는 씨. 보툴리누스 C 단편 유전자 및 씨. 다이피셀 독소 A 유전자간의 융합체를 코딩하는 플라즈미드 구성용 씨. 다이피셀 독소 A 유전자 서열의 근거로 사용하였다. pMA1870-2680 발현 구성체는 아밀로즈 칼럼(실시예 11d에서 설명된 정제)에서 친화성 정제가 가능한 높은 농도의 완전한 용해성 융합 단백질(배양물 1 ℓ당 20 ㎎)을 발현시켰다.
pAlterBot 구성체)도 25)는 보툴리누스 융합 단백질을 코딩하는 씨. 보툴리누스 C 단편 유전자의 서열의 근거로 사용하였다. pAlterBot는 미국방부에 근무하는 J. Middlebrook 및 R. Lemley로부터 얻었다. pAlterBot는 pALTER-1R 벡터(프로메가)에 삽입된 합성 씨. 보툴리누스 C 단편을 포함한다. 이 합성 C 단편 유전자는 C. 단편 유전자가 코딩하는 아미노산과 동일한 것을 코딩한다. 천연적인 C 단편 서열은 다른 클로스트리듐 유전자처럼 A/T가 극도로 많다(Thompson et al., supra). 이렇게 높은 A/T 함량으로 이. 콜라이 및 효모에서의 발현이 곤란하게 되는데, 각각의 경우, 코돈 사용 빈도의 변화 및 예기치 않은 폴리아데닐화로 인함이다. 이. 콜라이에서 C 단편 단백질의 발현을 향상시키기 위하여 바람직하지 않은 코돈을 바람직한 코돈으로 대체한 합성 유전자를 구성하였다.
pAlterBot내의 씨. 보툴리누스 C 단편 유전자의 염기 서열은 SEQ ID NO:22에 정리하였다. 첫 번째 염기서열(ATGGCT)는 메티오닌 및 알라닌 잔기를 각각 코딩한다. 이 두가지 아미노산은 씨. 보툴리누스 C 단편을 pALTERR 벡터에 삽입하여 생겨난 것이고, 결과적으로 개시제인 메티오닌을 제공하였다. pAlterBot에 포함된 서열에 의하여 코딩된 씨. 보툴리누스 C 단편의 아미노산 서열을 SEQ ID NO:23에 정리하였다. 첫 번째 두 개의 아미노산(Met Ala)는 벡터에서 유래한 서열이 코딩하는 아미노산이다. 세 번째 아미노산(Arg)부터의 아미노산 서열은 씨. 보툴리누스 A유형 독소 유전자의 아미노산 서열과 동일하였다.
pMA1870-2680, pPA1100-2680 및 pAlterBot 구성체를 원조 플라즈미드로 하여 pMAL-c 발현 벡터(New England BioLabs)를 사용하여 씨. 다이피셀 독소 A 반복 서열 영역 단편이 씨. 보툴리누스 C 단편 유전자와의 유전적 융합체로서 발현되는 발현 구성체를 만들었다. pMAL-c 발현 벡터는 단백질의 아미노 말단에 MBP를 포함하는 융합 단백질을 생성시킨다. 씨. 보툴리누스 C 단편 유전자는 오직 MBP와의 융합체로서만 발현되는 구성체인 pMBot를 구성하였다(도 25). 융합 단백질의 발현은 위의 플라즈미드를 가진 이. 콜라이에서 유발되었고 유발된 단백질은 아밀로즈 수지 칼럼에서 친화성에 근거하여 정제하였다.
i) pBleuBot의 구성
씨. 보툴리누스 C 단편 유전자 서열을 다수의 적합한 구성체에 클로닝하는 것을 용이케 하기 위하여 pAlterBot에서 보툴리누스 유전자 서열을 제거하고 pBluescript 플라즈미드(스트라타젠)에 삽입하여 pBlueBot를 구성하였다(도 25). pBlueBot는 다음의 방법으로 구성하였다. pAlterBot 플라즈미드를 가진 세균을 테트라사이클린이 포함된 배지에서 배양한 후 큐아프렙-스핀(QIAprep-spin) 플라즈미드 키드를 사용하여 플라즈미드 DNA를 분리하였다. pAlterBot DNA 1 ㎍을 NcoI으로 절단하고 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편(이후로는 클레노우 단편으로 표시)을 사용하여 3' 돌출 말단을 평활 말단으로 만들었다. pAlterBot DNA는 HindIII로 절단하여 평활 말단(NcoI 자리가 채워짐)-HindIII 단편의 형태로 보툴리누스 유전자 서열을 방출하였다. pBluescript 벡터 DNA는 pBluescript DNA 200 ng을 SmaI 및 HindIII로 절단하였다. 두 플라즈미드의 절단 생성물은 아가로즈 겔에서 확인하였다. 적당한 단편을 겔에서 오려내어 한데 섞고 프렙-a-진(Gene) 키트(바이오라드)를 사용하여 정제하였다. 용리한 DNA는 T4 DNA 라이게이즈를 사용하여 리게이션하였고 형질전환용 세포 DH5α(Gibco-BRL)을 형질전환하는데 사용하였다. 숙주 세포는 문헌[Sambrook et al., supra 1.82-1.83]의 염화칼슘 프로토콜에 따라 만들었다. 재조합 클론을 분리하고 표준 재조합 분자 생물학 기술(Sambrook et al. supra)을 사용하여 확인하였다. 생성된 클론인 pBlueBot는, 도 25가 보여 주는 바와 같이, Bot 삽입체(즉, pAlterBot로부터 유래한 씨. 보툴리누스 C 단편 서열)에 인접한 몇개의 유용한 유일한 제한효소 자리를 가지고 있다.
ii) 씨. 다이피셀/ 씨. 보툴리누스/ MBP 융합 단백질
씨. 다이피셀 독소 A 유전자 및 씨. 보툴리누스 C 단편 유전자 및 MBP간의 융합체를 코딩하는 구성체는 위에서 설명한 동일한 재조합 DNA 방법으로 구성하였다.
Bot 삽입체(즉, pAlterBot로부터 유래한 씨. 보툴리누스 C 단편 서열)에 융합된 씨. 다이피셀 독소 A 유전자로부터 유래한 2.4 kb 삽입체를 포함하는 pMABot 클론은 NcoI/HindIII로 절단한 pBlueBot(1.2 kb Bot 단편)으로부터 혼합된 겔에서 정제한 DNA로 구성한다. SpeI/NotI으로 자른 pPA1100-2680(2.4kb 씨. 다이피셀 독소 A 반복 서열 단편) 및 XbaI/HindIII로 자른 pMAL-c 벡터, 재조합 클론을 분리하고 제한 절단으로 확인하고 큐아프렙-스핀 플라즈미드 키트(Qiagen)을 사용하여 분리하였다. 이 클론은 독소 A 반복 서열 및 MBP와 프레임내 융합체로서의 보툴리누스 C 단편 단백질 서열을 발현한다.
씨. 다이피셀 독소 A 유전자 pMCABot 구성체는 Bot 삽입체에 융합된 씨. 다이피셀 독소 A 유전자로부터 유래하였다(즉, 씨. 보툴리누스 C 단편은 pAlterBot로부터 유래하였다). pMCABot는 pMABot클론의 5' 말단을 EcoRI으로 절단 (pMAL-c 벡터는 pMABot 클론의 씨. 다이피셀 삽입체의 5'쪽에 EcoRI 자리를 가지고 있다)하여 씨. 다이피셀 독소 A 반복체를 제거하였다. 겔에서 정제한 후에 제한 부위를 채우고 리게이션시켰다. 생성된 클론(pMCABot, 도 25 참조)은 MBP와 Bot 유전자에 융합된 남아 있는 씨. 다이피셀 독소 A 반복 서열 영역의 3' 부분을 프레임내 융합시킨다.
씨. 다이피셀 독소 A 반복 서열 영역으로부터 유래한 1 kb SpeI/EcoRI(채워짐) 단편 및 NcoI(채워짐)/HindIII 단편(pAlterBot로부터 유래)으로서의 1.2 kb 씨. 보툴리누스 C 단편을 포함한다. 이 두가지 단편은 XbaI/HindIII로 절단된 pMAL-c 벡터에 삽입하였다. 이 두 가지 삽입체는 적당한 플라즈미드를 EcoRI(pPA1100-2680) 또는 NcoI(pAlterBot)로 절단하여 생성시키고 이어서 클레노우 단편으로 처리하였다. 클레노우 단편을 처리한 후에, 이 플라즈미드는 두 번째 효소(SpeI 또는 HindIII)로 분해한다. 이 세가지 단편 모두 겔에서 잘라내어 혼합한 후 프렙-a-진으로 정제하고 리게이션시켰다. 리게이션 및 형질 전환 후에 추정되는 재조합체를 제한 분석으로 분석하였다. 채워진 EcoRI 및 NcoI 자리간의 융합체에서 예상되는 바와 같이 EcoRI 자리가 융합체 연결부위를 재생성 시킴을 발견하였다.
보툴리누스 C 단편 유전자 및 MBP 유전자간의 융합 단백질을 코딩하는 구성체를 구성하였고(즉, 이 융합체에는 씨. 다이피셀 독소 A 유전자 서열이 없다) 이를 pMBot로 명명하였다. pMBot 구성체는 pMABot 구성체로 부터 씨. 다이피셀 독소 A를 제거하고 C 단편 유전자 서열을 MBP에 융합하여 구성하였다. pMABot DNA를 StuI(pMALc 폴리링커내에서 XbaI의 5'쪽에 위치함) 및 XbaI(toxA-Bot 융합체 연결부위에서 NotI의 3'쪽에 위치함)으로 자른후 클레나운 단편을 사용하여 XbaI을 채우고 목적 제한 단편을 겔에서 분리한후 평활 말단을 서로 리게이션하여 플라즈미드를 천연으로 만들었다. 리게이션 및 형질 전환후에, 추정되는 재조합체는 Bot 삽입체의 제한 맵핑으로 분석하였다(즉, 씨. 보툴리누스 C 단편 서열).
b) 씨. 보툴리누스 C 단편 융합 단백질의 이. 콜라이에서의 발현
큰 단위의 배양물(1 ℓ)의 pMAL-c 벡터 배양물 및 (a)에서 설명한 각각의 재조합 구성체를 배양한후, 유발된 용해성 단백질 분류를 실시예 18에서 설명하는 바에 따라 분리하였다. 용해성 단백질 추출물은 아밀로즈 친화성 수지를 사용한 크로마토그래프를 하여 재조합 융합 단백질을 분리하였다. 정제한 재조합 융합 단백질은 문헌 [Williams et al. (1994) supra]에서 설명되어 있는 바에 따라 SDS-PAGE 겔에서 전개한 것을 쿠마시로의 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 통하여 분석하였다. 간단히 설명하자면, 문헌 [Williams, et al.(1994), supra]에서 설명하는 바에 따라 추출물을 준비하여 아밀로즈 수지(New England Biolabs)칼럼을 사용하여 칼럼 완충액(10 mM NaPO4, 0.5 M NaCl, 10 mMβ-메르캅토에탄올, pH 7.2)에서 크로마토그래프하고 10 mM 말토오즈를 포함하는 칼럼 완충액을 사용하여 용리하였다. 정제한 단백질을 건 SDS-PAGE 겔을 쿠마시 불루로 염색한 결과는 도 26에 나타내었다.
도 26에서는, 다음의 시료를 로딩하였다. 제 1 레인 내지 6 레인에는 pMAL-c, pPA1870-2680, pMABot, pMNABot, pMCABot 및 pMBot 플라즈미드를 각각 가지고 있는 이. 콜라이에서 정제한 단백질을 로딩하였다. 제 7 레인에는 넓은 범위의 분자량 단백질 마커(BioRad)를 로딩하였다.
용리된 단백질 5 ㎍을 2 x SDS-PAGE 시료 완충액(0.125 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 2 mM EDTA, 6% SDS, 20% 글리세롤, 0.025% 브로모페놀 블루; 사용하기 전에 β-메트밥토에탄올을 첨가하였다)과 혼합하여 전기영동하였다. 이 시료를 95℃에서 5 분간 가열한 후 냉각하고 7.5% 아가로즈 SDS-PAGE 겔에 걸었다. 넓은 범위의 분자량 단백질 마커도 걸어서 동정하는 융합 단백질의 분자량을 측정하였다. 전개한 후에 일반적으로 쿠마시 불루로 겔을 염색하여 탐지하였다.
모든 경우에 있어서, 수율은 배양물 1 ℓ당 융합 단백질 20 ㎎ 이상(표 36을 참조)이었고, pMCABot 단백질만 제외하고는 용리된 융합 단백질의 대부분이 전체 길이의 융합 단백질임을 분자량을 통하여 추정하였다(도 26). 10 %이하의 pMCABot 융합 단백질은 전체 길이의 융합 단백질로 발현되는 것으로 추측하였다(시각적인 조사에 의함).
| 구성체 | 수율(mg/배양물 11) | 전체 용해성 단백질에 대한 백분율 |
| pMABot | 24 | 5.0 |
| pMCABot | 34 | 5.0 |
| pMNABot | 40 | 5.5 |
| pMBot | 22 | 5.0 |
| pMA1870-2680 | 40 | 4.8 |
이러한 결과는 완전한 씨. 보툴리누스 C 단편/씨. 다이피셀 독소 A 융합 단백질을 이. 콜라이에서 높은 농도로 발현하는 것은 pMAL-c 발현 시스템을 사용함으로써 가능하다. 이러한 결과는 문헌 [H. F. LaPenotiere, et al. (1993), supra]에서 보고하는 바와 대조적이다. 또한, 이러한 결과는 이. 콜라이에서 pMAL-c 시스템을 사용하여 용해성 융합 단백질을 생성시키기 위해서 보툴리누스 C 단편 유전자를 씨. 다이피셀 독소 A유전자에 융합하는 것은 필요치 않다는 것을 보여준다.
위에서 설명된 보툴리누스 융합 단백질이 항-씨. 보툴리누스 독소 A 항체에 의하여 인지되는지 알아보기 위하여, 웨스턴 블롯을 하였다. pMABot, pMCABot, pMNABot, pMBot, pMA1870-2680 또는 pMALc 플라즈미드를 가진 이. 콜라이로부터 분리한 친화성 정제 단백질을 포함하는 시료를 분석하였다. SDS-PAGE 겔(7.5% 아크릴아마이드)에 각각의 발현 구성체에서 분리한 단백질 시료를 로딩하였다. 전기영동한 후에, 겔을 블롯팅한후 폰소 S 염색으로 단백질이 이동되었는지를 확인하였다(실시예 12b에서 설명하는 방법에 따름).
단백질을 이동시킨 후에, 블로킹 완충액 [PBST(0.5% 트윈 20 및 5% 분유를 포함하는 PBS)]에서 20 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 블로킹시켰다. 그 다음에, 이 블롯을 1 차 항체를 포함하는 용액 10 ㎖에 인큐베이션하였다; 이 용액은 항-씨. 보툴리누스 독소 A IgY PEG 제제(실시예 3에서 설명하였음)을 블로킹 완충액으로1/500로 희석한 것이다. 이 블롯을 1 차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이 블롯을 세척한 후에 항-닭 알카리성 포스파타제가 결합된 토끼 항체를 2 차 항체로 다음과 같이 사용하였다. 항-닭 토끼 항체를 블로킹 완충액(1 개의 블롯당 최종 용적 10 ㎖)에 1 ㎍/㎖로 희석하고 이 블롯을 2 차 항체와 함께 실온에서 1 시간 인큐베이션하였다. 그 다음에 블롯을 PBS, BBS-트윈 및 50 mM Na2CO3, pH 9.5로 세척하였다. 이 블롯에 금방 제조한 알카리성 포스파타제 기질 완충액(100 ㎍/㎖ 니트로 블루 테트라졸륨, 50 ㎍/㎖ 5-브로모-클로로인돌일포스페이트, 5 mM MgCl2가 50 mM Na2CO3, pH 9.5에 용해되어있음)을 처리하였다. 증류수를 블롯에 대량 가하여 전개를 정지시키고 블롯은 대기중에서 건조시켰다.
이 웨스턴 블롯 분석으로 pMABot, pMCABot, pMNABot 및 pMBot 단백질 시료내의 항-씨. 보툴리누스 독소 반응 단백질이 검출(도 25에서 쿠마시 염색으로 동정한 전체 길이로 예상된 단백질에 해당됨)되었으나, pMA1100-2680 또는 pMALc 단백질 시료에서는 검출되지 않았다.
이러한 결과는 예상하였던 바와 같이 아밀로즈 수지로 정제한 관계된 융합 단백질은 면역 반응성 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질을 포함하는 것을 나타낸다.
실시예 23
코를 통한 pMBot 단백질의 투여로 중화 항체의 생성
실시예 22에서 생성된 재조합 보쿨리넘 독소 단백질의 보툴리누스 독소 에피토프에 대한 전신 면역 반응 자극 능력을 측정하였다. 이 실시예는 a) 보툴리누스 독소를 포함하는 씨. 다이피셀 독소 A 융합 단백질을 코나 경구로 투여하여 생성시킨 혈청 IgG 농도의 유발을 측정하고 b) 항-재조합 씨. 보툴리누스 C 단편 항체를 사용하여 씨. 보툴리누스 A유형 신경독을 생체내에서 중화하는 것을 포함한다.
a) 씨. 다이피셀 독소 A 융합 단백질을 포함하는 보툴리누스 독소를 코 또는 경구 투여로 생성된 혈청 IgG 역가 유발의 측정
6 주된 CF 암컷 마우스(Charles River)를 각각 포함하는 6 개의 군을 코 또는 경구를 통하여 실시예 22에서 제조한 단백질을 사용하여 다음의 세가지 조합중 하나로 면역시켰다: (1) 랫트 1 마리당 pMBot 단백질 250 ㎍(코 또는 경구); 2) 랫트 1 마리당 pMABot 단백질 250 ㎍(코 또는 경구); (3) 랫트 1 마리당 pMA1870-2680 125 ㎍과 혼합된 pMBot 125 ㎍(코 또는 경구). CF 암컷 랫트 3 마리를 각각 포함하는 5 개 군으로 이루어진 두 번째 세트를 다음의 조합중 하나로 코 또는 경구를 통하여 면역시켰다 (4) 랫트 1 마리당 pMNABot 250 ㎍(코 또는 경구) 또는 랫트 1 마리당 pMAL-c 단백질 250 ㎍ (코 또는 경구).
면역법으로 사용하기 위하여 다음의 방법으로 융합 단백질을 제조하였다 단백질(10 mM 말토오즈를 포함하는 칼럼 완충액내)을 0.1 M 탄산염 완충액, pH 9.5로 희석하고 200 ㎕의 용적로 코 또는 경구로 투여하였다. 투여전에 가볍게 마우스를 안정시켰다. 20 게이지짜리 급식 바늘을 사용하여 경구 투여 하였다. P-200 마이크로-피페터(Gilson)을 사용하여 코로 투여하였다. 마우스는 위에서 설명한 기술로 1 차 면역을 시킨 후에 14 일간 안정시키고 7일이 지나서 피를 뽑았다. 각 군의 마우스를 에테르로 가볍게 마취시키고 꼬리에서 피를 뽑았다.
각 랫트의 혈청은 ELISA를 사용하여 항-씨. 보툴리누스 A유형 독소 IgG 혈청 역가를 측정하기 위하여 분석하였다. 실시예 13c에서 설명한 프로토콜을 변형하여 ELISA를 수행하였다. 간단하게 설명하자면, 96 개의 웰이 있는 마이크로타이터 플레이트(Falcon, Pro-Bind Assay Plates)를 0.005% 티머로살을 포함하는 PBS에 용해된 2.5 ㎍/㎖의 씨. 보툴리누스 A유형 톡소이드 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가한 후 밤새도록 4℃에 인큐베이션함으로써 씨. 보툴리누스 A유형 톡소이드(실시예 3a에서 설명된 방법으로 조제하였음)로 코팅하였다. 다음날 아침에, 코팅 현탁액은 버리고 모든 웰을 PBS를 사용하여 3 회 세척하였다.
비특이성 결합 부위를 블로킹하기 위하여, 블로킹 용액(PBS에 용해된 0.5% BSA) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가한후 이 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이 블로킹 용액을 제거하고 희석된 랫트 혈청인 2 벌의 시료 150 ㎕를 희석 시리즈의 첫 번째 웰에 첨가하였다. 첫 번째 시험 혈청 0.5% 트윈 20을 포함하는 블로킹 용액으로 1:30으로 희석한 것이며 이후에는 이 용액으로 5 배 희석하였다. 0.5% 트윈 20을 포함하는 블로킹 용액 120 ㎕에 30 ㎕씩 소량 첨가하고 혼합하고 새로운 웰에 다시 희석하는 것을 연속적으로 하여서 위와 같이 희석하였다. 희석이 다 되면, 각 웰에서 30 ㎕씩을 제거하여 최종 용적이 120 ㎕가 되도록 하였다. 이러한 희석을 3 회 더 행하였다(모두 4 개의 웰) 이 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후에, 연속적으로 희석한 시료를 제거하고 0.5% 트윈 20(PBST)를 포함하는 PBS를 사용하여 6 회 세척하였다. 0.5% 트윈 20을 포함하는 블로킹 완충액으로 희석된 토끼 항-랫트 IgG 알카리성 포스파타제(시그마)(1/1000) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 이 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합된 용액을 제거하고 위에서 설명된 바에 따라 이 플레이트를 세척하고 마지막에는 PBST 대신에 50 mM Na2CO3, pH 9.5로 척하였다. 50 mM Na2CO3, pH 9.5에 용해된 1 ㎎/㎖의 파라-니트로 페닐 포스페이트(시그마)를 포함하는 용액 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 실온의 어두운 곳에서 5 내지 45 분간 인큐베이션하였다. 각 웰의 흡광도는 디나테크 MR 700 판독기를 사용하여 410 nm에서 측정하였다. 그 결과는 표 37 및 38에 요약하였고 개별적인 랫트의 평균 혈청 반응성을 나타낸다.
| 면역법 경로 | 코 | 경구 | |||||
| 면역원 | 면역전 | pMBot | pMBot& pMA1870-2680 | pMABot | pMBot | pMBot& pMA1870-2680 | pMABot |
| 희석율 | |||||||
| 1:30 | 0.080 | 1.040 | 1.030 | 0.060 | 0.190 | 0.080 | 0.120 |
| 1:150 | 0.017 | 0.580 | 0.540 | 0.022 | 0.070 | 0.020 | 0.027 |
| 1:750 | 0.009 | 0.280 | 0.260 | 0.010 | 0.020 | 0.010 | 0.014 |
| 1:3750 | 0.007 | 0.084 | 0.090 | 0.009 | 0.009 | 0.010 | 0.007 |
| # 시험한 랫트 수 | 5 | 5 | 5 | 5 | 2 | 2 | |
* 숫자는 면역전 대조군을 사용하여 표준화한 두 벌의 ELISA 플레이트로부터 얻은 값의 평균을 나타낸다.
| 면역법 경로 | 코 | 경구 | |||
| 면역원 | 면역전 | pMBot | pMABot | pMNABot | pMNABot |
| 희석율 | |||||
| 1:30 | 0.040 | 0.557 | 0.010 | 0.015 | 0.010 |
| 1:150 | 0.009 | 0.383 | 0.001 | 0.003 | 0.002 |
| 1:750 | 0.001 | 0.140 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| 1:3750 | 0.000 | 0.040 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| # 시험한 랫트 수 | 1 | 1 | 3 | 3 | |
위의 ELISA 결과는 투여 경로가 코일 때에 보툴리누스 융합 단백질에 대한 반응성이 가장 강하다는 것을 나타낸다. 보툴리누스 융합 단백질을 경구 투여하였을 경우에 약한 반응만이 보였다. 코로 투여한 pMbot 및 pMA1870-2680과 혼합된 pMBot는 현저한 혈청 IgG 반응을 유발한다. 이러한 결과는 pMA1870-2680 단백질을 항체 반응성을 향상시키지 않으므로(표 37) pMBot 단백질만이 이 반응을 유발한는데 필수적임을 나타낸다. 씨. 다이피셀 독소 A 단편을 MBP와 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질 사이에 위치시키는 것은 항-bot IgG의 역가를 현저하게 함소시켰다(pMABot, pMCABot 및 pMNABot 단백질을 사용한 결과를 참조).
이 연구를 통하여 pMBot 단백질이 씨. 보툴리누스 A유형 독소에 대하여 조절되는 강한 혈청 IgG 반응을 유발한다는 사실을 알 수 있다.
b) 항-재조합 씨. 보툴리누스 C 단편 항체를 이용한 씨. 보툴리누스 A유형 신경독의 생체내 중화
마우스의 중화 모델을 사용하여, 재조합 보툴리누스 융합 단백질을 생취의 코에 투여하여 생성시킨 항-씨. 보툴리누스 A유형 독소 항체의 씨. 보툴리누스 A유형의 중화력를 시험하였다. 생취 모델은 생체 유동체내의 보툴리누스 독소를 탐지 및 항-보툴리누스 항체를 측정하는 방법으로 받아들어진 기술이다[E. J. Schantz and D. A. Kautter, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61:96 (1990) 및 Investigational New Drug(BB-IND-3703) application by the Surgeon General of the Department of the Army to the Federal Food and Drug Administration]. 항-씨. 보툴리누스 A유형 독소 항체는 다음의 방법으로 제조하였다.
코를 통하여 pMBot 단백질이 투여된 군의 랫트에 pMBot 단백질을 마우스 1 마리당 250 ㎍씩 2 번째 투여하고 7일이 지난 후에 혈청을 뽑았다. 이 군의 각 랫트의 혈청 및 면역전 랫트의 혈청의 마우스의 중화 모델계에서의 항-씨. 보툴리누스 A유형 독소 중화력을 시험하였다.
Eric Johnson 박사(University of Wisconsin Madison)으로부터 얻은 전제된 씨. 보툴리누스 A유형 독소 복합 용액의 LD50을 18 내지 22 g의 암컷 ICR 마우스를 사용하는 Schantz 및 Kautter [J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61:96 (1978)]의 복강(IP) 방법으로 측정하였고 그 값은 3500 LD50/㎖이었다. LD50은 다음의 방법으로 측정 하였다. 정제한 A유형 독소 복합체를 25 mM 인산 나트륨 완충액, pH 6.8에 용해시켜 A유형 독소 표준을 제조하여 3.14 x 107 LD50/㎎의 저장용 독소 용액을 제조하였다. 이 용액의 OD278을 측정하고 농도를 10 - 20 ㎍/㎖로 맞추었다. 독소 용액을 겔-포스페이트(30 mM 포스페이트, pH 6.4; 0.2% 젤라틴)로 1:100으로 희석하였다. 독소 용액을 아래의 표 39에서 보이는 바와 같이 더 희석시켰다. 두 마리의 마우스에 아래에 보여진 농도로 각각 희석한 0.5 ㎖로 IP 투여한 후 72 시간 동안 보툴리누스 중독현상의 증세를 관찰하였다.
| 희석율 | 72시간 째에 치사 수 |
| 1:320 | 2/2 |
| 1:640 | 2/2 |
| 1:1280 | 2/2 |
| 1:2560 | 0/2 (72시간 후 발병) |
| 1:5120 | 0/2 (증상 없음) |
표 39에 나타난 결과로부터 독소의 역가는 2560 LD50/㎖과 5120 LD50/㎖(또는 약 3840 LD50/㎖)사이임으로 추측되었다. 이 값은 편리한 계산을 위하여 약 3500 LD50/㎖으로 한다.
pMBot 단백질로 코를 통하여 면역시킨 랫트의 혈청에 존재하는 중화 항체 양을 측정하였다. 위에서 설명한 방법에 따라 pMBot 단백질을 투여한 두 마리 랫트의 혈청 및 한 마리 랫트로부터 채취한 면역전 혈청을 다음의 방법으로 시험하였다. 표준이 되는 독소는 겔-포스페이트로 1:100으로 희석하여 최종 농도가 350 LD50/㎖이 되도록 하였다. 이 희석한 표준 독소 1 ㎖을 세 마리의 랫트에서 각각 25 ㎕씩 채취한 혈청 및 겔-포스페이트 0.2 ㎖과 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 가끔씩 섞어주면서 30 분간 인큐베이션하였다. 이 혼합물 0.5 ㎖씩 두 마리의 마우스에 각각 IP 투여하였다. pMBot 단백질로 면역시킨 랫트의 혈청을 투여한 마우스는 이 효력있는 복용을 중화하였다. 면역전 랫트의 혈청을 투여한 마우스는 24 시간 이내에 죽었다.
pMBot 단백질로 면역시킨 랫트의 혈청에 존재하는 항-독소 중화 항체를 정량하였다. 혈청 항체 적정은 각각의 항체 희석액 0.1 ㎖씩(표 40을 참조)과 보관용 독소 용액(3.5 x 104 LD50/㎖)의 1:10으로의 희석액 0.1 ㎖와 겔-포스페이트 0.1 ㎖을 혼합하고 각각의 희석액 0.5 ㎖을 2 마리의 마우스에 IP 투여하였다. 마우스들은 3 일 동안에(72 시간) 보툴리누스 증세를 보였다. 그 결과는 표 39에 정리하였다.
표 40에서 알 수 있듯이 pMBot 혈청은 1:320 또는 그 이하로 희석하여 사용하였을 때에 씨. 보툴리누스 A유형 독소 복합체를 중화시킨다. pMBot 혈청으로 얻은 평균 중화값은 168 IU/㎖(IU는 10,000 마리 랫트의 LD50으로 정의됨) 이었다. 이 값은 약 3.7 IU/㎎의 혈청 단백질의 순환 혈청 역가로 이해된다. 이 중화 역가는 시판 중인 농축되어 병에 포장된(Connaught Laboratories, Ltd.) 말 항-씨. 보툴리누스 항혈청과 유사하다. 약 200 ㎎/㎖의 단백질을 포함하는 코노트(Connaught) 항혈청은 씨. 보툴리누스 A유형 독소 750 IU를 중화할 수 있다. 사람에게 1 개의 물약병을 투여한 후에는, 평균 혈청 용적이 3 ℓ로 가정하면 코노트 제제의 순환 혈청 농도는 약 25 IU/㎖일 것이다. 따라서, pMBot 단백질(168 IU/㎖)으로 코를 통하여 면역 처리한 랫트에서 관찰되는 순환 항-씨. 보툴리누스 역가는 사람에게 방어력을 나타내는 항-씨. 보툴리누스 항체의 필수 순환 역가보다 6.7 배 높다.
| 희석율 | pMBota | |
| 랫트 1 | 랫트 2 | |
| 1: 20 | 2/2 | 2/2 |
| 1: 40 | 2/2 | 2/2 |
| 1: 80 | 2/2 | 2/2 |
| 1: 160 | 2/2 | 2/2 |
| 1: 320 | 2/2b | 2/2b |
| 1: 640 | 0/2 | 0/2 |
| 1: 1280 | 0/2 | 0/2 |
| 1: 2560 | 0/2 | 0/2 |
| a pMBot 단백질로 면역된 랫트로부터 취한 혈청을 받은 후 72시간 동안 생존한 마우스의 수 b 생존하였으나 72시간 후에 질병이 개시된 마우스 | ||
이 결과들은 이. 콜라이에 의해 생산된 재조합 씨. 보툴리누스 C 단편 융합 단백질을 면역원으로 사용할 때, 씨. 보툴리누스 A유형 독소를 중화시킬 수 있는 항체가 유발되는 것을 입증하였다.
실시예 24
내독소 오염이 실질적으로 없는 용해성 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질의 생산
실시예 23은 중화 항체가 이. 콜라이에서 발현된 pMBot 단백질로써 면역시킴으로써 생성됨을 입증하였다. 이 결과는 pMBot 융합 단백질이 양호한 백신 후보임을 보여주었다. 그러나, 백신으로 사용되기에 적합한 면역원은 중화 항체를 유발할 수 있는 능력 외에 발열원이 없어야 한다. 백신으로서 사용될 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질의 생산을 용이하게 하는 발현 클론 및 조건들을 개발하였다.
이 실시예는 (a) pMBot 단백질의 발열원 함량의 결정, (b) MBP가 없는 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질의 생산, (c) 다양한 발현 벡터를 이용한 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질의 발현, 및 (d) 유의한 내독소 오염이 실질적으로 없는 용해성 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질의 정제를 수반한다.
a) pMBot 단백질의 발열원 함량의 결정
사람 또는 다른 동물에서 재조합 항원을 백신으로서 사용하기 위하여, 항원 제제는 발열원이 없음이 입증되어야 한다. 그람 음성 세균, 예를 들어, 이. 콜라이에 의해 생산된 재조합 단백질의 제제 중에 존재하는 가장 의미있는 발열원은 내독소이다 [F.C. Pearson, 발열원:내독소, LAL 시험 및 발열원 제거 (1985) Marcel Dekker, New York. pp23-56]. pMBot 단백질을 백신 후보로서의 이용성을 평가하기 위하여, MBP 융합 단백질 중 내독소의 함량을 결정하였다.
재조합 단백질 시료의 내독소 함량을 제조자의 지시에 따라 리뮬러스 분석법(LAL 키트: 어소시에이트 오브 캐이프 코드)을 사용하여 분석하였다. 친화성 정제된 pMal-c 단백질 및 pMA1870-2680의 시료는 고수준의 [〉50,000 EU/mg 단백질: EU(내독소 유니트)] 내독소를 함유하는 것으로 발견되었다. 이는 보툴리누스의 C 단편과 MBP- 또는 독소 A 반복 영역 함유 융합체도 고수준의 독소를 함유하는 것을 의미한다. 따라서, 친화성 정제된 pMal-c 및 pMBot 단백질 제제로부터 내독소의 제거를 하기와 같이 시도하였다.
pMal-c 및 pMBot 단백질의 시료로부터 폴리믹신으로 발열원 제거를 수행하여 내독소가 쉽게 제거될 수 있는 지를 측정하였다. 단백질을 pMal-c에 대해서는 4.8 OD280/㎖에서 29 ㎖ 및 pMBot에 대해서는 1.44 OD280/㎖에서 19 ㎖의 양으로 처리하였다. 단백질 시료를 PBS에 대해 강력하게 투석하고, 0.5 ㎖ PBS-평형상태가 된 폴리믹신 B (Affi-Prep Polymixyn, 바이오라드사)와 50 ㎖ 튜브(팔콘)에서 혼합하였다. 시료를 밤새 4℃에서 튜브를 회전시킴으로써 혼합되도록 하였다. 폴리믹신을 30분 동안 벤치 탑 원심분리기에서 최대 속도 (약 2000×g)에서 원심분리하여 펠릿화하고, 상등액은 제거하였다. 회수된 단백질 (상등액에서)은 OD280에 의해 정량 분석하고, 내독소 활성은 LAL로 분석하였다. 모두의 경우에, 주입 단백질의 약 1/3만이 회수되었고, 폴리믹신 처리된 단백질은 유의한 내독소 오염원 (약 7000 EU/mg의 pMBot)을 보유하였다.
발열원 제거 실험은 정제된 pMal-c 단백질 제제를 독립적으로 사용하여 반복하였고, 유사한 결과를 얻었다. 이 연구 결과로부터, 유의한 수준의 내독소가 아밀로스 수지를 사용하여 MBP 융합 단백질과 공정제된다는 결론을 얻었다. 더우기, 내독소는 폴리믹신 처리에 의해 쉽게 제거될 수 없다.
이 결과는 융합 단백질 상의 MBP 서열의 존재가 pMBot 단백질 제제로부터 내독소의 제거를 어렵게 한다는 것을 시사한다.
b) MBP가 없는 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질의 생성
상기 섹션 (a)에서, pMBot 융합 단백질을 오염 내독소로부터 쉽게 정제될 수 없음이 입증되었다. MBP 표지가 없는 용해성 보툴리누스 C 단편 단백질의 발열원이 없는 (예를 들어, 내독소가 없는) 제제를 생성하는 능력을 하기에 조사하였다. pMBot 발현 구성체를 구성하여 MBP 및 보툴리누스의 C 단편 간에 존재하는 조작된 펙터 Xa 절단 부위를 이용하여 융합 단백질을 절단하여 MBP 표지로부터 보툴리누스의 C 단편의 정제를 용이하게 하였다. 펙터 Xa 절단을 하기와 같이 수행하였다.
펙터 Xa(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 다양한 완충 조건 [예를 들어, PBS-NaCl(0.5 M NaCl를 함유하는 PBS), 0.2% 트윈 20을 함유하는 PBS-NaCl, PBS, 0.2% 트윈 20을 함유하는 PBS, PBS-C (2 mM CaCl2를 함유하는 PBS), 0.1 또는 0.5% 트윈 20를 함유하는 PBS-C, 0.1 내지 0.5% NP-40를 함유하는 PBS-C, 0.1 또는 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS-C, 0.1% 나트륨 데옥시콜레이트를 함유하는 PBS-C, 0.1% SDS를 함유하는 PBS-C]에서 pMBot 단백질(0.1-1.0% 펙터 Xa/pMBot 단백질 비율을 사용)에 가하였다. 절단된 펙터 Xa를 실온에서 12-72시간 동안 인큐베이션하였다.
실시예 22에 기재된 바와 같이, 절단 정도를 변성 SDS-PAGE 겔 상에서 전기 영동을 수행한 후, 단백질의 웨스턴 블롯 또는 쿠마시 블루 염색으로 평가하였다. 절단 반응 (및 비절단된 pMBot 단백질의 대조 시료)을 마이크로퓨즈로 2분 동안 원심분리하여 겔 상에 시료를 로딩하기 전에 불용성 단백질을 제거하였다. 펙터 Xa 처리된 시료를 동일 겔 상의 절단되지 않고 원심분리되지 않은 pMBot 시료와 비교하였다. 이 분석 결과는 하기에 요약하였다.
1) 비절단된 대조 시료를 사용할 때에도, 대부분 (약90%)의 pMBot 단백질을 원심분리에 의해 제거할 수 있었다. 이는 pMBot 융합 단백질이 완전히 용해성은 아니라는 것을 나타낸다 (즉, 용액으로서 보다는 현탁액으로서 존재함) [이 결과는 최고 친화성 정제된 pMBot 단백질이 4℃에서 장기간 (2주 이상) 저장 후 침강되는 현상과 일치한다. 또한, 유발된 pMBot 단백질 중의 대부분 (즉, 75%)은 유발된 이. 콜라이를 초음파 처리 및 정화한 후 펠렛으로 남았다. 이 불용성 펠렛을 PBS에 재현탁시킨 후, 초음파 처리하여 펠렛 중 불용성 pMBot 단백질의 부분적 용해를 초래하였다].
2) 완전한 용액 형태의 pMBot 단백질의 부분 (약 10%의 pMBot 단백질)은 펙터 Xa에 의해 완전히 절단되나, 절단된(방출된) 보툴리누스의 C 단편은 절단된 MBP 만이 용액에 완전히 잔류하는 정도로 비교적 불용성이다.
3) 상기 반응 조건은 효과적 절단을 감소시키지 않으면서 용해도를 증가시키지 못했다. 절단된 보툴리누스의 C 단편을 효과적으로 용해시키는 조건은 밝혀지지 않았다.
4) 펙터 Xa 절단을 위해 사용된 완충액 중 0.1% SDS의 사용은 pMBot 단백질(모든 pMBot 단백질은 용해성임)의 용해도를 증진시켰다. 그러나, SDS의 존재는 펙터 Xa에 의한 융합 단백질의 절단을 모두 막았다.
5) 절단 반응물로부터 펠렛화된 단백질의 분석은 모든 전체 길이의 pMBot 단백질 (즉, 절단되지 않음) 및 절단된 보툴리누스의 C 단편 단백질이 인큐베이션되는 동안 침강되는 것을 관찰하였다.
이 결과는 pMBot 융합 단백질의 절단 후, 용해성 보툴리누스의 C 단편 단백질의 정제가 pMBot 단백질 및 절단된 보툴리누스의 C 단편 단백질의 불용성으로 인해 악화됨을 입증한다.
(c) 다양한 발현 벡터를 이용한 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질의 발현
보툴리누스의 C 단편의 용해도가 C 단편 단백질을 천연 단백질, N-말단 His-표지된 단백질로서, 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)와 융합체로서 발현시킴으로써 증진되는지를 측정하기 위하여, 대체 발현 플라즈미드를 구성하였다. 이 발현 구성체를 실시예 22의 방법을 이용하여 생성하였다. 도 27은 하기에 기재될 벡터의 개략도를 제공한다.
도 27에서, 하기 약자를 사용한다. pP는 pET23 벡터를 말한다. pHIS는 pETHisa 벡터를 말한다. pBlue는 pBluescript 벡터를 말한다. pM은 pMAL-c 벡터를 말하고, pG는 pGEX3T 벡터를 말한다(실시예 11에 기재됨). 실선은 씨. 보툴리누스 C 단편 유전자 서열을 나타내고, 검정색 타원은 MBP를 나타내고, 음영이 있는 타원은 GST를 나타내고, "HHHHH"는 폴리-히스티딘 표지를 나타낸다. 도 27에서, 제한 효소 이름이 괄호 내에 제시된 경우, 이는 제한 부위가 구성되는 동안 파괴됨을 나타낸다. 별표가 있는 제한 효소 이름은 제한 부위가 클로닝 접합점에서 재창출됨을 나타낸다.
i) pPBot의 구성
씨. 보툴리누스 C 단편을 천연 (융합되지 않은) 단백질로 발현시키기 위하여, pPBot 플라즈미드 (도 27에서 대략적으로 도시됨)를 하기와 같이 구성하였다. pAlterBot 중 존재하는 C 단편 서열 (실시예 22)를 NcoI 및 HindIII로 pAlterBot를 소화시킴으로써 제거하였다. NcoI/HindIII C 단편 삽입물을 NcoI 및 HindIII로 소화된 pETHisa 벡터 (실시예 18b에 기재됨)에 리게이션하였다. 이 리게이션은 보툴리누스의 C 단편의 NcoI-코딩된 메티오닌이 개시 코돈이고, 천연 보툴리누스의 C 단편의 발현을 지시하는 발현 구성체를 생성하였다. 이 리게이션 생산물을 사용하여 수용성 (competent) BL21(DE3)pLysS 세포(노바겐)를 형질전환하였다. 재조합 클론을 제한 맵핑으로 동정하였다.
ii) pHisBot의 구성
재조합 단백질의 아미노 말단에 폴리-히스티딘 표지를 함유하는 씨. 보툴리누스 C 단편을 발현시키기 위하여, pHisBot 플라즈미드 (도 27에 개략적으로 도시됨)를 하기와 같이 구성하였다. pAlterbot로부터의 NcoI/HindIII 보툴리누스 C 단편 삽입물을 NheI 및 HindIII로써 소화된 pETHisa 벡터내로 리게이션하였다. (C 단편 삽입물 상의) NcoI 및 (pETHisa 벡터 상의) NheI 부위는 클레노우 단편을 사용하여 리게이션되기 전에 채워진 후, 이 부위는 평활 말단 리게이션된다(NdeI 부위는 예견된 대로 클론 접합점에서 재생된다). 리게이션 생산물을 사용하여 수용성 BL21(DE3)pLysS 세포를 형질전환하고, 재조합 클론을 제한 맵핑으로 동정하였다.
생성된 pHisBot 클론은 MetGlyHisHisHisHisHisHisHisHisHisHisSerSer GlyHisGluGlyArgHisMetAla (SEQ ID NO: 24)의 서열을 갖고, 보툴리누스의 C 단편 유전자에 의해 코딩되는 아미노산에 밑줄을 그었고, 아미노산에 의해 코딩된 벡터는 평이한 유형으로 나타나는 히스티딘-표지된 N-말단 연장부를 갖는 보툴리누스의 C 단편 단백질을 발현시켰다. pETHisa 벡터에 존재하는 pHisBot 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 25에 나타난다. pHisBot 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 26에 나타난다.
iii) pGBot의 구성
보툴리누스의 C 단편 단백질을 pGBot 플라즈미드를 구성함으로써 글루타티온-S-트랜스퍼라제 단백질과의 융합체로서 발현시켰다 (도 27에 대략적으로 도시됨). 이 발현 구성체는 pBlueBot (실시예 22)에 존재하는 NotI/SalI C 단편 삽입물을 SmaI 및 Xhol로 소화된 pGEX3T 벡터내로 클로닝하여 생성하였다. 리게이션하기 전에 클레노우 단편을 사용하여 NotI 부위(보툴리누스의 단편 상에 존재)를 평활하게 만들었다. 리게이션 생산물을 사용하여 수용성 BL21 세포를 형질전환시켰다.
상기 구성체 완결성을 확인하기 위하여 상기 발현 구성체를 각각 제한 소화에 의해 시험하였다.
pPBot[BL21(DE3)pLysS 숙주], pHisBot[BL21(DE3)pLysS 숙주] 및 pGBot (BL21 숙주)의 대규모 (1ℓ) 배양물을 2X YT 배지에서 증식시키고, 실시예 22에 기재된 바와 같이 (0.8-1.0 mM IPTG를 사용하여) 3시간 동안 유발시켰다. 전체 단백질, 용해성 단백질 및 불용성 단백질 제제를 각각 대규모 배양물의 1㎖ 부분 시료로부터 제조하고 [윌리암스 등 (1994), 상기 문헌], SDS-PAGE로 분석하였다. 쿠마시 염색에 의해 기대하는 분자량의 현저한 불용성 밴드가 pGBot 시료 중에서 검출되는 반면에, 현저하게 유발된 밴드가 pPBot 또는 pHisBot 시료 중에서 검출되지 않았다. 대규모의 pGBot 배양물(PBS에 재현탁) 또는 대규모의 pHisBot 배양물 [노바겐 1X 결합 완충액(5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.9)에 재현탁] 용해성 용해물을 제조하고, 용해성 친화성 표지된 단백질을 하기와 같이 친화성 정제하는 데 사용하였다.
pGBot 용해물을 스미스 앤드 코르코란의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 28(1994), pp 16.7.1-16.7.7]에 기재된 바와 같이 글루타티온-아가로스 수지 (파마시아) 상에서 친화성 정제하였다. pHisBot 단백질을 His-결합 수지 (노바겐) 상에서 His-결합 완충액 장치 (노바겐)를 제조자의 지시에 따라 정확히 이용하여 정제하였다.
pGBot 및 pHisBot 단백질(비유발된, 유발된, 전체, 용해성 및 친화성 정제된 용리 단백질)의 정제된 시료를 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 전기영동 후, 단백질을 닭의 항-씨. 보툴리누스 A 유형 톡소이드 항체를 사용하여 쿠마시 염색 또는 웨스턴 블롯 검출에 의해 (실시예22에 기재된 바와 같이) 분석하였다.
이 연구는 사용된 조건 하에서 pHisBot 단백질이 용해성인 반면에, pGBot 단백질이 거의 전적으로 불용성임을 보여주었다. 이 첫번째 시도에서, 수율(면역반응성 보툴리누스 단백질의 대부분은 His-결합 수지에 결합되지 않음) 및 순도(보툴리누스 단백질은 총 용리된 단백질의 약 20%인 것으로 추정됨)에 있어서, pHisBot 단백질의 친화성 정제는 비효율적이었다.
d) 실질적으로 내독소 오염이 없는 용해성 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질의 정제
상기 연구는 pHisBot 단백질이 이. 콜라이에서 용해성 단백질로서 발현되는 것을 보여주었다. 그러나, 이 단백질을 His-결합 수지 상에서 친화성 정제하는 것은 매우 비효율적이었다. 용해성 pHisBot 단백질의 친화성 정제를 개선하기 위하여 (수율 및 순도 면에 있어서), 또 다른 폴리-히스티딘 결합 친화성 수지 (Ni-NTA 수지; 퀴아겐사)를 사용하였다. Ni-NTA 수지는 His-결합 수지보다 월등한 결합 친화성 (pH 8.0에서 Kd=1×10-13; 퀴아겐 사용자 지침서)를 갖는다고 보고되었다.
1ℓ의 2X YT 배양물로부터 유발된 용해성 용해물 (노바겐 1X 결합 완충액)을 상기와 같이 제조하였다. 간략히, pHisBot [B121(DE3)pLysS 숙주]의 배양물을 37℃에서 100 ㎍/ml 암피실린, 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 0.2% 글루코스를 함유하는 1ℓ의 2X YT 배양물에서 0.7의 OD600이 될 때까지 증식시켰다. IPTG를 1mM로 가하여 단백질 발현을 유발하였다. IPTG를 가한지 3시간 후, 세포를 15분 동안 빙수조에서 냉각시킨 후, JA10 로터 (베크만 사)에서 5000 rpm의 속도로 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 노바겐 1X 결합 완충액 (5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.9)에 총용적이 40 ml이 되도록 재현탁하고, 두개의 35 ml 오크릿지 튜브로 옮기고, -70℃에서 1시간 이상 동결시켰다. 튜브를 해동하고, 세포를 얼음 위에서 초음파 처리 (전력 세팅이 6-7로 맞춰진 브란슨 소니파이어 450을 4 X 20초 동안)로 용해시켰다. 현탁액을 JA-17 로터 (베크만 사)에서 9,000 rpm의 속도로 20분 동안 원심분리하여 정화하였다.
용해성 용해물을 0.1% NP40에 넣은 후, 4℃에서 1시간 동안 교반하여 7 ml의 Ni-NTA 수지:결합 완충액의 1:1 슬러리에 뱃치 흡수시켰다. 슬러리를 내부 직경이 1 또는 2.5 ㎝인 칼럼 (바이오라드)에 부어넣었다. 칼럼을 0.1% NP40을 함유하는 15 ml의 노바겐 1X 완충액, 15 ml의 노바겐 1X 결합 완충액, 15 ml의 세척 완충액 (60 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.9) 및 15 ml의 NaHPO4 세척 완충액 (50 ml NaHPO4, pH 7.0, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤)의 순서로 세척하였다. 결합된 단백질을 용리 완충액 (50 mM NaHPO4, pH 4.0, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤)을 사용하여 수지의 프로톤화에 의해 용리하였다. 용리된 단백질을 4℃에서 보관하였다.
총 단백질, 용해성 단백질 및 용리된 단백질을 SDS-PAGE로 분리해냈다. 단백질 시료를 실시예 22b에 기재된 전기영동에 사용하기 위해 제조하였다. 이중 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분리된 단백질들을 가시화하고, 씨. 보툴리누스 A 유형 독소 반응성 단백질을 실시예 22b에 기재된 웨스턴 블롯 분석법으로 검출하였다. 쿠마시 염색된 겔을 도 28에 도시하였다. 도 28에서, 하기 시료를 12.5% 아크릴아미드 겔 상에 로딩하였다. 레인 1-4는 각각 총 단백질, 용해성 단백질, Ni-NTA 칼럼의 용리액 중 존재하는 용해성 단백질 및 친화성 정제된 pHisBot 단백질 (즉, 프로톤화에 의해 Ni-NTA 수지로부터 방출된 단백질)을 각각 함유하였다. 레인 5는 고분자량 단백질 마커 (바이오라드사)를 함유하였다.
pHisBot 단백질의 정제는 pHisBot 플라즈미드를 함유하는 BL21(DE3)pLysS 세포의 1ℓ 출발 배양물로부터 7 mg의 친화성 정제된 단백질 수율을 얻었다. 정제된 pHisBot 단백질의 수율은 유발된 배양물 중 총 단백질, 용해성 단백질의 약 0.4%였다. SDS-PAGE에 의해 정제된 pHisBot 단백질의 분석은 약 90-95%의 단백질이 예견된 분자량(50 kD)의 단일 밴드 (도 28)로서 나타났다. 이 50 kD 단백질 밴드는 항-씨. 보툴리누스 A 유형 독성 항체와 면역 반응하였다. 단백질 제제의 흡광 계수는 1 mg/ml 용액 당 1.4 (피얼스 BCA 분석법 사용) 또는 1.45 (로우리 분석법 사용)의 OD280로 측정되었다.
pH가 중성화된 용리된 pHisBot 단백질 시료를 KB 803 HPLC 칼럼(쇼덱스) 상에서 분리하였다. 비록 His-표지된 단백질은 크기 칼럼에 의해 보유되지만(아마도 단백질 고유의 금속 결합능에 기인함), pHisBot 단백질의 상대적 이동성은 용액 중 비응결성 단백질에 대해 기대했던 바와 일치하였다. 대부분의 유발된 pHisBot 단백질을 상기 사용한 증식 및 용해 조건 하에서 측정한 결과 용해성이었다(90%를 초과하는 pHisBot 단백질을 pHisBot 플라즈미드를 함유하는 BL21(DE3)pLysS로부터 제조된 총 단백질 시료 및 용해성 단백질 시료에서 발견되는 pHisBot 단백질의 농도와 비교하여 용해성으로 확인되었다). 원심 분리 후 얻은 시료의 SDS-PAGE 분석물을 -20℃에서 더 보관하고, 2회 이상의 동결 및 해동으로 (침강으로 인한) 단백질 손실이 일어나지 않았다는 것은 pHisBot 단백질이 용리 완충액 (즉, 50 mM NaHPO4, pH 4.0, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤)에서 용해성이라는 것을 의미한다.
(pH 중화 후) LAL 분석법 (어소시에이트 오브 케이프 코드 사)을 사용한 친화성 정제된 pHisBot 제제에서 내독소 오염원의 측정에서는 유의한 내독소 오염원이 검출되지 않았다. 제조자의 지시에 따라 종말점 색소체 형성 방법 (디아조-커플링 없이)을 사용히여 분석을 수행하였다. 이 방법은 0.03 EU/㎖ (EU는 내독소 단위) 이상의 내독소 농도를 검출할 수 있다. LAL 분석법은 50 mM NaHPO4, pH 4.0, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤 중 0.5 ㎎ pHisBot 단백질을 함유하는 0.5 ㎖의 용액을 사용하여 0.5 ㎖의 시료 중에서 30-60 EU를 검출하였다. 따라서, 친화성 정제된 pHisBot 제제는 60-120 EU/㎎의 단백질을 함유하였다. 비경구적 제약 투여를 위한 FDA 지침에 따라 5 EU/㎏ 체중 미만으로 함유하는 조성물이 사람에게 투여되는 것을 요구하였다(평균 사람 체중은 70㎏이고, 따라서 비경구적 투여량으로 349 EU 유닛 이하가 수송될 수 있다). 매우 소량의 단백질을 백신 제제로 투여하기 때문에 (일반적으로 10-500 ㎍ 범위의 단백질), 60-120 EU/㎎ 단백질을 함유하는 친화성 정제된 pHisBot 단백질의 투여는 허용가능한 내독소 적재량의 소량 만이 수송될 것이다. 예를 들어, 단백질 제제는 60 EU/㎎ 단백질을 함유하는 10-500 ㎍의 정제된 pHisBot을 70㎏의 사람에게 투여하는 것은 0.6 내지 30 EU만이 주입되는 결과를 초래한다 [즉, 비경구적 투여량 당 0.2 내지 8.6%의 최대 허용가능한 내독소 적재(5 EU/㎏ 체중 미만)].
상기 결과는 내독소 (LPS)가 상기 정제 과정을 사용하여 pHisBot 단백질과 공정제되지 않는다는 것을 입증하였다. 낮은 수준의 내독소 (2 EU/㎎ 이하의 재조합 단백질)를 함유하는 재조합적으로 생산된 pHisBot 단백질의 제제는 Ni-NTA 칼럼을 OD280이 기저 수준으로 될 때까지 (즉, UV-흡수 물질이 칼럼에서 더 이상 용리되지 않을 때까지) 세척 완충액으로 세척함으로써 생산될 수 있다.
상기 결과는 실질적으로 내독소가 제거된 용해성 보툴리누스의 C 단편 단백질의 생산 및 정제 방법을 예시하였다.
실시예 25
pHisBot 단백질의 발현 및 정제의 최적화
실시예 24d에서의 결과는 pHisBot 단백질이, 이. 콜라이에서 용해성 단백질로서 생산되고, 발열원 활성이 제거되도록 정제될 수 있는 백신으로서, 우수한 후보자임을 입증하였다. pHisBot 단백질의 발현 및 정제를 최적화하기 위하여, 다양한 증식 및 정제 조건을 시험하였다.
a) 증식 매개 변수
i) 숙주 균주
용해성 pHisBot 단백질의 생산 시에 이용된 숙주 균주의 영향을 관찰하였다. 대규모의 pHisBot 단백질 정제를 BL21(DE3)pLysS 숙주보다는 BL21(DE3)(노바겐사)를 사용하여 (실시예 24d에서 기재한 바와 같이) 수행하였다. BL21(DE3) 숙주 중 pLysS 플라즈미드의 결실은 플라즈미드의 T7-lac 프로모터의 탈억제에 기인한 높은 수준의 발현을 초래하였다. 그러나, 실시예 24d에 기재된 바와 동일한 조건 하에서 정제되는 경우, 친화성 정제된 용해성 재조합 단백질의 수율은 매우 낮았다(약 600 ㎍/ℓ 배양물). 이 결과는 BL21(DE3) 숙주에서의 발현이, 유발된 BL21(DE3) 배양물로 부터 제조된 단백질의 SDS-PAGE 분석법에 의해 나타난대로(도 29, 레인 1-7 하기됨), pHisBot 단백질을 불용성 봉입체로서 매우 높은 수준으로 발현시킨다는 사실에 기인한다. 이 결과는 pHisBot 단백질이 이. 콜라이 세포에 선천적으로 독성이고, 적절한 프로모터/숙주 배합물을 사용하여 높은 수준으로 발현시킬 수 있음을 입증하였다.
도 29는 pHisBot 플라즈미드를 함유하는 BL21(DE3) 세포로부터 제조된 추출물을 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔 (12.5% 아크릴아미드)상에서 로딩한 것이다. 각 레인에 2.5 ㎕ 단백질 시료와 2.5 ㎕의 2X SDS 시료 완충액을 혼합하여 로딩하였다. 이 시료를 상기 실시예 22b에서와 같이 취급하였다. 하기 시료를 겔에 가하였다. 레인 1-7은 BL21(DE3) 숙주로부터 단리된 단백질을 함유하였다. 레인 8-14는 BL21(DE3)pLysS 숙주로부터 단리된 단백질을 함유하였다. 총 단백질은 레인 1, 2, 4, 6, 8, 10 및 12에 로딩하였다. 용해성 단백질을 레인 3, 5, 7, 9, 11 및 13에 로딩하였다. 레인 1은 비유발된 숙주 세포로부터의 단백질을 함유하였다. 레인 2-13은 3시간 동안 유발된 숙주 세포로부터의 단백질을 함유하였다. IPTG를 가하여 최종 농도가 0.1 mM (레인 6-7), 0.3 mM (레인 4-5) 또는 1.0 mM (레인 2, 3, 8-13)가 되도록하였다. 배양물을 LB 브로쓰 (레인 8-9), 2X YT 브로쓰 (레인 10-11) 또는 터리픽(terrific) 브로쓰 (레인 1-7, 12-13)에서 증식시켰다. 레인 3,5 및 7에서 관찰된 pHisBot 단백질은 각각 레인 2, 4 및 6로부터 넘친 불용성 단백질이었다. 고분자량 단백질 마커 (바이오라드사)를 레인 14에 로딩하였다.
다양한 발현 조건을 시험하여 BL21(DE3) 숙주가 용해성 pHisBot 단백질을 적절히 높은 수준(즉, 약 10 ㎎/㎖)으로 발현시키는데 사용될 수 있는지를 측정하기 위해 시험하였다. 변경된 조건은 온도 (37 또는 30℃에서 증식), 인큐베이션 배지 (2X YT, LB 또는 터리픽 브로쓰) 및 유발 수준 (0.1, 0.3 또는 1.0 mM IPTG)였다. 이 변수들의 모든 배합을 시험하고, 유발 수준 및 용해도를 총 추출물 및 용해성 추출물의 SDS-PAGE 분석법으로 평가하였다[윌리암스 등의 상기 문헌 (1994)에 기재된 바대로 1 ㎖ 시료로부터 제조].
모든 배양물을 15 ㎖ 튜브 (팔콘 #2057)에서 증식시켰다. 모든 증식 배지를 적절한 온도에서 밤새 예비 가온하였고, 100 ㎍/㎖ 암피실린 및 0.2% 글로코스로 보충하였다. 터리픽 브로쓰는 12 g/ℓ 박토-트립톤, 24 g/ℓ 박토-이스트(효모) 추출물, 및 0.17 M KH2PO4, 0.72 M K2HPO4를 함유하는 100 ㎖/ℓ의 용액을 함유하였다. 배양물은 회전기 위의 인큐베이션기에서(통기를 위하여) 약 0.4의 OD280가 될때까지 증식시키고, IPTG를 첨가하여 유발하였다. 모든 경우에, 온도, 배지 또는 유발물질의 농도에 관계없이 불용성 pHisBot 단백질의 높은 수준의 발현을 관찰하였다.
23℃에서 증식한 2X YT 배양물 상에서 다양한 IPTG 농도 변화 효과를 관찰하였다. IPTG를 가하여 최종 농도가 1 mM, 0.1 mM, 0.05 mM 또는 0.01 mM가 되도록 가하였다. 이 온도에서, 1 또는 0.1 mM IPTG의 존재 하에 유사한 수준의 pHisBot 단백질이 유발되었고, 이 발현 수준은 더 높은 온도에서 관찰된 것보다 낮았다. 유발된 단백질 수준은 (23℃에서 1.0 및 0.1 mM IPTG 유발에 비해) 0.05 mM IPTG에서 감소되고, 0.01 mM IPTG에서 사라졌다. 그러나, 유발된 pHisBot 단백질이 이 숙주에서 용해성임을 관찰한 조건은 없었다. 따라서, 비록 발현 수준이 (BL21(DE3)pLysS 숙주와 비교하여) BL21(DE3) 숙주에서 월등하더라도, 이 숙주에서 용해성 단백질 생산을 용이하게 하는 조건은 확인하지 못했다.
이 결과는 용해성 pHisBot 단백질의 생산이 BL21(DE3)pLysS 숙주를 T7-Lac 프로모터와 결합하여 사용하였을 때 획득되었음을 입증하였다.
ii) 다양한 온도, 배지 및 IPTG 농도, 및 유발 기간의 효과
pHisBot 발현 구성체로부터 재조합 보툴리누스 단백질의 C 단편의 (BL21(DE3)pLysS 숙주에서) 발현 시에 다양한 배지 중 숙주 세포의 증식 효과를 관찰하였다. pHisBot 플라즈미드를 함유하는 BL21(DE3)pLysS 세포를 37℃에서 LB, 2X YT 또는 터리픽 브로쓰에서 증식시켰다. 3시간의 유발 기간 동안 1 mM IPTG를 사용하여 세포를 유발하였다. pHisBot 단백질의 발현은, 세포가 2X YT 브로쓰에서 증식할 때 가장 높은 것으로 관찰되었다 (도 29, 레인 8-13).
이어서, 세포를 30℃에서 2X YT 브로쓰에서 증식시키고, IPTG를 1.0, 0.3 또는 0.1 mM로 변화시키고, 유발 기간은 3 또는 5시간이었다. pHisBot 단백질의 발현은 3개의 유발물질 농도에서 모두 유사하였고, 유발된 단백질의 농도는 3시간 유발와 비교하여 5시간 유발된 후에 더 높았다.
pHisBot 단백질의 발현을 위한 최적 조건을 사용하여, 대규모의 pHisBot 단백질 정제를 위한 충분한 물질을 제공하기 위하여 대규모의 배양물을 증식시켰다. 세개의 1ℓ 배양물을 100 ㎍/㎖ 암피실린, 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜 및 0.2% 글루코스를 함유하는 2X YT 배지에서 증식시켰다. 배양물을 30℃에서 증식시키고, 1.0 mM IPTG로 5시간 동안 유발하였다. 배양물을 수확하고, 용해성 용해물을 실시예 18에 기재된 바와 같이 제조하였다. 용해성 용해물이 1시간 보다는 3시간 동안 배치 흡수된 점을 제외하고는 실시예 24d에 기재된 바와 같이 대규모의 정제를 수행하였다. 최종 수율은 13 ㎎ pHisBot 단백질/ℓ 배양물이었다. pHisBot 단백질은 총 용해성 단백질의 0.75%였다.
상기 결과는 용해성 pHisBot 단백질이 생산되는 증식 조건을 입증하였다(즉, BL21(DE3)pLysS 숙주, 30℃에서 2X YT 배지, 5시간 동안 1.0 mM IPTG를 사용).
b) 정제 매개변수의 최적화
정제 조건의 최적화를 위하여, 상기한 바와 같이 대규모의 배양물 (3 × 1ℓ)를 30℃에서 증식시키고, 1 mM IPTG로 5시간 동안 유발하였다. 실시예 24d에 기재된 바와 같이 배양물을 풀링하고, 원심 분리 병에 나누고, 냉각하고, 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 사용하기 전까지 -70℃로 동결하였다. 각 세포 펠렛은 출발 배양물의 1/3이었고, 하기된 각 최적 실험을 위하여 병을 사용하였다. 이는 각 실험에 사용된 공급 세균을 친화성 정제된 pHisBot 단백질의 수율을 상이한 최적화 실험들 간에 비교할 수 있는 것과 같이 표준화하였다.
i) 결합 특이성 (pH 프로톤화)
pHisBot 배양물의 용해물을 PBS(pH 8.0)에서 제조하고, 이코노 크로마토그래피 시스템 (바이오라드사)를 사용하여 0.2㎖/분 (3-4 칼럼 용적/시간)의 유속으로 PBS (pH 8.0) 중에서 평형화된 3 ㎖ Ni-NTA 칼럼에 가하였다. 칼럼을 PBS (pH 8.0)으로 용리액의 흡광 (OD280)이 기저 수준이 될 때까지 세척하였다. 이어서, 유속을 2 ㎖/분으로 증가시키고, 칼럼을 PBS (pH 7.0)으로 평형화하였다. 결합된 pHisBot 단백질을 칼럼으로부터 용리하기 위하여, pH 구배 (PBS 중 pH 7.0 내지 4.0)을 가하였다. 분획을 수거하고, 부분 시료를 SDS-PAGE 상에서 분리하였다. PAGE 겔을 웨스턴 블롯팅하고, pHisBot 단백질을 닭의 항-씨. 보툴리누스 A 유형 독소 항체를 사용하여 실시예 22에 기재된 바와 같이 검출하였다.
웨스턴 블롯 분석법으로부터, pHisBot 단백질이 pH 6.0에서 Ni-NTA 칼럼으로부터 용리되기 시작하는 것을 측정하였다. 이는 pH 5.9에서 His-표지된 단백질 모노머의 예견된 용리와 부합하였다.
이 결과는 pHisBot 단백질이 PBS 완충액 중 Ni-NTA 수지로부터 프로톤화 (방출)되는 pH가 pH 6.0임을 입증하였다.
ii) 결합 특이성 (이미다졸 경쟁)
칼럼에 결합된 pHisBot 단백질을 놔둔 채 음성 이. 콜라이 단백질이 Ni-NTA 칼럼으로부터 제거될 수 있는 정제 조건을 정의하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다. pHisBot 배양물의 용해물을 50 mM NaHPO4, 0.5 M NaCl (pH 7.0), 8mM 이미다졸에서 제조하였다. 이 용해물을 이코노 크로마토그래피 시스템 (바이라드사)를 사용하여 50 mM NaHPO4, 0.5 M NaCl (pH 7.0)로 평형화된 3 ㎖ Ni-NTA 칼럼에 가하였다. 0.2 ㎖/분의 유속 (3-4 칼럼 용적/시간)을 사용하였다. 칼럼을 50 mM NaHPO4, 0.5 M NaCl (pH 7.0)로 용리물의 흡광이 기저선이 될 때까지 세척하였다. 그런 후에 유속을 2 ㎖/분으로 증가시켰다.
칼럼을 이미다졸 단계 구배 (50 mM NaHPO4, 0.5 M NaCl (pH 7.0))로 용리하였다. 용리 단계는 20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 200 mM, 1.0 M 이미다졸이었고, 0.1 mM EDTA로의 세척(칼럼으로부터 니켈을 벗겨내고 임의의 잔사 단백질을 제거하기 위하여)이 수반되었다. 각 단계에서, 세척액은 OD280이 기저선이 될 때까지 계속하였다. 분획을 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 실시예 22에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯을 수행하고, 항-씨. 보툴리누스 A 유형 독소 항체를 사용하여 pHisBot 단백질을 검출하였다. 이중 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 각 분획에서 용리된 단백질을 검출하였다.
PAGE 분석의 결과는 대부분의 비특이적 결합 세균 단백질이 20 mM 이미다졸 세척액으로 제거되었고, 잔사 세균 단백질은 40 및 60 mM 이미다졸 세척액으로 제거되었음을 나타내었다. pHisBot 단백질은 100 mM 이미다졸에서 용리되기 시작하였고, 200 mM 이미다졸에서 정량적으로 용리되었다.
이 결과는 특이적으로 완충액 중 pHisBot 단백질을 보유하면서, 최적으로 칼럼으로부터 이. 콜라이 단백질을 제거하는 이미다졸 세척 강도의 윈도우를 정확하게 정의하였다. 이 결과는 pHisBot 단백질이 숙주 단백질의 오염 원이 제거되어 정제될 수 있는 조건을 제공하였다.
iii) 정제 완충액 및 최적화된 정제 프로토콜
용해성 pHisBot 단백질의 배치 정제를 위한 최적화된 프로토콜을 개발하는 동안 다양한 정제 매개변수를 시험하였다. 이 분석법의 결과를 하기에 요약하였다.
실시예 24에 기재된 바와 같이 여러 완충액을 사용하여 다른 완충액이 pHisBot 단백질의 Ni-NTA 칼럼에의 결합에 이용될 수 있는 지를 측정하기 위하여 배치 정제를 수행하였다. pHisBot 단백질의 Ni-NTA 수지에의 정량 결합을 트리스-HCl (pH 7.9) 또는 NaHPO4 (pH 8.0) 완충액에서 획득하였다. NaHPO4 완충액 중 pHisBot 단백질의 결합을 5 mM, 8 mM 또는 60 mM 이미다졸을 사용하여 억제하였다. 50 mM NaHPO4, 0.3 M NaCl (pH 3.5-4.0), 존재하는 또는 존재하지 않는 10% 글리세롤을 함유하는 완충액에서 결합된 pHisBot 단백질의 정량 용리를 얻었다. 그러나, 동결-해동 전후로 (-20℃에서 친화성 정제된 용리액의 수주간 보관 후) 용해성 친화성 정제된 pHisBot 단백질의 정량 용리는 글리세롤 함유 완충액을 사용하여 94%의 단백질이 회수되었으나, 글리세롤이 결핍된 완충액을 사용하는 경우에 68%의 단백질만이 회수됨을 나타내었다. 이는 용리된 단백질이 동결 온도 (예를 들어, -20℃)에서 보관되는 경우, 낮은 pH 완충액에서 글리세롤이 pHisBot 단백질의 용해도를 증진시킴을 입증하였다. NaH2PO4 완충액의 첨가로 인한 pH의 중화는 현저한 단백질 침강을 초래하지는 않았다.
3시간 후 배치 형식을 사용한 pHisBot 단백질의 정량 결합이 일어났으나(도 30), 4℃에서 1시간 후에는 일어나지 않았다(수지가 결합되는 동안 교반됨). 도 30은 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔 (7.5% 아크릴아미드)는 BL21(DE3)pLysS 숙주로부터 제조된 용해물로부터의 pHisBot 단백질이 정제되는 동안 단리된 단백질 시료를 함유하는 것을 보였다. 각 레인에 5 ㎕의 2X 시료 완충액과 혼합된 5 ㎕의 단백질 시료를 로딩하고, 상기 실시예 22b에 기재된 방법을 수행하였다. 레인 1은 고분자량 단백질 마커 (바이오라드사)를 함유하였다. 레인 2 및 3은 Ni-NTA 수지로부터 용리된 단백질을 함유하였다. 레인 4는 Ni-NTA 수지로 3시간 동안 인큐베이션한 후의 용해성 단백질을 함유하였다. 레인 5 및 6은 용해성 단백질 및 총 단백질을 각각 함유하였다. 도 30은 pHisBot 단백질이 완전히 용해성임을 입증하였다(유사량의 50 kD pHisBot 단백질이 모두에서 나타나는 레인 5 및 6과 비교하여, pHisBot 단백질의 상당량(20%를 초과)이 숙주 세포에서 부분적으로 불용성인 경우, 레인 5(용해성 단백질)와 비교하여 더 많은 pHisBot 단백질이 레인 6 (총 단백질)에서 나타난다). 도 30은 Ni-NTA 수지와 3시간 동안 배치 흡수된 후 pHisBot 단백질이 용해물로부터 완전히 제거됨을 보여주었다(레인 4 및 5와 비교하여).
Ni-NTA 수지와 His-표지된 단백질의 보고된 높은 친화성 작용(pH 8.0에서 Kd=1×10-13)을 수지-단백질 복합체를 결합된 단백질의 상당량의 방출 없이 조작할 수 있다는 것을 시사하였다. 재조합 단백질이 Ni-NTA 수지에 결합된 후, 수지-pHisBot 단백질 복합체는 매우 안정하고, 1600×g에서 2분 동안 반복된 수지의 원심분리 후에도 결합되어 있는 것으로 측정되었다. 이 원심분리 단계가 50 ㎖ 튜브 (팔콘)에서 수행하는 경우, 단단히 달라붙은 수지 펠렛이 형성되었다. 이는 상등액을 쏟아 버린 후, 펠렛을 세척 완충액에 재현탁시킴으로써 사용된 용해성 용해물을 제거를 가능하게 하였다. 또한, 세척은 원심분리로 수행하였다. 추가의 세척을 수행하는 능력은 용해물의 큰 용적의 배치 흡수 및 재조합 단백질의 수지에 대한 결합 후 단순히 원심분리에 의한 용해물의 제거를 위한 프로토콜의 개발을 가능하게하였다.
단순화되고 통합된 정제 프로토콜은 하기와 같이 개발되었다. 용해성 용해물을 유발된 세포 펠렛을 결합 완충액(50 mM NaHPO4, 0.5 M NaCl, 60 mM 이미다졸 (pH 8.0))에 재현탁시키고, 4×20초 동안 초음파 처리하고, 20분 동안 10,000×g에서 원심분리하여 제조하였다. NP-40을 0.1%로 가하고, Ni-NTA 수지 (결합 완충액으로 평형화됨)를 가하였다. 8ℓ의 1:1 슬러리(수지:결합 완충액)를 출발 배양물 1ℓ당 사용하였다. 혼합물을 4℃에서 3시간 동안 교반하였다. 슬러리를 내부 직경이 1 ㎝인 칼럼 (바이오라드사)에 부어넣고, 0.1% NP-40을 함유하는 결합 완충액으로 세척한 후, 결합 완충액이 기저선이 될 때 까지 세척하였다(이 단계는 별법으로 수지의 원심분리, NP-40을 함유하는 결합 완충액 중 재현탁, 이어서 원심분리 및 결합 완충액 중 재현탁이 수반되어 수행될 수 있다). 이미다졸을 50 mM NaHPO4, 0.3 M NaCl (pH 7.0)으로 수지를 세척하여 제거하였다. 수지에 결합된 단백질을 감소된 pH (pH 3.5-4.0)을 갖는 동일 완충액(50 mM NaHPO4, 0.3 M NaCl)을 사용하여 용리하였다.
파일롯 정제를 이 프로토콜을 사용하여 수행하고, 18 ㎎/ℓ의 친화성 정제된 pHisBot를 얻었다. pHisBot 단백질은 SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색에 의해 추정된 바로는 90%의 순도를 초과하였다. 이는 용해성 친화성 정제된 pHisBot 단백질의 가장 높은 수율을 관찰하였고, 이 프로토콜은 각각 이미다졸 함유 결합 완충액 및 세척 완충액을 위한 요구치를 추정하였다. 또한, 재조합 pHisBot 단백질의 친화성 정제를 위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제공하기 위하여, 상기 결과는 pHisBot 단백질이 단리될 수 있는 다양한 정제 조건을 제공한다.
실시예 26
pHisBot 단백질은 효과적인 면역원이다
실시예 23에서, pMBot 단백질로 비강 면역시킨 후, 중화 항체가 랫트의 혈청에서 생성되는 것을 입증하였다. 그러나, pMBot 단백질은 쉽게 제거되지 않는 유의한 내독소와 공정제되는 것을 발견하였다. 대조적으로, pHisBot 단백질은 유의한 내독소 오염이 제거되어서 단리될 수 있고, 이로 인하여 pHisBot를 백신 생성에 대해 우수한 후보자로 만들었다. 백신으로서 pHisBot의 적합성을 측정하기 위하여, 마우스에서 pHisBot 단백질의 면역원성을 측정하고, pMBot 및 pHisBot 단백질의 상대적 면역원성의 비교를 하기와 같이 수행하였다.
8마리의 BALBc 마우스의 두 집단을 게르부 마우스엠디피(Gerbu GMDP) 보조제 (CC 바이오테크)을 사용하여 pMBot 단백질 또는 pHisBot 단백질로 면역시켰다. pMBot 단백질 (PBS 중 10 mM 말토오즈를 함유) 또는 pHisBot 단백질 (50 mM NaHPO4, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤, pH 4.0)을 게르부 보조제와 혼합하고, 마우스에 면역시키는데 사용하였다. 각 마우스에 0일에 100 ㎕ 항원/보조제 혼합물(50 ㎍ 항원 및 1 ㎍ 보조제)을 복강 내 투여하였다. 14 및 28 일째는 투여 경로가 근육 내라는 것을 제외하고는, 마우스를 상기한 바와 같이 추가 자극시켰다. 마우스를 77 일째에 방혈시키고, 항-씨. 보툴리누스 A 유형 독소 역가를 각 집단의 개개의 마우스로부터 수거된 혈청을 사용하여 (실시예 23에 기재된 바와 같이) 측정하였다. 결과는 표 41에 나타내었다.
| 면역전 | pMBot2 | pHisBot2 | ||||||||||
| 마우스 번호 | 시료 희석 | 시료 희석율 | 시료 희석율 | |||||||||
| 1:50 | 1:250 | 1:1250 | 1:6250 | 1:50 | 1:250 | 1:1250 | 1:6250 | 1:50 | 1:250 | 1:1250 | 1:6250 | |
| 1 | 0.678 | 0.190 | 0.055 | 0.007 | 1.574 | 0.799 | 0.320 | 0.093 | ||||
| 2 | 1.161 | 0.931 | 0.254 | 0.075 | 1.513 | 0.829 | 0.409 | 0.134 | ||||
| 3 | 1.364 | 0.458 | 0.195 | 0.041 | 1.596 | 1.028 | 0.453 | 0.122 | ||||
| 4 | 1.622 | 1.189 | 0.334 | 0.067 | 1.552 | 0.840 | 0.348 | 0.090 | ||||
| 5 | 1.612 | 1.030 | 0.289 | 0.067 | 1.629 | 1.580 | 0.895 | 0.233 | ||||
| 6 | 0.913 | 0.242 | 0.069 | 0.013 | 1.485 | 0.952 | 0.477 | 0.145 | ||||
| 7 | 0.910 | 0.235 | 0.058 | 0.014 | 1.524 | 0.725 | 0.269 | 0.069 | ||||
| 8 | 0.747 | 0.234 | 0.058 | 0.014 | 1.274 | 0.427 | 0.116 | 0.029 | ||||
| 평균 적정 농도 | 0.048 | 0.021 | 0.011 | 0.002 | 1.133 | 0.564 | 0.164 | 0.037 | 1.518 | 0.896 | 0.411 | 0.114 |
| 1 면역전 시료는 재조합 스타필로코커스 장독소 B (SEB) 항원으로 면역된 각 마우스로부터의 혈청을 함유하는 이중 웰의 두 세트로부터의 평균치이다. 이 항원은 면역학적으로 씨. 보툴리누스와 연관이 없고, 대조 혈청을 제공한다.2 이중 웰의 평균치 | ||||||||||||
표 41에서의 결과는 pMBot 및 pHisBot 단백질 모두가 비면역에서 면역 상태로 혈청 전환된 각 집단에서 마우스의 100%(8/8) 면역원임을 입증하였다. 또한, 결과는 항-씨. 보툴리누스 A 유형 톡소이드 IgG의 평균 역가가 pHisBot 단백질로 면역된 후, pMBot 단백질로 면역된 것에 비해, 2 내지 3배 높다는 것을 나타내었다. 이는 pHisBot 단백질이 pMBot 단백질에 비해 월등한 면역원일 수 있음을 시사하였다.
실시예 27
재조합 pHisBot 단백질로써의 면역은 중화 항체를 생성한다
실시예 26에서의 결과는 pHisBot 및 pMBot 단백질 모두가 면역된 숙주에서 높은 역가의 항-씨. 보툴리누스 A 유형 톡소이드 반응성 항체를 유발할 수 있음을 입증하였다. pHisBot 또는 pMBot 단백질로 면역된 마우스로부터의 면역 혈청의 씨. 보툴리누스 A 유형 톡소이드를 생체 내에서 중화시키는 능력을 실시예 23b에 기재된 마우스의 중화 분석법을 사용하여 측정하였다.
실시예 26에서, pMBot 단백질 또는 pHisBot 단백질로 면역된 두 집단의 BLABc 마우스를 77일째 방혈시킨 후, 다시 한번 추가 자극시켰다. 실시예 26에 기재되 바대로, pMBot 단백질 (10 mM 말토오즈를 함유하는 PBS에서) 또는 pHisBot 단백질 (50 mM NaHPO4, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤, pH 4.0)을 게루브 보조제와 함께 혼합하여 추가 자극을 수행하였다. 각 마우스에 100 ㎕의 항원/보조제 혼합물 (50 ㎍ 항원 및 1 ㎍ 보조제)을 복강 내로 투여하였다. 마우스를 추가 자극한지 6일 후 방혈시키고, 집단 내의 마우스로부터 혈청을 풀링하였다. 또한, 면역전의 마우스로 부터의 혈청을 수거하였다(이 혈청은 표 40에 각주된 혈청과 동일함).
풀링 또는 면역전 혈청에서 중화 항체의 존재를 100㎕의 풀링된 혈청과 혼합된 5 LD50 유닛의 A 유형 독소로 마우스를 공격(challenging)하여 검출하였다. 챌린지는 각 풀로부터 100 ㎕의 혈청과 100 ㎕의 정제된 A 유형 독소 표준물 (실시예 23b에서 기재된 바와 같이 제조된 50 LD50/㎖) 및 500 ㎕의 겔-인산염과 혼합하여 수행하였다. 혼합물을 30분 동안 실온에서 가끔씩 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 4마리 마우스에 혼합물(0.7 ㎖/마우스)을 복강 내로 투여하였다. 마우스를 72시간 동안 보투린 증상의 증후에 대해 관찰하였다. pHisBot 또는 pMBot 단백질로 면역된 랫트로부터의 혈청과 혼합된 독소를 수용한 마우스는 보툴리누스의 중독의 징후를 보이지 않았다. 대조적으로, 면역전 혈청을 수용한 마우스는 24시간 전에 죽었다.
이 결과는 씨. 보툴리누스 A 유형 독소를 중화시킬 수 있는 항체는 씨. 보툴리누스 C 단편 단백질 pHisBot 또는 pMBot을 면역원으로 사용하는 경우에 유발된다는 것을 입증하였다.
실시예 28
1870-2680, 1870-2190 및 1960-2680 인터벌을 함유하는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질의 발현 및 정제
상기 다른 이들은 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 항체를 인터벌 6 영역 내에 위치하는 재조합 폴리펩티드에 대해 햄스터를 활성적으로 면역시킴으로써 증가시켰다[리엘리(Lyerly), D.M. (1990) Curr. Microbiol. 21:29]. 리엘리 등에 의해 사용된 재조합 클론의 구조는 도 31에서 pUC1960-2680으로 개략적으로 도시하였다.
도 31에서, 하기 약자를 사용한다. pP는 pET23 벡터를, pM은 pMAL-c 벡터를, pGEX는 pGEX 벡터를, Trx는 티오레독신을, pUC는 pUC9 벡터를, A는 씨. 다이피셀 독소 A를 말한다. 숫자는 소정의 구성체에서 발현된 아미노산 인터벌을 말한다. 흑색 사각형은 코딩 영역을 나타내고, 흰색 사각형은 pUC1960-2680 구성체의 3' 말단에서 벡터 서열에 의해 코팅되는 lacZ 유전자의 α-펩티드 영역을 나타낸다. 흑색 타원은 MBP를 나타낸다. "HHH"는 폴리-히스티딘 트랙을 나타낸다. 열린 천연은 티오레독신을 나타낸다. 음영이 있는 타원은 GST를 나타낸다.
항체가 예방적으로 공급된 씨. 다이피셀 관련 질병(CDAD)의 햄스터 모델을 사용하여, 리엘리 등의 항체 (내부-인터벌 6; pUC1960-2680)는 씨. 다이피셀 감염에 대해 생존에 있어서 부분적으로만 햄스터를 방어할 수 있고(8마리 중 4마리가 생존), 더우기 이 항체들은 임의의 동물에서 설사를 예방하지 못하였다. 추가로, 내부 인터벌 6 항체들로 처리된 동물 [리엘리 등 (1990) 상기 문헌]은 처리를 하지 않는 경우 죽었다. 대조적으로, 실시예 16은 항-인터벌 6 항체의 수동적 투여(항-pMA 1870-2680)는 7마리의 동물 중 6마리에서 설사를 에방하고, 예방 처리 모델 시스템에서 CDAD에 기인한 사망을 완전히 예방하였다. 더우기, 항-인터벌 6 항체들의 수동적 투여는 장기간 치료를 제공하였다 (중대한 사고가 없다면 처리를 종결지을 수 있다).
리엘리 증의 항체는 CDAD에 대한 특정 방어를 제공하는 것으로 보고되는 반면, pUC1960-2680 구성체로부터 발현된 재조합 단백질의 완결성 및 순도는 보고되지 않았다. pUC1960-2680 구성체는 잠재적으로 pU69 벡터에서 씨. 다이피셀 독소 A의 1960-2680aa 인터벌을 발현시키고, 이 간격은 pMA1870-2680 클론 내에 존재한다(도 31 참조).
이 실시예는 (a) pUC1960-2680의 구성 및 발현된 단백질의 웨스턴 블롯 분석법에 의한 특징 규명, (b) pET 및 pMal 벡터에서 친화성 표지된 단백질로서 1960-2680 인터벌의 클로닝 및 발현, 및 (c) 1870-2680, 1870-2190 또는 1960-2680을 발현시키는 클론으로부터 용해성 MBP 표지된 단백질의 친화성 정제 및 특징 규명에 관한 것이다.
(a) pUC1960-2680의 구성 및 발현된 단백질의 웨스턴 블롯 분석법에 의한 특징 규명
pUC1960-2680 구성체는 38개의 반복 단위 중에서 33개를 코딩하는 2.1 kb의 씨. 다이피셀 독소 A 유전자 단편을 함유한다. 이 구성체는 리엘리 등에 의해 [(1990) Curr. Microbiol. 21;29] 항-씨. 다이피셀 독소 A 항체를 생성하기 위하여 사용된 동일 재조합 단백질을 제공하기 위하여 생산되었다. pUC1960-2680를 하기와 같이 구성하였다. 요약하여, 씨. 다이피셀 독소 A 반복 영역을 함유하는 2.1 kb PstI 단편을 pPA1100-2680(실시예 11)로부터 제거하여, PstI으로 소화되고 탈인산화된 pUC9로 클로닝되었다. 탈인산화 반응을 제조자(뉴잉글랜드 바이오랩)의 지시에 따라 송아지의 장 알칼리성 포스파타제 (CIP)를 사용하여 수행하였다. 제한 소화 및 CIP-처리 후에, 반응 생성물을 아가로스 겔 상에서 분리하고, 적절한 단편을 잘라낸 후, 혼합하고, 프레파 진(Prep-a-Gene) 장치 (바이오라드사)를 사용하여 정제하였다. 용리된 DNA를 리게이션하고, JM109 수용성 세포 내로 형질전환시키고, 재조합 클론을 단리하고, 분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 제한 효소에 의해 확인하였다. 플라즈미드 DNA를 퀴아 프렙 스핀 (QIA-prep spin) 플라즈미드 장치 (퀴아겐사)를 사용하여 단리하였다.
pUC1960-2680 구성체를 함유하는 JM109를 증식시키고, 유발하고, 총 추출물 및 용해성 추출물을 리엘리 등의 문헌[(1990) Curr. Microbiol. 21;29]에 기재된 바대로 제조하였다. 요약하여, 500 ㎖의 터리픽 브로쓰를 pUC1960-2680 (JM109에서)로 접종하고, 37℃에서 초기 정지기(0.8의 OD600)까지 증식시켰다. IPTG를 가하여 최종 농도를 1 mM로 되게하고, 배양물을 2시간 동안 유발하였다. 배양물에서 1㎖의 부분 시료를 IPTG를 가하기 전에 취하여, 비유발된 시료로 사용하였다. IPTG의 존재 하에 2시간 동안 증식시키 후, 배양물에서 1 ㎖ 부분 시료를 취하여, 유발된 시료로 사용하였다. 이 1 ㎖의 비유발된 시료 및 유발된 시료를 하기와 같이 시험하였다. 세균을 원심분리로 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 100 ㎕의 2X 시료 완충액 (0.125 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 2 mM EDTA 6% SDS, 20% 글리세롤, 0.25% 브로모페놀 블루; β-메르캅토에탄올을 사용하기 전에 5%로 가함)에 재현탁시켰다.
이어서, 잔사 배양물을 분석을 위한 총 추출물 및 용해성 추출물을 제조하기 위하여 처리하였다. 배양물을 500 ㎖ 원심분리 병에 나누었다. 병을 15분 동안 빙수조에서 냉각하고, 세포를 베크만 JA 10 로터에서 5,000 rpm의 속도로 원심분리하여 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 TBS (0.05 M 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.5)의 1/10 초기 인큐베이션 용적 (즉, 50 ㎖)에 재현탁시키고, 35 ㎖ 오크릿지 튜브에 나누었다. 라이소자임의 (TBS 중에서) 10 ㎎/㎖ 용액의 1 ㎖과 1/4 ㎖을 각 튜브에 가하고, 혼합물을 얼음 위에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 두개의 튜브를 -70℃에서 밤새 보관하였다. 유발된 배양물로 부터 두개의 튜브 중 하나를 해동하고, 빙수에서 20초간 4회초음파 처리하였다(5-6 레벨에 맞춰진 브란슨 소니파이어 모델 450). 시료를 9000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여(베크만 J2-21 로터), 0.45 ㎛ 필터를 통해 멸균된 용해성 용해물 필터에 의해 정화하였다. 추출물과 16 ㎕의 PBS 및 20 ㎕의 2X 시료 완충액을 혼합하여 전기영동을 위한 총 추출물 (원심분리 전) 및 용해성 (여과 멸균 후) 추출물을 제조하였다.
단백질 시료를 12.5% SDS-PAGE 겔 상에서 전기 영동으로 분리하고, 단백질을 쿠마시 블루 염색(모든 단백질을 검출) 및 염소의 항-독소 A 특이적 항체(테크랩스)를 이용하는 웨스턴 블롯 분석법(특이적 단백질을 검출)에 의해 검출하였다. 12.5% SDS-PAGE 겔에 단백질 시료를 로딩하였다. 전기영동 후, 겔을 두부분으로 나누었다. 반쪽을 쿠마시 블루로 염색하고, 다른 반쪽의 단백질은 웨스턴 블롯을 위한 고형 지지체로 옮겼다. 단백질 이동은 폰소 에스 (Ponceau S) 염색(실시예 12b에 기재됨)에 의해 확인되었다. 이어서, 블롯을 20℃에서 0.1% 트윈 20 (PBST) 및 5% 우유 (차단 완충액)을 함유하는 PBS 중에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 차단 완충액에서 친화성 정제된 염소의 항-씨. 다이피셀 독소 A 항체(테크 랩)의 1/1000 희석물을 함유하는 10 ㎖의 용액을 가하고, 블롯을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 블롯을 세척하고, 결합된 항-씨. 다이피셀 항체의 존재를 토끼의 항-염소 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트를 2차 항체로 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 검출하였다. 생성된 쿠마시 블루 염색된 겔 및 웨스턴 블롯을 도 32에 나타내었다.
도 32에서, 쿠마시 블루 염색된 겔을 좌측 (레인 1-5)에 나타내고, 웨스턴 블롯을 우측 (레인 6-9)에 나타내었다. 비유발된(U), 유발된 (I), 총(T), 용해성(S) 및 광범위한 분자량 마커 (M;바이오라드사)의 약자를 사용하였다. 분자량 마커의 크기는 레인 5의 우측의 숫자에 의해 표시된다. 도 32는 재조합 pUC1960-2680 단백질에 대한 목적하는 크기에 상응하는 유발된 밴드가 쿠마시 블루 염색에 의해 검출되지 않았음을 나타낸다. 그러나, 씨. 다이피셀 독소 A 반응성 물질의 웨스턴 블롯 검출은 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질의 전 길이에 대한 예견된 분자량을 갖는 우세하게 유발된 단백질 종을 나타내었다. 비록 특정 유발된 단백질이 용해성이더라도, 대부분의 단백질은 [레인 8(총 단백질) 및 9(용해성 단백질)에 존재하는 항체와 반응성인 단백질양을 비교하여] 불용성이다. 분해된 생산물이 비유발된(레인 6) 또는 유발된(레인 7) 인큐베이션 시료 중에서도 검출되기 때문에, pUC1960-2680에 의해 생산된 재조합 단백질도 명확하게 불안정하였다.
b) pET 및 pMal 벡터에서 친화성 표지된 단백질로서 1960-2680 인터벌의 클로닝 및 발현
상기한 바와 같이, pUC1960-2680 구성체에 의해 생산된 단백질은 불안정하였고(즉, 단백질 분해되기 쉬움), 더우기 친화성 표지가 결핍되었다. pUC1960-2680 단백질의 불안정성은 융합 단백질의 C 말단에서 lacZ 유전자의 α-펩티드의 존재에 기인할 수 있고, 융합 단백질 상에서 이 서열의 존재는 불안정한 단백질의 생산을 초래하는 것으로 공지되어 있다. pUC1960-2680 인터벌로 표시된 용해성이고 안정한 친화성 정제된 융합 단백질을 단리할 수 있는지를 측정하기 위하여, 하기 두 구성체를 만들었다. pPA1960-2680 구성체는 pET23c 벡터(노바겐사)에서 씨. 다이피셀 독소 A의 1960-2680 인터벌을 함유하였다. 벡터의 pET23 연속물은 삽입된 유전자가 융합 단백질의 C 또는 N 말단에서 폴리-히스티딘 표지 또는 트랙을 함유하는 융합 단백질로서 발현되게 하였다. pPA1960-2680 구성체는 씨. 다이피셀 독소 A 반복 영역을 C-말단 폴리-히스티딘 트랙을 함유하는 융합 단백질로서 발현시켰다. pMA1960-2680 구성체는 pMal-c 벡터(뉴잉글랜드 바이오랩)에서 씨. 다이피셀 독소 A의 1960-2680 인터벌을 함유하고, 융합 단백질의 N 말단에서 MBP를 함유하는 융합 단백질을 발현시켰다.
pPA1960-2680 구성체를 하기와 같이 제조하였다. 2.1 kb PstI 단편이 전사 방향과 반대편에 위치한 (벡터 상에서 LacZ 서열을 통한 전사 방향에 비해) pUC1960-2680 클론을 a)에 기재된 방법을 사용하여 단리하였다. 씨. 다이피셀 독소 A 삽입물을 BamHI 및 HindIII로 소화시켜서 절단하고, 삽입물을 a)에 기재된 바와 같이 BamHI 및 HindIII로 절단한 pET23c 벡터(노바겐사)로 클로닝하였다.
pMA1960-2680 구성체는 pPA1960-2680의 씨. 다이피셀 독소 A 반복 영역을 NheI-HindIII 단편으로서 XbaI(XbaI 말단은 NheI 말단과 상용성) 및 HindIII로 절단한 pMal-c 벡터로 클로닝하여 생성하였다.
두개의 플라즈미드로부터의 재조합 단백질의 발현을 BL21(DE3)pLysS(pPA1960-2680) 또는 BL21pLysS(pMA1960-2680) 숙주를 사용하여 30℃에서 증식된 작은 스케일 배양물에서 평가하였다. 인큐베이션 배지(2X YT, LB, 터리픽 배지) 및 유발물질 농도(0.1, 0.3 또는 1.0 mM IPTG)를 변형시켰다. 이 변수들의 모든 배합을 시험하였다[터리픽 브로쓰에서 단일 농도(1 mM)의 IPTG를 시험함]. 유발시에 발현된 재조합 단백질의 농도 및 재조합 단백질의 용해도를 총 추출물 및 용해성 추출물(실시예 25에 기재된 바대로 1㎖의 시료로부터 제조함)의 SDS-PAGE 분석법에 의해 평가하였다. 모든 배양물을 15㎖ 튜브(팔콘 2057)에서 증식시키고, 모든 인큐베이션 배지는 적절한 온도에서 밤새 예비가온시키고, 100 ㎍/㎖ 암피실린 및 0.2% 글루코스로 보충하였다. 배양물을 회전기 상의 인큐베이션기(통기를 위하여)에서 증식시켜 약 0.5 내지 0.7의 OD600으로 증식시키고, IPTG의 지정된 농도로 유발하였다.
모든 경우에, 사용된 브로쓰 또는 유발물질의 농도와 상관없이, 불용성 pPA1960-2680 단백질의 높은 수준의 발현을 관찰하였다. pMA1960-2680 단백질은 낮은 유발 물질 농도(즉, 0.1 및 0.3 mM IPTG)에서 2X YT 배지에서 생산된 용해성 단백질의 최대 수준으로, 모든 시험된 조건 하에서 부분적으로 용해성이었다.
이 결과는 pPA1960-2680 구성체 중 씨. 다이피셀 독소 A의 1960-2680 인터벌의 발현이 시험된 조건 하에서 불용성 재조합 단백질 생산을 초래함을 입증하였다. pMA1960-2680 구성체에서 이 인터벌의 발현은 특정 용해성 재조합 단백질의 발현을 가능하게 하였다.
c) 씨. 다이피셀 독소 A의 1870-2680, 1870-2190 또는 1960-2680 인터벌을 발현시키는 구성체로부터의 용해성 MBP-표지된 단백질의 친화성 정제 및 특징 규명
pMal-c 벡터(즉, 삽입이 결핍된 벡터)의 대규모(1ℓ) 배양물 및 하기 재조합 구성체 각각이 증식, 유발되고, 용해성 단백질 분획 pMA1870-2190(실시예 17), pMA1960-2680 (실시예 28b) 및 pMA1870-2680[실시예 11; 인터벌 6; 인터벌 6은 씨. 다이피셀 독소 A 단백질의 1873 내지 2684의 아미노산 잔기(SEQ ID NO: 29)를 함유]을 단리하였다. 대규모의 배양물을 32℃의 2X YT 브로쓰에서 증식시키고, 재조합 단백질 발현물을 0.6의 OD600에서 0.3 mM IPTG의 첨가로 유발하였다. 배양물을 4-5 시간 동안 유발한 후, 세포를 수확하였다. 용해성 단백질 추출물을 제조하고, 친화성 크로마토그래피를 수행하여 재조합 융합 단백질 (실시예 11d)를 단리하고, 상기한 바와 같이(실시예 11b) 쿠마시 염색 및 웨스턴 분석법으로 분석하였다.
요약하여, 용해성 추출물을 제조하고, PBS에서 아밀로스 수지 (뉴잉글랜드 바이오랩) 칼럼에 가하였다. 칼럼을 10 mM 말토오즈를 함유하는 PBS로 용리하였다. 단백질 수율은 각 재조합물에 대해서 출발 용적 1ℓ(즉, 1ℓ의 배양물) 당 40 ㎎이었다. 단백질 시료를 7.5% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동한 후, a)에 기재된 바와 같이 쿠마시 블루로 염색하고 웨스턴 블롯 분석법으로 분석하였다. 단백질 시료를 1㎕의 총(T) 단백질 또는 용해성(S) 단백질을 4㎕의 PBS 및 5 ㎕의 2X 시료 완충액, 또는 5㎕ 용리된(E) 단백질 및 5 ㎕의 2X 시료 완충액 또는 0.5 ㎕의 용리된 단백질, 4.5 ㎕의 PBS 및 5㎕ 2X 시료 완충액(1/10E)과 혼합하여 전기 영동에 사용하기 위하여 제조하였다. pMA1870-2680 및 pPA1870-2680 시료(실시예 11에서 기재된 봉입체 제제)도 겔 상에서 분리되었다. 시료를 95℃에서 5분 동안 가열한 후, 냉각하고, 7.5% SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 광범위한 영역의 분자량 단백질 마커(바이오라드사)도 로딩하여 확인된 융합 단백질의 분자량의 측정을 가능하게 하였다.
전기영동 후, 쿠마시 블루로 겔을 염색하여 단백질을 검출하거나 또는 단백질을 염소의 항-독소 A 항체(테크 랩)를 사용하는 웨스턴 블롯팅을 상기 a)에서와 같이 수행하였다. 생성된 겔 및 웨스턴 블롯은 도 33에 나타내었다.
도 33에서, 쿠마시 블루 염색된 겔은 좌측 (레인 1-10)에 나타내고, 웨스턴 블롯은 우측(레인 1'-10')에 나타내었다. 레인 1-10 및 1'-10'는 서로 거울상이고, 레인 1 및 1'는 pMA1870-2190(T), 레인 2 및 2'는 pMA1870-2190(E), 레인 3 및 3'는 pMA1960-2680(T), 레인 4 및 4'는 pMA1960-2680(S), 레인 5 및 5'는 pMA1960-2680(E), 레인 6 및 6'는 pMA1960-2680(1/10E), 레인 7 및 7'는 pMA1870-2680(E), 레인 8및 8'는 pMA1870-2680(1/10E), 레인 9 및 9'는 pPA1870-2680(N/C)(E) [pPA1870-2680(N/C)는 실시예 15 및 29d에 기재됨] 및 레인 10 및 10'는 분자량 마커를 함유한다.
도 33에 나타난 결과는 하기와 같다.
1) pMA1870-2190 단백질은 불안정하나, 사용된 증식 조건 하에서 적어도 부분적으로 용해성이었다. 그러나, 친화성 정제된 pMA1870-2190 제제는 상당 농도의 전 길이 융합 단백질을 함유한다(도 33, 레인 2).
2) pMA1960-2680 단백질은 부분적으로 용해성 (도 33의 레인 3' 및 4'에 비해서)이고, 친화성 정제된 단백질의 완결성 (도 33의 레인 5' 및 6')은 pMA1870-2190 제제(도 33, 레인 2)의 것과 견줄만하다.
3) 전길이 pMA1960-2680, pMA1870-2680 및 pMA1870-2680 단백질은 항-씨. 다이피셀 독소 A 항체와 결합하는 반면, 전 길이 pMA1870-2190 단백질은 그렇지 않다(그러나, pMA1870-2190의 더 작은 분해 산물은 도 33의 레인 1' 및 2'에 도시된 항체와 결합함). 이는 항체에 의해 밝혀진 에피톱프가 반복 영역의 C 말단에만 존재하거나, 또는 항체가 pMA1870-2190의 N-말단 단편과 형성할 수 없는 형태를 인지하는 것을 의미한다. 이 관찰은 씨. 다이피셀 독소 B 유전자 (pMB1750-1970)의 N-말단 단편과 실시예 19b(도 24)에서의 웨스턴 블롯 상에서 항-독소 B 항체(테크 랩)의 반응성의 결핍과 유사하다.
상기 결과는 1870-2190 및 1960-2680 인터벌로부터의 친화성 정제된 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질의 생산 방법을 제공한다. 이 결과는 리엘리 등의 문헌[(1990), Curr. Microbiol. 21:29]에 기재된 바에 따라 제조된 pUC1960-2680 구성체를 사용하는 경우에 얻은 것과 대조적이었다. pUC1960-2680 구성체에 의해 발현된 단백질은 주로 불용성이고, 재조합 단백질 상의 친화성 표지의 존재로 인하여 친화성 정제될 수 없었다.
실시예 29
용해성이고 실질적으로 내독소가 제거된 pPA1870-2680(N/C) 단백질의 정제
인간 백신으로 잠재적 사용을 위하여(즉, 활성 면역을 유발하기 위하여), 또는 인간의 수동 면역을 위한 방어 항체(항독소)를 유발하기 위한 숙주 동물에서 항원으로서, 단백질 항원은 1) 쉽게 정제되고, 2) 잘 특징규명되고, 순도가 높고, 3) 발열원이 적고 (사람 백신으로 사용되는 경우), 4) 면역원이고, 5) 방어 면역 반응을 유발할 수 있어야한다. 씨. 다이피셀 독소 A 반복 영역 항원의 경우에, 단백질은 용해성이고, 방어 반응을 유발할 수 있는 형태를 가정할 수 있어야한다. 실시예 17에 기재되 바와 같이, 불용성 단백질로서 봉입체 내부에 발현되는 pPA1870-2680(N/C) 단백질이 SDS와 용해된 후, 닭을 면역시키는데 사용되고, 방어 항-독소 A 항체를 생산하지 않았다.
이 실시예에서, 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질을 발현시키고, 백신 후보로서 상기한 영역을 사용하여 평가하였다. 이 실시예는 a) 친화성 정제된 pMA1870-2680 단백질의 백신 항원으로서의 유용성 평가, b) pGA1870-2680 단백질의 구성체, 정제 및 평가, c) 용해성 pPA1870-2680의 생산을 위한 프로토콜의 개발, d) pPA1870-2680(N)의 구성체 및 N, C 및 N/C His-표지된 1870-2680 단밸질의 대규모 정제, e) pPTrxA 1870-2680(N), (C) 및 (N/C)의 구성체, 및 N, C 및 N/C His-표지된 Trx1870-2680 단백질의 대규모 정제, f) pPA1870-2680 및 pPB1750-2360 단백질의 대규모의 친화성 정제 및 내독소 수준의 검출, 및 g) pPB1750-2360 (N/C)의 구성체, 대규모의 친화성 정제, 및 내독소 수준의 측정에 관한 것이었다.
a) 친화성 정제된 pMA1870-2680 단백질의 백신 항원으로서의 유용성 평가
비록 pMA1870-2680 단백질(실시예 11)이 쉽게 정제되고, 면역원성이고 방어 반응을 유발할 수 있는 것으로 보일지라도(실시예 17), 이 단백질의 백신으로서의 사용능은 친화성 정제된 단백질의 낮은 순도에 의해 제한된다(도 33, 레인 7' 및 8'). 친화성 정제된 단백질의 50%만이 전 길이 융합 단백질인 것으로 추정되었다. 친화성 정제된 제제 중 잔사 단백질은 주로 MBP가 단독으로, 오염원인 이. 콜라이 단백질 오염이 발견되었다.
친화성 정제된 pMA1870-2680 단백질이 백신 후보로 사용될 수 있을지를 평가하기 위하여, pMA1870-2680 단백질의 두개의 독립적으로 친화성 정제된 제제 중 내독소 함량을 측정하였다. 시료 중 발열원 함량을 리물러스 분석법 (LAL 장치; 어소시에이트 오브 케이프 코드)을 사용하여 실시예 24d에 기재된 바와 같이 분석하였다. 친화성 정제된 pMA1870-2680의 두 시료가 고농도의 내독소 (〉50,000 EU/㎎ 정제된 재조합 단백질)을 함유하는 것으로 발견되었다. 실시예 24 a 및 b에 나타난 바와 같이, 높은 내독소 적재를 측정하여 친화성 정제된 MBP 융합 단백질 또는 MBP 단독의 일반적 특징으로 발견되었다. 상기 결과는 현재의 정제 프로토콜을 사용하여, 친화성 정제된 MBP-씨. 다이피셀 A 융합 단백질을 백신 항원으로서 사용하기에 적합하지 않다는 것을 의미한다.
pMA1870-2680 발현 구성체를 구성하여 MBP 및 독소 A 단백질 도멘인의 사이에 위치한 엔지니어링된 펙터 Xa 절단 부위에서 융합 단백질을 절단하여 MBP 표지로부터의 독소 A 단백질의 정제를 용이하게 하였다. MBP 독소 A 단백질로부터 절단된 씨. 다이피셀 독소 A 단백질을 정제하여 실질적으로 내독소가 제거된 용해성 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질의 획득 가능성을 평가하였다. 펙터 Xa(뉴잉글랜드 바이오랩스)를 10 mM 말토오즈를 함유하는 PBS 중 친화성 정제된 pMA1870-2680 단백질 (0, 0.2, 0.5, 1.0 및 2.5% 펙터 Xa/pMA1870-2680 단백질 비율)에 가하고, 혼합물을 5.5 내지 20 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 절단 정도를 SDS-PAGE 겔 상에서 전기 영동한 후 쿠마시 블루 염색 단백질에 의해 평가하였다.
결과는 특정 절단이 20 시간 후 2.5% 펙터 Xa 시료에서 관찰되었으나, 절단은 부분적이었다. 이는 상기 시험된 반응 조건을 사용한 pMA1870-2680의 절단이 용해성이고 내독소가 제거된 씨. 다이피셀 독소 A 반복 단백질을 얻기 위한 효율적 정제 방법은 아님을 의미한다.
b) pGA1870-2680 단백질의 구성체, 정제 및 평가
대규모의 항원 생산의 수단으로서의 GST 함유 단백질의 평가를 용이하게 하기위하여, 씨. 다이피셀 독소 A 반복 영역을 GST와 융합체로서 발현시켰다. 씨. 다이피셀 독소 A 반복 영역은 SpeI를 사용하여 pPA1100-2680(실시예 11)의 절단하여 단리한 후, 클레노우 단편으로 처리하여 말단을 채우고, DNA는 XhoI로 소화되었다. SpeI(클레노우로 충전된)-XhoI 단편을 EcoRI(클레노우 충전된)-XhoI 절단된 pGEX3T 벡터(플라즈미드)로 클로닝하여 pGA1870-2680 발현 구성체를 얻었다.
대규모(1ℓ)의 pGA1870-2680의 2X YT 배양물[BL21 숙주 세포(노바겐사)에서 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 2X YT 배지에서 증식시키고, 실시예 28에서 기재된 바와 같이 30℃에서 3시간 동안 (1.0 mM IPTG를 사용하여) 유발하였다. pGA1870-2680의 대규모 배양물의 용해성 용해물 (PBS에 재현탁)을 제조하고, 용해성 친화성 표지된 단백질을 친화성 정제하는데 사용하였다. 수지에 대한 단백질 결합을 4℃에서 1시간 동안 수행한 점을 제외하고는 문헌[스미스 앤드 코르코란의 Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 28 (1994) pp 16.7.1.-16.7.7]에 기재된 바와 같이 pGA1870-2680 용해물을 글루타티온-아가로스 수지(파시아) 상에서 친화성 정제하였다.
요약하여, 1ℓ 배양물의 유발를 3시간 동안 수행한 후, 세포를 실온에서 5,000×g의 속도로 10분 동안 원심분리로 수거하였다. 세포 펠렛을 10 ㎖의 빙냉 PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 실시예 24d에 기재된 바와 같이 세포를 초음파 처리로 파괴하였다. 트리톤 X-100을 가하여 최종 농도가 1%가 되게하고, 시료를 잘 혼합하였다. 4℃에서 10,000×g의 속도로 5분 동안 시료를 원심분리하여 불용성 데브리스를 제거하였다. 상등액을 조심스럽게 제거하고, 1 ㎖의 글루타티온-아가로스 비드 (파시아사)의 50% 슬러리에 가하였다. 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 GST 표지된 융합 단백질이 수지에 결합되도록 하였다. 이어서, 글루타티온-아가로스 비드를 50 ㎖의 빙냉 PBS를 가하여 세척하고, 혼합하고, 실온에서 500×g의 속도로 10초 동안 원심분리하였다. 세척 단계를 두번씩 반복하였다(총 세번의 세척에 대해서). 수지를 1 ㎖의 빙냉 PBS에 재현탁시키고, 1.5 ㎖ 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 수지를 실온에서 500×g의 속도로 10초 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상등액을 제거하고, 융합 단백질을 1 ㎖의 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 5 mM의 환원된 글루타티온을 가하여 세척된 수지로부터 용리하였다. 튜브를 2분 동안 조심스럽게 혼합한 후, 실온에서 500×g의 속도로 10초 동안 원심분리하였다. 용리를 두번씩 반복하고, 상등액을 풀링하였다. 풀링된 상등액은 용리된 융합 단백질을 함유하였고, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 및 5 mM의 환원된 글루타티온 및 10% 글리세롤을 함유하는 용액에 보관하였다. 정제된 융합 단백질의 내독소 정도를 상기 실시예 24d에 기재된 바와 같이 LAL 장치를 사용하여 측정하였다.
증식, 유발 및 정제 단계로부터의 시료(비유발된, 유발된, 총, 용해성 및 친화성 정제된 용리액)을 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 단백질을 쿠마시 블루로 염색하여 검출하였다(실시예 28에 기재된 바와 같이). 융합 단백질은 부분적으로 용해성(즉, 대부분의 단백질은 펠렛으로 남는다)인 것으로 발견되었고, 대부분의 전 길이 단백질의 약 0.5 ㎎/ℓ의 출발 배양물을 친화성 정제하였다. 친화성 정제된 단백질은 약 5000 EU/㎎의 친화성 정제된 융합 단백질을 함유하였다. 이러한 결과는 상기 조건 하에서, pGEX 발현계는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 융합 단백질의 높은 수준의 생산이 어려우며, 회수된 단백질은 유의한 내독소 오염원을 함유하는 것을 입증하였다.
c)용해성 pPA1870-2680의 생산을 위한 프로토콜의 개발
실시예 11에서 기재된 바와 같이, 37℃에서 증식하여 생산되고, 유발된 pPA1870-2680 단백질은 거의 불용성이었다. 낮은 온도에서의 발현이 용해도를 증진시킬 수 있는 지를 측정하기 위하여, pPA1870-2680(N/C)의 배양물을 30℃에서 증식시키고, 용해성 친화성 정제가능한 단백질의 수준을 측정하였다. 유발된 1ℓ의 2X YT 배양물로부터의 용해성 용해물 (노바겐사 1X 결합 완충액)을 하기와 같이 제조하였다.
요약하여, pPA1870-2680(N/C)[BL21(DE3)pLysS 숙주에서]의 배양물을 30℃에서 100 ㎍/㎖ 암피실린, 34㎍/㎖ 클로람페니콜 및 0.2% 글루코스를 함유하는 1ℓ의 2X YT 배지에서 0.9의 OD600이 될 때까지 증식시켰다. 단백질 발현을 IPTG가 1 mM이 되도록 가하여 유발하였다. 5시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 15분 동안 빙수조에서 냉각한 후, JA10 로터 (베크만)에서 4℃에서 5,000rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 40 ㎖의 노바겐 1X 결합 완충액(5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.9)의 총 용적에 재현탁시키고, 35 ㎖의 오크릿지 튜브로 옮기고, -70℃에서 1시간 이상 동결시켰다. 튜브를 해동하고, 세포를 얼음 위에서 6-7의 전력으로 브란슨 소니파이어 450을 사용하여 초음파 (4×20 초)로 용해하였다. 현탁액을 JA-17 로터 (베크만)에서 9,000rpm(10,000×g)의 속도로 20분 동안 원심분리하였다. 혼합물을 4℃에서 3시간 동안 교반함으로써, 용해성 용해물(NP40을 0.1%로 가한 후)을 7 ㎖의 NiNTA 수지(퀴아겐):결합 완충액[50 mM NaHPO4, 0.5 M NaCl, 60 mM 이미다졸 (pH 8.0)]의 1:1 슬러리에 배치 흡수되도록 하였다. 슬러리를 1 ㎝의 내부 직경을 갖는 칼럼(바이오라드사)에 부어넣고, 0.1% NP40, 15 ㎖ 결합 완충액, 15 ㎖ 세척 완충액(40 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.9)의 순서로 세척하였다. 결합된 단백질을 200 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.9로 용리하였다.
총 단백질, 용해성 단백질 및 용리된 단백질 시료를 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 총 단백질은 쿠마시 블루에 의해 겔을 염색하여 검출하였다. 정제 결과는 1ℓ의 출발 배양물 (3.2%의 총 용해성 추출물)로부터 34 ㎎의 친화성 정제된 단백질을 얻었고, 이들 중 90-95%의 단백질은 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 융합 단백질[즉, pPA1870-2680 (N/C) 단백질]에 대해 예견된 분자량(90kD)의 단일 밴드로서 이동하는 것이 발견되었다.
이 결과는 pPA1870-2680(N/C) 발현 플라즈미드를 이용하는 높은 수준의 용해성 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질의 효율적 정제를 용이하게 하는 방법, 감소된 증식 온도를 제공한다.
d) pPA1870-2680(N)의 구성체, 및 N, C 및 N/C His-표지된 1870-2680 단백질의 대규모 정제
N-말단 His-표지[pPA1870-2680(N)], C 말단 His-표지[pPA1870-2680(C)], 또는 N 말단 및 C 말단 His-표지[pPA1870-2680(N/C)]를 모두 지닌 씨. 다이피셀 독소 A의 1870-2680 인터벌의 발현을 용이하게하는 발현 플라즈미드를 씨. 다이피셀 독소 A 반복 단백질의 대규모 생산 및 친화성 정제에 대해 평가하였다.
pPA1870-2680(C) 및 pPA1870-2680(N/C) 발현 벡터의 특징은 실시예 11 및 15에 기재되어 있다. 실시예 11에서는 pPA1870-2680(C)가 pPA1870-2680로, 실시예 15에서는 pPA1870-2680(N/C)가 pPA1870-2680(H)로 표현되었다. 폴리-히스티딘 트랙(His-표지)의 위치를 명확히 밝히기 위하여, 하기에서는 플라즈미드를 (C), (N) 및 (N/C) 접미사와 함께 사용한다. 이 세개의 발현 플라즈미드는 하기와 같이 구성된다.
pPA1870-2680(C)는 pPA1000-2680(실시예 11a)으로부터 NheI-HindIII로 절단된 pET23b 벡터(노바겐사)로 SpeI-HindIII 단편을 함유하는 씨. 다이피셀 독소 A 반복 영역을 삽입하여 구성된다.
pPA1870-2680(N/C) 플라즈미드를 BglII-NdeI 단편 상에 함유된 pPA1870-2680(C) 프로모터 영역을 치환에 의해 구성하고, pET16b 벡터(노바겐사)로부터 상응하는 BglII-NdeI 단편을 치환하여 구성하였다.
pPA1870-2680(N) 벡터를 C 말단 HindIIi 부위에서 pPA1870-2680(N/C)의 소화 후, 클레노우 효소로 처리하여 잘린 말단에 충전시킴으로써 생성하였다.
대규모의 pPA1870-2680(N) 및 pPA1870-2680(C)를 (BL21(DE3)pLysS 숙주를 사용하여) 증식시키고, 유발하고, 용해성 단백질을 친화성 정제하고, 상기 c)에 기재된 바와 같이 용리하였다. 각 경우에 10-20 ㎎ 친화성 정제된 단백질을 회수하고, 정제된 단백질은 SDS-PAGE 분석에 의해 측정된 바와 같이 전 길이 융합 단백질의 50%를 초과하였다. 그러나, 다량의 pPA1860-2680(C) 단백질을 40 mM 세척 완충액으로 용리하였다. 상당량의 pPA1870-2680(C) 단백질의 용리를 초래하지 않는 세척 조건을 밝히기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.
pPA1870-2680(C)의 1ℓ 배양물을 상기와 같이 증식시키고, 인산 완충액 기재 결합 완충액, 세척 완충액 및 용리 완충액을 사용하여 정제하였다. 세포를 인산 결합 완충액 (50 mM NaPO4, 0.5 M NaCl. 5 mM 이미다졸, pH 8.0)에 재현탁시키고, 20, 40 또는 200 mM 이미다졸을 함유하는 인산 결합 완충액으로 순서적으로 세척하였다. 세가지 세척액으로 용리된 재조합 단백질(각각 5.5 ㎎. 12.5 ㎎ 및 12 ㎎ 총 단백질)은 C 말단 His-표지된 단백질이 사용된 완충계에서 40 mM 이미다졸 농도에서 수지에 보유되지 않음을 나타내었다.
상기 결과는 용해성이고 친화성 정제된 씨. 다이피셀 독소 A 단백질이 임의의 pPA1870-2680(N), (C) 또는 (N/C) 발현 플라즈미드를 사용하여 단리되는 것을 입증하였다.
e) pPTrxA1870-2680 (N), (C) 및 (N/C)의 구성체 및 N, C 및 N/C His-표지된 Trx1870-2680 단백질의 대규모 정제
티오레독신(Trx) 발현계(인비트로겐사)는 일반적으로 불용성이거나 또는 발현이 어려운 단백질의 용해성 발현을 용이하게 하기 위해 개발되어 왔다. 유전자를 pTrxFus 벡터로 클로닝하고, 이. 콜라이 티오레독신 단백질과 융합체로서 발현시키는데, 이러한 결합은 종종 티오레독신의 용해도 특성을 융합 단백질에 부여한다[La Vallie 등 (1993) Bio/Technology 11:187]. 그러나, pTrxFus 벡터는 발현 벡터로서 바람직하지 못한 몇가지 특성을 갖는다. 이 시스템에서 융합 단백질 발현이 트립토판에 의해 유발되기 때문에, 모든 플라즈미드는 특정 균주 및 증식 배지에서 증식되야만한다. 또한, 프로모터는 감소된 온도(즉, 30℃)에서도 낮은 수준의 융합 단백질이 발현되는 것과 같이 엄격하게 조절되지 않는다. 마지막으로, 발현 벡터는 용해성 융합 단백질의 높은 수준의 친화성 정제를 용이하게하는 친화성 표지를 함유하지 않는다.
IPTG 유발적 친화성 표지된 Trx 융합 단백질의 구성을 용이하게 하기 위하여, pETHisTrx 벡터를 구성하였다. pTrxFus(인비트로겐사)의 티오레독신 유전자를 NdeI-BamHI DNA 단편으로 잘라내고, NdeI-BamHI 소화된 pETHisb 벡터(실시예 18)로 클로닝하여 pETHisTrx 벡터를 생성하였다.
pETHisTrx 벡터에서, Trx 유전자를 pET16b 프로모터로부터 발현시키고, pET16b N-말단 리더 및 Trx의 His-표지 서열 업스트림, 및 C-말단 유전적 융합의 구성을 위한 Trx 유전자의 pET23b 폴리링커 (BamHI 부위로 부터) 다운스트림을 함유하였다. Trx 독소 A1870-2680 인터벌 융합의 발현을 용이하게하는 3개의 발현 구성체를 N, C 또는 N/C 말단 His 표지로서 하기와 같이 구성하였다.
pPTrxA1870-2680 (N/C) 구성체를 NdeI-BamHI(채워짐)Trx 유전자 (pTrxFus 벡터로부터 단리됨) 및 씨. 다이피셀 독소 A 1870-2680 유전자[pPA1100-2680 구성체로부터 단리됨(실시예 11)]를 함유하는 SpeI(채워짐)-XhoI 단편을 NdeI-XhoI 절단된 pETHisb 벡터로 리게이션하였다(채워진 BamHI 및 SpeI 부위 블런드 말단을 함께 리게이션하고, 인-프레임 Trx-씨. 다이피셀 독소 A 융합체를 생성).
상기 Trx-씨. 다이피셀 독소 A 융합체를 NdeI-BamHI 단편으로 잘라내고, NdeI-HindIII 절단된 pET23a 벡터(노바겐사)로 삽입하여 pPTrxA1870-2680(C)를 생성하였다.
pPTrxA1870-2680(N/C)의 HindIII 부위를 절단하고, 클레노우 효소로 처리하여 채우고, 다시 리게이션하여서 pPTrxA1870-2680(N)을 생성하였다.
상기 구성체를 실시예 29에 기재된 분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 구성하였다.
모든 세가지 TrxA1870-2680 융합체[즉, pPTrxA1870-2680(C), pPTrxA1870-2680(N) 및 pPTrxA1870-2680(N/C)]의 대규모의 배양물을 증식시키고, 용해성 친화성 정제된 단백질을 상기 c)에 기재된 바와 같이 단리하였다. 모든 경우에 있어서, 친화성 정제된 Trx 융합 단백질 수율은 용해도, ㎎/㎖ 인큐베이션 수율, 및 순도에 있어서, d)에서 기재된 pPA1870-2680 N, C 또는 N/C 구성체와 비슷하였다.
f) pPA1870-2680 및 pPB1750-2360 단백질의 대규모의 친화성 정제 및 내독소 수준의 측정
친화성 정제된 pPA1870-2680(N/C)(실시예 15) 및 pPB1750-2360 (실시예 15b) 단백질의 제제를 생산하여 정제된 시료에서 내독소 수준의 측정하였다. 모든 완충액을 여과 멸균하고, 정제된 재조합 단백질 시료의 완충 매개된 내독소 오염을 감소시키기 위한 완충액을 제조하는 동안 장갑을 착용하였다. pPA1870-2680(N/C) 및 pPB1750-2360의 단백질의 대규모의 정제를 하기와 같이 수행하였다.
요약하여, pPA1870-2680(N/C) 및 pPB1750-2360 [BL21(DE3)pLysS 숙주에서]의 배양물을 30℃에서 100 ㎍/㎖ 암피실린, 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜 및 0.2% 글루코스를 함유하는 2X YT 배지에서 1.0의 OD600에 도달할 때까지 증식시켰다. 재조합 단백질의 발현은 IPTG를 0.3 mM로 가하여 유발되었다. 유발된지 5-6시간 후, 세포를 빙수 조에서 15분 동안 냉각한 후, 4℃에서 JA10 로터 (베크만 사)에서 5000 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 -70℃에서 밤새 동결시킨 후, 해동하고, 40 ㎖의 결합 완충액 (5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl. 50 mM NaPO4, pH 8.0)의 총 용적에 재현탁시키고, 35 ㎖의 오크릿지 튜브로 옮겼다. 실시예 29 c)에 기재된 바와 같이 초음파(8×20초)로 얼음 위에서 세포를 용해시켰다. 현탁액을 JA-17 로터 (베크만 사)에서 9,000 rpm(10,000×g)의 속도로 30분 동안 원심분리하여 정화하였다. 상등액(용해성 용해물로 구성)을 제거하고, NP40을 최종 농도가 1%가 되도록 가하였다. 용해성 용해물(NP40을 0.1%로 가한 후)을 4℃에서 3시간 동안 교반함으로써 8 ㎖의 NiNTA 수지(퀴아겐):결합 완충액의 1:1 슬러리에 배치 흡수되도록 하였다. 슬러리를 50 ㎖ 튜브(팔콘)에서 500×g의 속도로 1분 동안 원심분리하고, 5 ㎖의 0.1% NP40을 함유하는 결합 완충액에 재현탁시키고, 2.5 ㎝의 내부 직경을 갖는 칼럼(바이오라드사)에 부어넣었다. 이어서, 수지를 0.1% NP40을 함유하는 20 ㎖ 결합 완충액으로 세척하였다. 칼럼을 UV 모니터(ISCO)에 부착하고, 결합 완충액으로 기저선에 도달할 때까지 세척하였다. 기저선 흡광을 획득한 후, 칼럼을 세척 완충액[20 mM(pPB1750-2360) 또는 40 mM(pPA1870-2680) 이미다졸, 0.5 M NaCl, 50 mM NaPO4, pH 8.0]으로 기저선을 획득할 때가지 세척하였다. 칼럼을 50 mM NaPO4, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.0으로 세척하여 이미다졸을 제거하고, 결합된 단백질을 50 mM NaPO4, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤, pH 3.5-4.0으로 용리하였다. 정제 과정 중 다양한 단계에서 얻은 단백질 시료를 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동으로 분리하고, 생성된 겔은 도 34에 나타내었다.
도 34는 정제 단계를 나타내는 쿠마시 블루 염색된 겔을 도시한 것이다. 1㎕의 총(T) 또는 용해성(S) 또는 NiNTA 수지에 결합된 후의 용해성 단백질 및 원심분리(A) 단백질을 4㎕ PBS 및 5 ㎕ 2X SDS-PAGE 시료 완충액, 또는 5 ㎕ 용리된(E) 단백질 및 5 ㎕ 2X 시료 완충액과 혼합하여 전기영동을 위한 단백질 시료를 제조하였다. 시료를 95℃에서 5분간 가열한 후, 냉각하고, 7.5% SDS-PAGE 겔 상에서 로딩하였다. 광범위한 분자량 단백질 마커(M:바이오라드사)도 로딩하여 밝혀진 융합 단백질의 분자량을 추정하였다. 전기영동한 후, 단백질은 일반적으로 쿠마시 블루로 염색하여 검출하였다. 도 34에서, 레인 1-4는 pPA1870-2680 단백질의 정제된 단백질을 함유하고, 레인 5-8은 pPB1750-2360 단백질의 정제된 단백질을 함유한다.
정제는 단백질 모두에 대해서 1ℓ의 출발 배양물(2-2.5%의 총 용해성 추출물)로 부터 약 30 ㎎/ℓ의 친화성 정제된 단백질 수율을 초래하였고, 단백질의 90-95% 이상이 재조합 씨.다이피셀 독소 A 단백질에 대한 예견된 분자량(90kD)의 단일 밴드로 이동하였다. 모든 경우에서, 대부분(즉, 90%를 초과)의 유발된 단백질은 용해성이고, 사용된 정제 조건 하에서 정량적으로 수지에 결합된다.
정제된 재조합 단백질의 내독소 수준을 LAL 장치(실시예 24d)를 사용하여 측정하였고, pPA1870-2680(N/C)에 대한 1.0 EU/㎎ 미만의 정제 단백질 및 pPB1750-2360에 대한 250 EU/㎎를 초과하는 정제 단백질을 발견하였다. 이 두개의 정제된 재조합 단백질 간의 내독소 수준의 차이는 pPB1750-2360 단백질을 정제하는 동안 이용된 낮은 강도의 세척을 반영할 수 있다.
g) pPB1750-2360(N/C)의 구성체, 대규모의 친화성 정제 및 내독소 수준의 측정
상기한 바와 같이, 친화성 정제된 pPB1750-2360 단백질은 정제된 pPA1870-2680(N/C) 단백질보다 높은 수준의 내독소를 함유하였다. pPA1870-2680(N/C)가 아미노 및 카르복시 말단에 폴리-히스티딘 트랙을 함유하는 반면, pPB1750-2360 단백질은 카르복시 말단에 폴리-히스티딘 트랙을 함유하였다. 융합 단백질의 양쪽 말단에 존재하는 폴리-히스티딘 트랙은 pPB1750-2360에 비하여 pPA1870-2680(N/C)를 친화성 정제하는 동안 사용된 고강도의 세척 조건을 가능하게 하였다(각각이 40 mM 이미다졸 대 20 mM 이미다졸).
아미노 및 카르복시 말단 모두에 폴리-히스티딘 트랙을 함유하는 씨. 다이피셀 독소 B의 1750-2360 인터벌을 함유하는 융합 단백질을 생산하기 위하여, pPB1750-2360(N/C)을 하기와 같이 구성하였다. pPB1750-2360 (실시예 15b)를 NdeI 및 XhoI으로 소화시키고, 1.5 kb NdeI/XhoI 단편을 단리하고, NdeI 및 XhoI로 소화된 pETHisb 벡터(실시예 18)로 삽입하였다. 통상의 방법을 사용하여 상기 실시예에 기재된 바와 같이 이 구성체를 구성하였다.
pPB1750-2360(N/C)의 대규모의 정제를, 세척 완충액이 40 mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 50mM NaPO4, pH 8.0을 함유하는 것을 제외하고는, pPB1750-2360의 정제에 대한 상기 f)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 세척 단계 후에, 칼럼을 50 mM NaPO4, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.0으로 세척하여 이미다졸을 제거하였다. 50 mM NaPO4, 0.3 M NaCl, 10% 글리세롤, pH 3.0으로 칼럼을 세척하여 결합된 단백질을 용리하였다. 이 조건 하에서는 pPB1750-2360(N/C)가 용리되지 않았다.
40 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 50 mM NaPO4, pH 8.0을 함유하는 세척 완충액을 사용하는 세척 단계를 제외하고는, 상기한 바와 같이 대규모의 정제를 반복하고, 결합된 단백질을 200 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 50 mM NaPO4, pH 8.0을 함유하는 용액을 사용하여 용리하였다. PBS에 대해 투석하여 이미다졸을 용리된 단백질로부터 제거하였다.
쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔 상의 용리된 pPB1750-2360(N/C)의 분석은 전 길이 융합 단백질에 대한 예견된 분자량의 단일 밴드를 나타내었다.
정제된 pPB1750-2360(N/C) 단백질의 내독소 수준을 LAL 장치(실시예 24d)를 사용하여 측정하였다. 세개의 개별적 측정을 수행하여, 내독소 수준이 80, 300 또는 450 EU/㎎의 정제된 재조합 단백질로 발견되었다. 임의의 특정 메카니즘에 한정되지 않으면서, pPB1750-2360(N/C)로 관찰된 부합되지 않는 LAL 분석 및 pPB1750-2360((f) 참조)로 얻어진 높은 판독은 이 단백질 상에 존재하는 씨. 다이피셀 독소 B 위의 탄수화물 결합 잔기에 의한 LAL 성분의 비특이적 교착에 기인하는 것으로 믿어진다. 실제 내독소 수준이 80 또는 450 EU/㎎의 정제 단백질인 것에 상관 없이, 친화성 정제된 pPB1750-2360(N/C) 제제는 실질적으로 내독소가 제거된 재조합 단백질의 제제이다(10 내지 500 ㎍의 정제된 pPB1750-2360(N/C)의 투여는 오직 4.5 내지 225 EU의 도입만을 초래할 것이다. 70 ㎏의 사람에서는 내독소량이 최대 허용 투여량의 1.3 내지 64.5%이다).
상기 결과는 높은 수율의 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 반복 단백질의 실질적으로 내독소가 제거된 제제의 친화성 정제를 위한 방법을 제공한다.
실시예 30
용해성 pPA1870-2680(N/C), pPA1960-2680 및 pPA1870-2190 단백질의 정제
실시예 29에서, 항원 생산에 대한 초기 영역을 만족시키는 단백질을 생성하는, 용해성이고 실질적으로 내독소가 제거된 pPA1870-2680(N), (C) 또는 (N/C) 시료의 생산 방법을 제공하였고, 즉 단백질은 1) 쉽게 정제된고, 2) 확실히 규명되고, 순도가 높고, 3) 실질적으로 내독소가 제거되었다. 이 실시예에서는 pPA1870-2190 또는 pPA1960-2680 발현 구성체로부터 거의 순수한 항원을 생산하는 능력을 검진하였다. 이 실시예는 a) 용해성 pPA1870-2190 및 pPA1960-2680 단백질의 대규모 정제 및 b) pPTrxA1870-2190 벡터의 구성체 및 용해성 pPTrxA1870-2190 단백질의 대규모 정제에 관한 것이다.
a) 용해성 pPA1870-2190 및 pPA1960-2680 단백질의 대규모 정제
pPA1870-2190(실시예 17a) 및 pPA1960-2680 (실시예 28)을 사용하는 상기 용해성 친화성 정제된 단백질을 생산하려는 상기 시도는 소규모 인큐베이션에서 생산된 총 단백질 및 용해성 단백질의 분석에 따라 성공적이지 못한 것으로 평가되었다. 그러나, 소규모 또는 소인큐베이션을 사용하여 측정된 단백질의 용해도 특성은 완충액, 초음파 조건 등의 상이함으로 인하여 대규모 인큐베이션으로 옮길 수 없을 것이다. 정말로, pPA1870-2680 N, C 또는 N/C 구성체를 사용하는 용해성이고 실질적으로 내독소가 제거된 씨. 다이피셀 독소 A 반복 단백질의 성공적인 발현은 이 단백질을 용해시킬 수 있는 조건은 또한 pPA1870-2190 및 pPA1960-2680 단백질의 용해도를 증진시킬 수 있음을 시사하였다. 이 가설을 하기와 같이 시험하였다.
대규모의 pPA1870-2190 및 pPA1960-2680 인큐베이션을 증식시키고, 실시예 29C에 기재된 바와 같이 용해성 단백질을 Ni-NTA 수지 상에서 친화성 정제하였다. pPA1960-2680에 대해서는 BL21(DE3) 및 BL21(DE3)pLysS 숙주를, pPA1870-2190에 대해서는 BL21(DE3)pLysS 숙주를 사용하였다. pPA1870-2190(N/C)의 배양물[BL21(DE3)pLysS 숙주에서]를 30℃에서 100 ㎍/㎖의 암피실린 및 0.2%의 글루코스를 함유하는 1ℓ의 2X YT 배지에서 0.9의 OD600이 될 때까지 증식시켰다. 사용된 숙주가 pLysS 플라즈미드를 함유하는 경우, 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 상기 배지에 가하였다. IPTG를 1mM이 되도록 가하여 단백질 발현을 유발하였다. 유발한지 5시간 후, 세포를 빙수조에서 15분 동안 냉각한 후, 4℃에서 JA10 로터 (베크만 사)에서 5000 rpm의 속도로 15분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 노바겐 1X 결합 완충액 (5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.9)에 총용적이 40 ml이 되도록 재현탁하고, 두개의 35 ml 오크릿지 튜브로 옮기고, -70℃에서 1시간 이상 동결하였다. 튜브를 해동하고, 세포를 얼음 위에서 초음파 장치 (6-7의 전력으로 맞춰진 브란슨 소니파이어 450을 사용하여 4 X 20초 동안)로 용해시켰다. 현탁액을 JA-17 로터 (베크만 사)에서 9,000 rpm(10,000×g)의 속도로 20분 동안 원심분리하여 정화하였다. 용해성 용해물을 (NP40을 0.1%로 가한 후), 4℃에서 3시간 동안 교반하여서 7 ml의 Ni-NTA 수지(퀴아겐):노바겐 1X 결합 완충액의 1:1 슬러리에 배치 흡수시켰다. 슬러리를 내부 직경이 1㎝인 칼럼 (바이오라드 사)에 부어넣고, 칼럼을 0.1% NP40을 함유하는 15 ml의 노바겐 1X 완충액, 15 ml의 노바겐 1X 결합 완충액, 15 ml의 세척 완충액 (40 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.9) 순서로 세척하였다. 결합된 단백질을 200 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.9로 용리하였다.
총 단백질, 용해성 단백질 및 용리된 단백질 시료(40mM 및 200 mM의 세척 및 용리 완충액)을 SDS-PAGE로 분리해냈다. 실시예 28에 기재된 바대로 친화성 정제된 양의 항-독소 A 항체를 사용하여, 총 단백질을 쿠마시 염색으로 검출하고, 씨. 다이피셀 독소 A 반응성 단백질(pPA1960-2680의 경우)을 웨스턴 블롯 검출로 검출하였다.
이 분석법의 결과는 pPA1870-2190 단백질에 대해서는 600 ㎍ 단백질/ℓ의 배양물만이 200 mM 이미다졸 용리액에서 정제되는 것으로 나타났다. 씨. 다이피셀 독소 A 단백질은 이 구성체를 높은 수준으로 발현시키나, 대부분의 유발된 단백질은 용해성이었다. 또한, pPA1870-2190 단백질은 총 용리된 단백질의 10 % 미만이었다. pPA1960-2680 구성체에 있어서, 용해성 친화성 정제된 단백질의 총 수율은 200mM 용리 분획에서 1 ㎎의 [BL21(DE3)pLysS 숙주] 또는 200 ㎍의 [BL21(DE3) 숙주]였다. 쿠마시 및 웨스턴 분석은 pPA1960-2680 단백질이 높은 수준으로 발현되나, 대부분의 단백질이 불용성이고, 또한 용리된 단백질 제제는 약 20%의 씨. 다이피셀 독소 A 반응성 단백질만을 함유하는 것을 입증하였다.
상기 결과는 pPA1870-2680 단백질이 용해될 수 있는 조건이 pPA1960-2680 또는 pPA1870-2190 구성체에 의해 발현되는 용해된 씨. 다이피셀 독소 A 반복 단백질을 생산하는데 성공적이지 못하다는 것을 입증하였다.
b) pPTrxA1870-2190 플라즈미드의 구성체 및 용해성 단백질의 대규모 정제
씨. 다이피셀 독소 A의 1870-2680 인터벌을 함유하는 재조합 단백질의 용해도가 Trx 단백질, 융합 구성체의 용해 특성을 이용하여 증진될 수 있는지를 측정하기 위하여, 1870-2680 인터벌이 티오레독신(Trx)과의 융합체로서 발현되는 융합 구성체를 구성하였다.
pPTrxA1870-2190 구성체를 두 단계로 구성하였다. 먼저, 1870-2190 인터벌을 pPTrxFus 벡터(인비트로겐사)로 클로닝하였다. 이는 KpnI-SalI 단편을 씨. 다이피셀독소 A의 1870-2190 인터벌을 함유하는 pPTrxApMA1870-2190으로부터 KpnI-SalI 절단된 pTrxFus 벡터로 리게이션함으로써 달성하였다. 적절한 DNA 단편을 함유하는 재조합 클론을 선별하고, Trx-씨. 다이피셀 독소 A 융합 단백질을 코딩하는 서열을 NdeI 및 SalI를 사용하여 절단하고, NdeI 및 XhoI으로 절단된 pETHisb 벡터로 클로닝하였다(실시예 18). 생성된 구성체, pPTrxA1870-2190은 pET16b 프로모터에 의한 N-말단 His-표지된 Trx-씨. 다이피셀 독소 A 융합체를 함유하였다.
pTrxA1870-2190 구성체로부터 용해성 친화성 정제된 Trx-씨. 다이피셀 독소 A 단백질의 정제를 상기 a)에 기재된 바와 같이 대규모 배양물로부터 수행하였다. 총 시료, 용해성 시료 및 용리 시료를 12.5% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 단백질을 쿠마시 블루로 염색하여 검출하였다.
이 분석의 결과는 친화성 정제된 재조합 단백질의 총 수율은 200 mM 이미다졸 용리액 중 순수 단백질의 50%를 초과하는 2 ㎎였다. 1 ㎎의 특이적 단백질의 이 수율은(2 ㎎의 총 정제된 단백질의 50%) pPA1870-2190 구성체로 얻어진 수율보다 10배 증가된 것이었고(600 ㎍의 10%, 또는 100 ㎍ 미만의 특이적 단백질), Trx 단백질의 용해 특성을 입증하였다. 그러나, 대부분의 유발된 단백질은 양 구성체(즉, pPTrxA1870-2190 및 pPA1870-2190)에서 불용성이었고, pPTrxA1870-2190 벡터에서 총 친화성 정제 단백질 수율은 pPA1870-2190 구성체에서 얻어진 것에 비해 여전히 20배 미만으로 낮았다.
실시예 31
재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B에 대한 새의 항체(IgY)를 지닌 씨. 다이피셀 질병에 대한 햄스터의 방어
이 실험에서는 실험을 씨. 다이피셀 독소 A의 재조합 단편 및(또는) 씨. 다이피셀 독소 B의 재조합 단편에 대해 경구적으로 투여될 IgY가 효과적으로 씨. 다이피셀 질병에 대해 햄스터를 방어할 수 있는지를 측정하기 위하여 수행하였다. 이 실시예는 a) 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B 단백질에 의한 닭의 면역법, b) 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B IgY의 정제, 검출 및 정량화, 및 c) 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY 또는 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY와 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 B IgY의 혼합물을 사용하는 생체 내 방어 감염 연구에 관한 것이다.
a) 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B 단백질에 의한 닭의 면역법
알을 낳는 레그혼종 닭을 각각 씨. 다이피셀 독소 A 재조합 단백질 pMA1870-2680(씨. 다이피셀 독소 A의 1870-2680 인터벌은 인터벌 A-6으로 언급) 또는 씨. 다이피셀 독소 B 재조합 pPB1750-2360(씨. 다이피셀 독소 B의 1750-2360 인터벌은 인터벌 B-3으로 언급)으로 면역시켰다. 양 재조합 단백질은 용해성 생산물로서 발현되고, 실시예 28(pMA1870-2680) 및 실시예 29(pPB1750-2360)에 기재된 바와 같이 정제하였다. 약 1 ㎎의 각 재조합 단백질을 완전 프로인트의 보조제(실시예 1에서와 같이 제조)와 혼합하고, 닭의 여러 부위에 피하 투여하였다. 닭을 10번 면역시켰다. 먼저 4번의 면역법은 1, 14, 21 및 35 일째에 시행하였다. 나머지 면역은 4주 인터벌로 시행하였다.
b) 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 독소 B IgY의 정제, 검출 및 정량화
알을 수거하고, 마지막 추가 자극한지 약 1주일 후, PEG를 실시예 1에서와 같이 사용하여 IgY를 추출하였다. 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B IgY를 0.1M 탄산 완충액 (pH 9.5)에 4X PEG 농축물로서 현탁시켰다(즉, 원래 노른자 용적의 1/4에 재현탁). 4X IgY 농축물의 총 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광에 의해 측정된 바대로 20 ㎎/㎖이었다. 면역원과의 반응성에 대한 상대적 수준의 IgY 특이성은 ELISA에 의해 하기와 같이 검출하였다.
마이크로타이터 플레이트를 0.05 ㎍/㎖의 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질, pPA1870-2680(실시예 11) 또는 1 ㎍/㎖의 재조합 씨. 다이피셀 독소 B pPB1750-2360(실시예 18b) 를 사용하여 100 ㎕/웰의 농도로 코팅하였다. ELISA를 실시예 13c에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이 분석의 결과는 항체 역가가 1:125,000을 초과하는 것으로 나타났다(항체 역가는 면역전 IgY에 비해 3배 이상의 ELISA 신호를 방출하는 가장 높은 항체 희석의 역수로 정의된다). 특이적 항-재조합 독소 A 및 항-재조합 독소 B IgY의 양을 실시예 15c에 기재된 바와 같이 친화성 정제에 의해 측정하였다. 항-pMA1870-2680 및 항-pPB 1750-2360 제제 중에 존재하는 특이적 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 항체의 양을 각각 약 160 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖로 측정하였다.
c) 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY 또는 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY와 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 B IgY의 혼합물을 사용하는 생체 내 방어 감염 연구
pMA1870-2680(실시예 15) 및 pPB 1750-2360 (실시예 18b)에 대해 발생된 항체를 사용하는 생체 내 방어 연구를 씨. 다이피셀 햄스터 모델을 사용하여 수행하였다. 이 연구는 실시예 9에 사용된 것에서 변형된 햄스터 모델을 하기와 같이 사용하였다.
햄스터를 1 ㎖의 무균수 중 1 ㎎/100 g 체중의 클린다마이신 인산염(바이오몰 사)을 복막내로 투여하여 씨. 다이피셀로 감염시켜 소인성으로 만들었다. 클린다마이신을 1 ㎖ 투베쿨린 주사기(테루모사)를 사용하여 복막내로 투여하였다. 약 20-24 시간 후, 햄스터를 각각 1 ㎖의 1×104의 씨. 다이피셀 (ATCC 43596)를 함유하는 염수로 경구적으로 감염시켰다. 감염시키기 전에, 씨. 다이피셀을 약 48시간 동안 CCFA (씨. 다이피셀 선택적 한천) 플레이트 (BBL) 상에서 48시간 동안 증식시켰다.
햄스터 모델에서 상기 변형을 사용하여, 햄스터에서 감염 기간 (특히, 질병의 개시기)는 실시예 9에 기재된 조건을 사용하여 얻은 결과와 비교하여 더욱 부합되고 신속하였다. 현재 연구에 있어서, 집단 당 8마리의 햄스터(사스코) 중 3 집단을 2 ㎖의 면역전 또는 40 ㎎의 총 IgY를 함유하는 항 재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY의 4X 농축물로 처리하였고, 여기서 특이적 항 재조합 씨. 다이피셀 독소 A의 양은 약 400 ㎍이었다. 세번째 집단을 각각 2X의 최종 특이적 농축물이되는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B에 대한 IgY의 4X 농축물의 동량 혼합물 2 ㎖로 처리하였다(트깅적 항-재조합 독소 A 및 B에 대한 IgY의 양은 각각 약 200 ㎍이었다). 따라서, 세번째 집단은 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A로만 처리한 것에 비하여 재조합 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 특이적 항체량의 반이었다.
햄스터를 감염하기 24시간 전부터 약 4시간 간격으로 1일 3번씩 처리하였다. 햄스터를 5일 동안 처리하였다. 이는 실시예 9에서 사용된 처리 기간보다 약 1주일이 적은 기간이었다. 본 발명의 예방적 치료 연구의 산물은 도 35에 도시되어 있다.
도 35에서, 누적 치사율은 종축을 따라 나타내고, 시간을 횡축을 따라 나타내었다. 처리 기간은 0에서 4일 동안 막대를 사용하여 표시하였다. 클린다마이신 투여 및 씨. 다이피셀로의 접종(도 35에서 "감염"으로 표시)를 나타내었다. 흑색 사각형은 면역전 IgY를 수용한 햄스터를 나타내고, 흰색 사각형은 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY(항 인터벌 A-6)를 수용한 햄스터를 나타내고, 흑색 다이아몬드는 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B IgY(항 인터벌 A-6/B-3)의 혼합물을 수용한 햄스터를 나타낸다.
도 35에 나타난 결과는 이 모델 조건 하에서, 면역전 IgY를 지닌 모든 햄스터는 접종 후 24시간 이전에 설사를 하였다. 접종한지 1일 후, 이 집단의 모든 동물은 죽었다. 대조적으로, 실시예 9에서의 조건을 사용하여, 면역전 IgY로 처리된 집단은 질병이 발병하기 전에 며칠이 걸렸고, 모든 구성원들이 질병으로 죽지는 않았다.
도 35에 도시된 바와 같이, 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY(항-pMA1870-2680) 또는 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A (항-pMA1870-2680)와 독소B (항-pPB1750-2360)의 혼합물로 처리된 햄스터를 사망으로부터 방어하여, 각 집단에서 62% 및 88%의 생존도를 나타냈다. 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 혼합물 처리된 집단의 Chi 제곱(squared) 분석법의 결과는 면역전 처리된 집단과 비교하여 0.05 미만 및 0.005 미만의 P값을 지닌 것으로 의미가 있었다. 비록 두개의 시험 집단 간의 종말점으로서 사망을 비교한 결과가 의미있지는 않았지만(P〈0.75), 면역전 대조 집단과 비교하여 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B IgY 혼합물을 수용한 동물에서는 심각한 설사를 보이지 않았다.
CDAD의 매우 활동적인 햄스터 모델을 사용한 상기 결과는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질 (pMA1870-2680)에 대한 IgY는 방어성이었으나, 재조합 씨. 다이피셀 독소 B(pPB1750-2360)에 대한 항체의 첨가는 추가의 방어(즉, 질병 증상의 심각성을 완화)를 제공하는 것으로 나타났.
실시예 32
재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B에 대한 새의 항체(IgY)로 씨. 다이피셀 감염된 햄스터의 치료
씨. 다이피셀 독소 A 단백질 및(또는) 씨. 다이피셀 독소 B에대한 경구적으로 투여된 IgY가 씨. 다이피셀로 감염된 햄스터를 효과적으로 치료할 수 있는지를 측정하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다. 이 실시예는 a) 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B 단백질로의 닭의 감염, b) 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B의 닭 IgY의 정제 및 검출 및 c) 햄스터를 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 재조합 독소 B에 대한 IgY로 치료하는 생체 내 감염 연구(감염 연구 #1)에 관한 것이다. 또한, 재조합 독소 A 또는 B를 함유하는 IgY의 혼합물을 사용하여 씨. 다이피셀로 감염된 후, 햄스터를 치료하였다(감염 연구 #2). 감염 연구 #2에 사용된 조건을 반복하여 감염 연구 #3을 얻었다.
a) 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B 단백질로의 닭의 감염
알을 낳는 레그혼종 닭을 각각 씨. 다이피셀 독소 A 재조합 단백질 pMA1870-2680(인터벌 A-6) 또는 씨. 다이피셀 독소 B 재조합 pPB1750-2360(인터벌 B-3으로)으로 면역시켰다. 재조합물은 씨. 다이피셀 독소 A 및 B의 반복 영역을 함유하였다. 양 재조합 단백질은 독소 A 재조합 단백질에 대한 pMal 벡터(실시예 15) 및 독소 B에대한 재조합물에 대한 pET(실시예 18b)을 사용하여 용해성 단백질로서 발현되었다.
약 1 ㎎의 각 재조합 단백질을 씨. 다이피셀 독소 A 재조합물에 대한 프로인트의 보조제 500 ㎍(RIBI 이뮤노케미칼 리써치) 또는 씨. 다이피셀 독소 B 재조합물에 대한 프로인트의 보조제(실시예 1에서와 같이 제조)과 혼합하였다. 각 닭을 약 2 내지 4주 간격으로 약 7번 피하 면역시켰다.
b) 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B 닭의 IgY의 정제 및 검출
알을 수거하고, 마지막 추가 자극한지 약 1주일 후, PEG를 실시예 1에서와 같이 사용하여 항체를 추출하였다. IgY를 8X 또는 4X 농축물로서 재현탁시켰다(즉, 0.1M 탄산 완충액 (pH 9.5)에서 노른자 용적의 1/8 또는 1/4에 재현탁). 재조합 면역원에 대한 특이적 항체의 상대적 수준을 하기와 같이 변형하여 실시예 13c에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 검출하였다. 96개 웰의 마이크로타이터 플레이트를 0.05 ㎍/㎖의 재조합 독소 A 단백질 pPTrxA1870-2680N/C(실시예 29e) 또는 1 ㎍/㎖의 독소 B 재조합 pPB1750-2360(실시예 18b)를 사용하여 100 ㎕/웰의 농도로 코팅하였다. 표준 ELISA 유형을 수행하여 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B를 검출하였다(실시예 13c). ELISA에 의한 항체 역가는 모두에서 1: 125,000을 초과하는 것으로 측정되었다.
c) 생체 내 감염 연구
3개의 감염 연구 #1, #2 및 #3을 실시예 31에 기재된 바와 같이 햄스터 모델을 사용하여 수행하였다.
i) 감염 연구 #1
감염 연구 #1에서, 세개의 분리된 실험 집단은 약 80-90 g 체중의 12개의 골든 시리안 햄스터 (사스코)를 각각 사용하였다. 동물을 우리 당 3마리씩 기르고, 연구하는 동안 임의량의 음식 및 물을 제공하였다. 햄스터 모델을 실시예 31에서와 같이 사용하였다. 연구 처음에, 각 햄스터를 1 ㎖ 투베쿨린 주사기(27 게이지 바늘)을 사용하여 1 ㎖의 물 중 1 ㎎/100 g 체중의 클린다마이신 인산염(바이오몰 사)을 복막내로 투여하여 씨. 다이피셀로 감염시켜 소인성으로 만들었다. 약 24 시간 후, 각 동물을 무균 염수 중 약 103 내지 104의 균을 함유하는 1 ㎖의 씨. 다이피셀 (ATCC 43596) 균주를 18 게이지 공급 바늘을 사용하여 경구적으로 항원투여하였다. 감염시키기 전에, 균주를 약 48시간 동안 CCFA 플레이트 (BBL) 상에서 48시간 동안 증식시켰다.
접종한지 3시간 후(1 일째), 양 집단에 대한 처리를 개시하였다. 집단을 각각 18 게이지 공급 바늘을 사용하여 재조합 씨. 다이피셀 독소 A(pMA1870-2680; 인터벌 A-6) 또는 독소 B (pPB1750-2360; 인터벌 B-3)에 대한 면역전 IgY 또는 특이적 면역 IgY의 2 ㎖의 4X 농축물을 경구적으로 처리하였다. 1 일째, 햄스터를 추가로 2시간 간격으로 2회 이상 처리하였다. 2 내지 4 일째, 햄스터를 각각의 2 ㎖의 항체 제제로 1일 세번 약 4시간 간격으로 처리하였다. 각 2 ㎖의 투여량은 약 40 ㎎의 IgY를 함유하였고, 여기서 약 400 ㎍은 재조합 독소 단백질에 대한 특이적 IgY 또는 1일 당 1200 ㎍의 특이적 항-씨. 다이피셀 독소 단백질이다(실시예 15c에 기재된 바와 같이 친화성 정제에 의해 측정). 모든 동물은 치료 기간 동안 및 이후에 설사를 시작하고 사망하는 것으로 관찰되었다. 결과를 도 36에 기재하였다.
도 36에서, 누적 치사율은 종축을 따라 나타내고, 시간(일)을 횡축을 따라 나타내었다. 처리 기간은 1일에서 4일 동안 막대를 사용하여 표시하였다. 클린다마이신 및 씨. 다이피셀 균의 투여("감염")을 나타내었다. 흑색 사각형은 면역전 IgY를 수용한 햄스터를 나타내고, 흰색 사각형은 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY의 4X 제제(항 인터벌 A-6)을 수용한 햄스터를 나타내고, 흑색 다이아몬드는 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 B IgY의 4X 제제(항 인터벌 B-3)을 수용한 햄스터를 나타낸다.
도 36에 나타난 결과는 씨. 다이피셀 독소 A 재조합에 대한 항체로 감염된 후 치료된 햄스터의 반(6/12)은 CDAD로 인하여 사망하지 않았다. 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 집단에서 방어 정도는 Chi-제곱 분석법을 사용하여 통계적으로 P〈0.025에서 의미가 있었다. 집단에서 대부분의 햄스터(10/12)는 설사를 하였다. 시험된 농도에서 씨. 다이피셀 독소 A 재조합물에 대한 항체는 햄스터에서 설사를 방지할 수 없는 것으로 나타났다. 대조적으로, 모든 면역전 및 항 재조합 씨. 다이피셀 독소 B 처리된 햄스터는 설사를 하였고, 곧 사망하였다.
상기 결과는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질(pMA1870-2680)에 대해 발생된 IgY가 햄스터를 CDAD로 인한 사망으로부터 방어하였다.
ii) 감염 연구 #2
재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B에 대한 항체의 혼합물을 CDAD로부터 햄스터의 방어능을 시험하는 것을 제외하고는 기본적으로 상기한 바와 같이 두번째 실험을 수행하였다. 양 재조합물(pMA1870-2680 및 pPB1750-2360)에 대한 IgY의 8X 농출물을 동일 용적로 혼합하여 최종 농도가 각 재조합물이 동일하게 4X가 되었다. 각 투여량(2 ㎖)은 각 재조합물에 대한 400 ㎍의 특이적 IgY (총 단백질에 비하여 1% 특이적 항-씨. 다이피셀 독소 단백질)을 함유하는 약 80 ㎎/㎖의 단백질을 함유하였다. 각 독소 재조합물에 대한 특이적 항-재조합 IgY의 양을 각각의 재조합 단백질을 사용하여 친화성 정제에 의해 측정하였다. 따라서, 생성된 제제는 단백질 함량을 두배로 함유하는 점을 제외하고는 상기 실험에서 사용된(c(i)) 항-재조합 독소 A의 동일 최종 농도를 함유하였다. 이러한 차이점으로 인하여, 추가의 시험 집단을 만들고, 항 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 면역전 IgY의 두개의 8X 농축물의 동일 용적로 처리하였다. 대조구로서, 세번째 햄스터 집단을 면역전 IgY의 8X 농축물만으로 처리하였다. 집단 중 9마리의 햄스터를 1×104의 씨. 다이피셀 (ATCC 43596)로 감염시킨 후, 2 ㎖의 면역전 IgY, 면역전 IgY와 혼합된 항 재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY 또는 항 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B IgY의 혼합물로 처리하였다. 동물을 상기한 바와 같이 (c(i)) 4일 동안 1일 세번 처리하였다. 이 실험의 산물은 도 37에 도시하였다.
도 37에서, 누적 치사율은 종축을 따라 나타내고, 시간(일)을 횡축을 따라 나타내었다. 처리 기간은 1일에서 4일 동안 막대를 사용하여 표시하였다. 클린다마이신 및 씨. 다이피셀 균의 투여("감염")을 나타내었다. 흑색 사각형은 면역전 IgY의 8X 제제를 수용한 햄스터를 나타내고, 흰색 사각형은 면역전 혈청 및 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY(항 인터벌 A-6)의 8X 제제를 수용한 햄스터를 나타내고, 흑색 다이아몬드는 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B IgY(항 인터벌 A-6/B-3)의 8X 제제의 혼합물을 수용한 햄스터를 나타낸다.
도 37에 나타난 결과는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B (pMA1870-2680 및 pPB1750-2360)에 대한 IgY의 혼합물은 모든 햄스터를 CDAD로 인한 사망으로부터 방어하였다. 항 씨. 다이피셀 독소 A 및 B 항체 혼합물로 처리된 동물들의 1/3(9마리 중 3마리)만이 설사를 하였다(매우 온화한 증상을 보임). 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 항체 (항 인터벌 A-6) 및 면역전 IgY의 혼합물로 처리된 햄스터는 56%의 생존율로 방어되었다. 항 인터벌 A-6/면역전 IgY 집단에서 한 마리의 햄스터를 제외한 모든 햄스터는 설사를 하였다. 이 집단에서의 생존율은 면역전 IgY를 사용하지 않고 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY만을 사용하는 감염 연구 # 1에서 보인 생존율(50%)와 필적할만 하였다. 이는 면역전 IgY의 추가가 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY의 효능에 미치는 영향이 거의 없거나 전혀 없는 것을 의미한다(위장관에서 프로테아제로부터의 비특이적 방어에 있어서). 통상적으로, 면역전 항체 단독으로 동물의 치료는 씨. 다이피셀 감염으로부터 햄스터를 방어하지 못했고, 햄스터는 감염된 후 2일 내에 사망하였다. 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY 및 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B의 투여로 인한 생존율은 면역전 IgY와 비교하여 각각 0.05 내지 0.001 미만의 P값을 지닌 통계적으로 의미가 있었다. 재조합 처리된 집단과 비교하여 P값은 0.10 미만이었다.
감염 연구 #1 및 #2에서 생존자는 장기간(즉, 처리를 완결한 후 30일 이상의 기간 동안; 실험을 종결지을 경우, 동물은 처리를 종결한지 약 1달 후 안락사시켰다.)동안 생존하였다. 또한, 이 동물들에서 재발은 관찰되지 않았다(재발은 통상적으로 씨. 다이피셀 감염에 대처하기 위한 반코마이신 또는 메트로니다졸과 같은 제약으로 처리한 인간을 포함한 동물에서 발견된다). 이 결과는 씨. 다이피셀 독소 A 및 B로부터 유발된 재조합 단백질에 대해 발생된 제1항체가 씨. 다이피셀로 치명적으로 감염된 동물에서 완전한 효과를 나타냄을 보여주었다.
iii) 감염 연구 #3
재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단독으로(pMA1870-2680) 및 씨. 다이피셀 독소 A/B 재조합물(pMA1870-2680 및 pPB1750-2360의 혼합물)로 닭을 몇 차례 더 면역시킨 후, 두 항체의 혼합물을 사용하는 상기 (감염 연구 #2) 생체 내 치료 연구를 반복하였다(감염 연구 #3). 3 집단의 햄스터에서, 10 마리의 구성원으로 이루어진 각 집단을 상기와 동일한 투여량 및 시간에서, 면역전 IgY, 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B IgY의 혼합물로 감염 후 4시간 처리하였다. 이 연구의 결과는 도 38에 도시하였다.
도 38에서, 누적 치사율은 종축을 따라 나타내고, 시간(일)을 횡축을 따라 나타내었다. 처리 기간은 1일에서 4일 동안 막대를 사용하여 표시하였다. 클린다마이신 및 씨. 다이피셀 균의 투여("감염")을 나타내었다. 흑색 사각형은 면역전 IgY의 8X 제조물을 수용한 햄스터를 나타내고, 흰색 사각형은 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY의 8X 제제(항 인터벌 A-6)을 수용한 햄스터를 나타내고, 흑색 다이아몬드는 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B IgY의 8X 제제(항 인터벌 A-6/B-3)을 수용한 햄스터를 나타낸다.
도 38에 도시된 바와 같이, 두 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 B에 대한 항체 혼합물로 처리한 햄스터를 상기 실험(감염 연구 #2)에서 나타난 사망으로부터 완전히 방어하였으나, 처리된(항-재조합 독소 A 및 B) 어느 동물도 설사를 보이지 않았다. 항 재조합 씨. 다이피셀 독소 A로 처리된 햄스터도 모두(10마리 중 1마리만이 사망) 사망하지 않았으나, 90%는 설사를 하였다. 면역전 IgY로 처리된 모든 햄스터는 설사를 하였고, 감염된지 48시간 이내에 사망하였다.
재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 두 씨. 다이피셀 독소 A 및 B에 대한 항체를 사용한 사망에 대한 예방은 통계적으로 면역전 항체를 사용하여 얻은 결과와 비교하여 의미가 있었다(P〈0.001). 또한, 상기 실시예 (상기 16 i) 및 ii))에 기재된 바와 같이, 모든 처리된 햄스터는 재발의 징후 없이 장기간 동안 생존하였다. 항 재조합 A 및 B IgY로 치료하는 햄스터에서 설사 및 체중 감소를 포함하는 질병 상태의 예방은 표 42에 기재되어 있다.
| 치료군 | 설사증이 있는 동물 (%) | P | 체중 감소(%)a | P |
| 면역전 | 100 | NAb | ||
| pmA1870-2680(A-6) | 90 | NSc | 16 | 〈0.001 |
| pmA1870-2680 및 pPB1750-2360(A-6/B-3) | 0 | 〈0.001 | 1 | NS |
| a 초기 체중과 처리 종말 시의 체중 간의 차이로서 생존자의 체중 감소를 계산함b NA, 해당 안됨 c NS, 의미 없음 | ||||
표 42에 나타난 바와 같이, 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY 단독(pMA1870-2680:A-6)으로 처리된 생존자에서 체중 감소율는 감염되기 전의 평균 체중과 비교하여 약 16%였다. 두 재조합물(pMA1870-2680 및 pPB1750-2360: A-6/B-3)에 대한 두 항체 햄스터만이 그들의 평균 체중의 1%만을 손실하였다. 이 결과는 씨. 다이피셀 독소 A 재조합물에 대해 발생된 항체가 CDAD의 치명적 단계로부터 햄스터를 방어하였으나, 씨. 다이피셀 독소 B 재조합물에 대한 항체의 첨가는 CDAD와 관련된 설사 단계의 예방에 요구되었다.
실시예 33
반코마이신 요법을 사용하여 씨. 다이피셀로 감염된 햄스터를 생체 내 치료하는 동안의 재발
상기 치료 연구 조건 하에서, 씨. 다이피셀 질병의 재발이 반코마이신 처리 후 재발하는지를 측정하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.
햄스터 모델에서 사용된 조건은 실시예 32에서 사용된 것과 동일하였다. 햄스터의 3개 집단(사스코), 각 집단의 6 마리의 구성원을 무균수 1 ㎖ 중 0.1, 1 또는 5 ㎎/㎏의 반코마이신(반코마이신 HCl, 릴리사)로 처리하였다. 동물에 5일 동안 1일에 한번씩 투여하였다. 추가의 비처리된 집단을 대조구로 시험하였다. 햄스터는 각각 1×103 씨. 다이피셀 균 (ATCC 43596)으로 경구적으로 투여한 후, 반코마이신 처리를 감염한지 3시간 후에 시작하였다. 감염한지 20일 후, 실험 산물을 도 39에 도시하였다.
도 39에서는 누적 치사율은 종축을 따라 나타내고, 시간(일)을 횡축을 따라 나타내었다. 처리 기간은 1일에서 5일 동안 막대를 사용하여 표시하였다. 클린다마이신 투여 및 씨. 다이피셀로의 접종(도 39에서 "감염"으로 표시)를 나타내었다. 흑색 사각형은 처리되지 않은(비처리된) 햄스터를 나타내고, 흰색 사각형은 0.2 ㎎/㎏ 반코마이신을 수용한 햄스터를 나타내고, 흑색 다이아몬드는 1.0 ㎎/㎏ 반코마이신을 수용한 햄스터를 나타내고, 흰색 다이아몬드는 5.0 ㎎/㎏ 반코마이신을 수용한 햄스터를 나타낸다.
도 39에 나타난 결과는 0.2 ㎎/㎏의 반코마이신으로 처리한 햄스터는 처리하는 동안 모두 죽는 것으로 나타났다. 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏의 반코마이신으로 처리한 햄스터는 처리 기간 동안 방어되었으나, 신속히 재발하고, 대부분이 처리가 끝난 후 곧 바로 사망하였다. 모든 처리된 햄스터는 설사를 하였고, 1 ㎎/㎏ 반코마이신으로 처리한 햄스터의 83%(5/6) 또는 5 ㎎/㎏ 반코마이신으로 처리한 햄스터의 100%(6/6)는 처리를 끝낸지 7일 또는 9일 후에 치사하였다.
본 명세서에 예시된 바와 같이, 햄스터 모델 또는 사람에서 씨. 다이피셀 감염을 치료하기 위한 반코마이신 또는 메트로니다졸을 사용한 재발 효과는 통상적으로 발생하는 것으로 자주 보고되고 있다. 이 두 약제로 치료된 햄스터는 100% 이하. 사람은 약 25%로 재발되었다. 이 재발 효과는 씨. 다이피셀로 감염된 햄스터를 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 또는 B에 대해 발생된 IgY로 치료하는 본 발명의 효과와 현저히 대조된다. 동물이 항-씨. 다이피셀 독소 IgY로 치료하는 경우, 재발은 거의 또는 전혀 발생하지 않는다. 따라서, 항-씨. 다이피셀 독소 IgY의 투여에 의한 재발의 예방은 통상의 항생제 치료에 대한 중요한 치료적 장점을 나타낸다.
실시예 34
세개의 상이한 씨. 다이피셀 독소 A 반복 영역 함유 재조합 단백질에 대한 IgY를 사용하는 생체 내 씨. 다이피셀 독소 A 중화의 비교
씨. 다이피셀 독소 A의 반복 영역으로부터의 세개의 씨. 다이피셀 독소 A 재조합 단백질을 pMal-c 벡터에서 발현시켰다. 각각에 대한 항체를 생성하고, 햄스터에서 씨. 다이피셀 독소 A를 중화시키는 그의 능력을 비교하였다. 이 실시예는 a) 닭의 면역법, b) 항-재조합 독소 A IgY의 정제 및 검출 및 c) 항-재조합 독소 A IgY를 사용한 햄스터에서 씨. 다이피셀 독소 A의 중화 연구에 관한 것이다.
a) 닭의 면역법
3 집단의 알을 낳는 레그혼 종 닭을 pMal 벡터에서 생산된 상이한 독소 A 재조합 단백질로 면역시켰다. 모두를 MBP 융합체로서 발현시켰다. 이들은 pMA 1870-2190 (실시예 17), pMA 1960-2680 (실시예 28) 및 pMA 1870-2680 (실시예 11)였다. 먼저 두 재조합 단백질은 재조합 pMA 1870-2680에서 함유된 인터벌 내에서 중복 하부 단편을 함유하였다.
프로인트의 보조제와 함께 약 1 ㎎의 각 재조합 단백질을 닭에 투여하였다. 보조제를 사용하는 표준 면역 방법을 실시예 1에 기재된 방법으로 수행하였다. 닭을 실시예 32a에 기재된 시간 간격을 사용하여 여러 부위에 4번 면역시켰다.
b) 항-재조합 독소 씨. 다이피셀 A IgY의 정제 및 검출
마지막 추가 자극을 한지 1주일 후, 수거된 알로부터 PEG를 사용하여 항체를 추출하였다. 항-씨. 다이피셀 독소 A(CTA) 및 면역전 IgY도 대조구로서 제조하였다(실시예 1에 기재된 바대로). IgY를 4X 농도로(원래 노른자 용적의 1/4) 0.1M 탄산 완충액(pH 9.5)에 재현탁시켰다. 각 집단으로부터의 특이적 항체의 수준을 ELISA로 검출하였다. 용해성 재조합 독소 A 단백질 pPTrx1870-2680에 대한 반응성을 측정하였다. pPTrx1870-2680 단백질은 3개의 면역원에서와 같이 MBP를 함유하지 않고, 따라서 ELISA 반응성은 독소 A 재조합물에만 특이적이었다. 표준 ELISA 프로토콜을 사용하였다(실시예 13c). ELISA 결과로부터, 총 4개의 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY 면역전 IgY와 비교하여 1:31,250을 초과하는 유사 역가를 갖는 것으로 나타났다.
c) 항-재조합 독소 A IgY를 사용한 햄스터에서 씨. 다이피셀 독소 A의 중화 연구
상기 재조합 독소 A IgY (즉, pMA1870-2190, pMA1960-2680 및 pMA 1870-2680)의 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 방어능을 햄스터 모델에서 측정하였다. 두 집단의 햄스터에 항-pMA1870-2190 IgY를 투여하고, 따라서 총 6개의 치료 집단을 관찰하였다. 실시예 14에 기재된 바와 같이 분석을 수행하였다.
1 ㎖의 IgY를 혼합하고, 30 ㎍의 씨. 다이피셀 독소 A (테크 랩스)로 1시간 동안 예비인큐베이션한 후, 30-40 g의 골든 시리안 햄스터(챨스 리버산)를 경구적으로 투여하였다. 면역전 및 CTA IgY(실시예 8)는 각각 음성 및 양성 대조구로서 작용하였다. 동물을 24시간 동안 관찰하였고, 각 집단에서 치사자수를 조사하였다. 실험 결과는 표 43에 기재하였다.
| 치료군 | 생존1 | 치사1 |
| 면역전 | 0 | 5 |
| CTA | 5 | 0 |
| pMA1870-2190 | 0 | 5 |
| pMA1960-2680 | 5 | 0 |
| pMA1870-2680a | 5 | 0 |
| pMA1870-2680b | 3 | 2 |
| 1 24시간 후 연구 결과 | ||
표 43에 기재된 바대로, pMA1870-2680에 대한 IgY로 씨. 다이피셀 독소 A의 예비 치료는 "pMA1870-2680a"로 지칭된 치료 집단에서 5마리의 치료된 햄스터 모두의 치사를 예방하였고, "pMA1870-2680b"로 지칭된 치료 집단에서 5마리 중 3마리의 치사를 예방하였다. pMA1870-2680 및 조금 작은 카르복시 말단 폴리펩티드, pMA1960-2680에 대해 발생된 항체 모두는 5마리 동물 모두에서 치사를 예방하였다. 대조적으로, 면역전 IgY를 사용하는 경우, 아미노 말단 폴리펩티드 pMA1870-2190에 대해 발생된 IgY는 치사 예방 효과가 없었다. 예견했던 바와 같이, CTA IgY로 치료된 햄스터는 씨. 다이피셀 독소 A의 장독소 효과로부터 완전히 방어되었다.
실시예 35
생체 내 천연 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 중화 항체를 최적으로 유발하는 보조제의 확인
닭에서 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질을 면역원으로 사용하여 상이한 보조제의 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 중화 항체 생산 능력을 비교하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다. 이 실시예는 a) 4개의 상이한 보조제를 사용한 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질에 의한 닭의 면역법, b) ELISA에 의한 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY 역가의 측정, 및 c) 생체 내 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A의 중화능의 시험에 관한 것이다.
a) 4개의 상이한 보조제를 사용한 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질에 의한 닭의 면역법
알을 낳는 레그혼 종 닭의 8 집단 (각 집단은 4마리의 닭을 함유)을 100 ㎍ 또는 1 ㎎의 재조합 독소 A 단백질 (pMA1870-2680, 실시예 11)을 4개의 상이한 보조제와 혼합하여 면역시켰다. 시험된 4개의 보조제로는 프로인트 보조제(깁코), 가금 보조제 LES-STM (하기에서는 RIBI 보조제로 언급), 게르부(바이오테크) 및 퀴일 에이 (애큐리트 케미칼)이 있다. 각 보조제를 두개의 농도의 항원으로 시험하였다. 각 보조제에 대한 제조 및 투여 방법은 각 제조자의 프로토콜에 의해 제공되었다. 닭에서 보조제 투여도 상세화되어 있는 경우, 제조자의 추천에 따라 측정하였다.
프로인트의 보조제로의 면역법에 있어서, 표준 프로토콜을 사용하였다(실시예 1). 즉, 1차 면역 또는 추가의 추가 자극을 위한 불완전 프로인트의 보조제를 위해서 1 용적의 항원을 1.2 용적의 완전 프로인트의 보조제에 유화시켰다. 1 ㎖의 항원/프로인트의 보조제 혼합물을 각 닭에게 4 부위에서 투여하였다. 프로인트의 보조제가 오일을 함유하기 때문에, 프로인트의 보조제와 면역원의 혼합물은 벽 연결기에 의해 결합된 두개의 주사기를 사용하여 고형화될 때까지 물질의 격렬한 유화를 요구하였다. 다른 3개의 보조제 (RIBI, 게르부 및 퀴일 에이)는 조성물에서 수성이고, 재조합 항원과의 균일한 혼합은 프로인트의 보조제와 비교하여 훨씬 용이하였다. 3가지 수성 보조제의 혼합에서는 온화한 볼텍싱만이 요구되었다. 이 수성 보조제를 사용한 최종 혼합물도 프로인트의 보조제 사용과 비교하여 닭으로의 용이한 투여를 가능하게 하는 균질 액체로 되었다.
RIBI 보조제를 사용하여, 각 닭에게 100 ㎍의 보조제를 함유하는 500 ㎕의 항원/보조제 혼합물을 한 부위에 투여하였다. 기니아피그 및 토끼에 대해 추천되는 퀴일-에이 투여량은 각각 50 ㎍ 및 100 ㎍이었다. 중량 단위로 외삽하여, 닭에게 500 ㎕의 항원/보조제 용적로 75 ㎍의 퀴일 에이 보조제를 한 부위에 투여하였다. 게르부 물질을 사용하여, 각 닭에 500 ㎕의 항원 혼합물 중 5 ㎍의 보조제를 한 부위에 투여하였다. 닭을 2주 간격으로 4번 피하 면역시켰다.
b) ELISA에 의한 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY 역가의 측정
상이한 보조제를 사용하여 생성된 항-재조합 독소 A 항체 수준을 ELISA에 의해 비교하였다. 마지막 추가 자극한지 약 1주일 후, 면역전에 8개 집단 중 각각 3개의 달걀을 수거하였고, 집단 내에서 풀링된 노른자 및 IgY를 실시예 1에 기재된 바와 같이 PEG로 추출하였다. 정제된 항-재조합 독소 A IgY를 PBS 중 1X 노른자 용적에서 재현탁하였다. 280 nm에서 흡광 측정된 각 제제의 단백질 농도는 약 4 내지 5 ㎎/㎖이었다. IgY 반응성 및 pMA1870-2680에 대한 각각의 항체 제제의 역가를 씨. 다이피셀 독소 A 1870-2680 인터벌의 용해성(pPTrxA1870-2680N/C: 실시예 29) 및 불용성(pPA1870-2190:실시예 17a) 동족체에 대한 ELISA로 측정하였다. 이 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 동족체를 pMA1870-2680 면역원과 같이 pPTrxA1870-2680N/C 및 pPA1870-2680을 MBP와 융합체로서 발현되지 않는 것과 같이 면역법(pMA1870-2680)에 사용된 재조합물 대신 ELISA를 위한 마이크로타이터 플레이트를 코팅하는데 사용하였다. 이는 융합 단백질의 MBP 영역보다는 특이적으로 씨. 다이피셀 독소 A 재조합물의 독소 영역에 대한 항체 반응성을 측정하기 위하여 수행하였다.
마이크로타이터 플레이트를 코팅하는데 사용된 용해성 동족체 pPTrxA1870- 2680N/C를 용해도를 증진시키고 생성된 융합 단백질을 원래 형태로 존재하게 하는 티오레독신과의 융합체로서 발현시켰다. 변성된 에피토프를 함유하는 것으로 추정되는 용해성 동족체 pPA1870-2190도 마이크로타이터 플레이트를 코팅하는데 사용하였다. 각 IgY의 용해성 및 불용성 동종체에 대한 ELISA 반응성을 시험하여 상이한 보조제를 IgY의 생성을 위하여 사용하는 경우, 하나 이상의 동종체에 대한 임의의 바람직한 반응성이 있는지를 측정하였다.
20 내지 40배 적은 pPTrxA1870-2680N/C 단백질을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 13c에 기재된 표준 ELISA 프로토콜을 사용하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트(팔콘, 예비 결합 분석 플레이트) 코팅하였다. 100 ㎕/웰을 0.05 ㎍/㎖의 용해성 pPTrxA1870-2680N/C 단백질 또는 1 ㎍/㎖의 불용성 단백질 pPA1870-2680로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 결과는 도 40에 도시하였다.
도 40에서, 불용성 (I) 또는 용해성(S) 씨. 다이피셀 독소 A 재조합물에 대한 각 보조제/항원 배합물의 항체 역가를 비교한 ELISA 반응성의 결과를 기재하였다. 하기 약자, PI(면역전), 보조제들은 각각 1 ㎎(1) 또는 100 ㎍(100)의 프로인트의 보조제에 대한 F, R, Q 및 G, RIBI, 퀴일-에이 및 게르부를 사용하였다.
또한, 각 집단에서 항체 역가는 항체 반응이 고평부를 갖는지를 측정하기 위한 3 또는 4개의 면역법 후를 비교하였다(도 40에서 -3 또는 -4를 사용하여 표시). 모든 4개의 보조제가 닭에서 항체 반응을 다양한 정도로 밝힐 수 있었으나, 용해성 또는 천연 항원 및 불용성 또는 변성된 항원에 대한 그들의 항체 반응도는 달랐다. 프로인트의 보조제는 용해성인 것과 비교하여 불용성 동족체에 대한 보다 큰 항체 반응도를 생성하였다. 프로인트의 보조제를 100 ㎍의 항원을 사용하여 용해성 동족체에 대한 반응성은 거의 관찰하지 못했다. 용해성 동족체에 대한 반응성의 증가가 낮은 농도에 비해 높은 농도에서 관찰되는 반면에, 항원의 둘 중의 하나의 농도(100 ㎍ 또는 1 ㎎)의 면역원에서 불용성 동족체에대한 프로인트의 보조제를 사용한 반응도에서는 차이점이 없었다. 대조적으로, 용해성 동족체에 대한 항체 반응성은 일반적으로 세개의 다른 수성 보조제를 사용하는 불용성 동족체보다 컸다. ELISA에서 용해성 동족체에 대한 항체 반응성은 불용성 동족체에 비해 약 2배 높았다. 항체 반응성은 항원의 증가된 투여량(1 ㎎ 대 100 ㎍)을 사용하여 게르부, RIBI 및 퀴일-에이 족에서 개선되었고, 불용성 동족체에 비하여 용해성 동족체에 대해 더욱 연장되었다. 3차 및 4차 면역과 비교하여, 대부분의 집단에서 불용성 및 용해성 동족체에 대한 항체 수준은 추가의 추가 자극 후 증가되었다.
도 40에 도시된 결과는 용해성 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 면역원을 사용한 프로인트의 보조제로의 닭의 면역법는 우선 불용성 동족체에 대한 항체를 확인한 것을 입증하였다. 이 발견은 형태적 항체가 생체 내 방어를 위해 요구되는 경우 중요한다. 형태적 항체가 요구되는 경우, 여기서 사용된 게르부 또는 RIBI와 같은 별법의 보조제가 바람직하다. 다른 보조제와 비교하여 프로인트의 보조제가 사용되는 경우, 용해성 항원은 격렬한 유화 과정 동안 변성될 수 있다. 생성된 변성 항원은 먼저 불용성 또는 비형태적 동족체에 대한 항체를 초래할 수 있다. 총량보다 적게 변성되고, 많은 양의 천연 항원이 존재하기 때문에, 프로인트의 보조제의 사용 효과는 면역에 대한 추가의 항원을 사용함으로써 극복될 수 있다. 정말로, 두개의 면역원 농도에서는 불용성 항체 반응성의 차이가 없는 반면에, 높은 면역원 농도에서는 용해성 동족체 항체 반응성의 증가가 있었다.
c) 생체 내 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A의 중화능의 시험
상이한 보조제를 사용하여 생성된 pMA1870-2680 단백질에 대한 발생된 항체의 독소 A를 중화시키는 능력을 생체 내에서 비교하였다. 1 ㎎의 면역원 농도에서 각 4개의 보조제로 면역된 닭의 달걀로부터 PEG-정제된 IgY를 0.1 M 탄산 완충액 (pH 9.5)에서 0.5X 노른자 용적로 희석하였다. 상이한 보조제를 사용한 IgY 중화수용능에서 최적 시차를 예시하여서, 이 항체 농도(0.5X)를 선택하였다. 면역전 항체도 탄산에서 0.5X 농도를 대조구로 사용하였다. 항체를 탄산 완충액으로 희석하여, 위에서 적게 분해되면서 경구 투여될 수 있게 하였다.
모든 0.5X 제제의 280 nm에서의 흡광에 의한 IgY 단백질 농도는 2.4-2.5 ㎎/㎖였고, 이 중 25 내지 50 ㎍/㎖은 씨. 다이피셀 독소 A 재조합 단백질에 대한 특이적 항체였다. 5개의 IgY 프렙을 사용한 씨. 다이피셀 독소 A에 대한 햄스터의 생체 내 방어 연구를 실시예 14(c)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 5개 집단은 4마리의 수컷 30-40 g 골든 시리안 햄스터(챨스 리버)로 각각 구성되었다. 각 햄스터에 1 ㎖의 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY 또는 면역전 IgY 중 30 ㎍의 씨. 다이피셀 독소 A(테그 랩스)의 혼합물을 투여하였다. 이 혼합물을 먼저 경구 투여하기 전에, 1시간 동안 37℃에서 예비인큐베이션하였다. 이어서, 설사 및 치사에 대해 투여 후 동물을 24시간 동안 관찰하였다. 결과를 표로 만들어 표 44에 기재하였다.
| 치료군 | 건강a | 설사a | 치사a |
| 면역전 | 0 | 1 | 3 |
| 프로인트의 보조제 | 0 | 0 | 4 |
| 게르부 | 4 | 0 | 0 |
| RIBI | 4 | 0 | 0 |
| 퀴일 A | 4 | 0 | 0 |
| a 24시간 후 연구 결과 | |||
표 44에 기재된 결과는 씨. 다이피셀 독소 A와 0.5X 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY의 예비 혼합물을 게르부, RIBI 및 퀴일 에이 보조제를 사용하여 투여되기 전에 햄스터에서 모든 징후 및 질병으로 인한 치사를 예방하였다. 대조적으로, 프로인트의 보조제(0.5X 항체 제제)과 혼합된 씨. 다이피셀 독소 A를 사용하여 생성된 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY로 처리된 모든 동물은 방어되는데 실패하였고, 햄스터는 설사를 하였고, 24시간 내에 치사하였다. 면역전 IgY로 처리된 4마리의 햄스터 중 3마리는 치사하였고, 얼마 않되는 생존자는 심한 설사를 하였다. 이 결과는 게르부, RIBI 및 퀴일-에이를 사용하여 생성된 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY는 생체 내에서 씨. 다이피셀 독소 A를 중화시킬 수 있는 반면, 프로인트의 보조제에 의한 동일 농도로 생성된 IgY는 할 수 없었다는 것을 보여주었다. 프로인트의 보조제에 의해 생성된 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY가 씨. 다이피셀 독소 A를 중화시킬 수 없는 것은 용해성 독소 A 동족체에 대한 낮은 ELISA 반응성과 관련되어 있다. 대조적으로, 모든 다른 보조제는 용해성 동족체에 대해 높은 수준의 항체를 초래하고, 중화하였다. 이 결과는 항체의 중화능이 그들의 불용성 동족체가 아닌, 용해성 동족체 대한 반응성과 관련되어 있다는 것을 의미하였다. 또한, 이 결과는 용해성 또는 형태적 씨. 다이피셀 독소 A 면역원의 보존은 중화 항체를 생성하는데 중요하다는 것을 의미하였다. 따라서, RIBI 또는 게르부와 같은 보조제의 선택은 생체 내에서 방어성 항-씨. 다이피셀 독소 A 항체를 생성하는데 중요한 면역원의 형태를 보존하는데 중요하였다.
실시예 36
재조합 pPA1870-2680 단백질에 대한 항체를 사용한 독소 A의 생체 내 중화
씨. 다이피셀 독소 A 재조합 pPA1870-2680(N/C)로 면역된 닭이 중화 항체를 유발하는지를 측정하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다. 이 실시예는 a) 4개의 상이한 보조제를 사용한 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 재조합 pPA1870-2680(N/C)로 닭의 면역법, b) 항-재조합 IgY의 정제 및 검출, 및 c) 독소 A로 인큐베이션된 항-pPA1870-2680 항체를 사용한 햄스터의 생체 내 중화 연구에 관한 것이다.
a) 4개의 상이한 보조제를 사용한 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 재조합 pPA1870-2680(N/C)로 닭의 면역법
알을 낳는 레그혼 종을 씨. 다이피셀 독소 A 재조합 pPA1870-2680(N/C)(실시예 29d)로 면역시켰다. 재조합 단백질을 pET 벡터에서 발현시키고, pMal-c(실시예 11)과 같은 다른 벡터에서 발현된 동일 영역과 비교하여 매우 낮은 수준의 내독소를 함유하는 매우 순수한 형태로 단리할 수 있는 것으로 나타났다. 이 결과는 pPA1870-2680 재조합 단백질이 백신으로 상용될 수 있음을 보여주었다. 따라서, pPA1870-2680의 항체 반응 증진 능력을 시험하였다.
4 집단의 닭(2마리/집단)을 4가지 상이한 보조제를 사용하여 100 g의 pPA1870-2680(N/C) (실시예 29d에서 기재된 바와 같이 정제)로 면역시켰다. 보조제로는 프로인트의 보조제(깁코), 파울(RIBI) 보조제(RIBI 이뮤노케미칼), 게르부(바이오테크) 및 퀴일 에이 (애큐리트 케미칼)이 있다. 재조합물과 사용된 각 보조제의양은 실시예 35에 기재되어 있다. 닭을 2주 간격으로 4번 면역시켰다.
b) 항-재조합 IgY의 정제 및 검출
상이한 보조제를 사용하여 항-재조합 pPA1870-2680(N/C) 수준을 ELISA에 의해 비교하였다. 마지막 추가 자극한지 약 1주일 후, 표준 PEG 제제를 각 집단의 달걀로부터 제조하였고, 0.1 M 탄산 완충액(pH 9.5)에서 4X 농축물(모두 약 20 mg/ml IgY를 함유)로 재현탁시켰다. 표준 ELISA 프로토콜(실시예 13c)를 수행하여 용해성 면역원 pPA1870-2680에 대한 특이적 항체 반응성을 측정하였다. ELISA 결과는 도 41에 도시하였다.
도 41에서, 410 nm에서의 흡광을 각 시험된 항체 희석액의 log10에 대해 플롯하였다. 흑색 사각형은 면역전 IgY를 사용한 ELISA의 결과를, 흰색 사각형, 흑색 다이아몬드, 흰색 다이아몬드 및 흑색 삼각형은 pPA1870-2680(N/C)(인터벌 A2)을 사용하여 생성된 항체를 사용한 ELISA의 결과는 나타내고, 보조제로는 게르부 (G-A2), 퀴일 에이(Q-A2), RIBI(R-A2) 및 프로인트의 보조제 (F-A2)이 있다.
4시간 동안 면역시킨 후, 모든 닭은 pET 벡터에서 발현되는 씨. 다이피셀 독소 A 재조합물에 대한 특이적 IgY 반응을 생성하였다[즉, pPA1870-2680(N/C)]. 프로인트의 보조제, 가금(RIBI) 보조제 및 퀴일 에이를 사용하여 생성된 반응은 도 41에 도시된 것과 필적할만 하였다. 낮은 항체 반응은 게르부로 면역시킨 닭에서 나타났다. 흥미롭게도, 프로인트의 보조제와 pPA1870-2680(N/C)을 사용하여 가장 높은 항-재조합 활성을 얻었고, 반면에 상기 실시예(실시예 35)에서는 pMal-c(pMA1870-2680)에서 발현된 동일 재조합 영역을 사용한 프로인트의 보조제는 가장 약한 반응을 생성하였다. 다른 보조제들은 양 재조합물을 비교하여 유사한 항체 반응을 초래하였다. 이 결과는 프로인트의 보조제를 사용한 항체 반응의 수준이 사용된 항체의 유형에 의존한다는 것을 의미한다.
c) 씨. 다이피셀 독소 A로 인큐베이션된 항-pPA1870-2680(N/C) 항체를 사용한 햄스터의 생체 내 중화 연구
생체 내에서 씨. 다이피셀 독소 A를 중화할 수 있는 항체의 능력은 RIBI 및 프로인트의 보조제를 사용하여 생성된 pPA1870-2680(N/C) 단백질에 대해 발생된 항체를 사용하여 비교하였다. 이 분석법은 항체를 10 mg/ml의 IgY 단백질을 함유하는 2X 농출물로 희석하는 것을 제외하고는 실시예 35c에 기재된 바와 동일하게 수행하였다. 씨. 다이피셀 독소 A(테크 랩스)를 프로인트의 보조제 및 가금(RIBI) 보조제를 사용하여 생성된 항체와 혼합하고, 햄스터에 경구적으로 투여하였다. 면역전 IgY로 처리된 햄스터를 대조구로 사용하였다. IgY를 투여한 지 24시간 후에 설사를 하거나 또는 치사한 많은 건강한 햄스터를 표 45에 기재하였다.
| 치료군 | 건강 | 설사 | 치사 |
| 면역전 | 0 | 0 | 4 |
| 프로인트의 보조제 | 4 | 0 | 0 |
| RIBI | 4 | 0 | 0 |
표 45에 기재된 바대로, pPA1870-2680(N/C)과 함께 사용된 프로인트의 보조제 및 RIBI 보조제는 면역전 IgY과 비교하여 씨. 다이피셀 독소에 대한 생체 내 중화 항체를 밝힐 수 있다. 이 실시예 및 실시예 35에 기재된 씨. 다이피셀 독소 A를 중화시키는 항체의 능력은 그들의 용해성(천연) 재조합 단백질에 대한 ELISA 반응성과 관련이 있는 것으로 보인다. 이 결과는 씨. 다이피셀 독소 pPA1870-2680(N/C)는 닭에서 면역원이고, 생체 내 중화 항체를 생성할 수 있음을 보여주었고, 따라서 pPA1870-2680(N/C) 단백질은 우수한 백신 후보임을 보여주었다.
실시예 37
경구 투여를 위한 재조합 씨. 다이피셀 독소 A에 대해 발생된 IgY의 장용 코팅
재조합 씨. 다이피셀 독소 A에 대해 발생된 새의 항체(IgY)가 장용 코팅될 수 있고 생체 내 방어능을 잠재적으로 보유할 수 있는지를 측정하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다. 이 실시예는 a) 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 항체의 장용 코팅, b) 장용 코팅된 IgY의 붕괴 동력학을 pH의 함수로 측정하기 위한 용해 연구 및 c) ELISA에 의한 코팅 및 용해 후 항체 반응성의 안정성의 측정에 관한 것이다.
a) 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 항체의 장용 코팅
선행 연구는 효과적 장용 코팅 방법을 측정하기 위해 수행하였다. 장용 코팅된 새의 항체는 투여 경로가 구강인 경우, 용액으로 운반되는 항체에 비하여, 위에서의 분해에 대해 내성을 지녀야한다. 장용 코팅은 위에서의 낮은 pH 범위에서도 보존되고, 따라서, 코팅된 IgY는 위를 통과하면서 분해되지 않으나 높은 pH(약 6.0)에서 용해되고 장에서 IgY를 방출할 수 있어야 한다. 시험을 위해 선별된 장용막의 또 다른 특성은 코팅 과정에서 유기 용매 대신 수용액에서 상용성이라는 것이다. 장용막의 이러한 특성은 코팅 과정 중 아마도 IgY 항체의 형태 및 완결성을 보존해야 할 것이다. 장이 씨. 다이피셀 질병 부위이기 때문에, 항-씨. 다이피셀 독소 IgY의 장용 코팅은 감염 부위에서 유용한 항체의 양을 농축하여 효율을 증진시키고, 비코팅된 IgY의 사용과 비교하여 요구되는 유효 투여량이 감소되야만 한다.
항-씨. 다이피셀 독소 A 항체를 하기와 같이 코팅하였다. 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질 pMA1870-2680에 대한 6 g의 동결건조된 항체(실시예 11)을 제조하였다. 재조합 단백질로 면역시킨 닭의 달걀로부터 수거된 IgY를 PEG-침강화로 정제하였다. 정제 후 IgY 펠렛을 약 1/4의 출발 노른자 용적(4X)로 0.1 X PBS(pH 7.4)에 재현탁시키고, 200 내지 250 ml의 용적을 600 ml의 동결 건조 플라스크(라브콘코)로 옮겼다. IgY 용액을 드라이 아이스를 함유하는 시약 알코올조에서 회전시킴으로써 플라스크에서 플래쉬 동결하였다. 동결된 항체를 제조자의 지시에 따라 작용되는 라브콘코 프리즈 드라이 시스템/리프 락 4.5 유닛 상에서 동결 건조시켰다. 약 250 ml의 4X IgY 제제를 동결건조시킨 후 약 10 g의 건조 물질을 얻었다.
동결건조된 IgY를 장용 코팅을 위해 코팅 플레이스 인크. (미국 위스콘신주 베로나)에 보냈다. 항체를 단일 작용에서 물질이 효율적 및 균일하게 소규모로 코팅되기에 적절한 울스터 코팅 챔버를 사용하여 캡슐화하였다. 단 단계 직접 방법 또는 두 단계 방법은 논-패리얼(즉, 40-60 메쉬 크기의 당 입자)을 사용하였다. 동결건조된 IgY를 막 코팅으로 직접 오버코팅하거나 또는 먼저 IgY 그 자체가 논-패리얼을 오버코팅하는데 사용된 두 단계 방법을 수행하였다. 이어서, IgY 코팅된 당 입자를 장용막으로 오버코팅하였다. 당 입자의 사용은 코팅 챔버에서 항체가 보존되는데 요구되는 여분의 용적(bulk)를 공급하고, 장용막이 더욱 균일하게 도포되도록 도울 수 있다.
두개의 상이한 수성 장용막을 선택하고, 각 코팅 방법을 사용하였다. 동결건조된 IgY는 아쿠아테릭(Aquateric FMC Corp.) 또는 유드라기트 (Eudragit)(등록 상표) L30D (롬 테크 인크.) 이 코팅들은 모두 pH 6.5 또는 5.5에서 각각 수용성 장용막이다. 이 장용막들은 상기 요구에 대한 적절한 선별 영역을 만족시킬 수 있기 때문에 모두 선택하였다. 장용막을 사용한 각각의 상이한 코팅 방법으로 장용 코팅된 항체 생산물을 얻었다. 당 입자를 사용한 두 단계 방법은 울스터 장치에서 오버코팅 방법을 물질의 손실이 적고, 최종 산물의 큰 수율을 지닌 기술적으로 용이하게 하였다. 약 27-30 중량%의 장용 코팅을 직접법을 사용하여 IgY에 도포하였다. 이 장용 코팅된 물질의 약 70%의 잔사 중량은 IgY였다. 장용 코팅의 약 32-33 중량%를 IgY-오버코팅된 당 입자에서 획득하였다. 장용 입자의 잔사 67 중량%는 약 40-50%의 당 입자 및 약 20%의 IgY로 이루어진다.
b) 장용 코팅된 IgY의 붕괴 동력학을 pH의 함수로 측정하기 위한 용해 연구
각각의 장용 코팅된 IgY의 수행능을 용해 프로파일을 측정함으로써 시험하였다. 장용막으로 적절히 코팅된 IgY 입자는 약 pH 1 내지 2인 위액에서는 보존되나, pH 7.5인 장액에서는 용해되고 IgY를 방출해야만한다. 약 pH 1.2이 증진된 위액 및 pH 7.5의 증진된 장액을 소화 효소가 생략된 점을 제외하고는 USP 지침에 따라 제조하였다[United States Pharmacopeia, Vol. XXII (1990) United States Pharmacopeial Convention, 미국 매릴랜드 주 록빌 소재, pp 1788-1789]. 10 mg의 각 장용 코팅 제제 (즉, 아쿠아테릭 및 유드라기트 (등록 상표) 코팅)을 1 ml의 증진된 위 및 장액에 가하고, 실온에서 1-2시간 동안 온화하게 혼합하였다. 용액의 부분 시료를 상이한 시간대에서 취하고, 용액에 용해된 단백질의 존제를 체크하였다. 용액 중 단백질의 양을 280 nm에서의 흡광 또는 BCA 단백질 분석법(피얼스)을 사용하여 측정하였다.
연구는 아쿠아테릭 및 유드라기트 (등록 상표) 코팅으로 직접 코팅된 IgY 및 아쿠아테릭-오버코팅된 IgY 당 입자는 용해 연구에서 적절하지 못하다는 것을 입증하였다. 이 입자를 가한지 수분 내에 pH 1.2 및 7.5에서 IgY가 용액 중 방출되었다. 흡광에 의해 모니터링된 아쿠아테릭-오버코팅된 IgY 당 입자에 대한 용액 프로파일은 도 42에 도시되어 있다. 유드라기트 (등록 상표)-오버코팅된 IgY 당 입자에 대한 용액 프로파일은 도 43에 도시되어 있다.
도 42에서는 280 nm에서의 흡광을 분에 대해서 플롯하였다. 증진된 위액 중 아쿠아테릭-오버코팅된 입자로부터 IgY의 방출은 흑색 사각형으로 표시되고, 증진된 장액 중 코팅된 입자로부터 IgY의 방출은 흰색 사각형으로 표시하였다. 아쿠아테릭막은 단백질에서와 유사한 파장에서 그 자체가 UV를 흡수하기 때문에, 280 nm에서의 UV 흡광은 용액 중 IgY의 양을 정확히 정량화할 수 없다. 따라서, 단백질 농도의 정확한 측정을 위하여, 1시간(60분) 동안 용해에서 단백질을 BCA 방법을 사용하여 정량하였다.
도 42에서는 두개의 액체 중 아쿠아테릭-오버코팅된 IgY의 용해 후 발견된 특이적 IgY의 양이 pH 1.2에서 4 ㎎/㎖이고 pH 7.5에서는 4.9 ㎎/㎖로 유사하였다. 도 42에 도시된 위액 및 장액 간의 흡광의 차이는 장액에 용해되는 아쿠아테릭막의 존재로 인한 것이었다.
실패한 코팅의 수행능과 대조적으로, 유드라기트(등록상표)-오버코팅된 IgY 당 입자는 위액에는 천연 그대로 남아 있으면서, 시간이 지나면서 증진된 장액의 용액 중에 적절히 개방되고, IgY를 방출하였다. 유드라기트(등록상표)-오버코팅된 IgY 당 입자의 위액 및 장액에서의 용해 프로파일을 시간에 대한 함수로서 도 43에 도시하였다.
도 43에서, 280nm에서의 흡광을 분에 대해 플롯하였다. 유드라기트(등록상표)-오버코팅된 입자로부터 증진된 장액으로의 IgY의 방출을 흑색 사각형으로 표시하고, 코팅된 입자로 부터 IgY 강화 장액으로의 방출을 흰색 사각형으로 표시하였다. 유드라기트(등록상표)는 코팅 중에서 발견되는 양으로는 UV를 흡수하지 않기 때문에, 280nm에서의 흡광은 직접 단백질 농도에 대해 전환될 수 있다.
도 43에 도시된 바와 같이, 위액에서는 단백질이 거의 또는 전혀 방출되지 않는 반면에, 장액에서는 2시간 후 최대 용해에 도달할 때까지 일정한 속도로 단백질을 연속적으로 방출하였다. 10 ㎎/㎖의 유드라기트(등록상표)-오버코팅된 입자는 용해된 후 약 2.0 내지 2.5 ㎎/㎖의 IgY를 방출하였다. 위액에서의 유드라기트(등록상표)-오버코팅된 입자는 장시간 동안, 4℃에서 한주 더 인큐베이션한 후에도 손상되지 않은 채 남아있었다.
유드라기트(등록상표)-오버코팅된 IgY 당 입자의 용해의 프로파일은 보통의 생리적 조건을 모방한 조건(즉, 위장관을 통한 증진된 통과) 하에서 측정하였다. 입자를 먼저 위액에서 120분 동안 인큐베이션한 후, 장액에서 180분 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션은 37℃에서 온화하게 혼합하면서 일어났다. 이 조건 하에서(즉, 위액에서 인큐베이션한 후, 장액에서 인큐베이션), 유드라기트(등록상표)-오버코팅된 당 입자로부터의 IgY는 도 42에서 발견된 위액 단백질(위액에서만 인큐베이션함)로 방출되지 않았으나, 장액에서는 도 42에서 발견된 것과 비슷한 수준으로 방출되고 검출되었다(약 2시간 후 2 내지 2.5 ㎎/㎖ 단백질 방출).
상기 용해 연구는 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY는 유드라기트(등록상표) 및 논-패리얼을 사용하여 성공적으로 장용 코팅됨을 입증하였다.
c) ELISA에 의한 코팅 및 용해 후 항체 반응성의 안정성의 측정
오버코팅 처리한 후, 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY의 안정성을 측정하였다. 이는 코팅하기 전 및 코팅 처리 후에 pH 1.2 이어서 pH 7.5에서 용해한 후, 항체의 ELISA와의 반응성을 비교하여 시험하였다. 용해한 후 유드라기트(등록상표)-오버코팅된 IgY 당 입자로 부터 획득한 면역전 IgY, 동결건조된 항-재조합 독소 IgY 출발 물질 및 항 재조합 독소 A IgY를 모두 단백질에 대해 정량화하고 PBS(pH 7.4) 중 2 ㎎/㎖로 표준화하였다. ELISA를 실시예 35c에 기재된 바와 같이 수행하여 재조합 독소 A pPTrxA1870-2680N/C에 대한 항체를 검출하였다. ELISA 결과를 표 46에 기재하였다.
| 희석율 | 면역전 IgY* | 코팅하기 전의 항-재조합 A* | 코팅한 후의 항-재조합 A* |
| 1:50 | 0.017 | 1.4 | 1.2 |
| 1:250 | 0.005 | 0.59 | 0.38 |
| 1:1,250 | 0.004 | 0.15 | 0.10 |
| 1:6,250 | 0.005 | 0.037 | 0.026 |
| 1:31,250 | 0.007 | 0.015 | 0.009 |
| 1:156,250 | 0.009 | 0.009 | 0.007 |
| * 평균 A280 판독 | |||
표 46의 결과는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질에 대한 유드라기트 (등록상표)의 코팅 전후로, 항 재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY의 반응성은 매우 유사한 것으로 입증되었다. 이 결과는 코팅 처리가 IgY에 대해 유해하지 않으며, 생리적 조건 하에서 용해된 후 IgY는 반응성 및 작용성인 채로 남는다는 것을 의미한다.
상기의 결과는 안정하고 활성적인 장용피 코팅된 IgY가 생산됨을 입증하였다.
실시예 38
재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질을 사용한 클로스트리듐
다이피셀 감염에 대한 햄스터의 면역
클로스트리듐 다이피셀 독소 A 재조합 단백질로 백신 접종된 햄스터가 클로스트리듐 다이피셀 감염에 대한 방어 항체를 유도하는지를 결정하기 위해 다음의 실험을 수행하였다. pMal-c 또는 pET 벡터에서 발현된 세 개의 상이한 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 재조합체를 비교하였다. 실험은 a) 햄스터의 면역, b) ELISA에 의한 액성 및 점액성 항-재조합 항체 반응의 탐지 및 c) 클로스트리듐 다이피셀을 사용한 햄스터의 공격 연구를 포함하였다.
a) 햄스터의 면역
각각 9 내지 11 마리의 구성원을 포함하는 90 - 100 그램의 암컷 골든 시리안(Golden Syrian) 햄스터의 3 개의 군을 다음과 같이 실험하였다. 각 군으로부터의 햄스터들을 확인용 귀 펀치를 사용하여 개별적으로 꼬리표를 달았다. 각 군의 동물들을 함께 사육하고 실험 과정 전반에 걸쳐 수시로 사료와 물을 공급하였다. 햄스터들을 pMal-c 벡터 중에서 생성된 두 개의 상이한 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질 반복 단편으로 면역시키고, 말토오스 결합 단백질 (MBP) 융합체 및 pET 벡터 중에서 생산된 한 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질 반복 단편으로 발현시켰다. 동물들을 pPA1870-2680N/C(실시예 15), pMA1870-2680, pMA1960-2680이라고 하는 pMA1870-2680의 소단편 또는 대조군으로서 MBP(pMal-c) 단독의 것 중 어느 하나의 정제 단백질 25 ㎍으로 피하 면역시켰다. 세 개의 모든 재조합 pMal 벡터들을 실시예 28c에서 기술한 바와 같이 증식시키고, 단백질을 발현시킨 후 정제하였다. 재조합 pPA1870-2680N/C를 실시예 29f에 기술한 바와 같이 정제하였다.
항원 200 ㎕ 및 완전 프로인트 보조제(첫 주사용) 및 불완전 프로인트 보조제(후속 주사용)으로 이루어진 혼합물을 목 뒤의 피하에 주입하였다. 백신 접종은 동물들을 가볍게 마취시킨 후, 27 게이지 투베르쿨린 주사기 1 ㎖을 사용하여 투여하였다. 동물들을 대략 2 주 간격으로 5회 백신 접종시켰다.
b) ELISA에 의한 액성 및 점액성 항-재조합 항체 반응의 탐지
햄스터에서 액성 및 점액성 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A IgY 역가의 탐지는 ELISA에 의하여 결정하였다. 액성 반응에 대하여, 각 군의 모든 구성원으로부터의 혈청을 수집하고 항-재조합 독소 A IgG 농도를 분석하였다. 최종 면역시킨지 적어도 일주일 후에, 햄스터들을 에테르 마취시켰다. 심장 천자에 의해 출혈시키고 혈청을 수집하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트(Probind, Falcon)을 용해성 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 재조합체, pPTrxA1870-2680N/C(실시예 29e)로 PBS(pH 7.4) 중의 0.05㎍/㎖로 웰 당 100 ㎕ 씩 밤새 피복시켰다. 표준 ELISA 공정을 실시예 35b에 기술된 바에 따라 수행하였다. 사용된 2차 항체는 1/2000 희석배의 양 항-햄스터 IgG-알칼리성 포스파타아제(Southern Biotech)이었다. 1/250으로 희석한 각 혈청 시료의 중복 시험 웰로부터의 410 nm에서의 평균 흡광도는 도 44에 나타냈다.
도 44에 있어서, 1:250 희석시킨 혈청의 OD410은 pMal-c (삽입체가 없는 pMal-c 벡터), pMA1870-2680(실시예 28c), pMA1960-2680(실시예 28b) 또는 pPA1870-2680(실시예 15) 중 어느 하나로 면역시킨 햄스터로부터 취하였다. 세로좌표 상의 숫자는 군 내의 동물들에 부여한 숫자를 나타낸다.
도 44로부터의 결과들은 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 재조합체로 면역된 모든 햄스터들은 혈청 중에 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A IgG를 생성함으로써 반응하였음을 입증한다. 일 군의 햄스터들 내의 항체 반응에서 약간의 변이성이, 이 차이는 4배 이하였긴 하지만, 존재하였다. pMA1870-2680 및 pPA1870-2680에 대한 평균 항체 반응은 pMA1870-2680에 대한 반응 보다 균일하게 높았다. pMal 단백질로 면역된 햄스터들은 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 재조합 단백질에 대한 항혈청 IgG 반응을 나타내지 않았다.
점액성 IgA 반응이 면역후에 유발되었는지도 또한 ELISA에 의해 결정되었다. 각 군의 4원으로부터의 새로이 단리된 배설물들을 수집하고, 체중을 재고 0.05% 치메로살을 함유하는 PBS (pH 7.4) 중의 변통 100 ㎎ 당 300 ㎕으로 와동에 의해 현탁시켰다. 배설물 현탁액을 소형 원심분리기 중에서 14,000 rpm으로 5분 동안 원심분리시켰다. 마이크로타이터 플레이트들을 상기한 바와 같이 재조합 항원으로 피복시켰다.
표준 ELISA 공정은 2차 항체로서 1/1000의 양 항-마우스 IgG-알칼리성 포스파타아제(Southern Biotech)와 함께 사용하였다. 이 접합체는 항-햄스터 IgA가 상업상 입수가 용이하지 않고 항-마우스 항체가 햄스터 IgA와 교차반응하는 것으로 이전에 보고되어 있기 때문에 항-햄스터 IgA 대신에 사용하였다. 배설 추출물의 모든 시료에 있어서, 재조합 독소 A에 대한 점액성 IgA는 ELISA에 의해 탐지되지 않았다. 이들 결과는 톡소이드 A에 대한 IgA가 클로스트리듐 다이피셀 독소 A로부터 제조된 톡소이드로 면역된 햄스터에서 탐지되지 않았다는 이전의 연구[Kim and Rolfe (1989) Microbial Ecology in Health and Disease 2:47]와 부합된다.
c) 클로스트리듐 다이피셀을 사용한 햄스터의 공격 연구
백신 접종된 햄스터 (상기 단락에서 기술함)를 클로스트리듐 다이피셀로 공격시켜 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 항체가 클로스트리듐 다이피셀 질환에 대하여 방어적인가를 결정하였다. 클로스트리듐 다이피셀의 독성 유발 균주로 감염된 정상의 햄스터들은 설사로 시작하는 치명적인 질병이 발병되어 맹장(결장 부근) 및 회장(실시예 9에서 기술한 바와 같음)의 심한 소장결장염으로 인해 결국 치사하게 된다.
4 군의 백신 접종된 햄스터들을 먼저 물 1 ㎎ 중의 클린다마이신-포스페이트(Clindamycine-phosphate, Biomol) 1㎎/체중 100g으로 복강내 투여하여 각각을 예비처리하였다. 약 24 시간 후, 햄스터들을 18 게이지 주사기를 사용하여 무균 염수 1 ㎖ 중의 1 x 106 클로스트리듐 다이피셀로 경구 공격시켰다. 이 동물들을 투여하기에 앞서 에테르로 가볍게 마취시켰다. 클로스트리듐 다이피셀, ATCC 43596의 독소원성 균주는 CCFA 플레이트(BBL) 상에서 48 시간 증식시킨 후 사용하였다. pMA1960-2680 면역법 군의 한 햄스터가 에테르 과량투여의 사고로 인해 치사하여 이 군의 수가 9에서 8로 줄었다. 면역 연구의 결과는 표 47에 나타냈다.
| 백신 접종 군 | 방어 % |
| pMA-c (MBP) | 10%(1/10) |
| pMA1960-2680 | 62%(5/8) |
| pMA1870-2680 | 30%(3/10) |
| pPA1870-2680 | 19%(2/11) |
표 47에 나타낸 결과들은 치사에 대한 방어가 각각의 재조합 독소 A 단백질(예, pMA1960-2680 및 pMA1870-2680)로 면역시킨 일부의 햄스터에서 일어났음을 입증한다. 이들 결과들은 0.05 이하의 P-값으로 융합 대조군(MBP만을 발현하는 pMal-c )에 비교하여 통계학적으로 중요하지 않다. 90%의 치사율이 융합 대조군 면역된 군(pMal-c)에서 일어났다. pMA1960-2680 면역법 군에 있어서 치사율은 38%이었다. pMA1870-2680 면역법 군에 있어서 치사율은 70%이었고, pPA1870-2680 면역법 군에 있어서는 81%이었다. 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 백신 접종 군에서 치사에 이르는 시간은 대조군에 비교하여 지연되지 않고 감염후 3일 이내에 발생하였다. 치사된 햄스터의 검시 결과 심한 거대맹장 등의 전형적인 병리학을 나타냈다.
pMA1960-2680, pMA1870-2680 및 pPA1870-2680 군들의 대조군에 비교한 시험 군의 특이적 P-값은 각각 0.10 미만, 0.75 미만 및 0.75 미만이었다. pMA1870-2680 면역법 군 중에서 하나를 제외한 모든 햄스터가 감염후 1 내지 2일만에 설사 증상을 보였다. 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 항체 역가와 방어의 수준 사이에는 아무런 상관관계가 없는 것으로 보였다. 예를 들면, pMA1960-2680 면역법 군에서 6번 햄스터는 2번 햄스터에 비교하여 더 낮은 ELISA 역가를 가졌으나(도 44 참조), 6번은 여전히 생존한 반면 2번은 방어하지 못하고 치사하였다. 이들 결과로부터, 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 반복 단백질 중 하나로 백신 접종된 햄스터들은 클로스트리듐 다이피셀 유발 설사에 대해 방어하지 못하였고, 19 내지 62%가 질병의 치명적인 단계로부터 방어하였다.
상기 결과들은 pUC에서 발현된 보다 소량의 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 재조합 단편(1960-2680 인터벌)로 백신 접종된 햄스터들이 질병의 치명적인 단계에 대해 단지 부분적으로 방어하였고, 그들 햄스터의 어느 것도 설사에 대해 방어하지 못하였다는 이전에 간행된 연구 [Lyerly et al. (1990) Curr. Microbiol. 21:29]와 상관 관계가 있다. 리엘리 등 [Lyerly et al. (1990) Curr. Microbiol. 21:29]은 시험된 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 재조합 단백질에 대한 항체가 질병의 설사 단계를 예방하지 못하였으며 햄스터의 반수의 치사가 독소 A 재조합체에 대한 중화 혈청 항체의 변화하는 농도에 기인하는 것이라고 진술하였다. 이상의 결과로부터, 일 군의 햄스터들 사이에서 나타난 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 항체 역가의 차이는 방어가 동물 모두에 있어서 일어나지 않는 이유를 설명할 수 없다. 이상의 결과들은 아마도 독소 B 재조합 단백질인 추가의 성분이 클로스트리듐 다이피셀 질병에 대한 보다 효과적인 백신에 대해 필요할 것 같다.
실시예 39
클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 독소 B 재조합 단백질을 사용한 클로스트리듐 다이피셀 감염에 대한 햄스터의 백신 접종
햄스터들을 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 또는 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 단독으로 또는 혼합물로 면역시켜 이것이 재조합 단백질에 대한 액성 반응을 일으키는지를 시험하였다. 또한, 이들 백신 접종에 의해 생산된 항체의 능력을 클로스트리듐 다이피셀의 감염으로부터 햄스터를 방어하는 능력에 대해 시험하였다. 구체적으로, 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B에 대해 발생된 항체가 생체내에서 단독으로 또는 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단독으로의 백신 접종에 의해 제공된 것 이상으로 방어를 제공하는가를 결정하였다. 시험은 a) 햄스터의 면역, b) ELISA에 의한 액성 및 점액성 항체 반응의 결정 및 c) 백신접종 햄스터에서의 생체내 공격 연구를 포함하였다.
a) 햄스터의 면역법
백신 접종에 사용된 재조합 단백질은 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 재조합 단백질 pPA1870-2680N/C(실시예 11 및 29), 및 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 재조합 단백질 pPB1750-2360(실시예 15b)이었다. 재조합 단백질은 실시예 38에서 사용된 pMal-c 벡터 대신에 pET 벡터에서 발현되었는데, pET 벡터를 사용하여 발현되고 단리된 단백질이 더 높은 수준의 순도 및 더 낮은 농도의 내독소로 정제될 수 있는 것으로 밝혀졌기 때문이다. pET 벡터에서 재조합 단백질의 생산은 특히 높은 순도 및 낮은 수준의 잠재적으로 해로운 내독소를 요구하는 인간 백신으로서의 재조합 단백질의 가능한 이용에 대해 특히 권유할 만하다.
면역법을 위해, pPA1870-2680 100 ㎍, pPB1750-2630 100 ㎍, 또는 각각의 100 ㎍의 조합물(총 200 ㎍)을 게르부 보조제(Gerbu, Biotech) 2㎍과 혼합시켰다. 대조군은 소혈청 알부민(BSA) 100 ㎍과 게르부 보조제로 면역시켰다. 각 군(총 4 군)은 100g의 9 내지 11 마리의 암컷 골든 시리안(Golden Syrian) 햄스터(Charles river)으로 이루어졌다. 동물들을 개별적으로 꼬리표를 달아 구성원을 동정하였다. 햄스터들을 27 게이지 바늘이 있는 1 ㎖ 주사기로 목 뒤를 피하주사하기 전에 가볍게 마취시켰다. 햄스터들을 대략 2 주 간격으로 4회 면역시켰다.
b) ELISA에 의한 액성 및 점액성 항체 반응의 결정
각각의 상기 군들의 모든 개체들로부터의 혈청을 ELISA에 의해 항-재조합 단백질 IgG 농도에 대해 시험하였다. 최종 면역시킨지 적어도 일주일 후에, 각군으로부터의 모든 동물들을 심장의 천자에 의해 출혈시켜 혈청을 수집하였다. 혈청 시료들로부터의 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B를 ELISA에 의해 결정하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트(Probind, Falcon)를 PBS (pH 7.4) 중의 0.05 ㎍/㎖의 pPA1870-2680 단백질 또는 1.0 ㎍/㎖의 pPB1750-2360 단백질 중 어느 하나로 웰당 100 ㎕ 씩 4℃에서 밤새 피복시켰다. 표준 ELISA 공정은 (정확히 실시예 13c에) 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과들은 도 45 및 46에 나타냈다.
두 배의 농도 및 1/250으로 희석에서 수행한 각 혈청 시료의 평균 흡광도는 도 45 및 46에 나타냈다. 도 45는 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 재조합체 (pPA1870-2680) 또는 재조합체 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B (pPA1870-2680 및 pPB1750-2360)의 혼합물 중 어느 하나로 면역시킨 군들에서 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A에 대한 개별 항체 반응도를 나타낸다. 도 46은 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 재조합체 (pPB1750-2630) 또는 재조합체 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B (pPA1870-2680 및 pPB1750-2360)의 혼합물 중 어느 하나로 면역시킨 군들에서 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B에 대한 개별 항체 반응도를 나타낸다.
도 45 및 46으로부터의 결과들은 모든 경우에 있어서 각 동물들이 반응하여 면역원에 대한 특이성 IgG 항체 반응을 일으켰음을 입증한다. 예견한 대로, BSA(음성 대조군)로 면역된 햄스터들은 재조합 항체에 대해 어떠한 항체 반응을 일으키지 않았다. 동일 군의 구성원 내에서 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 또는 B 반응은 마찬가지였다.
면역후에 유발된 점액성 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 항체 또는 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B IgA 반응도 또한 ELISA에 의해 결정하였다. 각 군의 4 원으로부터의 새로이 단리된 배설물들을 수집하고, 체중을 재고 실시예 21에서 기술한 바와 같이 처리하였다. 플레이트들을 혈청 IgG 농도의 측정에 대해 상기한 바와 같이 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A또는 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 항원으로 피복시켰다. 표준 ELISA 공정(실시예 13c)을 양 항-마우스 IgA-알칼리성 포스파타아제(Southern Biotech, Birmingham, AL)와 함께 사용하였다. 모든 배설 추출물의 시료에 있어서, 재조합 독소 A 및 B에 대한 IgA는 탐지되지 않았다. 상이한 재조합체를 사용한 이 시험은 실시예 38에서 발견된 것을 재확인하며 이전의 연구[Kim and Rolfe (1989), 상기함]와 일치한다.
c) 백신 접종 햄스터에서의 생체내 공격 연구
상기 a) 부분에서 기술한 백신 접종 햄스터를 클로스트리듐 다이피셀로 공격시켜 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 또는 B 단독 또는 조합 중 어느 하나에 대한 혈청 항체 반응이 CDAD에 대하여 방어성을 갖는가를 결정하였다. 4 군의 백신 접종 햄스터들을 먼저 물 1 ㎎ 중의 클린다마이신-포스테이트(Biomol) 1㎎/체중 100g으로 복강내 투여하여 CDAD에 대해 각각을 예비처리하였다. 약 24 시간 후, 햄스터들을 18 게이지 주사기를 사용하여 무균 염수 1 ㎖ 중의 1 x 106 클로스트리듐 다이피셀 균으로 경구 공격시켰다. 이 동물들을 투여하기에 앞서 에테르로 가볍게 마취시켰다. 클로스트리듐 다이피셀, ATCC 43596의 독소원성 균주는 CCFA 플레이트(BBL) 상에서 48 시간 증식시킨 후 사용하였다. 면역 연구의 결과는 표 48에 나타냈다.
| 백신 접종 군a | 방어 % |
| BSA | 0%(0/10) |
| pPA1870-2680N/C | 20%(2/8) |
| pPB1750-2360 | 0 %(0/10) |
| pPA1870-2680N/C & pPB1750-2360 | 100%(9/9) |
| a 햄스터 당 100 ㎍의 재조합 단백질을 2 주 간격으로 4회 피하주사하여 백신 접종시킴. | |
표 48에 나타낸 바와 같이, 클로스트리듐 다이피셀로 공격시킨지 1 내지 3일 후, pPA1870-2680 또는 pPB1750-2360 중 어느 하나 및 SBA 대조군으로 면역된 모든 햄스터들에서 설사가 발병되었다. pPA1870-2680으로 면역된 두 마리의 구성원을 제외하고는 이들 3개의 군에서의 모든 햄스터들은 설사의 개시가 탐지된 후 몇 시간에서 48 시간까지에 걸쳐 치사하였다. 검시 결과 클로스트리듐 다이피셀 질병의 충혈되고 확대된 맹장의 특징을 갖는 동물에 있어서 심한 거대맹장을 나타냈다. 대조적으로, pPA1870-2680 또는 pPB1750-2360 단백질의 조합을 포함하는 백신으로 면역된 햄스터들은 설사 등의 질병의 징후를 나타내지 않고 전체 14일의 감염후 관찰 기간 동안 건강하게 살아 남았다. 실제로, 이들 동물들은 감염 후 적어도 5 개월의 기간 동안 건강하게 생존하였다: 이들 결과는 pPA1870-2680C 또는 pPB1750-2360의 조합을 사용한 백신 접종은 클로스트리듐 다이피셀로 감염된 햄스터에 대해 완전하고 장기적인 방어를 제공함을 입증한다.
조합 백신을 사용하여 나타난 방어 효과는 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 또는 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 만으로 백신 접종시킨 햄스터에 비교하여 이 군에서 항체 역가의 차이에 기인하지 않았다. 클로스트리듐 다이피셀 독소 A/B조합(즉, pPA1870-2680 및 pPB1750-2360)을 사용하여 면역시킨 햄스터의 방어는 대조군에 비하여 통계적으로 유의성이 있었다; P값은 0.001 미만인 것으로 결정되었다.
상기 결과들은 재조합 독소 A 및 B 단백질들이 클로스트리듐 다이피셀에 대한 효과적인 백신에 대한 두 결정적인 성분이고 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 또는 B 단백질 단독에 대한 항체의 유발은 완전한 방어를 부여하기에는 불충분하였음을 증명한다. 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A이외에 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B에 대해 발생된 항체들은 모두 방어를 부여하였고 이들 모두는 상승적으로 작용하여 중화시킨다. 본 발명은 특정 기작에 의해 제한되지 않으나, 항-클로스트리듐 다이피셀 독소 혈청 항체로부터의 방어는 클로스트리듐 다이피셀 소장결장염의 초기 단계에서 수반되는 염증 동안 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 중화 항체의 조직 또는 장의 관강으로의 유출에 기인할 것이다.
상기(재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B) 및 실시예 32(c)(iii)(클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 모두에 대해 야기된 항체의 혼합물로 이루어진 항독소의 투여)에서 나타낸 결과들은 서로를 강력히 지지한다. 이들은 함께 CDAD로부터의 충분한 방어(즉, 질병율 및 치사율로부터의 방어)는 능동 또는 수동 면역 중 어느 하나에 대해 두 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B로부터 유도된 재조합 단백질의 사용을 요한다.
실시예 40
재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 단백질에 대한 항체의 비경구 투여에 의한 클로스트리듐 다이피셀 감염에 대한 생체내 방어
실시예 39에 나타낸 결과들은 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 단백질을 사용한 햄스터의 백신 접종이 수용체 동물에서 중화 혈청 항체를 발생시켰으며, 이는 클로스트리듐 다이피셀 감염의 해로운 효과로부터 완전한 방어(즉, 질병율 및 치사율로부터의 방어)를 부여하였음을 입증하였다. 실시예 38은 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질을 사용한 햄스터의 백신 접종은 중화 혈청 항-독소 A 항체(IgG)를 발생시켰으나 점액성(IgA) 항-독소 A 항체의 농도는 탐지할 수 없는 정도이었음을 입증하였다. 따라서, 혈청 항-독소 A 및 B 항체의 생산은 CDAD로부터의 방어를 부여하기에 충분하다. 항-재조합 독소 A 및 B IgY의 비경구 전달이 클로스트리듐 다이피셀 감염을 치료하는데 효과적인가를 결정하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.
각각이 9 내지 10 마리의 원을 포함한 80 - 100 그램의 암컷 골든 시리안 햄스터(Charles River)의 6 개의 군을 실시예 32 c)에 기술한 바와 같이 클로스트리듐 다이피셀로 감염시켰다. 동물들을 우리 당 세마리씩 사육하고 연구 과정 전반에 걸쳐 수시로 사료와 물을 공급하였다. 연구의 개시 시점에서, 각각의 햄스터를 물 1 ㎎ 중의 클린다마이신-포스테이트(Biomol) 1㎎/체중 100g으로 1 ㎖ 투베르툴린 주사기(27 게이지 바늘)를 사용하여 복강내 투여하여 예비처리하였다. 대략 24 시간 후, 각각의 동물들을 18 게이지 주사기를 사용하여 무균 염수 중의 대략 103 내지 104 균이 포함된 클로스트리듐 다이피셀(ATCC 43596) 1 ㎖로 경구 공격시켰다. 이 균들은 감염에 앞서 CCFA 플레이트(BBL) 상에서 48 시간 증식시킨 후 사용하였다.
감염(1일)시킨지 3 시간 후, 치료를 다음과 같이 개시하였다. 각각의 햄스터들을 면역전 IgY(8X PEG 제제로서) 또는 항-재조합 독소 A 및 B의 혼합물(즉, pMA1870-2680 및 pPB1750-2360에 대해 야기된 항독소) 중 어느 하나를 포함하는 용액 2 ㎖을 수용시켰다. 8X PEG 제제는 IgY를 탄산염 완충액에서 보다는 무균 염수 중에서 현탁시킨 것을 제외하고는 실시예 32 (c)(ii)에 기술한 바와 같이 제조하고 혼합하였다. IgY 제제는 복강내 주사에 의해 전달하였다. IgY 제제는 4일의 주기로 하루에 1회, 2회 또는 3회 중 하나에 의해 투여하였다(치료 기간).
동물들은 치료 기간 동안 및 후에 설사의 개시 및 치사에 대해 관찰하였다. 각 치료 투여량에 의해 제공된 방어의 수준을 계산하였다. 가장 낮은 투여량이 상당한 수의 햄스터에서 방어적이면, 가장 낮은 투여량을 상기의 존건을 사용하여 후속 실험에서 사용하였다. 예를 들면 4일 동안 하루에 동물 당 1.0 및 0.5 ㎖의 IgY 제제를 시험하여 방어에 충분한 가장 낮은 복강내 투여량을 결정할 수 있다. 단지 매우 적은 투여량의 IgY가 복강내 주사를 통해 방어를 제공하는데 필요하다면, IgY를 또한 혈관내를 통해 전달하여 IgY 제제의 혈관내 전달이 클로스트리듐 다이피셀 감염으로부터의 방얼를 부여하는지를 결정할 수 있다.
실시예 41
재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질에 대한 장용 피복된 IgY를 사용한 클로스트리듐 다이피셀로 감염된 햄스터의 치료
장용 피복된 항-재조합 독소 A IgY(실시예 37a)가, 장용 피복하지 않은 동일한 IgY를 사용하여 필요한 가장 낮은 투여량에서, 햄스터의 클로스트리듐 다이피셀 감염을 치료하는데 효과적인가를 결정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
햄스터 감염 모델은 장용 피복된 항독소[먼저 비파레일로서 가해졌던Eudragit(등록상표) L30D-피복 pMA1870-2680]를 탄산염 완충액 중의 비피복 IgY 대신에 사용한 것을 제외하고는 실시예 32c에 기술된 바와 정확하게 같이 수행하였다. 간단히 설명하자면, 군 당 7마리의 구성원을 포함하는 3 군의 햄스터(사스코)를 클린다마이신-포스테이트(Biomol) 1㎎/체중 100g로 감염에 대해 예비처리하였다. 24 시간 후, 각각의 동물들을 18 게이지 주사기를 사용하여 무균 염수 중의 대략 1 X 103 균이 포함된 클로스트리듐 다이피셀(ATCC 43596) 1 ㎖로 경구 공격시켰다. 이 균들은 감염에 앞서 CCFA 플레이트(BBL) 상에서 48 시간 증식시킨 후 사용하였다.
감염(1일)시킨지 3 시간 후, 치료를 다양한 농도의 Eudragit(등록상표) 피복 항독소 A IgY의 경구 투여에 의해 다음과 같이 개시하였다. 각각의 군은 4일의 기간 동안 하루에 1회 장용 피복된 IgY 0(대조군), 2, 20, 50, 100 또는 600 ㎎을 수용시켰다. 장용 피복된 입자들은 각 투여량을 소형 원심분리 관 중에 위치시키고, 입자들을 아세테이트, pH 4.0 등의 낮은 pH 완충액(낮은 pH 완충액은 햄스터에의 전달에 앞서 장용 피복된 입자로부터 IgY의 방출을 방지하는데 사용된다) 중에서 현탁시키고, 이어서 현탁액을 14 게이지 주사기를 사용하여 경구적으로 투여함으로써 투여한다. 동물들을 치료 기간 동안 및 후에 설사의 개시 및 치사에 대해 관찰하였다. 누진적인 치사율(즉, 치사) 및 발병율(즉, 설사) 백분율을 계산하였다.
상기 실험(장용 피복된 IgY의 투여)로부터의 결과들을 실시예 32c에서 얻은 결과에 비교하였다. 실시예 32c에서 동일한 감염 조건을 사용하였으나 항독소 A 항체는 탄산염 완충액 중에 전달하였고 이들은 장용 피복이 결핍되어 있다. 실시예 32 c에 있어서, 비피복 IgY로 감염시킨후 처리된 햄스터의 50%가 클로스트리듐 다이피셀로부터의 치사로부터 방어하였다. 실시예 32 c에서 하루 당 주입된 전체 IgY의 양은 약 120 ㎎이었다. 그 투여량 중에서, 방어의 수준(즉, 50% 생존)을 얻는데 필요한 하루 당 특이성 항체의 양은 특이성 IgY 약 1200 ㎍이었다. 본 실시예에서, 햄스터들은 각각 2, 20, 50, 100 또는 600 ㎎의 장용 피복된 IgY를 주입시켰다. 장용 피복 물질의 약 1/5 중량만이 IgY이기 때문에, 2, 20, 50, 100 또는 600 ㎎으로 투여되는 전체 IgY의 실제량은 각각 약 0.40 ㎎, 4 ㎎, 20 ㎎ 및 120 ㎎이다. 그 중 약 1%는 특이성 항-재조합 독소 A IgY이었다. 장용 입자 (즉, Eudragit(등록상표) 피복 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A IgY 제제)의 600 ㎎ 투여량은 50% 방어를 나타냈던 실시예 32 c에서 탄산염 완충액 중에 전달된 항체의 양에 대략 동등하였다. 동일한(즉, 50%) 수준의 방어를 나타내는데 필요한 장용 입자의 투여량의 비교는 IgY를 장용 피복시킴으로써 제공된 증가된 효능의 정도를 나타낸다. 상기 실험의 결과는 장용 피복된 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A IgY(실시예 37a)가 비피복된 항-재조합 독소 A에 비교하여 낮은 투여량에서 햄스터의 클로스트리듐 다이피셀 감염을 치료하는데 효과적임을 입증한다.
따라서, 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B IgY(즉, 항-pPB1750-2360)도 또한 실시예 37a에 기술한 방법을 사용하여 장용 피복시켰다. 장용 피복된 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B IgY는 상기한 단독의 햄스터 감염 모델에서 또는 장용 피복된 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A (즉, 장용 피복된 항-pMa1870-2680 IgY 제제)와 조합시켜 시험하였다. 이들 시험의 결과는 장용 피복된 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B IgY(실시예 37a)가 비피복된 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B IgY의 사용에 비교하여 낮은 투여량에서 클로스트리듐 다이피셀 감염과 관련된 질병율 및 치사율로부터 동물들을 완전하게 방어하는데 효능이 있음을 입증한다.
실시예 42
클로스트리듐 다이피셀 감염된 햄스터의 치료를 위한 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 단백질에 대한 탄산염 완충액 중의 조류 항체의 최소 유효 투여량의 결정
햄스터에서 클로스트리듐 다이피셀 관련 질병(CDAD)을 치료하는데 필요한 재조합 독소 A 단백질 및 재조합 독소 B 단백질에 대해 생성된 조류의 항체(IgY)의 최소 유효 투여량을 결정하였다. 실험은 햄스터들을 재조합 독소 A 및 재조합 독소 B에 대해 생성된 상이한 농도의 IgY로 처리하는 생체내 감염 연구를 수반하였다.
항체들을 RIBI 보조제를 사용하여 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A(pMA1870-2680; 인터벌 A-6)에 대해 및 프로이트 보조제를 사용하여 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B (pPB1750-2360; 인터벌 B-3)에 대해 발생시켰다. 각 보조제에 대해 사용된 면역 프로토컬은 앞서 실시예 35에 기술하였다. 항체들은 PEG-정제되었고 0.1 M 탄산염 완충액, pH 9.5 중의 8X 농도(모두는 약 40 ㎎/㎖ IgY를 함유하였다)로 현탁시켰다.
감염 연구는 3개의 실험군(I 군, II 군, III 군)의 시험을 수반하였다. I군 동물은 면역전 IgY 2 ㎖을 수용시켰다. II 군 동물들을 항-클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 항-클로스트리듐 다이피셀 독소 B IgY를 포함하는 혼합물 1㎖을 수용시켰다. III 군의 동물들은 II 군의 동물들에 주어진 혼합물 2 ㎖을 수용시켰다. 각각의 군은 체중 79+/- 3.2g의 8 마리의 골든 시리안 햄스터 (사스코)로 이루어졌다. 동물들을 우리 당 두 세마리 씩 수용하고 연구 과정 전반에 걸쳐 수시로 사료와 물을 공급하였다. 감염 연구는 실시예 31c에 기술된 프로토컬을 사용하여 수행하였다.
햄스터들을 무균수 1 ㎎ 중의 클린다마이신-포스페이트(Biomol) 1㎎/체중 100g를 복강내 투여하여 감염에 대해 예비처리하였다. 클린다마이신은 27 게이지 투베르쿨린 주사기(Terumo) 1 ㎖를 사용하여 복강내 투여하였다. 약 24 시간 후, 햄스터들 각각을 1 x 104 클로스트리듐 다이피셀(ATCC 43596)를 포함한 무균 염수 대략 1 ㎖로 경구 감염시켰다. 클로스트리듐 다이피셀은 접종에 앞서 CCFA(cycloserine-cefoxitin-froctose-egg york agar, 클로스트리듐 다이피셀 선택성 및 선별 배지) 플레이트(BBL) 상에서 48 시간 증식시킨 후 사용하였다.
감염(1일)시킨지 8 시간 후, 치료를 다음과 같이 개시하였다. 세 군의 햄스터들 각각을 18게이지 주사기(Popper)를 통해 3개의 치료 중 하나를 경구적으로 수용시켰다. I 군은 면역전 IgY(8X PEG 제제로서)를 수용시켰고, II 군은 면역 IgY(즉, pMA1870-2680; 인터벌 A-6 및 pPB1750-2360; 인터벌 B-3에 대해 발생된 항체의 혼합물) 1㎖을 수용시키고, III 군은 면역 IgY 2 ㎖을 수용시켰다.
면역 IgY 혼합물은 pMA1870-2680에 대해서 생성된 8X 농도의 면역 IgY의 동 용적을 pPB1750-2360p에 대해서 생성된 8X 농도의 면역 IgY의 동 용적을 혼합시킴으로써 제조하였다; 결과의 혼합물을 A-6/B-3 IgY로 명명하였다. 이 A-6/B-3 IgY 중에 함유된 항독소 단백질 특이성 항체의 양은 항-재조합 독소 A IgY의 약 1.2 ㎎/㎖ 및 항-재조합 독소 B IgY의 약 400 ㎍/㎖이었다. 이들 양은 앞서 실시예 15c에 기술한 바와 같이 친화성 정제에 의해 결정하였다. IgY 2㎖ 중의 전체 IgY의 양은 약 80 ㎎이었고, 1 ㎖ 투여량에서 약 40 ㎎이었다.
햄스터들을 3일 동안 하루 1 회씩 치료하였다. [이 치료 요법에서 투여량 스케쥴은 이전의 실시예(실시예 32)에서 사용된 것과는 상이하며, 여기서는 3일 동안 매일 2㎖ 씩 3회 치료하였다]. 모든 햄스터들은 치료 기간 동안 및 후에 설사의 개시 및 치사에 대해 관찰하였다. 결과들은 도 47 및 표 49에 나타냈다.
도 47에 있어서, 누적 치사율(백분률로 나타낸)은 세로좌표를 따라 나타내고, 시간(날로 표시된)은 횡좌표를 따라 나타냈다. 도 47에서 수평 바아로 표시한 치료 주기의 기간은 3일이었다. 클린다마이신의 투여 및 클로스트리듐 다이피셀("감염")의 접종은 화살표로 나타냈다. 진한 검정 사각형은 I군 햄스터(면역전 IgY 2 ㎖로 처리한 햄스터)를 나타내고, 빈 사각형은 II군 햄스터(즉, A-6/B-3 IgY 1 ㎖로 처리한 햄스터)를 나타낸다. 진한 흑색 다이아몬드는 III군 햄스터(즉, A-6/B-3 IgY 2㎖로 처리한 햄스터)를 나타낸다.
도 47에 나타낸 결과들은 III 군에서 모든 햄스터들(즉, 8/8)은 치사에 대해 방어를 하였음을 나타낸다. 대조적으로, I 및 II 군 모두에 있어서 햄스터들은 단지 13%(즉, 1/8) 만이 생존하였다. III 군에서 방어의 정도는 Chi-square 분석을 사용하여 p<0.005로 통계적으로 유의성이 있었다.
다음의 표는 A-6/B-3 IgY를 사용하여 관찰된 결과들을 나타낸다. 이 표에 있어서 주어진 투여량은 1 또는 2 ㎖ 투여량으로 동물들에게 주어진 전체(특이적이 아님) IgY 농도를 의미한다.
| 치료 군 | 설사증이 있는 동물 % | 평균 중량1 |
| 면역전, 80 ㎎ (I군) | 100 | 67.3±3.9 |
| A-6/B-3, 40 ㎎ (II군) | 100 | 69±4.2 |
| A-6/B-3, 80 ㎎ (II군) | 0 | 81.6±5.5 |
| 1 그램±S.D로 나타낸 중량: 햄스터의 평균 출발 중량은 79±3.2 그램이었다. 치사 동물들에 대해서는 치사 시에 측정하였다. 생존자에 대해서는 치료의 종료후에 측정하였다. | ||
표 49에 나타낸 결과들은 햄스터들을 하루 당 2 ㎖의 A-6/B-3 IgY를 사용하여 치료했을 때도 마찬가지로 발병이 방지되었다. CDAD로 부터의 발병률은 본 명세서에서는 설사 및 체중의 감소로서 정의된다. 표 49에 나타낸 바와 같이, III 군 햄스터 중 어느 것도 설사를 나타내지 않았다. 대조적으로 A-6/B-3 IgY(II 군) 1 ㎖ 또는 면역전 IgY(I 군) 2㎖ 중 어느 하나로 처리한 모든 햄스터들은 설사를 나타냈다. 더욱이, I 군 및 II 군에서 한 마리의 햄스터를 제외한 모두는 설사를 나타낸 후, 약 48 시간 내에 치사하였다. III 군에서 설사의 방지는 다른 두 치료 군의 것에 비해 통계학적으로 유의성이 있었다(P<0.001).
또한, 표 49에 나타낸 결과들은 면역전 IgY (I 군) 2㎖ 또는 A-6/B-3 IgY(II 군) 1 ㎖ 중 어느 하나로 처리한 햄스터들은 감염전의 그들의 평균 출발 중량의 14%가 감소되었다. 대조적으로, A-6/B-3 IgY 2 ㎖ (III 군)으로 처리된 동물들은 치료 기간의 종료시에 그들의 평균 체중이 2%가 불었다.
상기 결과에 기초하여, 상기에 제시한 조건(즉, 탄산염 완충액) 하에서 햄스터에서 CDAD의 발병 및 치사를 방지하는데 필요한 두 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 단백질(pMA1870-2680 및 pPB1750-2360; 각각 인터벌 A-6 및 B-3)에 대한 특이성 IgY의 최소 유효 투여량은 3일 동안 A-6 IgY 2.4 ㎎ 및 B-3 IgY 약 800 ㎍이다.
실시예 43
항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B로 처리한 햄스터의 맹장에서 특이성 IgY의 결정
재조합 독소 A(pMA1870-2680; 인터벌 A-6) 및 재조합 독소 B (pPB1750-2360; 인터벌 B-6)에 대해 발생된 항체를 사용하여 햄스터의 맹장에서 발견되는 특이성 항 클로스트리듐 다이피셀 독소 IgY의 양을 결정하였다. 이 연구의 결과는 감염의 부위에 존재하여 클로스트리듐 다이피셀로 감염된 동물들을 방어해야 하는 항-재조합 독소 A 및 항-재조합 독소 B IgY(A-6/B-3 IgY)의 대략적인 투여량의 표시를 제공한다.
본 실시예는 a) 미처리 햄스터 및 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B IgY(A-6/B-3 IgY)로 처리된 햄스터로부터 맹장의 성분들을 회수하고, b) 맹장 성분에서 특이성 A-6 IgY 및 B-3 IgY의 양의 ELISA에 의한 직접적인 결정 및 c) 맹장 중의 전체 IgY의 ELISA에 의한 직접적인 결정 및 특이성 IgY의 간접적인 결정을 수반하였다.
a) 미처리 햄스터 및 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B IgY(A-6/B-3 IgY)로 처리된 햄스터로부터 맹장의 성분들의 회수
햄스터들을 실시예 42에 기술된 바와 같이 III 군 동물들에 대한 프로토컬에 따라 처리하였다(즉, 햄스터들을 3일 동안 하루에 8X A-6/B-3 IgY 2 ㎖을 사용하여 CDAD에 대해 연속적으로 치료하였다). IgY의 최적 투여량을 투여한지 4시간 후에, 햄스터들을 에테르를 사용하여 희생시켰다. 대조군 햄스터들은 클린다마이신으로 처리하여 클로스트리듐 다이피셀로의 감염에 대해 동물들을 예비처리하였으나, 어떠한 IgY 또는 음성 대조군으로서 작용하는 클로스트리듐 다이피셀을 수용시키지 않았다. 대조군 햄스터는 클린다마이신 투여후 2 일만에 희생시켰다.
모든 햄스터들로부터의 맹장을 제거하고 대부분의 맹장 성분들을 15 ㎖ 원심 분리관 중에 수집하였다. 각각의 원심분리관은 수 ㎖의 맹장 재료를 함유하였다. 각 튜브 중의 성분들을 와동시키고 각 튜브로 부터 1㎖ 부분 시료를 1.5 ㎖ 소형 원심분리관으로 옮겼다. 소형원심분리 관을 14,000 rpm에서 1 분 동안 원심분리시켰다. 결과의 상층액을 회수하고 시료 중의 특이성 IgY를 ELISA에 의해 정량화하였다.
b) 맹장 성분에서 특이성 A-6 IgY 및 B-3 IgY의 양의 ELISA에 의한 직접적인 결정
맹장 성분에 존재하는 항-재조합 독소 A 및 독소 B IgY의 농도를 실시예 13c에 기술된 프로토컬을 사용하여 다음을 변형시켜 ELISA에 의해 탐지하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트를 PBS, pH 7.4 중의 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질[pPA1870-2680(N/C)(실시예 29)] 0.05 ㎍/㎖ 또는 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 단백질[pPB1750-2360(실시예 18b)] 1 ㎍/㎖로 4 ℃에서 웰 당 100 ㎕ 씩 밤새 피복시켰다. 맹장 시료들을 먼저 PBS 중에 2배로 희석시켜 웰 중에 위치시켰다. 이어서 희석된 시료들을 마이크로타이터 웰 중에서 순차적으로 5배 희석시켰다. 모든 시료들을 2회 시험하였다.
맹장 시료 중의 특이성 IgY의 정량화는 재조합 독소 A 또는 재조합 독소 B 중 어느 하나에 대해서 생성된 항체 반응성을 친화성 정제된 IgY의 공지된 양을 사용하여 ELISA 분석으로 생성된 반응성에 비교함으로써 결정하였다. 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 또는 B 단백질에 대한 특이성 IgY는 실시예 15c에 기술된 바와 같이 친화성 정제하였다. 간단히 설명하자면, 친화성 정제된 항체들은 pMA1870-2680 (인터벌 A-6) 및 pPB1750-2360 (인터벌 B-3) 중 어느 하나로 면역시킨 암탉의 알로부터의 PEG-정제된 IgYs에서 단리하였다. PEG-정제된 항-pMA1870-2680 IgY는 Actigel(Sterogene)에 결합된 pMA1870-2680으로 이루어진 칼럼을 사용하여 친화성 정제하였다. PEG-정제된 항-pPB1750-2360 IgY는 pPB1750-2360 보다 적은 100 아미노산인 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 단백질인pPB1850-2360(실시예 15c)을 함유하는 Actigel 칼럼을 사용하여 친화성 정제하였다.
친화성-정제된 항-pMA1870-2680 IgY(A-6) 및 친화성-정제된 항-pPB1750-2360 IgY(B-3)은 280 nm에서 흡광도를 측정함으로서 정량화하고 각각의 제제는 PBS 중의 10 ㎍/㎖의 농도로 희석하였다. 친화성-정제된 IgY는 10 ㎍/㎖의 초기 농도로 시작하는 ELISA 및 맹장 추물물의 측면을 따라 각각의 피복된 마이크로타이터 플레이트 중에서 순차적인 5배 희석에 의해 시험하였다. 알칼리성 포스파타아제(Sigma)와 접합된 토끼 항-닭 IgY를 1:750의 희석배에서 2차 항체로서 사용하여 ELISA에서 결합 IgY를 탐지하였다.
공지의 농도의 친화성-정제된 IgY에 대한 맹장 추출물들 사이의 ELISA 반응성 등가성의 비교에 의해 맹장 추출물에 존재하는 특이성 항-재조합 IgY의 양이 측정될 수 있었다. ELISA 결과로부터 특이성 항-pMA1870-2680 IgY(A-6)의 양은 약 12 ㎍/㎖인 것으로 밝혀졌다. 특이성 항-pPB1750-2360 IgY(B-3)의 양은 약 800 ng/㎖인 것으로 밝혀졌다. 특이성 IgY의 이들 농도는 감염의 부위에서 방어를 획득하는데 필요한 유효 치료 농도의 계산을 제공한다. 맹장 유체의 회수 전에 경구적으로 주어진 특이성 IgY의 양은 독소 A 재조합체에 대해서는 약 2400-2800 ㎍이었고, 독소 B 재조합체에 대해서는 대략 400-800 ㎍이었기 때문에, 각각 인터벌 A-6 및 인터벌 B-3에 대해 유도된 맹장 중에서 발견된 항-재조합 독소 단백질 IgY의 탐지량에 있어서 약 200-233 배 감소 및 500-1000배 감소가 있었다.
이들 결과들은 탄산염 완충액에 존재하는 항체를 사용하여 얻었다. 경구투여된 항-재조합 독소 IgY가 (실시예 37에 기술된 바의 장용 피복의 사용을 통하여) GI 관을 통한 통과 동안 분해에 대해 적절히 방어를 하였다면 경구 투여에 필요한 유효 치료 투여량은 실시예 42에 정의된 것 미만일 것이다.
c) ELISA에 의한 맹장 성분 중의 특이성 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 항-재조합 독소 B IgY의 간접적인 결정
처리된 햄스터의 맹장에서 발견되는 항-재조합 독소 IgY 농도의 양에 대하여 실시예 43 (b)에서 결정된 값을 확인하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. (실시예 13c에 기술된) 표준 ELISA 형태를 달리 정의하지 않는한 그대로 사용하였다.
미처리 햄스터(음성 대조군으로서 작용함)로부터의 맹장 추출물 및 두 항-재조합 독소 A 및 항-재조합 독소 B IgY(상기 a) 부분에서 기술됨)을 이 실험에서 사용하였다. 단지 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 단백질에 대해 특이성 맹장의 IgY의 양이 아닌, 전체 맹장의 IgY을 직접적으로 결정하였다. IgY 제제 내에 함유된 특이 항체량의 백분률은 알려졌기 때문에, 맹장 추출물 중에 존재하는 전체 IgY 농도의 결정에 의해 맹장 추출물 중의 특이 항체의 양이 계산될 수 있었다.
샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 다음과 같이 맹장 물질 중에서 IgY를 포획하였다. PBS 중의 0.1 ㎍/㎖의 토끼 항-닭 IgG(Cappel)을 사용하여 마이크로타이터 플레이트(웰 당 100 ㎕)를 4℃에서 밤새 피복시켰다. 두 맹장 추출물을 1:500의 처음 희석 및 최종 희석배 1:312,500 까지의 순차적인 5회의 희석배로 측정하였다. 항-재조합 독소 A (pPA1870-2680, 인터벌 A-6)은 0.1 ㎍/㎖으로 희석하고 0.16 ng/㎖의 최종 농도로 5회 순차적으로 더 희석시켜 비교에 의한 정량화를 허용하도록 ELISA에 의해 마찬가지로 시험하였다. 인큐베이션 및 세척후, 토끼 항-닭 알칼리성 포스파타제 IgG(Sigma)를 플레이트에 첨가(1:1000 희석배)하였다. 이어서 플레이트들을 세척하고 기질(p-니트로페닐 포스페이트)를 첨가하고 플레이트들을 실시예 13c에 기술된 바와 같이 평가하였다.
상기 실시예 43 b)에 기술된 바와 같이, 친화성 정제된 항-재조합 독소 A IgY를 사용하여 얻은 ELISA 활성은 맹장 추출물의 희석에서 발생한 ELISA 활성에 부합되어 처리된 햄스터의 맹장에서 발견되는 전체 IgY의 양을 정량화하였다.
ELISA 분석의 결과로부터, 처리된 햄스터의 맹장 중의 전체 IgY의 양은 50 ㎍/㎖로 측정되었다. 친화성 정제 연구는 전체 IgY 제제가 재조합 독소 A (항-A-6 IgY)에 대해 특이성 IgY 7% 또는 3.5 ㎍/㎖ 및 재조합 독소 B (항-B-3 IgY)에 대해 특이성 IgY 1-2% 또는 500-1000 ng/㎖로 이루어졌음을 나타냈다. 여기에서 탐지된 두 특이성 IgY의 농도는 상기 실시예 43(b)에서 탐지된 양과 아주 밀접하게 즉, 항-인터벌 A-6에 대해 3.5 ㎍/㎖ 대 12 ㎍/㎖ 및 항-인터벌 B-3에 대해 800 ng/㎖ 대 500-1000 ng/㎖으로 상관이 있었다.
상기 및 본 실시예의 b) 부분의 결과는 모두 매우 낮은 농도의 특이성 항-인터벌 A-6 및 B-3 IgY가 클로스트리듐 다이피셀 감염 부위에서 탐지되었음을 나타낸다. 햄스터는 CDAD에 대해 방어하였기 때문에, 이 농도의 항-재조합 독소 A 및 B는 치료범위 내에 있는 것이다. 이들 결과는 또한 훨씬 낮은 농도의 항-재조합 독소 IgY가 이들이 GI관에서 분해를 방지하기 위한 수단(예컨대, IgY의 장용 피복)을 사용하여 전달될 경우 경구적으로 투여되는데 필요할 것이라는 제안을 지지한다.
실시예 44
항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질 IgY를
사용한 설사증의 햄스터의 치료
클로스트리듐 다이피셀로 감염된 후 설사의 징후를 나타내는 햄스터가 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A IgY 단독을 사용하여 효과적으로 치료될 수 있는가 또는 항-재조합 독소 A 및 B IgY의 조합이 필요한가를 결정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
햄스터들을 본질적으로 실시예 32c)에 기술된 바와 같이 클린다마이신을 주입시키고 클로스트리듐 다이피셀로 감염시켰다. 항-재조합 독소 A IgY 및 항-재조합 독소 B IgY는 각각 pMA1870-2680 (인터벌 A-6) 및 pPB1750-2360(인터벌 B-3)에 대하여 생성하였다.
3 군의 햄스터(사스코)를 클린다마이신-포스테이트(Biomol) 1㎎/체중 100g로 복강내 주사에 의해 클로스트리듐 다이피셀 감염에 대해 예비처리하였다. 24 시간 후, 각각의 햄스터들을 18 게이지 주사기를 사용하여 무균 염수 중의 대략 1 X 104 클로스트리듐 다이피셀(ATCC 43596) 균이 포함된 1 ㎖로 공격시켰다. 이 세균들은 감염에 앞서 CCFA 아가 (BBL) 상에서 약 48 시간 동안 증식시킨 후 사용하였다.
각각이 9 내지 10 마리의 구성원을 함유하는 3개의 군을 주사기를 사용하여 IgY를 주입시켰다. I 군은 면역전 IgY를 수용시켰다; II 군은 항-재조합 독소 A(항-A-6 IgY)를 수용시켰다; III 군은 항-재조합 독소 A IgY 및 항-재조합 독소 B IgY의 혼합물 (항-A-6/B-3 IgY)을 주입시켰다. 각각의 IgY 제제는 0.1 M 탄산염 완충액, pH 9.5 중의 8X PEG 제제로 이루어졌고, 약 40 ㎎/㎖의 단백질을 함유하였다. 항-A-6/B-3 IgY 혼합물을 생성시키기 위하여, 두 8X 농축물(즉, 항-A-6 및 항-B-3)의 동일 용적을 함께 혼합하였다. 항-A-6 IgY 제제 중의 특이성 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A IgY의 양은 약 2.8 ㎎/㎖이었다. 따라서, 항-A-6/B-3 IgY 제제 중의 1 ㎖ 당 특이성 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A IgY의 양은 A-6 IgY 제제의 것의 절반이었다(즉, 1. 4 ㎎/㎖). 약 200-400 ㎍/㎖의 특이성 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 B IgY가 항-A-6/B-3 IgY 제제 중에 존재하였다.
설사의 개시가 각 개별 햄스터에서 탐지된 후, 이 동물을 그들의 각각의 치료 제제(즉, 면역전, 항-A-6 IgY 또는 항-B-3 IgY) 2 ㎖로 투여하였다. 설사의 개시는 클로스트리듐 다이피셀으로 접종한지 22-44 시간 후에 햄스터에서 탐지되었다. 대대수의 햄스터(82%)는 균 접종후 24 시간내에 설사를 보였다. 동물들의 대다수는 2일 동안 대략 4 시간의 간격으로 하루 당 IgY를 3회 주입하였다; 그러나, 일부의 햄스터들은 설사의 늦은 개시로 인해 치료의 첫날에 1회 또는 2회만을 투여하였다.
이 실험의 결과는 항-A-6 IgY가 대다수의 햄스터들을 설사의 개시후에 주입되었다 하더라도 치사로부터 방어할 수 있었음을 나타낸다. 항-A-6 IgY로 치료된 약 절반(55%)의 햄스터들이 대략 1 개월 동안 생존하였고, 반면 면역전 IgY로 치료된 햄스터들의 11% 및 항-A-6/B-3 IgY로 치료된 햄스터들의 20% 만이 생존하였다.
항-A-6 IgY는 햄스터 모델(예, 실시예 32(a)에서 가장 중요한 성분인 것으로 보이기 때문에, (A-6 IgY 단독의 제제에 비교하여 특이성 항-A-6 IgY의 양의 절반을 포함하는) 항-A-6/B-3 IgY로 치료된 햄스터들로부터 얻은 결과들은 예측되지 않았다(20%의 동물들이 치사로부터 방어하였다). 본 실시예에서, 항-A-6 IgY 단독은 햄스터의 50% 치사를 방지할 수 없었고 항-B-3 IgY 단독은 방어를 제공하지 못하였다. 또한 이전의 연구(실시예 32 c)에서 얻어진 결과들은 항-B-3 항체가 CDAD에 기한 치사를 방지하는 것 보다 설사의 개시를 방지함에 있어서 더 중요한 것으로 나타냈다.
항-A-6/B-3 IgY로 연속적으로 치료된 모든 동물들은 치료가 개시되기 전에 가벼운 설사 증세를 보였다. 치료를 개시하기 전에 설사가 심하고 신경학적인 징후가 존재할 경우, 햄스터들은 경구 항-A-6 IgY로 성공적으로 치료할 수 없다.
상기 햄스터 치료 실험을 면역전 또는 항-A-6 IgY를 투여한 것만을 예외로 하여 반복하였다. 군 당 10 내지 11마리의 햄스터들을 설사가 각 개별 햄스터에서 탐지된 후 8X IgY 농축물 2 ㎖로 처리하였다. 치료 스케쥴을 후술한다.
설사는 클로스트리듐 다이피셀을 접종한지 약 20 내지 45 시간후에 햄스터들에서 탐지되었다. 동물들의 85%(17/20)가 감염 후 약 28 시간에 설사를 보였다. 이들 두 연구들로부터의 데이터를 합하여 도 48에 나타냈다.
도 48에 있어서, 백분률 누적 치사율은 세로좌표를 따라 나타내고, 시간(일로 표시된)은 횡좌표를 따라 나타냈다. 치료 기간은 2일 및 3일 사이에 바아를 사용하여 표시하였다. 클린다마이신의 투여 및 클로스트리듐 다이피셀 균의 접종(도 48에서 "감염"으로 표시함)은 화살표로 나타냈다. 진한 검정 사각형은 면역전 IgY를 수용시킨 햄스터를 나타내고, 빈 사각형은 항-A-6 IgY를 수용시킨 햄스터를 나타낸다.
도 48에 나타낸 결과들은 설사후 항-A-6 IgY으로 처리된 햄스터 중 45%가 치료후(설사는 이들 대부분의 햄스터에서 스스로 없어졌다)에 생존하였음을 입증한다. 면역전 IgY를 사용하여 얻은 결과에 비교한 항-A-6 IgY를 사용하여 얻은 결과는 p<0.05로 통계적으로 유의성이 있었다. 항-A-6 IgY를 사용하여 치료한 모든 햄스터들은 장기간(치료후 실험의 종료까지 1개월 이상) 동안 생존하였다.
이들 결과는 클로스트리듐 다이피셀의 감염에 기인한 설사의 개시후 햄스터를 치료하는데 사용될 수 있는 치료 요법에 대한 최초의 기재를 제공한다. 더욱이, 이들 결과는 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A IgY가 CDAD의 나중 단계(즉, 설사의 개시후)에 투여되었을 때에서도 유효한 치료제임을 입증한다.
실시예 45
두 상이한 보조제를 사용하여 생성된 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질 및 독소 B 단백질 IgYs를 사용한 만성의 클로스트리듐 다이피셀 감염의 치료
pET 벡터를 사용하여 생산된 재조합 독소 A 및 B 단백질의 닭에서 클로스트리듐 다이피셀 감염에 대하여 햄스터를 방어할 수 있는 중화 IgY를 유발하는 능력을 시험하였다. 이전의 연구(실시예 32 또는 실시예 44)에서, IgY를 pMal 벡터를 사용하여 발현시킨 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질에 대하여 생성시켰다. pET 시스템을 사용하여 발현된 재조합 단백질은 pMal 벡터(pMA1870-2680 , 인터벌 A-6)를 사용하여 발현시킨 단백질에 비하여 고도로 정제된 형태로 단리될 수 있기 때문에, pET (pPA1870-2680, A-6)에서 생산된 독소 A 재조합체에 대한 항체의 생산이 바람직하였다.
항-pPA1870-2680 IgY들은 pET (pPB1750-2360, 인터벌 B-3)를 사용하여 마찬가지로 발현된 독소 B 단백질에 대하여 발생된 항체와 함께 햄스터 모델에서 시험하였다. 두 재조합 독소를 생산하는 공통 발현계의 사용은 명확한 제조 이점을 갖는다. 예를 들면, 동일한 친화성 정제 칼럼 및 프로토컬들이 두 재조합체에서 사용될 수 있으며 두 항원은 유사한 순도 및 수율을 가져야 한다.
본 발명의 추가의 목적은 동일한 보조제를 사용하여 두 pET 생산 A-6 및 B-3 독소 단백질에 대한 항체를 생성시키는 것이다. 이전의 실시예(실시예 32 및 실시예 44)에서, 시험된 IgY들을 상이한 보조제를 사용하여 A-6 또는 B-3 재조합체 중 하나에 대해 생성시켰다(RIBI 보조제를 항-재조합 독소 A IgY에 대하여 사용하였고, 프로이트 보조제를 재조합 독소 B IgY에 대하여 사용하였다).
이 실험은 a) pET 벡터 및 두 상이한 보조제를 사용하여 발현시킨 재조합 클로스트리듐 다이피셀 단백질로의 암탉의 면역 및 ELISA에 의한 항-재조합 단백질 IgY 역가의 결정 및 b) 게르부(Gerbu) 또는 퀴일(Quil) A-생성 항-재조합 독소 A(A-6) 및 독소 B(B-3) IgY의 혼합물을 사용한 클로스트리듐 다이피셀 감염 햄스터의 치료를 수반한다.
a) pET 벡터 및 두 상이한 보조제를 사용하여 발현시킨 재조합 클로스트리듐 다이피셀 단백질로의 암탉의 면역 및 ELISA에 의한 항-재조합 단백질 IgY 역가의 결정
암탉들을 pET 벡터를 사용하여 발현시킨 재조합 단백질로 면역시켰다; 니켈 칼럼 친화성 정제된 재조합 독소 A (pPA1870-2680) 또는 재조합 독소 B (pPB1750-2360) 단백질들을 퀴일(Quil) A(Accurate Scientific) 또는 게르부(Gerbu)(CC Biotech) 보조제와 혼합시켰다. 이들 두 보조제는 성능(실시예 35에 나타냄) 및 비용을 기초로 하여 선택하였다. 이어진 면역 프로토컬은 기본적으로 실시예 35에 기술된 것이었다.
간단히 설명하자면, 암탉들을 pPA1870-2680 100 ㎍으로 처음 4회에 이어 단백질 1 ㎖을 사용하여 2회 면역시켰다. 암탉들을 면역당 pBP1750-2360 1 ㎎을 사용하여 6회 면역시켰다. 재조합 독소 단백질 및 게르부 5㎍ 또는 퀴일 A 75㎍ 중 어느 하나를 함유하는 용액 500㎕를 각 암탉에 피하 투여하였다. 약 최종 면역 1주 후, 알들을 수집하여 각 군(4 군의 암탉, 두 보조제를 갖는 독소 재조합체를 사용함)에서 IgY을 실시예 1에 기술한 바와 같이 PEG를 사용하여 추출하였다. 면역전 알로부터의 IgY를 역시 가공하였다.
IgY를 0.1M 탄산염 완충액, pH 9.5 중에서 8X 난황 농도(약 40㎎/㎖)에서 현탁시키고, ELISA를 (실시예 35에 기술된 바와 같이) 수행하여 항-재조합 독소 A 및 항-재조합 독소 B 역가를 결정하였다. 게르브 또는 퀴일 A 보조제 중 어느 하나를 사용한 pPA1870-2680 (A-6) 또는 pBP1750-2360 (B-3) 단백질 중 어느 하나에 대하여 생성된 항체 역가는 1:62,000인 것으로 밝혀졌다. 친화성 정제에 의하여, 게르부를 사용한 특이성 A-6 및 B-3 IgY의 양은 각각 4.3% 및 1.0%이었다. 퀴일 A를 사용한 특이성 IgY의 양은 A-6에 대하여 2.2%이었고, B-3에 대하여 1.9%이었다.
b) 게르부(Gerbu) 또는 퀴일(Quil) A-생성 항-재조합 독소 A(A-6) 및 독소 B(B-3) IgY의 혼합물을 사용한 클로스트리듐 다이피셀 감염 햄스터의 치료
동일 보조제를 사용하여 a) 부분에서 생성된 항-A-6 및 B-3 IgY PEG 제제의 동일 용적을 혼합하였다. 햄스터 치료 연구는 정확히 실시예 42에 기술된 바와 같이 수행하였다. 104 클로스트리듐 다이피셀 균 (ATCC 43956)으로 공격시킨지 6 시간 후에, 햄스터들을 면역전 IgY 또는 면역 IgY 제제(A-6/B-3 게르부 및 퀴일 A) 중 어느 하나를 2 ㎖로 치료하였다. 햄스터들을 하루에 1회씩 2일 이상 IgY 2 ㎖로 치료하였다.
이 햄스터 치료 연구의 결과를 도 49에 나타냈다. 도 49에서, 누적 치사율(백분률로 나타낸)은 세로좌표를 따라 나타내고, 시간(날로 표시된)은 횡좌표를 따라 나타냈다. 치료 기간은 1일 및 3일 사이에 바아를 사용하여 표시하였다. 클린다마이신의 투여 및 클로스트리듐 다이피셀 균의 접종(도 49에서 "감염"으로 표시함)은 화살표로 나타냈다. 진한 흑색 사각형은 면역전 IgY를 수용시킨 햄스터를 나타내고, 빈 사각형은 항-A-6/B-3 게르부 IgY를 수용시킨 햄스터를 나타내고, 진한 흑색 다이아몬드는 항-A-6/B-3 퀴일 A IgY를 수용시킨 햄스터를 나타낸다.
도 49에 나타낸 결과들은 두 면역 IgY 제제(A-6/B-3 게르부 및 A-6/B-3 퀴일 A IgY)는 CDAD에 기인한 치사로부터 햄스터들을 완전히 방어하였음을 입증한다. 면역 IgY 제제 중 하나로 치료된 햄스터 9마리 중 9마리가 클로스트리듐 다이피셀의 감염에 대해 생존한 반면, 면역전 IgY로 처리된 햄스터 9 마리 모두는 치사되었다. A-6/B-3 게르부 및 A-6/B-3 퀴일 A 제제를 사용하여 나타난 생존률은 면역전 IgY를 사용하여 얻은 결과에 비교하여 통계적으로 유의성이 있었다(Chi-square 분석을 사용한 p값<0.001).
A-6/B-3 게르부로 처리한 동물 9 마리 중 3 마리 및 A-6/B-3 퀴일 A로 처리한 동물 9 마리 중 1 마리는 매우 약한 설사증세를 보였다. 이들 처리된 햄스터(실시예 32와 같은 이전의 실시예에서 나타난 설사의 전체적인 부재와 비교하여)에서 나타난 약한 설사는 여기에서 사용된 제제의 낮은 항체 역가(1:62,500 대 1:125,000)에 기인할 수도 있다. 추가의 2차 면역은 게르부 또는 퀴일 A 보조제 중 하나를 사용하여 면역된 암탉에 대하여 1:125,000 범위까지 역가를 증가시켜, 설사에 대한 치료 효능을 증가시켜야 한다.
상기 결과들은 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 단백질이 중화 항독소의 생산에 해로운 효과를 미침이 없이 pET 벡터(pMal 벡터 대신에)를 사용하여 생산될 수 있음을 나타낸다. 더욱이, 동일한 보조제가 pET-생산 단백질과 함께 사용되어 생체내 중화 IgY를 유발할 수 있다. 게다가. 동일한 보조제는 두 재조합 독소 단백질과 함께 사용되어 생체내 치료적 항-재조합 IgY 반응을 일으킬 수 있다.
실시예 46
재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B의 혼합물을 사용한 암탉에서 항체의 생산
조합한 면역원으로써 두 단백질의 혼합물을 사용한 두 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 단백질에 대해 유도된 닭 항체를 발생시키는 능력을 시험하였다. 이 실시예는 a) 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 단백질의 혼합물을 사용한 암탉의 면역 및 b) 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 독소 B IgY의 정제 및 탐지를 수반한다.
a) 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 B 단백질의 혼합물을 사용한 암탉의 면역
알을 낳는 레그호른 암탉을 재조합 독소 A(pPA1870-2680, 인터벌 A-6) 및 재조합 독소 B(pPB1750-2360, 인터벌 B-3) 단백질의 혼합물로 면역시켰다: 두 단백질은 pET 벡터계를 사용하여 발현시켰다. 암탉의 2 군(각각은 4 마리의 암탉을 포함함)을 퀴일(Quil) A(Accurate Scientific) 또는 게르부(Gerbu)(CC Biotech) 보조제 중 어느 하나와 함께 혼합시킨 각각의 재조합 단백질 500 ㎍으로 면역시켰다. 재조합 단백질 및 게르브 5 ㎍ 및 퀴일 A 75 ㎍ 중 어느 하나를 함유하는 1㎖의 전체 용적을 각각의 암탉에 투여하였다. 각 보조제에 대해 후속된 면역 프로토컬은 실시예 35에 기술된 바와 같았다. 암탉은 2주 간격으로 2회 면역시켰다.
b) 항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 및 독소 B IgY의 정제 및 탐지
최종 면역 후 약 1 주일 쯤에, 각 군으로부터의 3 개의 알을 수집하고 IgY를 실시예 1에 기술된 바와 같이 PEG를 사용하여 추출하였다. IgY를 PBS(pH 7.4) 중에서 각각이 전체 단백질 약 20㎎/㎖을 함유하는 4X 농도로 현탁시켰다. 면역전 IgY는 음성 대조군으로서 작용하였다.
두 면역 IgY에 존재하는 항-재조합 독소 A(A-6 IgY) 및 항-재조합 독소 B(B-3 IgY)의 양은 실시예 13c 또는 실시예 43b에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다. 간단히 설명하자면, 마이크로타이터의 웰을 재조합 독소 A (pPA1870-2680) 또는 재조합 독소 B (pPB1750-2360) 중 하나로 수동적으로 피복시켰다. IgY 시료들을 처음에 250배로 희석시키고, 이어서 순차적으로 5배 희석시켰다. 모든 시료들을 2회 시험하였다. 1:1000으로 희석된 토끼 항-닭 IgG 알칼리성 포스파타아제(Sigma)를 사용하여 특이성 IgY를 탐지하였다.
이들 ELISA 분석의 결과는 두 재조합 독소 항원이 암탉에서 IgY 반응을 유발할 수 있었음을 나타냈다. 항체 역가는 동일한 희석배에서 면역전(즉, 음성 대조군)에 비교하여 ELISA 반응성에서 약 3 배 높은 것으로 밝혀진 가장 높은 희석배의 역수로서 나타낸다. 게르부 보조제를 사용하여 생성된 두 항-A-6 IgY 및 항-B-3 IgY에 대한 역가는 1:250 희석에서 매우 낮았다. 퀴일 A 보조제를 사용하여 생성된 두 항-A-6 IgY 및 항-B-3 IgY에 대한 역가는 게르부 보조제의 것에 비해 5 내지 25 배 더 높았다. 항-A-6 IgY에 대해 퀴일 A를 사용하여 생성된 항체 역가는 1:6250 이상이었고, B-3 IgY에 대해 1:1250 이상이었다.
퀴일 A를 사용한 재조합 독소에 대한 IgY 역가는 이전의 실시예(즉, 실시예 32)에서 얻은 수준보다 낮은 반면(주로 이 실시예에서 이들 암탉은 2회이 면역되었기 때문; 비교하면 이전의 실시예들에서 암탉들은 5 내지 10회 이상 면역되었고 결과의 항 독소 단백질 역가는 1:100,00에 달했다), 결과들은 두 재조합 독소 단백질이 암탉에서 동등하게 항원성을 갖는 것으로 보이고 각각에 대해 생성된 항체는 상당한 수준으로 존재하였음을 나타냈다. 이 결과들은 또한 항체 반응의 수준은 사용된 보조제에 의존됨을 나타냈다. 퀴일 A 보조제는 게르부 보조제를 사용하여 얻은 결과에 비하여 면역법 공정 동안 초기에 높은 항-A-6 및 항-B-3 IgY 반응을 유발한 것으로 밝혀졌다.
실시예 47
항-재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 항체를 사용한
천연 클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 친화성 정제
친화성 리간드로서 인터벌 A-6를 사용하여 재조합 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 단백질에 대해 발생된 조류 항체 (IgY)를 친화성 정제하였다. 이이서, 생성되는 특이성 항체를 고형 지지체 상에 고정화시켜 BHI 브로쓰 중에 침지된 투석 백에서 증식한 클로스트리듐 다이피셀 균 (ATCC#43255)로부터 유래한 천연 독소 A를 정제하였다. 다음의 실시예는 a) 독소 A의 재조합 단편에 대해 유도된 조류 항체의 친화성 정제 및 독소 A 친화성 칼럼의 생성, b) 투석 백 배양 상등액 중에서 독소 A 및 B를 생산하는 클로스트리듐 다이피셀 균의 증식, c) 독소 A의 친화성 정제, d) 친화성 정제된 독소 A의 시험관 내 특성화, 및 e) 항-A-6 IgY의 친화성 정제 독소 A에 대한 고형 지지체로의 커플링을 위한 별도의 전략의 연구, f) A-6 IgY의 과요오드산염 산화에 의해 생산된 친화성 칼럼 상의 클로스트리듐 다이피셀의 친화성 정제 및 g) 친화성 정제된 클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 시험관내 특성화를 수반한다.
a) 독소 A의 재조합 단편에 대해 유도된 조류 항체의 친화성 정제 및 독소 A 친화성 칼럼의 생성
클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 인터벌 A-6(아미노산 1870-2680)에 특이적인 항체를 친화성 정제하여 액체 배양 상등액으로부터 클로스트리듐 다이피셀 독소 A를 정제할 수 있는 친화성 칼럼을 제조하기 위한 시약을 제공하고 배양 상등액 및 친화성-정제 클로스트리듐 다이피셀 독소 A 시료에서 클로스트리듐 다이피셀 독소 A를 정제하기 위한 면역 분석 시약을 제공하였다.
i) A-6 IgY의 친화성 정제
프로이트 보조제를 사용하여 A-6 재조합 단백질에 대한 항체를 포함하는 알로부터 과면역 IgY를 PEG 분획법 (실시예 1)을 사용하여 추출하였다. 항체 함유 상등액을 제조원의 지시에 따라 Actigel A 친화성 수지 (Sterogene)에 pPA1870-2680 IgY 단백질 (실시예 29에서 제조됨)을 커플링시켜 제조된 A-6 친화성 칼럼에 적용하였다. pPA1870-2680 (A-6) 단백질 대략 10.2 ㎎은 Actigel 친화성 수지 5 ㎖에 커플링되었다. 항-A-6 IgY를 실시예 15c에 기술된 바와 같이 Actisep 용출 매질 (Sterogene Biochemical)로 용출시키고, 2 내지 8℃에서 24 내지 48시간 동안 PBS에 대하여 투석시켰다.
ii) 활성화된 친화성 수지에 대한 친화성 정제된 항-A-6 IgY의 커플링에 의한 클로스트리듐 다이피셀 독소 B 친화성 칼럼의 제조
초기 독소 A 친화성 칼럼을 후술하는 실시예 48a에 기술된 바와 같이 항-A-6 IgY를 Actigel 친화성 수지에 커플링시켜 제조하였다. 커플링 전후의 280 nm에서의 IgY 흡수치를 비교하여 항-A-6 IgY의 약 58% 또는 약 7.6 mg이 수지에 커플링되었음이 측정되었다.
b) 투석 백 배양물 중에서 독소 A 및 B를 생성하는 클로스트리듐 다이피셀 균의 증식
클로스트리듐 다이피셀 균주 (ATCC #43255)을 후술하는 실시예 49b iv 및 v에 기술한 바와 같이 증식시켰다. PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 다음과 같이 수행하여 클로스트리듐 다이피셀 투석 백 배양 상등액 중에 독소 A가 존재하는 지의 여부를 결정하였다. 상업적으로 입수한 투석 백 배양 상등액 시료 및 공지의 독소 A 시료는 친화성 정제된 A-6 IgY를 먼저 웨스턴 블로팅을 위한 일차 항체로 사용한 것을 제외하고는 후술하는 실시예 49b, iv부분에 기술한 바와 같이 분석하였다.
SDS-PAGE (5% 폴리아크릴아미드 겔) 다음, 단백질을 제조원의 지시에 따라 Milliblot 전이 기구(Millipore)를 사용하여 니트로셀룰로오스로 옮겼다. 블롯을 일시적으로 10% Ponceau S로 염색시키고 1 ㎎/㎖ 분유를 함유하는 PBS 중에서 밤새 블록킹시켰다. 면역전 및 항-A-6 IgY 일차 항체를 1 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 PBS 1 ㎎/㎖에 희석시키고, 적절한 항체를 가볍게 흔들면서 실온에서 2 시간 동안 대응하는 블롯으로 인큐베이션시켰다. 스트립을 PBS (10 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.2), BBS-Tween (0.1 M 붕산, 0.025 M 붕산 나트륨), 1 M NaCl, 0.1% v/v Tween 20) 및 PBS로 세척하여 미결합 항체를 제거하고, PBS/BSA 중에 1:2000으로 희석된 토끼 항-닭 IgG 알칼리성 포스페이트 접합 2차 항체(Sigma Chemical Co.)로 인큐베이션시켰다. 블롯들을 세척하여 미결합 2차 항체를 제거하고 스트립을 (실시예 48에 기술된 바와 같이) BCIP/NBT 기질 중에 전개시켰다.
분석된 두 배양 상등액 시료는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였을 때 면역 반응성 클로스트리듐 다이피셀 독소 A를 포함하는 것으로 나타났다. 이 단백질은 상업적인 독소 A와 함께 이동하였으며, 친화성 정제 항-A-6 IgY로 인식되었다. 배양 상등액 시료를 독소 A의 친화성 정제전에 풀링하였다. 풀링된 배양 상등액은 친화성 칼럼에 부하기 전에 농축시키지 않았다.
c) 클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 친화성 정제
클로스트리듐 다이피셀 독소 배양 상등액 시료를 실시예 48c에 기술된 바와 같이 친화성 정제하였다. 용리 및 투석후, 악티셉 분획의 용적은 42 ml이었고, 그 중 15 ㎖을 분리하여 분석전에 3 ㎖로 농축시켰다. 센트리콘 30 농축기 (아미콘사)를 사용하여 시료를 농축하였다.
d) 클로스트리듐 다이피셀 배양 상등액, 악티셉 용리 분획 및 칼럼 용출물의 독소 A의 존재에 대한 분석
악티셉-용리 시료 및 친화성 칼럼으로부터의 용리액에 독소 A가 존재하는지의 여부를 결정하기 위해서, 배양 상등액 출발 물질과 함께 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 상기 시료를 분석하였다. 이들 분석은 상기 b)에 기술된 바와 같이 수행하여 시료 중의 독소 A의 상대적인 양 및 친화성 정제의 효율을 평가하기 위해 실시하였다.
결과의 웨스턴 블롯은 도 50에 나타냈다. 도 50에서 레인 1-3은 1차 항체로서 면역전 IgY로 인큐베이션시켰고, 레인 4-6은 1차 항체로서 항-A-6 IgY로 인큐베이션시켰다. 레인 1 및 4는 배양 상등액 출발 물질을 포함하고; 레인 2 및 5는 칼럼 통과액을 포함하고, 레인 3 및 6은 친화성 정제된 독소 A를 포함한다.
도 50에 나타낸 결과는 면역 반응성 독소 A가 배양 상등액 출발 물질 및 악티셉 분획에서 탐지되었음을 나타낸다. 더욱이, 칼럼 용출 시료에서는 아무런 독소 A가 관찰되지 않았으며, 이는 대부분의 독소가 친화성 칼럼에 결합되었음을 나타낸다. 악티셉 분획에서 보다는 출발 물질에서 상당히 많은 독소 A가 발견되었다. 칼럼 용리액은 명백히 독소 A를 포함하지 않기 때문에, 출발 물질 및 악티셉 분획 사이의 독소 A의 양의 차이는 상당한 양의 독소가 여전히 칼럼에 결합되었음을 제시한다. 악티셉이 모든 독소 A를 용출할 수 없는 데에 대한 한 가지 가능한 설명은 독소 A가 면역글로불린등의 분자의 탄수화물 영역에 비특이적으로 결합하는 경향이다. 이것은 칼럼 상의 항-A-6 IgY가 일차 아민을 경유하여 결합되고 이것이 IgY의 소집단을 Fab 영역을 경유하여 커플링되게 하고, 독소 A에 결합하기 위해 탄수화물 함유 Fc영역에 접근하게 하기 때문에 가능하다.
e) 항-A-6 IgY의 친화성 정제 독소 A에 대한 고형 지지체로의 커플링을 위한 별도의 전략의 연구
다음에 탄수화물 영역의 과요오드산염 산화에 의한 IgY의 고형 지지체에 대한 커플링의 가능성을 시험하였다. 이 커플링 방법은 다음을 수행하는 것으로 예측된다: 1) IgY가 Fc 영역을 경유하여 지지체에 결합하여 Fab 영역이 클로스트리듐 다이피셀 독소에 결합하는 것을 가능하게 함 및 2) 탄수화물을 클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 비 특이성 결합을 제거하거나 감소시키기에 충분하게 변경시키는 것.
i) 과요오드산 나트륨을 사용한 항-A-6 IgY의 산화
항-A-6 IgY를 다음과 같이 과요오드산 나트륨(Sigma Chemical Co.)를 사용하여 산화시켰다. 과요오드산 나트륨 원액을 과요오드산 나트륨 25㎎을 1.2 ㎖의 증류, 탈이온수 중에 용해시킴으로써 제조하였다. 15 ㎖ 폴리스티렌 튜브 중의 A-6 IgY 6㎖ (2.7 ㎎/㎖으로)에 과요오드산 나트륨 원액 600 ㎕ (0.1 용적)를 첨가하였다. 이어서 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 1 시간 20분 동안 가볍게 혼합하였다. 이어서 글리세롤을 최종 농도 20 mM로 첨가하고, 튜브를 10 분 더 도립시켰다. 이어서 용액을 100 mM 소듐 아세테이트, 150 mM NaCl, pH 5.5에 대하여 투석시켜 과요오드산 나트륨을 제거하였다.
ii) Affi-Gel Hz 하이드라 겔(BioRad)에 대한 산화된 IgG의 커플링
Affi-Gel 수지 6 ㎖을 커플링 완충액(100 mM 소듐 아세테이트, 150 mM NaCl, pH 5.5)으로 세척하였다. 산화된 항-A-6 IgY를 유리 섬유 주사기 필터를 통해 여과시켜 산화 공정 동안 형성된 침전물을 제거하고, 100 ㎕ 부분 표본을 A280 분석을 위해 제거하였다. 세척된 Affi-Gel 수지를 15㎖ 폴리스티렌 튜브 중의 산화된 IgY에 첨가하고 튜브를 실온에서 밤새 도립시켰다(전체 용적=12 ㎖).
iii) 커플링 효율의 측정
항-A-6 IgY-Affi-Gel 친화성 수지를 BioRad Econo 칼럼 상에 붓고 미결합 항체를 수지를 통해 세척하고 A280 분석을 위해 저장하였다. 이어서 수지를 1 베드 용적의 PBS (10 mM 인산 나트륨, 10.5 M NaCl, pH 7.2)로 세척하였다. 이것을 또한 수집하여 A280 분석을 위해 저장하였다. 이어서 수지를 몇배 더 많은 용적의 PBS로 세척하고, 악티셉 용출 완충액(Bioseparation)으로 처리하여 미결합 항체가 수지 상에 잔류하는 것을 확인하였다. A-6 IgY에 대한 커플링 전후의 A280 값을 비교함으로써 IgY의 95% 또는 8.4 ㎎이 수지에 결합되었음을 확인하였다.
f) A-6 IgY의 과요오드산염 산화에 의해 생산된 친화성 칼럼 상의 클로스트리듐 다이피셀의 친화성 정제
실시예 48b, iv 부분에 기술한 바와 같이 증식시킨 두 투석 백 배양 상등액을 풀링하고, 아미콘 센트리프렙 농축기를 사용하여 약 15 ㎖로 농축시켰다. 이어서, 풀링되고, 농축된 상층액을 항-A-6 IgY Affi-Gel 친화성 칼럼에 가하고 칼럼 용출물을 을 수집하고 가능한한 많은 양의 독소를 결합시키기 위하 수회 더 재부하하였다. 이어서, 미결합 단백질을 수 베드 용적의 PBS로 칼럼을 세척함으로써 제거하고 결합 독소 A를 악티셉 친화성 정제의 2 베드 용적로 용출시켰다. 칼럼 용출물을 분석을 위해 저장하여 친화성 정제의 효율을 평가하였다. 악티셉-용리 독소를 TBS에 대하여 24-48 시간 동안 2-8℃에서 투석하여 센트리프렙 농축기(Amicon)을 사용하여 53에서 3 ㎖로 농축시켰다.
g) 친화성 정제된 클로스트리듐 다이피셀 독소 A의 시험관내 특성화
i) 단백질 분석
정제된 독소 농도는 BCA단백질 분석 (Pierce)을 사용하여 결정하여 70 ㎍/㎖또는 배양 상등액의 37 ㎖로부터 약 전체 210 ㎍인 것으로 밝혀졌으며, 이는 배양 상등액의 약 5.7 ㎍의 독소/㎖임을 나타낸다.
ii) HPLC에 의한 독소 순도 및 체류 시간의 비교
HPLC분석을 사용하여 친화성 정제된 독소 A 시료의 순도 및 체류 시간 모두를 비교하였다. 상업적인 것 및 친화성 정제된 독소 A 시료들을 Shodex KW 803 HPLC 칼럼에 가하고 Waters HPLC 칼럼을 사용하여 PBS로 용출시켰다. 독소 A 체류 시간은 두 독소 시료에 대해 대략 7분이었으며, 이는 독소가 동일함을 의미한다. 더욱이, 두 독소의 순도도 유사하였다.
iii) 배양 상등액 출발 물질, 친화성 정제된 독소 A 및 칼럼 용리액(통과)에 대한 웨스턴 블롯
친화성 정제의 효율을 평가하고 친화성 정제된 독소 A를 면역화학적으로 동정하기 위하여, 배양 상등액, 친화성 정제된 독소 A 및 칼럼 용리 시료를 5% 겔 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 전기영동시키고 표준 방법을 사용하여 니트로셀룰로오스에 전이시켰다. 블롯을 일시적으로 10% 폰소 S로 염색시켜 레인을 표시되게 하고 잔여 단백질 결합 부위를 1 ㎎/㎖ 분유를 함유하는 PBS 중에서 2-8℃에서 밤새 블록킹시켰다. 블롯을 절반으로 잘라 두개로 만들고, 그중 하나를 항-A-6 IgY 일차 항체로 인큐베이션시키고, 1 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 PBS 1 ㎎/㎖에 희석시키고, 절반 중 두 번째의 것은 PBS/BSA 1 ㎍/㎖로 희석시킨 면역전 IgY로 인큐베이션시켰다. 일차 항체의 존재하에서 (가볍게 흔들면서) 2 시간 동안 인큐베이션시킨후, PBS, BBS-Tween 및 PBS로 세척하여 미결합 항체를 제거하였다. 이어서 1 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 PBS 중에 1:200으로 희석된 토끼 항-닭 IgG 알칼리성 포스페이트 접합 2차 항체를 각 블롯에 첨가하였다. 두 시간 후, 블롯들을 세척하여 미결합 2차 항체를 제거하고 BLIP/NBT(Kirkegaard and Perry) 기질 용액 중에 전개시켰다. 결과의 웨스턴 블롯을 도 51에 나타냈다.
도 51에서, 레인 1-7은 일차 항체로서 항-A-6 IgY로 인큐베이션시켰고, 레인 8-15는 일차 항체로서 면역전 IgY로 인큐베이션시켰다. 레인 1 및 9는 넓은 범위 분자량 마커(BioRad)를 함유하였다. 레인 2 및 10은 클로스트리듐 다이피셀 배양 상등액 # 1을 함유하였다. 레인 3 및 11은 클로스트리듐 다이피셀 배양 상등액 # 2를 함유하였다. 레인 4 및 12는 클로스트리듐 다이피셀 배양 상등액 # 1 및 #2(풀링됨)를 함유하였다. 레인 5 및 13은 통과 칼럼을 함유한다.
레인 6 및 14는 친화성 정제된 독소 A(고부하; 즉 레인 7 및 15에서 나타낸 2X 부하)를 함유하였다. 레인 7 및 15는 친화성 정제된 독소 A(저부하)를 함유하였고 레인 8은 시료 물질을 함유하지 않았다(블랭크).
친화성 정제된 독소 A 시료(레인 7)은 풀링된 출발 물질 시료(레인 4)에 비하여 3.5 배 이상 농축되었다; 그러나, 친화성 정제된 시료의 1/3 용적(5 ㎕ 대 15 ㎕)는 풀링된 출발 물질 시료에 비하여 부하되었다. 결과적으로, 대부분의 독소 A가 칼럼으로부터 회수되었다면, 웨스턴 블롯 상에서 탐지된 독소 A 농도는 유사할 것이다. 도 51에 나타낸 바와 같이, 주된 고분자량 밴드에 대응하는 신호는 비슷하였다. 따라서, 친화성 정제 칼럼으로부터 독소 A의 회수는 정량적인 것으로 나타났다.
실시예 48
항-재조합 씨. 다이피셀 독소 B 항체를 사용한
천연 씨. 다이피셀 독소 B의 친화성 정제
친화성 리간드로서 인터벌 B-3 (즉, 씨. 다이피셀 독소 B의 aa 1750-2360)을 사용하여 재조합 씨. 다이피셀 독소 B 단백질 (pPB1750-2360: 인터벌 B-3)에 대항해 생성된 조류 항체 (IgY)를 친화성 정제하였다. 이어서, 생성되는 정제된 항-인터벌 B-3 특이 항체를 독소 생성에 유리한 조건 하에 증식한 씨. 다이피셀 균 (ATCC#43255)로부터 유래한 천연 독소 B의 정제를 촉진하기 위해 고형 지지체 상에 고정화시켰다.
본 실시예는 a) 씨. 다이피셀 독소 B의 재조합 단편에 대해 유도된 조류 항체의 친화성 정제 및 씨. 다이피셀 독소 B 친화성 칼럼의 제조, b) 액체 배양물 및 투석 백 배양 상등액 중에서 독소 A 및 B를 생성하는 씨. 다이피셀 균의 증식, c) 씨. 다이피셀 독소 B의 친화성 정제 및 d) 씨. 다이피셀로부터의 친화성 정제된 독소 B의 시험관 내 및 체내 특성화를 포함한다.
a) 씨. 다이피셀 독소 B의 재조합 단편에 대해 유도된 조류 항체의 친화성 정제 및 씨. 다이피셀 독소 B 친화성 칼럼의 제조
액체 배양 상등액으로부터 씨. 다이피셀 독소 B를 정제할 수 있는 친화성 칼럼을 제조하기 위한 시약을 제공하고 배양 상등액 및 친화성-정제 씨. 다이피셀 독소 B 시료에서 씨. 다이피셀 독소 B를 검출하기 위한 면역 분석 시약을 제공하기 위해 씨. 다이피셀 독소 B 단백질의 인터벌 B-3에 특이적인 항체를 친화성 정제하였다.
i) 항-인터벌 B-3 IgY의 친화성 정제
PEG 분획법 (실시예 1)을 사용하고 게르부 (Gerbu) 첨가제 (실시예 45)를 사용하여 생성된 인터벌 B-3 재조합 단백질 (pPB 1750-2360)에 대한 항체를 포함하는 에그로부터 과면역 IgY를 추출하였다. 항체 함유 상등액을 실시예 15c에서 기술한 바와 같이 악티겔 (Actigel) A 친화성 수지 (스테로겐사 (Sterogene))에 pPB 1750-2360 단백질 (실시예 29에서 제조됨)을 공유결합시켜 제조된 인터벌 B-3 친화성 칼럼에 적용하였다. 상기 단편은 씨. 다이피셀 독소 B 반복 영역을 포함하고 씨. 다이피셀 독소 A 단백질과 상동성인 영역을 포함하지 않아 생성되는 정제된 항체가 씨. 다이피셀 독소 A와 가교반응하지 않아야 하는 조건을 충족시키기 때문에 선택되었다. 항-인터벌 B-3 항체 (항-B-3 IgY)를 4 M 구아니딘 HCl, pH 8.0을 사용하여 칼럼으로부터 용리시키고 2 내지 8℃에서 24 내지 48시간 동안 PBS에 대하여 투석시켰다.
ii) 활성화된 친화성 수지에 대한 친화성 정제된 항-B-3 IgY의 커플링에 의한 씨. 다이피셀 독소 B 친화성 칼럼의 제조
상기 제조된 친화성 정제된 조류 항-B-3 항체 11 mg을 악티겔 친화성 수지(스테로겐사) 5 ml에 커플링시켜 씨. 다이피셀 독소 B 친화성 칼럼을 제조하였다. 각 항체 분자가 수지에 커플링되어 항체가 독소에 보다 접근할 수 있는 부위의 수를 최소화하기 위해서 제조자가 권고한 최소시간인 2시간이 아니라 30분 동안 커플링시켰다. 또한, 칼럼을 고염 완충액 또는 악티셉 (Actisep) 용리 완충액 (스테로겐사)에만 노출시키고 항-B-3 항체의 변성을 최소화하기 위해서 구아니딘 용액은 친화성 칼럼의 제조 동안에는 사용하지 않았다. 커플링 전후의 289 nm에서의 IgY의 흡광도를 비교하여 추정치의 약 62% 또는 약 6.8 mg의 항-B-3 IgY가 수지에 커플링되었음을 알았다.
b) 액체 배양물 및 투석 백 배양 상등액 중에서 독소 A 및 B를 생성하는 씨. 다이피셀 균의 증식
i) BHI 브로쓰 중에서 씨. 다이피셀의 액체 배양
씨. 다이피셀 (ATCC #43255)의 동결 스톡 바이알을 해동시키고 CCFA 플레이트 (BBL) 상에 플레이팅시키고 혐기성 챔버 내에서 37℃에서 36 내지 48시간 동안 증식시켰다. 멸균 면봉을 사용하여 CCFA 플레이트로부터 군체를 수거하였다. 수거된 군체를 사용하여 BHI 브로쓰 (BBL)의 액체 배양물 20 ml을 접종하였다. 이 배양물을 혐기성 자 내에서 37℃에서 24시간 동안 증식시켰다. 철야배양한 10 ml을 사용하여 BHI 브로쓰의 액체 배양물 500 ml을 접종하고 배양물을 혐기성 챔버 내에서 37℃에서 약 72시간 동안 증식시켰다.
ii) 액체 배양 상등액의 수거
72시간 배양물을 베크만 (Beckman) J2-21 원심분리기로 5000 rpm (4420 x g)에서 10분 동안 원심분리하여 씨. 다이피셀 균을 펠렛화시키고 상등액을 0.45 μ 필터 (날겐 (Nalgene))를 통과시켜 여과하고 독소 정제 및 분석을 위해 2 내지 8℃에서 보관하였다.
iii) 씨. 다이피셀 독소 B의 존재를 검사하기 위한 배양 상등액의 시험관내 분석
배양 상등액 중에 씨. 다이피셀 독소 B가 존재하는 지의 여부를 결정하기 위해 천연 PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 상등액을 다음과 같이 분석하였다. 천연 PAGE겔 상에서의 전기영동 전에 Centricon 30 농축기 (Amicon)를 사용하여 수거된 배양 상등액을 약 10배로 농축하였다. 이어서, 농축 시료를 등용량의 천연 겔 시료 완충액 (50% 슈크로스, 0.1% 브로모페놀 블루)와 혼합하여 Techlab사에서 구입한 공지의 씨. 다이피셀 독소 B의 시료와 함께 4 내지 15% 트리스-글리신 구배 겔 (Bio-Rad) 상에 로딩하였다. 시료를 회퍼 (Hoefer) 전원을 사용하여 일정 전압 150 볼트에서 3시간 동안 전기영동시켰다. 전기영동 후에 겔을 1/2로 절단하여 반쪽을 코마시 블루로 염색하고 10% 빙초산/40% 메탄올을 포함하는 용액으로 염색을 제거하여 단백질 밴드를 가시화시켰다. 겔의 다른 반쪽은 블로팅시키고 친화성 정제된 항-B-3 항체 (상기 섹션 i)를 사용하여 프로빙하였다.
코마시 블루로 염색된 겔은 도 52에 도시하였다. 도 52에서, 레인 1은 광역 분자량 마커를 포함한다. 레인 2는 시판되는 독소 B (Techlab)를 포함하고, 레인 3은 BHI 브로쓰를 포함하고, 레인 4는 배양 상등액을 포함하고, 레인 5는 농축 배양 상등액을 포함한다.
도 52에 도시한 바와 같이, 시판되는 독소 B를 코마시 염색된 겔 상에서 검출할 수 있었다. 농축 배양 상등액은 복수개의 비교적 희미한 밴드를 보였지만, 공지의 씨. 다이피셀 독소 B 시료와 함께 이동하는 검출가능한 단백질은 상등액 시료 중에 없었다. 또한, 웨스턴 블롯 분석은 친화성 정제된 항-B-3 항체에 의해 인식되는 어떠한 단배질도 배양 상등액에서 검출하지 못했다. 이러한 결과는 상기 증식 조건이 독소 생성에 최적의 상태가 아니라는 것을 증명한다.
iv) 투석 백 배양에서 씨. 다이피셀 독소 B의 생성
씨. 다이피셀 독소 B의 생성에 최적의 증식 조건을 확인하기 위해서, 다음과 같은 실험을 실시하였다. 씨. 다이피셀 #43255의 액체 배양물을 상기한 바와 같이 철야 증식시켰다. 철야 배양물을 사용하여 PBS를 포함하는 투석 백에서 증식한 대규모 배양물을 접종하고 문헌 [Meador and Tweten, Infection and Immunity, 56:7 (1988)]에 기재된 바와 같이 BHI 브로쓰에 침지시켰다. 넓은 개구부를 갖는 500 ml 배지 바틀 2개를 BHI 브로쓰 400 ml로 채웠다. 차단 분자량이 12 내지 14,000이고 PBS 25 ml을 포함하는 투석 백 (Spectrapor)을 양 말단에서 묶고 각각의 500 ml 바틀 중의 BHI 배지에 침지시켰다. 이어서, 브로쓰 및 PBS를 멸균처리하기 위해 바틀 및 투석 백을 30분 동안 고압 멸균하였다. 이어서, 바틀을 혐기성 조건 하에 37℃에서 1시간 동안 배양하여 액체를 냉각시키고 배지로부터 산소를 제거하였다.
이어서, 27 게이지 바늘이 부착된 10 cc 주사기를 사용하여 브로쓰 수준 위에서 백을 찔러서 각 투석 백 중의 PBS를 철야 배양물 10 ml로 접종하였다. 이어서, 바틀을 혐기성 조건 하에 37℃에서 48 내지 72시간 동안 배양하였다. 두개의 바틀은 투석 백 내부에서 큰 증식을 보였지만, 바틀 중의 하나는 또한 투석 백 외부의 BHI 브로쓰에서 흐림 현상을 보여서 BHI가 오염되었음을 시사하였다. 따라서, 두개의 투석 백의 내용물은 각 내용물이 별개로 분석될 수 있을 때까지 계속 분리된 상태로 유지하였다. 오염된 백 내의 BHI 증식은 투석 백의 접종 중에 바늘로부터 떨어졌을 수 있는 씨. 다이피셀 때문인 것으로 생각된다.
v) 투석 백 배양 상등액의 수거
투석 백 내용물을 제거하고 5000 rpm (3440 x g)에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화시키고 각 투석 백으로부터의 투석 백 배양 상등액을 별도로 처리하였다. 각각을 0.45 μ 주사기 필터를 통과시켜 여과하고 센트리프렙 30 농축기 (아미콘사)를 사용하여 농축하였다. 2개의 시료를 35 ml에서 3 ml로 농축시키고 2 내지 8℃에서 보관하였다.
투석 백 액체 배양물으로부터의 배양 상등액을 천연 PAGE 및 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석하여 투석 백 배양 상등액 중에서 생산된 독소 B의 양을 평가하였다.
vi) 씨. 다이피셀 투석 백 배양 상등액의 천연 PAGE/웨스턴 블롯 분석
농축된 투석 백 배양 상등액의 부분 시료 및 알려진 씨. 다이피셀 독소 B 시료를 상기 섹션 iii)에서 기술한 바와 같이 4 내지 15% 트리스-글리신겔 (바이오-라드사) 상에서 전기영동시켰다. 겔의 1/2을 코마시 블루로 염색하고 다른 1/2은 웨스턴 블롯 분석을 위해 반건조 이송 장치 (밀리포어) 및 표준 이송 조건 (12 볼트, 일정 전압, 30분)을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인에 이송하였다. 멤브레인 상의 나머지 단백질 결합 부위는 건유 1 mg/ml을 함유하는 PBS 중에서 철야 블로킹하였다.
도 53은 생성되는 코마시 염색 겔 및 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 53에서 레인 1-4는 코마시 염색 겔을 나타내고 레인 6-9는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 레인 1 및 6은 광역 분자량 마커를 포함하고, 레인 2 및 7은 시판되는 독소 B (테크랍사)를 포함하고, 레인 3 및 8은 멸균 BHI 브로쓰를 갖는 배양물으로부터의 투석 백 배양 상등액을 포함하고, 레인 4 및 9는 "오염된" BHI 브로쓰를 갖는 배양물으로부터의 투석 백 배양 상등액을 포함하고, 레인 5는 아무것도 포함하지 않은 블랭크이다.
도 53에 나타낸 바와 같이, 씨. 다이피셀 독소 B의 존재는 블롯 스트립을 친화성 정제된 항-B-3 IgY와 함께 배양함으로써 검출되었다. 블롯을 세척하여 결합하지 않은 항-B-3 항체를 제거한 후, 스트립을 알칼린 포스파타제 (시그마사)에 접합된 토끼 항-닭 Ig로 이루어지는 2차 항체와 함께 배양하여 결합된 항-B-3 항체를 검출하였다. 블롯을 다시 세척하여 결합하지 않은 2차 항체를 제거하고 블롯을 새로 제조한 BLIP/NBT 기질 용액 중에서 전개하였다. 적합한 신호가 얻어진 후에 블롯을 물에 잠기게 하여 전개를 중단시켰다.
PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 결과는 투석 백 상등액 시료 중에 존재하는 독소 B의 양이 너무 희석되어 코마시 염색에 의해 검출될 수 없다는 것을 보여준다. 그러나, 배양 상등액 시료 두개 (멸균 BHI 브로쓰를 갖는 바틀로부터의 시료 및 오염된 BHI 브로쓰를 갖는 바틀로부터의 시료) 모두는 웨스턴 블로팅에 의해 분석할 때 면역반응성 독소 B를 포함하였다. 2개의 배양 상등액 시료 사이의 유일한 차이점은 생산된 독소 B의 양인 것으로 보였다. 멸균 브로쓰 시료는 오염된 브로쓰 시료보다 많은 독소 B를 포함하는 것으로 나타났다.
투석 백 배양 상등액 시료에서 생산된 독소 B와 시판되는 독소 B를 비교하여 배양 상등액 시료가 완전한 독소 B 단백질을 보다 높은 백분율로 포함함 (즉, 배양 상등액 시료에 존재하는 작은 면역반응성 밴드의 형태로 분해된다는 증거가 훨씬 적었음)을 알 수 있었다. 배양 상등액 시료 두개 모두는 독소 B를 포함하기 때문에 (상이한 농도로 포함하지만) 친화성 정제 전에 풀링되었다.
c) 씨. 다이피셀 독소 B의 친화성 정제
투석 백 배양 상등액 시료를 풀링하여 독소 B 친화성 칼럼 [섹션 a에서 제조됨]에 적용하였다. 기준선 OD를 얻을 때까지 칼럼을 PBS로 세척하여 비특이 단백질을 제거하였다. 악티셉 용리 매질 (스테로겐사)을 사용하여 결합된 단백질을 용리시킨 후 트리스-완충 염수, pH 7.5 (50 mM 트리스, 150 mM NaCl)에 대하여 투석시켰다. 투석 후에 센트리콘 30 농축기 (아미콘사)를 사용하여 친화성 정제된 단백질을 40 ml에서 4.5 ml로 농축하였다.
d) 씨. 다이피셀로부터의 친화성 정제된 독소 B의 시험관내 및 체내 특성화
악티셉-용리 시료 및 친화성 칼럼으로부터의 용리액 (즉, 통과액)의 씨. 다이피셀 독소 B 존재 여부를 결정하기 위해서, 배양 상등액 출발 물질과 함께 천연 PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 상기 시료를 분석하였다. 분석은 배양 상등액 내의 씨. 다이피셀 독소 B의 상대적인 양 및 친화성 정제의 효율을 평가하기 위해 실시하였다.
친화성 정제된 배양 상등액, 통과액 및 시판되는 씨. 다이피셀 독소 B 시료를 각각 등용량의 천연 시료 완충액과 혼합하고 4-15% 천연 트리스-글리신 구배 겔 (바이오-라드사) 상에 로딩하였다. 회퍼 전원을 사용하여 일정 전압 200 볼트에서 약 2.5시간 동안 전기영동시키고 제조자의 지시에 따라 반고형 블로팅 장치 (밀리포어사)를 사용하여 니트로셀룰로스에 이송하였다. PBS 중의 1% 분유를 포함하는 용액을 사용하여 블롯을 철야 블로킹하였다. 이어서, 블롯을 1차 항체로서의 친화성 정제된 항-B-3 IgY 및 2차 항체로서의 알칼린 포스파타제에 접합된 토끼 항-닭 Ig와 함께 배양하였다. 블롯을 섹션 b(vi)에서 기술한 바와 같이 처리하여 씨. 다이피셀 독소 B 단백질을 가시화시켰다.
도 54는 코마시 염색 겔 및 대응하는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 54에서 레인 1-3은 코마시 블루로 염색되었고, 레인 5-10은 항-B-3 항체 IgY로 프로빙되었고, 레인 8-10은 면역전 IgY로 프로빙하였다. 레인 1, 5 및 8은 친화성 정제 독소 B를 포함하고, 레인 2, 6 및 9는 칼럼 통과액을 포함하고, 레인 3, 7 및 10은 시판되는 독소 B (테크랍사)를 포함한다. 레인 4는 어떠한 단백질도 포함하지 않는다 (블랭크).
웨스턴 블롯 분석을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 3개의 시료 (배양 상등액, 용리된 단백질 및 통과액)는 모두 면역반응성 독소 B를 포함하였다. 이 결과는 친화성 정제 프로토콜이 일부 독소 B의 정제에 성공적이라는 것을 나타낸다. 그러나, 통과액 분획은 상당량의 독소 B 포함하는 것으로 밝혀졌기 때문에 정제 과정 (예를 들면, IgY의 페리오데이트 산화를 통한 B-3 IgY의 아피겔 히드라지드 지지체 (바이오라드사)에의 커플링)을 최적화하기 위한 능력에 대해 그 변형이 조사될 것이다
ii) 친화성 정제된 씨. 다이피셀 독소 B의 수율
친화성 정제된 씨. 다이피셀 독소 B의 수율은 단백질 표준으로서 BSA를 사용하여 BCA 단백질 분석 (피어스사)에 의해 측정하였다. 이 분석을 통하여 독소 B의 농도가 73 μg/ml x 4.5 ml (친화성 정제된 물질의 용량) = 독소 B 365 μg임을 알았다. 투석 백 배양 상등액 약 70 ml을 출발 물질로 사용하여 배양물 1 밀리리터 당 약 5 μg의 독소 B를 회수하였다. 이 수득량은 상기 씨. 다이피셀 배양 방법을 사용한 과거에 보고된 수득량 [배양 상등액 1 ml 당 독소 B 7.8 μg: Meador and Tweten (1988), 상기 문헌]에 일관된다.
iii) 친화성 정제된 씨. 다이피셀 독소 B의 체내 활성의 측정
상이량의 정제된 독소 B 제제 (후술함)를 30 내지 40 그램의 시리아 햄스터 암컷에 주사하여 친화성 정제된 씨. 다이피셀 독소 B의 체내 활성을 측정하였다. 이전에 얻은 결과와 비교하기 위해 또다른 군의 햄스터에게 상이량의 시판되는 독소 B 제제 (테크랍스사)를 주사하였다. 씨. 다이피셀 독소 B의 테크랍스사 제제의 LD100은 복강내 투여시 (실시예 19) 30 내지 40 g의 햄스터의 경우 약 5 μg인 것으로 판명되었다. 상기 농도 (5 μg/30-40 g 햄스터)에서 햄스터는 복강내 주사 약 3시간 내에 죽었다.
친화성 정제된 독소 B의 LD100 농도는 염수에 희석된 친화성 정제 독소 B 5 또는 50 μg을 포함하는 용액 1 ml을 복강내 주사하여 측정하였다. 30 내지 40 g의 햄스터 두마리에 각각의 농도의 친화성 정제 독소 B를 주사하였다. 친화성 정제 물질 50 μg을 주사한 햄스터는 2시간 내에 죽었고, 친화성 정제 독소 B 5 μg을 주사한 햄스터는 4시간 내에 죽었다. 이러한 결과는 친화성 정제된 씨. 다이피셀 독소 B 제제의 독성은 시판되는 씨. 다이피셀 독소 B에 필적할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 49
씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B의 검출을 위한 진단 응집 분석
본 실시예에서, 배양 상등액 또는 생물학적 시편, 예를 들면 대변에서 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B를 검출하기 위해 고안된 신속 응집 분석법이 개발되었다. 닭으로부터의 재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B에 대한 친화성 정제된 항체를 사용하여 수동적으로 폴리스티렌 소립자를 코팅하였다. 원칙적으로, 독소 A 및 독소 B에 대한 특이 조류 항체 (IgY)로 코팅된 입자는 이들이 독소를 포함하는 시료에 혼합되었을 때 가시적인 응집체를 형성하여야 한다. 이러한 형식은 특이적이고 감도 높은 신속한 분석법을 제공한다. 이 경우에 친화성 정제 IgY는 씨. 다이피셀 독소에 대한 특이성 및 감도를 부여하고, 응집 분석 형식을 사용함으로써 사용의 용이성 및 신속한 분석을 제공할 수 있다. 본 실시예는 a) 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B의 검출을 위한 응집 분석법의 개발 및 b) 응집 분석의 평가 및 최적화를 기술한다.
a) 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B의 검출을 위한 응집 분석법의 개발
항체는 상기 실시예에서 기술한 바와 같이 독소 A 재조합체 (pMAL 1870-2680) 및 독소 B 재조합체 (pPB 1750-2360)를 사용하고 프로인트 첨가제를 사용하여 닭에서 생성되었다. 재조합 독소 A 항체 (A-6 IgY) 및 재조합 독소 B 항체 (B-3 IgY)를 실시예 15c에서 기술한 바와 같이 PEG 분획화한 후 친화성 정제하였다. A-6 IgY는 pPA 1870-2680에 대하여 친화성 정제하고 B-3 IgY는 pB1750-2369에 대하여 친화성 정제하였다. 이어서, 친화성 정제된 항체를 수동적으로 폴리스티렌 입자 상에 코팅하였다.
코팅되는 각각의 IgY 제제에 대해 1 μ 비드의 5% 비드 현탁액 (미국 일리노이주 리버티빌 소재의 스페로테크사) 100 μl를 제거하고 베크만 미세원심분리기 중에서 14,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 입자를 펠렛화하였다. 이어서, 입자를 TBS (10 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 8), PBS-트윈 (10 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.2 + 0.05% 트윈 20) 및 TBS로 세척하였다. 각각의 세척 후에 입자를 2분 동안 원심분리하고 세척 완충액을 버렸다. 최종 TBS 세척 후에 입자를 항체 코팅 용액 (TBS 중의 친화성 정제된 조류 A-6 또는 B-3 IgY 100 μg/ml) 1 ml 중에 재현탁시켰다. PEG 분획화 면역전 IgY을 동일한 방식으로 코팅하여 응집 분석의 음성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 입자 현탁액을 실온에서 18 내지 24시간 동안 뒤집어 IgY가 입자를 코팅하도록 하였다.
결합하지 않은 항체를 제거하기 위해, 현탁액을 2분 동안 원심분리하고 항체 용액을 버리고 입자를 상기와 같이 (TBS, PBS-트윈, TBS) 세척하였다. 최종 TBS 세척 후에 IgY-코팅 입자를 TBS 200 μl 중에 재현탁시켜 2.5% 입자 현탁액을 얻었다.
입자가 IgY로 코팅되었음을 입증하기 위해 입자 10 μl를 오목 웰 중에서 비희석된 염소 항-닭 IgG (피셔 바이오테크사) 5 μl와 함께 배양하였다. 이어서, 시료의 응집을 육안으로 평가하였다. IgY로 코팅되지 않은 입자는 상기 과정에서 응집을 보이지 않았다.
이러한 종류의 분석에서 친화성 정제된 다클론성 조류 IgY의 사용 가능성을 입증하기 위해서 상이한 농도의 독소 A의 존재 하에 A-6 IgY 코팅된 입자의 응집 능력을 평가하였다.
희석제로서 BSA 1 mg/ml을 포함하는 PBS를 사용하여 시판되는 독소 A (테크 랍스사)를 출발 농도 0.29 mg/ml로부터 연속적으로 10배 희석하였다. 각 희석액 10 μl를 오목 웰 슬라이드 중의 코팅된 비드 10 μl와 혼합하고 혼합물을 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 이어서, 슬라이드를 육안으로 관찰하여 응집의 증거를 분석하였다.
강한 응집은 1:10 및 1:100 희석액에서 관찰되었고, 약한 응집은 1:1000 희석액에서 관찰되었다. 1:1000 보다 큰 희석액에서는 응집이 관찰되지 않았다. 면역전 코팅 입자는 어떠한 시험 희석액에서도 응집하지 않았다. 독소 A의 1:100 희석액의 농도는 2.9 μg/ml이었다. 2.9 μg/ml 희석액 10 μl는 독소 A 29 ng을 포함하여 분석은 독소 A 29 ng 또는 2.9 μg/ml에 민감하다. 응집 분석 형식은 씨. 다이피셀 독소 A 및 B의 검출에 적합한 것으로 보인다.
친화성 정제된 다클론성 조류 항체가 입자를 코팅하기 위해 가장 일반적으로 사용되지만, 친화성 정제 중에 상실되는 일군의 고친화성 항체를 포함할 수 있는 다클론성 항체를 사용함으로써 응집 분석의 감도를 증가시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 PEG-분획화 및 물-희석 IgY 제제의 사용도 연구되었다.
PEG-분획화 다클론성 A2 IgY를 사용하여 상기와 동일한 조건 하에 1 μ 폴리스티렌 입자를 코팅하고 씨. 다이피셀 독소 A 응집 분석에서의 입자의 감도를 평가하였다. 이들 입자는 친화성 정제된 IgY로 코팅된 입자보다 감도가 작았다.
PEG-분획화 IgY에서의 잔류 PEG가 분석에서 입자 응집을 억제할 수 있는 가능성을 조사하기 위해 A-2 IgY를 문헌 [Akita and Nakai, J. of Food Science. 57:629 (1992)]에 기재된 산성화수 희석 방법에 의해 추출하였다. 이어서, 상기와 동일한 조건 하에 폴리스티렌 입자를 물-희석 IgY로 코팅하고 씨. 다이피셀 독소 A 응집 분석에서의 입자의 감도를 평가하였다.
물-희석 IgY 제제로 코팅된 입자가 친화성 정제된 IgY로 코팅된 입자보다 감도가 작음이 측정되었다. 따라서, 친화성 정제된 IgY가 상기 분석 형식에서 배치-분획화 IgY 제제보다 우수한 것으로 보인다. 응집 분석의 감도를 증가시키고 특이성을 유지하기 위해 본 발명자들은 분석 성능에 대한 복수개의 다른 변수의 영향을 평가하였다.
b) 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B 응집 분석의 평가 및 최적화
A-6 및 B-3 IgY-코팅 비드의 최저량의 독소와의 응집성 (즉, 감도) 및 특이성을 평가하였다. PEG-분획화 면역전 IgY를 사용하지 않고 무관한 항원 씨. 아트록스 (atrox) 뱀 독물에 대한 친화성 정제된 IgY을 사용하여 음성 대조군으로서의 입자를 코팅하였다. 독소 A 및 독소 B를 PBS 중에서 연속적으로 1 μg/ml에서 0.1 ng/ml로 희석하였다. 비드 현탁액 10 μl를 유리 응집 플레이트의 웰 중에서 시료 20 μl와 혼합하고 회전기 (랩 퀘이크사) 상에서 회전시키기나 수동으로 2분 동안 혼합하였다. 2분 후에 응집을 판독하였다. 완전 균일한 현탁액은 "-"로 표시하고, 약간 흐릿한 모습은 "±"로 표시하고, 뚜렷한 응집은 응집의 크기에 따라 "+" 또는 "++"로 표시하였다.
분석의 감도 및(또는) 특이성에 영향을 주는 상이한 파라미터, 예를 들면 비드 크기, 코팅 항체의 농도, 반응 온도, 코팅 완충액의 pH, 상이한 첨가제를 사용하여 생성된 항체, 비드의 최종 밀도 (%, w/v) 및 시료 희석액을 평가하였다. 4개의 상이한 비드 크기 0.39 μ, 0.81 μ, 1 μ 및 1.2 μ를 평가하였다. 1 μ 비드는 매우 신속하게 응집하여 비특이 응집을 거의 또는 전혀 갖지 않는 큰 응집체를 형성하였다. 따라서, 1 μ 비드 크기는 추가의 최적화 연구를 위해 선택하였다. 시료를 처음에 PBS 중에 희석하였다. 비드가 PBS 중에서 자동응집하는 경우, 1 mg/ml BSA를 갖는 PBS 또는 0.01% 트윈-20을 갖는 PBS로 대체하였다. 두개의 희석액은 자동응집을 억제하지만, 트윈-20을 갖는 PBS는 또한 특이 신호를 억제한다. 상이한 다른 블로킹제, 예를 들면 슈크로스, 고농도의 BSA 및 젤라틴을 희석액으로서 평가하였다. 1 mg/ml BSA를 포함하는 PBS는 특이 신호를 억제하지 않으면서 자동응집을 억제하는 최적 희석액으로 판명되었다.
또한, 최종 현탁액 내의 비드의 밀도를 평가하였다. 감도 및 특이성을 개선하기 위해서 A-6 또는 B-3 IgY-코팅 유액 입자의 응집성을 2.5%, 1.25%, 0.5% 및 0.25% 현탁액에서 시험하였다. 2.5%를 제외한 모든 비드 현탁액은 신호를 발생시키지 않거나 신호를 적게 발생시켰다. 상이한 첨가제를 사용하여 생성된 항체는 상이한 친화성을 갖고 따라서 상이하게 응집한다. 보다 높은 친화성을 갖는 항체는 크고 현저한 응집체를 형성하는 것으로 알려졌다. 프로인트 및 게르부를 첨가제로 사용하여 생성된 A-6 및 B-3 IgY의 응집성을 가장 낮은 독소 농도에서 평가하였다. 게르부 첨가제를 사용하여 생성된 항체는 프로인트 첨가제를 사용하여 생성된 항체에 비해 독소 A 또는 독소 B의 10배 더 낮은 농도에서 현저하고 큰 응집체의 형성시에 보다 우수함이 판명되었다.
보다 높거나 낮은 배양 온도를 사용하여 항체 농도/비드 mg의 영향을 시험하였다. 폴리스티렌 입자를 비드 1 mg 당 IgY 20 μg 또는 50 μg을 사용하여 코팅하고 실온, 37℃ 또는 56℃에서 배양하였다. 감도를 증가시킴에 있어서, 코팅 항체의 높은 농도와 높은 온도 사이에는 직접적인 상호 관계가 있었다. 그러나, 보다 높은 온도에서 입자를 코팅하는 것은 또한 비특이 신호의 증가를 야기하였다. 최대 감도 및 특이성을 최적화하기 위하여 높은 pH 및 낮은 pH의 코팅 완충액을 평가하였다. 50 mM 아세트산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 5.5 (낮은 pH 완충액) 중에서 코팅된 폴리스티렌 입자는 비특이적으로 응집하였지만, 50 mM 탄산나트륨, pH 9.5 (높은 pH 완충액) 완충액을 사용하여 코팅된 비드는 A-6 IgY 코팅된 입자와의 감도 및 특이성이 증가했지만, B-3 IgY 코팅된 입자에 대해서는 증가하지 않았다. 다양한 방법을 사용하여 구한 A-6 또는 B-3 IgY 민감성 입자의 감도 및 특이성을 표 50에 요약하였다.
| A-6 IgY-민감성 비드 | B-3 IgY-민감성 비드 | |||||||||||||
| 감도 | 특이성 | 감도 | 특이성 | |||||||||||
| 조건 | 100ng/ml | 50ng/ml | 10ng/ml | 1ng/ml | 음성대조군 | 대변M | 이.콜라이 | 100ng/ml | 10ng/ml | 1ng/ml | 음성 대조군 | 대변M | 이.콜라이 | |
| A. 100 μg/ml, 1μ, TBS, pH 7.5 (F/RT) | ++ | - | - | - | - | - | - | ++ | + | - | - | - | - | |
| B. 100 μg/ml, 1μ, TBS, pH 7.5 (G/RT) | ++ | ± | - | - | - | ++ | ++ | ++ | ++ | ± | - | - | - | |
| C. 100 μg/ml, 1μ, TBS, pH 7.5 (G/37℃) | ++ | ++ | + | - | - | ++ | ++ | n/a | ||||||
| D. 250 μg/ml, 1μ, TBS, pH 7.5 (G/RT) | ++ | + | - | - | - | ++ | ++ | n/a | ||||||
| E. 250 μg/ml, 1μ, TBS, pH 7.5 (G/37℃) | ++ | ++ | ++ | - | - | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | +* | ++ | ++ | |
| F. 비드 30 μg/ml 0.81μ (야마모토 등의 방법), | ± | - | - | - | - | ++ | ++ | ± | - | - | - | - |
 |
|
| G. 비드 30 μg/ml 0.39μ (야마모토 등의 방법), | ± | - | - | - | - | ++ | ++ | ± | - | - | - | - |
 |
|
| H. 150 μg/ml, 1μ, TBS, pH 7.5 (G/RT) 블로킹 방법 | ++ | ++ | + | - | - | ++ | ++ | + |
 |
 |
 |
++ | ++ | |
| I. 150 μg/ml, 0.81μ, TBS, pH 7.5 (G/RT) 블로킹 방법 | ++ | ± | - | - | - | ++ | + | + | ± |
 |
 |
++ | + | |
| J. 100 μg/ml, 1μ, TBS, pH 7.5 (F/RT) | ++ | + | - | - | - | - | - | n/a | ||||||
| K. 100 μg/ml, 1μ, TBS, pH 7.5 (G/RT) | ++ | ++ | ± | - | - | ++ | ++ | n/a | ||||||
| L. 250 μg/ml, 1μ, TBS, pH 7.5 (F/RT) | ++ | ++ | ± | - | - | ± | ± | n/a | ||||||
| M. 250 μg/ml, 1μ, 아세 테이트, pH 5.5 (F/RT) | ++ | ++ | ± | - | - | ++ | ++ | n/a | ||||||
| N. 250 μg/ml, 1μ, CO3 완충액, pH 9.5 (F/RT) | ++ | ++ | - | - | - | - | - | |||||||
| O. 250 μg/ml, 1μ, CO3 완충액, pH 9.5 (G/RT) | ++ | ++ | + | - | - | - | - | ++ | ± | - | - | - | - | |
| P. 250 μg/ml, 1μ, 글리 신 염수 완충액, pH 8.2 (F/56℃) | ++ | ++ | ++ | - | + | ++ | ++ | n/a | ||||||
| Q. 250 μg/ml, 1.2μ, pH 9.5 (F/RT) | ++ | ++ | ++ | + | - | ++ | + | ++ | ++ | + | + | ++ | + | |
| R. w/BSA를 오버코팅시킨 후 Q와 동일한 조건임 | ++ | ++ | ++ | - | - | ++ | + | ++ | ++ | + | + | + | + | |
조건 설명: IgY 코팅 농도, 비드 크기, 코팅 용액, pH, 사용된 첨가제, 코팅 동안의 온도.
* PBS+BSA+0.01% TW20의 존재 하에 1 ng/ml의 감도로 사용할 때 자동응 집 미발생, 그러나, 이 희석액을 사용하는 경우에도 이. 콜라이 및 마우스 대변에서는 비특이 응집이 발생함.
F = 프로인트 첨가제를 사용하여 생성된 IgY.
G = 게르부 첨가제를 사용하여 생성된 IgY.
이. 콜라이 = 이. 콜라이 군체는 아가 플레이트로부터 채취하여 500 μl 희석 액 중에 재현탁시킴.
대변M = 마우스 대변 50 mg을 희석액 500 μl에 현탁시키고 볼텍싱하고 14,000 x g에서 2분 동안 회전시켜 상등액을 분석에 사용함.
시험된 상이한 파라미터로부터 얻은 정보를 기초로 하여 다음과 같은 A-6 및 B-3 IgY을 사용한 비드 코팅 프로토콜을 확립하였다.
i) 인간 환자의 대변으로부터 독소 A를 직접 검출하기 위한 A-6 IgY 코팅 입자
폴리스티렌 입자 (1 μ, 미국 일리노이주 리버티빌 소재의 스페로테크사) 5 mg을 튜브에 첨가하고 TBS, PBS-T 및 TBS 1 ml로 세척한 후 50 mM Na2CO3, pH 9.5 완충액으로 다시 세척하였다. 비드를 총용량 1 ml이 되도록 탄산나트륨 완충액 중에 재현탁시켰다. A-6 IgY (친화성 정제됨, 게르부를 사용하여 생성됨)을 최종 농도 250 μg/ml로 비드에 첨가하고 회전기 상에서 실온에서 철야 배양하였다. 다음날, IgY-감수성 입자를 TBS, PBS-T 및 TBS로 세척하고 TBS 중에 최종 농도 2.5%로 재현탁시켰다. 이들 IgY-감수성 입자를 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
ii) 인간 환자의 대변으로부터 독소 B를 직접 검출하기 위한 B-3 코팅 유액 입자
폴리스티렌 입자 (1 μ, 미국 일리노이주 리버티빌 소재의 스페로테크사) 5 mg을 튜브에 첨가하고 TBS, PBS-T 및 TBS 1 ml로 세척한 후 50 mM Na2CO3, pH 9.5 완충액으로 다시 세척하였다. 비드를 총용량 1 ml이 되도록 탄산나트륨 완충액 중에 재현탁시켰다. B-3 IgY (친화성 정제됨, 게르부를 사용하여 생성됨)을 최종 농도 100 μg/ml로 비드에 첨가하고 회전기 상에서 실온에서 철야 배양하였다. 다음날, IgY-감수성 유액 입자를 TBS, PBS-T 및 TBS로 세척하고 TBS 중에 최종 농도 2.5%로 재현탁시켰다. 이들 IgY-감수성 유액 입자를 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
대변으로부터 독소 A 및 B를 검출하기 위한 응집 분석을 인간 대변 시편으로부터 독소 A 및 B를 검출하기 위한 시판되는 분석법과 비교하였다. 독소 A 및 B를 모두 검출하는 CytocloneTM A+B EIA (캠브리지 바이오테크사) 및 독소 A만을 검출하는 PremierTM 씨. 다이피셀 독소 A 시험 (메리디안 다이어그노스틱스사)를 비교용으로 사용하였다. 정상 인간 대변 시편을 각 제조자의 지시에 따라 처리하였다. 대변 시료에 독소 A 또는 B 1 μg/ml로 첨가하고 연속적으로 10배 희석하여 독소 A 0.01 ng/ml 및 독소 B 0.1 ng/ml로 만들었다. 응집 분석을 위해 대변을 BSA 1 mg/ml을 함유하는 PBS로 5배 희석하고 2500 x g에서 3분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 분석에 사용하였다.
EIA를 제조자의 지시에 따라 실시하고 결과를 분광광도계로 판독하였다. 결과에 대한 해석은 광학 밀도치 및 제조자의 권고를 기초로 하여 실시하였다. 응집 분석을 위해 A-6, B-3 IgY- 또는 비특이적 IgY-감수성 입자의 현탁액 10 μl를 유리 응집 플레이트의 웰에 넣었다. 시료 20 μl를 각 웰에 첨가하고 잘 혼합하여 회전기 상에서 회전시켰다. 회전 2분 후에 응집이 가시적으로 판독되었다. 결과에 대한 해석은 상기와 같이 실시하였다. 결과의 요약을 표 51에 나타내었다. 본 발명의 응집 분석은 독소 A를 1 ng/ml에서 검출하였지만, CytocloneTM A+B EIA 및 PremierTM 씨. 다이피셀 독소 A 시험은 둘 모두 10배 더 낮은 수준에서 독소를 검출하였다. 본 발명의 응집 및 Cytoclone A+B EIA를 모두 사용하여 독소 B를 1 ng/ml에서 검출하였다. 이러한 결과는 본 발명의 응집 분석법이 단순하여 실시가 용이하고 결과를 5분 내에 얻을 수 있기 때문에 매우 신속하다는 것을 보여준다.
| 파라미터 | CytocloneTM A+B EIA캠브리지 바이오테크사 | PremierTM 씨. 다이피셀 독소 A 시험 메리디안 다이어그노스틱스사 | 독소 A 및 B에 대한 응집 분석법 오피디언 파마슈티칼즈사 |
| 독소 A가첨가된 대변100 ng/ml10 ng/ml1 ng/ml0.1 ng/ml0.01 ng/ml | +++++++- | ++++++++미측정 | +++++-미측정 |
| 독소 B가 첨가된 대변100 ng/ml10 ng/ml1 ng/ml0.1 ng/ml | ++++±- | 해당 안됨 | ++++±- |
| 총 시간 | 150분 | 150분 | 5분 |
실시예 50
재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B 단백질에 대한
조류 항체를 사용하여 성공적으로 처리한 후의 햄스터의 특성 분석
씨. 다이피셀의 공격 전후에 재조합 독소 A (A-6 IgY) 및 재조합 독소 B (B-3 IgY)에 대해 유도된 IgY로 처리된 햄스터가 처리 중단 후에 재발하지 않고 씨. 다이피셀 관여 질병 (CDAD)에 걸리지 않는 이유를 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.
재발은 일반적으로 약물, 예를 들면 CDAD를 치료하는 반코마이신 또는 메트로니다졸로 처리한 후 약물 처리가 종료된 후에 햄스터 (실시예 33에서 입증한 바와 같이) 및 인간에서 발견된다. 반대로, 실시예 16 및 32에 나타낸 데이타는 재조합 씨. 다이피셀 독소 A에 대해서만 유도된 IgY (예방목적으로 제공됨) 또는 재조합 독소 A 및 독소 B 단백질에 대하여 유도된 IgY를 포함하는 혼합물 (치료 목적으로 제공됨)을 사용하여 CDAD를 성공적으로 예방하거나 치료할 수 있고 재발을 예방할 수도 있다.
본 실시예는 a) 항-A-6/B-3 IgY로 처리된 햄스터의 대변에서 씨. 다이피셀 균 및 독소의 검출, b) 처리된 햄스터의 혈청에서 항-씨. 다이피셀 독소 A 및 항-씨. 다이피셀 독소 B IgG의 ELISA에 의한 검출, c) 처리된 햄스터의 타액에서 항-씨. 다이피셀 독소 A 및 항-씨. 다이피셀 독소 B IgA의 ELISA에 의한 검출 및 d) A-6/B-3 처리 햄스터의 항생제에의 재노출을 포함한다.
a) A-6/B-3 IgY로 처리된 햄스터의 대변에서 씨. 다이피셀 균 및 독소의 검출
1일당 A-6/B-3 IgY 2 ml을 성공적으로 처리한 햄스터 7마리 및 1일당 A-6/B-3 IgY 1 ml을 처리한 유일한 생존 햄스터 1마리 (실시예 42)에 대하여 처리를 중단한 후에 씨. 다이피셀 및 독소 A 및 독소 B의 존재 여부를 시험하였다. 이 측정은 IgY 처리가 처리 햄스터의 소화관으로부터 씨. 다이피셀 균 및 독소를 저하시키거나 완전히 제거하기 때문에 A-6/B-3 IgY 처리 햄스터가 재발로부터 방어되는 지를 조사하기 위해 실시하였다.
A-6/B-3 IgY 처리 종료 4일 후에 햄스터 7마리로부터 대변을 수거하였다. 다음과 같이 대변 시료로부터 현탁액을 제조하였다. 대변 50 mg을 PBS (pH 7.4) 100 μl에 첨가하고 시료를 볼텍싱함으로써 혼합물을 현탁시켰다. 각 현탁액의 분취량 (50 μl)을 씨. 다이피셀 선별 아가 플레이트 (CCFA 플레이트: BBL) 상에 스트리킹하고 플레이트를 혐기 조건 하에 48시간 동안 배양하였다. 나머지 현탁액은 실시예 49에서 기술한 독소 응집 분석법을 사용하여 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B의 존재를 시험하였다.
대변 현탁액을 CCFA 플레이트 상에서 배양하여 얻은 결과는 A-6/B-3 IgY로 성공적으로 처리된 모든 햄스터는 처리 4일 후에 씨. 다이피셀 균 (약 6 내지 100개의 군체)을 계속 보유하고 있음을 보여준다. 또한, 씨. 다이피셀 독소 A는 응집 분석 (실시예 49)에서 처리 햄스터 9마리 모두의 대변에서 검출되었다. 놀랍게도, 씨. 다이피셀 독소 B는 어느 햄스터의 대변에서도 검출되지 않았다.
항체 처리 종료 약 5주 후에 다시 동일한 햄스터 7마리로부터 대변 시료를 수거하였다. 상기한 바와 같이 현탁액을 제조하여 CCFA 플레이트 상에 플레이팅하였다. 상기 연장 기간 후에 씨. 다이피셀의 존재는 햄스터 한마리의 대변에서만 검출되었다. 흥미로운 것은, 균은 A-6/B-3 IgY를 저투여량 (1 ml)으로 처리한 햄스터에서 검출되었다는 것이다. 소수의 군체 (5개의 군체)만이 이 햄스터에서 검출되었다. 대조군 동물에서 정상적인 것으로서 균은 검출되지 않았고 매우 낮은 백분율의 햄스터만이 검출가능한 수준의 균을 보유하였다.
이러한 결과는 A-6/B-3 처리 햄스터가 CDAD에 대해 성공적으로 치료되고 재발하지 않았지만 처리 후 초기에 대변에 씨. 다이피셀 균을 계속 보유하고 독소 A를 포함하는 것을 나타낸다. 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A 및 독소 B 항체 (즉, A-6/B-3 IgY)는 처리된 햄스터의 소화관으로부터 씨. 다이피셀 균 또는 독소 A를 완전히 제거하지 않으면서 질병 증상을 분명히 제거하였다. 특정 이론에 의해 본 발명이 제한되지 않지만, 조류 IgY는 존재하는 독소의 수준을 저하시키고, 독소 A는 씨. 다이피셀의 군체화를 돕기 때문에, 이에 의해 균의 수를 CDAD의 억제는 물론 재발도 억제할 정도로 크게 저하시켜 그의 치료 효과를 발휘할 수 있다.
조류 항독소 제제의 처리 5주 후에 씨. 다이피셀 균은 처리 햄스터의 대부분 (7/8)의 대변에서 검출되지 않았다. 이러한 결과는 소화관에서의 씨. 다이피셀의 장기간 군체화는 A-6/B-3 IgY 처리 후에 발생하지 않음을 나타낸다.
b) 처리된 햄스터의 혈청에서 항-씨. 다이피셀 독소 A 및 항-씨. 다이피셀 독소 B IgG의 ELISA에 의한 검출
씨. 다이피셀 독소에 대하여 유도된 내인성 혈청 IgG 반응이 처리 햄스터에서 도출되는지의 여부를 결정하기 위해 항-A-6/B-3 IgY로 처리한 햄스터로부터 혈청을 수거하였다. 항-독소 IgG의 생성은 햄스터의 후속 재발을 억제하는 원인이 될 수 있다.
처리 종료 5주 (상기함) 4일 후에 계속 용해된 햄스터 7마리에서 심장 천자에 의해 혈액을 수거하였다. 혈액을 응고시키고 응고된 시료를 원심분리하여 혈청을 제조하였다. 또한, 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 작용하는 비감염 햄스터 및 재조합 독소 A 및 독소 B 단백질 (실시예 39)의 혼합물로 백신처리된 햄스터로부터 혈청을 수거하였다. 실시예 1에서 기술한 프로토콜을 사용하여 ELISA를 실시하였다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 독소 A 재조합 pPA1870-2680 (A-6) 0.05 μg/ml 또는 독소 B 재조합 pPB 1750-2360 (B-3) 1.0 μg/ml을 사용하여 웰당 100 μl로 코팅하였다. 혈청 시료를 1:50의 희석율로 시작하여 연속적으로 5배 희석하여 시험하였다. 염소-항-햄스터 IgG 알칼린 포스페이트 (서던 바이오테크놀로지 어소우시에이션사)를 2차 항체로서 1:1000의 희석율에서 사용하였다. 모든 항체 배양은 37℃에서 2시간 동안 실시하였다. 파라-니트로페닐 포스페이트 (시그마사)를 사용하여 플레이트를 30분 동안 전개시켰다.
ELISA 결과는 시험 햄스터의 모든 혈청 시료는 양성 대조군 혈청 (재조합 독소 A 및 독소 B 단백질로 활성 면역시킨 후에 방어 IgG 반응을 생성하는 햄스터로부터의 혈청)에 비해 상당히 낮은 수준의 항-독소 A 및 항-독소 B IgG를 포함하는 것을 보여주었다. 처리된 햄스터 7마리로부터의 혈청에 존재하는 항체 역가는 음성 대조군에 존재하는 것과 필적할 수 있었다. 이 결과는 A-6/B-3 IgY으로 햄스터를 처리하여 달성된 CDAD 재발의 억제는 씨. 다이피셀 균의 감염 후의 햄스터의 활성 혈청 IgG 반응의 생성에 의한 것이 아닐 가능성이 있음을 입증하였다.
c) 처리된 햄스터의 타액에서 항-씨. 다이피셀 독소 A 및 항-씨. 다이피셀 독소 B IgA의 ELISA에 의한 검출
항-A-6/B-3 IgY 처리 햄스터에서 보이는 CDAD의 재발로부터의 방어가 햄스터의 점막 IgA 반응의 생성에 의한 것인지의 여부를 조사하기 위해서 다음과 같은 실험을 실시하였다. 항-A-6/B-3 IgY (실시예 42; 2 ml)로 사전 처리한 햄스터 6마리로부터 타액의 과분비를 야기하는 필로카르핀 (시그마사)을 사용하여 타액을 수거하였다. 무균수 중의 필로카르핀 1 mg/ml을 함유하는 용액을 햄스터의 복강내 주사하여 햄스터에게 필로카르핀 1 내지 3 mg을 투여하였다. 피페터를 사용하여 햄스터 6마리로부터 타액을 수거하였다. 음성 대조군으로서 필로카르핀 200 μg을 투여한 마우스로부터 타액을 수거하였다. 시판되는 유일한 항-IgA 접합체가 염소 항-마우스 IgA (이 시약은 햄스터 IgA와 가교 반응하는 것으로 보고됨)이기 때문에 마우스 시편이 음성 대조군으로서 사용되었다.
상기 (b)의 ELISA를 다음과 같이 변형하여 실시하였다. 타액 시료를 처음 1:10 희석율로 시작하여 연속적으로 5배 희석하여 시험하였다. 염소 항-마우스 IgA (서던 바이오테크놀로지 어소우시에이트사)를 2차 항체로서 1:1000 희석율에서 사용하였다.
ELISA 결과는 처리 햄스터 6마리 중 단지 2마리만이 마우스 음성 대조군에서 보이는 것보다 더 높은 수준으로 항-독소 A 및 항-독소 B IgA를 포함한다는 것을 보여주었다. 항-독소 IgA-양성 햄스터 2마리의 타액은 매우 낮은 역가 (1:250 내지 1:1250)를 가졌다. 전형적인 과면역 IgA 역가는 통상 약 1:10,000 이상이다. 나머지 햄스터 4마리는 음성 대조군에 비해 독소 A 또는 독소 B에 대한 의미있는 항-독소 IgA 반응을 갖지 않았다. 6마리의 햄스터 모두가 CDAD 재발에 대해 성공적으로 처리되고 대부분 (4/6)의 처리 햄스터가 의미있는 항-독소 IgA 반응을 생성하지 않았기 때문에 재발 억제는 햄스터에 의한 항-독소 A 또는 항-독소 B IgA 반응의 생성에 기인한 것으로 보이지는 않는다.
섹션 b) 및 c)에 나타낸 결과는 씨. 다이피셀 인터벌 A-6 및 B-3에 대하여 유도된 IgY로 성공적으로 처리된 햄스터에서 보이는 재발 억제는 숙주에 의한 항-씨. 다이피셀 독소 체액 반응의 생성에 의한 것이 아니라는 것을 보여준다. 따라서, 재발 억제는 IgY 제제 투여의 기능이다. 이것은 숙주의 면역 상태가 질병 결과 (즉, 생존)의 예견의 측면에서 관계가 없을 수 있거나 재발 발생과는 무관하다는 것을 나타낸다. 이는 A-6/B-3 IgY 치료 처리로 가장 혜택을 많이 받을 많은 환자가 면역처리되기 때문에 중요하다.
d) A-6/B-3 처리 햄스터의 항생제에의 재노출
상기 a)에 나타낸 바와 같이, 처리 햄스터는 그의 대변 (IgY 처리 종료 4일 후)에 씨. 다이피셀 균을 검출가능한 수준으로 계속 보유하여 CDAD의 발생 잠재력이 있다. 이들 처리 햄스터를 클린다마이신에 재노출시키면 CDAD의 발병을 개시시키는지의 여부를 조사하기 위해 실험하였다.
A-6/B-3 IgY로 성공적으로 처리된 상기 실험 (즉, 실시예 42)에서 사용된 것과 동일한 햄스터 4마리를 클린다마이신-포스페이트의 투여로 다시 씨. 다이피셀 감염에 노출되도록 하였다. 초기 항체 처리 종료 7일 후에 햄스터에게 클린다마이신-포스페이트 (바이오몰사)를 체중 100 g당 1 mg을 추가로 복강내 주사하였다. 클린다마이신 노출 (즉, 제2 클린다마이신 적용) 12일 후에 모든 햄스터는 어떠한 CDAD의 신호도 발생시키지 않았다.
이 결과는 햄스터가 일단 항-A-6/B-3 IgY로 성공적으로 처리된 후에는 클린다마이신에 다시 노출된 후에도 CDAD 발생에 내성을 갖는다는 것을 입증하였다. 이 결과를 다른 단계로 확인하기 위해, 동일한 햄스터에게 다른 항생제, 즉 햄스터를 씨. 다이피셀 감염에 노출시키는 것으로 알려진 세폭시틴 (Cefoxitin, 시그마사)을 토여하였다. 이것은 클린다마이신 재처리 후에 햄스터에서의 CDAD 억제가 소화관에서 씨. 다이피셀의 군체화를 억제할 수 있는 클린다마이신 내성의 정상 미생물상의 생성에 기인할 수 있기 때문에 실시하였다. 햄스터 4마리 각각에게 11일 후 (A-6/B-3 IgY 처리 18일 후)에 염수 중의 세폭시틴 10 mg을 피하주사하였다. 이 세폭시틴 투여량은 햄스터를 CDAD에 노출시키는 것으로 알려진 양이다.
세폭시틴 처리 7일 후에 4마리의 햄스터 중 1마리는 설사를 하고 죽었다. 나머지 3마리의 햄스터는 계속 건강한 상태로 오랜 기간 (즉, 1달 이상) 생존하였다. 세폭시틴 처리 후에 얻은 이 결과는 처리 햄스터에서의 CDAD 재발 억제가 햄스터 미생물상에서의 특정 항생제 내성 (즉, 클린다마이신 내성)의 발생에 기인한 것이 아닐 수 있다는 것을 나타낸다.
상기 결과는 또한 CDAD를 위해 항-A-6/B-3 IgY를 사용하여 처리된 햄스터가 처리 중단 후 초기에 그의 소화관에 생존가능한 씨. 다이피셀 균 및 씨. 다이피셀 독소 A를 보유하면서도 계속 재발하지 않음을 보여준다. 더욱 놀라운 것은, 햄스터가 계속 소화관에 씨. 다이피셀을 보유하는 동안에도 이들은 햄스터를 CDAD에 노출시킬 수 있는 항생제를 사용한 후속 공격에 내성을 갖는다는 발견이다. 상기 나타낸 바와 같이, 조류 항독소 중단 5주 후에 햄스터는 더 이상 대변에 균을 보이지 않고, 따라서 더 이상 씨. 다이피셀의 군체를 보유하지 않을 가능성이 있다. 이 결과는 또한 A-6/B-3 IgY의 햄스터에 대한 경구 투여는 CDAD를 성공적으로 치료할 뿐만 아니라 재발에 대한 내성을 부여함을 나타낸다. 또한, A-6/B-3 IgY는 2개의 상이한 항생제를 사용한 반복된 항생제 노출로 인한 CDAD로부터 햄스터를 방어하였다.
상기 결과로부터 본 발명은 씨. 다이피셀 질병의 치료 및 예방을 위한 항독소 및 백신을 제공한다는 것이 분명해진다. 또한, 이들 항독소는 통상의 치료 프로토콜을 사용할 때 일반적으로 보이는 씨. 다이피셀 질병의 재발을 억제한다. 또한, 본 발명은 시료에서 씨. 다이피셀 독소 A 및 B를 검출하기 위한 신속한 응집 분석법을 제공한다.
실시예 51
클로스트리듐 독소 단백질에 대해 유도된
조류 항독소를 포함하는 경구 전달용 정제의 형성 및 장용 과코팅
본 실시예는 씨. 다이피셀 질병의 효과적인 치료를 위한 경구 전달에 적합한 클로스트리듐 독소 단백질에 대하여 유도된 닭 IgY를 포함하는 정제의 형성을 설명한다. 실시예 43에 나타낸 바와 같이, 탄산염 완충액 중의 IgY가 햄스터에 경구 투여되었을 때 전달된 항체의 매우 소량만이 감염이 발생하는 관련 부위인 맹장에서 검출되었다. 대부분의 IgY는 위 내의 산성 환경에서 가수분해되거나 프로테아제에 의해 분해될 가능성이 있다. 또한, 위를 통과하는 나머지 기능성 IgY의 상당량은 이어서 소장에서 발견되는 상이한 효소에 의해 소화될 것이다. 처리된 햄스터의 맹장에서 발견되는 저수준의 IgY는 닭 IgY이 낮은 pH 및 장내 프로테아제의 효과에 매우 민감하다는 것을 시험관내 실험에서 발견한 로쉬 (Losch) 등의 연구에 의해 지지된다. 경구 항체 치료제의 제공된 투여량의 효용을 최대화하기 위해서, PEG-분획화 IgY가 용이한 투여용으로 정제화되고 소화관에서의 분해를 억제하기 위한 장용 과코팅이 가능한 지의 여부를 결정하기 위해 실험하였다. 본 실시예는 a) PEG-정제된 항-A6 IgY를 함유하는 정제의 제조, b) pH 민감성 장용피를 사용한 IgY 정제의 과코팅, c) 과코팅 IgY 정제의 용해 프로필의 시험, d) 정제화, 장용 과코팅 및 용해 후의 ELISA에 의한 IgY 반응성의 안정성 측정 및 e) 정제화된 IgY의 체내에서의 씨. 다이피셀 중화능 보유의 입증을 포함한다.
a) PEG-정제된 항-A6 IgY를 함유하는 정제의 제조
재조합 씨. 다이피셀 독소 A 단백질 pMA 1870-2680 (A-6 영역)으로 면역처리된 닭으로부터의 닭 IgY를 실시예 37 (a)에서 기술한 바와 같이 (즉, 재조합 단백질로 면역처리된 닭으로부터 수거한 알의 IgY을 PEG-침전에 의해 정제하고 정제 후에 IgY 펠렛을 0.1 x PBS, pH 7.4 중에 재현탁시킴) PEG에 의해 분획화하였다. 이 프로토콜은 0.1 x PBS를 사용한다는 점에서 1 x PBS를 사용하는 실시예 1에서 기술한 프로토콜과 경미하게 상이하다. 0.1 x PBS로 변경함으로써 최종 건조 제제 중의 IgY에 대한 염의 최종 비율을 1차적으로 저하시켰다.
113개의 알을 분획화하고 12% PEG 단계 후의 최종 IgY 펠렛을 난황 용량의 1/4의 처리수 중에 재현탁시켰다. 물에 재현탁된 IgY를 동결건조 용기에 이송하고 시약 알콜 중의 드라이아이스 상에서 급속 동결시켰다. 용기를 드라이아이스조 내에서 회전시켜 용기의 벽에 적층되도록 함으로써 IgY 용액이 균일하게 동결되도록 하였다. 동결 IgY 용액을 Labconco Freeze-Dry System/Lyph Lock 4.5 장치 상에 위치시키고 약 18시간 동안 건조될 때까지 동결건조시켰다. 최종 동결건조된 IgY의 중량은 13.56 g 또는 알 1개당 건조물 약 120 mg이었다.
Stokes B2 정제 압축기를 사용하여 동결건조된 IgY 12 g을 40개의 250 mg 정제로 가공하였다. 통상의 평면상 1/4 인치 다이 압형을 사용하였다. 4500 파운드의 압력을 사용하여 2중 압축함으로써 정제를 제조하고 정제의 평균 중량은 256 mg± 6 mg으로서 단단한 평면상이었다.
b) pH 민감성 장용피를 사용한 IgY 정제의 과코팅
Eudragit S-100 (미국 매사츄세츠주 말덴 소재의 롬 테크사), pH 7.00 이상의 용액에 용해성인 장용막 코팅 (메타크릴산 공중합체 B형, USP/NF)를 사용하여 정제를 코팅하였다. Eudragit S-100의 원액을 제조자의 지시에 따라 제조하였다. Eudragit S-100 (건조 중합체 물질의 12.5%) 13 중량부를 이소프로필 알콜 82중량부와 처리수 5 중량부의 혼합물 중에 혼합함으로써 Eudragit S-100를 용해시켰다. 장용 코팅막은 Eudragit S-100 12.5% 용액 480 g, 가소제로서의 트리에틸 시트레이트 6 g, 항부착제로서의 탈크 30 g, 처리수 50 g 및 이소프로필 알콜 434 g의 그램 중량에 의해 제조되었다. 최종 현탁액 중의 고형 함량은 9.6%이었고 건조 중합체 물질의 함량은 6.0%이었다.
장용 코팅 혼합물을 비이커에 넣고 각 정제를 끝이 미세한 핀셋을 사용하여 약 1초 동안 용액에 적셨다. 이어서, 코팅된 정제를 한 장의 파라필름 상에서 실온에서 건조시켰다. 정제 일부는 다시 추가로 2회 더 장용 코팅액에 담그고 이 코팅 사이에 실온에서 건조시켰다. 이것은 정제의 보다 완전한 과코팅을 보장하기 위해서 실시하였다. 장용 코팅 용액에 1회 및 3회 담근 정제를 각각 1x 및 3x 정제로 명명하였다.
c) 과코팅 IgY 정제의 용해 프로필의 시험
실시예 37 (b)에서 기술한 방법을 사용하여 장용 정제의 분해 동력학을 결정하기 위해 분해 연구를 실시하였다. 정제의 분해는 2개의 조건 하에, 즉, 모두 USP 지침을 사용하여 제조된 pH 1.2의 모조 위 용액 또는 pH 7.5의 모조 장 용액 중에서 실시되었다. 각 정제를 칭량하여 각각의 용액을 포함하는 비이커에 용액 1 ml당 정제 10 mg으로 첨가하였다. 다음과 같은 형태의 정제, 1) 비코팅 IgY 정제, 2) 1x 코팅 IgY 정제 및 3) 3x 코팅 IgY 정제를 시험하였다.
실온에서 교반 막대기를 사용하여 부드럽게 혼합하여 정제를 용해시켰다. 상이한 시간에서 각각의 분취량을 취하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 용액 내의 IgY의 양을 정량하였다. Eudragit 과코팅 IgY 정제의 분해 프로필을 도 55에 나타내었다.
도 55에서, 280 nm에서의 흡광도를 시간 (분)에 대하여 그래프화하였다. 위액 또는 장액 중에서 비코팅 IgY 정제로부터의 IgY의 방출은 각각 검은 사각형 및 흰색 다이아몬드형으로 표시하였다. 도 55에 나타낸 바와 같이, 비코팅 IgY 정제의 분해 속도는 장 용액에 비해 위 용액에서 보다 느렸다. 이러한 비코팅 정제의 고유의 물리적 특성은 정제의 예기치 못한 이점으로서 정제를 위에서의 분해에 보다 내성을 갖도록 만든다.
장액에 넣은 1x 및 3x 코팅 IgY 정제의 분해 프로필은 도 55에서 검은 삼각형 및 흰색 삼각형으로 표시하였다. 도 55에 나타낸 바와 같이, 1x 및 3x 코팅 정제는 두개 모두 완전한 분해가 약 1시간 후에 발생하는 유사한 속도로 용해되었다. 또한, 장용 코팅 IgY 정제의 분해 속도는 장액에서의 비코팅 IgY정제보다 약간 더 빨랐다. 이와 대조적으로, 위액에서의 1x 및 3x 코팅 IgY 정제 (도 55에 흰색 사각형 및 검은 삼각형으로 각각 표시함)는 매우 느리게 분해되었고 정제에 포함된 전체 IgY의 일부만이 용액으로 방출되었다. 1x 또는 3x 코팅 IgY 정제의 분해 프로필에서의 차이가 가장 작았다. 이러한 결과로부터 Eudragit 과코팅 IgY 정제는 시간 의존적 방식으로 pH 7.5의 모조 장액의 용액에 적절하게 개방되지만 pH 1.2의 위액에서는 대부분 온전하게 유지되었다.
상기 분해 연구는 정제로 제형화된 IgY는 성공적으로 장용 코팅될 수 있음을 입증한다.
d) 정제화, 장용 과코팅 및 용해 후의 ELISA에 의한 IgY 반응성의 안정성 측정
동결건조된 A-6 출발 물질 (비정제화)의 ELISA 반응성을 Eudragit S-100 장용 코팅 또는 비코팅 항-A-6 IgY와 비교함으로써 정제화 (즉, 정제로의 제제화) 및 장용 과코팅 과정 후의 항-재조합 씨. 다이피셀 독소 A IgY의 안정성을 측정하였다. 장용 코팅 (3x 정제) 또는 비코팅 IgY 정제를 10 mg/ml의 농도로 pH 7.5에서 모조 장액 중에 용해시켰다. 출발 비정제화 IgY (벌크 항체로 명명)을 동일한 농도로 장액 중에 용해시켰다. 표준 ELISA를 실시하여 실시예 35에서 기술한 바와 같은 독소 A 재조합 pPA1870-2680 N/C 단백질 (A-6)에 대하여 유도된 항체의 존재를 검출하였다. 동일한 표준화 농도의 면역전 IgY (위약으로 명명함, 도 56에서 사각형으로 표시함)를 음성 대조군으로서 시험하였다. ELISA 결과를 도 56에 나타내었다.
도 56에서 410 nm에서의 흡광도를 시험 항체 희석액의 역수에 대하여 그래프화하였다. 도 56에 나타낸 결과는 정제화 (장용 비코팅됨, 검은 다이아몬드로 표시함) 후의 항-A-6 IgY 및 정제화 및 Eudragit S-100 혼합물로 장용 과코팅 (장용 3x, 흰색 다이아몬드로 표시함) 후의 항-A-6 IgY의 반응성이 출발 벌크 항-A-6 IgY (벌크 항체, 흰색 사각형으로 표시함)과 매우 유사함을 입증한다. 이 결과는 정제화 및 장용 과코팅 과정이 IgY 제제에 해를 끼치지 않고 항-A-6 IgY가 생리적 조건 하에 용해 후에 계속 활성을 갖고 기능을 보일 수 있다는 것을 나타내었다.
상기 결과는 안정하고 반응성인 장용 코팅 IgY 정제가 생성되었음을 입증한다.
e) 정제화된 IgY의 체내에서의 씨. 다이피셀 중화능 보유의 입증
A-6 IgY 정제가 분해 후에 씨. 다이피셀 독소 A를 중화하는 능력을 체내에서 측정하였다. 마우스는 LD (치사 투여량) 100을 위해 보다 적은 독소를 필요로 하기 때문에 햄스터 대신에 마우스를 사용하여 독소 A 중화도를 시험하였다.
25 g의 Balb/c 마우스 (Charles River)에 씨. 다이피셀 독소 A를 50 ng, 500 ng 또는 5000 ng을 포함하는 PBS 1 ml을 복강내 주사하여 마우스에 있어서의 씨. 다이피셀 독소 A의 LD100을 측정하였다. 이 연구에서 사용된 씨. 다이피셀 독소 A는 미국 와싱턴주 바텔스 디비젼 시애틀에 소재한 데이드 인터내셔날사 (Dade International, Inc.)로부터 구입하였다. 씨. 다이피셀 독소 A 50 ng이 시험된 최소 치사량인 것으로 판명되었고 모든 마우스는 처리 후 24시간 내에 죽었다. 모든 마우스는 씨. 다이피셀 독소 A 500 및 5000 ng을 투여하였을 때 각각 3 및 4시간 내에 죽었다.
면역전 IgY가 체내에서의 독성을 감소시키는 지의 여부를 결정하기 위해 면역전 IgY의 존재 하에 씨. 다이피셀 독소 A의 주사 효과를 측정하였다. 마우스에게 투여하기 전에 면역전 IgY 최대 50,000 ng (100배 더 많음)과 함께 독소 A 50 ng을 37℃에서 1시간 동안 에비배양하였다. 면역전 IgY의 존재 하에서도 씨. 다이피셀 독소 A 50 ng은 24시간 내에 마우스에 치명적임이 판명되었다.
체내에서 씨. 다이피셀 독소 A를 중화하는 항-A-6 IgY 정제의 능력을 독소를 중화시키는 항-A-6 벌크 IgY (정제화 전)의 능력과 비교하였다. 항-A-6 IgY 정제 (이 정제는 실온에서 3주 동안 보관된 것임) 250 mg을 모조 장액 중에 용해시키고 용액 중의 IgY의 양을 280 nm에서의 흡광도에 의해 정량하였다. 정제화 전의 동결건조된 A-6 IgY 및 면역전 (PI) IgY을 장액 중에 제조하고 280 nm에서의 흡광도에 의해 정량하였다. 1 mg당 면역전 항-A-6 벌크 또는 용해된 항-A-6 IgY 5,000 ng, 25,000 ng 및 50,000 ng을 각각 1 ml당 씨. 다이피셀 독소 A 50 ng과 함께 37℃에서 1시간 동안 예비배양하였다. 이것은 독소의 양과 비교할 때 (중량의 측면에서) 각각 100배, 500배 및 1000배 더 많은 IgY을 나타낸다.
1시간 동안 배양한 후에 혼합물을 20 내지 25 g의 Balb/c 마우스에게 복강내 투여하였다. 1군당 마우스 3마리의 총 9개의 군에 대하여 시험하였다. 27시간 동안 관찰한 후에 각 군당 생존한 마우스의 개체수를 확인하였다. 그 결과는 하기 표 52에 요약하였다.
| 처리군(독소 A 50 ng과 혼합된 IgY의 ng수) | 생존율 (%) | |
| 1 | 항-A-6 정제 5000 ng | 100% (3/3) |
| 2 | 항-A-6 정제 250,000 ng | 100% (3/3) |
| 3 | 항-A-6 정제 500,000 ng | 100% (3/3) |
| 4 | 항-A-6 벌크 5000 ng | 100% (3/3) |
| 5 | 항-A-6 벌크 250,000 ng | 100% (3/3) |
| 6 | 항-A-6 벌크 500,000 ng | 66% (2/3) |
| 7 | PI 5000 ng | 0% (0/3) |
| 8 | PI 250,000 ng | 0% (0/3) |
| 9 | PI 500,000 ng | 33% (1/3) |
상기 결과는 항-A-6 IgY 정제가 pH 7.5에서 분해된 후에 출발 (즉, 벌크 또는 비코팅) 물질을 사용했을 때 관찰되는 것과 필적할 만한 방식으로 씨. 다이피셀 독소 A의 치사 효과를 중화할 수 있음을 입증한다. 이 결과는 정제화 과정이 항-A-6 IgY의 중화능에 대한 부작용을 갖지 않는다는 것을 보여준다. 면역전 IgY을 사용하여 얻은 결과와 비교할 때, 벌크 및 정제화 항-A-6 IgY 제제는 모두 100배 초과량의 단백질에서 씨. 다이피셀 독소 A를 중화할 수 있었다 (A-6 IgY 5000 ng은 독소 50 ng을 중화함).
이러한 결과는 대장에 전달하기 위해 장용 코팅된 고형 투여 형태 (즉, 정제)로 항-클로스트리듐 독소 IgY를 제제화할 수 있음을 입증한다. 또한, 정제에 존재하는 항-클로스트리듐 독소 IgY는 계속 안정적이고 활성을 갖고 기능을 갖는다.
실시예 52
독소 A 재조합 인터벌 6에 대한 항체에 의한
햄스터에서의 씨. 다이피셀 질병의 예방 처리
본 실시예는 씨. 다이피셀을 사용한 햄스터의 감염 및 재조합 독소 A (IgY)에 대해 발생된 항체를 사용한 씨. 다이피셀-유발 질병의 치료를 포함한다. IgY 항체는 씨. 다이피셀 독소 A 재조합 pMA1870-2680 (인터벌 A-6)에 대해 생성되었다. 대조군 동물은 면역전 면역글로불린 분획 (PI)로 처리된 감염 햄스터이었다. 조야한 PI 및 IgY를 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 분획화하고 0.1 M 탄산염 완충액 pH 9.5 중에 8x 농도 (40 mg/ml)에서 재현탁시켰다.
햄스터 2개의 군은 각각 약 80 g의 골든 시리아 햄스터 (사스코; 이계교배된 LVG) 암컷 9 또는 10마리로 구성되었다. 햄스터를 우리당 3마리 수용하고 연구 내내 먹이 및 물을 충분히 공급하였다.
문헌 [Lyerly et al., Infect. Immun., 59(6): 2215-2218 (1991)]의 방법을 사용하여 햄스터를 씨. 다이피셀 감염에 노출시켰다. 클린다마이신-HCl (시그마사)를 각 햄스터에게 위관 영양 바늘을 사용하여 무균수 1 ml 중의 3 mg/100 g(체중)을 위내 투여하였다. 클린다마이신 처리 2 및 4시간 후에 햄스터에게 8x PI 또는 8x IgY 2 ml을 경구 투여하였다. 클린다마이신-HCl 투여 2 내지 4시간 후에 햄스터에게 씨. 다이피셀 VPI 7698 약 108 마리를 포함하는 인산염 완충 염수 (PBS) pH 7.2 1 ml로 공격하였다. 공격 투여액은 Gaspak 혐기성 챔버 내에서 37℃에서 혐기 상태로 철야 증식된 (증식 조건은 상기 문헌을 따름) 뇌 심장 융합 (BHI) 브로쓰 배양물으로부터 제조하였다. 공격 1시간 전 및 공격 8시간 후에 햄스터에게 8x PI 또는 8x IgY를 투여하였다. 처리는 1일 2회 약 8시간의 간격으로 2일 더 (총 4일) 계속되었다.
결과를 도 57에 나타내었다. 처리 지속 기간은 횡좌표 아래의 수평 막대기에 의해 나타내었다. 클린다마이신 및 씨. 다이피셀의 투여 (감염)은 화살표로 나타내었다. 검은 사각형은 PI 처리된 햄스터를 나타내고 흰색 사각형은 A-6 IgY 처리된 햄스터를 나타내었다.
PI 처리 햄스터는 24 내지 48시간 내에 설사가 발생하였고 설사 발생 24시간 후에 죽었다. PI 처리 햄스터 9마리는 모두 공격 48시간 후에 죽었다. 이와 대조적으로, 항-A-6 IgY가 투여된 햄스터의 60% (6/10)는 햄스터 모니터링이 종결된 공격후 19일 동안 계속 생존하였다. 다른 4마리의 항-A-6 IgY 처리 햄스터의 치사 발생은 PI 처리 햄스터에 비해 1일 내지 3일 더 늦었다. 항-A-6 IgY에 의한 장기간 방어 수준은 통계적으로 유의하다 (P<0.025를 갖는 chi-스퀘어 분석). 대부분 (8/10)의 항-A-6 IgY 처리 햄스터에서 설사가 발생했지만 설사가 발생한 햄스터의 절반만이 씨. 다이피셀 감염으로 죽었다. 설사가 발생했음에도 불구하고 항-A-6 IgY은 발병 햄스터의 생존을 촉진하였다.
이러한 결과는 예방 목적의 저투여량의 항-A-6 IgY이 씨. 다이피셀 유발 질병의 심각한 영향으로부터 햄스터를 장기간 방어한다는 것을 나타낸다. 이러한 방어는 그중 단지 3회의 투여만이 감염 전에 투여된 것인 4일에 걸친 8회의 투여에 의한 투여법으로 달성되었다. 이러한 최소 처리는 소 항독소를 공격 전에 처음 3일 동안 매일 3회 투여하고 공격후 10일 동안 계속 투여하여 햄스터를 총 39회 예방 처리하는 리엘리 (Lyerly) 등의 방법과 대조적이다. 또한, 리엘리의 소 항독소 투여량은 본 실험에서의 투여량보다 더 크다 (즉, 300 mg 소 항체/투여 대 80 mg 조류 항체/투여). 또한, 본 발명자들의 발견과 대조적으로 리엘리는 햄스터가 처리 종료 후 (처리 후 72시간 내에 모두 치사) 또는 설사 발생 후에 더 이상 장기간 방어를 보이지 않았다고 보고하였다.
리엘리의 연구와 달리, 본 실시예의 결과는 조류 항-재조합 독소 A 항체는 그의 방어 효과가 치료 종료 후에도 계속 지속되는 효과적인 예방제임을 입증한다.
실시예 53
독소 A 재조합 인터벌 6에 대한 항체에 의한
햄스터에서의 씨. 다이피셀 질병의 치료 처리
또다른 실시예에서 햄스터에게 항-A-6 IgY를 치료목적으로 (감염 후) 처리하였다. 이것은 보다 어려운 처리 방법으로서 리엘리에 의해 보고되지 않았다.
씨. 다이피셀 균주, 증식 배지, 공격 투여 및 감염 방법은 실시예 52와 동일하였다. 각각 9마리의 햄스터 암컷 (사스코사)을 포함하는 2개의 군을 씨. 다이피셀 균주 VPI 7698의 약 108 마리로 공격하였다. 공격 4시간 후에 실시예 52와 동일한 농도의 PI 또는 항-A-6 IgY 2 ml을 사용하여 처리를 개시하였다. 약 4시간 후에 다시 햄스터에게 투여한 후 8시간의 간격으로 하루에 2회씩 2일 더 처리를 계속하였다. 햄스터를 3일에 걸쳐서 총 6회 처리하였다.
그 결과를 도 58에 나타내었다. 처리 지속 기간은 횡좌표 아래의 수평 막대기에 의해 나타내었고, 클린다마이신 투여 및 씨. 다이피셀 공격은 화살표로 나타내었다.
항-A-6 IgY으로 치료상 처리된 햄스터 (흰색 사각형)은 대조군 (검은색 사각형)보다 더 낮은 누적 치사율을 가졌다. 또한, 설사의 개시는 PI 처리된 햄스터에 비해 항-A-6 IgY 처리된 햄스터에서 24시간 이상 지연되었다. PI 처리 햄스터는 모두 설사가 발생하였고 설사 발생 2일 내에 죽었고, 이는 대조군 면역 분획을 사용하여 질병에 대한 방어의 결여를 입증한다. 항-A-6 IgY 처리 햄스터의 56% (5/9)는 장기간 동안 (관찰 기간 20일) 계속 생존하였다. 항-A-6 IgY에 의해 제공된 방어 (생존)은 PI 처리군에 비해 통계적으로 유의하였다 (chi-스퀘어치 P<0.05).
이러한 결과는 리엘리와 동일한 감염 조건 하에 씨. 다이피셀로 감염된 햄스터가 조류 항-A-6 IgY를 사용한 효과적인 치료상 방어를 받았고 장기간 생존을 보였음을 입증한다.
<서열 목록>
(1) SEQ ID NO: 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 1:
GGAAATTTAG CTGCAGCATC TGAC
24
(2) SEQ ID NO: 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 2:
TCTAGCAAAT TCGCTTGTGT TGAA
24
(2) SEQ ID NO: 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 3:
CTCGCATATA GCATTAGACC
20
(2) SEQ ID NO: 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 19 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 4:
CTATCTAGGC CTAAAGTAT
19
(2) SEQ ID NO: 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 8133 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(ix) 특징:
(A) 네임/키이: CDS
(B) 위치: 1..8130
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 5:
(2) SEQ ID NO: 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 2710 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 6:
(2) SEQ ID NO: 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 811 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 나선형태: 밝혀지지 않음
(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 7:
(2) SEQ ID NO: 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 91 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 나선형태: 밝혀지지 않음
(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 8:
(2) SEQ ID NO: 9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 7101 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(ix) 특징:
(A) 네임/키이: CDS
(B) 위치: 1..7098
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 9:
(2) SEQ ID NO: 10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 2366 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 10:
(2) SEQ ID NO: 11에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 19 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 11:
TAGAAAAAAT GGCAAATGT
19
(2) SEQ ID NO: 12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 12:
TTTCATCTTG TAGAGTCAAA G
21
(2) SEQ ID NO: 13에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 13:
GATGCCACAA GATGATTTAG TG
22
(2) SEQ ID NO: 14에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 14:
CTAATTGAGC TGTATCAGGA TC
22
(2) SEQ ID NO: 15에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 15:
CGGAATTCCT AGAAAAAATG GCAAATG
27
(2) SEQ ID NO: 16 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 16:
GCTCTAGAAT GACCATAAGC TAGCCA
26
(2) SEQ ID NO: 17에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 17:
CGGAATTCGA GTTGGTAGAA AGGTGGA
27
(1) SEQ ID NO: 18에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 18:
CGGAATTCGG TTATTATCTT AAGGATG
27
(2) SEQ ID NO: 19에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 단일나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 19:
CGGAATTCTT GATAACTGGA TTTGTGAC
28
(2) SEQ ID NO: 20에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 511 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 나선구조: 밝혀지지 않음
(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 20:
(2) SEQ ID NO: 21에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 608 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 나선구조: 밝혀지지 않음
(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 21:
(2) SEQ ID NO: 22에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1330 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 이중나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(ix) 특징:
(A) 네임/키이: CDS
(B) 위치: 1..1314
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 22:
(2) SEQ ID NO: 23에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 438 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 23:
(2) SEQ ID NO: 24에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 23 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 나선구조 : 밝혀지지 않음
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 24:
(2) SEQ ID NO: 25에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1402 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 이중나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(ix) 특징:
(A) 네임/키이: CDS
(B) 위치: 1..1386
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 25:
(2) SEQ ID NO: 26에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 462 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 26:
(2) SEQ ID NO: 27에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 3891 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 나선구조: 이중나선
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: DNA (게놈성)
(ix) 특징:
(A) 네임/키이: CDS
(B) 위치: 1..3888
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 27:
(2) SEQ ID NO: 28에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1296 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 28:
(2) SEQ ID NO: 29에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 812 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 나선구조: 밝혀지지 않음
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 29:
(2) SEQ ID NO: 30에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 609 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 나선구조: 밝혀지지 않음
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 30:
Claims (35)
- 호기성 박테리아를 사용하여 보툴리누스 독소를 재조합 발현시키는 방법에 의해 호기성 박테리아로부터 얻어지며, SEQ ID NO:28의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는, 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- SEQ ID NO:28의 클로스트리듐 보툴리누스 A 유형 독소 단백질 서열의 일부분 이상을 포함하는 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터를 함유하며, 상기 단백질을 용해성 단백질로서 숙주 세포에서 총 세포질 단백질의 0.75% 이상의 수준으로 발현할 수 있는, 숙주 세포.
- 제2항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 단백질을 상기 숙주 세포에서 총 세포질 단백질의 20% 이상의 수준으로 발현시킬 수 있는 것인 숙주 세포.
- 제2항에 있어서, 독소의 상기 부분이 SEQ ID NO:23을 포함하는 것인 숙주 세포.
- 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질이 SEQ ID NO:26을 포함하는 것인 숙주 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 부분이 SEQ ID NO:23의 클로스트리듐 보툴리누스 독소 서열을 포함하는 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제1항에 있어서, 비독소 단백질 서열을 더 포함하는 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 비독소 단백질 서열 및 클로스트리듐 보툴리누스 A 유형 독소의 일부분을 포함하는(여기서 클로스트리듐 보툴리누스 A 유형 독소의 상기 부분은 SEQ ID NO:28의 서열의 일부분을 포함함), 용해성 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 클로스트리듐 보툴리누스 A 유형 독소 서열의 상기 부분이 SEQ ID NO:23을 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 비독소 단백질 서열이 폴리-히스티딘 트랙을 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제10항에 있어서, SEQ ID NO:26을 포함하는 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질이 실질적으로 내독소가 없는 것인 융합 단백질.
- 호기성 숙주 세포를 사용하여 독소를 재조합 발현시키는 방법에 의해 호기성 숙주 세포로부터 얻어지며, SEQ ID NO:23의 클로스트리듐 보툴리누스 A 유형 독소 아미노산 서열을 포함하는, 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제13항에 있어서, 독소가 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제7항에 있어서, 상기 비독소 단백질 서열이 폴리-히스티딘 트랙을 포함하는 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- a. 임의 순서로(i) 폴리-히스티딘 트랙 및 SEQ ID NO:28의 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소 서열의 일부분을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 용액 및(ii) 고형 지지체에 공유 결합된 2가 양이온을 포함하는 크로마토그래피 수지를 제공하는 단계,b. 상기 용액을 상기 크로마토그래피 수지에 첨가하여 상기 융합 단백질을 크로마토그래피 수지에 결합시키는 단계,c. 결합된 융합 단백질을 함유하는 크로마토그래피 수지를 세척하여 상기 크로마토그래피 수지로부터 비융합 단백질을 제거하는 단계,d. 세척한 크로마토그래피 수지로부터 상기 결합된 융합 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는, 클로스트리듐 보툴리누스 A유형 독소로부터 유래되며 폴리-히스티딘 트랙을 포함하는 재조합 융합 단백질의 정제 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 크로마토그래피 수지가 고형 지지체에 공유 결합된 니켈 이온을 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 단계 a.에서 상기 융합 단백질을 포함하는 상기 용액이 재조합 융합 단백질을 함유하는 숙주 세포를 포함하는 세포 펠렛으로부터 유래된 용해성 추출물을 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 용해성 추출물이 상기 세포 펠렛을 결합 완충액 중에 현탁시키고 상기 현탁액을 분쇄시킴으로써 숙주 세포의 막을 파괴하여 용해성 단백질 및 불용성 세포질 파편을 포함하는 혼합물을 생성함으로써 상기 펠렛으로부터 생성된 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 분쇄된 세포 현탁액으로부터의 불용성 세포질 파편을 제거하여 정화된 용해성 용해물을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, 비이온성 세정제를 정화된 용해성 용해물에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제21항에 있어서, 단계 b) 후에, 상기 비이온성 세정제를 함유하는 상기 정화된 용해성 용해물을 크로마토그래피 수지와 함께 4℃에서 1시간 이상 동안 인큐베이션시켜 상기 융합 단백질을 상기 크로마토그래피 수지에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 독소가 E. coli 박테리아로부터 얻어지는 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제1항에 있어서, 상기 독소가 수성 환경에서 용해성인 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제1항에 있어서, 상기 독소가 박테리아의 세포질 중의 용액 중에 존재하는 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제1항에 있어서, 상기 독소가 유의량의 하나 이상의 이온성 세제 및 변성제가 없는 용액 중에서 용해성인 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제1항의 용해성 재조합 보툴리누스 독소를 포함하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 폴리-히스티딘 트랙을 추가로 포함하는 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제13항에 있어서, 독소가 E. coli 박테리아로부터 얻어지는 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제13항에 있어서, 독소가 수성 환경에서 용해성인 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제13항에 있어서, 독소가 숙주 세포의 세포질 중의 용액 중에 존재하는 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제13항에 있어서, 독소가 유의량의 하나 이상의 이온성 세제 및 변성제가 없는 용액 중에서 용해성인 것인 용해성 재조합 보툴리누스 독소.
- 제13항의 용해성 재조합 보툴리누스 독소를 포함하는 조성물.
- 폴리-히스티딘 태그에 연결된 클로스트리듐 보툴리누스 C 단편 일부분 이상을 포함하는 용해성 융합 단백질.
- 호기성 숙주 세포 중에서 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열의 일부분 이상을 재조합에 의해 발현시키는 단계; 및호기성 숙주 세포로부터 상기 부분을 얻는 단계 (여기서, 독소는 용해성 형태임)를 포함하는, 용해성 재조합 보툴리누스 독소의 제조 방법.
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|---|---|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019970702691A KR100497700B1 (ko) | 1994-10-24 | 1995-10-23 | 용해성재조합보툴리누스독소단백질 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100497700B1 (ko) |
-
1995
- 1995-10-23 KR KR1019970702691A patent/KR100497700B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Hokkaido Igaku Zasshi. 1991 Nov;66(6):841-8.(1991년 * |
| Toxicon, 1994 Sep;32(9);1095-104 (1994년 * |
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