CN106872624A

CN106872624A - 一种适用于聚乙二醇化蛋白质纯度检测的方法

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Publication number: CN106872624A
Application number: CN201611088647.XA
Authority: CN
Inventors: 马永; 颜莎; 王俊
Original assignee: ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Current assignee: ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Priority date: 2015-12-11
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: CN106872624B

Abstract

本发明涉及一种检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，该方法以分子筛色谱法检测，流动相中添加有：1)主链具有三个或三个以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇；或2)与修饰用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修饰剂。本发明提供的流动相添加剂相对于常规添加剂，可有效提高检测方法的灵敏度，能检出现有方法无法检出聚乙二醇化蛋白质中的杂质，更好地控制药品质量。

Description

一种适用于聚乙二醇化蛋白质纯度检测的方法

技术领域

本发明涉及一种适用于聚乙二醇化蛋白质的纯度检测方法，尤其是适用于聚乙二醇化药用蛋白酶的纯度检测，更具体的是一种聚乙二醇化门冬酰胺酶或激肽原酶的纯度检测方法。

背景技术

药品的纯度与药物的理化及生物学性质息息相关，不仅会对药物的稳定性有影响，甚至与药品的药效、药代行为、安全性均有较大的关联。由此可见，杂质研究对于药品研发来说意义重大。《化学药物杂质研究的技术指导原则》中规定：任何影响药物纯度的物质统称为杂质。杂质的研究是药品开发的一项重要内容，杂质是否能被全面准确地加以控制，直接关系到药品的质量可控性和安全性，所以在药物的研究、生产、供应和临床使用等方面必须保证药物的纯度。规范地进行杂质的研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围之内，才能保证药物的有效和安全。

中国药典中收载的一些常用的蛋白纯度检测方法缺乏普遍适用性，无法准确的对每种蛋白类药物进行纯度检测，尤其无法用于聚乙二醇化蛋白质的纯度检测。

采用常规的SDS-PAGE方法来分析聚乙二醇化蛋白质的纯度(中国药典2005年版二部附录V F第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)存在诸多问题：1.操作繁琐，耗时较长。总体说来，SDS-PAGE需要经历制板->制分离胶->制浓缩胶->电泳槽安装->制样->加样->电泳->剥胶->染色->脱色->结果观察等十一个步骤；尽管可以购买商品化的电泳胶节省制胶的步骤和时间，但是依旧耗时较长，第一，样品的制备需要放入100℃加热5-10min；第二，电泳需要45min～1hr；第三，考马斯亮蓝染色、脱色同样需要1～2hr，并且需要多次更换脱色液。2.方法精密度较差，且具有一定的危险性。首先，若使用的是商品胶，方法的精密度取决于商品胶的生产质量；若为自制胶，则凝胶聚合受各种因素的影响，丙烯酰胺有毒性，能致癌致突变；TEMED易燃易挥发，有强神经毒性。3.方法灵敏度低，主成分与杂质分离度无法达到要求。聚乙二醇化蛋白质一般是蛋白质与一个以上的聚乙二醇通过共价结合而制得的。每一个蛋白质分子上都结合有一定数量的聚乙二醇。被聚乙二醇修饰后蛋白质受长链PEG水力学臂的影响，在电泳胶上呈弥散状态分别，根本无法准确考察聚乙二醇化蛋白质所产生的微量降解或聚集杂质。4.方法难以定量，目前除了灰度扫描外，并没有有效的手段通过SDS-PAGE电泳胶对目的蛋白进行定量分析；而灰度扫描也是通过色阶的差异进行分析，缺乏准确性及稳定性。

高效液相色谱或超高效液相色谱为近年来逐渐广泛应用的蛋白质纯度分析方法，但是由于蛋白质经聚乙二醇化后性质发生改变，较难以通过常规色谱柱及色谱程序达到聚乙二醇化蛋白质及其相关杂质的分离。此外，申请人在研究中还发现，当以高效液相色谱或超高效液相色谱检测聚乙二醇化蛋白质的纯度时，普遍会存在检测结果中目的蛋白的色谱峰有严重拖尾的现象，无法有效并准确的检测出目的蛋白的纯度。如发明人用UPLC反相色谱法鉴定培门冬酶(聚乙二醇随机修饰门冬酰胺酶(L-ASP))的纯度时，培门冬酶的拖尾因子高达2.0；UPLC分子筛色谱法分析样品时，培门冬酶的拖尾仍然很严重，且无法通过常规手段如改变了流动相中的缓冲盐种类、盐浓度或者流动相pH值等方法改善培门冬酶在分子筛色谱法中的色谱行为。

发明内容

本发明解决的技术问题是：现有聚乙二醇化蛋白质纯度分析方法操作繁琐、精密度差、灵敏度低并具有一定的安全隐患；以及色谱法检测拖尾严重等的问题。

本发明提供了一种分子筛色谱法检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，流动相中添加有：

1)主链具有三个或三个以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇；

或2)与修饰用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修饰剂。

上述醇类如正丁醇、异丙醇、3-甲基-1,3-丁二醇。

上述PEG修饰剂优选与修饰用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修饰剂。如PEG随机修饰门冬酰胺酶所用PEG修饰剂为分子量5K的PEG修饰剂，流动相添加剂可选择分子量5K或大于5K(如40K)的PEG修饰剂。

作为优选，流动相中含有2％～5％(V/V)异丙醇。

作为优选，流动相是含2％～5％(V/V)异丙醇的20mmol/L磷酸盐缓冲液,pH6.0±0.5。

作为优选，流动相流速为0.3mL/min。

作为优选，色谱柱柱温25℃±5℃。所述聚乙二醇化蛋白质为聚乙二醇修饰的药用蛋白酶。

作为优选，所述聚乙二醇化蛋白质为聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶或精氨酸脱亚胺酶。

作为优选，其中色谱柱选用填料为亚乙基桥杂化颗粒BEH。

本发明的另一目的是，主链具有三个或三个以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇或与修饰用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修饰剂在分子筛色谱法检测聚乙二醇修饰蛋白纯度时作为流动相添加剂的用途。上述物质可改善分子筛色谱法检测聚乙二醇修饰蛋白纯度时的色谱峰峰形，提高准确度。

本发明开发的SEC-UPLC的分析方法，待检样品经适当稀释处理即可直接进样检测，操作简单，解决了现有方法操作繁琐的问题；本发明方法全程可以由仪器自动进样检测，通量较高，单针样品检测时间约为15min，解决了现有方法耗时长的问题；本发明方法仅受色谱方法条件中pH、温度、流速的影响，而这些条件可以通过仪器及溶液配制等操作进行准确控制，重复性及中间精密度均良好，解决了现有方法精密度差，受多种因素影响的问题。

另一方面在本方法发现之前，发明人也尝试了多种色谱法对聚乙二醇化蛋白质进行纯度检测，如HPLC配合使用SEC柱、HPLC配合使用C4柱、UPLC配合使用C4柱等等，但始终未能使培门冬酶及其相关杂质达到分离，甚至未有任何分离的趋势。偶然的机会，发明人在流动相中混入了一些特定的醇，意外发现培门冬酶拖尾现象有很大的好转。同时，发明人也换用有机溶剂如甲醇、乙腈进行过相关的方法学考察，在含有此二种有机溶剂流动相条件下根本无法检出杂B；培门冬酶的拖尾因子严重，在甲醇的条件下甚至连杂A都无法检出，培门冬酶拖尾因子高达2.06。因此，本发明方法很好的解决了以色谱法检测聚乙二醇化蛋白质时拖尾严重的问题，能检出现有方法无法检出聚乙二醇化蛋白质中的杂质，更好地控制药品质量。

附图说明

图1：空白溶剂色谱图

图2：系统适应性色谱图

图3a：本公司研发的培门冬酶溶液(a)、自研培门冬酶对照品(b)、门冬酰胺酶蛋白(c)、国内首仿培门冬酶(d)、原研培门冬酶(e)用实施例1方法分析的色谱图

图3b：图3a的局部放大图

图4：不同程度降解的培门冬酶(样品1，样品2，样品3)用实施例1所述方法检测的液相色谱图

图5:不同程度降解的培门冬酶用SDS-PAGE法检测图

图6:方法验证中线性考察图谱(n＝3)。

图7:流动相组分是否加异丙醇对比色谱图

图8：流动相组分是否加盐对比色谱图

图9:流动相加不同比例异丙醇对比色谱图

图10:改变流动相pH值对比色谱图

图11:改变柱温对比色谱图

图12:改变流速的对比色谱图

图13:实施例4方法1的系统适应性定位色谱图

图14:实施例4方法1的培门冬酶与杂质A分离色谱图

图15：实施例4方法2的色谱图

图16：实施例4方法3以甲醇代替异丙醇的色谱图

图17：实施例4方法4以乙腈代替异丙醇的色谱图

图18：实施例5PEG定点修饰门冬酰胺酶色谱图，其中图18a是不添加异丙醇的色谱图，图18b是添加异丙醇的色谱图

图19：实施例5PEG定点修饰激肽原酶色谱图，其中图19a是不添加异丙醇的色谱图，图19b是添加异丙醇的色谱图

图20：实施例5门冬酰胺酶不添加异丙醇的色谱图

图21：实施例5激肽原酶不添加异丙醇的色谱图

具体实施方式

实施例1本发明分析方法的色谱条件及方法

仪器：品牌型号：Waters Acquity UPLC H class；bioQuaternary solventManager；BioSample Manager-FTN；PDA Detector；Empower 3.0数据处理软件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH450SEC2.5μm，4.6mm*300mm

流动相：含2％异丙醇(V/V)的20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5±0.5，取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液87.7mL，0.2mol/L磷酸氢二钠12.3mL，异丙醇20mL，加水充分混匀并定容至1000mL)

流速：0.3mL/min，检测波长280nm，进样量10μL，样品池温度10℃，色谱柱温25±5℃。

方法：取待测样品适量，加流动相稀释并制成每1mL中约含250单位培门冬酶的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法(中国药典2010年版二部附录ⅤH)测定，记录色谱图，按照峰面积归一化法计算主峰相对百分含量，应不低于95％，理论塔板数不低于2000。

系统适应性溶液：培门冬酶：杂质A：门冬酰胺酶按质量比8:1:1比例混合，照上述方法进样，培门冬酶与杂质A、杂质B分离度均不低于1.5。

杂质A：取培门冬酶适量，经高温55℃处理24h所得；为培门冬酶主要的降解杂质；

杂质B：为培门冬酶的聚集杂质，为生产工艺中所引入的杂质。

实施例2实施例1分析方法性能验证的过程及结果

本纯度分析方法验证主要参考了《化学药物质量控制分析技术指导原则》、《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》、《International Conference onHarmonization(ICH)of Technical Requirements for Registration ofPharmaceuticals for Human Use,Topic Q2(R1):Validation of AnalyticalProcedures:Text and Methodology，Geneva，2005，p.11》及USP MC《PegfilgrastimSummary Validation Report，Sep 17,2012》中有关于纯度分析方法验证的要求进行。

为方便实验，本公司按如下方法自主制备培门冬酶(PEG随机修饰的门冬酰胺酶)：

第一步：缓冲液置换

把门冬酰胺酶的冻干粉(购自常州千红生化制药股份有限公司)溶于20mM的Tris-Hcl(pH8.0)缓冲液中，配制成蛋白浓度为5mg/mL的溶液。然后把样品通过AKTA层析系统的上样泵进行上样，样品吸入到Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrap Q HP 5mL)上。上样结束后用平衡缓冲液A液平衡色谱柱，平衡5个柱体积后用洗脱缓冲液B液进行一步洗脱，收集洗脱峰。

(A液：20mM磷酸缓冲液(pH8.0)，B液：20mM磷酸缓冲液+0.2M氯化钠(pH7.5))

第二步：修饰反应及修饰产物纯化

用M-SPA-5000(购自北京键凯科技有限公司)作为PEG修饰剂，将第一步所收集洗脱峰的门冬酰胺酶溶液按门冬酰胺酶:PEG修饰剂为1:50的摩尔比进行反应，在4℃下反应12h。其中PEG修饰反应中门冬酰胺酶的蛋白浓度为5mg/mL。反应结束后，检测结果表明门冬酰胺酶的修饰率达到了100％。

反应结束后用离子交换色谱层析进行纯化。纯化的色谱法条件：Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrap Q HP 5mL)，平衡缓冲液C液：20mM的Tris-HCl(pH9.0)，洗脱缓冲液D液：含0.1M NaCl的20mM的磷酸缓冲液(pH8.0)，流速2.5mL/min，检测波长为280nm。

上样：上述修饰反应产物用0.5M的NaOH溶液调节至pH 9.0，结合至Q离子交换柱。

平衡：C液冲洗5个柱体积。

洗脱：流动相配比为0-50％D液，洗脱体积为10个柱体积，洗脱时间为20分钟。

按上述方法平行制备三批培门冬酶样品，备用。

2.1专属性及系统适应性分析

2.1.1取空白溶剂适量，照实施例1所示的色谱条件进样，采集色谱图(图1)。结果表明空白溶剂对于样品检测无干扰。

2.1.2系统适应性溶液(随机取用上述自制培门冬酶，将培门冬酶、杂质A、门冬酰胺酶照质量比8:1:1混合，采集色谱图(图2)。

表1系统适应性

以上结果表明，培门冬酶与杂质A、B均能达到基线分离，且培门冬酶拖尾因子为1.03，对称性良好。

2.1.3本公司研发的培门冬酶溶液(a)、自研培门冬酶对照品(b)、门冬酰胺酶蛋白(c)(购自常州千红生化制药股份有限公司)、国内首仿培门冬酶(d)(购买自恒瑞医药股份有限公司，商品名：艾阳)、原研培门冬酶(e)(购买自Enzo公司，商品名oncaspar)用本法对比分析(图3)。a、b、d、e在主成分前面均出现了面积百分比为0.1％～0.3％不等的蛋白聚集杂质B。

所述培门冬酶溶液(a)、自研培门冬酶对照品(b)为上述自制培门冬酶中随机挑选的2批。

不同程度降解的培门冬酶(a)(样品1：取培门冬酶100μl，加0.1M的NaOH强制降解10min，加0.1M的HCl终止反应；样品2：同样品1强制降解条件，反应时间为0.5h；样品3：同样品1强制降解条件，反应时间为1h。)用实施例1所述方法检测，由图4(其中图4a-图4c分别为样品1-3的实验结果)可知，对于7.9min和/或9.3min处杂质均能准确检出。

2.1.4采用SDS-PAGE法(本发明背景技术提及的方法)进行分析：

取依据上述方法强制降解得到的不同程度降解的各样品(样品1、样品2、样品3)适量，加样品缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH8.0)，充分溶解，混匀即得制成每1ml中约含100单位的溶液，作为供试品溶液；同法制备对照品溶液；选用10％分离胶，5％浓缩胶(胶尺寸8×8cm，1mm(长×宽及厚度)，分别取供试品溶液和对照品溶液各2ul，照电泳法(中国药典2005年版二部附录V F第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)试验。结果如图5所示，其中泳道A1-A3为样品1，其中B1-B2为样品2，其中C1-C2为样品3。

由图5结果比较可知，由于随机修饰蛋白本身具有一定程度的离散性，且培门冬酶表观分子量受线性PEG空间结构的影响，与其分子量接近的微量杂质，在SDS-PAGE方法中根本无法检出。

2.2精密度

2.2.1重复性

随机取用上述自制培门冬酶，平行配制供试品6份，分别进样，采集色谱图，以主成分保留时间、峰面积、％面积的RSD(相对标准偏差relative standard deviation)来考察方法重复性。

表2培门冬酶分析方法验证-重复性

主成分保留时间RSD＝0.02％，面积RSD＝0.3％，％面积RSD＝0.2％，表明该方法重复性良好。

2.2.2中间精密度

另一人于另一日随机取用上述2批自制培门冬酶，分别平行配制6份样品，依照本法，分别进样，采集色谱图，结合重复性共12次检测结果，以主成分保留时间、峰面积、％面积等RSD来考察方法重复性。

表3培门冬酶分析方法验证-中间精密度

主成分保留时间RSD＝0.03％，面积RSD＝0.52％，％面积RSD＝0.29％，表明该方法中间精密度良好。

2.3线性

随机取用上述自制培门冬酶，分别配制10％、25％、50％、75％、100％、150％共6个浓度水平的供试品(所述100％浓度即为每1mL中约含250单位培门冬酶的溶液)，每个浓度平行配制3份样品，依照实施例1方法，分别进样，采集色谱图，考察10％-150％浓度水平范围内的线性关系。

表4培门冬酶分析方法验证-线性

根据平行三次色谱采集峰面积对浓度水平进行线性关系拟合，见图6a、6b、6c。三次线性曲线R²≥0.9990，表明本方法线性关系良好。

2.4检测限(LOD)

LOD值通过如下公式进行计算：LOD＝3.3σ/S×100％，σ＝响应值的标准方差，S＝线性方程的斜率；

表5培门冬酶分析方法验证-LOD计算

曲线编号	斜率	Y轴截距
				1	865527	13866	0.9996
2	866393	14134	0.9998
				3	862409	14148	1
平均值	864776.3	14049.33	0.9998
				SD	2095.40	158.93	-

因此，LOD＝3.3×158.93/864776.3×100％＝0.06％，说明该方法灵敏度较高，可以用于培门冬酶的纯度检测。

2.5溶液稳定性

随机取用上述自制培门冬酶，加流动相稀释并制成每1mL中约含250单位的溶液，作为供试品溶液放置于2-8℃(5℃±3℃)的进样器中，分别考察1-12h内溶液的稳定性情况。

表6培门冬酶分析方法验证-溶液稳定性

^a培门冬酶与降解杂质A的分离度

^b培门冬酶与工艺杂质B的分离度

由以上结果可知，在0-12h内主成分保留时间RSD＝0.05％，面积RSD＝1.25％，％面积RSD＝0.06％，表明该方法溶液稳定性良好。

实施例3改变实施例1中部分色谱条件(其他条件不变)前后的方法性能比较

表7改变实施例1部分色谱条件的对比试验参数及结果

实施例4

方法1、采用TSKgel G4000PWXL(7.8*300mm，10um)色谱柱，柱温25℃，流动相为0.02mol/L磷酸缓冲液(0.02mol/L磷酸盐缓冲液，加0.1mol/L硫酸钠，pH6.0)；waterse2695色谱仪配PDA检测器。

使用该方法检测上述系统适应性溶液，培门冬酶、杂A及门冬酰胺酶均无法达到基线分离；通过调整流速，pH，流动相组成均未达到理想效果。将流速调至0.2ml/min时，主峰保留时间已经延至40min，但仍未与杂A达到基线分离，更无法检出杂B。(见图13、图14)

方法2、采用ACQUITY UPLC BEH300C4(1.7μm，2.1×100mm)色谱柱，以0.1％TFA水为流动相A，0.1％TFA乙腈作为流动相B，以下表8所示的流动相梯度作为起始条件进行方法摸索；Waters Aquaity H Class液相色谱仪。同样，无论如何调整流动相比例或改性剂的种类，均无法使杂A与培门冬酶达到分离。(见图15)

表8

T(min)	流动相A	流动相B
			0	90％	10％
5	90％	10％
			10	40％	60％
20	0％	100％
			20.01	90％	10％
25	90％	10％

方法3、2％甲醇代替2％异丙醇，其他条件同实施例1，实验结果见图16、表9

表9

方法4、2％乙腈代替2％异丙醇，其他条件同实施例1，见图17、表10

表10

发明人在偶然发现异丙醇对于以色谱法检测聚乙二醇化蛋白纯度的过程中能解决谱峰严重拖尾的技术问题后，进行了进一步的分析，初步推测聚乙二醇化蛋白由于表面覆盖了许多的聚乙二醇分子，其中的醇羟基能与填料表面的硅羟基选择性吸附，从而造成谱峰严重拖尾；而异丙醇的加入可以竞争性地抑制硅醇基的吸附从而有效地改善峰形，同时申请人也以具有相同性质的甲醇、乙腈进行了替代实验，却无法解决上述技术问题。申请人同时推测，本技术问题的解决应该还同时与异丙醇本身粘度较大的物理特性，以及其他一些无法确定的性质共同作用解决了该技术问题。

实施例5

变更待检测样品，根据样品的分子量选择相应的色谱柱填料规格，其余条件与实施例1保持一致，具体结果如下：

表11实施例1的方法对于其他PEG修饰类产品的峰形改善效果

所述PEG定点修饰门冬酰胺酶，具体由以下方法制备得到：

1.PEG偶联物样品制备

用40mM pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解将L-门冬酰胺酶(来源于常州千红生化制药股份有限公司)以配制成为20mg/mL的溶液，分别用Y-PALD-40K(购自北京键凯科技有限公司)，按门冬酰胺酶:PEG:氰基硼氢化钠为1:4:200的摩尔比进行反应，在4℃下反应12h后，加入1M甘氨酸终止反应。制备得到单修饰产物Y-PALD-40K-ASP(Mono)及二修饰产物Y-PALD-40K-ASP(Di)。

2.PEG偶联物样品纯化

色谱法条件：Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrap Q HP 5mL)，A液：20mM的Tris-HCl(pH9.0)，B液：含1M NaCl的20mM的Tris-HCl(pH9.0)，流速2.5mL/min，检测波长为280nm。

平衡：A液冲洗5个柱体积。

洗脱：0-50％B液，洗脱体积为10个柱体积，时间20分钟，分步进行收样得到二修饰产物Y-PALD-40K-ASP(Di)。

所述PEG定点修饰激肽原酶，具体由以下方法制备得到：

1.PEG偶联物样品制备

用50mM pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解将激肽原酶(来源于常州千红生化制药股份有限公司)以配制成为8mg/mL的溶液，用Y-PALD40K(购自北京键凯科技有限公司)，按激肽原酶:PEG:氰基硼氢化钠为1:10:100的摩尔比进行反应，在4℃下反应12h后，加入1M甘氨酸终止反应。制备得到Y-PALD-40K-KLK1。

2.PEG偶联物样品纯化

2.1色谱法去除未反应PEG

色谱法条件：Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrap Q HP 5mL)，A液：20mM的Tris-HCl(pH8.0)，B液：含1M NaCl的20mM的Tris-HCl(pH8.0)，流速2.5mL/min，检测波长为280nm。

上样：上述修饰反应产物用0.5M的NaOH溶液调节至pH 8.0，结合至Q离子交换柱。

平衡：A液冲洗5个柱体积。

收集：50％(v/v)的B液洗脱，并收集洗脱峰样品。

2.2色谱法纯化单修饰PEG偶联物

色谱法条件：Hiload 16/60Superdex 200pg(购自GE公司)半制备型凝胶过滤柱，洗脱液为PBS，流速1.5mL/min，检测波长为280nm。

由图20中可以看出PEG修饰前的门冬酰胺酶在SEC-HPLC上峰形对称性较好，谱峰较窄；由图18a中可以看出，经PEG定点修饰之后的门冬酰胺酶峰展约为3min，拖尾严重，容易造成定量不准确的情况；而图18b中可以看出，经过流动相中添加异丙醇，可以有效地改善色谱峰形，且能同时检测到相应的蛋白聚集杂质，可以将定点修饰门冬酰胺酶及其相关杂质得到较好的分离。

表12定点修饰门冬酰胺酶采用实施例1的方法分析色谱分离相关结果参数

	保留时间(min)	峰面积	％面积	USP分离度	USP拖尾因子	USP理论塔板数
							1	7.905	2929	0.42			3490
2	8.999	698992	99.26	1.74	1.12	4369
							3	10.195	2282	0.32	2.61	1.14	1519

同样地，对于PEG定点修饰激肽原酶产品也同样具有改善峰形的效果。由图21可以看出，修饰前的激肽原酶色谱峰对称性良好，谱峰较窄；由图19a中可以看出，经PEG定点修饰的激肽原酶在进行SEC-HPLC分析时，流动相中若不添加异丙醇，则峰展较宽，接近2.5min；而在流动相中添加5％的异丙醇后，色谱峰不仅对称性得到较好的改善，且峰展宽缩短至1.5min。

对于PEG定点修饰精氨酸脱亚胺酶产品也同样具有改善峰形的效果。经PEG定点修饰的蛋白在不添加任何改性剂的流动相中不出峰，或者出峰效果不佳(拖尾严重，峰展极宽)，而在流动相中添加10％的异丙醇后，色谱峰得到明显的改善，且能看到明显杂质分离。

实施例6

将实施例1中异丙醇替换为其他添加剂，并改变部分色谱条件，其他条件同实施例1，检测PEG随机修饰门冬酰胺酶、PEG定点修饰门冬酰胺酶、PEG定点修饰激肽原酶、PEG定点修饰精氨酸脱亚胺酶纯度：

1.改性剂：5％正丁醇

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH450SEC3.5μm，7.8mm*300mm，上样量10-40μL，流速为0.8ml/min，检测波长280nm，柱温30℃。

结果分析：正丁醇作为改性剂，四种样品出峰效果均较理想，峰形对称性好，拖尾小，在1.07-1.45之间。

2.改性剂：10％异丙醇

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH450SEC3.5μm，7.8mm*300mm，上样量10-40μL，流速为0.8ml/min，检测波长280nm，柱温30℃。结果分析：异丙醇作为改性剂，四种样品出峰效果均较理想，峰形对称性好，拖尾小，在1.07-1.26之间。

3.改性剂：5％3-甲基-1,3-丁二醇

结果分析：3-甲基-1,3-丁二醇作为改性剂时也能使这四种修饰蛋白出峰效果理想。

4.改性剂：5％戊二醇

结果分析：PEG随机修饰门冬酰胺酶、PEG定点修饰激肽原酶、PEG定点修饰精氨酸脱亚胺酶的峰形具有一定的改善。在该改性剂条件下，峰形均具有一定的改善。但仍需加大其用量才能获得理想的效果，限制了其应用。

5.改性剂：1％异戊醇

结果分析：异戊醇作为改性剂对这四种样品均没有良好的分离效果，由于异戊醇本身的碳链较前二者长，其与水的溶解度不佳，因此限制其作为SEC流动性改性剂的应用。

6.改性剂：5％1,2丙二醇

结果分析：1,2丙二醇作为改性剂对PEG随机修饰门冬酰胺酶、PEG定点修饰门冬酰胺酶、PEG定点修饰激肽原酶都没有良好的分离效果，而对PEG定点修饰精氨酸脱亚胺酶而言，有明显出峰，但对称性较差，拖尾严重。

7.改性剂：0.25％PEG 5K(M-SPA-5000)

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH450SEC2.5μm，4.6mm*300mm，上样量10-40μL，流速为0.3ml/min，检测波长280nm，柱温30℃。

结果分析：PEG随机修饰门冬酰胺酶的出峰最好，PEG定点修饰门冬酰胺酶、PEG定点修饰精氨酸脱亚胺酶无明显出峰，PEG定点修饰激肽原酶虽然有出峰但响应值较低。

8.改性剂：0.5％PEG 40K(Y-PALD-40KD)

结果分析：PEG随机修饰门冬酰胺酶、PEG定点修饰门冬酰胺酶、PEG定点修饰激肽原酶、PEG定点修饰精氨酸脱亚胺酶出峰效果均较好，对称性好，拖尾小。

总结：

本专利中发明人一共考察了8种改性剂，其中正丁醇、异丙醇、3-甲基-1,3-丁二醇和PEG 40K、PEG5K均有一定的改善效果，戊二醇、异戊醇因其与水的溶解度有限影响其作为改性剂的应用、1,2丙二醇极性较大，使用效果也不理想，综上所述，针对PEG修饰药物(蛋白、多肽、小分子等，不限于此)，良好的SEC的改性剂具有以下特征：

1)主链具有三个或以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇；

2)或与修饰用PEG具有相同分子量或分子量更大的PEG，且用分子量比修饰用PEG更大的PEG作为SEC改性剂时效果更佳。

Claims

1.一种分子筛色谱法检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，流动相中添加有：

或2)PEG修饰剂，所述PEG修饰剂的分子量不小于制备所述聚乙二醇修饰蛋白时所采用的PEG修饰剂。

2.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于所述醇类物质是正丁醇、异丙醇、3-甲基-1,3-丁二醇。

3.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于所述流动相中含有2％～5％(V/V)异丙醇。

4.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于所述流动相是含2％～5％(V/V)异丙醇的20mmol/L磷酸盐缓冲液,pH6.0±0.5。

5.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于所述流动相流速为0.3mL/min。

6.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于所述色谱法中色谱柱柱温25℃±5℃。

7.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于所述聚乙二醇化蛋白质为聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶或精氨酸脱亚胺酶。

8.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于色谱柱选用填料为亚乙基桥杂化颗粒BEH。

9.主链具有三个或三个以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇在分子筛色谱法检测聚乙二醇修饰蛋白纯度时作为流动相添加剂的用途。

10.PEG修饰剂在分子筛色谱法检测聚乙二醇修饰蛋白纯度时作为流动相添加剂的用途，所述PEG修饰剂的分子量不小于制备所述聚乙二醇修饰蛋白时所采用的PEG修饰剂。