CN102724980B - 蛋白-聚合物偶联物的治疗用途 - Google Patents

蛋白-聚合物偶联物的治疗用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102724980B
CN102724980B CN201080056068.1A CN201080056068A CN102724980B CN 102724980 B CN102724980 B CN 102724980B CN 201080056068 A CN201080056068 A CN 201080056068A CN 102724980 B CN102724980 B CN 102724980B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
polymer conjugates
interferon
disease
albumen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201080056068.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102724980A (zh
Inventor
K-C·林
R·威德曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PharmaEssentia Corp
Original Assignee
PharmaEssentia Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PharmaEssentia Corp filed Critical PharmaEssentia Corp
Publication of CN102724980A publication Critical patent/CN102724980A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102724980B publication Critical patent/CN102724980B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及采用说明书描述的蛋白-聚合物偶联物来治疗多种疾病，包括的疾病是原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症。

Description

蛋白-聚合物偶联物的治疗用途
相关申请段落的交叉引用
本申请要求2009年12月10日提交的美国临时申请No.61/285,411的优先权，其内容以引用方式全部合并于此。
背景技术
细胞生物学和重组蛋白技术的发展导致蛋白疗法的发展。
然而，主要障碍仍然存在。大多数蛋白质易于发生蛋白水解的降解，因此在循环系统中具有短的半衰期。其他不利性包括低的水溶性和诱导中和抗体。
将聚合物例如聚乙二醇(PEG)连接至蛋白质阻止了蛋白水解酶接近蛋白质骨架，从而导致蛋白质稳定性提高。另外，它也改善水溶性并使免疫原性最小化。因此需要将聚合物连接至蛋白质的有效方法。
发明简述
本发明的一方面涉及采用蛋白-聚合物偶联物来治疗多种疾病。所述偶联物包含至少一个聚合物部分、干扰素α部分和连接体。在所述偶联物中，总分子量是2-200kD(优选40kD)，且所述偶联物中的聚合物部分的数目不大于10。所述一个或多个聚合物部分连接至连接体；干扰素α部分的N末端氮原子结合至连接体；以及所述连接体是共价键、C1-10亚烷基、C2-10亚烯基或C2-10亚炔基。优选地，所述偶联物是基本上纯的，例如，纯度大于70％、80％或90％。可由所述偶联物治疗的疾病包括多发性硬化、慢性病毒感染(例如乙肝病毒感染、丙肝病毒感染和人乳头状瘤病毒感染)、癌症、原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症。
本发明的另一方面涉及采用如下所示的式I的蛋白-聚合物偶联物来治疗上述疾病：
其中R1、R2、R3、R4和R5各自独立为H、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、芳基、杂芳基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；A1和A2各自独立为聚合物部分；G1、G2和G3各自独立为键或连接官能团；P是干扰素α部分；m是0或1-10的整数；且n是1-10的整数。
关于上式，所述蛋白-聚合物偶联物可以具有一个或多个以下特征：G3是键且P是干扰素α部分，其中N末端的氨基连接至G3；A1和A2是分子量为2-100kD(优选10-30kD)的聚环氧烷(polyalkylene oxide)部分，G1和G2各自为
(其中O连接至A1或A2，且NH连接至如式I所示的碳原子)，或G1和G2各自为尿素、磺酰胺或酰胺，(其中N连接至如式I所示的碳原子)；m是4，N是2，且R1、R2、R3、R4和R5各自为H；且P是含有1-4个额外的氨基酸残基的修饰的干扰素α部分。
术语“烷基”是指一价直链或支链烃基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基和正戊基。类似地，术语“烯基”或“炔基”是指包含一个或多个C＝C双键或一个或多个C≡C三键的一价直链或支链烃基。
术语“亚烷基”是指二价直链或支链烃基。类似地，术语“亚烯基”或“亚炔基”是指包含一个或多个C＝C双键或一个或多个C≡C三键的二价直链或支链烃基。
术语“芳基”是指具有至少一个芳环的烃环系统(单环或二环)。芳基部分的实例包括但不限于苯基、萘基和芘基。
术语“杂芳基”是指具有至少一个芳环的烃环系统(单环或二环)，所述芳环包含至少一个杂原子如O、N或S作为环系统的一部分，其余为碳。杂芳基部分的实例包括但不限于呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基和吲哚基。
术语“环烷基”是指仅具有碳环原子的部分或完全饱和的单环或二环的环状系统。实例包括但不限于环丙烯基、环戊烯基和环己烯基。
术语“杂环烷基”是指除碳之外还具有一个或多个杂原子(例如O、N或S)作为环原子的部分或完全饱和的单环或二环的环状系统。实例包括但不限于哌啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉和1，4-氧杂氮杂环庚烷。
此处提及的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基包括取代和未取代部分两者。取代基的实例包括C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、C1-C10烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、氨基、C1-C10烷基氨基、C1-C20二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、羟基氨基、烷氧基氨基、C1-C10烷基磺酰胺、芳基磺酰胺、羟基、卤素、硫代、C1-C10烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、羧基和羧酸酯。
术语“聚环氧烷部分”是指衍生自直链、支链或星型聚环氧烷的单价基团。聚环氧烷部分的分子量可以是2-100kD。聚环氧烷部分是饱和或不饱和的。聚环氧烷部分的实例包括但不限于聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚环氧异丙烷、聚环氧丁烷，及其共聚物。其他聚合物例如右旋糖酐、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或基于碳水化合物的聚合物也可用于代替聚环氧烷部分，只要它们不是抗原性、毒性的或不引起免疫反应。聚环氧烷部分是取代或未取代的。例如，它可以是甲氧基-封端的聚乙二醇(mPEG)。
术语“干扰素α部分”是指衍生自干扰素α的单价基团。“干扰素α”是指抑制病毒复制和细胞增殖并调节免疫应答的高度同源种类-特异性蛋白质家族。参见Bonnem等人，J.Biol.Response Mod.，1984，3(6)：580-598；和Finter，J.Hepatol.，1986，3Suppl 2：S 157-160。它可以是天然存在形式或修饰形式。修饰的干扰素α例如可以是包含干扰素α和在所述干扰素的N末端具有1-4个额外的氨基酸残基的蛋白质。这种修饰的干扰素α的一个实例是
IFN代表干扰素α-2b部分，其N末端氨基结合至羰基。
许多类型的干扰素α蛋白质是可商购的，包括Schering Corporation，Kenilworth，N.J.提供的Intron-A干扰素、Hoffmann-La Roche，Nutley，N.J.提供的Roferon干扰素、Boehringer Ingelheim Pharmaceutical，Inc.，Ridgefield，Conn.提供的Berofor α2干扰素、Sumitomo，Japan提供的Sumiferon和Glaxo-Wellcome Ltd.，London，Great Britain提供的Wellferon干扰素α-n1(INS)。
以下所列是前体形式或成熟形式的五种典型的人干扰素α蛋白质的氨基酸序列：
maltfallva llvlsckssc svgcdlpqth slgsrrtlml laqmrrislf sclkdrhdfgfpqeefgnqf qkaetipvlh emiqqifnlf stkdssaawd etlldkfyte lyqqlndleacviqgvgvte tplmkedsil avrkyfqrit lylkekkysp cawevvraei mrsfslstnl qeslrskeSEQ ID NO.：1
(参见Krasagakis等人，Cancer Invest.26(6)，562-568，2008)cdlpqthslg srrtlmllaq mrkislfscl kdrhdfgfpq eefgnqfqka etipvlhemiqqifnlfstk dssaawdetl ldkfytelyq qlndleacvi qgvgvtetpl mkedsilavr kyfqritlylkekkyspcaw evvraeimrs fslstnlqes lrske SEQ ID NO.：2
(参见Klaus等人，J.Mol.Biol.274(4)，661-675，1997)
mcdlpqthsl gsrrtlmlla qmrrislfsc lkdrhdfgfp qeefgnqfqk aetipvlhemiqqifnlfst kdssaawdet lldkfytely qqlndleacv iqgvgvtetp lmkedsilav rkyfqritlylkekkyspca wevvraeimr sfslstnlqe slrske SEQ ID NO.：3
(参见GenBank登录号AAP20099，2003年4月30日版)
mallfpllaa lvmtsyspvg slgcdlpqnh gllsrntlvl lhqmrrispf lclkdrrdfrfpqemvkgsq lqkahvmsvl hemlqqifsl fhterssaaw nmtlldqlht elhqqlqhletcllqvvgeg esagaisspa ltlrryfqgi rvylkekkys dcawevvrme imkslflstnmqerlrskdr dlgss SEQ ID NO.：4
(参见Capon等人，J.Mol.Cell.Biol.5(4)：768-779，1985)
lsyksicslg cdlpqthslg nrralillaq mgrispfscl kdrhdfglpq eefdgnqfqktqaisvlhem iqqtfnlfst edssaaweqs llekfstely qqlnnleacv iqevgmeetplmnedsilav rkyfqritly ltekkyspca wevvraeimr slsfstnlqk rlrrkd SEQ ID NO.：5
(参见Lund等人，J.Interferon Res.5(2)，229-238，1985)
在一个实施方式中，用于制备本发明偶联物的干扰素α蛋白质的氨基酸序列与上列氨基酸序列之一、或与对应于成熟干扰素α的其片断具有至少80％(例如，85％、90％、95％或99％)的一致性。
两种氨基酸序列的“一致性百分比”采用Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68，1990、在Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77，1993中修改的算法测定。这种算法合并入Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-10，1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST蛋白搜索可采用XBLAST程序、分数＝50、字长＝3来进行，从而获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两种序列之间存在间隙，可如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402，1997所描写使用间隙BLAST。当采用BLAST和间隙BLAST程序时，可使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
术语“连接官能团”是指二价官能团，一端连接到聚合物部分且另一端连接到蛋白部分。实例包括但不限于，-O-、-S-、羧酸酯、羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸酯、尿素、磺酰基、亚磺酰基、氨基、亚氨基、羟基氨基、膦酸酯或磷酸基。
上述蛋白-聚合物偶联物可以是游离形式或盐形式(如果需要的话)。例如，盐可以通过本发明蛋白-聚合物偶联物上的阴离子和带正电荷的基团(例如氨基)之间形成。适当的阴离子包括氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、三氟醋酸盐和醋酸盐。类似地，盐也可以通过本发明蛋白-聚合物偶联物上的阳离子和带负电荷的基团(例如羧酸盐)之间形成。适当的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子、和铵阳离子，例如四甲铵离子。
此外，所述蛋白-聚合物偶联物可具有一个或多个双键或一个或多个不对称中心。这种偶联物可作为外消旋物、外消旋混合物、单一对映体、单一非对映体、非对映混合物和正-或反-或E-或Z-双键异构形式存在。
本发明蛋白-聚合物偶联物的一个实例显示如下：
其中mPEG的分子量为20kD且IFN是干扰素α-2b部分。
所述偶联物在制备治疗上述疾病之一的药剂中的用途也在本发明范围内。
本发明一个或多个实施方式的细节将在以下说明书中阐明。本发明的其他特征、目的和优点将从说明书和权利要求书中变得明显。
发明详述
用于实施本发明的蛋白-聚合物偶联物可以通过化学领域熟知的合成方法，例如美国序列号12/192,485中描述的方法来制备。方案1显示制备本发明蛋白-聚合物偶联物的实例。含有乙缩醛基的二胺化合物1与N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯mPEG(即化合物2)反应形成二-PEG化化合物3，其随后转化为醛4。所述醛化合物与具有游离氨基的蛋白质经由还原性烷基化反应生成本发明蛋白-聚合物偶联物。
方案1
由此合成的蛋白-聚合物偶联物可通过例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、电泳、透析、超滤或超离心法进一步纯化。
上述的化学反应包括使用溶剂、试剂、催化剂、保护基和脱保护基试剂，以及某种反应条件。它们还可以在此处具体描述的步骤之前或之后包括添加或去除适当的保护基的步骤，从而最终合成蛋白-聚合物偶联物。此外，多个合成步骤可以交替的顺序或次序进行，从而形成所需蛋白-聚合物偶联物。用于合成适当的蛋白-聚合物偶联物的合成化学转化和保护基方法(保护和脱保护)是本领域已知的，例如包括在R.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，John Wiley和Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，JohnWiley和Sons(1994)；以及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents forOrganic Synthesis，John Wiley和Sons(1995)及其后续版本中描述的那些。
本发明偶联物可具有非常高的纯度。即，60％或以上(例如，70％、80％或90％)的偶联物分子在所有方面是相同的，包括蛋白部分的序列及其与聚合物部分的结合位置。
本发明偶联物的偶联形式可以是药学活性的。或者，它可以通过酶性裂解蛋白部分和聚合物部分之间的键合而在体内释放药学活性的干扰素α(例如，通过水解)。涉及体内裂解键合的酶的实例包括氧化酶(例如，过氧化酶、胺氧化酶或脱氢酶)、还原酶(例如，酮还原酶)和水解酶(例如，蛋白酶、酯酶、硫酸酯酶或磷酸酶)。
本发明偶联物可用于治疗多发性硬化、慢性病毒感染(例如乙肝病毒感染、丙肝病毒感染和人乳头状瘤病毒感染)、癌症、原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症。其具有意想不到地长的体内半衰期、降低的药物剂量和/或延长的给药间隔。
如本发明所使用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”定义为将包含蛋白-聚合物偶联物的组合物施用或给药于受试者(人或动物)，所述受试者具有疾病、疾病症状、所述疾病继发的疾病或疾患、或患病倾向，目的是治愈、缓解、减轻、补救或改善所述疾病、疾病症状、所述疾病继发的疾病或疾患、或患病倾向。“有效量”是指赋予被治疗受试者治疗效果的蛋白-聚合物偶联物的量。所述治疗效果可以是客观的(即，通过一些试验或标志物测定)或主观的(即，受试者出现效果指征或感觉到效果)。
包含有效量的至少一种上述的蛋白-聚合物偶联物和药学可接受的载体的药物组合物也在本发明范围内。此外，本发明包括将有效量的一种或多种的蛋白-聚合物偶联物给予患有一种或多种疾病的患者的方法。如本领域技术人员所了解，有效剂量将例如取决于蛋白-聚合物偶联物的水解速度、待治疗疾病类型、给药途径、赋形剂使用和与其他治疗法的共同使用的可能性而改变。
为实施本发明方法，含有一种或多种上述化合物的组合物可以胃肠外、口服、经鼻、直肠、局部、或经颊给予。此处使用的术语“胃肠外”是指经皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、损害内、腹内、气管内或颅内注射，以及任何适当的滴注技术。
无菌可注射组合物可以是非毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(例如1，3-丁二醇溶液)中的溶液或悬浮液。可使用的可接受的介质和溶剂是甘露醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质(例如，合成的单甘油酯或甘油二酯)。脂肪酸(例如油酸)及其甘油酯衍生物可用于制备注射制剂，如天然药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液也可包含长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似分散剂。通常用于制备药学可接受的固体、液体或其他剂型的其他的常用表面活性剂例如吐温和司盘或其他类似的乳化剂或生物利用率增强剂也可用于制剂目的。
用于口服给药的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散体和溶液。在片剂情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服给予水悬浮液或乳剂时，活性成分可以悬浮或溶解在添加有乳化剂或悬浮剂的油相中。如果需要，可添加某些甜味剂、矫味剂或着色剂。
鼻气雾剂或吸入组合物可根据药物制剂领域熟知的技术来制备。例如，这种组合物可制成盐溶液，采用苯甲醇或其他适当的防腐剂、提高生物利用率的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂。含有一种或多种上述的化合物的组合物也可以以栓剂形式给予，用于直肠给药。
药学可接受的载体通常和一种或多种上述活性化合物一起使用。药物组合物中的载体必须是“可接受的”，意思是它与所述组合物的活性成分相容(且优选地，能够稳定所述活性成分)且对待治疗受试者无害。其他载体的实例包括胶体二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠和D&C Yellow#10。
适当的试验可用于初步评价上述偶联物在治疗多种疾病中的功效。例如，可以分别根据Kiladjian等人，Blood 2008；112(8)：3065-72和Langer等人，Haetatologica 2005；90：1333-1338描述的方法评价所述偶联物在治疗真性红细胞增多症和原发性血小板增多症中的效果。
以下实施例仅作为说明性解释，而不以任何方式限定本发明的其余部分。无需进一步细节，据信本领域技术人员可以基于本说明书而充分利用本发明。本发明引用的所有出版物以引用方式全部合并于此。
具体实施方式
二-PEG醛的制备
20kD PEGO(C＝O)OSu由从(SunBio Inc.，CA，USA)购买的20kDmPEGOH根据Bioconjugate Chem.1993，4，568-569描述的方法制备。
将6-(1，3-二氧戊环-2-基)己烷-1，5-二胺的二氯甲烷(含有9.03mg二胺的11.97g溶液，47.8μmol)溶液添加到含有20kD PEGO(C＝O)OSu(1.72g，86.0μmol)的烧瓶中。PEGO(C＝O)OSu完全溶解后，添加N，N-二异丙基乙胺(79μL，478μmol)。反应混合物在室温下搅拌24小时，然后在搅拌下滴加甲基叔丁基醚(200mL)。收集所得沉淀并在真空下干燥，生成白色固体状二-PEG缩醛(1.69g，98％)。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ7.16(t，J＝5.2Hz，1H)，7.06(d，J＝8.8Hz，1H)，4.76(t，J＝4.8Hz，1H)，4.10-3.95(m，4H)，1.80-1.65(m，1H)，1.65-1.50(m，1H)，1.48-1.10(m，6H)。
将二-PEG缩醛(4.0g，0.2mmol)悬浮在pH 2.0的缓冲液(柠檬酸，40mL)中。反应混合物在35℃下搅拌24小时，然后以二氯甲烷(3x50mL)萃取。合并的有机层以硫酸镁干燥、浓缩、然后再溶解在二氯甲烷(20mL)中。搅拌下将该溶液滴加至甲基叔丁基醚(400mL)中。收集所得沉淀并减压干燥，生成白色固体状二-PEG醛(3.8g，95％)。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.60(s，1H)，7.24(d，J＝8.4Hz，1H)，7.16(t，J＝5.2Hz，1H)，4.10-3.95(m，4H)，3.95-3.80(m，1H)，3.00-2.85(m，2H)，2.58-2.36(m，2H)，1.46-1.15(m，6H)。
修饰干扰素的制备
修饰的重组人干扰素α-2b通过PCR法采用人基因组DNA作为模板克隆。寡核苷酸基于人干扰素α-2b的侧翼序列(GenBank登录#J00207，2008年1月8日)合成。衍生的PCR产物亚克隆入pGEM-T载体(Promega)中。IFN变种通过pGEM-T克隆再次PCR扩增，随后采用NdeI/BamHI作为克隆位点亚克隆入蛋白表达载体pET-24a(Novagen)(一种T7RNA聚合酶启动子驱动载体)中。然后将载体pET-24a转化到大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Stratagene)菌株。在卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(50μg/mL)存在下通过维持转化的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE 3)-RIL来选择高表达克隆。
在1000mL烧瓶中采用Terrific培养基(BD，200mL)来繁殖带有Pro-IFN基因的BL21-CodonPlus(DE 3)-RIL。烧瓶在37℃下以230rpm振摇16小时。在5升发酵罐(Bioflo 3000；New Brunswick Scientific Co.，Edison，NJ)中进行分批发酵和分批补料发酵。分批发酵使用150mL预培养过夜的接种物和含有卡那霉素(50μg/mL)、氯霉素(50ug/mL)、0.4％甘油和0.5％(v/v)痕量元素(10g/L FeSO4·7H2O、2.25g/L ZnSO4·7H2O、1g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L MnSO4·H2O、0.3g/L H3BO3、2g/L CaCl2·2H2O、0.1g/L(NH4)6Mo7O24、0.84g/LEDTA，50ml/L HCl)的3LTerrific培养基。将溶解氧浓度控制在35％并通过添加5N NaOH水溶液将pH维持在7.2。制备包含600g/L葡萄糖和20g/L的MgSO4·7H2O的补料溶液。当pH升至大于凝结点的值时，添加适当体积的补料溶液以提高培养基中的葡萄糖浓度。Pro-IFN基因的表达通过添加IPTG至最终浓度为1mM来诱导，且在培养3小时后收获培养基。
收集的细胞沉淀用TEN缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，100mM NaCl)以约1∶10(湿重g/mL)的比率重悬，并通过微射流机破裂，然后以10,000rpm离心20分钟。含有包涵体(IB)的沉淀用TEN缓冲液洗涤两次，并如上所述进行离心。然后将含有IB的沉淀悬于150mL 4M的盐酸胍(GuHCl)水溶液中，并以20,000rpm离心15分钟。然后将IB溶解在50mL 6MGuHCl溶液中。GuHCl溶液化材料以20,000rpm离心20分钟。通过以1.5L新鲜制备的复性(Refolding)缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5M L-精氨酸，2mM EDTA)稀释变性IB开始复性，仅在添加期间搅拌。无搅拌下使复性反应混合物培养48小时。以20mM Tris缓冲液(含有2mM EDTA和0.1M尿素，pH 7.0)透析复性重组人干扰素α-2b(即Pro-IFN)，用于通过Q-Sepharose柱色谱法进一步纯化。
将复性重组人蛋白Pro-IFN装载在Q-Sepharose柱(GE AmershamPharmacia，Pittsburgh，PA)上。所述柱用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)预平衡并洗涤。用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)和200mM NaCl的混合物洗脱产物。含有Pro-IFN的馏分基于其在280nm处的吸光率来收集。Pro-IFN的浓度通过蛋白分析试剂盒采用Bradford法(Pierce，Rockford，IL)来测定。
制备蛋白-聚合物偶联物
向上述制备的二-PEG醛(1.2g，0.03mmol)的水(72mL)溶液中添加2M磷酸钠缓冲液(pH 4.0，5mL)和Pro-IFN(200mg于22.2mL pH 7.0的含有20mMTris-HCl和0.2M NaCl的缓冲液中，0.01mmol)。反应混合物在室温下搅拌10分钟；然后添加氰基硼氢钠水溶液(400mM，1.25mL，0.5mmol)。反应混合物在暗处搅拌16小时，并通过SP XL Sepharose层析纯化。含有所需聚合物-蛋白偶联物的馏分基于其保留时间和在280nm处的吸光率来收集。偶联物的浓度通过蛋白分析试剂盒采用Bradford法(Pierce，Rockford，IL)来测定。偶联物的分离产率大致为40％或更高。
其他实施方式
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合结合。本说明书中公开的各特征可以被提供相同、相当或相似目的的选择性特征替代。因此，除非另有说明，所公开的各特征仅是通用系列的相同或相似特征的实例。
从以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的必要特征，并且可以在不脱离其精神和范围的前提下进行本发明的各种变化和修改以使其适应多种用法和条件。因此，其他实施方式也在以下权利要求范围内。

Claims (4)

1.有效量的下式偶联物在制备治疗疾病的药物中的用途：
其中：
IFN代表干扰素α-2b部分，其中IFN的N末端氨基结合至羰基；
mPEG的分子量为20kD；
所述疾病为原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症或原发性血小板增多症。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述疾病是原发性骨髓纤维化。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述疾病是真性红细胞增多症。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述疾病是原发性血小板增多症。
CN201080056068.1A 2009-12-10 2010-12-09 蛋白-聚合物偶联物的治疗用途 Active CN102724980B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28541109P 2009-12-10 2009-12-10
US61/285,411 2009-12-10
PCT/US2010/059714 WO2011072138A2 (en) 2009-12-10 2010-12-09 Therapeutic use of protein-polymer conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102724980A CN102724980A (zh) 2012-10-10
CN102724980B true CN102724980B (zh) 2014-10-15

Family

ID=44146181

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080056068.1A Active CN102724980B (zh) 2009-12-10 2010-12-09 蛋白-聚合物偶联物的治疗用途

Country Status (32)

Country Link
US (1) US8617532B2 (zh)
EP (1) EP2509593B1 (zh)
JP (1) JP5547816B2 (zh)
KR (1) KR101782084B1 (zh)
CN (1) CN102724980B (zh)
AR (1) AR079369A1 (zh)
AU (1) AU2010328067B2 (zh)
BR (1) BR112012014017B1 (zh)
CA (1) CA2782624C (zh)
CL (1) CL2012001503A1 (zh)
CY (1) CY1122901T1 (zh)
DK (1) DK2509593T3 (zh)
EA (1) EA022354B9 (zh)
ES (1) ES2786025T3 (zh)
HK (1) HK1176015A1 (zh)
HR (1) HRP20200678T1 (zh)
HU (1) HUE049051T2 (zh)
IL (1) IL220249A0 (zh)
LT (1) LT2509593T (zh)
MA (1) MA33913B1 (zh)
MX (1) MX337705B (zh)
MY (1) MY169961A (zh)
NZ (1) NZ600528A (zh)
PL (1) PL2509593T3 (zh)
PT (1) PT2509593T (zh)
RS (1) RS60336B1 (zh)
SG (1) SG181084A1 (zh)
SI (1) SI2509593T1 (zh)
TN (1) TN2012000256A1 (zh)
UA (1) UA109646C2 (zh)
WO (1) WO2011072138A2 (zh)
ZA (1) ZA201205056B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530403A (zh) * 2014-11-06 2018-01-02 药华医药股份有限公司 用于长效型干扰素的剂量方案

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1630530A (zh) * 2002-01-18 2005-06-22 比奥根艾迪克Ma公司 聚亚烷基聚合物及其用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7563810B2 (en) * 2002-11-06 2009-07-21 Celgene Corporation Methods of using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myeloproliferative diseases
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
CN101636414B (zh) * 2007-09-04 2012-02-15 厦门伯赛基因转录技术有限公司 聚乙二醇修饰的干扰素α2b及其制备方法和应用
GB0908393D0 (en) * 2009-05-15 2009-06-24 Almac Sciences Scotland Ltd Labelling method

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1630530A (zh) * 2002-01-18 2005-06-22 比奥根艾迪克Ma公司 聚亚烷基聚合物及其用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENOTYPE-PHENOTYPE RELATIONSHIPS IN CYSTIC FIBROSIS;John E.Mickle et al;《MEDICAL CLINICS OF NORTH AMERICA》;20000531;第84卷(第3期);第597-607页 *
Jean-Jacques Kiladjian et al.pegylated interferon-alpha-2a induces complete hematologic and molecular responses with low toxicity in polycythemia vera.《BLOOD》.2008,第112卷(第8期),第3065-3072页.
John E.Mickle et al.GENOTYPE-PHENOTYPE RELATIONSHIPS IN CYSTIC FIBROSIS.《MEDICAL CLINICS OF NORTH AMERICA》.2000,第84卷(第3期),第597-607页.
pegylated interferon-alpha-2a induces complete hematologic and molecular responses with low toxicity in polycythemia vera;Jean-Jacques Kiladjian et al;《BLOOD》;20080723;第112卷(第8期);第3065-3072页 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530403A (zh) * 2014-11-06 2018-01-02 药华医药股份有限公司 用于长效型干扰素的剂量方案

Also Published As

Publication number Publication date
CA2782624C (en) 2016-11-01
KR101782084B1 (ko) 2017-09-26
EA201200865A1 (ru) 2012-11-30
HK1176015A1 (zh) 2013-07-19
MX2012006132A (es) 2012-06-19
TN2012000256A1 (en) 2013-12-12
JP2013513611A (ja) 2013-04-22
BR112012014017A2 (pt) 2016-04-12
HRP20200678T1 (hr) 2020-10-02
CN102724980A (zh) 2012-10-10
PT2509593T (pt) 2020-04-21
CL2012001503A1 (es) 2012-11-09
BR112012014017B1 (pt) 2021-10-26
AR079369A1 (es) 2012-01-18
LT2509593T (lt) 2020-05-25
KR20120110105A (ko) 2012-10-09
ZA201205056B (en) 2013-03-27
IL220249A0 (en) 2012-07-31
RS60336B1 (sr) 2020-07-31
EP2509593A4 (en) 2016-01-13
WO2011072138A9 (en) 2011-10-06
EA022354B1 (ru) 2015-12-30
MA33913B1 (fr) 2013-01-02
EP2509593B1 (en) 2020-02-12
MY169961A (en) 2019-06-19
AU2010328067B2 (en) 2014-10-02
UA109646C2 (uk) 2015-09-25
SI2509593T1 (sl) 2020-07-31
MX337705B (es) 2016-03-15
SG181084A1 (en) 2012-07-30
PL2509593T3 (pl) 2020-08-24
CA2782624A1 (en) 2011-06-16
AU2010328067A1 (en) 2012-07-05
US8617532B2 (en) 2013-12-31
JP5547816B2 (ja) 2014-07-16
CY1122901T1 (el) 2021-05-05
ES2786025T3 (es) 2020-10-08
NZ600528A (en) 2014-01-31
WO2011072138A2 (en) 2011-06-16
HUE049051T2 (hu) 2020-09-28
EA022354B9 (ru) 2016-02-29
EP2509593A2 (en) 2012-10-17
DK2509593T3 (da) 2020-05-11
US20110262380A1 (en) 2011-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101405024B (zh) 药物-聚合物的结合物
CN101367872B (zh) 蛋白质-聚合物缀合物
CN102724980B (zh) 蛋白-聚合物偶联物的治疗用途
JP5798628B2 (ja) ウシ顆粒球コロニー刺激因子のための製剤およびその変異体
TWI421093B (zh) 胜肽－聚合物綴合物
CN103933577B (zh) 重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1176015

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1176015

Country of ref document: HK