KR20120110105A - 단백질-고분자 접합체의 치료적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특발성 골수섬유증(idiopathic myelofibrosis), 진성 적혈구 증다증(polycythaemia vera), 및 본태성 혈소판 증가증(essential thromobocythaemia)을 포함하는 다양한 질병을 치료하기 위한 명세서 내에 기재된 단백질-고분자 접합체의 용도에 관한 것이다.

Description

단백질-고분자 접합체의 치료적 용도{THERAPEUTIC USE OF PROTEIN-POLYMER CONJUGATES}
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2009년 12월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/285,411호의 이익을 주장하고, 이의 내용 전부는 본 명세서에 포함된다.
세포 생물학 및 재조합 단백질 기술의 발전은 단백질 치료제의 개발을 이끌었다.
그러나, 여전히 주요 장애가 존재한다. 대부분의 단백질은 단백질 가수분해 저하에 민감할 수 있으며, 따라서 순환 시스템의 짧은 반감기를 가지고 있다. 다른 단점은 낮은 수 용해도 및 중화 항체의 유도를 포함한다.
단백질에 고분자, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 부착은 단백질 골격에 단백질 가수분해 효소의 접근을 방해하여 단백질의 안정성을 향상시킨다. 또한, 이것은 수 용해도를 향상시키고 면역원성을 최소화시킨다. 단백질에 고분자를 부착하는 효과적인 방법이 필요하다.
개요
본 발명의 양상은 다양한 질병을 치료하기 위한 단백질-고분자 접합체의 용도에 관한 것이다. 접합체는 적어도 하나의 고분자 부분(moiety), 인터페론-α 부분, 및 링커를 함유한다. 접합체의 총 분자량은 2-200kD (바람직하게는 40kD)이고 접합체 내 고분자 부분의 수는 10 미만이다. 고분자 부분 또는 부분들은 링커에 부착되어 있고; 인터페론-α 부분의 N-말단의 질소 원자는 링커에 결합되어 있으며; 링커는 공유결합, C1 -10 알킬렌, C2 -10 알케닐렌, 또는 C2 -10 알키닐렌이다. 바람직하게는, 접합체는 70%, 80% 또는 90% 이상의 순도를 갖는 실질적으로 순수하다. 접합체에 의해 치료될 수 있는 질병은 다발성 경화증, 만성 바이러스 감염증 (B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 및 인유두종 바이러스 감염과 같은), 암, 특발성 골수섬유증(idiopathic myelofibrosis), 진성 적혈구 증다증(polycythaemia vera), 및 본태성 혈소판 증가증(essential thromobocythaemia)을 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 상기 언급된 질병을 치료하기 위한 하기에 나타낸 화학식 Ⅰ의 단백질-고분자 접합체의 용도에 관한 것이다.
[화학식 Ⅰ]
Figure pct00001
여기서, R1, R2, R3, R4, 및 R5는 각각 독립적으로 H, C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐, C2-5 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3 -8 시클로알킬, 또는 C3 -8 헤테로시클로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 고분자 부분이고;
G1, G2, 및 G3는 각각 독립적으로 결합(bond) 또는 결합 작용기(linking functional group)이고;
P는 인터페론-α 부분이고;
m은 0 또는 1-10의 정수이고; 및
n은 1-10의 정수이다.
상기 화학식과 관련하여, 단백질-고분자 접합체는 하나 이상의 하기 특징을 가질 수 있다: G3는 결합이고, P는 N-말단의 아미노기가 G3에 부착되어 있는 인터페론-α 부분이고; A1 및 A2는 2-100kD (바람직하게는 10-30kD)의 분자량을 갖는 폴리알킬렌 옥사이드 부분이며, G1 및 G2는 각각
Figure pct00002
이고 (여기서, O는 A1 또는 A2에 부착되어 있고, NH는 화학식 Ⅰ에 나타난 바와 같이 탄소 원자에 부착되어 있음), 또는 G1 및 G2는 각각 우레아, 설폰아미드, 또는 아미드 (여기서, N은 화학식 Ⅰ에 나타난 바와 같이 탄소 원자에 부착되어 있음)이고; m은 4이고, n은 2이고, R1, R2, R3, R4, 및 R5는 각각 H이고, P는 1-4 추가 아미노산 잔기를 함유하는 변형된 인터페론-α 부분이다.
용어 "알킬(alkyl)"은 1가 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 나타낸다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, tert-부틸, 및 n-펜틸을 포함한다. 유사하게, 용어 "알케닐(alkenyl)" 또는 "알키닐(alkynyl)"은 하나 이상의 C=C 이중 결합 또는 하나 이상의 C≡C 삼중 결합을 함유하는 1가 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 나타낸다.
용어 "알킬렌(alkylene)"은 2가 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 나타낸다. 유사하게, 용어 "알케닐렌(alkenylene)" 또는 "알키닐렌(alkynylene)"은 하나 이상의 C=C 이중 결합 또는 하나 이상의 C≡C 삼중 결합을 함유하는 2가 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 나타낸다.
용어 "아릴(aryl)"은 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 탄화수소 고리계(단일-원(mono-cyclic) 또는 두-원(bi-cyclic))를 나타낸다. 아릴 부분의 예는 페닐, 나프틸, 및 피레닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "헤테로아릴(heteroaryl)"은 고리계의 일부로서 O, N, 또는 S와 같은 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 나머지는 탄소를 함유하는 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 탄화수소 고리계(단일-원 또는 두-원)를 나타낸다. 헤테로아릴 부분의 예는 푸릴, 피롤릴, 티에닐, 옥사졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 피리디닐, 피리미디닐, 퀴날졸릴, 및 인돌릴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "시클로알킬(cycloalkyl)"은 탄소 고리 원자만을 갖는 부분적 또는 완전 포화 단일-원 또는 두-원 고리계를 나타낸다. 시클로알킬의 예는 시클로프로파닐, 시클로펜타닐, 및 시클로헥사닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "헤테로시클로알킬(heterocycloalkyl)"은 고리 원자로서 탄소 외에, 하나 이상의 헤테로원자(예를 들어, O, N, 또는 S)를 갖는 부분적 또는 완전 포화 단일-원 또는 두-원 고리계를 나타낸다. 헤테로시클로알킬의 예는 피페리딘, 피페라진, 모폴린, 티오모폴린, 및 1,4-옥사제판을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 언급된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 및 헤테로시클로알킬은 치환 및 비치환 부분을 모두 포함한다. 치환체의 예는 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C16 알키닐, C3-C8 시클로알킬, C5-C8 시클로알케닐, C1-C10 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 아미노, C1-C10 알킬아미노, C1-C20 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 히드록시아미노, 알콕시아미노, C1-C10 알킬설폰아미드, 아릴설폰아미드, 히드록시, 할로겐, 티오, C1-C10 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 카복실, 및 카복실릭 에스터를 포함한다.
용어 "폴리알킬렌 옥사이드 부분(polyalkylene oxide moiety)"은 선형, 분지, 또는 별-모양의 폴리알킬렌 옥사이드로부터 유도된 1가 라디칼을 나타낸다. 폴리알킬렌 옥사이드 부분의 분자량은 2-100kD일 수 있다. 폴리알킬렌 옥사이드 부분은 포화 또는 불포화이다. 폴리알킬렌 옥사이드 부분의 예는 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리이소프로필렌 옥사이드, 폴리부테닐렌 옥사이드, 및 이의 공중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들이 항원성, 독성, 또는 면역 반응을 야기하지 않는 한, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 또는 탄수화물계 고분자와 같은 다른 고분자도 폴리알킬렌 옥사이드 부분을 대체하기 위해 사용될 수 있다. 폴리알킬렌 옥사이드 부분은 치환 또는 비치환이다. 예를 들어, 이것은 mPEG(methoxy-capped polyethylene glycol)일 수 있다.
용어 "인터페론-α 부분(interferon-a moiety)"은 인터페론-α로부터 유도된 1가 라디칼을 나타낸다. "인터페론-α"는 바이러스 복제 및 세포 증식을 저해하고, 면역 반응을 조절하는 매우 상동적인 종-특이적 단백질의 과(family)를 나타낸다. 참조 Bonnem et al., J. Biol. Response Mod., 1984, 3(6):580-598; 및 Finter, J. Hepatol., 1986, 3 Suppl 2:S157-160. 이는 자연적으로 발생하거나 또는 변형된 형태일 수 있다. 변형된 인터페론-α는 인터페론-α 및 인터페론의 N-말단의 1-4 추가 아미노산 잔기를 함유하는 단백질일 수 있다. 이러한 변형된 인터페론의 예는 카보닐기에 결합된 N-말단의 아미노기인 인터페론-α2b 부분을 표시하는 IFN인,
Figure pct00003
이다.
Schering Corporation, Kenilworth, N.J.에 의해 제공된 인트론-A 인터페론, Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J.에 의해 제공된 로페론 인터페론, Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, Conn.에 의해 제공된 베로포 알파 2 인터페론(Berofor alpha 2 interferon), Sumitomo, Japan에 의해 제공된 수미페론 (Sumiferon), 및 Glaxo-Wellcome Ltd., London, Great Britain에 의해 제공된 웰페론 인터페론 알파-n1(Wellferon interferon alpha-n1, INS)을 포함하는 많은 종류의 인터페론-α 단백질이 시판되고 있다.
전구체형 또는 성숙형의 5개의 대표적인 인간 인터페론-α 단백질의 아미노산 서열을 하기에 열거한다.
maltfallva llvlsckssc svgcdlpqth slgsrrtlml laqmrrislf sclkdrhdfg fpqeefgnqf qkaetipvlh emiqqifnlf stkdssaawd etlldkfyte lyqqlndlea cviqgvgvte tplmkedsil avrkyfqrit lylkekkysp cawevvraei mrsfslstnl qeslrske 서열번호: 1
(참조 Krasagakis et al., Cancer Invest. 26 (6), 562-568, 2008)
cdlpqthslg srrtlmllaq mrkislfscl kdrhdfgfpq eefgnqfqka etipvlhemi qqifnlfstk dssaawdetl ldkfytelyq qlndleacvi qgvgvtetpl mkedsilavr kyfqritlyl kekkyspcaw evvraeimrs fslstnlqes lrske 서열번호: 2
(참조 Klaus, et al., J. Mol. Biol. 274 (4), 661-675, 1997)
mcdlpqthsl gsrrtlmlla qmrrislfsc lkdrhdfgfp qeefgnqfqk aetipvlhem iqqifnlfst kdssaawdet lldkfytely qqlndleacv iqgvgvtetp lmkedsilav rkyfqritly lkekkyspca wevvraeimr sfslstnlqe slrske 서열번호: 3
(참조 GenBank Accession Number AAP20099, the 30-APR-2003 version.)
mallfpllaa lvmtsyspvg slgcdlpqnh gllsrntlvl lhqmrrispf lclkdrrdfr fpqemvkgsq lqkahvmsvl hemlqqifsl fhterssaaw nmtlldqlht elhqqlqhle tcllqvvgeg esagaisspa ltlrryfqgi rvylkekkys dcawevvrme imkslflstn mqerlrskdr dlgss 서열번호: 4
(참조 Capon et al., J. Mol. Cell. Biol. 5 (4):768-779, 1985)
lsyksicslg cdlpqthslg nrralillaq mgrispfscl kdrhdfglpq eefdgnqfqk tqaisvlhem iqqtfnlfst edssaaweqs llekfstely qqlnnleacv iqevgmeetp lmnedsilav rkyfqritly ltekkyspca wevvraeimr slsfstnlqk rlrrkd 서열번호: 5
(참조 Lund et al., J. Interferon Res. 5 (2), 229-238, 1985)
하나의 실시예에서, 본 발명의 접합체의 제조에 사용된 인터페론-α 단백질은 상기 열거된 아미노산 서열 중 하나에 또는 성숙 인터페론 알파에 상응하는 이의 단편에 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
2개의 아미노산 서열의 "상동 비율(percent identity)"은 Karlin 및 Altschul Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90:5873-77, 1993에서 변형된 Karlin 및 Altschul Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:2264-68, 1990의 알고리즘을 이용하여 결정하였다. 이러한 알고리즘은 Altschul, et al . J. Mol . Biol . 215:403-10, 1990의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(version 2.0)에 포함된다. BLAST 단백질 탐색은 점수=50, 워드길이(wordlength)=3인 XBLAST 프로그램을 수행하여 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 경우, Gapped BLAST는 Altschul et al ., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수(default parameter)가 사용될 수 있다.
용어 "결합 작용기(linking functional group)"는 고분자 부분에 연결된 하나의 말단 및 단백질 부분에 연결된 다른 말단인 2가 작용기를 나타낸다. 이의 예는 -O-, -S-, 카복실릭 에스터, 카보닐, 카보네이트, 아미드, 카바메이트, 우레아, 설포닐, 설피닐, 아미노, 이미노, 히드록시아미노, 포스포네이트, 또는 포스페이트 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
만일 적용된다면, 상기 기재된 단백질-고분자 접합체는 유리 형태 또는 염의 형태일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질-고분자 접합체에 있는 음이온 및 양전하 기(예를 들어, 아미노) 사이에서 염이 형성될 수 있다. 적당한 음이온은 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 설페이트, 니트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 메탄설포네이트, 트리플루오로아세테이트, 및 아세테이트를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 단백질-고분자 접합체에 있는 양이온 및 음전하 기(예를 들어, 카복실레이트) 사이에서도 염이 형성될 수 있다. 적당한 양이온은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 및 테트라메틸암모늄 이온과 같은 암모늄 양이온을 포함한다.
또한, 단백질-고분자 접합체는 하나 이상의 이중 결합, 또는 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있다. 이러한 접합체는 라세미체, 라세믹 혼합물, 단일 에난티오머, 각각의 부분입체이성질체, 부분입체이성질체 혼합물, 및 시스- 또는 트랜스- 또는 E- 또는 Z-이중 결합 이성질체 형태로 발생할 수 있다.
본 발명의 단백질-고분자 접합체의 예는 하기에 나타낸다:
Figure pct00004
여기서, mPEG는 20kD의 분자량을 가지고, IFN은 인터페론-α2b 부분이다.
또한, 상기 언급된 질환 중 하나를 치료하기 위한 약제의 제조용 접합체의 용도도 본 발명의 범위 내이다.
발명의 하나 이상의 실시예의 세부 사항은 하기의 설명에 명시되어 있다. 발명의 기타 특징, 목적, 및 장점은 설명과 청구항으로부터 명백할 것이다.
본 발명을 실행하기 위해 사용된 단백질-고분자 접합체는 화학 문헌에 잘 알려진 합성 방법, 예를 들어 U.S. 일련 번호 제 12/192,485호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 반응식 1은 본 발명의 단백질-고분자 접합체의 제조예를 나타낸다. 아세틸기를 함유하는 디아민 화합물 1을 N-히드록시석신이미딜 카보네이트 mPEG(즉, 화합물 2)와 반응시켜 디-페그(PEGylated) 화합물 3을 형성하고, 이후 알데히드 4로 전환된다. 이 알데히드 화합물은 환원성 알킬화를 통해 유리 아미노기를 갖는 단백질과 반응하여 본 발명의 단백질-고분자 접합체를 제공한다.
[반응식 1]
Figure pct00005
이렇게 합성된 단백질-고분자 접합체는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 전기영동, 투석, 한외 여과(ultrafiltration), 또는 초원심분리와 같은 방법으로 더 정제될 수 있다.
상기 기재된 화학 반응은 용매, 시약, 촉매, 보호기 및 탈보호기 시약, 및 특정 반응 조건을 이용하는 것을 포함한다. 궁극적으로 단백질-고분자 접합체의 합성을 허여하기 위해, 본 명세서에 상세히 기재된 단계 전 또는 후에 적당한 보호기를 추가 또는 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 다양한 합성 단계를 교대 순서 또는 순서로 수행하여 바람직한 단백질-고분자 접합체를 제공할 수 있다. 적용할 수 있는 단백질-고분자 접합체의 합성에 유용한 합성 화학 변환 및 보호기 방법(보호 및 탈보호)은 기술분야에서 알려져 있으며, 예를 들어, R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); 및 L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) 및 이의 후 판(subsequent edition)에 기재된 방법을 포함한다.
본 발명의 접합체는 매우 높은 순도를 가질 수 있다. 즉, 60% 이상(예를 들어, 70%, 80%, 또는 90%)의 접합체 분자는 단백질 부분의 서열 및 고분자 부분의 이의 결합 위치를 포함하는 모든 양상에서 동일하다.
본 발명의 접합체는 접합체 형태로 약학적으로 활성일 수 있다. 대안적으로, 단백질 부분과 고분자 부분 사이의 결합을 효소적으로 절단하여(예를 들어, 가수분해를 통해) in vivo에서 약학적으로 활성 인터페론-α를 방출할 수 있다. in vivo 절단 결합에 포함된 효소의 예는 산화적 효소(예를 들어, 퍼옥시다제, 아민 옥시다제, 또는 탈수소효소), 환원적 효소(예를 들어, 케토 환원제), 및 가수분해 효소(예를 들어, 프로테아제, 에스터라제, 설파타제, 또는 포스파타제)를 포함한다.
본 발명의 접합체는 다발성 경화증, 만성 바이러스 감염증 (B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 및 인유두종 바이러스 감염과 같은), 암, 특발성 골수섬유증, 진성 적혈구 증다증, 및 본태성 혈소판 증가증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 놀랍게도 긴 in vivo 반감기, 감소된 약물 용량, 및/또는 장기의 투여 간격을 가진다.
본 명세서에 사용된 대로, 용어 "치료하는(treating)" 또는 "치료 (treatment)"는 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인(predisposition)을 치료, 경감, 완화, 요법(remedy), 또는 향상하기 위한 목적과 함께 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인을 갖는 피험자(인간 또는 동물)에게 단백질-고분자 접합체를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여로 정의된다. "유효량(An effective amount)"은 치료받는 피험자에게 치료 효과를 부여하는 단백질-고분자 접합체의 양을 나타낸다. 치료 효과는 객관적(즉, 어떤 시험 또는 마커에 의해 측정할 수 있음) 또는 주관적(즉, 피험자가 효과의 징후를 나타내거나 또는 느낌)일 수 있다.
또한, 적어도 하나의 상기 기재된 단백질-고분자 접합체의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물도 본 발명의 범위 내이다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 질병에 걸린 환자에게 하나 이상의 단백질-고분자 접합체의 유효량을 투여하는 방법을 포함한다. 유효량은 기술분야에서 숙련된 자에 의해 인식된 바와 같이, 단백질-고분자 접합체의 가수분해율, 치료된 질병의 종류, 투여 경로, 부형제 사용량, 및 다른 치료제와 공동-사용의 가능성에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 방법을 실행하기 위해, 하나 이상의 상기 언급된 화합물을 갖는 조성물은 비경구, 경구, 비강, 직장, 국소, 또는 구강으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 대로, 용어 "비경구(parenteral)"는 피하, 피내(intracutaneous), 정맥내, 근육내, 관절내(intraarticular), 동맥내, 활액내(intrasynovial), 흉골내 (intrasternal), 수막강내(intrathecal), 병변내(intralesional), 복강내, 기관내 (intratracheal) 또는 두개강내(intracranial) 주사, 및 어느 적당한 주입기술 (infusion technique)을 나타낸다.
멸균 주사 조성물은 1,3-부탄디올 용액과 같은 비-독성 비경구적으로 허용가능한 희석액 또는 용매의 용액 또는 현탁액일 수 있다. 허용가능한 비히클 및 용매 중에서 만니톨, 물, 링거 용액, 및 등장성 염화나트륨 용액이 사용될 수 있다. 또한, 고정된 오일은 용매 또는 현탁 매질(예를 들어, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드)로서 전통적으로 사용된다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산은 올리브 오일 또는 피마자유와 같은 천연 약학적으로 허용가능한 오일로서 주사가능한 제제, 특히 이의 폴리옥시에틸화 형태로 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액 또한 긴 사슬 알콜 희석액 또는 분산제, 또는 카복시메틸 셀룰로오스, 또는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. 트윈 또는 스판과 같은 다른 통상적으로 사용된 계면활성제 또는 기타 유사한 에멀젼화제 또는 약학적으로 허용가능한 고체, 액체, 또는 기타 복용 형태의 제조에서 통상적으로 사용된 생체이용률 인핸서 또한 제형의 목적을 위해 사용될 수 있다.
경구 투여용 조성물은 캡슐, 정제, 에멀젼, 및 수성 현탁액, 분산액, 및 용액을 포함한 경구적으로 허용가능한 복용 형태일 수 있다. 정제의 경우, 통상적으로 사용된 담체는 락토오스 및 옥수수 전분을 포함한다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 또한 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해 유용한 희석제는 락토오스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액 또는 에멀젼이 경구로 투여된 경우, 활성 성분은 에멀젼화제 또는 현탁제와 함께 결합된 오일 상에 현탁될 수 있거나 또는 용해될 수 있다. 원하는 경우, 특정 감미료, 향료, 또는 착색제를 첨가할 수 있다.
비강 에어로졸 또는 흡입 조성물은 약학적 제형의 기술분야에서 잘 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 벤질 알콜 또는 다른 적당한 보존제, 생체이용률을 향상시키는 흡수 프로모터, 플루오로카본, 및/또는 기술분야에서 알려진 다른 용해제 또는 분산제를 사용하여 소금물 용액으로 제조될 수 있다. 하나 이상의 상기 기재된 화합물을 갖는 조성물도 직장 투여를 위해 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 하나 이상의 상기 언급된 화합물과 함께 일상적으로 사용된다. 약학적 조성물에서 담체는 조성물의 활성 성분과 호환될 수 있고 (바람직하게는, 활성 성분을 안정화시킬 수 있는) 치료받는 피험자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능한(acceptable)"임에 틀림없다. 하나 이상의 용해제는 상기 언급된 화합물의 전달을 위해 약학적 부형제로서 이용될 수 있다. 기타 담체의 예는 콜로이드성 실리콘 옥사이드, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 소듐 라우릴 설페이트, 및 D&C Yellow # 10을 포함한다.
다양한 질병 치료에서 상기 기재된 접합체의 효능을 미리 평가하기 위해 적당한 어세이를 사용할 수 있다. 예를 들어, Kiladjian et al., Blood　2008; 112(8): 3065-72 및 Langer et al., Haetatologica 2005; 90: 1333-1338에 각각 기재된 방법으로 진성 적혈구 증다증 및 본태성 혈소판 증가증 치료에서 접합체의 효능을 평가할 수 있다.
하기의 실시예는 단지 예시적인 것일 뿐, 어떠한 방법으로 명세서의 나머지를 한정하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 더 이상 상술하지 않고, 기술분야에서 숙련된 자는 본 명세서의 설명을 기준으로 본 발명을 충분히 이용할 수 있다고 생각된다. 본 명세서에 인용된 모든 공개본은 이들의 전체 참조로 통합된다.
디- PEG 알데히드의 제조
Figure pct00006
20 kD PEGO(C=O)OSu는 (SunBio Inc., CA, USA)로부터 구입된 20 kD mPEGOH로부터 Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569에 기재된 방법에 따라 제조되었다.
디클로로메탄 내 6-(1,3-디옥솔란-2-일)헥산-1,5-디아민의 용액(9.03 mg의 디아민을 함유하는 11.97　g의 용액, 47.8 μmol)을 20 kD PEGO(C=O)OSu (1.72 g, 86.0 μmol)를 함유하는 플라스크에 가하였다. PEGO(C=O)OSu를 완전히 용해시킨 후, N,N-디이소프로필에틸아민(79 μL, 478 μmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한 다음, 메틸 t-부틸 에테르 (200 mL)를 교반하면서 방울방울 가하였다. 결과로 생긴 침전물을 모으고 진공 하에 건조하여 백색 고체의 디-PEG 아세탈(1.69 g, 98%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 7.16 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.76 (t, J = 4.8 Hz, 1 H), 4.10-3.95 (m, 4 H), 1.80-1.65 (m, 1 H), 1.65-1.50 (m, 1 H), 1.48-1.10 (m, 6　H).
Figure pct00007
디-PEG 아세탈(4.0 g, 0.2 mmol)을 pH 2.0 완충액 (시트르산, 40　mL)에 현탁시켰다. 반응 혼합물을 35℃에서 24시간 동안 교반한 다음, 디클로로메탄 (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 모아진 유기층을 마그네슘 설페이트로 건조하고, 농축한 다음 디클로로메탄 (20 mL)에 재-용해시켰다. 용액을 메틸 t-부틸 에테르 (400 mL)에 교반하면서 방울방울 가하였다. 결과로 생긴 침전물을 모으고, 감압 하에 건조하여 백색 고체의 디-PEG 알데히드 (3.8 g, 95%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 9.60 (s, 1 H), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.16 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 4.10-3.95 (m, 4 H), 3.95-3.80 (m, 1 H), 3.00-2.85 (m, 2 H), 2.58-2.36 (m, 2 H), 1.46-1.15 (m, 6 H).
변형된 인터페론의 제조
Figure pct00008
변형된 재조합 인간 인터페론-α2b는 주형으로 인간 게놈 DNA를 이용하여 PCR 방법으로 클론되었다. 올리고뉴클레오티드는 인간 인터페론-α2b(GenBank Accession # J00207, January 8, 2008)의 인접서열(flanking sequence)을 기준으로 합성되었다. 유도된 PCR 산물을 pGEM-T 벡터(Promega)로 서브클론하였다. IFN 변이체를 pGEM-T 클론을 통해 다시 PCR 증폭시키고 이어서 클로닝 사이트로 NdeI/BamHI를 이용하여 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 기반 벡터인 단백질 발현 벡터 pET-24a (Novagen)로 서브클론 하였다. 그 다음, 벡터 pET-24a를 E. coli BL21-CodonPlus(DE　3)-RIL (Stratagene) 균주로 형질전환하였다. 카나마이신 (50 ㎍/mL) 및 클로람페니콜 (50 ㎍/mL) 존재 하에 형질전환된 E. coli BL21-CodonPlus(DE　3)-RIL를 유지시켜 과발현 클론을 선별하였다.
1000 mL 플라스크에서 Pro-IFN 유전자를 갖는 BL21-CodonPlus(DE　3)-RIL의 증식을 위해 terrific broth medium (BD, 200 mL)를 사용하였다. 플라스크를 230 rpm에서 37℃에서 16시간 동안 흔들었다. 배치 및 유가식 발효(fed-batch fermentation)를 5-리터 액침배양조(jar fermentor) (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에서 수행하였다. 배치 발효는 150 mL의 밤새 전배양 접종물(overnight preculture inoculum) 및 카나마이신(50　㎍/mL), 클로람페니콜 (50 ㎍/mL), 0.4% 글리세롤, 및 0.5% (v/v) 미량 원소 (10 g/L의 FeSO4?7H2O, 2.25 g/L의 ZnSO4?7H2O, 1 g/L의 CuSO4?5H2O, 0.5 g/L의 MnSO4?H2O, 0.3　g/L의 H3BO3, 2 g/L의 CaCl2?2H2O, 0.1　g/L의 (NH4)6Mo7O24, 0.84 g/L EDTA, 50 ml/L HCl)를 포함한 3 L의 Terrific broth를 사용하였다. 용해된 산소 농도는 35%로 조절되었고, pH는 5 N NaOH 수용액을 가하여 7.2로 유지하였다. 600 g/L의 글루코오스 및 20 g/L의 MgSO4?7H2O를 함유하는 피딩 용액(feeding solution)을 제조하였다. pH를 설정점 (set point)보다 더 큰 값으로 올린 경우, 적당한 부피의 피딩 용액을 가하여 배양 배지(culture broth) 내 글루코오스 농도를 증가시켰다. 1mM의 최종 농도로 IPTG를 가하여 Pro-IFN 유전자의 발현을 유도하고, 3시간 동안 배양한 후 배양 배지를 수확하였다. 대략 1:10 비율(습윤 중량 g/mL)로 모아진 세포 펠렛을 TEN 완충액(50 mM Tris-HCl (pH　8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl)에 재현탁시키고, 고압 유화기 (microfluidizer)로 분쇄한 다음 10,000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 상기 기재된 대로 봉입체(inclusion body, IB)를 함유하는 펠렛을 TEN 완충액으로 2번 세척하고 원심분리하였다. 그 다음, IB를 함유하는 펠렛을 150 mL의 4 M 구아니디움 HCl(GuHCl) 수용액에 현탁시키고 20,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 그 다음, IB를 50 mL의 6 M GuHCl 용액에 용해시켰다. GuHCl 용해된 물질을 20,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 가하는 동안만 교반하여 1.5 L의 새로 제조된 리폴딩 완충액 (refolding buffer) (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M L-아르기닌, 2 mM EDTA)에서 변성된 IB를 희석시켜 리폴딩을 시작하였다. 리폴딩 반응 혼합물을 교반 없이 48시간 동안 배양하였다. Q-세파로오스 컬럼 크로마토그래피로 더 정제하는 동안 리폴딩된 재조합 인간 인터페론-α2b(즉, Pro-IFN)를 20　mM Tris 완충액 (2 mM EDTA 및 0.1M 우레아, pH 7.0)에 대해 투석하였다.
리폴딩된 재조합 인간 단백질 Pro-IFN을 Q-세파로오스 컬럼(GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA) 위에 로딩하였다. 컬럼은 미리 평형을 유지하고 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)로 세척하였다. 생성물을 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 및 200 mM NaCl의 혼합물로 용출하였다. Pro-IFN을 함유하는 분획을 280 nm에서 이의 흡광도를 기준으로 모았다. Pro-IFN의 농도를 Bradford 방법 (Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 단백질 어세이 키트로 측정하였다.
단백질-고분자 접합체의 제조
Figure pct00009
물 (72　mL) 내 상기 제조된 디-PEG 알데히드 (1.2 g, 0.03 mmol) 용액에 2 M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 4.0, 5 mL) 및 Pro-IFN (20 mM Tris-HCl 및 0.2M NaCl을 함유하는 pH 7.0 완충액 22.2 mL 내 200 mg, 0.01 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음; 소듐 시아노보로하이드라이드 수용액 (400 mM, 1.25 mL, 0.5 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 어둠 속에서 16시간 동안 교반하고, SP XL 세파로오스 크로마토그래피로 정제하였다. 바람직한 고분자-단백질 접합체를 함유하는 분획을 이의 보유시간(retention time) 및 280 nm에서의 흡광도를 기준으로 모았다. 접합체의 농도는 Bradford 방법 (Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 단백질 어세이 키트로 측정하였다. 접합체의 분리된 수율은 대략 40% 또는 그 이상이었다.
기타 실시예
본 명세서에 기재된 모든 특성은 어느 조합으로 결합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 각 특성은 동일, 등가, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안 특성으로 대체될 수 있다. 따라서, 명확히 별도의 언급이 없는 한, 기재된 각 특성은 단지 포괄적인 일련의 등가 또는 유사한 특성의 예이다.
상기 설명으로부터, 기술분야에서 숙련된 자는 본 발명의 본질적인 특성을 용이하게 확인할 수 있으며, 이의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 발명의 다양한 변화 및 변형을 다양한 사용 및 조건에 적응할 수 있다. 따라서, 기타 실시예도 하기 청구항의 범위 내에 있다.

Claims (16)

  1. 적어도 하나의 고분자 부분, 단백질 부분, 및 링커를 갖는 실질적으로 순수한 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료 방법으로서, 적어도 하나의 고분자 부분은 링커에 부착되어 있고, 단백질 부분의 N-말단의 질소 원자는 링커에 결합되어 있으며, 링커는 공유결합, C1 -10 알킬렌, C2 -10 알케닐렌, 또는 C2 -10 알키닐렌이고, 단백질 부분은 인터페론-α 부분이고; 질병은 특발성 골수섬유증(idiopathic myelofibrosis), 진성 적혈구 증다증 (polycythaemia vera), 또는 본태성 혈소판 증가증(essential thromobocythaemia)인 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단백질 부분은 N-말단의 1-4 추가 아미노산 잔기를 함유하는 변형된 인터페론-α2b 부분인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 접합체의 순도는 70% 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 질병은 특발성 골수섬유증인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 질병은 진성 적혈구 증다증인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 질병은 본태성 혈소판 증가증인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 화학식 Ⅰ의 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료 방법으로서, 질병은 특발성 골수섬유증, 진성 적혈구 증다증, 또는 본태성 혈소판 증가증인 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법:
    [화학식 Ⅰ]
    Figure pct00010

    여기서, R1, R2, R3, R4, 및 R5는 각각 독립적으로 H, C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐, C2-5 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3 -8 시클로알킬, 또는 C3 -8 헤테로시클로알킬이고;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 고분자 부분이고;
    G1, G2, 및 G3는 각각 독립적으로 결합(bond) 또는 결합 작용기(linking functional group)이고;
    P는 인터페론-α 부분이고;
    m은 0 또는 1-10의 정수이고; 및
    n은 1-10의 정수이다.
  8. 제 7항에 있어서, G3는 결합이고, P는 N-말단의 아미노기가 G3에 부착되어 있는 인터페론-α 부분인 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법.
  9. 제 8항에 있어서, A1 및 A2는 각각 10-30kD의 분자량을 갖는 mPEG 부분인 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법.
  10. 제 9항에 있어서, G1 및 G2는 각각
    Figure pct00011
    이고, 여기서, O는 A1 또는 A2에 부착되어 있고, NH는 화학식 Ⅰ에 나타난 바와 같이 탄소 원자에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법.
  11. 제 10항에 있어서, P는 N-말단의 1-4 추가 아미노산 잔기를 함유하는 변형된 인터페론 부분인 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법.
  12. 제 11항에 있어서, n은 2인 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 접합체는
    Figure pct00012
    이며, 여기서, mPEG는 20kD의 분자량을 가지고, IFN은 인터페론-α2b 부분인 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법.
  14. 제 7항에 있어서, 질병은 특발성 골수섬유증인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 7항에 있어서, 질병은 진성 적혈구 증다증인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 7항에 있어서, 질병은 본태성 혈소판 증가증인 것을 특징으로 하는 방법.
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