MX2012006132A - Uso terapeutico de conjugados proteina-polimero. - Google Patents

Abstract

Esta invención se relaciona con el uso de conjugados proteína-polímero descriptos en la memoria descriptiva para tratar diversas enfermedades, entre las que se incluyen mielofibrosis idiopática, policitemia vera y trombocitemia esencial.

Description

USO TERAPÉUTICO DE CONJUGADOS PROTEÍNA-POLÍMERO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA- Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud provisoria de Estados Unidos No. 61/285.411, presentada el 10 de diciembre de 2009, el contenido de la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES El avance en biología celular y tecnologías de proteínas recombinantes ha llevado al desarrollo de terapéutica con proteínas .

Sin embargo, existen aún importantes obstáculos. La mayoría de las proteínas son susceptibles a la degradación proteolítica y, por lo tanto, tienen una corta vida media en el aparato circulatorio. Otras desventajas incluyen baja solubilidad en agua e inducción de propiedades neutralizantes .

El acoplamiento de un polímero, por ej . , polietilenglicol (PEG) , a una proteína impide el acceso de enzimas proteolíticas al esqueleto de la proteína, para dar lugar a una estabilidad potenciada de la proteína. Además, también mejora la solubilidad en agua y minimiza la inmunogenicidad . Existe la necesidad de métodos eficaces para acoplar un polímero a una proteína.

SÍNTESIS Un aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de un conjugado proteína-polímero para tratar diversas enfermedades. El conjugado contiene por lo menos un resto polimérico, un resto interferón a y un ligante. En el conjugado, el peso molecular total es de 2-200 kD (preferentemente 40 kD) y el número de restos poliméricos en el conjugado no es superior a 10. Los restos de polímero están acoplados al ligante, el átomo de nitrógeno del término N del resto interferón a está unido al ligante y el ligante es un enlace covalente, alquileno Cl-10, alquenileno C2-10 o alquinileno C2-10. De preferencia, el conjugado es sustancialmente puro, por ej . , con una pureza de más de 70%, 80% o 90%. Las enfermedades que se pueden tratar con el conjugado incluyen esclerosis múltiple, infección viral crónica (como por ejemplo el virus de la hepatitis B, infección por el virus de hepatitis C , infección por el papiloma virus humano) , cáncer, mielofibrosis idiopática, policitemia vera y trombocitemia esencial.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de un conjugado proteína-polímero de la fórmula I expuesta a continuación para el tratamiento de las enfermedades antes citadas: fórmula I en la cual cada uno de Rl, R2, R3 , R4 y R5 es, de manera independientemente, H, alquilo Cl-5, alquenilo C2-5, alquinilo C2-5, arilo, heterarilo, cicloalquilo C3-8 o heterocicloalquilo C3-8; cada uno de Al y A2 es, independientemente, un resto polimérico; cada uno de Gl , G2 y G3 es, independientemente un enlace o un grupo funcional ligante; P es un resto interferón a(· m es 0 o un entero de 1-10 y n es un entero de 1-10.

Con referencia a la fórmula precedente, el conjugado proteína-polímero puede presentar una o más de las siguientes características: G3 es un enlace y P es un resto interferón a en el cual el grupo amino del término N está acoplado a G3 ; Al y A2 son restos óxido de polialquileno con un peso molecular de 2-100 kD (preferentemente 10-30 kD) , cada uno de Gl y G2 (donde O está acoplado a Al o A2 , y NH está acoplado a un átomo de carbono como se ilustra en la fórmula I) , o bien cada uno de Gl y G2 es urea, sulfonamida o amida, (en la cual N está acoplado a un átomo de carbono como se ilustra en la fórmula I) ; m es 4 , n es 2 y cada uno de Rl , R2 , R3 , R4 y R5 es H; y P es un resto interferón modificado que contiene 1-4 residuos aminoácidos adicionales .

El término "alquilo" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena recta o ramificada. Entre los ejemplos de grupos alquilo se cuentan metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, tere-butilo y n-pentilo. De modo similar, el término "alquenilo" o "alquinilo" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena recta o ramificada que contiene uno o más enlaces dobles C=C o uno o más enlaces triples C=C.

El término "alquileno" se refiere a un radical hidrocarburo bivalente de cadena recta o ramificada. De modo similar, el término "alquenileno" o "alquinileno" se refiere a un radical hidrocarburo bivalente de cadena recta o ramificada que contiene uno o más enlaces dobles C=C o uno o más enlaces triples C=C.

El término "arilo" se refiere a un sistema de anillos de hidrocarburo (monocíclico o bicíclico) que tiene por lo menos un anillo aromático. Entre los ejemplos de restos arilo se cuentan, aunque no a título de limitación, fenilo, naftilo y pirenilo .

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos de hidrocarburo (monocíclico o bicíclico) con por lo menos un anillo aromático que contiene por lo menos un heteroátomo tal como 0, N o S como parte del sistema de anillos y donde el resto está constituido por carbono. Entre los ejemplos de restos heteroarilo se incluye, aunque no a título de limitación, furilo, pirrolilo, tienilo, oxazolilo, imidazolilo, tiazolilo, piridinilo, pirimidinilo, quinazolinilo e indolilo.

El término "cicloalquilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclico o bicíclico parcial o totalmente saturado que tiene, además de carbono, uno o más heteroátomos (por ej . , O, N o S) , como átomos del anillo. Entre los ejemplos se cuentan, aunque no a título de limitación, piperidina, piperazina, morfolina, tiomorfolina y 1 , 4-oxazepán .

Alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo y heterocicloalquilo mencionados en este documento incluyen tanto restos sustituidos como no sustituidos. Los ejemplos de sustituyentes incluyen alquilo C1-C10, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, cicloalquilo C3-C8, cicloalquenilo C5-C8, alcoxi C1-C10, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi , amino, alquilamino C1-C10, dialquilamino C1-C20, arilamino, diarilamino, hidroxiamino, alcoxiamino, alquilsulfonamida C1-C10, arilsulfonamida, hidroxi, halógeno, tio, alquiltio C1-C10, ariltio, ciano, nitro, acilo, aciloxi, carboxilo y éster carboxílico.

El término "resto óxido de polialquileno" se refiere a un radical monovalente derivado de óxido de polialquileno lineal, ramificado o estrellado. El peso molecular de un resto óxido de polialquileno puede ser de 2-100 kD . El resto óxido de polialquileno es saturado o insaturado. Entre los ejemplos de resto óxido de polialquileno se cuentan, aunque no a título de limitación, óxido de polietileno, polietilenglicol, óxido de poliisopropileno , oxido de polibutenileno y copolímeros de los mismos. También se pueden utilizar otros polímeros tales como dextrano, alcoholes polivinílicos , poliacrilamidas o polímeros con base de carbohidrato para reemplazar el resto óxido de polialquileno, siempre que no sean antigénicos, tóxicos o susciten una respuesta inmune. El resto óxido de polialquileno está sustituido o no sustituido. Por ejemplo, puede ser polietilenglicol con casquete de metoxi (mPEG) .

El término "resto interferón a" se refiere a un radical monovalente derivado de algún interferón a. "Interferón a" se refiere a una familia de proteínas de especies específicas altamente homologas que inhiben la replicación viral y la proliferación celular y modulan la respuesta inmune. Ver Bonnem et al., J. Biol. Response od. , 1984, 3(6): 580-598 y Finter, J. Hepatol . , 1986, 3 Suppl 2:S157-160. Puede estar en la forma en que se produce en la naturaleza o en forma modificada. El interferon a modificado puede ser, por ej . , una proteína que contiene interferon a y 1-4 residuos aminoácidos adicionales en el término N del interferon.

Un ejemplo de dicho interferon modificado es donde IFN representa un resto interferon a2b, cuyo grupo amino en el término N está unido al grupo carbonilo.

Hay numerosos tipos de proteínas interferon a existentes en el comercio, incluyendo el interferon Intron-A provisto por Schering Corporation, Kenilworth, N.J., Roferon interferon comercializado por Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J., el interferon alfa 2 Berofor comercializado por Boehringer Ingelheim Pharmaceutical , Inc., Ridgefield, Conn. , Sumiferon provisto por Sumitomo, Japón y el interferon alfa-nl ellferon (INS) provisto por Glaxo-Wellcome Ltd., Londres, Gran Bretaña.

A continuación se enumeran secuencias de aminoácidos de cinco proteínas interferon alfa humanas ilustrativas, ya sea en su forma precursora o en forma madura: maltfallva llvlsckssc svgcdlpqth slgsrrtlml laqmrrislf sclkdrhdfg fpqeefgnqf qkaetipvlh emiqqifnlf stkdssaawd etlldkfyte lyqqlndlea cviqgvgvte tplmkedsil avrkyfqrit lylkekkysp cawevvraei mrsfslstnl qeslrske SEC ID NO. : 1 (Ver Krasagakis et al., Cáncer Invest. 26 (6), 562-568, 2008) cdlpqthslg srrtlmllaq mrkislfscl kdrhdfgfpq eefgnqfqka etipvlhemi qqifnlfstk dssaawdetl ldkfytelyq qlndleacvi qgvgvtetpl mkedsilavr kyfqritlyl kekkyspcaw evvraeimrs fslstnlqes lrske SEC ID NO.: 2 (Ver Klaus, et al., J. Mol. Biol . 274 (4), 661-675, 1997) mcdlpqthsl gsrrtlralla qmrrislfsc lkdrhdfgfp qeefgnqfqk aetipvlhem iqqifnlfst kdssaawdet lldkfytely qqlndleacv iqgvgvtetp lmkedsilav rkyfqritly lkekkyspca wevvraeimr sfslstnlqe slrske SEC ID NO. : 3 (Ver el Número de acceso del GenBank AAP20Q99, la versión del 30-ABR-2003) mallfpllaa lvmtsyspvg slgcdlpqnh gllsrntlvl lhqmrrispf lclkdrrdfr fpqemvkgsq lqkahvmsvl hemlqqifsl fhterssaaw nmtlldqlht elhqqlqhle tcllqvvgeg esagaisspa ltlrryfqgi rvylkekkys dcawevvrme imkslflstn mqerlrskdr dlgss SEC ID NO. : 4 (Ver Capón et al., J. Mol. Cell. Biol. 5 (4): 768-779, 1985) lsyksicslg cdlpqthslg nrralillaq mgrispfscl kdrhdfglpq eefdgnqfqk tqaisvlhem iqqtfnlfst edssaaweqs llekfstely qqlnnleacv iqevgmeetp lmnedsilav rkyfqritly ltekkyspca wevvraeimr slsfstnlqk rlrrkd SEC ID NO. : 5 (Ver Lund et al., J. Interferón Res. 5 (2), 229-238, 1985) En un ejemplo, la proteína interferón a empleada para preparar el conjugado de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% (por ej . , 85%, 90%, 95% o 99%) idéntica a una de las secuencias de aminoácidos precedentemente enumeradas o el fragmento de la misma que corresponde al interferón alfa maduro.

El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos se determin empleando el algoritmo de arlin y Altschul Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado de acuerdo con Karlin and Altschul Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Dicho algoritmo está incorporado a los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, efc al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación= 50, longitud de palabra= 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteína de la invención. Cuando existen brechas entre dos secuencias, se puede utilizar Gapped BLAST de acuerdo con lo descripto por Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402, 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden emplear los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ej . , XBLAST y NBLAST) .

El término "grupo funcional ligante" se refiere a un grupo funcional bivalente, un extremo del cual está conectado con el resto polímero y donde el otro extremo está conectado al resto proteico. Los ejemplos incluyen, aunque no a título de limitación, -0-, -S-, un grupo éster carboxílico, carbonilo, carbonato, amida, carbamato, urea, sulfonilo, sulfinilo, amino, imino, hidroxiamino, fosfonato o fosfato.

El conjugado proteína-polímero antes descripto puede presentarse en forma libre o en forma de sal, si correspondiera. Se puede formar una sal, por ejemplo, entre un anión y un grupo con carga positiva (por ej . , amino) en un conjugado proteína-polímero de la presente invención. Los aniones adecuados incluyen cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, nitrato, fosfato, citrato, metansulfonato, trifluoroacetato y acetato. Del mismo modo, también se puede formar una sal entre un catión y un grupo con carga negativa (por ej . , carboxilato) en un conjugado proteína-polímero de la presente invención. Los cationes adecuados incluyen el ion sodio, ion potasio, ion magnesio, ion calcio y un catión de amonio tal como el ion tetrametilamonio .

Por añadidura, el conjugado proteína-polímero puede tener uno o más enlaces o uno o más centros asimétricos. Ese tipo de conjugado se puede presentar en forma de racematos, mezclas racémicas, enantiómeros únicos, diastereómeros individuales, mezclas diastereoméricas y formas isoméricas de doble enlace cis o trans o E o Z.

A continuación se presenta un ejemplo de conjugado proteína-polímero de la presente invención: en el cual mPEG tiene un peso molecular de 20 k.D e IFN es un resto interferón a2 .

También está dentro del alcance de la presente invención el uso del conjugado para la elaboración de un medicamento para tratar uno de los trastornos antes mencionados.

En la siguiente descripción se presentan detalles de una o más realizaciones de la invención. Otras características, objetivos y ventajas de la invención surgirán claramente de la descripción y las reivindicaciones.

DESCRIPCION DETALLADA Los conjugados proteína-polímero utilizados para poner en práctica la presente invención se pueden preparar por métodos de síntesis muy conocidos en la técnica, por ej . , los métodos descriptos en la solicitud de Estados Unidos Acta No. 12/192.485. El Esquema 1 ilustra un ejemplo de preparación de los conjugados proteína-polímero de la presente invención. Se hace reaccionar el compuesto de diamina 1, que contiene un grupo acetal, con carbonato de N-hidroxisuccinimidil mPEG (es decir, el compuesto 2) para formar el compuesto 3 di-PEGilado, al que a continuación se convierte al aldehido 4. Se hace reaccionar este compuesto aldehido con una proteína con un grupo amino libre mediante alquilación reductiva para dar un conjugado proteína-polímero de la presente invención.

Esquema 1 Un conjugado proteína-polímero sintetizado de esa manera puede ser adicionalmente purificado por un método tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, electroforesis, diálisis, ultrafiltración o ultracentrifugación.

Las reacciones químicas antes descriptas incluyen el uso de solventes, reactivos, catalizadores, reactivos grupos protectores y grupos desprotectores y ciertas condiciones de reacción. Además pueden incluir otros pasos, anteriores o posteriores a los pasos descriptos específicamente en la presente, para agregar o eliminar grupos protectores adecuados a fin de dar lugar, en última instancia, a la síntesis de un conjugado proteína-polímero. Además, se pueden realizar diversos pasos de síntesis en una secuencia ú orden alternado a fin de producir los conjugados proteína-polímero pretendidos. Las metodologías de transformaciones por síntesis química y grupos protectores (protección y desprotección) ventajosas para sintetizar los conjugados proteína-polímero aplicables son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descriptos por R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989) ; T.W. Greene y P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2a. Ed., John iley and Sons (1991); L. Fieser y M. Fieser, Fieser and Fieser 's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994) y L. Paquette, ed., Enciclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) y ediciones posteriores de los mismos.

El conjugado de la invención puede tener una pureza muy elevada. En otras palabras, 60% o más (por ej . , 70%, 80% o 90%) de las moléculas de conjugado son idénticas en todos los aspectos, incluyendo la secuencia del resto proteico y su posición de unión al resto polímero.

El conjugado de la presente invención puede ser farmacéuticamente activo en la forma de conjugado. Por otro lado, puede liberar un interferón a farmacéuticamente activo in vivo (por ej . , por medio de hidrólisis) por escisión enzimática del ligamiento entre el resto proteico y el resto polimérico. Los ejemplos de enzimas implicadas en los ligamientos escindidos in vivo incluyen enzimas oxidativas (por ej . , peroxidasas, amina oxidasas o deshidrogenasas) , enzimas reductoras (por ej . , ceto reductasas) y enzimas hidrolíticas (por ej . , proteasas, esterasas, sulfatasas o fosfatasas) .

El conjugado de la presente invención se puede utilizar para tratar la esclerosis múltiple, infección viral crónica (como por ejemplo el virus de la hepatitis B, infección por el virus de hepatitis C, infección por el papiloma virus humano) , cáncer, mielofibrosis idiopática, policitemia vera y trombocitemia esencial. Tiene una vida media in vivo sorprendentemente larga, una dosis f rmacológica reducida y/o un intervalo de dosificación prolongado.

En el presente contexto, el término "tratar" o "tratamiento" se define como la aplicación o administración de una composición que incluye un conjugado proteína-polímero a un sujeto (humano o animal) , que padece un trastorno, un síntoma del trastorno, una enfermedad o trastorno secundario al trastorno o una predisposición al trastorno, con el propósito de curar, mitigar, aliviar, remediar o mejorar el trastorno, el síntoma del trastorno, la enfermedad o trastorno secundario al trastorno o la predisposición al trastorno. "Una cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un conjugado proteína-polímero que confiere un efecto terapéutico al sujeto tratado. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, determinable mediante ciertos análisis o marcadores) o subjetivos (es decir que el sujeto da una indicación del efecto o lo percibe) .

También está dentro del alcance de la presente invención una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva de por lo menos uno de los conjugados proteína-polímero antes descriptos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Más aun, esta invención incluye un método para administrar una cantidad efectiva de uno o más de los conjugados proteína-polímero a un paciente que presenta una o más enfermedades. Las dosis efectivas pueden variar, como reconocen las personas con capacitación en la técnica, dependiendo de, por ejemplo, la velocidad de hidrólisis de un conjugado proteína-polímero, los tipos de enfermedades a tratar, la vía de administración el uso de excipientes y la posibilidad de uso conjunto con otro tratamiento terapéutico.

Para poner en práctica el método de la presente invención, se puede administrar una composición que contiene uno o más de los compuestos antes mencionados por vía parenteral, oral, nasal, rectal, tópica o bucal. El término "parenteral" se refiere, en el presente contexto, a la inyección subcutánea, intracutánea, endovenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial , intrasinovial , intraesternal , intratecal, intralesional , intraperitoneal , intratraqueal o intracraneal, como así también cualquier técnica de infusión.

Una composición inyectable estéril puede ser una solución o suspensión en un diluyente o solvente no tóxico aceptable para la vía parenteral, como por ejemplo una solución en 1 , 3-butandiol . Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear se cuentan manitol, agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, habitualmente se emplean aceites fijos como solvente o medio de suspensión (por ej . , mono y diglicéridos sintéticos) Los ácidos grasos tales como el ácido oleico y sus derivados glicéridos son útiles en la preparación de inyectables, al igual que los aceites naturales farmacéuticamente aceptables tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas . Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga o carboximetil celulosa o agentes dispersantes similares. También se pueden utilizar otros tensioactivos de uso común tales como Tweens o Spans u otros agentes emulsionantes similares en la elaboración de las formas de dosificación sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables para la formulación.

Una composición para la administración oral puede ser cualquier forma de dosificación aceptable para uso oral incluyendo cápsulas, comprimidos, emulsiones y suspensiones, dispersiones y soluciones acuosas. En el caso de los comprimidos, los vehículos empleados comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se agregan, por lo general, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de la administración oral en forma de cápsulas, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se administran suspensiones y emulsiones por vía oral, el ingrediente activo puede estar suspendido o disuelto en una fase oleosa combinada con agentes emulsionantes o suspensores. Si se desea, se pueden agregar agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.

Se puede preparar una composición para aerosol nasal o inhalación de acuerdo con técnicas muy conocidas en el campo de la formulación farmacéutica. Por ejemplo, ese tipo de composición se puede preparar en forma de solución en salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes, promotores de la absorción adecuados para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes conocidos en la técnica. También se puede administrar una composición que contiene uno o más de los compuestos antes mencionados en forma de supositorios para la administración rectal.

Habitualmente se utiliza un vehículo farmacéuticamente aceptable con uno o más compuestos activos antes citados. El vehículo incluido en la composición farmacéutica debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con el ingrediente activo de la composición (y preferentemente, con capacidad para estabilizar el ingrediente activo) y no deletéreo para el sujeto a tratar. Se puede utilizar uno o más agentes solubilizantes como excipientes farmacéuticos para la administración de un compuesto antes citado. Entre los ejemplos de vehículos adicionales se cuentan óxido de silicio coloidal, estearato de magnesio, celulosa, lauril sulfato de sodio y Amarillo D&C # 10.

Se pueden utilizar análisis adecuados para evaluar en forma prelimitar la eficacia de los conjugados ante descriptos para tratar diversas enfermedades. Por ejemplo, se puede evaluar la efectividad del conjugado para tratar la policitemia vera y la trombocitemia esencial siguiendo los métodos descriptos por Kiladjian et al., Blood 2008; 112(8) : 3065-72 y Langer et al., Haetatologica 2005; 90: 1333-1338, respectivamente .

El siguiente ejemplo debe ser considerado meramente ilustrativo y de ninguna manera restrictivo del resto de la descripción. Sin más elaboración, se cree que una persona con capacitación en la técnica puede utilizar, basándose en la presente descripción, la presente invención en su alcance más amplio. Todas las publicaciones citadas en este documento se incorporan a la presente como referencia en su totalidad .

Preparación de di-PEG aldehido Su = succinimidilo Se preparó PEGO(C=0)OSu de 20 kD a partir de mPEGOH de 20 kD adquirido a (SunBio Inc., CA, E.E.U.U.) de acuerdo con el método descripto en Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569.

Se agregó una solución de 6- (1, 3-dioxolan-2-il) hexan- 1,5-diamina en diclorometano (11,97 g de la solución que contenia 9,03 mg de diamina, 47,8 µp???) a un matraz que contenía PEGO(C=0)OSu de 20 kD (1,72 g, 86,0 µp???) . Una vez disuelto por completo el PEGO (C=0) OSu, se agregó N, N- diisopropiletilamina (79 µ?, 478 µp???) . La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente por espacio de 24 h y luego se agregó gota a gota metil t-butil éter (200 mi) con agitación. Se recogió el precipitado asi obtenido y se lo secó al vacío para dar di-PEG acetal (1,69 g, 98%) en forma de sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, d6-DMS0) d 7,16 (t, J = 5,2 Hz, 1 H) , 7,06 (d, J = 8,8 Hz, 1 H) , 4,76 (t, J = 4,8 Hz , 1 H) , 4,10- 3,95 (m, 4 H) , 1,80-1,65 (m, 1 H) , 1,65-1,50 (m, 1 H) , 1,48- í, 10 (m, 6 H) .

Se suspendió di-PEG acetal (4,0 g, 0,2 mmol) en buffer a pH 2,0 (ácido cítrico, 40 mi), La mezcla de reacción fue agitada a 35oC durante 24 h y luego extraída con diclorometano (3 x 50 mi) . Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre sulfato de magnesio, se las concentró y redisolvió en diclorometano (20 mi) . Se agregó la solución gota a gota a metil t-butil éter (400 mi) con agitación. Se recogió el precipitado así obtenido y se lo secó a presión reducida para dar di-PEG aldehido (3,8 g, 95%) en forma de sólido blanco. 1H R N (400 MHz, d6-DMS0) d 9,60 (s, 1 H) , 7,24 (d, J = 8,4 Hz, 1 H) , 7,16 (t, J = 5,2 Hz, 1 H) , 4,10-3,95 (m, 4 H) , 3,95-3,80 (m, 1 H) , 3,00-2,85 (m, 2 H) , 2,58-2,36 (m, 2 H) , 1,46-1, 15 (m, 6 H) .

Preparación de interferón modificado 0 IFN HNQ Se clonó interferón a2b recombinante humano modificado mediante un método de PCR utilizando ADN genómico como plantilla. Se sintetizaron los oligonucleótidos sobre la base de las secuencias flanqueantes de interferón a2b humano (Acceso al GenBank # J00207, 8 de enero de 2008) . Se subclonaron los productos derivados por PCR en el vector pGEM-T (Promega) . La variante de IFN fue amplificado por PCR una vez más por medio de los clones de pGEM-T y seguidamente se la subclonó en el vector de expresión de proteínas pET-24a (Novagen) , un vector impulsado por el promotor de T7 RNA polimerasa, usando Ndel/BamHI como sitios de clonación. A continuación se transformó el vector pET-24a en la cepa de E. coli BL21-CodonPlus (DE 3 ) -RIL (Stratagene) . Se seleccionaron los clones con alta expresión manteniendo la E. coli BL21-CodonPlus (DE 3) -RIL transformada en presencia de kanamicina (50 µ9/?t?1) y cloranfenicol (50 ig/ml) .

Se empleó el medio caldo terrific (BD, 200 mi) para la propagación de BL21-CodonPlus (DE 3 ) -RIL con el gen Pro-IFN en un matraz de 1000 mi. Se agitó el matraz a 37°C a 230 rpm por espacio de 16 h. Se llevaron a cabo fermentaciones discontinuas y de alimentación por lotes en un fermentador de frasco de 5 litros (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) . La fermentación discontinua utilizó 150 mi de un inoculo de precultivo de un día para otro y 3 1 del medio caldo Terrific con kanamicina (50 µg/ml) , cloranfenicol (50 ug/ml) , 0,4% de glicerol y 0,5% (v/v) de oligoelementos (10 g/1 de FeS04-7H20, 2.25 g/1 de ZnS04-7H20, 1 g/1 de CuS04-5H20, 0.5 g/1 de MnS04-H20, 0.3 g/1 de H3B03, 2 g/1 de CaC12-2H20, 0.1 g/1 de (NH4 ) 6Mo7024 , 0.84 g/1 de EDTA, 50 ml/1 de HC1) . Se controló la concentración de oxígeno disuelto para mantenerla a 35% y se mantuvo el pH a 7,2 mediante la adición de una solución acuosa de NaOH 5 N. Se preparó una solución de alimentación que contenía 600 g/1 de glucosa y 20 g/1 de MgS04-7H20. Una vez que el pH se elevó a un valor superior al punto de referencia, se agregó un volumen apropiado de la solución de alimentación para aumentar la concentración de glucosa en el caldo de cultivo. Se indujo la expresión del gen de Pro-IFN mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y se cosechó el caldo de cultivo después de 3 h de incubación.

Se resuspendió el pellet celular recolectado con buffer TEN buffer (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 100 mM) en una proporción apropiada de 1:10 (g de peso húmedo/ml) y se lo roturó con un microfluidizante y luego se lo centrifugó a 10.000 rpm durante 20 min. El pellet que contenía el cuerpo de inclusión (IB) fue lavado dos veces con buffer TEN y centrifugado del a manera antes descripta. A continuación se suspendió el pellet que contenía el IB en 150 mi de una solución acuosa de HC1 de guanidio (GuHCl) y se lo centrifugó a 20.000 rpm por espacio de 15 min. Seguidamente se solubilizó el IB en 50 mi de una solución de GuHCl 6 M. Se centrifugó el material de GuHCl solubilizado a 20.000 rpm durante 20 min. Se inició el replegamiento mediante la dilución del IB desnaturalizado en 1,5 1 de un buffer de replegamiento recién preparado (Tris-HCl 100 mM (pH 8.0), L-Arginina 0,5 M, EDTA 2 mM) que fue agitado sólo durante la adición. Se dejó incubar la mezcla de reacción por espacio de 48 h sin agitación. Se dializó el interferón ot2b recombinante humano replegado (es decir, Pro-IFN) contra el buffer de Tris 20 mM (con EDTA 2 mM y urea 0,1M, pH 7,0) para la posterior purificación por cromatografía en columna Q-Sepharose .

Se cargó la proteína recombinante humana replegada Pro-IFN en una columna Q-Sepharose (GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA) . Se equilibró previamente la columna con un buffer de Tris-HCl 20 mM (pH 7,0). Se eluyó el producto con una mezcla de buffer Tris-HCl 20 mM (pH 7,0) y NaCl 200 mM . Se recogieron las fracciones que contenían Pro-IFN basándose a su absorbancia a 280 nm. Se determinó la concentración de Pro-IFN mediante un kit de ensayo de proteínas utilizando el método de Bradford (Pierce, Rockford, IL) .

Preparación del Conjugado proteína-polímero A una solución de di-PEG aldehido preparada precedentemente (1,2 g, 0,03 mmol) en agua (72 mi) se agregó una solución 2 M de fosfato de sodio (pH 4,0, 5 mi) y Pro-IFN (200 mg en 22,2 mi de buffer de pH 7,0 que contenía Tris-HCl 20 mM y NaCl 0,2M, 0,01 mmol). La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente por espacio de 10 min; a continuación se le agregó una solución acuosa de cianoborohidruro de sodio (400 mM, 1,25 mi, 0,5 mmol) . Se agitó la mezcla de reacción en la oscuridad durante 16 h y se la purificó por cromatografía SP XL Sepharose. Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado polímero proteína buscado basándose en su tiempo de retención y absorbancia a 280 nm. Se determinó la concentración del conjugado por medio de un kit de ensayo de proteínas empleando el método de Bradford (Pierce, Rockford, IL) . El rendimiento aislado del conjugado fue, alrededor de 40% o más.

OTRAS REALIZACIONES Todas las características descriptas en esta memoria descriptiva pueden ser combinadas de cualquier modo. Cada característica descripta en esta memoria descriptiva puede ser reemplazada por una característica alternativa que sirva un propósito igual, equivalente o similar. Por consiguiente, a menos que expresamente se indique lo contrario, cada característica descripta es sólo un ejemplo de una serie genérica de equivalentes o características similares.

De la descripción que antecede, una persona con capacitación en la técnica puede deducir fácilmente las características esenciales de la presente invención y sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, puede efectuar diversos cambios y modificaciones a la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por consiguiente, otras realizaciones también están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como prioridad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descripto y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un método para tratar una enfermedad, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un conjugado sustancialmente puro que consta de por lo menos un resto polimérico, un resto de proteína y un ligando, donde dicho por lo menos un resto polimérico está acoplado al ligante, el átomo de nitrógeno del término N del resto proteico está unido al ligante y el ligante es un enlace covalente, alquileno Cl-10, alquenileno C2-10 o alquinileno C2-10, donde la enfermedad es mielofibrosis idiopática, policitemia vera o trombocitemia esencial.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el resto de proteína es un resto interferón a2b modificado que contiene 1-4 residuos aminoácidos adicionales en el término N.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual la pureza del conjugado es 70% o más.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la enfermedad es mielofibrosis idiopática.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la enfermedad es policitemia vera.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la enfermedad es trombocitemia esencial.

7. Un método para tratar una enfermedad, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un conjugado de la fórmula I: fórmula I en la cual cada uno de Rl, R2, R3 , R4 y R5 es, de manera independientemente, H, alquilo Cl-5, alquenilo C2-5, alquinilo C2-5, arilo, heterarilo, cicloalquilo C3-8 o heterocicloalquilo C3-8 cada uno de Al y A2 es, independientemente, un resto polimérico ; cada uno de Gl, G2 y G3 es, independientemente un enlace o un grupo funcional ligante; P es un resto interferón oc; m es 0 o un entero de 1-10 y n es un entero de 1-10. donde la enfermedad es raielofibrosis idiopática, policitemia vera o trombocitemia esencial.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual G3 es un enlace y P es un resto interferón a en el cual el grupo amino del término N está unido a G3.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual cada uno de Al y A2 es un resto mPEG con un peso molecular de 10-30 kD.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual cada uno de Gl y G2 es donde O está acoplado a Al o A2 y NH está acoplado a un átomo de carbono como se ilustra en la fórmula I.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual P es un resto interferón modificado que contiene 1-4 residuos aminoácidos adicionales en el término N.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual n es 2. 3 O

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual el conjugado es en el cual mPEG tiene un peso molecular de 20 kD e IFN es un resto interferón a2b.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual la enfermedad es mielofibrosis idiopática.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual la enfermedad es policitemia vera.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual la enfermedad es trombocitemia esencial.