CN100502944C - 一种天门冬酰胺酶注射液、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种天门冬酰胺酶注射液、其制备方法及其在制备用于治疗白血病等血液系统肿瘤的药物中的应用。该制剂由天门冬酰胺酶、药用辅料和水组成。单位制剂中天门冬酰胺酶的含量可以是5-200mg，单位制剂体积可以是1-200ml。辅料可以选用但不仅限于甘露醇或者聚乙二醇等碳水化合物、各种环糊精、半胱氨酸等20种人体氨基酸、低分子右旋糖酐、泊洛沙姆、磷酸盐或者醋酸盐等缓冲盐类等等。该制剂的制备方法包括配液、除菌、分装、压塞和包装等步骤。该注射液具有稳定性好、制备方便的特点，能很好保持天门冬酰胺酶的结构和活性，在制备用于治疗白血病等血液系统肿瘤的药物中应用前景广泛。

Description

一种天门冬酰胺酶注射液、其制备方法及应用

本发明涉及药物及其制剂领域。发明的核心在于提供了一种天门冬酰胺酶的新制剂、其制备方法及其在制备用于治疗白血病等血液系统肿瘤的药物中的应用。

L-天门冬酰胺酶II(以下称为“天门冬酰胺酶”)是一种酰胺基水解酶。其活性形式为一个同源四聚体，每个亚基由326个氨基酸组成。可以专一地催化L-门冬酰胺降解为L-门冬氨酸和氨。反应式如下：

HOOCCHNH₂CONH₂+H₂O→HOOCCHNH₂CH₂COOH+NH₃

1922年Clementi发现豚鼠血清中存在天门冬酰胺酶，1953年Kidd发现在豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质，1961年Broome确证了该抗癌物质为门冬酰胺酶。实验研究表明天门冬酰胺酶广泛存在于动物组织、微生物、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体各种组织器官中的分布未见报道。

某些肿瘤细胞缺乏门冬酰胺合成酶，因此不能自身合成生长必需的门冬酰胺，其生长需要依赖宿主正常细胞合成的门冬酰胺。天门冬酰胺酶可以将血清中的门冬酰胺水解为门冬氨酸和氨。使用天门冬酰胺酶可使血中门冬酰胺急剧缺失，肿瘤细胞既不能依赖宿主取得足够的门冬酰胺，也不能自身合成，导致其蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，增殖受抑制，肿瘤细胞大量破坏而不能生长、存活。

门冬酰胺酶的抗肿瘤活性得到医学界的广泛认可。特别是来源于大肠杆菌的天门冬酰胺酶。大肠杆菌能产生两种门冬酰胺酶即L-ASPsI·和L-ASPsII，分别由其染色体上基因ansA和ansB编码。其中只有L-ASPsII具有抗肿瘤活性。

天门冬酰胺酶在临床上适用于治疗急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色素瘤等。尤其是对儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)的诱导缓解期疗效最好。

目前临床使用的门冬酰胺酶主要有三种来源：两种是未经修饰的源于细菌的天然酶。一种是经过化学修饰的。天然酶来源于大肠杆菌和欧文氏菌。源于欧文氏菌的产品主要在加拿大和欧洲使用。第三种即PEG化门冬酰胺酶是用化学方法将PEG与酶分子偶联。FDA证实使用天然酶治疗急性淋巴细胞性白血病过敏的患者可以用PEG化门冬酰胺酶继续治疗。

用微生物特别是大肠杆菌来生产门冬酰胺酶已有广泛的研究。国外早已有该酶制剂上市。在我国，二十世纪70年代曾有天津生化制药厂生产，但后因菌种退化，产量降低而停产。目前只有常州千红制药有限公司和广州瑞星两家公司在生产。其产量远不能满足国内需求。国内临床上使用的门冬酰胺酶主要从日本和美国进口，价格昂贵。

综上所述，天然菌来源的门冬酰胺酶具有疗效确切，使用安全，毒副作用相对较低，生产成本低，产品纯度高等优点，是一种成功的癌症治疗药物。

目前生产天门冬酰胺酶的工艺很多，但制剂研究很少。国内外市场上只有冻干制剂一种。天门冬酰胺酶是大分子蛋白质，传统的做法仅仅是进行冻干保存。近年来制剂研究工艺和各种辅料的发展，出现了众多新的工艺，丰富了蛋白质多肽类药物的剂型。本公司研究人员从大分子蛋白质稳定性的角度出发，筛选了多种处方，解决了天门冬酰胺酶在水溶液中的稳定性问题，最终研制出稳定的天门冬酰胺酶注射液，为临床用药提供了方便。

本发明设计思路、研究内容和技术方案：

本发明主要内容包括制剂工艺的研制、稳定性考察和药理学研究三个部分。其中，天门冬酰胺酶在注射液中的稳定性是需要重点解决的问题。

根据人用注射液研究的要求，该溶液型制剂应该是澄明、安全、无害、稳定性好的溶液。溶剂可以是水性也可以是非水性的，水性溶剂最常用的是注射用水。根据活性药物的特点，可以选择各种药用辅料，如渗透压调节剂、增溶剂、抗氧化剂、助溶剂、pH值调节剂等等。结合天门冬酰胺酶的特点，我们主要考虑应用了以下辅料：渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、抗氧化剂和防腐剂。

可选的渗透压调节剂可以是但不仅限于氯化钠等无机盐类化合物；可选的pH值调节剂可以是但不仅限于磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等；可选的增溶剂或者助溶剂可以是但不仅限于甘氨酸等20种人体氨基酸及其盐(如半胱氨酸、亮氨酸、蛋氨酸等)、各种环糊精、甘油(或者山梨醇、聚乙二醇、丙二醇)等碳水化合物、各种环糊精、低分子右旋糖酐、泊洛沙姆等等；可选的抗氧化剂可以是但不仅限于乙二胺四乙酸及其盐、抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋氨酸等等；可选用的防腐剂可以是但不仅限于肉桂醇、甲酸等等。

经过大量的正交试验表明，上述辅料对天门冬酰胺酶有很好的稳定效果。其中，优选的pH值调节剂是磷酸缓冲液、优选的增溶剂是环糊精类化合物，优选的渗透压调节剂是氯化钠，优选的抗氧化剂是EDTA二钠和L-半胱氨酸。

在处方中天门冬酰胺酶和辅料用量组成方面，单位制剂中天门冬酰胺酶可以是5-200mg，例如5、10、20、40、100、200mg。单位制剂的体积可以是1-200ml。

一个优选的处方方案是：5-100mg天门冬酰胺酶、1-50mmol/L的L-半胱氨酸、5-50mmol/L磷酸缓冲液、0.5-10mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.5-5％的氯化钠。在此基础上更优选的方案是：10-80mg天门冬酰胺酶、2-30mmol/L的L-半胱氨酸、10-30mmol/L磷酸缓冲液、0.5-5mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.5-2％的氯化钠。最优选的方案是：20mg天门冬酰胺酶、5mmol/L的L-半胱氨酸、20mmol/L磷酸缓冲液、1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.7％的氯化钠，制备成规格为20mg∶5ml/支的制剂。

另一个优选的处方方案是：5-100mg天门冬酰胺酶、1-50mmol/L的L-半胱氨酸、5-50mmol/L磷酸缓冲液、0.5-10mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.5-5％的氯化钠、0.1-10％羟丙基β环糊精。在此基础上，更优选的组分方案是：10-80mg天门冬酰胺酶、2-30mmol/L的L-半胱氨酸、10-30mmol/L磷酸缓冲液、0.5-5mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.5-2％的氯化钠、0.5-5％羟丙基β环糊精。最优选的组分方案是：20mg天门冬酰胺酶、5mmol/L的L-半胱氨酸、20mmol/L磷酸缓冲液、1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.7％的氯化钠、2％羟丙基β环糊精，制剂规格是20mg∶5ml/支。

上述制剂处方可以通过如下工艺进行配制：

(1)在100级层流下按投料量称取所需的氯化钠、12水磷酸氢二钠、2水磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠等上述辅料，装入适宜的容器中，加计算量灭菌注射用水溶解立即使用。

(2)将处方量天门冬酰胺酶加入缓冲液，溶解后摇匀，超滤柱超滤除热原，再用高压蒸汽灭菌过的滤器(0.22μm、0.45μm双层滤膜)过滤除菌，封口，准备分装。

(3)分装前先用灭菌注射用水调整剂量，剂量调整合格后，换药液分装。全加塞后，将药瓶送入上瓶轨道，进行压盖。

(4)启动轧盖机，药瓶随转盘进入轨道，铝盖经轨道加至药瓶上，并被机头锁紧。轧盖后铝盖应严密、边缘整齐。

上述处方中提到的天门冬酰胺酶可以是大肠杆菌来源(L-天门冬酰胺酶I或者II)，也可以是欧文氏菌来源的L-天门冬酰胺酶。在我国已经有常州千红等多个厂家提供这种产品，而处方中的制剂辅料也是商品化的物质，可以方便得到。

至此，我们的发明完成了制剂制备工艺的设计和研究，开始考察制剂的稳定性。实验用样品来自实施例1所制备的产品。

按照相应的研究要求，稳定性研究我们主要考察了外观性状、pH值、溶液的澄明度检查、活性、纯度、细菌内毒素和无菌等。其中，我们重点考察了活性指标。活性变化反应了这种药物有效成份的变化。

活性检测方法采用体外法，具体操作步骤参考2000版《中国药典》二部中门冬酰胺酶项(第41页)描述方法。纯度检查采用高效液相方法。

稳定性研究中我们主要进行了影响因素试验、加速试验和长期试验。

影响因素试验主要考察因素是高温和强光照射。

强光照射实验：将供试品放在澄明度检测仪内，于光照强度为4000lx±500lx的条件下放置10天，于第5和第10天取样，按稳定性重点考察项目检测，并与0天相比较。结果如表1。结果表明，本品经光照后活性明显下降，其它各项指标无明显变化，因此本品应遮光保存。

表1 光照试验稳定性考察结果

高温实验：将供试品置于玻璃平皿中，分别在60℃下放置10天，在此期间，分别于第5和第10天取样，按稳定性重点考察项目检测，并与0天比较。检测结果见表2。

表2 高温试验稳定性考察结果(60℃)

高温60℃实验结果表明：本品经高温60℃10天后，纯度明显下降，活性明显下降。根据以上几点变化故进行高温40℃试验。见表3。

表3 高温试验稳定性考察结果(40℃)

高温40℃实验结果表明：本品经高温40℃10天后，纯度明显下降，活性明显下降。根据以上几点变化故进行25℃试验。见表4。

表4 25℃试验稳定性考察结果

在25℃实验条件下结果表明：本品经25℃条件放置10天后，纯度明显下降，活性明显下降。故可确定本品属于对温度特别敏感的制剂，加速实验可在温度25℃±2℃，RH 60±10％的条件下进行；长期实验可在温度2℃-10℃条件下进行。

加速试验：将本品包装置于温度25℃±2℃，RH 60±10％的环境中，放置6个月，分别于第1个月，2个月，3个月，6个月末取样，按稳定性重点考察项目进行检测。试验结果见表5。

表5 加速试验老察结果(25℃+2℃，′RH60±10％)

加速试验结果表明，天门冬酰胺酶水溶液在此条件下放置6个月，纯度和活性下降，说明本品属对温度特别敏感的制剂，需放冷处保存。

长期试验：将本品包装置于温度2℃-10℃条件下，放置6个月，每3个月取样一次，分别于0个月、3个月、6个月按稳定性重点考察项目检测。9个月后，分别于12个月、18个月、24个月、36个月继续考察。试验结果见表6。

表6 长期试验考察结果(2℃-10℃)

结果表明，天门冬酰胺酶水溶液在长期试验条件下放置6个月，各项指标均无明显改变，说明本品稳定性良好。

稳定性试验结论：由影响因素试验结果表明，天门冬酰胺酶水溶液在光照、在高温(60℃)40℃、25℃条件下放置后纯度和活性下降；在加速试验条件(25℃±2℃，RH 60±10％)放置6个月，纯度和活性下降，在长期试验条件(2℃-10℃，)放置6个月，各项指标均无明显改变。确定本品应在遮光、冷处(2-10℃)保存。03批样品在0、3、6个月时纯度检查结果分别见说明书附图1、2、3。

本发明的另一部分内容是考察所述水溶液注射制剂的药理学。药理学主要内容有药效、毒理等等。这部分的主要目的是评价发明所述的制剂在药效、毒性等方面与市售品的一致性，以确定其在临床应用的可行性。根据该药物的作用机理，药效可以通过检测活性指标来完成。在稳定性研究中，发明所述的制剂在2℃-10℃下能够保持很好的活性，其比活性在药典规定的范围之内(不低于250U/mg)，可以认为其药理活性符合临床用药要求。我们进一步进行了毒理学的有关试验。在本制剂中引入了新的辅料，L-半胱氨酸和羟丙基β环糊精。前者是常见的药用辅料，不需要再进行研究，我们对含后者的制剂进行了急性毒性和过敏性研究，重点比较其与市售品的差异。

1、天门冬酰胺酶豚鼠过敏试验：

材料和试剂：

市售注射用天门冬酰胺酶(5000单位/支，用前以5ml注射用水稀释，常州千红制药厂)、本发明实施例制备的04号样品、人血清白蛋白(江西博雅生物制药股份有限公司，批号：020401)。

动物和分组：

豚鼠12只，雌雄各半、2-3个月龄、200-300g、购自军事医学科学院。

实验方法：参照中国国家食品药品监督管理局2005年3月颁布的《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》进行。采用腹腔注射致敏，静脉注射激发。实验分四组，每组3只：空白对照组，注射0.5ml生理盐水，隔日一次，连续三次；阳性对照组，注射阳性药物人血清白蛋白，50mg/只，隔日一次，连续三次；给市售药组，10mg/只，隔日一次，连续三次；给发明所述药组，10mg/只，隔日一次，连续三次。首次给药14天后激发，激发剂量是致敏剂量的2倍。

注射后观察2小时内动物有无用爪搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、紫绀、窒息或休克、死亡等反应，并观察24小时后动物的反应情况。

实验结果

在首次给药后14天激发，试验结果见表7。

表7.豚鼠14天激发给药的实验结果

注：阴性-可疑-+轻度+中度++重度+++死亡X

结论

试验结果表明，本试验条件下豚鼠对两种受试品都有轻微的过敏反应，两组制剂无明显差别。

2、急性毒性试验

材料和试剂：

市售注射用天门冬酰胺酶(5000单位/支，用前以5ml注射用水稀释，常州千红制药厂)、本发明实施例制备的04号样品。

动物：

昆明种系小鼠，体重：20±2g，雌雄各半，每组动物20只。

方法：

选择健康昆明种小鼠60只，随机分成3组：生理盐水组、市售药组和发明药组。给药途径和容量：尾静脉注射0.5ml。禁食6小时后，分别按照相应给药途径一次性注射药物或等容积生理盐水。各组均于注射后连续观察14天，观察活动、行为、摄食、饮水、皮毛色泽、大小便、体重、呼吸有无异常以及有无死亡。

结果：

小鼠经一次性静脉注射药物或等容积的生理盐水后，全部动物均未出现异常情况，也未发生死亡。各组动物的体重药后14天与药前比明显增加(t检验，P<0.01)，各用药组与对照组比则无明显差别，见表8。

表8.小鼠静脉注射药物急性毒性结果

与用药前比较^*P<0.01

结果表明，在本试验剂量下，本发明提供的天门冬酰胺酶水溶液与传统的冻干粉针剂都没有观察到明显的急性毒性反应。

综上所述，本发明提供了一个天门冬酰胺酶的新剂型，该剂型生产工艺比现有的冻干粉针剂生产工艺简单，在生产上易于放大，优势明显，便于产业化的实现；同时，在生物活性和制剂稳定性方面，如权利要求和说明书所述的剂型稳定性好，能够长期储存，其活性与现有冻干粉针剂相同。因此本发明很好地体现了新颖性、创造性和实用性的专利要素。

为了更好地说明本专利的实施过程，我们列举如下实施例。需要说明的是，所列举的实施例是本发明思路和精神的具体体现之一，并不是对发明专利说明书内容的范围限制，更不是对权利要求的细化。

实施例1、权利要求7所述药物制剂的制备

精密称定氯化钠35.0g、磷酸氢二钠(含12结晶水)21.85g、磷酸二氢钠(含2结晶水)6.10g、乙二胺四乙酸二钠3.20g、天门冬酰胺酶20g、L-半胱氨酸3.06g，溶解于注射用水，最后定容至5000ml，用12ml西林瓶分装成1000支。最终规格为20mg:5ml/支。按照该处方总共生产样品3批，编号分别为01、02、03。操作程序按照说明书描述执行。

实施例2、权利要求10所述药物制剂的制备

精密称定氯化钠35.0g、磷酸氢二钠(含12结晶水)21.85g、磷酸二氢钠(含2结晶水)6.10g、乙二胺四乙酸二钠3.20g、天门冬酰胺酶20g、L-半胱氨酸3.06g、羟丙基β环糊精100g，溶解于注射用水，最后定溶至1000ml，用12ml西林瓶分装成1000支。最终规格为20mg:5ml/支。按照该处方总共生产样品1批，编号04。操作程序按照说明书描述执行。

Claims (5)

1、一种天门冬酰胺酶注射液，其主要组成是：10-80mg天门冬酰胺酶、2-30mmol/L的L-半胱氨酸、10-30mmol/L磷酸缓冲液、0.5-5mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和0.5-2％的氯化钠。

2、根据权利要求1所述的天门冬酰胺酶注射液，其组成是：20mg天门冬酰胺酶、5mmol/L的L-半胱氨酸、20mmol/L磷酸缓冲液、1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和0.7％的氯化钠，制备成规格为20mg：5ml/支的制剂。

3、根据权利要求1所述的天门冬酰胺酶注射液，其主要组成是：10-80mg天门冬酰胺酶、2-30mmol/L的L-半胱氨酸、10-30mmol/L磷酸缓冲液、0.5-5mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.5-2％的氯化钠和0.5-5％羟丙基β环糊精。

4、根据权利要求3所述的天门冬酰胺酶注射液，其组成是：20mg天门冬酰胺酶、5mmol/L的L-半胱氨酸、20mmol/L磷酸缓冲液、1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.7％的氯化钠和2％羟丙基β环糊精，制剂规格是20mg：5ml/支。

5、权利要求1、2、3、4任意一项所述的天门冬酰胺酶注射液在制备用于治白血病等血液系统肿瘤的药物中的应用。

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