CN106596428A - 一种测定急性白血病患者体内培门冬酰胺酶活力的试剂盒 - Google Patents
一种测定急性白血病患者体内培门冬酰胺酶活力的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，同时又属于临床诊断和检测领域。具体而言本发明提供了一种检测急性淋巴细胞性白血病患者体内培门冬酰胺酶活度的方法及试剂盒。培门冬酰胺酶催化门冬酰胺水解产生门冬氨酸和氨，氨与奈氏试剂反应产生的黄色络合物在450nm处有较大吸收，通过将吸光度与酶活度建立标准曲线，进而可以求得待测样品中的酶活度，该方法的重现性较好，操作简单，可行性强，因此可以得到切实的推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，同时又属于临床诊断和检测领域。具体而言本发明提供了一种检测急性白血病患者体内培门冬酰胺酶活力的方法及试剂盒。
背景技术
左旋门冬酰胺酶(L-Asp)是急性白血病(AL)诱导治疗和早期强化治疗期的重要药物。目前临床用于治理小儿AL的L-Asp主要来源于大肠埃希氏菌(E.coli)和欧文氏菌(Erwinia)，此外，培门冬酰胺酶是一种由活化聚乙二醇(PEG)与L-Asp通过特定化学反应结合而成，且保留一定L-Asp活性的缀合物，其免疫原性降低，体内消除半衰期延长，可以用于对上述两种原生酶出现过敏情况的病人治疗。
门冬酰胺酶是一种细菌酶，催化门冬酰胺(Asn)至门冬氨酸(aspartic acid)和氨的水解过程。门冬酰胺对于细胞内蛋白质、DNA、RNA的合成都具有及其重要的作用，对于正常细胞来讲，可通过门冬酰胺合成酶(AS)合成非必需氨基酸Asn，而对肿瘤细胞来说，由于缺乏相应的AS，需要依赖于外源性的Asn供生长所需，因此L-Asp可以使肿瘤细胞蛋白合成受阻，通过耗竭血液中的Asn，L-Asp可选择性地导致白血病细胞死亡。
门冬酰胺酶作为AL治疗中重要的基础药物，一般可用于所有小儿以及大部分成人治疗的缓解诱导阶段和强化阶段，大量临床数据显示门冬酰胺酶的强化治疗可以提高患儿的治疗成效，但也存在不良反应较多等缺点，治疗过程中还受各种因素影响，患者个体间体内酶活性差异变化极大，因此开展治疗药物浓度监测具有重大的意义。
不同制剂之间门冬酰胺酶的药动学和药效学参数差异巨大。目前有不同来源的普通门冬酰胺酶制剂两种(大肠埃希氏菌来源酶(E.coli-Ase)和欧文氏菌来源酶(Erwinia-Ase))和培门冬酰胺酶(PEG-asparaginase)制剂一种，后者为长效缓释制剂。E.coli-Ase多作为一线治疗药物，Erwinia-Ase则作为过敏患者的替代用药。上述两种普通门冬酰胺酶半衰期较短，需频繁给药以维持血药浓度水平。培门冬酰胺酶药物半衰期较长，理论上可维持较平稳的血药浓度，同时减少药物给药次数。患者在整个抗白血病疗程中需反复、多次使用该类药物，即便临床选用不同剂型，通过监测血药浓度也可以保证药物治疗的有效性。
相同剂型、不同疗程间门冬酰胺酶的药代动力学过程有差异。由于各种门冬酰胺酶制剂均来源于细菌，具有免疫原性，药物相关的抗体除了诱发过敏反应之外，还会不同程度地缩短药物的半衰期，表现为门冬酰胺酶药物浓度迅速下降。培门冬酰胺酶作为PEG化的纳米药物，其体内药代动力学过程可能还受机体免疫系统的影响。已有研究证实了这种影响，lshida等发现PEG化的脂质体重复注射时存在脂质体加速从血液中被清除的效应(Accelerated blood clearance effect，简称ABC效应)。培门冬酰胺酶是否存在这种加速清除的效应，需要药代动力学研究来验证。因此，通过治疗药物监测可以了解不同疗程间潜在的药动学过程差异，有助于临床治疗做出相应调整。
培门冬酰胺酶治疗过程中需要开展监测。培门冬酰胺酶是经结构改造的长效缓释剂型，该制剂载药量大，给药次数少，每14天给药一次。在14天给药周期中，培门冬酰胺酶否能持续、平稳的维持在酶活性谷值以上，是治疗有效的关键；另一方面，缓释制剂载药量巨大，其不规律释放会给化疗过程增加风险。药品说明书和《中国国家处方集(儿童卷)》均要求监测接受培门冬酰胺酶治疗的患儿的血药浓度。鉴于药品书和《国家处方集》的学术、法律权威性，开展这项技术服务，可以保证医患双方的治疗安全。
目前用于培门冬酰胺酶活度的测定方法主要有靛酚蓝比色法，但该方法的标准物质不易获得，操作相对较为繁琐；酶联免疫试剂盒法价格昂贵，不易大量应用研究。而本发明中所采用的紫外可见分光光度法重现性较好，操作简单，可行性强，因此可以得到切实的推广使用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种测定培门冬酰胺酶活力的方法，以及应用该方法配制的成本低、性质稳定的培门冬酰胺酶诊断试剂盒。
本发明是将待测的样品与门冬酰胺溶液在37℃恒温水浴条件下孵育，取适量上清液与一定量奈氏试剂混合，使其发生以下反应：
氨+奈氏试剂→黄色络合物(↓)
静置一段时间以后，将最终反应物置于紫外/可见分光光度计下，检测其在波长为450nm处的吸光度值，代入标准曲线中，即可测得酶溶液的活力值。
标准曲线的绘制：取上述硫酸铵标准系列溶液各0.5ml分别置于不同试管中，加入去离子水4.0ml，混匀后再分别加奈氏试剂0.5ml混匀，室温放置一定时间后后测其吸光度；确定标准方程和相关性。
试剂盒的试剂由以下成分组成：奈氏试剂、门冬酰胺、三氯乙酸溶液、硫酸铵标准溶液、磷酸盐缓冲液。
根据前述的试剂盒的成分组成，.其中门冬酰胺溶液需要临用前新鲜配制，所述门冬酰胺溶液浓度为0.010-1.000mM，优选为0.020-0.060mM，最终优选为0.044mM。
根据前述的试剂盒的成分组成，.其中磷酸盐缓冲液pH范围为5.0-9.0，优选为7.0-8.5，最终优选为8.0。
根据前述的试剂盒的成分组成，.其中奈氏试剂为具有一定的毒性的试剂，使用时需格外小心，且奈氏试剂需要避光保存，若奈氏试剂中有少量沉淀，可过滤后使用。
根据前述的试剂盒的成分组成，其特征在于所用的三氯乙酸溶液浓度为15％-35％，优选为20％-30％，最终优选为25％。
根据前述的试剂盒的成分组成，.其中硫酸铵标准溶液需要进行稀释得到系列硫酸铵标准溶液后使用，其浓度分别为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mM。
本发明的最优试剂盒由以下成分组成：
根据前述的样品酶活性的测定方法，.其中将待测样品与培门冬酰胺酶溶液在37恒温水浴条件下孵育30-60min使门冬酰胺水解，最终选择最优孵育时间为45min，可以使培门冬酰胺酶充分水解；将上清液与奈氏试剂静置5-20min后再测定其吸光度值，最终选择最佳静置时间为15min，可以得到较为稳定的吸光度值。
本发明试剂盒中所使用试剂的配制工艺如下：
磷酸盐缓冲液(pH8；0.1mM)：取94.7ml 0.2M磷酸氢二钠，加入0.2M磷酸二氢钠至100ml，加入去离子水至200ml，用0.2M磷酸二氢钠调节pH至8.0；
门冬酰胺溶液：精密称量一定量的门冬酰胺溶于适量pH8的磷酸盐缓冲液中得到浓度为0.044M的门冬酰胺溶液；
奈氏试剂：称取24g氢氧化钾溶于70ml蒸馏水中，完全冷却后转移至100ml容量瓶中；称取7g碘化钾，10g碘化汞溶于10ml蒸馏水中，搅拌后缓慢转移至上述容量瓶中，充分混匀，放置两天后备用；
三氯乙酸溶液(TCA)：精密称取一定量的三氯乙酸溶于适量去离子水中得到浓度为25％的三氯乙酸溶液；
硫酸铵标准系列溶液：精密称量干燥至恒重(105，2h)的硫酸铵溶于适量去离子水中得到浓度为25mM的硫酸铵标准溶液。
本发明中培门冬酰胺酶活度值的测定范围为27.8-1111U/L范围内，在该活度范围内，吸光度OD值对酶活度有良好的线性关系。
附图说明
图1为紫外扫描图谱，可以看出，空白管溶液在200-400nm之间有吸收峰，会干扰样品的测定，加样样品在400-450nm之间吸收较大，参考文献中测定波长的选择，最终以450nm为测定波长。
图2为标准曲线，以系列硫酸铵标准溶液与奈氏试剂反应，测其在450nm处的吸光度，将硫酸铵浓度与培门冬酰胺酶活度进行换算，建立培门冬酰胺酶活度与吸光度之间的标准曲线。
图3为样品测定方法的操作流程图。
图4为样品溶液用本方法测定活度时在测定时间为30min内的稳定性。可以发现发现无论是吸光度OD值还是活度值，其平均值的偏差均在零时(15min时)测定值的±5％以内，符合实验要求。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：
急性淋巴细胞性白血病患者给药后血浆中培门冬酰胺酶活度的测定(经前期处理)
检测方法
标准：分别取硫酸铵标准溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00ml于7个50ml的容量瓶中，可得到浓度为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mM的硫酸铵标准溶液，取上述系列硫酸铵标准溶液0.5ml分别置于不同试管中，加入去离子水4.0ml，混匀后再分别加奈氏试剂0.5ml混匀，室温放置15min后测其吸光度；确定标准方程和相关性。
空白：将900μl 0.044M门冬酰胺与100μl样品溶液在37水浴条件下孵育45min，加入250μl三氯乙酸溶液(25％，w/w)，取上述混合液5000r离心3min，取500μl上清液，依次加入4000μl去离子水和500μl奈氏试剂，静置15min待测。
样品：将900μl 0.044M门冬酰胺与250μl三氯乙酸溶液(25％，w/w)在37水浴条件下孵育45min，加入100μl待测样品溶液，取上述混合液5000r离心3min，取500μl上清液，依次加入4000μl去离子水和500μl奈氏试剂，静置15min，以上述空白溶液为空白对照管，在紫外/可见分光光度计上测其吸光度ΔA。
培门冬酰胺酶的活力吸光值ΔA。
一个培门冬酰胺酶单位相当于每分钟门冬酰胺水解产生1μmol氨所需要的酶的量，可用μmol/min，也可直接用用国际单位IU表示。
实验结果ΔA值为0.683±0.024，转化成酶活度均值为890.4IU，由此可见本发明的检测培门冬酰胺酶活力的方法和试剂可以有效检测出样本中的培门冬酰胺酶活力且检测稳定。
实施例2：
急性淋巴细胞性白血病患者给药后血浆中培门冬酰胺酶活度的测定(经前期处理)
检测方法：标准：分别取硫酸铵标准溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00ml于7个50ml的容量瓶中，可得到浓度为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mM的硫酸铵标准溶液取上述系列硫酸铵标准溶液0.5ml分别置于不同试管中，加入去离子水4.0ml，混匀后再分别加奈氏试剂0.5ml混匀，室温放置15min后测其吸光度；确定标准方程和相关性。
空白：将900μl 0.044M门冬酰胺与100μl样品溶液在37水浴条件下孵育45min，加入250μl三氯乙酸溶液(25％，w/w)，取上述混合液5000r离心3min，取500μl上清液，依次加入4000μl去离子水和500μl奈氏试剂，静置15min待测。
样品：将900μl 0.044M门冬酰胺与250μl三氯乙酸溶液(25％，w/w)在37水浴条件下孵育45min，加入100μl待测样品溶液，取上述混合液5000r离心3min，取500μl上清液，依次加入4000μl去离子水和500μl奈氏试剂，静置15min，以上述空白溶液为空白对照管，在紫外/可见分光光度计上测其吸光度ΔA。
培门冬酰胺酶的活力吸光值ΔA。
实验结果ΔA值为0.409±0.010，即所测样品中培门冬酰胺酶活度平均值为535.5IU。
实施例3：
急性淋巴细胞性白血病患者给药后血浆中培门冬酰胺酶活度的测定(经前期处理)
检测方法：标准：分别取硫酸铵标准溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00ml于7个50ml的容量瓶中，可得到浓度为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mM的硫酸铵标准溶液取上述系列硫酸铵标准溶液0.5ml分别置于不同试管中，加入去离子水4.0ml，混匀后再分别加奈氏试剂0.5ml混匀，室温放置15min后测其吸光度；确定标准方程和相关性。
空白：将900μl 0.044M门冬酰胺与100μl样品溶液在37水浴条件下孵育45min，加入250μl三氯乙酸溶液(25％，w/w)，取上述混合液5000r离心3min，取500μl上清液，依次加入4000μl去离子水和500μl奈氏试剂，静置15min待测。
样品：将900μl 0.044M门冬酰胺与250μl三氯乙酸溶液(25％，w/w)在37水浴条件下孵育45min，加入100μl待测样品溶液，取上述混合液5000r离心3min，取500μl上清液，依次加入4000μl去离子水和500μl奈氏试剂，静置15min，以上述空白溶液为空白对照管，在紫外/可见分光光度计上测其吸光度ΔA。
培门冬酰胺酶的活力吸光值ΔA。
实验结果ΔA值为0.069±0.001，即所测样品中培门冬酰胺酶活度平均值为100.4IU。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是为脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实例所作的任何简单修改，等同变化与修饰，均当属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种用于检测培门冬酰胺酶活力的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的试剂由以下成分组成：门冬酰胺、磷酸盐缓冲液、奈氏试剂、三氯乙酸溶液、硫酸铵标准溶液。
2.根据权利要求1所述的用于检测培门冬酰胺酶活力的试剂盒，其特征在于组成成分门冬酰胺溶液为门冬酰胺磷酸盐缓冲液，需要临用前新鲜配制，所述门冬酰胺磷酸盐缓冲液浓度为0.010-1.000M，优选为0.020-0.060M，最终优选为0.044M。
3.根据权利要求1所述的用于检测培门冬酰胺酶活力的试剂盒，其特征在于所使用的磷酸盐缓冲液pH范围为5.0-9.0，优选为7.0-8.5，最终优选为8.0。
4.根据权利要求1所述的用于检测培门冬酰胺酶活力的试剂盒，其特征在于所用的三氯乙酸溶液浓度为15％-35％，优选为20％-30％，最终优选为25％。
5.根据权利要求1所述的用于检测培门冬酰胺酶活力的试剂盒，其特征在于硫酸铵标准溶液需要进行一定稀释后得到系列硫酸铵标准溶液后使用，稀释后浓度分别为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mM。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用于检测培门冬酰胺酶活力的试剂盒，其特征在于所述试剂盒的试剂由以下成分组成：
7.一种用于检测培门冬酰胺酶活力的测定方法，其特征在于，测定方法如下：
将待测的样品与门冬酰胺溶液进行孵育，取上清液与奈氏试剂混合，使其发生以下反应：
氨+奈氏试剂→黄色络合物(↓)
将反应物置于紫外/可见分光光度计下，检测其在波长为450nm处的吸光度值，代入标准曲线即可求得培门冬酰胺酶的活力值。
8.根据权利要求2所述的检测培门冬酰胺酶活力值的测定方法，其特征在于将待测样品与培门冬酰胺酶溶液在37℃恒温水浴条件下孵育30-60min使门冬酰胺水解，最优孵育时间为45min。
9.根据权利要求2所述的检测培门冬酰胺酶活力值的测定方法，其特征在于将适量孵育后的上清液与奈氏试剂反应，静置5-20min后再测定其吸光度值，最优静置时间为15min。
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