MXPA05005263A

MXPA05005263A - Polipeptidos y conjugados de interferon alfa.

Info

Publication number: MXPA05005263A
Application number: MXPA05005263A
Authority: MX
Inventors: Torben Lauesgaard Nissen
Original assignee: Maxygen Inc
Priority date: 2002-11-18
Filing date: 2003-11-17
Publication date: 2005-07-25
Also published as: NZ540043A; WO2004046365A3; IL168049A0; KR20050086498A; EP1565205A4; AU2003297285A1; NO20052363D0; WO2004046365A2; JP2006506097A; NO20052363L; US20040219131A1; EP1565205A2; RU2005118998A; BR0316324A; CA2504267A1

Abstract

La presente invencion proporciona polipeptidos del interferon alfa y conjugados y acidos nucleicos que codifican los polipeptidos; la invencion tambien incluye composiciones que comprenden estos polipeptidos, conjugados y acidos nucleicos; celulas que contienen o expresan los polipeptidos, conjugados y acidos nucleicos; metodos para hacer los polipeptidos, conjugados y acidos nucleicos; y metodos para utilizar los polipeptidos, conjugados y acidos nucleicos.

Description

POLIPEPTIDOS Y CONJUGADOS DEL INTERFERON ALFA REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS De acuerdo con 35 U.S.C. §1 19(e), esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. de Serie 60/502,560, presentada en Septiembre 12, del 2003, y la Solicitud Provisional de E.U.A. No. de Serie 60/427,612, presentada en Noviembre 18, del 2002, las descripciones de cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad para todos los propósitos.

NOTIFICACION DE LOS DERECHOS DE REPRODUCCION De acuerdo con 37 C.F.R. 1.71 (e), las Solicitantes indican que una porción de esta descripción contiene material que es objeto de protección de los derechos de reproducción. El dueño de los derechos de reproducción no tiene objeción a la reproducción por facsímil de cualquiera del documento de la patente o la descripción de la patente, como aparece en el archivo o los registros de la patente en la Oficina de Patentes y Marcas, pero se reserva de otra manera, todos los derechos de reproducción.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona generalmente con polinucleótidos y polipéptidos codificados por los mismos, conjugados de los polipéptidos, así como vectores, células, anticuerpos y métodos para utilizar y producir los polinucleótidos, polipéptidos y conjugados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los interferones alfa son miembros de la superfamilia diversa de haces helicoidales de los genes de la citocina (Sprang, S.R. et al. (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:815-827). Los interferones alfa humanos son codificados por una familia de más de 20 genes no alélicos, duplicados en cascada, y pseudogenes que comparten 85-98% de identidad de la secuencia al nivel de los aminoácidos (Heneo, K. et al. (1985) J. Mol. Biol. 185:227-260). Los genes que expresan las proteínas activas del interferón alfa se han agrupado en 13 familias de acuerdo con los sitios específicos genéticos. Las proteínas conocidas expresadas del interferón alfa humano y sus variaciones alélicas se tabulan en Alien G. y Diaz M.O. (1996) J. Interferón and Cytokine Res. 16:181-184. Los interferones alfa han demostrado inhibir varios tipos de proliferación celular, y son especialmente útiles para el tratamiento de una variedad de trastornos de la proliferación celular, asociados frecuentemente con el cáncer, particularmente de malignidades hematológicas, tales como las leucemias. Estas proteínas han mostrado actividad antiproliferativa contra el mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma de grado inferior, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena crónica, carcinoma de las células renales, tumores de la vejiga urinaria y cánceres de ovario (Bonnem, E.M. et al. (1984) J. Biol. Response Modifiers 3:580; Oldham, R.K. (1985) Hospital Practice 20:71 ). Los interferones alfa también son útiles contra varios tipos de infecciones virales (Finter, N.B. et al. (1991 ) Drugs 42(5):749). Los interferones alfa tienen actividad contra la infección por el virus del papiloma humano, infecciones por Hepatitis B y Hepatitis C (Finter, N.B. et al., 1991 , supra; Kashima, H. et al. (1988) Laryngoscope 98:334; Dusheiko, G.M. et al. (1986) J. Hematology 3 (Suplem. 2):S199; Davis, GL et al. (1989) N. England J. Med. 321 :1501 ). También se ha investigado el papel de los interferones y los receptores del interferón en la patogénesis de ciertas enfermedades autoinmunes e inflamatorias (Benoit, P. et al. (1993) J. Immunol. 150(3):707). Aunque estas proteínas poseen un valor terapéutico en el tratamiento de varias enfermedades, no se han optimizado para utilizarse como productos farmacéuticos. Por ejemplo, la toxicidad que limita la dosis, la reactividad cruzada del receptor y las cortas vidas medias en suero, reducen significativamente la utilidad clínica de muchas de estas citocinas (Dusheiko, G. (1997) Hepatology 26:1 12S-121S; Vial, T. y Descotes, J. (1994) Drug Experience 10:115-150; Funke, I. et al. (1994) Ann. Hematol. 68:49-52; Schomburg, A. et al. (1993) J. Cáncer Res. Clin. Oncol. 1 19:745-755). Los perfiles diversos y los severos efectos laterales que acompañan la administración del interferón, incluyen síntomas similares a la gripe, fatiga, alucinaciones, fiebre, elevación de las enzimas hepáticas y leucopenia (Pontzer, C.H. et al. (1991 ) Cáncer Res. 51 :5304; Oldham, 1985, supra). El virus de la hepatitis C (HCV), es un virus del ARN integrado al hospedero, con una velocidad muy alta de replicación, y está asociado por lo tanto, con un gran grado de diversidad genética. Se han identificado al menos seis genotipos y más de treinta subtipos del ARN del HCV. El genotipo del HCV ha mostrado ser un predictor de la respuesta a la terapia con el IFN-alfa. Se ha encontrado que los pacientes infectados con los genotipos 2 y 3 del HCV, generalmente responden bien a la terapia con el interferón. Los pacientes infectados con los genotipos 4, 5 y 6, tienden a responder no tan bien. Los pacientes infectados con el genotipo 1 del HCV, tienden a responder de manera muy deficiente a la terapia con el interferón, con aproximadamente 50% de los pacientes con el Genotipo 1 , clasificados como "que no responden" hacia la terapia con el IFN-alfa. El Genotipo 1 es actualmente la forma más predominante de la Hepatitis C, infectando aproximadamente a 70% de los pacientes en los Estados Unidos y 50% de los pacientes en Europa. Claramente, existe una necesidad apremiante de terapias más efectivas para la infección por HCV, particularmente de la variedad del Genotipo 1.

Existe evidencia genética y bioquímica de que el Genotipo 1 del HCV (y otros subtipos), atenúan activamente la trayectoria de señalización del IFN-alfa, inhibiendo las proteínas clave sensibles al IFN, tales como la proteína cinasa PKR de serina/treonina activada por dsARN (Katze M.G., et al. (2002) Nat. Rev. Immunol. 2(9):675-687). Como una probable consecuencia de esta diversidad genética y la inhibición activa de la respuesta antiviral, el HCV (particularmente el Genotipo 1 ), tiene la capacidad de escapar a la vigilancia inmune del hospedero, conduciendo a una alta proporción de infección crónica. La extensa heterogeneidad genética del HCV tiene importantes implicaciones de diagnóstico y clínicas, resultando potencialmente en variaciones en el curso clínico, dificultades en el desarrollo de una vacuna y falta de respuesta a la terapia. La presente invención trata la necesidad de moléculas de interferón-alfa, que exhiban una eficacia antivíral y/o inmunomoduladora mejorada. La invención proporciona novedosos polipéptidos y conjugados polipeptídicos del interferón-alfa, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos y métodos para utilizar tales moléculas. Tales moléculas serían de uso benéfico en una variedad de aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, tratamientos terapéuticos y profilácticos, particularmente para infecciones virales, tales como la HCV. La presente invención cumple con estas y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona polipéptidos novedosos, incluyendo vanantes y polipéptidos de fusión. La invención también proporciona conjugados que comprenden un polipéptido de la invención, enlazado cova lente mente a una o más porciones no polipeptídicas. La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de la invención, y vectores y células hospederas que comprenden tales ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona métodos para hacer y utilizar tales polipéptidos, conjugados y ácidos nucleicos, y otras características evidentes tras una revisión adicional. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante, el polipéptido comprende una secuencia identificada como una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (tal como una de la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 , SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO.-67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 , SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81 , SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91 , SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101 , SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, y SEQ ID NO:104). La invención también proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden cada uno, una secuencia que difiere en 0-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 0-14 posiciones de los aminoácidos, en 0-12 posiciones de los aminoácidos, en 0-10 posiciones de los aminoácidos, en 0-8 posiciones de los aminoácidos, en 0-6 posiciones de los aminoácidos, en 0-5 posiciones de los aminoácidos, en 0-4 posiciones de los aminoácidos, en 0-3 posiciones de los aminoácidos, en 0-2 posiciones de los aminoácidos, o en 0-1 posiciones de los aminoácidos, de una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104, tales como, por ejemplo, una de las SEQ ID NOS:1-15, 47 ó 53 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). En algunos casos, el polipéptido exhibe una actividad del ¡nterferón alfa (tal como, por ejemplo, actividad antiviral, actividad de diferenciación a TH1 y/o actividad antiproliferativa). En algunos casos, la secuencia polipeptídica comprende una sustitución en una o más de las posiciones 47, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61 , 64, 69, 71 , 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161 y 162, con relación a una de las SEQ ID NOS: 1-15, 47 ó 53, tal como, por ejemplo, una de la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53. En algunos casos, la secuencia polipeptídica comprende uno o más de: His o Gln en la posición 47; Val, Ala o Thr en la posición 51 ; Gln, Pro o Glu en la posición 52; Ala o Thr en la posición 53; Phe, Ser o Pro en la posición 55; Leu, Val o Ala en la posición 56; Phe o Leu en la posición 57; Tyr o His en la posición 58; Met, Leu o Val en la posición 60; Met o lie en la posición 61 ; Thr o lie en la posición 64; Ser o Thr en la posición 69; Lys o Glu en la posición 71 ; Asn o Asp en la posición 72; Ala o Val en la posición 75; Ala o Thr en la posición 76; Trp o Leu en la posición 77; Asp o Glu en la posición 78; Glu o Gln en la posición 79; Thr, Asp, Ser o Arg en la posición 80; Glu o Asp en la posición 83; Lys o Glu en la posición 84; Phe o Leu en la posición 85; Tyr, Cys o Ser en la posición 86; lie o Thr en la posición 87; Phe, Tyr, Asp o Asn en la posición 90; Met o Leu en la posición 93; Lys o Glu en la posición 133; Ser o Ala en la posición 140; Phe o Leu en la posición 154; Lys o Glu en la posición 160; Arg o Ser en la posición 161 ; y Arg o Ser en la posición 162; la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1 . En algunos casos, la secuencia polipeptídica comprende uno o más de His47, Val51 , Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133 y Ser140, la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1. Algunos de tales polipéptidos incluyen las SEQ ID N0S:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104. La invención también proporciona proteínas de fusión y conjugados que comprenden cualquiera de estos polipéptidos, ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos y métodos para hacer tales polipéptidos. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una o más sustituciones, incluyendo, de manera no exclusiva, una sustitución seleccionada de: D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, G10C, R12C, R13C, M16C, A19C, Q20C, R22C, R23C, I24C, S25C, L26C, F27C, S28C, L30C, K31 C, R33C, H34C, D35C, R37C, Q40C, E41 C, E42C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, V51 C, Q52C, E59C, Q62C, Q63C, N66C, S69C, T70C, K71 C, N72C, S74C, A75C, D78C, E79C, T80C, L81C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91 C, N94C, D95C, E97C, A98C, V100C, M101 C, Q102C, E103C, V104C, G105C, E107C, E108C, T109C, P1 10C, L1 11 C, M112C, N1 13C, V114C, D115C, L1 18C, R121 C, K122C, Q125C, R126C, T128C, L129C, T132C, K133C, K134C, K135C, Y136C, S137C, P138C, A146C, M149C, R150C, S153C, F154C, N157C, Q159C, K160C, R161 C, L162C, R163C, R164C, K165C y E166C (o una posición equivalente con relación a la SEQ ID NO:1 ), y combinaciones de las mismas. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una o más sustituciones, incluyendo, de manera no exclusiva, una sustitución seleccionada de: D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, G10K, R12K, R13K, M16K, A19K, Q20K, R22K, R23K, I24K, S25K, L26K, F27K, S28K, L30K, R33K, H34K, D35K, R37K, Q40K, E41 K, E42K, D44K, N46K, H47K, Q49K, V51 K, Q52K, E59K, Q62K, Q63K, N66K, S69K, T70K, N72K, S74K, A75K, D78K, E79K, T80K, L81 K, E83K, I87K, F90K, Q91 K, N94K, D95K, E97K, A98K, V100K, M101 K, Q102K, E103K, V104K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L11 1 K, M112K, N113K, V1 14K, D115K, L118K, R121 K, Q125K, R126K, T128K, L129K, T132K, Y136K, S137K, P138K, A146K, M149K, R150K, S153K, F154K, N157K, Q159K, R161 K, L162K, R163K, R164K y E166K (o una posición equivalente con relación a la SEQ ID NO:1 ), y combinaciones de las mismas. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una o más sustituciones de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente, o una o más supresiones de un residuo de aminoácido, que eliminan una o más lisinas, por ejemplo, K31 , K50, K71 , K84, K122, K133, K134, K135, K160 y/o K165 (con relación a la SEQ ID NO:1 ), de cualquier polipéptido de la invención, tal como, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (tal como, por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). El o más residuos de lisina a ser eliminados, pueden sustituirse con cualquier otro aminoácido, pueden sustituirse con Arg (R) o Gln (Q), o pueden suprimirse. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una o más sustituciones de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente, o una o más supresiones de un residuo de aminoácido, que eliminan una o más histidinas, por ejemplo, H7, H1 1 , H34 y/o H47 (con relación a la SEQ ID NO:1 ), de cualquier polipéptido de la invención, tal como, por ejemplo, una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (tal como, por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). El uno o más residuos de histidina a ser eliminados, pueden sustituirse con cualquier otro aminoácido, pueden sustituirse con Arg (R) o Gln (Q), o pueden suprimirse. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una o más sustituciones, incluyendo, de manera no exclusiva, sustituciones seleccionadas de: D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N, T6N+S8T, H7N+L9S/T, S8N+G10S/T, L9N+H1 1 S/T, G10N+R12S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S/T, M16N+L18S/T, A19N+M21S/T, Q20N+R22S/T, R22N+I24S/T, R23N, R23N+S25T, I24N+L26S/T, S25N+F27S T, L26N, L26N+S28T, S28N+L30S/T, L30N+D32S/T, K31 N+R33S/T, R33N+D35S/T, H34N+F36S/T, D35N+R37S/T, R37N+P39SH", Q40N+E42S/T, E41 N+F43S/T, E42N+D44SH", D44N+N46S T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51 S/T, K50N+Q52S T, V51 N+A53S/T, Q52N+I54S/T, E59N+M61 S/T, Q62N, Q62N+T64S, Q63N+F65S/T, F68S/T, S69N+K71S T, T70N+N72S/T, K71 N, K71 N+S73T, S74T, S74N+A76S T, A75N+W77S/T, D78N, D78N+T80S, E79N+L81S/T, T80N+L82Sfl", L81 N+E83SH", E83N+F85S/T, K84N+Y86S/T, I87N+L89S T, F90N+Q92S/T, Q91 N+M93S T, L96S/T, D95N+E97S/T, E97N+C99S/T, A98N+V100S/T, V100N+Q102S T, 101 N+E103S T, Q102N+V104SAT, E103N+G105S/T, V104N+V106S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P1 10S/T, L1 1 1 N+N113S/T, M1 2N+V1 14S/T, N1 13N+D115S/T, V114N, V1 14N+S116T, D115N+I1 17S/T, L1 18N+V120S/T, R121 N+Y123S/T, K122N+F124S/T, Q125N+I127S/T, R126N, R126N+T128S, T128N+Y130S/T, L129N+L131 S T, T132N+K134S/T, K133N+K135S/T, K134N+Y136S/T, K135N, K135N+S137T, Y136N+P138S/T, P138N, P138N+S140T, A146N+I148S/T, M149N, M149N+S151T, R150N+F152S T, S153N, S153N+S155T, F154N+F156S/T, Q159S/T, K160N+L162SH", R161 N+R163S T, L162N+R164S/T, R163N+K165S/T y R164N+E166S/T (o posiciones equivalentes con relación a la SEQ ID NO:1 ), y combinaciones de las mismas. La invención también proporciona proteínas de fusión y conjugados que comprenden cualquiera de los polipéptidos anteriores, ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos y métodos para hacer y utilizar tales polipéptidos. En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes, cada uno que comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia del aminoácido con una de las SEQ ID NOS: 1-15 y las SEQ ID NOS:44-104, tales como, por ejemplo, una de las SEQ ID NOS:1-15, 47 y 53 (tal como, por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). Algunos de tales polipéptidos exhiben una actividad del interferón alfa (tal como, por ejemplo, actividad antiviral, actividad de diferenciación a TH1 y/o actividad antiproliferativa). En algunos casos, la secuencia tiene al menos aproximadamente 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NO 44-104 (tal como, por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). En algunos casos, la secuencia polipeptídica comprende una sustitución en una o más de las posiciones 47, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61 , 64, 69, 71 , 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161 y 162, con relación a, por ejemplo, una de las SEQ ID NOS:1-15. En algunos casos, la secuencia polipeptídica comprende uno o más de: His o Gln en la posición 47; Val, Ala o Thr en la posición 51 ; Gln, Pro o Glu en la posición 52; Ala o Thr en la posición 53; Phe, Ser o Pro en la posición 55; Leu, Val o Ala en la posición 56; Phe o Leu en la posición 57; Tyr o His en la posición 58; Met, Leu o Val en la posición 60; Met o lie en la posición 61 ; Thr o lie en la posición 64; Ser o Thr en la posición 69; Lys o Glu en la posición 71 ; Asn o Asp en la posición 72; Ala o Val en la posición 75; Ala o Thr en la posición 76; Trp o Leu en la posición 77; Asp o Glu en la posición 78; Glu o Gln en la posición 79; Thr, Asp, Ser o Arg en la posición 80; Glu o Asp en la posición 83; Lys o Glu en la posición 84; Phe o Leu en la posición 85; Tyr, Cys o Ser en la posición 86; lie o Thr en la posición 87; Phe, Tyr, Asp o Asn en la posición 90; Met o Leu en la posición 93; Lys o Glu en la posición 133; Ser o Ala en la posición 140; Phe o Leu en la posición 154; Lys o Glu en la posición 160; Arg o Ser en la posición 161 ; y Arg o Ser en la posición 162 (la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1 ). En algunos casos, la secuencia polipeptídica comprende uno o más de His47, Val51 , Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133 y Ser140, la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1. Algunos de tales polipéptidos comprenden una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104. La invención también proporciona proteínas de fusión y conjugados que comprenden cualquiera de los polipéptidos anteriores, ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos y métodos para hacer tales polipéptidos. En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes, que son variantes de un polipéptido original, cada variante comprende una secuencia variante que difiere de la secuencia polipeptídica original en al menos una posición del aminoácido con relación a la secuencia polipeptídica original, en donde la secuencia polipeptídica original es una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104, tal como, por ejemplo, una de las SEQ ID NOS:1-15, 47 y 53, por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53. En algunos casos, la variante exhibe una actividad del interferón alfa (tal como, actividad antiviral, actividad de diferenciación a TH1 y/o actividad antiproliferativa). En algunos casos, la secuencia variante difiere de la secuencia polipeptídica original en 1 -16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 1-14 posiciones de los aminoácidos, en 1-12 posiciones de los aminoácidos, en 1-10 posiciones de los aminoácidos, en 1-8 posiciones de los aminoácidos, en 1-6 posiciones de los aminoácidos, en 1-5 posiciones de los aminoácidos, en 1-4 posiciones de los aminoácidos, en 1-3 posiciones de los aminoácidos, o en 1 -2 posiciones de los aminoácidos. En algunos casos, la secuencia variante comprende una sustitución en una o más de las posiciones 47, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61 , 64, 69, 71 , 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161 y 162, con relación a una de las SEQ ID NOS:1-15. En algunos casos, la secuencia variante comprende uno o más de: His o Gln en la posición 47; Val, Ala o Thr en la posición 51 ; Gln, Pro o Glu en la posición 52; Ala o Thr en la posición 53; Phe, Ser o Pro en la posición 55; Leu, Val o Ala en la posición 56; Phe o Leu en la posición 57; Tyr o His en la posición 58; Met, Leu o Val en la posición 60; Met o lie en la posición 61 ; Thr o He en la posición 64; Ser o Thr en la posición 69; Lys o Glu en la posición 71 ; Asn o Asp en la posición 72; Ala o Val en la posición 75; Ala o Thr en la posición 76; Trp o Leu en la posición 77; Asp o Glu en la posición 78; Glu o Gln en la posición 79; Thr, Asp, Ser o Arg en la posición 80; Glu o Asp en la posición 83; Lys o Glu en la posición 84; Phe o Leu en la posición 85; Tyr, Cys o Ser en la posición 86; lie o Thr en la posición 87; Phe, Tyr, Asp o Asn en la posición 90; Met o Leu en la posición 93; Lys o Glu en la posición 133; Ser o Ala en la posición 140; Phe o Leu en la posición 154; Lys o Glu en la posición 160; Arg o Ser en la posición 161 ; y Arg o Ser en la posición 162; la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1. En algunos casos, la secuencia variante comprende uno o más de His47, Val51 , Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133 y Ser140, la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1. Algunas de tales variantes comprenden una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOS: 1-15 y las SEQ ID NOS:44-104. La invención también proporciona proteínas de fusión y conjugados que comprenden cualquiera de estas variantes, los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de estas variantes y métodos para hacer tales variantes. En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes, que son variantes de un polipéptido del interferón alfa original, cada variante comprende una secuencia variante que difiere de la secuencia del polipéptido del interferón alfa original en al menos una posición del aminoácido, en donde la secuencia variante comprende una o más de His47, Val51 , Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133 y Ser140, la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1. En algunos casos, la secuencia del polipéptido del interferón alfa original es una secuencia de un interferón alfa humano natural, tal como una de las SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO:32+R23K, o un interferón alfa no natural (es decir, sintético), tal como la SEQ ID NO:43. En algunos casos, la secuencia variante difiere de la secuencia del polipéptido del interferón alfa original en 1-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 1-14 posiciones de los aminoácidos, en 1-12 posiciones de los aminoácidos, en 1-10 posiciones de los aminoácidos, en 1-8 posiciones de los aminoácidos, en 1-6 posiciones de los aminoácidos, en 1-5 posiciones de los aminoácidos, en 1-4 posiciones de los aminoácidos, en 1-3 posiciones de los aminoácidos, o en 1-2 posiciones de los aminoácidos. En algunos casos, la variante exhibe una actividad del interferón alfa (tal como, por ejemplo, actividad antiviral, actividad de diferenciación a TH1 y/o actividad antiproliferativa). La invención también proporciona proteínas de fusión y conjugados que comprenden cualquiera de estas variantes, los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de estas variantes y métodos para hacer tales variantes. La invención también proporciona conjugados que comprenden un polipéptido de la invención, tal como cualquiera de los polipéptidos de la invención (incluyendo las variantes) descritos anteriormente, y al menos una porción no polipeptídica unida a un grupo de unión del polipéptido, en donde el polipéptido exhibe una actividad del interferón alfa. En algunos casos, la porción no polipeptídica es un polímero (tal como, por ejemplo, PEG o mPEG), o una porción de azúcar. La al menos una porción no polipeptídica puede unirse a una cisteína, a una Usina, al grupo amino N terminal del polipéptido, a un sitio de glucosilación in vivo del polipéptido. La invención también proporciona métodos para hacer y utilizar tales conjugados. La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican cualquiera de los polipéptidos (incluyendo las variantes) de la invención. La invención también proporciona vectores y células hospederas que comprenden tales ácidos nucleicos, y métodos para hacer los polipéptidos de la invención, que comprende cultivar células hospederas que comprenden tales ácidos nucleicos. En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la replicación viral en células infectadas con virus, el método comprende poner en contacto las células infectadas con el virus con un polipéptido o un conjugado de la invención. La invención también proporciona un método para reducir el número de copias de un virus en las células infectadas con el virus, que comprende poner en contacto las células infectadas con el virus con un polipéptido o un conjugado de la invención. Estos y otros objetos y características de la invención se volverán más evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada, en conjunto con las figuras acompañantes.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y 1 B muestran los cursos cronológicos bifásicos para la eliminación viral de células infectadas con HCV después del tratamiento con IFN-alfa (A. Cinética de los que no responden; B. Cinética de los que responden). La Figura 2 muestra una alineación de la secuencia de un polipéptido de la invención (SEQ ID NO:1 ), con las siguientes secuencias polipeptídicas del interferón alfa humano: hulFN-alfa 1a (SEQ ID NO:31 ), hulFN-alfa 2b (SEQ ID NO:32), hulFN-alfa 4b (SEQ ID NO:33), hulFN-alfa 5 (SEQ ID NO:34), hulFN-alfa 6 (SEQ ID NO:35), hulFN-alfa 7 (SEQ ID NO:36), hulFN-alfa 8b (SEQ ID NO:37), hulFN-alfa 10a (SEQ ID NO:38), hulFN-alfa 14a (SEQ ID NO:39), hulFN-alfa 16 (SEQ ID NO:40), hulFN-alfa 17b (SEQ ID NO:41 ) y hulFN-alfa 21 b (SEQ ID NO:42). Las convenciones de la nomenclatura para las secuencias hulFN-alfa son de acuerdo con Alien G. y Diaz M.O. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:181-184. Las flechas indican los residuos His47, Val51 , Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133 y Ser140 de la SEQ ID NO:1 , los cuales no están presentes en ninguna de las SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:42. Las posiciones de los residuos de los aminoácidos en las SEQ ID NO:31-42, que son idénticas a la SEQ ID NO:1 , se identifican con un punto (.), y los huecos en las secuencias se indican con un guión (-). La Figura 3 muestra una alineación de la secuencia de un polipéptido de la invención (SEQ ID NO:3), con hulFN-alfa 14a (SEQ ID NO:39) (LelF H; Goeddel et al. (1981 ) Nature 290:20-26), utilizando los siguientes parámetros: matriz BLOSUM62, penalización por abertura del hueco 1 1 , penalización por extensión del hueco 1. Las posiciones de los aminoácidos en la SEQ ID NO:39, que son idénticas a la SEQ ID NO:3, se indican con un punto (.). La Figura 4 muestra una alineación de la secuencia de un polipéptido de la invención (SEQ ID NO:8), con las secuencias polipeptídícas del interferon alfa humano SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:42. Las posiciones de los residuos de los aminoácidos en las SEQ ID NO:31-42, que son idénticas a la SEQ ID NO:8, se indican con un punto (.), y los huecos en la secuencia se indican con un guión (-). La Figura 5 muestra una alineación de la secuencia de un polipéptido de la invención (SEQ ID NO:12), con hulFN-alfa 14a (SEQ ID NO:39) (LelF H; Goeddel et al. (1981 ) Nature 290:20-26), utilizando los siguientes parámetros: matriz BLOSUM62, penalización por abertura del hueco 11 , penalización por extensión del hueco 1. Las posiciones de los aminoácidos en las posiciones SEQ ID NO:39, que son idénticas a la SEQ ID NO:12, se indican con un punto (.). La Figura 6 muestra la matriz de sustitución BLOSUM62. Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran ejemplos de los cálculos de las calificaciones de la alineación utilizadas para determinar las alineaciones óptimas de la secuencia, utilizando los siguientes parámetros: matriz BLOSUM62, penalización por abertura del hueco = 11 y penalización por extensión del hueco = 1.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones A menos que se defina de otra manera en la presente o en el resto de la especificación, todos los términos técnicos o científicos en la presente, tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por aquellos con experiencia en la técnica a la cual pertenece la invención. Una "secuencia polipeptídica" (por ejemplo, una proteína, polipéptido, péptido, etc.), es un polímero de aminoácidos que comprende aminoácidos naturales o análogos de aminoácidos artificíales, o una secuencia de caracteres que representa un polímero de aminoácidos, dependiendo del contexto. Dada la degeneración del código genético, uno o más ácidos, o los ácidos nucleicos complementarios de los mismos, que codifican una secuencia polipeptídica específica, pueden determinarse a partir de la secuencia polipeptídica. Una "secuencia polinucleotídica" (por ejemplo, un ácido nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, etc.), es un polímero de nucleótidos que comprende los nucleótidos A,C,T,U,G, u otros nucleótidos naturales o análogos nucleotídicos artificiales, o una secuencia de caracteres que representa un ácido nucleico, dependiendo del contexto. El ácido nucleico dado o el ácido nucleico complementario pueden determinarse a partir de cualquier secuencia polinucleotídica especificada. La numeración de un polímero de aminoácido o polímero de ácido nucleico dado "corresponde a" o es "relativa a" la numeración de un polímero de aminoácido o polímero de ácido nucleico seleccionado cuando la posición de cualquier componente del polímero dado (por ejemplo, aminoácido, nucleótido, también referidos genéricamente como un "residuo"), se designa con referencia a la misma o a una porción equivalente en el polímero de aminoácido o ácido nucleico seleccionado, más que por la posición numérica real del componente en el polímero dado. Así, por ejemplo, la numeración de una posición del aminoácido dado en una secuencia polipeptídica dada, corresponde a la misma posición del aminoácido o equivalente en una secuencia polipeptídica seleccionada, utilizada como una secuencia de referencia.

Una "posición equivalente" (por ejemplo, una "posición equivalente del aminoácido" o "posición equivalente del residuo"), se define en la presente como una posición (tal como, una posición del aminoácido o una posición del residuo), de una secuencia polipeptídica de prueba, la cual se alinea con una posición correspondiente de una secuencia polipeptídica de referencia, utilizando un algoritmo de alineación como se describe en la presente. La posición equivalente del aminoácido de la secuencia polipeptídica de prueba no necesita tener el mismo número de la posición numérica que la posición correspondiente del polipéptido de prueba. Como un ejemplo, la Figura 2 muestra la secuencia de un polipéptido de la invención (SEQ ID NO:1 ), alineado con varias secuencias polipeptídicas conocidas del interferón alfa humano. En este ejemplo, se considera que el número 47 de la posición del aminoácido de la SEQ ID NO:1 , es una posición equivalente del aminoácido (es decir, es "equivalente a"), con aquella posición del aminoácido con el número 46 de la SEQ ID NO:32 (hulFN-alfa 2b), puesto que el aminoácido número 47 de la SEQ ID NO:1 se alinea con el aminoácido número 46 de la SEQ ID NO:32. En otras palabras, la posición 47 del aminoácido de la SEQ ID NO:1 corresponde con la posición 46 del aminoácido de la SEQ ID NO:32. De igual manera, se entiende que el residuo H47 en la SEQ ID NO:1 corresponde al residuo Q47 en la SEQ ID NO:5, de manera que, por ejemplo, la sustitución H47C con relación a la SEQ ID NO:1 , se entiende que corresponde a la sustitución Q47C en, por ejemplo, la SEQ ID NO:5 (y así sucesivamente).

La terminología utilizada para identificar las posiciones de los aminoácidos y las sustituciones de los aminoácidos se ilustra como sigue: H47 indica la posición número 47 ocupada por un residuo de histidina (His) en una secuencia de aminoácidos de referencia, por ejemplo, la SEQ ID NO:1. H47Q indica que el residuo de histidina de la posición 47 se ha sustituido con un residuo de glutamina (Gln). Las sustituciones alternas se indican con una 7", por ejemplo, H47S/T significa una secuencia de aminoácidos en la cual el residuo de histidina en la posición 47, está sustituido con un residuo de serina o de treonina. Las sustituciones múltiples pueden indicarse con un "+", por ejemplo, H47Q+V51S/T significa una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución del residuo de histidina en la posición 47, con un residuo de glutamina y una sustitución del residuo de valina en la posición 51 con un residuo de serina o de treonina. Las supresiones se indican por un asterisco. Por ejemplo, H47* indica que el residuo de histidina en la posición 47 se ha suprimido. Las supresiones de dos o más aminoácidos continuos pueden indicarse como sigue, por ejemplo, R161*-E166* indica la supresión de los residuos R161-E166 inclusive (esto es, los residuos 161 , 162, 163, 164, 164 y 166 se suprimen). Las inserciones se indican de la siguiente manera: la inserción de un residuo de serina adicional después del residuo de histidina localizado en la posición 47, se indica como H47HS. Las sustituciones e inserciones combinadas se indican de la siguiente manera: la sustitución del residuo de histidina en la posición 47 con un residuo de serina y la inserción de un residuo de alanina después del residuo de aminoácido en la posición 47, se indica como H47SA. A menos que se indique de otra manera, la numeración de la posición de los residuos de aminoácidos expuesta en la presente, es con relación a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 . Se entenderá que aunque los ejemplos y modificaciones al polipéptido original se proporcionan generalmente en la presente con relación a la SEQ ID NO:1 (o con relación a otra secuencia especificada), los ejemplos pertenecen a otros polipéptidos de la invención y las modificaciones descritas en la presente pueden hacerse en posiciones equivalentes de los aminoácidos de cualquiera de los otros polipéptidos descritos en la presente. Así, como un ejemplo, la sustitución H47C con relación a la SEQ ID NO:1 , se entiende que corresponde a la sustitución Q47C en la SEQ ID NO:5 y así sucesivamente. El término "que exhibe (o exhibe, o tienen, o tiene) una actividad del ¡nterferón alfa", pretende indicar que el polipéptido o el conjugado de la invención tiene al menos una actividad exhibida por un polipéptido del ¡nterferón alfa de referencia (tal como, por ejemplo, un polipéptido del ¡nterferón alfa humano, por ejemplo, hulFN-alfa 2b identificado en la presente como SEQ ID NO:32, hulFN-alfa 2a identificado en la presente como la SEQ ID NO:32+R23K, hlFN-alfa 8b identificado en la presente como la SEQ ID NO:37, o cualquier otro polipéptido del ¡nterferón alfa humano conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, aquéllos mostrados en las Figuras 2 y 4 de la presente y/o listados en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra). Tal actividad incluye la capacidad de señalar a través de un receptor del interferon alfa, como se pone en evidencia, por ejemplo, por uno o más de: inhibición de la replicación viral en las células infectadas con el virus ("actividad antiviral"); aumento de la diferenciación de los linfocitos T sin estimular a un fenotipo TH1 y/o la supresión o diferenciación de los linfocitos T sin estimular a un fenotipo TH2 ("actividad de diferenciación a TH1"); o inhibición de la proliferación celular ("actividad antiproliferativa"). Una o más de las actividades del ¡nterferón alfa se prueban utilizando ensayos conocidos en la técnica y/o descritos en los Ejemplos. Se considera que un polipéptido o un conjugado que exhibe una actividad del ¡nterferón alfa, tiene tal actividad cuando muestra una actividad mensurable, por ejemplo, una actividad antiviral, una actividad antiproliferativa, o una actividad de diferenciación a ??1 mensurable (por ejemplo, como se determina por los ensayos conocidos en la técnica y/o descritos en los Ejemplos). Alguien con experiencia en la técnica reconoce que lo que constituye una actividad mensurable depende en parte de la naturaleza del ensayo que se lleva a cabo, pero como un lineamiento general, una actividad mensurable es una en la cual la señal del ensayo generada en la presencia del compuesto de prueba (por ejemplo, un polipéptido de la invención), es cuantificablemente diferente que la señal del ensayo generada en ausencia del compuesto de prueba. Se entenderá que el polipéptido o conjugado de la invención no necesita exhibir todas las actividades conocidas de un interferon alfa de referencia particular, o exhibir tales actividades al mismo grado que el interferón alfa de referencia. En algunos casos, la actividad exhibida por un polipéptldo o conjugado de la invención (como se evidencia, por ejemplo, por una EC50, actividad específica, u otro valor relacionado con la actividad), puede ser igual que, menor que o mayor que aquélla actividad particular exhibida por el interferón alfa de referencia. Una "variante", es un polipéptido que comprende una secuencia que difiere en una o más posiciones de los aminoácidos de aquélla de una secuencia polipeptídica original. Por ejemplo, una variante puede comprender una secuencia que difiere de la secuencia polipeptídica original hasta un 10% del número total de residuos de la secuencia polipeptídica original, tal como hasta un 8% de los residuos, por ejemplo, hasta un 5%, 4%, 3% 2% o 1 % del número total de residuos de la secuencia polipeptídica original. Por ejemplo, una variante de la SEQ ID NO:1 , puede comprender una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:1 en 1-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 1-15 posiciones de los aminoácidos, en 1-14 posiciones de los aminoácidos, en 1-13 posiciones de los aminoácidos, en 1-12 posiciones de los aminoácidos, en 1-11 posiciones de los aminoácidos, en 1-10 posiciones de los aminoácidos, en 1-9 posiciones de los aminoácidos, en 1-8 posiciones de los aminoácidos, en 1-7 posiciones de los aminoácidos, en 1-6 posiciones de los aminoácidos, en 1-5 posiciones de los aminoácidos, en 1-4 posiciones de los aminoácidos, en 1-3 posiciones de los aminoácidos o en 1-2 posiciones de los aminoácidos.

El término "polipéptido original" o "interferón alfa original", pretende indicar la secuencia polipeptídica a ser modificada de acuerdo con la presente invención. La secuencia polipeptídica original puede ser aquélla de un IFN-alfa natural (tal como un IFN-alfa de mamífero, por ejemplo, un IFN-alfa de primate, tal como un IFN-alfa de humano, tal como el polipéptido de hulFN-alfa identificado aquí como la SEQ ID NO:31-42, SEQ ID NO:32+R23K, u otra secuencia de hu IFN-alfa descrita en la presente y/o en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra). La secuencia polipeptídica original puede ser aquélla de un interferón alfa no natural (es decir, "sintético"), tal como el IFN-alfa Con1 (SEQ ID NO:43). En algunos casos, el polipéptido original a ser modificado puede ser el mismo o un polipéptido de la invención, tal como, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104. "Natural" como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza, a diferencia de ser producido artificialmente por el hombre. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo tejido de virus, bacteria, protozoarios, insectos, plantas o mamíferos), que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio, es natural. "No natural" (también denominado "sintético" o "artificial"), como se aplica a un objeto, significa que el objeto no es natural -- es decir, el objeto no puede encontrarse en la naturaleza, a diferencia de ser producido artificialmente por el hombre.

Un "fragmento" o "subsecuencia", es cualquier porción de una secuencia completa, pero que no incluye la secuencia completa. Así, un fragmento o subsecuencia se refiere a una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos, que comprende una parte de una secuencia más larga de aminoácidos (por ejemplo, polipéptido) o ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótido). Un tipo de fragmento contemplado por la presente invención, es un fragmento en el cual los residuos de aminoácido se eliminan del término N o del término C del polipéptido original (o ambos); de manera que un polipéptido se considera que está "truncado N terminalmente" o "truncado C terminalmente", respectivamente. Se sabe que una supresión de al menos los primeros cuatro aminoácidos del término N, no afecta de manera significativa la actividad del interferón alfa (Lydon, N.B. et al. (1985) Biochemistry 24: 4131-41 ). Además, se han descrito variantes que retienen la actividad del interferón alfa, en donde entre 7 y 1 1 aminoácidos se han suprimido del término C (Cheetham B.F. et al. (1991 ) Antiviral Res. 15(1 ):27-39; Chang N.T. et al. (1983) Arch. Biochem Biophys. 221 (2): 585-589; Franke A.E. et al. (1982) DNA 1 (3):223-230). Un "receptor", por ejemplo, un "receptor del interferón alfa" (también conocido como un "receptor del interferón del Tipo I"), es un receptor que es activado en las células por un interferón alfa, por ejemplo, se une a un interferón alfa e inicia la señalización intracelular, tal como un receptor del interferón del tipo I, que comprende las subunidades IFNAR-2 e IFNAR-1 del receptor (Domanski et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(6):3144-3147; Mogensen et al., (1999) Journal of Interferon and Cytokine Research, 19:1069-1098). En el contexto de esta invención, el receptor también pretende incluir las formas truncas de una molécula receptora de longitud completa, tal como, por ejemplo, una molécula receptora que carece de una porción que se une a la membrana, tal como una forma soluble de una molécula receptora (también conocida como un "receptor soluble"), que comprende un dominio de unión extracelular, que se une al interferon alfa, pero que no necesariamente se une a una membrana y/o inicia la señalización intracelular. Una "afinidad de unión específica" entre dos moléculas, por ejemplo, un ligando y un receptor, significa una unión preferencial de una molécula por otra en una mezcla de moléculas. La unión de las moléculas se considera típicamente específica, si la afinidad de la unión es de aproximadamente 1 x 104 M"1 a aproximadamente 1 x 109 M 1 o mayor (es decir, KD de aproximadamente 10"4 a 10"9 o menos). La afinidad de unión de un ligando y un receptor puede medirse mediante técnicas estándar conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Los ejemplos no limitantes de técnicas bien conocidas para medir las afinidades de unión, incluyen la tecnología Biacore® (Biacore AB, Suecia), la microcalorimetría con titulación isotérmica (MicroCal LLC, Northampton, MA EUA), ELISA y FACS. Por ejemplo, puede utilizarse FACS u otros métodos de clasificación para seleccionar las poblaciones de moléculas (tales como, por ejemplo, los ligandos mostrados en la superficie celular), que se unen específicamente al miembro del par de unión asociado (tal como un receptor, por ejemplo, un receptor soluble). Los complejos de ligando-receptor pueden detectarse y clasificarse por ejemplo, mediante fluorescencia (por ejemplo, haciendo reaccionar el complejo con un anticuerpo fluorescente que reconoce el complejo). Las moléculas de interés que se unen a un miembro del par de unión asociado (por ejemplo, receptor), se reúnen y reclasifican en la presencia de concentraciones menores del receptor. Al realizar múltiples rondas, clasificando en la presencia de concentraciones que disminuyen del receptor (un intervalo de concentración ejemplar es del orden de 10"6 M hasta 10"9 M, es decir, 1 micromolar (µ?) hasta 1 nanomolar (nM), o menos, dependiendo de la naturaleza de la interacción ligando-receptor), pueden aislarse poblaciones de la molécula de interés, que exhiban la afinidad de unión específica por el receptor. Un polipéptido, ácido nucleico u otro componente está "aislado" cuando está parcial o completamente separado de los componentes con los cuales está asociado normalmente (otros péptidos, polipéptidos, proteínas (incluyendo complejos, por ejemplo, polimerasas y ribosomas que pueden acompañar una secuencia nativa), ácidos nucleicos, células, reactivos sintéticos, contaminantes celulares, componentes celulares, etc.), por ejemplo, tal como de otros componentes, con los cuales está normalmente asociado en la célula de la cual se derivó originalmente. Un polipéptido, ácido nucleico u otro componente, está aislado cuando es parcial o completamente recuperado o separado de otros componentes de su medio natural, de manera que es la especie predominante presente en una composición, mezcla o colección de componentes (es decir, en una base molar, es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunos casos, la preparación consiste de más que aproximadamente 60%, 70% o 75%, típicamente, más que aproximadamente 80%, o de manera preferida, más que aproximadamente 90% de las especies aisladas. Un ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN), polipéptido o proteína, o composición "sustancialmente puro" o "aislado", también significa que las especies objeto (por ejemplo, el ácido nucleico o el polipéptido), comprenden al menos aproximadamente 50, 60 ó 70 por ciento en peso (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Una composición sustancialmente pura o aislada puede comprender también al menos aproximadamente 80, 90 ó 95 por ciento en peso de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. Una especie objeto aislada también puede purificarse hasta una homogeneidad esencial (los contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de inspección convencionales), en donde la composición consiste esencialmente de derivados de una sola especie macromolecular. El término "purificado", denota generalmente que un ácido nucleico, polipéptido o proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforético. Significa típicamente que el ácido nucleico, polipéptido o proteína está al menos aproximadamente 50% puro, 60% puro, 70% puro, 75% puro, de manera más preferida, al menos aproximadamente 85% puro, y de manera aún más preferida, al menos aproximadamente 99% puro. El término "ácido nucleico aislado", puede referirse a un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN), que no está inmediatamente contiguo a ambas de las secuencias codificantes con las cuales está inmediatamente contiguo (es decir, una en el extremo 5' y una en el extremo 3'), en el genoma natural del organismo del cual se deriva el ácido nucleico de la invención. Así, este término incluye, por ejemplo, un ADNc o un fragmento genómico de ADN producido mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el tratamiento con endonucleasa de restricción, ya sea que tal ADNc o fragmento de ADN genómico se incorpore en un vector, se integre en el genoma de la misma o una especie diferente que el organismo, incluyendo, por ejemplo, un virus, del cual se derivó originalmente, se enlace a una secuencia codificante adicional para formar un gen híbrido que codifica un polipéptido quimérico, o independiente de cualesquier otras secuencias de ADN. El ADN puede ser de doble hebra o de una sola hebra, sentido o antisentido. Un "polinucleótido recombinante" o un "polipéptido recombinante", es un polinucleótido o polipéptido no natural, que puede incluir secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, respectivamente, de más de una fuente de ácidos nucleicos o polipéptidos, fuente de ácidos nucleicos o polipéptidos la cual puede ser un ácido nucleico o un polipéptido natural, o la misma puede haberse sometido a mutagénesis u otro tipo de modificación. Un ácido nucleico o polipéptido puede considerarse "recombinante", cuando es sintético o artificial o modificado tecnológicamente, o derivado de un polipéptido o ácido nucleico sintético o artificial o modificado tecnológicamente. Un ácido nucleico recombinante (por ejemplo, ADN o ARN), puede hacerse mediante la combinación (por ejemplo, combinación artificial) de al menos dos segmentos de la secuencia que no están incluidos juntos típicamente, ni asociados típicamente uno con el otro, o están de otra manera separados típicamente uno del otro. Un ácido nucleico recombinante puede comprender una molécula de ácido nucleico formada por la unión o combinación de segmentos de ácidos nucleicos de diferentes fuentes y/o sintetizados artificialmente. Un "polipéptido recombinante" con frecuencia se refiere a un polipéptido que resulta de un ácido nucleico clonado o recombinante. La fuente de polinucleótidos o polipéptidos de la cual se derivan las diferentes secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, son algunas veces homologas (es decir, tienen o codifican un polipéptido que codifica la misma o una estructura y/o función similar), y son con frecuencia de diferentes aislados, serotipos, cepas, especies de organismos o por ejemplo de diferentes estados de enfermedad. El término "recombinante", cuando se utiliza con referencia, por ejemplo, a una célula, polinucleótido, vector, proteína o polipéptido, indica típicamente que la célula, polinucleótido o vector se ha modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo (o extraño), o la alteración de un ácido nucleico nativo, o que la proteína o polipéptido se ha modificado por la introducción de un aminoácido heterólogo, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Las células recombinantes expresan las secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan las secuencias nativas de ácidos nucleicos que, de otra manera, serían expresados anormalmente, subexpresados o no expresados por completo. El término "recombinante", cuando se utiliza con referencia a una célula, indica que la célula replica un ácido nucleico heterólogo, o expresa un polipéptido codificado por un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden contener secuencias codificantes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también pueden contener secuencias codificantes encontradas en la forma nativa de la célula, en donde las secuencias codificantes son modificadas y reintroducidas en la célula por medios artificiales. El término también abarca células que contienen un ácido nucleico endógeno a la célula que se ha modificado, sin eliminar el ácido nucleico de la célula; tales modificaciones incluyen aquéllas obtenidas por el reemplazo génico, mutación específica en el sitio, recombinación y técnicas relacionadas. El término "producido de manera recombinante", se refiere a una combinación artificial, lograda usualmente por medio de síntesis química, recombinación de una secuencia recursiva de segmentos de ácidos nucleicos u otros métodos de generación de la diversidad (tal como, por ejemplo, redistribución) de los nucleótidos, o manipulación de los segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de modificación genética conocidas por aquéllos con experiencia ordinaria en la técnica. "Expresado de manera recombinante", se refiere típicamente a técnicas para la producción de un ácido nucleico recombinante in vitro, y la transferencia del ácido nucleico recombinante en células in vivo, in vitro, o ex vivo, en donde pueden expresarse o propagarse. Un "cásete de expresión recombinante" o simplemente un "cásete de expresión", es un constructo de ácido nucleico, generado de manera recombinante o sintética, con elementos del ácido nucleico que son capaces de efectuar la expresión de un gen estructural en hospederos compatibles con tales secuencias. Los casetes de expresión incluyen al menos, promotores y opcionalmente, señales de terminación de la transcripción. Típicamente, el cásete de expresión recombinante incluye un ácido nucleico a ser transcrito (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado), y un promotor. También pueden utilizarse factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, como se describe en la presente. Por ejemplo, un cásete de expresión también puede incluir secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia de la señal que dirige la secreción de una proteína expresada de la célula hospedera. Las señales de terminación de la transcripción, mejoradores y otras secuencias de ácidos nucleicos que influencian la expresión del gen, también pueden incluirse en un cásete de expresión. Un "inmunógeno" se refiere a una sustancia capaz de provocar una respuesta inmune, e incluye, por ejemplo, antígenos, autoantígenos que juegan un papel en la inducción de las enfermedades autoinmunes y los antígenos asociados con el tumor expresados en las células cancerosas. Una respuesta inmune se refiere generalmente al desarrollo de una respuesta celular o mediada por un anticuerpo a un agente, tal como un antígeno o fragmento del mismo o un ácido nucleico que codifica tal agente. En algunos casos, tal respuesta comprende la producción de al menos uno o una combinación de CTL, linfocitos B o varias clases de linfocitos T que están dirigidos específicamente a las células que presentan el antígeno que expresan el antígeno de interés. Un "antígeno", se refiere a una sustancia que es capaz de provocar la formación de anticuerpos en un hospedero o generar una población específica de linfocitos, que reaccionan con esa sustancia. Los antígenos son típicamente macromoléculas (por ejemplo, proteínas y polisacáridos), que son extraños al hospedero. Un "adyuvante", se refiere a una sustancia que mejora las propiedades que estimulan la inmunidad del antígeno o el efecto farmacológico de un fármaco. Un adyuvante puede no mejorar específicamente la respuesta inmune a un antígeno. El "adyuvante completo de Freund", por ejemplo, es una emulsión de aceite y agua que contiene un inmunógeno, un agente emulsificante y micobacterias. Otro ejemplo, el "adyuvante incompleto de Freund" es lo mismo, pero sin micobacterias. Un vector es un componente o composición para facilitar la transducción o transfección de la célula, por un ácido nucleico seleccionado, o la expresión del ácido nucleico en la célula. Los vectores incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus, YAC, bacterias, polilisina, etc. Un "vector de expresión" es un constructo o secuencia de ácidos nucleicos, generada de manera recombinante o sintética, con una serie de elementos específicos de los ácidos nucleicos que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula hospedera. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye típicamente un ácido nucleico a ser transcrito, enlazado de manera operativa a un promotor. El ácido nucleico a ser transcrito está, típicamente bajo la dirección o control del promotor. "Sustancialmente toda la longitud de una secuencia polinucleotídica" o "sustancialmente toda la longitud de una secuencia polipeptídica", se refiere a al menos 50%, generalmente al menos aproximadamente 60%, 70% o 75%, usualmente al menos aproximadamente 80%, o típicamente al menos aproximadamente 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de la longitud de una secuencia polinucleotídica o una secuencia polipeptídica. El término "¡nmunoensayo", incluye un ensayo que utiliza un anticuerpo o un inmunógeno para unir o unir específicamente un antígeno. El ¡nmunoensayo está caracterizado típicamente por el uso de las propiedades de unión específicas de un anticuerpo particular para aislar, identificar y/o cuantificar el antígeno.

El término "sujeto" como se utiliza en la presente incluye, de manera no exclusiva, un organismo; un mamífero, incluyendo, por ejemplo, un humano, un primate no humano (por ejemplo, babuino, orangután, mono), ratón, cerdo, vaca, cabra, gato, conejo, rata, cobayo, hámster, caballo, mono, oveja u otro mamífero no humano; un no mamífero incluyendo, por ejemplo, un vertebrado no mamífero, tal como un pájaro (por ejemplo, un pollo o pato) o un pez, y un invertebrado no mamífero. El término "composición farmacéutica", significa una composición adecuada para el uso farmacéutico en un sujeto, incluyendo un animal o humano. Una composición farmacéutica generalmente comprende una cantidad efectiva de un agente activo y un portador, incluyendo, por ejemplo, un portador farmacéuticamente aceptable. El término "cantidad efectiva", significa una dosis o cantidad suficiente para producir un resultado deseado. El resultado deseado puede comprender una mejora objetiva o subjetiva en el receptor de la dosis o cantidad. Un "tratamiento profiláctico", es un tratamiento administrado a un sujeto que muestra signos o síntomas de una enfermedad, patología o trastorno médico, o muestra únicamente signos o síntomas tempranos de una enfermedad, patología o trastorno, de manera que el tratamiento se administra con el propósito de disminuir, prevenir o disminuir el riesgo de desarrollar la enfermedad, patología o trastorno médico. Un tratamiento profiláctico funciona como un tratamiento preventivo contra una enfermedad o trastorno.

Una "actividad profiláctica" es una actividad de un agente, tal como un ácido nucleico, vector, gen, polipéptido, proteína, sustancia o composición del mismo, que cuando se administra a un sujeto que no muestra signos o síntomas de patología, enfermedad o trastorno, o que muestra únicamente signos o síntomas iniciales de la patología, enfermedad o trastorno, disminuye, previene o disminuye el riesgo de que el sujeto desarrolle una patología, enfermedad o trastorno. Un agente o compuesto (por ejemplo, ácido nucleico o polipéptido) "profilácticamente útil", se refiere a un agente o compuesto que es útil para disminuir, prevenir, tratar o disminuir el desarrollo de la patología, enfermedad o trastorno. Un "tratamiento terapéutico", es un tratamiento administrado a un sujeto, que muestra síntomas o signos de una patología, enfermedad o trastorno, tratamiento el cual se administra al sujeto con el propósito de disminuir o eliminar aquellos signos o síntomas de la patología, enfermedad o trastorno. Una "actividad terapéutica", es la actividad de un agente, tal como un ácido nucleico, vector, gen, polipéptido, proteína, sustancia o composición del mismo, que elimina o disminuye los signos o síntomas de la patología, enfermedad o trastorno, cuando se administra a un sujeto que sufre de tales signos o síntomas. Un agente o compuesto (por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido) "terapéuticamente útil", indica que un agente o compuesto es útil para disminuir, tratar o eliminar tales signos o síntomas de una patología, enfermedad o trastorno.

El término "gen" se refiere ampliamente a cualquier segmento de ADN asociado con una función biológica. Los genes incluyen secuencias codificantes y/o secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Los genes también incluyen segmentos de ácido nucleico del ADN no expresado que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas (por ejemplo, promotor, mejorador, u otras regiones reguladoras). Los genes pueden obtenerse de una variedad de fuentes, incluyendo clonación de una fuente de interés o sintetización de información con una secuencia conocida o predicha, y pueden incluir secuencias diseñadas para tener los parámetros deseados. Generalmente, la nomenclatura utilizada de aquí en adelante y los procedimientos de laboratorio en el cultivo celular, la genética molecular, la biología molecular, la química de los ácidos nucleicos y la química de las proteínas descritos a continuación, son aquéllos bien conocidos y empleados comúnmente por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Se utilizan técnicas estándar, tales como las descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (de aquí en adelante "Sambrook"), y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (1994, suplementada hasta 1999) (de aquí en adelante "Ausubel"), para los métodos del ácido nucleico recombinante, la síntesis del ácido nucleico, los métodos del cultivo celular y los métodos de la incorporación del transgen, por ejemplo, electroporacion, inyección, cañón génico, impresión a través de la piel y lipofección. Generalmente, los pasos de la síntesis y purificación del oligonucleótido se realizan de acuerdo con las especificaciones. Las técnicas y procedimientos se realizan de acuerdo con los métodos convencionales en la técnica y varias referencias generales que se proporcionan en este documento. Se cree que los procedimientos de la presente son bien conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, y se proporcionan para la conveniencia del lector. Como se utiliza aquí, un "anticuerpo", se refiere a una proteína que comprende uno o más polipéptidos codificados sustancial o parcialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. El término anticuerpo se utiliza para referirse a anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, así como una multitud de genes de la región variable de la inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon, las cuales a su vez, definen las clases de la inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural típica de la inmunoglobulina (por ejemplo, anticuerpo), comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 KDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 KDa). El término N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH), se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente. Los anticuerpos también incluyen anticuerpos monoclonales compuestos con un solo brazo, anticuerpos con una sola cadena, incluyendo anticuerpos Fv con una sola cadena (sFv), en los cuales una cadena pesada variable y una cadena ligera variable se unen (directamente o a través de un enlazante peptídico) para formar un polipéptido continuo, así como diacuerpos, tricuerpos y tetracuerpos (Pack et al. (1995) J Mol Biol 246:28; Biotechnol 1 1 :1271 ; y Biochemistry 31 :1579). Los anticuerpos son, por ejemplo, policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, de una sola cadena, fragmentos de Fab, fragmentos producidos por una cadena de expresión de Fab o lo similar. El término "epítope" significa una proteína determinante, capaz de la unión específica a un anticuerpo. Los epítopes consisten usualmente de agrupaciones de moléculas con una superficie químicamente activa, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopes conformacionales y no conformacionales, se distinguen en que la unión al primero, pero no al último, se pierde en la presencia de solventes desnaturalizantes.

Un "fragmento que se une al antígeno" de un anticuerpo, es un fragmento de péptido o polipéptido del anticuerpo que se une a un antígeno. Un sitio de unión al antígeno se forma por aquellos aminoácidos del anticuerpo que contribuyen con, están involucrados en, o afectan la unión del antígeno. Véase, Scott, T.A. y Mercer, E.I., Concise Encyclopedia: Biochemistry and Molecular Biology (de Gruyter, 3d ed. 1997) y Watson, J.D. et al., Recombinant DNA (2a ed. 1992) [de aquí en adelante "Watson, ADN Recombinante"], cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad para todos los propósitos. El término "clasificación" describe, en general, un procedimiento que identifica las moléculas óptimas de la presente invención, tal como, por ejemplo, los polipéptidos de la invención, y los polipéptidos de fusión relacionados, que incluyen los mismos, y los ácidos nucleicos que codifican todas esas moléculas. Pueden utilizarse varias propiedades de estas moléculas respectivas en la selección y clasificación, por ejemplo: una capacidad de una molécula respectiva para unirse a un ligando o a un receptor, para inhibir la proliferación celular, para inhibir la replicación viral en las células infectadas con el virus, para inducir o inhibir la producción de la atocina celular, para alterar una respuesta inmune, por ejemplo, inducir o inhibir una respuesta inmune deseada, en un sistema de prueba o una aplicación in vitro, ex vivo o in vivo. En el caso de los antígenos, pueden utilizarse varias propiedades del antígeno en la selección y clasificación, incluyendo la selección del antígeno, el plegado, estabilidad, inmunogenicidad y presencia de epítopes de varios antígenos relacionados. La "selección" es una forma de clasificación, en la cual la identificación y la separación física se logra simultáneamente mediante, por ejemplo, la expresión de un marcador de selección, el cual, en algunas circunstancias genéticas, permite que las células que expresan el marcador sobrevivan, mientras que las otras células mueren (o viceversa). Los marcadores de la clasificación incluyen, por ejemplo, luciferasa, beta-galactosidasa y proteína fluorescente verde y lo similar. Los marcadores de la selección incluyen genes resistentes a los fármacos y a las toxinas, y lo similar. Otro modo de selección involucra la clasificación física basada en un evento detectable, tal como la unión de un ligando a un receptor, la reacción de un sustrato con una enzima, o cualquier otro proceso físico que pueda generar una señal detectable, ya sea directa (por ejemplo, utilizando un sustrato o ligando cromogénico) o indirectamente (por ejemplo, reaccionando con un anticuerpo cromogénico secundario). La selección mediante la clasificación física puede lograrse por una variedad de métodos, tal como mediante FACS en formatos en células completas o en microgotas. Un ácido nucleico "exógeno", "segmento de ADN exógeno", "secuencia heteróloga" o "ácido nucleico heterólogo", como se utiliza en la presente, es uno que se origina de una fuente extraña a la célula hospedera particular o, si es de la misma fuente, se modifica desde su forma original. Así, un gen heterólogo en una célula hospedera incluye un gen que es endógeno a la célula hospedera particular, pero que se ha modificado. La modificación de una secuencia heterologa en las aplicaciones descritas en la presente, ocurre típicamente a través del uso de una recombinación recursiva de la secuencia. El término se refiere a un segmento de ADN que es extraño o heterologo a la célula u homólogo a la célula, pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedera en la cual el elemento no se encuentra ordinariamente. Los segmentos de ADN exógeno, se expresan para proporcionar polipéptidos exógenos. El término "ácido nucleico", se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y a polímeros de los mismos, en forma de una sola hebra o de doble hebra. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen los análogos conocidos de los nucleótidos naturales, que tienen propiedades de unión similares que las del ácido nucleico de referencia, y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular, también abarca implícitamente las variantes modificadas de manera conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones degeneradas del codón) y las secuencias complementarias, y también la secuencia indicada explícitamente. De manera específica, las sustituciones degeneradas del codón pueden lograrse generando secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos), se sustituye con residuos con bases mezcladas y/o de desoxiinosina (Batzer et al. (1991 ) Nucleic Acid Res 19:5081 ; Ohtsuka et al. (1985) J Biol Chem 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol Cell Probes 8:91-98). El término ácido nucleico se utiliza de manera indistinta con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen. "Acido nucleico derivado de un gen", se refiere a un ácido nucleico para el cual la síntesis del gen, o una subsecuencia del mismo, ha servido finalmente como un patrón. Así, un ARNm, un ADNc transcrito de manera inversa de un ARNm, un ARN transcrito de ADNc, un ADN amplificado del ADNc, un ARN transcrito del ADN amplificado, efe, se derivan todos del gen y la detección de tales productos derivados, es indicativa de la presencia y/o abundancia del gen original y/o transcrito del gen en una muestra. Un ácido nucleico está "enlazado de manera operativa" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o mejorador está enlazado de manera operativa a una secuencia codificante, si incrementa la transcripción de la secuencia codificante. Enlazado de manera operativa significa que las secuencias de ADN que están enlazadas, están típicamente contiguas y, en donde es necesario unir dos regiones codificantes de la proteína, contiguas, y en un marco de lectura. Sin embargo, puesto que los mejoradores funcionan generalmente cuando están separados del promotor por varias kilobases y las secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos polinucleotídicos pueden estar enlazados de manera operativa, pero no contiguos.

El término "citocina" incluye, por ejemplo, interleucinas, interferones, quimiocinas, factores de crecimiento hematopoyéticos, factores de necrosis del tumor y factores de crecimiento transformantes. En general, éstas son proteínas de bajo peso molecular que regulan la maduración, activación, proliferación y diferenciación de las células del sistema inmune. En la presente descripción y reivindicaciones, cualquier referencia a "un" componente, por ejemplo, en el contexto de una porción no polipeptídica, un residuo de aminoácido, una sustitución, un amortiguador, un catión, etc., pretende referirse a uno o más de tales componentes, a menos que se indique de otra manera o a menos que esté claro del contexto particular que éste no sea el caso. Por ejemplo, la expresión "un componente seleccionado del grupo que consiste de A, B y C", pretende incluir todas las combinaciones de A, B y C, por ejemplo, A, B, C, A+B, A+C, B+C o A+B+C. Varios términos adicionales se definen o caracterizan de otra manera en la presente.

Moléculas y métodos de la invención Los pacientes con infección crónica con HCV tienen cargas virales típicamente en el intervalo de 104 - 107 copias de ARN HCV/ml de suero antes del tratamiento. Tras el tratamiento con el IFN-alfa, la carga viral en estos pacientes de manera característica, experimenta dos fases distintas logarítmicas-lineales de declinación (Figura 1 B; Neumann A.U., et al. (1998) Science 282:103-107). Se cree que la rápida caída inicial en la carga viral que ocurre dentro de los primeros dos días de la terapia con el IFN-alfa, se debe a la reducción mediada por el interferón alfa en la producción del virus en las células infectadas del hígado, y la protección concomitante de las células sin estímulos contra la infección. La velocidad de la producción viral alcanza un nuevo estado estacionario a aproximadamente dos días, tiempo en el cual se observa una segunda fase logarítmica-lineal de eliminación viral menos rápida. Se cree que esta segunda fase de eliminación viral se debe generalmente en parte, a la destrucción medida por los linfocitos T de las células infectadas del hígado (Neumann, et al., suprá). Se cree que el IFN-alfa juega un papel clave en esta respuesta biológica a través de la estimulación de los linfocitos T específicos para el antígeno, para diferenciarse en células TH1. Además, se cree que el modo de acción de la Ribavirina se debe al aumento de la respuesta a TH1 , y se piensa que es la base del mecanismo de su eficacia en la terapia de combinación con el IFN-alfa. Los pacientes infectados con HCV que no responden a las terapias con interferón alfa actualmente en uso (generalmente denominados "que no responden"), exhiben perfiles de eliminación de la carga viral mucho menos profundos (Figura 1A). Aunque la presente invención no pretende estar limitada a una teoría particular del mecanismo subyacente, se propone que la actividad antiviral en los sistemas de ensayo sustitutos (tales como aquéllos descritos con más detalle en la presente), puede ser predictiva de la eficacia del interferón alfa, por ejemplo, en la primera fase de la eliminación viral. Un ensayo antiviral ejemplar, descrito en la sección de los Ejemplos, verifica la efectividad del IFN-alfa para inhibir la replicación del EMCV (un ARN virus) en las células HuH7 derivadas del hígado humano, como un sistema sustituto para la replicación del HCV en las células del hígado humano. Los sistemas útiles adicionales de ensayo antiviral, incluyen EMCV en células WISH, y VSV en células WISH. Otro sistema de ensayo sustituto para la replicación del HCV en los hepatocitos infectados incluye sistemas del replicón del HCV, como se describe, por ejemplo, por Lohmann V., et al., (1999) Science 285(5424):285-3; Randall G. y Rice C.M. (2001 ) Curr Opin Infecí Dis 14(6):743-7; y Bartenschlager, R. (2002) Nature Reviews/Drug Discovery 1 :911. Un ejemplo de un sistema in vivo útil para verificar la eficacia antiviral del HCV es un ratón SCID quimérico de hígado humano, como se describe por Mercer, et al. (2001 ) Nature Medicine 7(8):927-933. Se propone además, sin estar limitado a una teoría, que el aumento de la diferenciación a ??1 y/o la supresión de la diferenciación a TH2 por el IFN-alfa, puede ser un factor que contribuye a la eficacia del interferón alfa, por ejemplo, en la segunda fase de la eliminación viral. De acuerdo con esta teoría, los IFN-alfa desarrollados con una potencia incrementada en estas actividades biológicas (es decir, la mejora de la diferenciación a TH1 y/o la supresión de la diferenciación a TH2), tendrían una eficacia incrementada predicha con relación a, por ejemplo, las moléculas terapéuticas de interferón alfa aprobadas actualmente, administradas a la misma dosificación. Un ensayo ejemplar, descrito en la sección de Ejemplos de la presente, verifica la mejora de la diferenciación a TH1 y/o la supresión de la diferenciación a TH2 por el IFN-alfa en las células TH0 sin estímulos, midiendo la producción de las citocinas asociadas con el fenotipo de TH1 (por ejemplo, IFN-gamma) y/o el fenotipo de TH2 (por ejemplo, IL-5, IL4), vía ELISA o vía tinción intracelular y clasificación mediante FACS. La eficacia terapéutica de las moléculas de IFN-alfa tiende a disminuir, en parte debido a las toxicidades que limitan la dosis, por ejemplo, trombocitopenia y neutropenia. Aunque la presente invención no pretende estar limitada por una teoría particular de un mecanismo subyacente, se propone que tal toxicidad puede estar asociada con los efectos antiproliferativos del IFN-alfa en lo precursores de las plaquetas y los neutrófilos, y que la actividad antiproliferativa en los sistemas de ensayo sustitutos (tales como aquéllos descritos en la presente), puede ser predictiva de la toxicidad relativa de una molécula de interferón alfa. Así, las toxicidades que limitan la dosis asociadas con la terapia con IFN-alfa, pueden disminuirse en las moléculas de IFN-alfa que exhiben una actividad antiproliferativa reducida con relación a, por ejemplo, las moléculas terapéuticas de interferón alfa aprobadas actualmente, tales como ROFERON®-A (Interferón alfa-2a, recombinante; Hoffmann-La Roche Inc.), INTRON® A (Interferón alfa-2b, recombinante; Schering Corporation) e INFERGEN® (interferón alfacon-1 ; InterMune, Inc.). Un ensayo ejemplar de la actividad antiproliferativa, descrito en la sección de Ejemplos en la presente, verifica el efecto del IFN-alfa en la proliferación de células linfoides humanas de Daudi. De manera alterna o adicional, las toxicidades que limitan la dosis pueden reducirse como resultado de administrar más moléculas terapéuticamente activas, lo cual permitiría dosificar a concentraciones menores o a una frecuencia menor que las moléculas aprobadas actualmente. Es un objeto de la invención proporcionar nuevos polipéptidos de interferón alfa y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. Algunos polipéptidos de la invención exhiben una actividad del interferón alfa, tal como, por ejemplo, actividad antiviral, actividad antiproliferativa y/o actividad de diferenciación a TH1. Algunos polipéptidos de la invención exhiben una o más de las siguientes propiedades: actividad antiviral incrementada o disminuida en comparación con un polipéptido de IFN-alfa de referencia; actividad de diferenciación a TH1 incrementada o disminuida en comparación con un polipéptido de IFN-alfa de referencia; actividad antiproliferativa incrementada o disminuida en comparación con un polipéptido de IFN-alfa de referencia. El polipéptido de IFN-alfa de referencia, puede comprender una secuencia de un interferón alfa no natural, tal como el IFN-alfa Con1 (SEQ ID NO:43), o puede comprender una secuencia de un polipéptido de interferón alfa natural (es decir, del tipo silvestre). Los ejemplos de las secuencias de los polipéptidos de interferón alfa naturales incluyen secuencias de polipéptidos de IFN-alfa humano, tales como, por ejemplo, hulFN-alfa 2b (SEQ ID NO:32), hulFN-alfa 2a (SEQ ID NO:32 con la posición 23 = Lys), hulFN-alfa 2c (SEQ ID NO:32 con la posición 34 = Arg), hulFN-alfa 8b (SEQ ID NO:33), hulFN-alfa 8a (SEQ ID NO:33 con las posiciones 98 = Val, 99 = Leu, 100 = Cys y 101 = Asp), hulFN-alfa 8c (SEQ ID NO:33 con la posición 161 = Asp y los aminoácidos en las posiciones 162-166 suprimidos), hulFN-alfa 14a (SEQ ID NO:39), hulFN-alfa 14c (SEQ ID NO:39 con la posición 152 = Leu), o una secuencia de cualquier otro polipéptido del ¡nterferón alfa humano natural, tal como aquélla mostrada en las Figuras 2 y 4 de la presente (SEQ ID NO:31-42) y/o listada en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra. En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos del interferón alfa que exhiben una eficacia mejorada para eliminar el HCV de las células infectadas, en comparación con una molécula de interferón alfa de referencia, tal como una empleada actualmente como un compuesto terapéutico (tal como, por ejemplo, ROFERON-A, INTRON A o INFERGEN). Tal eficacia mejorada puede surgir de una actividad antiviral mejorada, una actividad de diferenciación a TH1 mejorada, o ambas, con relación a la molécula de referencia. Algunos polipéptidos del interferón alfa de la invención pueden ser particularmente útiles para eliminar las cepas de HCV que muestran una respuesta deficiente al tratamiento con las moléculas de interferón alfa actualmente en uso, cepas tales como, por ejemplo, HCV del Genotipo 1. Algunos polipéptidos de la invención exhiben una relación incrementada de (actividad antiviral/actividad antiproliferativa), en comparación con la molécula de IFN-alfa de referencia y/o una relación incrementada de (actividad de diferenciación a TH1 /actividad antiproliferativa), en comparación con la molécula de IFN-alfa de referencia. Los polipéptidos que exhiben tales propiedades pueden ser particularmente efectivos en el tratamiento de infecciones virales, tales como infección por HCV. Algunos de tales polipéptidos pueden, por ejemplo, proporcionar una eficacia terapéutica mejorada con respecto a las moléculas de interferón alfa aprobadas actualmente, en el tratamiento de la HCV, en una o ambas fases del perfil de eliminación viral bifásico, y/o pueden exhibir una toxicidad reducida. Algunos de tales polipéptidos pueden proporcionar una eficacia terapéutica mejorada con respecto a las moléculas de interferón alfa aprobadas actualmente, en el tratamiento del HCV del Genotipo 1. Es otro objeto de la invención proporcionar conjugados, tales conjugados que comprenden una o más porciones no polipeptídicas enlazadas a un polipéptido de la invención, los cuales exhiben una actividad del interferón alfa (tal como una o más de las actividades listadas anteriormente), y que exhiben opcionalmente otras propiedades deseables, tales como una vida media en suero incrementada y/o una vida media funcional in vivo y/o antigenicidad disminuida, en comparación con el polipéptido no conjugado. Algunos de tales conjugados exhiben una eficacia mejorada para eliminar el HCV de las células infectadas, en comparación con una molécula de interferón alfa de referencia, tal como un conjugado de interferón alfa empleado actualmente como un compuesto terapéutico (tal como, por ejemplo, PEGASYS® (Peginterferon alfa-2a; Hoffmann-La Roche, Inc.) o PEG-INTRON® (peginterferon alfa-2b; Schering Corporation). Tal eficacia mejorada puede surgir de una actividad antiviral mejorada, una actividad de la diferenciación a TH1 mejorada, o ambas, con relación a la molécula de referencia. Algunos conjugados de interferón alfa de la invención pueden ser particularmente útiles para eliminar cepas de HCV que muestran una respuesta deficiente al tratamiento con las moléculas de interferón alfa actualmente en uso, cepas tales como, por ejemplo, el HCV del Genotipo 1. Algunos conjugados de la invención exhiben una relación incrementada de (actividad antiviral/actividad antiproliferativa), en comparación con la molécula de IFN-alfa de referencia y/o una relación incrementada de (actividad de diferenciación a TH1/actividad antiproliferativa), en comparación con la molécula de IFN-alfa de referencia. Los conjugados que exhiben tales propiedades pueden ser particularmente efectivos en el tratamiento de las infecciones virales, tales como infección por HCV. Algunos de tales conjugados pueden, por ejemplo, proporcionar una eficacia terapéutica mejorada con respecto a las moléculas de interferón alfa aprobadas actualmente para el tratamiento de HCV, en una o ambas fases del perfil de eliminación viral bifásico y/o pueden exhibir una toxicidad reducida. Algunos de tales conjugados pueden proporcionar una eficacia terapéutica mejorada con respecto a las moléculas de interferón alfa aprobadas actualmente, en el tratamiento del HCV del Genotipo 1. Es otro objeto de la invención proporcionar un método para inhibir la replicación viral en células infectadas con el virus, el método comprende administrar a las células infectadas con el virus un polipéptido o conjugado de la invención, en una cantidad efectiva para inhibir la replicación viral en las células. La invención también proporciona un método para reducir el número de copias de un virus en las células infectadas con el virus, que comprende administrar a las células infectadas con el virus un polipéptido o conjugado de la invención, en una cantidad efectiva para reducir el número de copias del virus en las células. El virus puede ser, por ejemplo, un ARN virus, tal como HCV, o un ADN virus, tal como HBV. Las células pueden estar en cultivo o aisladas de otra manera de un mamífero (es decir, in vitro o ex vivo), o pueden estar in vivo, por ejemplo, en un mamífero (por ejemplo, tal como un modelo de ratón SCID, como el descrito por Mercer, et al. (2001 ) Nature Medicine. 7(8): 927-933), en un primate o en el hombre. La invención también proporciona un método para mejorar la diferenciación a TH1 de las células TH0, que comprende administrar a una población que comprende células TH0, un polipéptido o conjugado de la invención, en una cantidad efectiva para incrementar la producción de una citocina asociada con el fenotipo de ??1 (por ejemplo, IFN-gamma) y/o disminuir la producción de una citocina asociada con el fenotipo de TH2 (por ejemplo, IL-4 o IL-5) en la población. La población puede estar en cultivo o aislada de otra manera de un mamífero (es decir, in vitro o ex vivo), o puede estar in vivo, por ejemplo, en un mamífero, en un primate o en el hombre. La invención también proporciona un método para inhibir la proliferación de una población celular, que comprende poner en contacto la población celular con un polipéptido, variante o conjugado de la invención, en una cantidad efectiva para disminuir la proliferación de la población celular.

La población celular puede estar en cultivo o aislada de otra manera de un mamífero (es decir, ¡n vitro o ex vivo), o puede estar in vivo, por ejemplo, en un mamífero, un primate o en el hombre. Estos y otros objetos de la invención se discuten con más detalle a continuación.

Polipéptidos de la invención La invención proporciona novedosos polipéptidos de interferón alfa, referidos de manera colectiva en la presente como "polipéptidos de la invención". El término "polipéptidos de la invención", pretende incluir completamente las variantes de las secuencias polipeptídicas descritas en la presente. También están incluidas en esta invención, las proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos de la invención, y los conjugados que comprenden los polipéptidos de la invención. Los fragmentos de varias secuencias que codifican el interferón alfa, se recombinaron de manera recursiva para formar bibliotecas que comprenden los polinucleótidos recombinantes, a partir de los cuales, se descubrieron algunos polipéptidos de la invención. Los métodos para obtener las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes y/o para obtener la diversidad de ácidos nucleicos utilizados como los sustratos para la recombinación recursiva de la secuencia también se describen mira. Los polipéptidos ejemplares de la invención, incluyen los polipéptidos que comprenden las secuencias identificadas en la presente como las SEQ ID NOS:1-15, tales como la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:15, codificadas por los ácidos nucleicos identificados en la presente como las SEQ ID NO:16-30, tales como la SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30. Los polipéptidos de la invención también incluyen aquéllos que comprenden las secuencias identificadas en la presente como las SEQ ID NOS:44-104, tales como la SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 , SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 , SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81 , SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91 , SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101 , SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103 y SEQ ID NO:104. Algunos de tales polipéptidos comprenden además un aminoácido adicional, tal como la metionina, agregada al término N. La invención también proporciona proteínas de fusión y conjugados que comprenden estos polipéptidos y ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipéptidos. La invención también incluye polipéptidos que comprenden secuencias que difieren en 0-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 0-16 posiciones, 0-15 posiciones, 0-14 posiciones, 0-13 posiciones, 0-12 posiciones, 0-1 1 posiciones, 0-10 posiciones, 0-9 posiciones, 0-8 posiciones, 0-7 posiciones, 0-6 posiciones, 0-5 posiciones, 0-4 posiciones, 0-3 posiciones, 0-2 posiciones, o 0-1 posiciones, de cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104, tal como, una de las SEQ ID NOS:1-15, 47 y 53 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). En algunos casos, el polipéptido exhibe una actividad del interferón alfa (por ejemplo, una actividad antiviral, una actividad de diferenciación a ??1 y/o una actividad antiproliferativa). Algunos de tales polipéptidos comprenden además un aminoácido adicional, tal como una metionina, agregada al término N. La invención también proporciona proteínas de fusión y conjugados que comprenden estos polipéptidos, y ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipéptidos.

En algunos casos, la secuencia del polipéptido de la invención comprende una sustitución de un aminoácido para un aminoácido diferente en una o más posiciones, incluyendo, de manera no exclusiva, las posiciones 47, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61 , 64, 69, 71 , 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161 y 162, con relación a cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15, 47 y 53, tal como, por ejemplo, la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53. En algunos casos, la secuencia polipeptídica comprende uno o más de: His o Gln en la posición 47; Val, Ala o Thr en la posición 51 ; Gln, Pro o Glu en la posición 52; Ala o Thr en la posición 53; Phe, Ser o Pro en la posición 55; Leu, Val o Ala en la posición 56; Phe o Leu en la posición 57; Tyr o His en la posición 58; et, Leu o Val en la posición 60; Met o lie en la posición 61 ; Thr o lie en la posición 64; Ser o Thr en la posición 69; Lys o Glu en la posición 71 ; Asn o Asp en la posición 72; Ala o Val en la posición 75; Ala o Thr en la posición 76; Trp o Leu en la posición 77; Asp o Glu en la posición 78; Glu o Gln en la posición 79; Thr, Asp, Ser o Arg en la posición 80; Glu o Asp en la posición 83; Lys o Glu en la posición 84; Phe o Leu en la posición 85; Tyr, Cys o Ser en la posición 86; He o Thr en la posición 87; Phe, Tyr, Asp o Asn en la posición 90; Met o Leu en la posición 93; Lys o Glu en la posición 133; Ser o Ala en la posición 140; Phe o Leu en la posición 154; Lys o Glu en la posición 160; Arg o Ser en la posición 161 ; y Arg o Ser en la posición 162; la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1. La invención también proporciona proteínas de fusión y conjugados que comprenden estos polipéptidos, y ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipéptidos. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una sustitución en una posición que en la molécula original se predice que contiene un residuo de aminoácido que está expuesto a la superficie de la molécula, por ejemplo, que se calcula que tiene al menos 25%, tal como al menos 50% de su cadena lateral expuesta en la superficie. Algunos de tales polipéptidos de la invención comprenden una sustitución de un aminoácido por un aminoácido diferente en una o más posiciones, incluyendo, de manera no exclusiva, las siguientes posiciones que contienen residuos de aminoácidos que tienen más que el 25% del Area Superficial Accesible (ASA) fraccionada: posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31 , 33, 34, 35, 37, 40, 41 , 42, 44, 46, 47, 49, 50, 51 , 52, 59, 62, 63, 66, 69, 70, 71 , 72, 74, 75, 78, 79, 80, 81 , 83, 84, 87, 90, 91 , 94, 95, 97, 98, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 1 10, 11 1 , 1 12, 113, 1 14, 115, 1 18, 121 , 122, 125, 126, 128, 129, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 146, 149, 150, 153, 154, 157, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165 y 166, con relación a cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15, 47 y 53 (por ejemplo, SEQ ID ??. , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). Algunos de tales polipéptidos de la invención, comprenden una sustitución de un aminoácido por un aminoácido diferente en una o más posiciones, incluyendo, de manera no exclusiva, las siguientes posiciones, que contienen los residuos de aminoácidos que tienen más que el 50% de ASA fraccionada: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 25, 27, 28, 31 , 33, 34, 35, 37, 41 , 44, 46, 47, 49, 50, 66, 71 , 75, 78, 79, 80, 83, 84, 87, 90, 91 , 94, 95, 101 , 102, 103, 105, 107, 108, 109, 1 10, 1 11 , 114, 1 15, 118, 121 , 122, 125, 126, 129, 132, 133, 135, 138, 150, 160, 162, 163, 164, 165 y 166, con relación a cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15, 47 y 53 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). Algunos polipéptidos de la invención comprenden una o más de las siguientes sustituciones, que introducen un residuo de cisteína en una posición que tiene más que el 25% de ASA fraccionada: D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, G10C, R12C, R13C, M16C, A19C, Q20C, R22C, R23C, I24C, S25C, L26C, F27C, S28C, L30C, K31 C, R33C, H34C, D35C, R37C, Q40C, E41 C, E42C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, V51 C, Q52C, E59C, Q62C, Q63C, N66C, S69C, T70C, K71C, N72C, S74C, A75C, D78C, E79C, T80C, L81 C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91 C, N94C, D95C, E97C, A98C, V100C, M101 C, Q102C, E103C, V104C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L1 1 1 C, M112C, N113C, V114C, D1 15C, L118C, R121 C, K122C, Q125C, R126C, T128C, L129C, T132C, K133C, K134C, K135C, Y136C, S137C, P138C, A146C, M149C, R150C, S153C, F154C, N157C, Q159C, K160C, R161 C, L162C, R163C, R164C, K165C y E166C (o una posición equivalente con relación a la SEQ ID NO:1 ), y combinaciones de las mismas. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una o más de las siguientes sustituciones, que introducen un residuo de lisina en una posición que tiene más que el 25% del ASA fraccionada: D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, G10K, R12K, R13K, M16K, A19K, Q20K, R22K, R23K, I24K, S25K, L26K, F27K, S28K, L30K, R33K, H34K, D35K, R37K, Q40K, E41 K, E42K, D44K, N46K, H47K, Q49K, V51K, Q52K, E59K, Q62K, Q63K, N66K, S69K, T70K, N72K, S74K, A75K, D78K, E79K, T80K, L81 K, E83K, I87K, F90K, Q91 K, N94K, D95K, E97K, A98K, V100K, M101 K, Q102K, E103K, V104K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L11 1 K, M1 12K, N113K, V114K, D115K, L118K, R121 K, Q125K, R126K, T128K, L129K, T132K, Y136K, S137K, P138K, A146K, M149K, R150K, S153K, F154K, N157K, Q159K, R161 K, L162K, R163K, R164K y E166K (o una posición equivalente con relación a la SEQ ID NO:1 ), y combinaciones de las mismas. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente, o una supresión de un residuo de aminoácido, la cual elimina una o más lisinas, por ejemplo, K31 , K50, K71 , K84, K122, K133, K134, K135, K160 y/o K165 (con relación a la SEQ ID NO:1 ), a partir de cualquier polipéptido de la invención, tal como una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104, tal como, por ejemplo, una de las SEQ ID NOS:1 -15, 47 y 53 (por ejemplo, la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). El uno o más residuos de lisina a ser eliminados, pueden sustituirse con cualquier otro aminoácido, pueden sustituirse con una Arg (R) o Gln (Q), o pueden suprimirse. Algunos de tales polipéptidos comprenden las sustituciones K31 R+K122R; K31 R+K133R; K122R+K 33R; o K31 R+K122R+K133R. Otras sustituciones ejemplares incluyen K71 E; K84E; K133E/G; y K160E. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una sustitución o una supresión que elimina una o más histidinas, por ejemplo, H7, H1 1 , H34 y/o H47 (con relación a la SEQ ID NO:1 ), de cualquier polipéptido de la invención, tal como una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104, tal como, por ejemplo, una de las SEQ ID NOS:1-15, 47 y 53 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). El uno o más residuos de histidina a ser eliminados, pueden sustituirse con cualquier otro aminoácido, pueden sustituirse con Arg (R) o Gln (Q), o pueden suprimirse. Algunos de tales polipéptidos comprenden las sustituciones H34Q; H47Q; o H34Q+H47Q. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una sustitución de un aminoácido por un aminoácido diferente, una supresión de un aminoácido, o una inserción de un aminoácido, la cual elimina o interrumpe de otra manera el arreglo espacial del sitio de glucosilación N enlazado N72 S73 S74 (con relación a la SEQ ID NO:1 ). La eliminación de este sitio puede lograrse de varias maneras, por ejemplo, por la supresión de N72 o la sustitución de N72 por un aminoácido diferente, la sustitución de Ser73 con Pro, la sustitución de Ser74 por un aminoácido diferente de Ser, Thr o Cys, o la inserción de un residuo de aminoácido diferente de Ser, Thr o Cys entre las posiciones 73 y 74. Por ejemplo, tales polipéptidos comprenden la sustitución N72D.

Algunos polipéptidos de la invención comprenden una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos que eliminan uno o más residuos básicos o uno o más pares de residuos básicos (tales como, Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Lys-Lys) con el fin de, por ejemplo, reducir al mínimo la presencia de los potenciales sitios sensibles a la proteasa, o en algunos casos, eliminar los sitios potencialmente reactivos hacia los reactivos de la conjugación reactiva a la amina (por ejemplo, PEGilación). Por ejemplo, la eliminación de las secuencias dibásicas cerca del término C puede lograrse eliminando uno o más de Lys160, Arg161 , Arg163, Arg164 y Lys165 (con relación a la SEQ ID NO:1 ). Una o más Lys o Arg a ser eliminadas pueden, por ejemplo, suprimirse o sustituirse con cualquier aminoácido diferente de Lys o Arg. Algunos de tales polipéptidos de la invención comprenden una sustitución de uno o más de Lys160, Arg161 y Arg164 por un aminoácido diferente de Lys o Arg, tal como, por ejemplo, una o más de las sustituciones Lys160Glu; Arg161Ser/Cys; y Arg164Ser/Cys. De manera alterna o adicional, algunos de tales polipéptidos comprenden una supresión de una o más de Lys160, Arg161 , Arg163, Arg164 y Lys165, que puede ser vía supresiones individuales (por ejemplo, K165*), o en grupos de más de una, incluyendo vía el truncamiento C terminal (por ejemplo, K165*- E166*). Otras modificaciones contempladas para los polipéptidos de la invención incluyen aquéllas descritas a continuación y en la sección titulada "CONJUGADOS DEL INTERFERON ALFA".

Se entenderá que aunque los ejemplos y modificaciones al polipéptjdo original se proporcionan generalmente en la presente con relación a la secuencia SEQ ID NO:1 (o con relación a alguna otra secuencia especificada), las modificaciones descritas pueden también hacerse en posiciones equivalentes de los aminoácidos de cualquiera de los otros polipéptidos de la invención (incluyendo las SEQ ID NO:2- 5 y las SEQ ID NOS:44-104 y las variantes de las mismas), descritos en la presente. Así, como un ejemplo, la sustitución H47C con relación a la SEQ ID NO:1, se entiende que corresponde a Q47C en la SEQ ID NO:5, y así sucesivamente. Los siguientes cuadros proporcionan las secuencias de algunos polipéptidos del interferón alfa de la invención. Por claridad, las secuencias se muestran con relación a la SEQ ID NO:3 (Cuadro 1) o SEQ ID NO:12 (Cuadro 2). Algunos de tales polipéptidos exhiben una actividad del interferón alfa, tal como una actividad antiviral, actividad de diferenciación a ??1 y/o actividad antiproliferativa.

CUADRO 1 Secuencia Polipeptídica (con relación a la SEQ ID Nombre de la SEQ ID NO:3) clona SEQ ID NO:3 B9x14C2a SEQ ID NO:44 + F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH01 SEQ ID NO:45 + E166EC SEQ ID NO:3 B9X14CH03 SEQ ID NO:46 + N72D SEQ ID NO:3 B9x14CH04, SEQ ID NO:47 + N72D, K160E, R161 S, R164S B9x14EC4 SEQ ID NO:3 B9x14CH05, SEQ ID NO:48 + N72D, K160E, R161 C, R164S B9x14EC5 SEQ ID NO:3 B9x14CH06, SEQ ID NO:49 + N72D, K160E, R161 S, R164C B9x14EC3 SEQ ID NO:3 + H47Q, V51A, F55S, L56V, F57L, Y58H, N72D, 14Ep01 SEQ ID NO:50 F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 + M61 I, N72D, E83D, M93L, M101T, T109I, P110A, 14Ep02 SEQ ID NO:51 V1 14E, F154L, K160E, R161S, R164S SEQ ID NO:3 14Ep03 SEQ ID NO:52 + N72D, M101 I, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 14Ep04 SEQ ID NO:53 + N72D, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 + H47Q, V51A, F55S, L56V, F57L, Y58H, N72D, 14Ep05 SEQ ID NO:54 M101 I, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 + H47Q, V51A, F55S, L56V, F57L, Y58H, 61 I, N72D, 14EF SEQ ID NO:55 E83D, M93L, M101T, T109I, P110A, V114E, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14Ep04C31 SEQ ID NO:56 + K31C, N72D, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH04C31 SEQ ID NO:57 + K31C, N72D, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH04C46 SEQ ID NO:58 + N46C, N72D, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH04C71 SEQ ID NO:59 + K71 C, N72D, K160E, R161S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH04C75 SEQ ID NO:60 + N72D, A75C, K160E, R161S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14 CH04C79 SEQ ID NO:61 + N72D, E79C, K160E, R161S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CHO4C107 SEQ ID NO:62 + N72D, E107C, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14 CH04C122 SEQ ID NO:63 + N72D, K122C, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH04C134 SEQ ID NO:64 + N72D, K134C, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14Ep04 SEQ ID NO:65 + N72D, F154L, K160E, R16T-E166* ?161-166 SEQ ID NO:3 B9x14Ep04 SEQ ID NO:66 + N72D, F154L, K160E, R161 S, R164S, K165*-E166* ?165-166 Secuencia Polipeptídica (con relación a la SEQ ID Nombre de la SEQ ID NO:3) clona SEQ ID NO:3 ?9?14??04?1 -4 + C-T-P4*, D44*, N72D, F154L, K160E, R161 S, SEQ ID NO:67 D44*A165-166 R164S, K165*-E166* SEQ ID NO:3 B9x14CH04NP1 SEQ ID NO:68 + H34Q, N72D, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14 CH04NP2 SEQ ID NO:69 + H34Q, H47Q, N72D, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH08 SEQ ID NO:70 + K31 R, N72D, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH09 SEQ ID NO:71 + K50R, N72D, K160E, R151 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CHO10 SEQ ID NO:72 + K71 R, N72D, K160E, R151S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH01 1 SEQ ID NO:73 + N72D, K84R, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH012 SEQ ID NO:74 + N72D, K122R, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH013 SEQ ID NO:75 + N72D, K134R, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH014 SEQ ID NO:76 + N72D, K135R, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH015 SEQ ID NO:77 + N72D, K160E, R161 S, R164S, K165R SEQ ID NO:3 B9X14CH016 SEQ ID NO:78 + N72D, K122R, K135R, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH017 SEQ ID NO:79 + K31 R, N72D, K135R, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH018 SEQ ID NO:80 + K31 R, N72D, K122R, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:3 + K31 R, H34Q, H47Q, N72D, K122R, K160E, R161 S, B9x14CH018NP2 SEQ ID NO:81 R164S SEQ ID NO:3 B9x14CH018NP2 + K31 R, H34Q, H47Q, N72D, K122R, K160E, R161 S, SEQ ID NO:82 ?165-166 R164S, K165*-E166* CUADRO 2 Secuencia Polipeptídica (con relación a la SEQ ID Nombre de la SEQ ID NO:12) clona SEQ ID NO:12 25Ep10 SEQ ID NO:95 + L17I, R22G, N72D, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:12 25Ep11 SEQ ID NO:96 + D2N, P4S, S10N, N72D, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:12 25Ep12 SEQ ID NO:97 + N72D, R125Q, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:12 + L17I, R22G, N72D, R125Q, F154L, K160E, R161 S, 25Ep13 SEQ ID NO:98 R164S SEQ ID NO:12 + D2N, P4S, S10N, N72D, R125Q, F154L, K160E, R161 S, 25Ep14 SEQ ID NO:99 R164S SEQ ID NO:12 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H, N72D, F154L, K160E, 25Ep15 SEQ ID NO:100 R161 S, R164S SEQ ID NO:12 + L17I, R22G, H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H, N72D, 25Ep16 SEQ ID NO:101 R125Q, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:12 + D2N, P4S, S10N, H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H, N72D, 25Ep17 SEQ ID NO:102 R125Q, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:12 + L17I, R22G, H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H, L60M, 25EF1 SEQ ID NO:103 N72D, E83D, M93L, N95D, I101T, V114E, R125Q, F154L, K160E, R161 S, R164S SEQ ID NO:12 + D2N, P4S, S10N, H47Q, V51 T, F55S, L56V, Y58H, L60M, 25EF2 SEQ ID NO:104 N72D, E83D, M93L, N95D, I101T, V114E, R125Q, F154L, K160E, R161 S, R164S Variantes En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante, que es una variante de un polipéptido del interferón alfa original, la variante comprende una secuencia que difiere de la secuencia polipeptídica original en al menos una posición del aminoácido, en donde la secuencia variante comprende una o más de His en la posición 47, Val en la posición 51 , Phe en la posición 55, Leu en la posición 56, Tyr en la posición 58, Lys en la posición 133 y en la posición Ser140, la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1. En algunos casos, la secuencia del polipéptido del interferón alfa original es una secuencia de un interferón alfa humano natural (tal como, por ejemplo, hulFN-alfa 2b (SEQ ID NO:32), hulFN-alfa 2a (SEQ ID NO:32 con la posición 23 = Lys), hulFN-alfa 2c (SEQ ID NO:32 con la posición 34 = Arg), hulFN-alfa 8b (SEQ ID NO:33), hulFN-alfa 8a (SEQ ID NO:33 con las posiciones 98 = Val, 99 = Leu, 100 = Cys y 101 = Asp), hulFN-alfa 8c (SEQ ID NO:33 con la posición 161 = Asp y los aminoácidos en las posiciones 162-166 suprimidos), hulFN-alfa 14a (SEQ ID NO:39), hulFN-alfa 14c (SEQ ID NO:39 con la posición 152 = Leu), o una secuencia de cualquier otro polipéptido del interferón alfa humano natural, tal como aquéllas mostradas en las Figuras 2 y 4 de la presente (SEQ ID NO:31-42) y/o listadas en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra). En algunos casos, la secuencia polipeptídica del interferón alfa original es una secuencia de un interferón alfa no natural (es decir, sintético), tal como un IFN-alfaCon1 (SEQ ID NO:43). En algunos casos, el polipéptido original a ser modificado, puede ser él mismo, un polipéptido de la invención, tal como, por ejemplo, cualquiera de una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104. En algunos casos, la secuencia variante difiere de la secuencia polipeptídica original en 1-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 1 -14 posiciones de los aminoácidos, en 1-12 posiciones de los aminoácidos, en 1-10 posiciones de los aminoácidos, en 1 -8 posiciones de los aminoácidos, en 1-6 posiciones de los aminoácidos, en 1-5 posiciones de los aminoácidos, en 1-4 posiciones de los aminoácidos, en 1-3 posiciones de los aminoácidos, o en 1-2 posiciones de los aminoácidos. Algunas de tales variantes exhiben una actividad del interferón alfa. La invención también proporciona proteínas de fusión y conjugados que comprenden estas variantes y ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estas variantes.

Variaciones de la secuencia Como se indicó anteriormente, los polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias que difieren de cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104, tales como una de las SEQ ID NOS:1-15, 47 y 53 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53), en 0-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 0-16 posiciones, 0-15 posiciones, 0-14 posiciones, 0-13 posiciones, 0-12 posiciones, 0-11 posiciones, 0-10 posiciones, 0-9 posiciones, 0-8 posiciones, 0-7 posiciones, 0-6 posiciones, 0-5 posiciones, 0-4 posiciones, 0-3 posiciones, 0-2 posiciones o 0-1 posiciones. Algunos de tales polipéptidos exhiben una actividad del interferón alfa. Por ejemplo, algunos de tales polipéptidos de la invención comprenden una secuencia que tiene una longitud de aproximadamente 150 aminoácidos, tales como aproximadamente 151 , 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164 ó 165 aminoácidos, que corresponden a una supresión de entre 1 y 16 aminoácidos con relación a una secuencia polipeptídica original (tal como, por ejemplo, una de las SEQ ID NOS:1-15). En algunos casos, entre 1 y 11 , por ejemplo, entre 1 y 10, tal como entre 1 y 7, por ejemplo, entre 1 y 5, tal como entre 1 y 3 aminoácidos se suprimen del término C, es decir, el polipéptido está truncado C terminalmente en comparación con la secuencia polipeptídica original (tal como, por ejemplo, una de las SEQ ID NOS: 1- 5, 47 ó 53) por 1-11 residuos de aminoácidos (por ejemplo, por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 1 1 residuos de aminoácidos), tal como por 1-10, 1-7, por ejemplo, por 1-5 o por 1-3 residuos de aminoácidos. De manera alterna o adicional, algunos de tales polipéptidos están truncados N terminalmente en comparación con la secuencia polipeptídica original (tal como, una de las SEQ ID NOS: 1-15, 47 ó 53), por 1 -4 residuo de aminoácidos (por ejemplo, por 1 , 2, 3 ó 4 residuo de aminoácidos), por ejemplo, 1-4, 1 -3, 1-2 ó 1 residuo de aminoácidos se eliminan del término N. Algunos de tales polipéptidos comprenden además una metionina en el término N. Algunos de tales polipéptidos exhiben una actividad del interferón alfa. Como otro ejemplo, algunos de tales polipéptidos de la invención comprenden una secuencia que contiene entre 0 y 16 sustituciones de aminoácidos con relación a una de las SEQ ID NOS: 1-15, 47 ó 53 (por ejemplo, 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 sustituciones de aminoácidos), tales como 0-14 ó 0-12 ó 0-10 ó 0-8 ó 0-6 ó 0-5 ó 0-4 ó 0-3 ó 0-2 ó 0-1 sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, uno o más de las sustituciones de los aminoácidos se hacen de acuerdo a, por ejemplo, un grupo de sustitución (tal como un grupo de sustitución conservadora), tal como uno expuesto a continuación. Algunos de tales polipéptidos exhiben una actividad del interferón alfa. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una secuencia que comprende entre 0 y 16 sustituciones de aminoácidos con relación a una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53), por ejemplo, 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 sustituciones de aminoácidos, tales como 0-14 ó 0-12 ó 0-10 ó 0-8 ó 0-6 ó 0-5 ó 0-4 ó 0-3 ó 0-2 ó 0-1 sustituciones de aminoácidos, en donde al menos una de la sustituciones introduce un residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para una porción no polipeptídica. Los ejemplos incluyen la introducción de uno o más sitios de N-glucosilación, o la introducción de uno o más residuos de cisteína o residuos de lisina, como se describió anteriormente, y en la sección titulada "CONJUGADOS DEL INTERFERON ALFA". Algunos de tales polipéptidos exhiben una actividad del interferón alfa. Algunos polipéptidos de la invención comprenden una secuencia que contiene entre 0 y 16 sustituciones o supresiones o inserciones de aminoácidos con relación a una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53), tales como 0-14 ó 0-12 ó 0-10 ó 0-8 ó 0-6 ó 0-5 ó 0-4 ó 0-3 ó 0-2 ó 0-1 sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos (o una combinación de las mismas), en donde al menos una de la sustitución o supresión elimina un residuo de aminoácido de una secuencia polipeptídica original, que comprende un grupo de unión para una porción no polipeptídica o, en el caso de la inserción de aminoácidos, interrumpe el arreglo espacial de los residuos, requerido para tal grupo de unión (por ejemplo, una inserción de un aminoácido para interrumpir un motivo N-X-S T de N glucosilación). Los ejemplos incluyen la eliminación de la secuencia polipeptídica original de un sitio de N glucosilación, o la eliminación de un residuo de lisina, histidina, o cisteína, como se describió anteriormente, y en la sección titulada "CONJUGADOS DEL INTERFERON ALFA". Algunos de tales polipéptidos exhiben una actividad del interferón alfa. Como un ejemplo no limitante, un polipéptido de la invención puede tener la secuencia SEQ ID NO:3 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:3 en un total de hasta 16 posiciones (que pueden ser una combinación de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos, incluyendo aquéllas descritas anteriormente). En algunos casos, ninguna, algunas o todas de las sustituciones son sustituciones de acuerdo con un grupo de sustitución definido a continuación. Las sustituciones de los aminoácidos de acuerdo con la invención pueden incluir, de manera no exclusiva, una o más sustituciones conservadoras de los aminoácidos. Los cuadros de las sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares, son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo se proporciona en el cuadro a continuación (Cuadro 3), el cual expone seis grupos ejemplares que contienen aminoácidos que pueden considerarse "sustituciones conservadoras" con otras.

CUADRO 3 Grupos de sustitución conservadora 1 Alanina (A) Glicina (G) Serina (S) Treonina (T) 2 Acido aspártico (D) Acido glutámico (E) 3 Asparagina (N) Glutamina (Q) 4 Arginina (R) Usina (K) Histidina (H) 5 Isoleucina (I) Leucina (L) Metionina (M) Valina (V) 6 Fenilalanina (F) Tirosina (Y) Triptófano (W) Pueden considerarse otros grupos de sustitución para los aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos pueden agruparse por función o estructura química similares (por ejemplo, ácidos, básicos, alifáticos, aromáticos, que contienen azufre). Por ejemplo, una agrupación Alifática puede comprender: Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I). Otros grupos que contienen aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras unas con otras incluyen: Aromáticos: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); que contienen azufre: Metionina (M), Cisteína (C); Básicos: Arginina (R), Usina (K), Histidina (H); Acidos: Acido aspártico (D), Acido glutámico (E), Asparagina (N), Glutamina (Q). Véase también Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company, para agrupaciones adicionales de aminoácidos. El listado de una secuencia polipeptídica en la presente, en conjunto con los grupos de sustitución anteriores, proporciona un listado expreso de todas las secuencias polipeptídicas sustituidas de manera conservadora.

Porcentaje de identidad de la secuencia En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes, que comprenden cada uno, una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia (por ejemplo, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de los aminoácidos), con cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104, tal como, por ejemplo, con una de las SEQ ID NOS:1-15, 47 y 53 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). En algunos casos, el polipéptido exhibe una actividad del interferón alfa. En algunos casos, la secuencia polipeptídica difiere en una o más posiciones de los aminoácidos, por ejemplo, en hasta 16 posiciones (tal como, 1-16 posiciones, 1-15 posiciones, 1-14 posiciones, 1-13 posiciones, 1-12 posiciones, 1-11 posiciones, 1-10 posiciones, 1-9 posiciones, 1-8 posiciones, 1-7 posiciones, 1-6 posiciones, 1-5 posiciones, 1-4 posiciones, 1-3 posiciones, o 1-2 posiciones), de cualquiera de las SEQ ID NOS:1 -15 y 44-104, tal como, por ejemplo, la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53. Como un ejemplo, algunas de las posiciones que pueden sustituirse por otro aminoácido de acuerdo con la invención incluyen, de manera no exclusiva, una o más posiciones 47, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61 , 64, 69, 71 , 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161 y 162, con relación a una de las SEQ ID NOS:1-15 y 44-104. En algunos casos, la secuencia comprende uno o más de: His o Gln en la posición 47; Val, Ala o Thr en la posición 51 ; Gln, Pro o Glu en la posición 52; Ala o Thr en la posición 53; Phe, Ser o Pro en la posición 55; Leu, Val o Ala en la posición 56; Phe o Leu en la posición 57; Tyr o His en la posición 58; Met, Leu o Val en la posición 60; Met o lie en la posición 61 ; Thr o He en la posición 64; Ser o Thr en la posición 69; Lys o Glu en la posición 71 ; Asn o Asp en la posición 72; Ala o Val en la posición 75; Ala o Thr en la posición 76; Trp o Leu en la posición 77; Asp o Glu en la posición 78; Glu o Gln en la posición 79; Thr, Asp, Ser o Arg en la posición 80; Glu o Asp en la posición 83; Lys o Glu en la posición 84; Phe o Leu en la posición 85; Tyr, Cys o Ser en la posición 86; lie o Thr en la posición 87; Phe, Tyr, Asp o Asn en la posición 90; Met o Leu en la posición 93; Lys o Glu en la posición 133; Ser o Ala en la posición 140; Phe o Leu en la posición 154; Lys o Glu en la posición 160; Arg o Ser en la posición 161 ; y Arg o Ser en la posición 162; la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1. Otras sustituciones contempladas en las secuencias de la invención se describen anteriormente y en la sección titulada "CONJUGADOS DEL INTERFERON ALFA". La invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden tales polipéptidos, conjugados que comprenden tales polipéptidos y ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican tales polipéptidos. Ejin otro aspecto, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que tienen al menos aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más porcentaje de identidad de la secuencia con una o más de las SEQ ID NOS:16-30. Algunos de tales ácido¡s nucleicos codifican polipéptidos que exhiben una actividad del interferón alfa como se describen en la presente. El grado al cual una secuencia (polipeptídica o de ácido nucleico) es similar a olla, proporciona una indicación de las propiedades estructurales el análisis de la secuencia asistido por computadora. Esta disponible una variedad de pjrogramas para computadora para realizar la alineación de la secuencia, o puede producirse por alguien con experiencia.

Como se indicó anteriormente, las secuencias de los ácidos nucleicos y polipéptidos empleados en la invención objeto, no necesitan ser idénticas, sino que pueden ser süstancialmente idénticas a la secuencia correspondiente de un polipéptido de la invención o un ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden someterse a varios cambios, tales como una o más inserciones, supresiones y/o sustituciones de ácidos nucleicos, ya sea conservadoras o no conservadoras, incluyendo en donde, por ejemplo, tales cambios pueden proporcionar ciertas ventajas en su uso, tal como en su uso terapéutico o profiláctico o una aplicación de administración o de diagnóstico. Los ácidos nucleicos de la invención también pueden someterse a varios cambios, tales como una o más sustituciones de uno o más ácidos nucleicos en uno o más codones, de manera que un codón particular codifica el mismo o un aminoácido diferente, resultando en una variación silenciosa (como se define en la presente), o una variación no silenciosa, o una o más supresiones de uno o más ácidos nucleicos (o codones) en la secuencia. Los ácidos nucleicos también pueden modificarse para incluir uno o más codones que proporcionan la expresión óptima en un sistema de expresión (por ejemplo, bacteriano o de mamífero), aunque, si se desea, uno o más codones codifican todavía los mismos aminoácidos. Tales cambios en los ácido nucleicos pueden proporcionar ciertas ventajas en su uso o administración terapéutica o profiláctica, o aplicación de diagnóstico. Los ácidos nucleicos y polipéptidos pueden modificarse de varias maneras, siempre que comprendan una secuencia sustancialmente idéntica (como se define a continuación) a una secuencia en un ácido nucleico o polipéptido respectivo de la invención. El término "idéntico" o "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para la similitud máxima, como se determina utilizando el algoritmo de comparación de la secuencia descrito a continuación o mediante inspección visual. El "porcentaje de identidad de la secuencia" ("% de identidad") de una secuencia objeto con una secuencia se referencia (es decir, de consulta), significa que la secuencia objeto es idéntica (es decir, en una base de aminoácido a aminoácido para una secuencia polipeptídica, o en una base de nucleótido a nucleótido para una secuencia polinucleotídica), por un porcentaje específico con la secuencia de consulta sobre una longitud de comparación. El porcentaje de identidad de la secuencia de una secuencia objeto con una secuencia de consulta, se calcula como sigue. Primero, la alineación óptima de las dos secuencias, se determina utilizando el algoritmo de comparación de la secuencia con parámetros de alineación específicos. Esta determinación de la alineación óptima puede realizarse utilizando una computadora, o puede calcularse manualmente, como se describe a continuación. A continuación, las dos secuencias alineadas de manera óptima, se comparan sobre una longitud de comparación y se determina el número de posiciones en la alineación óptima en la cual ocurren los residuos idénticos en ambas secuencias, lo cual proporciona el número de posiciones que coinciden. El número de posiciones que coinciden se divide entonces entre el número total de posiciones de la longitud de comparación (la cual, a menos que se especifique de otra manera, es la longitud de la secuencia de consulta), y a continuación multiplicando el resultado por 100, para proporcionar el porcentaje de identidad de la secuencia de la secuencia objeto con la secuencia de consulta. Con respecto a las secuencias polipeptídicas, típicamente, una secuencia se considera como una "secuencia de consulta" (por ejemplo, una secuencia polipeptídica de la invención), con la cual se comparan una o más de otras secuencias, es decir, "secuencias objetivo" (por ejemplo, secuencias presentes en una base de datos). El algoritmo de comparación de la secuencia utiliza los parámetros de alineación designados para determinar la alineación óptima entre la secuencia de consulta y la secuencia objetivo. Cuando se compara una secuencia de consulta contra una base de datos de secuencias, tal como, por ejemplo, GENBANK® (Banco de Datos de Secuencias Genéticas; Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos) o GENESEQ® (Thomson Derwent; también disponible como DGENE® en STN), usualmente sólo la secuencia de consulta y los parámetros de alineación se introducen en la computadora; las alineaciones óptimas entre la secuencia de consulta y cada secuencia objeto se regresan hasta por un número especificado de secuencias objetivo. Dos secuencias polipeptídicas están "alineadas de manera óptima", cuando se alinean utilizando parámetros definidos, es decir, una matriz definida de sustitución de aminoácidos, penalización por existencia del hueco (también denominada penalización por abertura del hueco) y penalización por extensión del hueco, para llegar a la calificación de similitud más alta posible para ese par de secuencias. La matriz BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89(22): 10915-10919), se utiliza con frecuencia como una matriz de sustitución de calificación predeterminada en algoritmos de alineación de secuencias polipeptídicas (tales como BLASTP, descrito a continuación). La penalización de existencia del hueco se impone para la introducción de un solo hueco de aminoácidos en una de las secuencias alineadas, y la penalización por extensión del hueco se impone para cada posición del residuo en el hueco. A menos que se indique de otra manera, los parámetros de alineación empleados aquí son: matriz de calificación BLOSUM62, penalización de existencia del hueco = 11 y penalización por extensión del hueco = 1. La calificación de la alineación se define por las posiciones de los aminoácidos de cada secuencia en las cuales empieza y termina la alineación (por ejemplo, la ventana de alineación), y opcionalmente, con la inserción de un hueco o múltiples huecos en una o ambas secuencias, para llegar a la calificación de similitud más alta posible.

Aunque la alineación óptima entre dos o más secuencias puede determinarse manualmente (como se describe a continuación), el proceso se facilita por el uso de un algoritmo de alineación implementado por computadora, tal como BLAST® (Biblioteca Nacional de Medicina), por ejemplo, BLASTP para secuencias polipeptídicas y BLASTN para secuencias de ácidos nucleicos, descritos en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, y disponibles al público a través de varias fuentes, tales como el Sitio en la Red del Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI). Cuando se utiliza una interfaz BLAST computarizada, si existe la opción de utilizar un "filtro de baja complejidad", esta opción debe apagarse (es decir, sin filtro). La Figura 3 muestra una alineación de un polipéptido de la invención (B9x14, SEQ ID NO:3) con IFN-alfa 14a humano (también conocido como LelF H, Goeddel et al. (1981 ) Nature 290:20-26; SEQ ID NO:39), el cual fue la secuencia más estrechamente relacionada recuperada en la búsqueda BLASTP de la secuencia de consulta SEQ ID NO:3 contra las bases de datos de GENBANK y GENESEQ, utilizando la matriz BLOSUM62, penalización por abertura del hueco 11 , penalización por extensión del hueco 1. Estas dos secuencias difieren en 18 posiciones de los aminoácidos sobre una longitud de 166 aminoácidos (es decir, la SEQ ID NO:39 difiere de la SEQ ID NO:3 en 18 posiciones de los aminoácidos); además, la SEQ ID NO:39 es 89% idéntica a la SEQ ID NO:3, puesto que ((166-18)/166) x 100 = 89.

La Figura 5 muestra una alineación de otro polipéptido de la invención (B9x25, SEQ ID N0:12) con IFN-alfa 14a humano (SEQ ID NO:39), la cual fue la secuencia más estrechamente relacionada, recuperada en una búsqueda BLASTP de la secuencia de consulta SEQ ID NO: 12 contra las bases de datos de GENBANK y GENESEQ, utilizando los parámetros especificados anteriormente. La SEQ ID NO:39 difiere de la SEQ ID NO:12 en 20 posiciones de los aminoácidos sobre una longitud de 166 aminoácidos; además, la SEQ ID NO:39 es 88% idéntica a la SEQ ID NO:3, puesto que ((166-20)/166) x 100 = 88. La alineación óptima entre dos secuencias polipeptídicas también puede determinarse mediante el cálculo manual del algoritmo BLASTP (es decir, sin la ayuda de una computadora), utilizando los mismos parámetros de alineación especificados anteriormente (matriz = BLOSUM62, penalización por abertura del hueco = 1 1 y penalización por extensión del hueco = 1 ). Para empezar, las dos secuencias se alinean inicialmente mediante inspección visual. A continuación, se calcula una calificación de la alineación inicial como sigue: para cada posición individual de la alineación (es decir, para cada par de residuos alineados), se asigna un valor numérico de acuerdo con la matriz BLOSUM62 (Figura 6). La suma de los valores asignados a cada par de residuos en la alineación, es la calificación de alineación inicial. Si las dos secuencias que están siendo alineadas son altamente similares, con frecuencia esta alineación inicial proporciona la calificación de alineación más alta posible. La alineación con la calificación de la alineación más alta posible es la alineación óptima basada en los parámetros de alineación empleados. La Figura 7A muestra un ejemplo de un cálculo de una calificación de la alineación para dos secuencias, una secuencia "de consulta", identificada aquí como los residuos 29-50 de la SEQ ID NO:3 (superior), y una secuencia "objeto", identificada aquí como los residuos 30-52 de la SEQ ID NO:5 (inferior). Las secuencias se alinearon mediante inspección visual, y el valor numérico asignado por la matriz BLOSUM62 para cada par alineado de aminoácidos, se muestra debajo de cada posición en la alineación (para ayudar a la visualización, cada par idéntico de aminoácidos en la alineación se muestra en negrillas). En este ejemplo, esta alineación inicial proporciona la calificación de la alineación más alta posible (la suma de los valores mostrados debajo de cada posición alineada); cualquier otra alineación de estas dos secuencias, con o sin huecos, resultaría en una calificación de la alineación inferior. En algunos casos, puede obtenerse una calificación de la alineación más alta, introduciendo uno o más huecos en la alineación. Cada vez que se introduce un hueco en la alineación, se asigna una penalización por abertura del hueco, y además, se valora una penalización por extensión del hueco para cada posición del residuo dentro del hueco. Por lo tanto, utilizando los parámetros de alineación descritos anteriormente (incluyendo la penalización por abertura del hueco = 1 1 y la penalización por extensión del hueco = 1 ), un hueco de un residuo en la alineación correspondería a un valor de - (1 1 +(1 x 1 )) = -12 asignado al hueco; un hueco de tres residuos correspondería a un valor de - (11 +(3 x 1 )) = -14 asignado al hueco, y así sucesivamente. Este cálculo se repite para cada hueco introducido en la alineación. Las Figuras 7B y 7C muestran un ejemplo que demuestra cómo la introducción de un hueco en una alineación puede resultar en una calificación de la alineación más alta, a pesar de la penalización del hueco. La Figura 7B muestra una alineación inicial de los residuos 29-50 de la SEQ ID NO:3 (superior, consulta), y los residuos 30-50 de la SEQ ID NO:32 (inferior, objeto) hecha por inspección visual, que resulta en una calificación de la alineación inicial de 67. La Figura 7C muestra el efecto de un hueco de un residuo en la SEQ ID NO:32 en la calificación de la alineación; a pesar de la penalización del hueco de -12, la calificación de la alineación total de las dos secuencias se incrementa a 88. En este ejemplo, la alineación mostrada en la Figura 7C, proporciona la calificación de la alineación más alta posible, y es por lo tanto, la alineación óptima de estas dos secuencias; cualquier otra alineación de estas dos secuencias (con o sin huecos), resultaría en una calificación de la alineación inferior. Deberá entenderse que los ejemplos de los cálculos de la alineación de la secuencia descritos anteriormente, que utilizan secuencias relativamente cortas, se proporcionan para propósitos de ilustración únicamente; en la práctica, los parámetros de alineación empleados (matriz BLOSUM62, penalización por abertura del hueco = 1 1 y penalización por extensión del hueco = 1 ), son óptimos para las secuencias polipeptídicas de 85 aminoácidos o más largas. El sitio en la red del NCBI, proporciona los siguientes parámetros de alineación para las secuencias de otras longitudes (que son adecuados para el cálculo de la alineación asistido por computadora, así como el manual, utilizando el mismo procedimiento, como se describió anteriormente). Para secuencias de 50-85 aminoácidos de longitud, los parámetros óptimos son matriz BLOSUM80 (Henikoff y Henikoff, supra), penalización por abertura del hueco = 10 y penalización por extensión del hueco = 1. Para secuencias de 35-50 aminoácidos de longitud, los parámetros óptimos son matriz PAM70 (Dayhoff, .O., Schwartz, R.M. & Orcutt, B.C. (1978) "A model of evolutionary change in proteins." En Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3, M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Nati. Biomed. Res. Found., Washington, DC), penalización por abertura del hueco = 10 y penalización por extensión del hueco = 1. Para las secuencias de menos que 35 aminoácidos de longitud, los parámetros óptimos son matriz PAM30 (Dayhoff, M.O., supra), penalización por abertura del hueco = 9 y penalización por extensión del hueco = 1. Una vez que las secuencias están alineadas de manera óptima, el porcentaje de identidad de la secuencia objeto con relación a la secuencia de consulta, se calcula contando el número de posiciones en la alineación óptima, que contienen pares de residuos idénticos, dividiendo eso entre el número de residuos en la longitud de comparación (el cual, a menos que se especifique de otra manera, es el número de residuos en la secuencia de consulta), y multiplicando el número resultante por 100. Refiriéndose nuevamente a los ejemplos mostrados en las Figuras 7A, 7B y 7C, en cada ejemplo, la secuencia designada como la secuencia de consulta es de 22 aminoácidos de longitud. Refiriéndose a la alineación de la Figura 7A, 20 pares de residuos de aminoácidos alineados (mostrados en negrillas), son idénticos en la alineación óptima de la secuencia de consulta (superior) con la secuencia objeto (inferior). Así, esta secuencia objeto particular tiene (20/22) x 100 = 91.1 % de identidad con la secuencia de consulta. En la alineación mostrada en la Figura 7C, 18 pares de residuos de aminoácidos (mostrados en negrillas), en la alineación óptima son idénticos; así, esta secuencia objeto particular tiene (18/22) x 100 = 81.8% de identidad con la secuencia de consulta. Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" (o "sustancialmente idéntica"), significa típicamente, que cuando dos secuencias de aminoácidos (es decir, una secuencia de consulta y una secuencia objeto), se alinean de manera óptima utilizando el algoritmo BLASTP (manualmente o vía computadora), utilizando los parámetros apropiados descritos anteriormente, la secuencia objeto tiene al menos aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de consulta. En algunos casos, la identidad sustancial existe sobre una longitud de comparación de al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, tal como, al menos aproximadamente 1 10, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165 ó 166 residuos de aminoácidos.

De manera similar, como se aplica en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos, el término identidad sustancial (o sustancialmente idéntica), significa que cuando dos secuencias de ácidos nucleicos (es decir, una secuencia de consulta y una objeto), se alinean de manera óptima utilizando el algoritmo BLASTN (manualmente o vía computadora), utilizando los parámetros apropiados descritos a continuación, la secuencia objeto tiene al menos aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más porcentaje de identidad de la secuencia de los ácidos nucleicos con la secuencia de consulta. Los parámetros utilizados para las alineaciones de la secuencia de ácidos nucleicos son: recompensa por coincidencia 1 , penalización por mala coincidencia -3, penalización por existencia del hueco 5, penalización por extensión del hueco 2 (no se utilizan matrices de sustitución en el algoritmo BLASTN). En algunos casos, la identidad sustancial existe sobre una longitud de comparación de al menos aproximadamente 300 residuos nucleotídicos, tal como al menos aproximadamente 330, 360, 375, 390, 405, 420, 435, 450, 465, 480, 483, 486, 489, 492, 495 ó 498 nucleótidos.

Aspectos adicionales Cualquier polipéptido de la invención puede estar presente como parte de una secuencia polipeptídica más larga, por ejemplo, una proteína de fusión, tal como ocurre tras la adición de uno o más dominios o subsecuencias para la estabilización o detección o purificación del polipéptido. Una subsecuencia de purificación del polipéptido puede incluir, por ejemplo, una marca de epítope, una marca FLAG, una secuencia de polihistidina, una fusión GST, o cualquier otra subsecuencia de detección/purificación o "etiqueta" conocida en la técnica. Estos dominios o subsecuencias adicionales tienen poco o ningún efecto en la actividad del polipéptido de la invención, o pueden eliminarse mediante pasos de procesamiento postsíntesis, tales como el tratamiento con una proteasa, inclusión de una inteína o lo similar. Cualquier polipéptido de la invención también puede comprender uno o más aminoácidos modificados. El aminoácido modificado puede ser, por ejemplo, un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado con una porción de lípido, o un aminoácido conjugado con un agente de derivación orgánico. La presencia de aminoácidos modificados puede ser ventajosa para, por ejemplo, (a) incrementar la vida media en suero del polipéptido y/o la vida media funcional ¡n vivo, (b) reducir la antigenicidad del polipéptido, (c) incrementar la estabilidad durante el almacenamiento del polipéptido, o (d) incrementar la biodisponibilidad, por ejemplo, incrementando el AUCSC. Los aminoácidos se modifican, por ejemplo, cotraduccionalmente o postraduccionalmente durante la producción recombinante (por ejemplo, glucosilación N enlazada en el motivo N-X-S T durante la expresión en células de mamífero), o se modifican por medios sintéticos. Este aspecto se describe con más detalle en la sección de la presente titulada "CONJUGADOS DEL INTERFERON ALFA". La invención también proporciona una composición que comprende al menos un polipéptido de la invención, y un excipiente o portador. En un aspecto, la composición comprende un polipéptido aislado o recombinante, que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en 0-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), de una de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (tal como, por ejemplo, una de la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53), más un portador o excipiente. La composición puede ser una composición que comprende un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones y excipientes y portadores ejemplares se describen a continuación.

Haciendo polipéptidos Los métodos recombinantes para producir y aislar polipéptidos de la invención se describen en la presente. Además de la producción recombinante, los polipéptidos pueden producirse mediante síntesis peptídica directa utilizando técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J. (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154). La síntesis peptídica puede realizarse utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando el Sintetizador de Péptidos 431 A de Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, Calif.), de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Por ejemplo, pueden sintetizarse químicamente subsecuencias de manera separada, y combinarse utilizando métodos químicos para proporcionar polipéptidos de longitud completa o fragmentos de los mismos. De manera alterna, tales secuencias pueden ordenarse de cualquier número de compañías que se especializan en la producción de polipéptidos. Más comúnmente, los polipéptidos de la invención pueden producirse expresando los ácidos nucleicos codificantes y recuperando los polipéptidos, por ejemplo, como se describe a continuación. Los métodos para producir los polipéptidos de la invención también se incluyen. Uno de tales métodos comprende introducir en una población de células cualquier ácido nucleico de la invención descrito en la presente, el cual está enlazado de manera operativa a una secuencia reguladora efectiva para producir el polipéptido codificado, cultivar las células en un medio de cultivo para expresar el polipéptido, y aislar el polipéptido de las células o del medio de cultivo. Se utiliza una cantidad de ácido nucleico suficiente para facilitar la captación por las células (transfección) y/o la expresión del polipéptido. El ácido nucleico se introduce en tales células mediante cualquier método de suministro descrito en la presente, incluyendo, por ejemplo, inyección, cañón génico, captación pasiva, etc. El ácido nucleico puede ser parte de un vector, tal como un vector de expresión recombinante, incluyendo un vector de plásmido de ADN, o cualquier vector descrito en la presente. El ácido nucleico o el vector que comprende un ácido nucleico de la invención, puede prepararse y formularse como se describe anteriormente en la presente. Tal ácido nucleico o vector de expresión puede introducirse en una población de células de un mamífero in vivo, o células seleccionadas del mamífero (por ejemplo, células tumorales) pueden retirarse del mamífero, y el vector del expresión del ácido nucleico introducirse ex vivo en la población de tales células, en una cantidad suficiente, de manera que resulta la captación y expresión del polipéptido codificado. O, un ácido nucleico o vector que comprende un ácido nucleico de la invención, se produce utilizando células cultivadas in vitro. En un aspecto, el método de producir un polipéptido de la invención comprende introducir en una población de células un vector de expresión recombinante que comprende cualquier ácido nucleico de la invención, descrito en la presente, en una cantidad y fórmula tal que resultará en la captación del vector y la expresión del polipéptido codificado; administrar el vector de expresión en un mamífero mediante cualquier formato de introducción/suministro descrito en la presente; y aislar el polipéptido del mamífero o de un subproducto del mamífero.

Anticuerpos En otro aspecto de la invención, un polipéptido de la invención (o un fragmento antigénico del mismo), se utiliza para producir anticuerpos que tienen, por ejemplo, usos de diagnóstico, terapéuticos o profilácticos, por ejemplo, relacionados con la actividad, distribución y expresión de los polipéptidos y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos de los polipéptidos de la invención pueden generarse por métodos bien conocidos en la técnica. Tales anticuerpos pueden incluir, de manera no exclusiva, policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, de una sola cadena, fragmentos de Fab y fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos, por ejemplo, aquéllos que bloquean la unión al receptor, son especialmente preferidos para uso terapéutico y/o profiláctico. Los polipéptidos para la inducción del anticuerpo no requieren actividad biológica; sin embargo, los polipéptidos o péptidos deben ser antigénicos. Los péptidos utilizados para inducir los anticuerpos específicos, pueden tener una secuencia de aminoácidos que consiste de al menos aproximadamente 10 aminoácidos, de manera preferida al menos aproximadamente 15 ó 20 aminoácidos, o al menos aproximadamente 25 ó 30 aminoácidos. Pueden fusionarse tramos cortos de polipéptidos con otra proteína, tal como hemocianina de lapa estriada, y el anticuerpo producido contra la molécula quimérica. Los métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, y están disponibles muchos anticuerpos. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, John Colligan et al., eds., Vols. I-IV (John Wiley & Sons, Inc., NY, Suplemento de 1991 y 2001 ); y Harlow y Lañe (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Coid Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA y referencias citadas en ellos; y Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2a ed.) Academic Press, New York, NY; y Kohier y Milstein (1975) Nature 256:495-497. Otras técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos incluyen la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares. Véase, Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281 ; y Ward et al. (1989) Nature 341 :544-546. Los anticuerpos monoclonales y policlonales específicos y el antisuero, se unirán usualmente con una KD de al menos aproximadamente 0.1 µ?, de manera preferida, al menos aproximadamente 0.01 µ? o mejor, y de manera más típica y preferida, 0.001 µ? o mejor. Los métodos detallados para la preparación de cuerpos quiméricos (humanizados), pueden encontrarse en la Patente de E.U.A. 5,482,856. Los detalles adicionales de la humanización y otras técnicas de producción y manipulación tecnológica de anticuerpos, pueden encontrarse en Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, 2a Edición Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL en Oxford Press, Oxford, Inglaterra (McCafferty) y Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul). En un aspecto, esta invención proporciona anticuerpos completamente humanizados contra los polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos humanizados son especialmente deseables en aplicaciones en donde los anticuerpos se utilizan como compuestos terapéuticos y/o profilácticos in vivo en pacientes humanos. Los anticuerpos humanos consisten de secuencias de inmunoglobulina característicamente humanas. Los anticuerpos humanos de esta invención pueden producirse utilizando una amplia variedad de métodos (véase, por ejemplo, Larrick et al., Patente de E.U.A. No. 5,001 ,065 y Borrebaeck McCafferty y Paul, supra, para una revisión). En un aspecto, los anticuerpos humanos de la presente invención se producen inicialmente en células de trioma. Los genes que codifican los anticuerpos se clonan a continuación y se expresan en otras células, tales como células de mamífero no humano. El procedimiento general para producir los anticuerpos humanos mediante la tecnología del trioma, se describe por Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2:361-367, Ostberg, Patente de E.U.A. No. 4,634,664 y Engelman et al, Patente de E.U.A. No. 4,634,666. Las líneas celulares que producen los anticuerpos, obtenidas mediante este método, son llamadas triomas debido a que descienden de tres células - dos humanas y una de ratón. Se ha encontrado que los triomas producen anticuerpos de manera más estable que los hibridomas ordinarios hechos a partir de células humanas. Otros usos contemplados para los polipéptidos de la invención se proporcionan a través de la especificación.

Conjugados del interferón alfa En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjugado que comprende un polipéptido que exhibe actividad del interferón alfa, que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS.44-104, y al menos una porción no polipeptídica unida a un grupo de unión del polipéptido, tal como, por ejemplo, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, por ejemplo, 1 ó 2 porciones no polipeptídicas unidas a un grupo de unión del polipéptido. Se entenderá que el conjugado también exhibe una actividad del interferón alfa (tal como una actividad antiviral, actividad de diferenciación del TH1 y/o actividad antiproliferativa). En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjugado que comprende un polipéptido que exhibe una actividad del interferón alfa, polipéptido el cual comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (tal como una de las SEQ ID NOS:1-15, 47 ó 53), en al menos un residuo de aminoácido seleccionado de un residuo de aminoácido introducido o eliminado, que comprende un grupo de unión para una porción no polipeptídica. Los ejemplos de residuos de aminoácidos a ser introducidos y/o eliminados de acuerdo con este aspecto, se describen con más detalle en las secciones siguientes. Se entenderá que el conjugado mismo también exhibe una actividad del interferón alfa. En otro aspecto, el conjugado comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (tal como una de las SEQ ID NOS:1 -15, 47 ó 53), en 0-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 0-14 posiciones de los aminoácidos, en 0-12 posiciones de los aminoácidos, en 0-10 posiciones de los aminoácidos, en 0-8 posiciones de los aminoácidos, en 0-6 posiciones de los aminoácidos, en 0-5 posiciones de los aminoácidos, en 0-4 posiciones de los aminoácidos, en 0-3 posiciones de los aminoácidos, en 0-2 posiciones de los aminoácidos, o en 0-1 posiciones de los aminoácidos. En un aspecto de la invención, se introduce el residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptídica (por ejemplo, por sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo diferente que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptídica, o por la inserción de un residuo de aminoácido adicional, que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptídica). El término "conjugado" (o de manera indistinta "conjugado polipeptídico" o "polipéptido conjugado"), pretende indicar una molécula heterogénea (en el sentido de compuesta), formada por la unión covalente de uno o más polipéptidos de la invención a una o más porciones no polipeptídicas. El término "unión covalente", significa que el polipéptido y la porción no polipeptídica están unidos covalentemente de manera directa uno con el otro, o además están unidos covalentemente de manera indirecta uno con el otro a través de una porción o porciones intervinientes, tal como una porción o porciones de puente, separadoras o de enlace. De manera preferida, un polipéptido conjugado es soluble a concentraciones y condiciones relevantes, es decir, es soluble en fluidos fisiológicos tales como la sangre. Los ejemplos de los polipéptidos conjugados de la invención incluyen polipéptidos glucosilados y/o PEGilados. El término "polipéptido no conjugado" puede utilizarse para referirse a la parte polipeptídica del polipéptido conjugado. El término "porción no polipeptídica", pretenden significar una molécula que es capaz de conjugarse a un grupo de unión del polipéptido. Los ejemplos preferidos de porciones no polipeptídicas incluyen porciones de polímero, porciones de azúcar, compuestos lipofílicos o agentes derivadores orgánicos, en particular moléculas de polímero o porciones de azúcar. Se entenderá que la porción no polipeptídica está enlazada al polipéptido a través de un grupo de unión del polipéptido. Excepto en donde el número de porciones no polipeptídicas, tales como la molécula de polímero unida al polipéptido se indique de manera expresa, cualquier referencia a "una porción no polipeptídica" unida al polipéptido o utilizada de otra manera en la presente invención, hará referencia a una o más porciones no polipeptídicas unidas al polipéptido. El término "molécula de polímero", se define como una molécula formada por un enlace covalente de dos o más monómeros, en donde ninguno de los monómeros en un residuo de aminoácido. El término "polímero", puede utilizarse de manera indistinta con el término "molécula de polímero". El término "porción de azúcar", pretende indicar una molécula de carbohidrato unida mediante glucosilación ¡n vivo o in vitro, tal como N u O-glucosilación.

Un "sitio de N glucosilación", tiene la secuencia N-X-S T/C, en donde X es cualquier residuo de aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S/T/C es ya sea serina, treonina o cisteína, de manera preferida serina o treonina, y de manera aún más preferida treonina. Un "sitio de O-glucosilación", comprende el grupo OH de un residuo de serina o treonina. El término "grupo de unión", pretende indicar un grupo de un residuo de aminoácido capaz de acoplarse a la porción no polipeptídica relevante, tal como una molécula de polímero o una porción de azúcar. Los ejemplos no limitantes de grupos de unión útiles y algunas porciones no polipeptídicas correspondientes se proporcionan en el Cuadro 4 a continuación.

CUADRO 4 Grupos de unión útiles y ejemplos de porciones no polipeptídicas correspondientes Grupo de Aminoácido Ejemplos de Método de Referencia unión porciones no conjugación/PEG polipeptídicas activado -NH2 Término N, Lys Polímero, por mPEG-SPA Nektar Inc. ejemplo, PEG mPEG2-NHS Catálogo 2003 mPEG2-butryALD -COOH Término C, Asp, Polímero, por mPEG-Hz Nektar Inc. Glu ejemplo, PEG Catálogo 2003 Acoplamiento in Porción de vitro azúcar Para la N glucosilacion in vivo, el término "grupo de unión" se utiliza de una manera no convencional para indicar los residuos de aminoácido que constituyen un sitio de N glucosilacion (con la secuencia N-X- S/T/C, en donde X es cualquier residuo de aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S/T/C es serina, treonina o cisteína, de manera preferida serina o treonina, y de manera aún más preferida treonina). Aunque el residuo de asparagina del sitio de N glucosilación es uno al cual se une la porción de azúcar durante la glucosilación, tal unión no puede lograrse a menos que otros residuos de aminoácidos del sitio de N glucosilación estén presentes. En consecuencia, cuando la porción no polipeptídica es una porción de azúcar y la conjugación se va a lograr mediante N glucosilación, el término "residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptídica", como se utiliza con relación a las alteraciones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención, debe entenderse como que uno, dos o todos los residuos de aminoácidos que constituyen un sitio de N glucosilación se van a alterar, de tal manera que se introduce un sitio funcional de N glucosilación en la secuencia de aminoácidos, se elimina de la secuencia o un sitio funcional de N glucosilación se retiene en la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, sustituyendo un residuo de serina, el cual ya constituye una parte del sitio de N glucosilación, con un residuo de treonina y vice versa). El término "introducir" (es decir, un residuo de aminoácido "introducido", "introducción" de un residuo de aminoácido), pretende principalmente significar una sustitución de un residuo de aminoácido existente por otro residuo de aminoácido, pero también significa la inserción de un residuo de aminoácido adicional. El término "eliminar" (es decir, un residuo de aminoácido "eliminado", "eliminación" de un residuo de aminoácido), pretende principalmente significar una sustitución del residuo de aminoácido a ser eliminado de otro residuo de aminoácido, pero también puede significar una supresión (sin sustitución) del residuo de aminoácido a ser eliminado. El término "residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptídica", pretende indicar que el residuo de aminoácido es uno al cual se une la porción no polipeptídica (en el caso de un residuo de aminoácido introducido), o se habría unido (en el caso de un residuo de aminoácido eliminado). El término "vida media funcional in vivo" se utiliza en su significado normal, es decir, el tiempo en el cual 50% de la actividad biológica del polipéptido está presente todavía en el cuerpo/órgano objetivo, o el tiempo en el cual la actividad del polipéptido es 50% del valor inicial. La vida media funcional in vivo puede determinarse en un animal experimental, tal como la rata, ratón, conejo, perro o mono. De manera preferida, la vida media funcional in vivo, se determina en un primate no humano, tal como un mono. Además, la vida media funcional in vivo, puede determinarse para una muestra que se ha administrado intravenosamente o subcutáneamente. Como una alternativa a la determinación de la vida media funcional in vivo, puede determinarse la "vida media en suero", es decir, el tiempo en el cual 50% del polipéptido circula en el plasma o corriente sanguínea antes de ser eliminado. La determinación de la vida media en suero con frecuencia es más simple que la determinación de la vida media funcional in vivo, y la magnitud de la vida media en suero es usualmente una buena indicación de la magnitud de la vida media funcional in vivo. De manera alterna, los términos para la vida media en suero incluyen "vida media en plasma", "vida media circulante", "eliminación del suero", "eliminación del plasma" y "vida media de eliminación". La vida media en suero puede determinarse como se describió anteriormente con relación a la determinación de la vida media funcional in vivo. El término "suero" se utiliza en su significado normal, es decir, como plasma sanguíneo sin fibrinógeno y otros factores de coagulación. El término "incrementado", como se utiliza acerca de la vida media funcional in vivo o la vida media en suero, se utiliza para indicar que la vida media relevante del conjugado de la invención es incrementada de manera estadísticamente significativa con relación a aquélla de una molécula de referencia, tal como un interferón alfa del tipo silvestre, por ejemplo, un interferón alfa humano, tal como uno de la SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:42 (u otras secuencias de hulFN-alfa como se describen en la presente y/o en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra), o con el polipéptido no conjugado correspondiente. Así, los conjugados interesantes de la invención incluyen aquéllos que tienen una vida media funcional in vivo incrementada o una vida media en suero incrementada en comparación con una molécula de referencia mencionada anteriormente. El término "AUCSC" o "Area Bajo la Curva cuando se administra subcutáneamente", se utiliza en su significado normal, es decir, como el área bajo la curva de actividad en suero del interferón alfa vs. tiempo, en donde la molécula conjugada se ha administrado subcutáneamente a un animal experimental. Una vez que se han determinado los puntos temporales de la actividad experimental del interferón alfa, el AUCSC puede calcularse de manera conveniente mediante un programa para computadora, tal como GraphPad Prism 3.01. El término "incrementado" como se utiliza acerca del AUCSC, se utiliza para indicar que el Area Bajo la Curva para un conjugado de la invención, cuando se administra subcutáneamente, se incrementa de manera estadísticamente significativa con relación a aquélla de una molécula de referencia, tal como un interferón alfa del tipo silvestre, por ejemplo, un interferón alfa humano, tal como uno de la SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:42 (u otras secuencias de hulFN-alfa como se describen en la presente y/o en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra), o el polipéptido no conjugado correspondiente, cuando se determina bajo condiciones comparables. De manera evidente, la misma cantidad de actividad del interferón alfa debe administrarse al conjugado de la invención y la molécula de referencia. En consecuencia, con el fin de hacer comparaciones directas entre diferentes moléculas de interferón alfa, los valores de la AUCSC deben normalizarse típicamente, es decir, deben expresarse como AUCsc/dosis administrada. El término "Tmax,Sc", se utiliza con respecto al punto temporal en la curva de actividad en suero del interferón alfa vs. tiempo, cuando se observa la actividad en suero más alta del interferón alfa.

Se entenderá que aunque los ejemplos y modificaciones al polipéptido original se proporcionan generalmente aquí con respecto a la secuencia SEQ ID NO:1 , las modificaciones descritas también pueden hacerse en posiciones equivalentes de los aminoácidos de cualquiera de otros polipéptidos de la invención (incluyendo las SEQ ID NO:2-15 y 44-104 y las variantes de las mismas), descritas anteriormente. Eliminando y/o introduciendo residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de unión para la porción no polipeptídica, es posible adaptar específicamente el polipéptido para hacer a la molécula más susceptible a la conjugación a la porción no polipeptídica de elección, para optimizar el patrón de conjugación (por ejemplo, para asegurar una distribución óptima de las porciones no polipeptídicas de la superficie de la molécula del interferón alfa y, por lo tanto, por ejemplo, proteger de manera efectiva los epítopes y otras partes superficiales del polipéptido sin disminuir significativamente la función del mismo). Por ejemplo, mediante la introducción de grupos de unión, el polipéptido del interferón alfa se altera en el contenido de los residuos específicos de aminoácidos, a los cuales se une la porción no polipeptídica relevante, por lo que se logra una conjugación más eficiente, específica y/o extensa. Al eliminar uno o más grupos de unión, es posible evitar la conjugación a la porción no polipeptídica en partes del polipéptido en las cuales tal conjugación es desventajosa, por ejemplo, a un residuo de aminoácido localizado en o cerca de un sitio funcional del polipéptido (puesto que la conjugación en tal sitio puede resultar en la inactivación o actividad reducida del interferón alfa del conjugado resultante, debido a un reconocimiento disminuido del receptor). Además, puede ser ventajoso eliminar un grupo de unión localizado cerca de otro grupo de unión. Se entenderá que el residuo de aminoácido que comprende el grupo de unión para una porción no pólipeptídica, ya sea que se elimine o introduzca, se selecciona basándose en la naturaleza de la porción no pólipeptídica y, en algunos casos, basándose en el método de conjugación a ser utilizado. Por ejemplo, cuando la porción no pólipeptídica es una molécula de polímero, tal como una molécula derivada de polietilenglicol o de óxido de polialquileno, los residuos de aminoácidos capaces de funcionar como un grupo de unión, pueden seleccionarse del grupo que consiste de cisteína, lisina (y/o el grupo amino N terminal del polipéptido), ácido aspártico, ácido glutámico, histidina y arginina. Cuando la porción no pólipeptídica es una porción de azúcar, el grupo de unión es un sitio de N o de O glucosilación in vivo o in vitro, de manera preferida un sitio de N glucosilación. En algunos casos, cuando un grupo de unión para una porción no pólipeptídica se va a introducir en o se va a eliminar del polipéptido del interferón alfa, la posición del polipéptido del interferón alfa a ser modificada puede seleccionarse de manera conveniente como sigue: La posición a ser modificada puede localizarse en la superficie del polipéptido del interferón alfa, tal como una posición ocupada por un residuo de aminoácido que tiene más que el 25% de su cadena lateral expuesta al solvente, tal como más que el 50% de su cadena lateral expuesta al solvente. Tales posiciones se han identificado basándose en un análisis de la estructura 3D de la molécula del interferon alfa 2a humano, como se describe en la sección de "Materiales y Métodos" de la presente. De manera alterna o adicional, la posición a ser modificada puede identificarse basándose en el análisis de una familia de la secuencias de las proteínas del interferon alfa (tal como se muestra en las alineaciones descritas en las Figuras 2 y 4). Para los propósitos del siguiente ejemplo, la SEQ ID NO:1 como se muestra en la línea superior de la alineación de la Figura 2, puede considerarse el interferón alfa original a ser modificado, y las secuencias del interferon alfa humano en el resto de la alineación se consideran los otros miembros de la familia. Por ejemplo, la posición a ser modificada en la secuencia original puede ser una, la cual, en uno o más miembros de la familia diferentes que el interferón alfa original, está (a) ocupada por un residuo de aminoácido que comprende el grupo de unión relevante (cuando tal residuo de aminoácido se va a introducir en la secuencia original) o (b) la cual en el interferón alfa original, pero no en uno o más de otros miembros de la familia, está ocupada por un residuo de aminoácido que comprende el grupo de unión relevante (cuando tal residuo de aminoácido se va a eliminar de la secuencia original). Con el fin de determinar una distribución óptima de los grupos de unión, la distancia entre los residuos de aminoácidos localizados en la superficie de la molécula del interferón alfa se calculó basándose en una estructura 3D de un polipéptido del interferón alfa. De manera más específica, se determinó la distancia entre los CB de los residuos de aminoácidos que comprenden tales grupos de unión, o la distancia entre el grupo funcional (NZ para lisina, CG para ácido aspártico, CD para ácido glutámico, SG para cisteína), de uno y el CB de otro residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión. En el caso de la glicina, se utilizó CA en lugar de CB. En la parte del polipéptido del interferón a de un conjugado de la invención, cualquiera de las distancias puede ser mayor que 8 Á, tal como más que 10 A, con el fin de evitar o reducir la conjugación heterogénea y proporcionar una distribución uniforme de los grupos de unión, por ejemplo, con el objeto de proteger el epítope. Además, en la parte del polipéptido del interferón alfa de un conjugado de la invención, en algunos casos se eliminan los grupos de unión localizados en o cerca de los sitios de unión al receptor del interferón alfa, tal como mediante la sustitución de un residuo de aminoácido que comprende tal grupo. En algunos casos, los residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de unión para una porción no polipeptídica, tal como cisteína o lisina, con frecuencia no se introducen en o cerca del sitio de unión al receptor de la molécula del interferón alfa. Otro procedimiento para modificar un polipéptido del interferón alfa es proteger, y por lo tanto modificar o destruir, o de otra manera inactivar un epítope presente en el interferón alfa original, mediante la conjugación a ¡una porción no polipeptídica. Los epítopes de los polipéptidos del interferón alfa, pueden identificarse utilizando métodos conocidos en la técnica, también conocidos como trazado del mapa del epítope, véase por ejemplo, Romagnoli et al., J. Biol Chem., 1999, 380(5):553-9, DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96:11 -20, Van de Water et al., Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85(3):229-35, Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119(1 ):77-81 y Lañe DP y Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5(2):268-71. Un método es establecer una biblioteca de representación del fago, que expresa oligopéptidos aleatorios de, por ejemplo, 9 residuos de aminoácidos. Los anticuerpos lgG1 de antisuero específico hacia el ¡nterferón alfa humano, se purifican mediante inmunoprecipitación, y los fagos reactivos se identifican mediante inmunotransferencia. Al secuenciar el ADN de los fagos reactivos purificados, la secuencia del oligopéptido puede determinarse, seguido por la localización de la secuencia en la estructura 3D del interferón alfa. De manera alterna, los epítopes pueden identificarse de acuerdo con el método descrito en la Patente de E.U.A. 5,041 ,376. La región identificada de esta manera en la estructura, constituye un epítope que a continuación puede seleccionarse como una región objetivo para la introducción de un grupo de unión para la porción no polipeptídica. De manera preferida, al menos un epítope, tal como dos, tres o cuatro epítopes del interferón alfa se protegen por una porción no polipeptídica de acuerdo con la presente invención. En consecuencia, en un aspecto, el conjugado de la invención tiene al menos un epítope protegido en comparación con un interferón alfa humano del tipo silvestre, incluyendo cualquier interferón alfa comercial mente disponible. Esto puede hacerse mediante la introducción de un grupo de unión para una porción no polipeptídica en una posición localizada en la vecindad de (es decir, dentro de 4 residuos de aminoácidos en la secuencia primaria o dentro de aproximadamente 10 Á en la secuencia terciaria) de un epítope dado. La distancia de 10 Á se mide entre los CB (CA en el caso de glicina). Tales introducciones específicas se describen en las siguientes secciones. En el caso de eliminación de un grupo de unión, el residuo de aminoácido relevante que comprende tal grupo y que ocupa una posición como se definió anteriormente, puede sustituirse con un residuo de aminoácido diferente, que no comprende un grupo de unión para la porción no polipeptídica en cuestión, o puede suprimirse. El retiro de un grupo de N glucosilación, también puede lograrse por la inserción o eliminación de un residuo de aminoácido dentro del motivo N-X-S T/C. En el caso de introducción de un grupo de unión, un residuo de aminoácido que comprende tal grupo, se introduce en la posición, tal como por la sustitución del residuo de aminoácido que ocupa tal posición. El número exacto de grupos de unión disponibles para la conjugación, y presentes en el polipéptido del interferón alfa, depende del efecto deseado a ser logrado por la conjugación. El efecto a ser obtenido es, por ejemplo, dependiente de la naturaleza y grado de conjugación (por ejemplo, la identidad de la porción no polipeptídica, el número de porciones no polipeptídicas deseables o posibles para conjugar el polipéptido, en donde deben conjugarse o en donde debe evitarse la conjugación, etc.). Por ejemplo, si se desea una inmunogenicidad reducida, el número (y ubicación de) los grupos de unión, debe ser suficiente para proteger la mayoría o todos los epítopes. Esto se obtiene normalmente cuando una proporción mayor del polipéptido del interferón alfa se protege. La protección efectiva de los epítopes se logra normalmente cuando el número total de grupos de unión disponible para la conjugación está en el intervalo de 1-6 grupos de unión, por ejemplo, 1-5, tal como en el intervalo de 1-3, tal como 1 , 2 ó 3 grupos de unión. La vida media funcional ¡n vivo es, i.a., dependiente del peso molecular del conjugado y el número de grupos de unión necesarios para proporcionar una vida media incrementada, depende entonces de peso molecular de la porción no polipeptídica en cuestión. Algunos de tales conjugados comprenden 1-6, por ejemplo, 1-5, tal como 1-3, por ejemplo, 1 , 2 ó 3 porciones no polipeptídícas, cada una que tiene un PM de aproximadamente 2-40 kDa, tal como aproximadamente 2 kDa, aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 12 kDa, aproximadamente 15 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 30 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En el conjugado de la invención, algunos, la mayoría o sustancialmente todos los grupos de unión conjugables están ocupados por la porción no polipeptídica relevante. El conjugado de la invención puede exhibir una o más de las siguientes propiedades mejoradas: Por ejemplo, el conjugado puede exhibir una inmunogenicidad reducida en comparación con un interferón alfa humano (tal como cualquiera de los polipéptidos definidos en la presente como las SEQ ID NO:31-42, SEQ ID NO:32+R23K, o cualquier otro hulFN-alfa descrito en la presente y/o en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra), o comparado con el polipéptido no conjugado correspondiente, por ejemplo, una reducción de al menos 10%, tal como una reducción de al menos 25%, tal como una reducción de al menos 50%, por ejemplo, una reducción de al menos 75% en comparación con el polipéptido no conjugado o en comparación con el interferón alfa humano. En otro aspecto, el conjugado puede exhibir una reacción reducida o ninguna reacción con los anticuerpos neutralizantes de pacientes tratados con un interferón alfa humano (tal como cualquiera de los polipéptidos definidos en la presente como las SEQ ID NO:31-42, SEQ ID NO:32+R23K, o cualquier otro hulFN-alfa descrito en la presente y/o en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra), o comparado con el polipéptido no conjugado correspondiente, por ejemplo, una reducción de la neutralización de al menos 10%, tal como al menos 25%, tal como al menos 50%, por ejemplo, al menos 75%. En otro aspecto de la invención, el conjugado puede exhibir una vida media funcional in vivo incrementada y/o una vida media en suero incrementada, en comparación con una molécula de referencia, tal como un interferón alfa humano (por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos definidos en la presente como las SEQ ID NO:31 -42, SEQ ID NO:32+R23K, o cualquier otro hulFN-alfa descrito en la presente y/o en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra), o comparado con el polipéptido no conjugado correspondiente. Los conjugados preferidos particulares son tales conjugados, en donde la relación entre la vida media funcional in vivo (o la vida media en suero) del conjugado y la vida media funcional in vivo (o la vida media en suero) de la molécula de referencia, es de al menos 1.25, tal como al menos 1.50, tal como al menos 1.75, tal como al menos 2, tal como al menos 3, tal como al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, tal como al menos 7, tal como al menos 8. Como se mencionó anteriormente, la vida media se determina de manera conveniente en un animal experimental, tal como una rata o un mono, y puede basarse en la administración intravenosa o subcutánea. En un aspecto adicional, el conjugado puede exhibir una biodisponibilidad incrementada, en comparación con una molécula de referencia, tal como un interferón alfa humano (por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos definidos en la presente como las SEQ ID NO:31-42, SEQ ID NO:32+R23K, o cualquier otro hulFN-alfa descrito en la presente y/o en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra), o el polipéptido no conjugado correspondiente. Por ejemplo, el conjugado puede exhibir un AUCSC incrementada en comparación con una molécula de referencia, tal como un interferón alfa humano o el polipéptido no conjugado correspondiente. Así, los conjugados ejemplares son tales conjugados, en donde la relación entre el AUCSC del conjugado y el AUCSC de la molécula de referencia, es de al menos 1.25, tal como al menos 1.5, tal como al menos 2, tal como al menos 3, tal como al menos 4, tal como al menos 5 o al menos 6, tal como al menos 7, tal como al menos 8, tal como al menos 9 o al menos 10, tal como al menos 12, tal como al menos 14, por ejemplo, al menos 16, al menos 18 o al menos 20, cuando se administra subcutáneamente, en particular cuando se administra subcutáneamente en un animal experimental tal como una rata o un mono. De manera análoga, algunos conjugados de la invención son tales conjugados en donde la relación entre Tmax para el conjugado y Tmax para la molécula de referencia, tal como un interferón alfa humano o el polipéptido no conjugado correspondiente, es al menos 1.2, tal como al menos 1.4, por ejemplo, al menos 1.6, tal como al menos 1.8, tal como al menos 2, por ejemplo, al menos 2.5, tal como al menos 3, tal como al menos 4, por ejemplo, al menos 5, tal como al menos 6, tal como al menos 7, por ejemplo, al menos 8, tal como al menos 9, tal como al menos 10, cuando se administra subcutáneamente, en particular cuando se administra subcutáneamente en un animal experimental, tal como una rata o un mono. En algunos casos, la magnitud de la actividad antiviral de un conjugado de la invención puede reducirse (por ejemplo, por al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 10%), o incrementarse (por ejemplo, por al menos aproximadamente 10 %) o es aproximadamente igual (por ejemplo, dentro de aproximadamente +/- 0% o aproximadamente +/- 5%) a aquélla de un interferón alfa humano (por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos identificados en la presente como las SEQ ID NO:31-42, SEQ ID NO:32+R23K, o cualquier otro hulFN-alfa descrito en la presente y/o en Alien G. y Diaz M.O. (1996), supra), o con aquélla del polipéptido no conjugado correspondiente. En algunos casos, el grado de actividad antiviral en comparación con la actividad antiproliferativa de un conjugado de la invención puede variar, y por lo tanto ser más alta, más baja o aproximadamente igual que aquélla de un interferón alfa humano o aquélla del polipéptido no conjugado correspondiente.

Conjugado de la invención en donde la porción no polipeptídica se une a un residuo de cisteína En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjugado que exhibe una actividad del interferón alfa, y que comprende al menos una porción no polipeptídica conjugada a al menos un residuo de cisteína de un interferón alfa, la secuencia de aminoácidos de la cual difiere en 0-16 posiciones de los aminoácidos de aquélla de un polipéptido del interferón alfa original, tal como un polipéptido del interferón alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-15 y 44-104 (tal como una de la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53), en que al menos un residuo de cisteína se ha introducido, tal como mediante sustitución o inserción, en una posición que está ocupada en el interferón alfa original por un residuo de aminoácido que está expuesto a la superficie de la molécula, de manera preferida una que tiene al menos 25%, tal como al menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie. Típicamente, el conjugado comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de, por ejemplo, las SEQ ID NOS: 1-15, 47 ó 53, en 1-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 1-14 posiciones de los aminoácidos, en 1-12 posiciones de los aminoácidos, en 1-10 posiciones de los aminoácidos, en 1-8 posiciones de los aminoácidos, en 1-6 posiciones de los aminoácidos, en 1-5 posiciones de los aminoácidos, en 1-4 posiciones de los aminoácidos, en 1-3 posiciones de los aminoácidos o en 1-2 posiciones de los aminoácidos. Algunos conjugados de la invención comprenden una secuencia polipeptídica que comprende una o más de las siguientes sustituciones, con relación a la SEQ ID NO:1 , que introducen un residuo de cisteína en una poción que se predice que está expuesta en la superficie de la molécula con más que un 25% del ASA fraccionada: D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, G10C, R12C, R13C, M16C, A19C, Q20C, R22C, R23C, I24C, S25C, L26C, F27C, S28C, L30C, K31 C, R33C, H34C, D35C, R37C, Q40C, E41 C. E42C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, V51 C, Q52C, E59C, Q62C, Q63C, N66C, S69C, T70C, K71 C, N72C, S74C, A75C, D78C, E79C, T80C, L81 C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91C, N94C, D95C, E97C, A98C, V100C, M101 C, Q102C, E103C, V104C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L1 11 C, M112C, N113C, V114C, D115C, L1 18C, R121 C, K122C, Q125C, R126C, T128C, L129C, T132C, K133C, K134C, K135C, Y136C, S137C, P138C, A146C, M149C, R150C, S153C, F154C, N157C, Q159C, K160C, R161 C, L162C, R163C, R164C, K165C y E166C, las posiciones de los residuos de aminoácido con relación a la SEQ ID NO:1. En algunos casos, entre las posiciones mencionadas anteriormente, uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 47, 51 y 133 no están sustituidos con cisteína. Por ejemplo, algunos de tales conjugados de la invención comprenden una secuencia polipeptídica que comprende una o más de las siguientes sustituciones, con relación a la SEQ ID ??. , que introducen un residuo de cisteína en una posición que se predice que está expuesta a la superficie de la molécula con más que un 50% del ASA fraccionada: D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, R12C, R13C, M16C, A19C, S25C, F27C, S28C, K31 C, R33C, H34C, D35C, R37C, E41C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, N66C, K71C, A75C, D78C, E79C, T80C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91C, N94C, D95C, M101 C, Q102C, E103C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L111C, V1 14C, D115C, L1 18C, R121 C, K122C, Q125C, R126C, L129C, T132C, K133C, K135C, P138C, R150C, K160C, L162C, R163C, R164C, K165C y E166C, las posiciones de los residuos de aminoácidos son con relación a la SEQ ID NO:1. En algunos casos, uno o ambos de los residuos de aminoácidos en las posiciones 47 y 133 no están sustituidos con cisteína. Como se indicó anteriormente, en algunos casos, puede ser preferible introducir residuos de cisteína fuera de los sitios de unión al receptor potenciales del interferón alfa, es decir, fuera de aproximadamente las posiciones 29-40, 79-96 y 124-141 , la numeración de la posición es con relación a la SEQ ID NO:1. Así, en algunos casos, una o más de las sustituciones de cisteina, se seleccionan del grupo que consiste de D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, G10C, R12C, R13C, M16C, A19C, Q20C, R22C, R23C, I24C, S25C, L26C, F27C, S28C, E41 C, E42C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, V51 C, Q52C, E59C, Q62C, Q63C, N66C, S69C, T70C, K71 C, N72C, S74C, A75C, E97C, A98C, V100C, M101 C, Q102C, E103C, V104C, G105C, E107C, E108C, T109C, P1 10C, L1 11C, M112C, N1 13C, V114C, D115C, L1 18C, R121 C, K122C, A146C, M149C, R150C, S153C, F154C, N157C, Q159C, K160C, R161C, L162C, R163C, R164C, K165C y E166C (posiciones que se predicen que están expuestas en la superficie de la molécula con más que un 25% del ASA fraccionada y que no son parte de los sitios de unión al receptor putativos), con relación a la SEQ ID NO:1. En algunos casos, una o ambas de las posiciones 47 y 51 , no están sustituidas con cisteina. En otros aspectos, la sustitución de la cisteina se selecciona del grupo que consiste de: D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, R12C, R13C, M16C, A19C, S25C, F27C, S28C, E41 C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, N66C, K71 C, A75C, M101 C, Q102C, E103C, G105C, E107C, E108C, T109C, P1 10C, L11 1 C, V114C, D1 15C, L1 18C, R121 C, K122C, R150C, K160C, L162C, R163C, R164C, K165C y E166C (posiciones que se predice que están expuestas en la superficie de la molécula con más que el 50% del ASA fraccionada y que no son parte de los sitios de unión al receptor putativos), con relación a la SEQ ID NO:1. En algunos casos, la posición 47 no está sustituida con una cisteína. Algunos de tales conjugados de la invención comprenden una secuencia polipeptídica que contiene una o más de las sustituciones S25C, S28C, L30C, K31 C, N46C, K71 C, S74C, A75C, E79C, E107C, E108C, T132C, K133C, P138C y K135C, con relación a la SEQ ID NO:1. En otro aspecto, uno o más residuos de cisteína se introducen en o cerca del término C, ya sea mediante sustitución (por ejemplo, Q159C, K160C, R161 C, L162C, R163C, R164C, K165C o E166C, con relación a la SEQ ID NO:1 ) o mediante inserción (por ejemplo, E166EC, también referida en la presente como 167C). Se entenderá que los residuos de cisteína también pueden introducirse, ya sea mediante sustitución o mediante inserción, en fragmentos truncados C terminalmente de las moléculas del interferón alfa, descritas en la presente. En algunos casos, solo un residuo de cisteína se introduce con el fin de evitar la formación de puentes de disulfuro entre dos o más residuos de cisteína introducidos. En los interferón alfa, los enlaces disulfuro se forman entre las cisteínas en las posiciones 1/99 y 29/139. El enlace de disulfuro 29/139 es esencial para la actividad biológica, mientras que el enlace 1/99 puede reducirse sin afectar de manera significativa la actividad biológica (Beilharz M.W. er a/. (1986) J. Interferón Res. 6(6):677-685). Así, en otro aspecto de la invención, uno de C1 o C99 se elimina, de manera preferida mediante sustitución, por ejemplo, C1 S o C99S, dejando por lo tanto el otro residuo de cisteína disponible para la conjugación a una porción no polipeptídica. Las porciones no polipeptídicas contempladas en este aspecto de la invención, incluyen moléculas de polímero, tal como cualquiera de las moléculas mencionadas en la sección titulada "Conjugación a una molécula de polímero", tal como PEG o mPEG. La conjugación entre el polipéptido que contiene la cisteína y la molécula de polímero, puede lograrse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, como se describe en la sección titulada "Conjugación a una molécula de polímero", por ejemplo, utilizando un método de un paso o de una manera paso a paso referida en dicha sección. Un método ejemplar para la PEGilación del polipéptido del interferón alfa es unir covalentemente el PEG a los residuos de cisteína utilizando PEG reactivos con cisteína. Una variedad de PEG reactivos con cisteína altamente específicos, con diferentes grupos (por ejemplo, disulfuro de ortopiridilo (OPSS), maleimida (MAL) y vinilsulfona (VS)), y PEG de diferentes tamaños lineales o ramificados (por ejemplo, 2-40 kDa, tal como 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa), están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Nektar Therapeutics Inc., Huntsville, AL, EUA, o de SunBio, Anyang City, Corea del Sur. Se entenderá que aunque los ejemplos de modificaciones a los polipéptidos originales se proporcionan generalmente en la presente con relación a la secuencia SEQ ID NO:1 (o con relación a alguna otra secuencia especificada), las modificaciones descritas también pueden hacerse en posiciones equivalentes de los aminoácidos en cualquiera de los otros polipéptidos de la invención (incluyendo la SEQ ID NO:2-15 y las SEQ ID NOS.44-104 y variantes de las mismas) descritas en la presente. Así, como un ejemplo, la sustitución H47C con relación a la SEQ ID NO:1 , se entiende que corresponde a Q47C en la SEQ ID NO:5 y así sucesivamente.

Conjugado de la invención en donde la porción no polipeptídica se une a un residuo de lisina En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjugado que exhibe una actividad del interferón alfa y que comprende al menos una porción no polipeptídica conjugada a al menos un residuo de lisina y/o al grupo amino N terminal, de un polipéptido del interferón alfa que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOS:1-15 y 44-104, o que comprende una secuencia que difiere de cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y 44-104 (tal como una de la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53), en 0-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 0-14 posiciones de los aminoácidos, en 0-12 posiciones de los aminoácidos, en 0-10 posiciones de los aminoácidos, en 0-8 posiciones de los aminoácidos, en 0-6 posiciones de los aminoácidos, en 0-5 posiciones de los aminoácidos, en 0-4 posiciones de los aminoácidos, en 0-3 posiciones de los aminoácidos, en 0-2 posiciones de los aminoácidos o en 0-1 posiciones de los aminoácidos. Algunos conjugados de acuerdo con este aspecto comprenden al menos un residuo de lisina eliminado y/o al menos un residuo de histidina eliminado y/o al menos un residuo de lisina introducido. Algunos conjugados de la invención comprenden una secuencia polipeptídica que comprende una sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente, o una supresión de un residuo de aminoácido, la cual elimina una o más lisinas, por ejemplo, K31 , K50, K71 , K84, K122, K133, K134, K135, K160 y/o K165 (con relación a la SEQ ID NO:1 ), de cualquier polipéptido de la invención, tal como, por ejemplo, una de la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53. Uno o más residuos de lisina a ser eliminados, pueden sustituirse con cualquier otro aminoácido, pueden sustituirse con una Arg (R) o Gln (Q), o pueden suprimirse. Algunos de tales conjugados comprenden las sustituciones K31 R+K122R; K31 R+K133R; K122R+K133R; o K31 R+K122R+K133R. Otras sustituciones ejemplares incluyen K71 E; K84E; K133E/G; y K160E. En los casos en donde se emplean químicas de conjugación reactiva con amina, puede ser ventajoso evitar o reducir al mínimo el potencial de la conjugación a los residuos de histidina. Por lo tanto, algunos conjugados de la invención comprenden una secuencia polipeptídica que comprende una sustitución o una supresión que elimina una o más histidinas, por ejemplo, H7, H1 1 , H34 y/o H47 (con relación a la SEQ ID NO:1 ), a partir de cualquier secuencia polipeptídica de la invención tal como, por ejemplo, una de la SEQ ID N0:1 , SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53. Uno o más residuos de histidina a ser eliminados, pueden sustituirse con cualquier otro aminoácido, pueden sustituirse con una Arg (R) o Gln (Q), o pueden suprimirse. Algunos de tales conjugados comprenden las sustituciones H34Q; H47Q; o H34Q+H47Q. De manera alterna o adicional, algunos conjugados de la invención comprenden una secuencia polipeptídica que comprenden una modificación que introduce una lisina en una posición que está ocupada en la secuencia original (por ejemplo, una de las SEQ ID NOS:1-15, 47 ó 53), por un residuo de aminoácido que está expuesto a la superficie de la molécula, por ejemplo, uno que tiene al menos 25%, tal como al menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie. Algunos de tales conjugados comprenden una secuencia polipeptídica que comprende una o más de las siguientes sustituciones, con relación a la SEQ ID NO:1 , que introduce un residuo de lisina en una posición que se predice que está expuesta en la superficie de la molécula con no más que un 25% del ASA fraccionada: D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, G10K, R12K, R13K, M16K, A19K, Q20K, R22K, R23K, I24K, S25K, L26K, F27K, S28K, L30K, R33K, H34K, D35K, R37K, Q40K, E41 K, E42K, D44K, N46K, H47K, Q49K, V51 K, Q52K, E59K, Q62K, Q63K, N66K, S69K, T70K, N72K, S74K, A75K, D78K, E79K, T80K, L81 K, E83K, I87K, F90K, Q91 K, N94K, D95K, E97K, A98K, V100K, M101 K, Q102K, E103K, V104K, G105K, E107K, E108K, T109K, P1 10K, L1 11 K, M1 12K, N1 13K, V1 14K, D1 15K, L1 18K, R121 K, Q125K, R126K, T128K, L129K, T132K, Y136K, S137K, P138K, A146K, M149K, R150K, S153K, F154K, N157K, Q159K, R161 K, L162K, R163K, R164K y E166K, las posiciones de los residuos de aminoácidos son con relación a la SEQ ID NO:1. En algunos casos, entre las posiciones mencionadas anteriormente, uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 47, 51 , 52 y 154 no están sustituidos con lisina. Algunos de tales conjugados de la invención comprenden una secuencia polipeptídica que comprende una o más de las siguientes sustituciones, con relación a la SEQ ID NO:1 , que introducen un residuo de lisina en una posición que se predice que está expuesta en la superficie de la molécula con más que un 50% del ASA fraccionada: D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, R12K, R13K, M16K, A19K, S25K, F27K, S28K, R33K, H34K, D35K, R37K, E41 K, D44K, N46K, H47K, Q49K, N66K, A75K, D78K, E79K, T80K, E83K, I87K, F90K, Q91 K, N94K, D95K, M101 K, Q102K, E103K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L1 1 1 K, V1 14K, D115K, L118K, R121 K, Q125K, R126K, L129K, T132K, P138K, R150K, L162K, R163K, R164K y E166K, las posiciones de los residuos de aminoácidos son con relación a la SEQ ID NO:1. En algunos casos, entre las posiciones mencionadas anteriormente, la posición 47 no está sustituida con lisina. Como se indicó anteriormente, en algunos casos puede ser preferible introducir residuos de lisina fuera de los sitios de unión al receptor potenciales, del interferón alfa, es decir, fuera de alrededor de las posiciones 29-40, 79-96 y 124-141 , la numeración de las posiciones es con relación a la SEQ ID N0:1. Así, en algunos casos, una o más sustituciones de lisina se seleccionan del grupo que consiste de D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, G10K, R12K, R13K, M16K, A19K, Q20K, R22K, R23K, I24K, S25K, L26K, F27K, S28K, E41 K, E42K, D44K, N46K, H47K, Q49K, V51 K, Q52K, E59K, Q62K, Q63K, N66K, S69K, T70K, N72K, S74K, A75K, E97K, A98K, V100K, M101K, Q102K, E103K, V104K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L111 K, M112K, N113K, V114K, D115K, L118K, R121 K, A146K, M149K, R150K, S153K, F154K, N157K, Q159K, R161 K, L162K, R163K, R164K y E166K (residuos que tienen más que el 25% de la cadena lateral expuesta a la superficie y que no forman parte de los sitios de unión al receptor putativos), con relación a la SEQ ID NO:1. En algunos casos, una o más de las posiciones 47, 51 y 154 no están sustituidas con lisina. En algunos casos, una o más sustituciones de lisina se seleccionan del grupo que consiste de: D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, R12K, R13K, M16K, A19K, S25K, F27K, S28K, E41 K, D44K, N46K, H47K, Q49K, N66K, A75K, M101 K, Q102K, E103K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L1 1 1 K, V1 14K, D115K, L1 18K, R121 K, R150K, L162K, R163K, R164K y E166K (residuos que tienen más que el 50% de la cadena lateral expuesta a la superficie y que no forman parte de los sitios de unión al receptor putativos), con relación a la SEQ ID ??. . En algunos casos, la posición 47 no está sustituida con una lisina. Las porciones no polipeptídicas contempladas para este aspecto de la invención, incluyen moléculas de polímero, tales como cualquiera de las 7 moléculas mencionadas en la sección titulada "Conjugación a una molécula de polímero", tal como PEG o mPEG. La conjugación entre el polipéptido que contiene lisina y la molécula de polímero puede lograrse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, como se describe en la sección titulada "Conjugación a una molécula de polímero", por ejemplo, utilizando un método de un paso o de una manera paso a paso referida en dicha sección. Un método ejemplar para la PEGilación del polipéptido del interferón alfa es unir covalentemente el PEG a los residuos de lisina utilizando PEG reactivos con lisina. Una variedad de PEG reactivos a la lisina, altamente específicos (tales como, por ejemplo, propionato de succinimidilo (SPA), butanoato de succinimidilo (SBA), N-hidroxilsuccinimida (NHS) y aldehido (por ejemplo, ButyrALD)), y PEG de diferentes tamaños lineales o ramificados (por ejemplo, 2-40 kDa, tales como 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, o 40 kDa), están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Nektar Therapeutics Inc., Huntsville, AL, EUA, o SunBio, Anyang City, Corea del Sur. Se entenderá que aunque los ejemplos de las modificaciones al polipéptido original se proporcionan generalmente en la presente con relación a la secuencia SEQ ID NO:1 (o con relación a alguna otra secuencia especificada), las modificaciones descritas también pueden hacerse en las posiciones equivalentes de los aminoácidos de cualquiera de los otros polipéptidos de la invención (incluyendo las SEQ ID NO:2-15 y las SEQ ID NOS:44-104 y variantes de las mismas), descritas en la presente. Así, como un ejemplo, la sustitución H47K con relación a la SEQ ID NO:1 , se entiende que corresponde a Q47K en la SEQ ID NO:5 y así sucesivamente.

Conjugado de la invención en donde la porción no polipeptídica es una porción de azúcar En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjugado que exhibe actividad del interferón alfa y que comprende al menos una porción de azúcar conjugada a un polipéptido del interferón alfa, la secuencia de aminoácidos de la cual difiere de aquélla de un polipéptido del interferón alfa original, tal como cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (tal como una de la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53), 1-16 posiciones de los aminoácidos, en que al menos un sitio de glucosilación, de manera preferida un sitio de N glucosilación in vivo, se ha introducido, de manera preferida, mediante sustitución, en una posición que en el polipéptido del interferón alfa original está ocupada por un residuo de aminoácido que está expuesto a la superficie de la molécula, por ejemplo, uno que tiene al menos 25%, tal .como al menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie. Típicamente, el conjugado comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de, por ejemplo, las SEQ ID NOS: 1-15, 47 ó 53, en 1-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 1-14 posiciones de los aminoácidos, en 1-12 posiciones de los aminoácidos, en 1- 10 posiciones de los aminoácidos, en 1-8 posiciones de los aminoácidos, en 1-6 posiciones de los aminoácidos, en 1-5 posiciones de los aminoácidos, en 1-4 posiciones de los aminoácidos, en 1-3 posiciones de los aminoácidos o en 1-2 posiciones de los aminoácidos. El sitio de N glucosilación se introduce de tal manera que el residuo N (Asn) del sitio, se localiza en la posición designada. De manera análoga, un sitio de O glucosilación se introduce de manera que el residuo de S (Ser) o T (Thr) que constituye tal sitio, se localiza en esa posición. Deberá entenderse que cuando el término "al menos 25% (o 50%) de su cadena lateral expuesta a la superficie", se utiliza en conexión con la introducción de un sitio de N glucosilación in vivo, este término se refiere a la accesibilidad superficial de la cadena lateral del aminoácido en la posición en donde la porción de azúcar está unida realmente. En muchos casos, será necesario introducir un residuo de serina o uno de treonina en la posición +2 con relación al residuo de asparagina al cual la porción de azúcar está unida realmente, y estas posiciones, en donde se introducen los residuos de serina o treonina, se dejan estar enterradas, es decir, que tengan menos que el 25% (o el 50%) de sus cadenas laterales expuestas a la superficie de la molécula. Algunos conjugados de la invención comprenden una secuencia polipeptídica que comprende una o más de las siguientes sustituciones, con relación a la SEQ ID NO:1 , las cuales introducen un sitio de N glucosilación en una posición que se predice que está expuesta en la superficie de la molécula con más que un 25% del ASA fraccionada: D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N, T6N+S8T, H7N+L9S/T, S8N+G10S/T, L9N+H11ST, G10N+R12S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S/T, M16N+L18S/T, A19N+M21S/T, Q20N+R22S/T, R22N+I24S/T, R23N, R23N+S25T, I24N+L26S T, S25N+F27S/T, L26N, L26N+S28T, S28N+L30S/T, L30N+D32ST, K31 N+R33S/T, R33N+D35ST, H34N+F36S/T, D35N+R37S/T, R37N+P39S/T, Q40N+E42S/T, E41 +F43S/T, E42N+D44S/T, D44N+N46S/T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51S/T, K50N+Q52S/T, V51N+A53S T, Q52N+I54S/T, E59N+M6 S/T, Q62N, Q62N+T64S, Q63N+F65S/T, F68S/T, S69N+K71S/T, T70N+N72S/T, K71N, K71N+S73T, S74T, S74N+A76S/T, A75N+W77S/T, D78N, D78N+T80S, E79N+L81S/T, T80N+L82S/ , L81N+E83S/T, E83N+F85S/T, K84N+Y86S/T, I87N+L89S/T, F90N+Q92ST, Q91N+M93S/T, L96ST, D95N+E97S/T, E97N+C99S/T, A98N+V100S/T, V100N+Q102S/T, M101 N+E103S/T, Q102N+V104S/T, E103N+G105S/T, V104N+V106S/T, G105N+E 07S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P110S/T, L111N+N113S/T, M112N+V114SfT, N113N+D115S/T, V114N, V114N+S116T, D115N+I117S/T, L118N+V120S/T, R121N+Y123S/T, K122N+F124S/T, Q125N+I127S/ , R126N, R126N+T128S, T128N+Y130ST, L129N+L131S/T, T132N+K134S/T, K133N+K135S/T, K134N+Y136S/T, K135N, K135N+S137T, Y136N+P138S/T, P138N, P138N+S140T, A146N+I148S/T, M149N, M149N+S151T, R150N+F152S/T, S153N, S153N+S155T, F154N+F156S/T, Q159S ~, K160N+L162S/T, R161N+R163S/T, L162N+R164S/T, R163N+K165S T y R164N+E166ST, con relación a la SEQ ID NO:1. En algunos casos, entre las posiciones mencionadas anteriormente, los residuos de aminoácido en una o más de las posiciones 47, 51 , 133 y 140, no están modificados como se muestra anteriormente. S/T indica una sustitución de un residuo de serina o treonina, de manera preferida, un residuo de treonina. Algunos conjugados de la invención comprenden una secuencia polipeptídica que comprende una o más de las siguientes sustituciones, con relación a la SEQ ID NO:1 , que introducen un sitio de N glucosilación en una posición que se predice que está expuesta en la superficie de la molécula con más que un 50% del ASA fraccionada: D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N, T6N+S8T, H7N+L9S/T, S8N+G10S/T, L9N+H11 S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S/T, M16N+L18S/T, A19N+M21 S/T, S25N+F27S/T, S28N+L30S/T, R33N+D35S/T, H34N+F36S/T, D35N+R37S/T, R37N+P39S T, E41 N+F43S/T, D44N+N46S/T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51 S T, K50N+Q52S/T, F68S T, K71 N, K71 N+S73T, A75N+W77S/T, D78N, D78N+T80S, E79N+L81 S/T, T80N+L82S/T, E83N+F85S/T, K84N+Y86S/T, I87N+L89S/T, F90N+Q92S T, Q91 N+M93S/T, L96S/T, D95N+E97S/T, M101 N+E103S/T, Q102N+V104S T, E103N+G105S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P1 10S/T, L1 1 1 N+N1 13S/T, V1 14N, V114N+S116T, D115N+I117S/T, L1 18N+V120S/T, R121 N+Y123S T, K122N+F124S/T, Q125N+I127S/T, R126N, R126N+T128S, L129N+L131 S/T, T132N+K134S/T, K133N+K135S/T, K135N, K135N+S137T, P138N, P138N+S140T, R150N+F152S/T, K160N+L162S/T, L162N+R164S/T, R163N+K165S/T y R164N+E166S/T, con relación a la SEQ ID NO:1. En algunos casos, entre las posiciones mencionadas anteriormente, los residuos de aminoácido en una o más de las posiciones 47, 51 , 133 y 140, no están modificados como se describió anteriormente. S/T indica una sustitución de un residuo de serina o treonina, de manera preferida, un residuo de treonina. En algunos casos puede ser preferible introducir un sitio de N glucosilación fuera de los sitios de unión al receptor potenciales del interferón alfa, es decir, fuera de alrededor de las posiciones 29-40, 79-96 y 124-141 , la numeración de las posiciones es con relación a la SEQ ID NO:1. Así, las sustituciones que conducen a la introducción de uno o más sitios de N glucosilación, pueden incluir una o más de D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N, T6N+S8T, H7N+L9S T, S8N+G10Sfi~, L9N+H11 S T, G10N+R12S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S T, M16N+L18S T, A19N+M21S T, Q20N+R22S T, R22N+I24S T, R23N, R23N+S25T, l24N+L26Sn", S25N+F27S/T, L26N, L26N+S28T, S28N+L30S/T, E41 N+F43S/T, E42N+D44S/T, D44N+N46S/T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51 S/T, K50N+Q52S/T, V51 +A53S T, Q52N+I54S/T, E59N+M61S/T, Q62N, Q62N+T64S, Q63N+F65S/T, F68S/T, S69N+K71S/T, T70N+N72S/T, K71 N, K71 N+S73T, S74T, S74N+A76S/T, A75N+W77SH", E97N+C99S/T, A98N+V100S/T, V100N+Q102S/T, M101 N+E103S/T, Q102N+V104ST, E103N+G105S T, V104N+V106S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P1 10S/T, L111 N+N1 13S/T, M1 12N+V1 14SÍT, N1 13N+D1 15S/T, V1 14N, V1 14N+S116T, D1 15N+I1 17S/T, L118N+V120S T, R121 N+Y123S/T, K122N+F124S/T, A146N+I148S/T, M149N, M149N+S151T, R150N+F152S/T, S153N, S153N+S155T, F154N+F156S/T, Q159S/T, K160N+L162S/T, R161 N+R163S/T, L162N+R164S/T, R163N+K165ST y R164N+E166S T (residuos que tienen más que el 25% de la cadena lateral expuesta a la superficie, y que no forman parte de los sitios de unión putativos). En algunos casos, entre las posiciones mencionadas anteriormente, los residuos de aminoácido en una o ambas de las posiciones 47 y 51 , no están modificados como se mostró anteriormente. S/T indica una sustitución de un residuo de serina o treonina, de manera preferida, un residuo de treonina. En algunos casos, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste de: D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N, T6N+S8T, H7N+L9S/T, S8N+G10S/T, L9N+H1 1 S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S/T, M16N+L18S T, A19N+M21 S/T, S25N+F27S/T, S28N+L30S/T, E41 N+F43S T, D44N+N46S/T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51 S/T, K50N+Q52S/T, F68S/T, K71 N, K71 N+S73T, A75N+W77S/T, M101 N+E103S T, Q102N+V104Sn", E103N+G105S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P1 10S/T, L1 11N+N113S/T, V1 14N, V114N+S116T, D115N+I1 17S/T, L118N+V120S/T, R121 N+Y123S/T, K122N+F124SH", R150N+F152S T, K160N+L162S/T, L162N+R164S/T, R163N+K165S/T y R164N+E166S/T (residuos que tienen más que el 50% de la cadena lateral expuesta a la superficie, y que no forman parte de los sitios de unión putativos). En algunos casos, entre las posiciones mencionadas anteriormente, los residuos de aminoácido en una o ambas de las posiciones 47 y 51 , no están modificados como se mostró anteriormente. S/T indica una sustitución de un residuo de serina o treonina, de manera preferida, un residuo de treonina. Con el fin de obtener un uso eficiente del sitio de N glucosilación introducido, es deseable seleccionar cualquiera de las sustituciones mencionadas anteriormente, dentro de aproximadamente los 125 residuos de aminoácidos N terminales, tal como dentro de aproximadamente los 100 residuos de aminoácidos N terminales, por ejemplo, dentro de los 75 residuos de aminoácidos N terminales, o dentro de los 50 residuos de aminoácidos N terminales. Cuando el polipéptido del ¡nterferón alfa que es parte de un conjugado de la invención está glucosilado, puede contener un solo sitio de glucosilación introducido in vivo, tal como un solo sitio de N glucosilación introducido in vivo. Sin embargo, con el fin de obtener una protección eficiente de los epítopes presentes en la superficie del polipéptido original, puede ser deseable que el polipéptido comprenda más que un sitio de glucosilación in vivo, tal como 2-5 sitios de glucosilación in vivo, por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5 sitios de glucosilación in vivo. Se entenderá que aunque los ejemplos de las modificaciones al polipéptido original se proporcionan generalmente en la presente con relación a la secuencia SEQ ID NO:1 (o con relación a alguna otra secuencia especificada), las modificaciones descritas también pueden hacerse en las posiciones equivalentes de los aminoácidos de cualquiera de los otros polipéptidos de la invención (incluyendo las SEQ ID NO:2-15 y las SEQ ID NOS:44-104, y variantes de las mismas), descritas en la presente. Así, como un ejemplo, la sustitución H47N+Q49S/T con relación a la SEQ ID NO:1 , se entiende que corresponde a Q47N+Q49S/T en la SEQ ID NO:5 y así sucesivamente.

Porción no polipeptídica del conjugado de la invención Como se indicó anteriormente, la porción no polipeptídica del conjugado de la invención, se selecciona generalmente del grupo que consiste de una molécula de polímero, un compuesto lipofílico, una porción de azúcar (por ejemplo, por medio de una N glucosilación in vivó), y un agente derivador orgánico. Todos de estos agentes pueden conferir propiedades deseables a la parte polipeptídica del conjugado, tal como una inmunogenicídad reducida, vida media funcional in vivo incrementada, vida media en suero incrementada, biodisponibilidad incrementada y/o AUCSC incrementada. La parte polipeptídica del conjugado con frecuencia se conjuga a sólo un tipo de porción no polipeptídica, pero también puede conjugarse a dos o más tipos diferentes de porciones no polipeptídícas, por ejemplo, a una molécula de polímero y a una porción de azúcar, etc. La conjugación a dos o más porciones diferentes no polipeptídícas puede hacerse de manera simultánea o secuencial. La elección de la porción/porciones no polipeptídícas, depende especialmente del efecto deseado a ser logrado por la conjugación. Por ejemplo, se ha encontrado que las porciones de azúcar son particularmente útiles para reducir la inmunogenicídad, mientras que las moléculas de polímero, tal como PEG son de uso particular para incrementar la vida media funcional in vivo y/o la vida media en suero. Utilizando una combinación de una molécula de polímero y una porción de azúcar, se puede mejorar la reducción en la inmunogenicidad y el incremento en la vida media en suero o in vivo funcional. En las siguientes secciones "Conjugación a un compuesto lipofílico", "Conjugación a una molécula de polímero", "Conjugación a una porción de azúcar" y "Conjugación a un agente derivador orgánico", se describe la conjugación a los tipos específicos de porciones no polipeptídicas.

Conjugación a un compuesto lipofílico Para la conjugación a un compuesto lipofílico, los siguientes grupos polipeptídicos pueden funcionar como grupos de unión: el término N o el término C del polipéptido, los grupos hidroxi de los residuos de aminoácidos Ser, Thr o Tyr, el grupo e-amino de Lys, el grupo SH de Cys o el grupo carboxilo de Asp y Glu. El polipéptido y el compuesto lipofílico pueden conjugarse uno con el otro ya sea directamente o mediante el uso de un enlazante. El compuesto lipofílico puede ser un compuesto natural, tal como un ácido graso saturado o no saturado, una dicetona de ácido graso, un terpeno, una prostaglandina, una vitamina, un carotenoide o esteroide, o un compuesto sintético, tal como un ácido carbónico, un alcohol, una amina y ácido sulfónico con uno o más compuesto de alquilo, arilo, alquenilo u otros compuestos no saturados múltiples. La conjugación entre el polipéptido y el compuesto lipofílico, opcionalmente a través de un enlazante, puede hacerse a través de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Bodanszky en Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 y en WO 96/12505.

Conjugación a una molécula de polímero La molécula de polímero a ser acoplada al polipéptido puede ser cualquier molécula de polímero, tal como un homopolímero o heteropolímero natural o sintético, típicamente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 300-100,000 Da, tal como aproximadamente 1000-50,000 Da, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1000-40,000 Da. Más particularmente, la molécula de polímero, tal como PEG, en particular mPEG, tendrá típicamente un peso molecular de aproximadamente 2, 5, 10, 12, 15, 20, 30, 40 ó 50 kDa, en particular, un peso molecular de aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 12 kDa, aproximadamente 15 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 30 kDa o aproximadamente 40 kDa. La molécula de PEG puede ser ramificada (por ejemplo, mPEG2), o puede ser no ramificada (es decir, lineal). Cuando se utilizan acerca de las moléculas de polímero en la presente, la palabra "aproximadamente" indica un peso molecular promedio aproximado y refleja el hecho de que normalmente habrá una distribución del peso molecular en una preparación de polímero dada.

Los ejemplos de homopolímeros incluyen un poliol (es decir poli-OH), una poliamina (es decir, poli-NH2), y un ácido policarboxílico (es decir poli-COOH). Un heteropolímero es un polímero que comprende uno o más grupos de acoplamiento diferentes, tal como un grupo hidroxiio y un grupo amina. Los ejemplos de las moléculas de polímero adecuadas incluyen moléculas de polímero seleccionadas del grupo que consiste de un óxido de polialquileno (PAO), incluyendo polialquilenglicol (PAG), tal como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglícol (PPG), PEG ramificados (PEG2), alcohol polivinílico (PVA), policarboxilato, poli-(vinilpirrolidona), anhídrido de polietilen-co-ácido maleico, anhídrido de poliestiren-co-ácido málico, dextrano incluyendo carboximetil-dextrano, o cualquier otro biopolímero adecuado para reducir la ¡nmunogenicidad y/o incrementar la vida media funcional in vivo y/o la vida media en suero. Generalmente, los polímeros derivados de polialquilenglicol son biocompatibles, no tóxicos, no antigénicos, no inmunogénicos, tienen varias propiedades de solubilidad en agua y se excretan fácilmente de los organismos vivos. El PEG es la molécula de polímero preferido a ser utilizada, puesto que tiene sólo pocos grupos reactivos capaces de reticularse en comparación con, por ejemplo, los polisacáridos tales como el dextrano. En particular, el PEG monofuncional, por ejemplo, el monometoxipolietilenglicol (mPEG), es de interés, puesto que su química de acoplamiento es relativamente simple (sólo está disponible un grupo reactivo para la conjugación con los grupos de unión en el polipéptido). En consecuencia, el riesgo de reticulación se elimina, los conjugados polipeptídicos resultantes son más homogéneos y la reacción de las moléculas de polímero con el polipéptido es más fácil de controlar. Para efectuar la unión covalente de las moléculas de polímero al polipéptido, los grupos de extremo de hidroxilo de la molécula de polímero, deben proporcionarse en forma activada, es decir, con grupos funcionales reactivos (los ejemplos de los cuales incluyen grupos amino primarios, hidrazida (HZ), tiol, succinato (SUC), succionato de succinimidilo (SS), succinimidil succinamida (SSA), propionato de succinimidilo (SPA), butanoato de succinimidilo (SBA), carboximetilato de succinimidilo (SCM), carbonato de benzotriazol (BTC), N-hidroxisuccinimida (NHS), aldehido, nitrofenilcarbonato (NPC) y tresilato (TRES)). Las moléculas de polímero activadas de manera adecuada, están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Nektar Therapeutics, Inc., Huntsville, AL, EUA; PolyMASC Pharmaceuticals pie, RU; o SunBio Corporation, Anyang City, Corea del Sur. De manera alterna, las moléculas de polímero pueden activarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en WO 90/13540. Los ejemplos específicos de moléculas de polímero lineales o ramificadas, activadas, adecuadas para utilizarse en la presente invención, se describen en Nektar Therapeutics, Inc., Catálogo 2003 ("Nektar Molecule Engineering: Polyetilene Glycol and Derivatives for Advanced Pegylation, Catálogo 2003"), incorporado aquí como referencia. Los ejemplos específicos de polímeros de PEG activados incluyen los siguientes PEG lineales: NHS-PEG, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, SCM-PEG, NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, OPSS-PEG, IODO-PEG y MAL-PEG y PEG ramificados, tales como PEG2-NHS, PEG2-MAL, y aquéllos descritos en US 5,932,462 y US 5,643,575, ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia. Además, las siguientes publicaciones, incorporadas aquí como referencia, describen moléculas de polímero y/o químicas de PEGilación útiles: US 5,824,778, US 5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281 ,698, US 5,122,614, US 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/1 1924, WO95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791 , WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131 , US 5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316. La conjugación del polipéptido y las moléculas activadas de polímero, se realiza utilizando cualquier método convencional, por ejemplo, como se describe en las siguientes referencias (las cuales también describen los métodos adecuados para la activación de las moléculas de polímero): Harris y Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F. Taylor, (1991 ), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Ratón; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y. Para la PEGilación de los residuos de cisteína, el polipéptido se trata usualmente con un agente reductor, tal como ditíotreitol (DDT), antes de la PEGilación. El agente reductor se elimina posteriormente mediante cualquier método convencional, tal como por desalación. La conjugación del PEG a un residuo de cisteína, tiene lugar típicamente en un amortiguador adecuado a pH 6-9 a temperaturas que varían de 4°C a 25°C durante periodos de hasta aproximadamente 16 horas. Los ejemplos de los polímeros activados de PEG para el acoplamiento a los residuos de cisteína, incluyen los siguientes PEG lineales y ramificados: vinilsulfona-PEG (PEG-VS), tal como vinilsulfona-mPEG (mPEG-VS); ortopiridil-disulfuro-PEG (PEG-OPSS), tal como ortopiridil-disulfuro-mPEG (mPEG-OPSS); y maleimida-PEG (PEG-MAL), tal como maleimida-mPEG (mPEG-MAL), y maleimida-mPEG2 ramificado (mPEG2-MAL). La pegilación de las Usinas con frecuencia emplea PEG-N-hidroxilsuccinimida (por ejemplo, mPEG-NHS o mPEG2-NHS), o esteres tales como PEG propionato de succinimidilo (por ejemplo, mPEG-SPA) o PEG butanoato de succinimidilo (por ejemplo, mPEG-SBA). Uno o más PEG pueden unirse a una proteína en 30 minutos a pH 8-9.5 a temperatura ambiente, si se mezclan cantidades aproximadamente equimolares de PEG y proteína. Una relación molar de PEG a los grupos amino de la proteína de 1-5 a 1 , usualmente será suficiente. El pH que se incrementa, incrementa la velocidad de la reacción, mientras que la disminución del pH reduce la velocidad de la reacción. Estos ésteres activos altamente reactivos, pueden acoplarse a un pH fisiológico, pero los derivados menos reactivos típicamente requieren un pH mayor. También pueden emplearse temperaturas bajas si se utiliza una proteína lábil. Bajo condiciones de temperatura baja, puede utilizarse un tiempo de reacción más largo. La PEGilación N terminal se facilita por la diferencia entre los valores del pKa del grupo a-amino del aminoácido N terminal (-7.6 a 8.0) y el grupo e-amino de la lisina (~10). La PEGilación del grupo amino N terminal con frecuencia emplea PEG-aldehídos (tales como mPEG-propionaldehído o mPEG-butilaldehído), los cuales son más selectivos para las aminas y por lo tanto, son menos probables de que reaccionen con el grupo imidazol de la histidina; además, los reactivos de PEG utilizados para la conjugación de la lisina (tales como mPEG-SPA o mPEG-SBA), también pueden utilizarse para la conjugación de la amina N terminal. La conjugación de un PEG-aldehído al grupo amino N terminal, típicamente se tiene lugar en un amortiguador adecuado (tal como, amortiguador de acetato de sodio 00 mM o de bisfosfato de sodio 100 mM con cianoborohidruro de sodio 20 mM) a pH ~ 5.0 durante la noche, a temperaturas que varían de aproximadamente 4°C a 25°C. Los métodos de PEGilación N terminal y las químicas útiles también se describen en la Patente de E.U.A. 5,985,265 y la Patente de E.U.A. 6,077,939, ambas incorporadas aquí como referencia. Típicamente, los polímeros de PEG o mPEG lineales tendrán un peso molecular de aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 12 kDa, aproximadamente 15 kDa, aproximadamente 20 kDa, o aproximadamente 30 kDa. Los polímeros de PEG ramificados (PEG2 o mPEG2), típicamente tendrán un peso molecular de aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 20 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En algunos casos, pueden utilizarse los reactivos de PEG2 ramificados de peso molecular más alto, tales como PEG2 de 20 kDa o 40 kDa, incluyendo por ejemplo, mPEG2-NHS para la PEGilacíón de la lisina, mPEG2-MAL para la PEGilación de la cisteína, o MPEG2-aldehído para la PEGilación N terminal (todos disponibles de Nektar Therapeutics, Inc, Huntsville AL). La estructura ramificada del compuesto de PEG2 resulta en un volumen molecular relativamente grande, de manera que menos moléculas unidas (o una molécula unida), pueden impartir las características deseadas de la molécula PEGilada. La persona con experiencia estará conciente de que métodos de activación y/o la química de la conjugación a ser utilizados dependen de los grupos de unión del polipéptido del interferón alfa, así como los grupos funcionales del polímero (por ejemplo, siendo amino, hidroxilo, carboxilo, aldehido o sulfhidrilo). La PEGilación puede dirigirse hacia la conjugación a todos los grupos de unión disponibles en el polipéptido (es decir, tales grupos de unión que están expuestos en la superficie del polipéptido), o puede dirigirse hacia los grupos de unión específicos, por ejemplo, residuos de cisteína, residuos de lisina, o el grupo amino N terminal. Además, la conjugación puede lograrse en un paso o de una manera paso a paso (por ejemplo, como se describe en WO 99/55377). En algunos casos, la conjugación del polímero se realiza bajo condiciones que apuntan a hacer reaccionar tantos grupos de unión del polímero disponibles como sea posible con las moléculas de polímero. Esto se logra por medio de un exceso molar adecuado del polímero con relación al polipéptido. Las relaciones molares típicas de moléculas de polímero activadas a polipéptido son de hasta aproximadamente 1000-1 , tal como hasta aproximadamente 200-1 o hasta aproximadamente 100-1. En algunos casos, la relación puede ser algo menor, sin embargo, tal como hasta aproximadamente 50-1 , 10-1 ó 5-1. También pueden utilizarse relaciones equimolares. También está contemplado de acuerdo con la invención, acoplar las moléculas de polímero a los polipéptidos a través de un enlazante. Los enlazantes adecuados son bien conocidos por las personas con experiencia. Un ejemplo preferido es el cloruro cianúrico (Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581 ; US 4,179,337; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378). Posteriormente a la conjugación, las moléculas de polímero activadas residuales se bloquean de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la adición de una amina primaria a la mezcla de reacción, y las moléculas de polímero inactivadas resultantes se eliminan mediante un método adecuado. El acoplamiento covalente in vitro de una porción de azúcar a los residuos de aminoácidos del interferón alfa, puede utilizarse para modificar o incrementar el número o el perfil de los sustituyentes de azúcar. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, los carbohidratos pueden unirse a a) arginina e histidina (Lundblad y Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Ratón, Fl), b) grupos carboxilo libres (por ejemplo, del residuo de aminoácido C terminal, asparagina o glutamina), c) grupos sulfhidrilo libres, tales como aquél de la cisteína, d) grupos hidroxilo libres, tales como aquéllos de la serina, treonina, tirosina o hidroxiprolina, e) residuos aromáticos tales como aquéllos de la fenilalanina o el triptófano o f) el grupo amida de la glutamina. Estos residuos de aminoácidos constituyen los ejemplos de los grupos de unión para una porción de azúcar, la cual puede introducirse y/o eliminarse en el polipéptido del interferón alfa. Los métodos adecuados del acoplamiento in vitro se describen en WO 87/05330 y en Aplin et al., CRC Crit Rev. Biochem., pp. 259-306, 1981. El acoplamiento in vitro de las porciones de azúcar o PEG a los residuos de Gln unidos a una proteína y un péptido, también puede llevarse a cabo mediante transglutaminasas (TGasas), por ejemplo, como se describe por Sato et al., 1996 Biochemistry 35, 13072-13080 o en EP 725145.

Acoplamiento a una porción de azúcar Con el fin de lograr la glucosilación in vivo de un polipéptido del interferón alfa que se ha modificado por la introducción de uno o más sitios de glucosilación (véase la sección "Conjugados de la invención en donde la porción no polipeptídica es una porción de azúcar"), la secuencia nucleotídica que codifica la parte polipeptídica del conjugado se inserta en un hospedero eucariótico de expresión, glucosilante. La célula hospedera de expresión puede seleccionarse de células de hongos (hongos filamentosos o levaduras), de insectos, de células de animales mamíferos, de células de plantas transgénicas o de animales transgénicos. Además, la glucosilación puede lograrse en el cuerpo humano cuando se utiliza una secuencia nucleotídica que codifica la parte polipeptídica de un conjugado de la invención o un polipéptido de la invención en la terapia génica. En un aspecto, la célula hospedera es una célula de mamífero, tal como una célula CHO, una célula COS, una célula BHK o HEK, por ejemplo, HEK293, o una célula de insecto, tal como una célula SF9, o una célula de levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris o cualquier otro hospedero glucosilante adecuado, por ejemplo, como se describe adicionalmente a continuación. Opcionalmente, las porciones de azúcar unidas al polipéptido del interferón-a mediante la glucosilación in vivo, se modifican adicionalmente por el uso de glucosiltransferasa, por ejemplo, utilizando la tecnología GlycoAdvance™ comercializada por Neose, Horsham, PA, EUA. Por lo tanto, es posible, por ejemplo, incrementar la sialiación del polipéptido del interferón alfa glucosilado después de la expresión y la glucosilación in vivo por las células CHO.

Acoplamiento a un agente derivador orgánico La modificación covalente del polipéptido del interferón alfa puede realizarse haciendo reaccionar un grupo de unión del polipéptido con un agente derivador orgánico. Los agentes derivadores y los métodos adecuados son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y con las aminas correspondientes), tal como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también se derivan mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(4-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-p¡ridilo, disulfuro de metil 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1 ,3-diazol. Los residuos de histidilo se derivan mediante la reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5.5-7.0, debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral del histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción se realiza de manera preferida en cacodilato de sodio 0.1 a pH 6.0. Los residuos terminales de lisinilo y amino se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivar los residuos que contienen a-amino, incluyen imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido nitrobencensulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentandiona; y reacción catalizada con transaminas con glioxilato. Los residuos de arginilo se modifican por la reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos el fenilglioxal, 2,3-butandiona, ,2-ciclohexandiona y ninhidrina. La derivación de los residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional de la guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como el grupo guanidino de la arginina. Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo o un residuo de aminoácido C terminal), se modifican selectivamente mediante la reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), en donde R y R' son diferentes grupos alquilo, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1 -etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten a los residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones amonio.

Bloqueo de un sitio funcional Puesto que la conjugación excesiva del polímero puede conducir a una pérdida de la actividad del polipéptido del interferón- al cual se conjuga el polímero, puede ser ventajoso para eliminar los grupos de unión localizados en el sitio funcional o bloquear el sitio funcional antes de la conjugación. Estas últimas estrategias constituyen los aspectos adicionales de la invención (la primera estrategia se ejemplifica anteriormente, por ejemplo, por la eliminación de los residuos de lisina que pueden localizarse cerca de un sitio funcional). Más específicamente, de acuerdo con la segunda estrategia, la conjugación entre el polipéptido del interferón alfa y la porción no polipeptídica se realiza bajo condiciones en donde el sitio funcional del polipéptido se bloquea por una molécula auxiliar, capaz de unirse al sitio funcional del polipéptido. De manera preferida, la molécula auxiliar es una que reconoce específicamente un sitio funcional del polipéptido, tal como un receptor, en particular, el receptor del interferón del tipo I. De manera alterna, la molécula auxiliar puede ser un anticuerpo, en particular, un anticuerpo monoclonal que reconoce el polipéptido del interferón alfa. En particular, la molécula auxiliar puede ser un anticuerpo monoclonal neutralizante. El polipéptido se deja interactuar con la molécula auxiliar antes de efectuar la conjugación. Esto asegura que el sitio funcional del polipéptido está cubierto o protegido, y en consecuencia, no está disponible para la derivación por la porción no polipeptídica, tal como un polímero. Después de su elusión de la molécula auxiliar, el conjugado entre la porción no polipeptídica y el polipéptido puede recuperarse con al menos un sitio funcional parcialmente conservado. La conjugación subsiguiente del polipéptido que tiene un sitio funcional bloqueado a un polímero, un compuesto lipofílico, un agente derivador orgánico o cualquier otro compuesto, se realiza de la manera normal, por ejemplo, como se describe en las secciones anteriores tituladas "Conjugación a Sin importar la naturaleza de la molécula auxiliar a ser utilizada para proteger el sitio funcional del polipéptido de la conjugación, es deseable que la molécula auxiliar esté libre de, o que comprenda sólo pocos grupos de unión para la porción no polipeptídica de elección, en las partes de la molécula en donde la conjugación a tales grupos entorpecería la desorción del polipéptido conjugado de la molécula auxiliar. Por lo tanto, puede obtenerse la conjugación selectiva a los grupos de unión presentes en las partes no protegidas del polipéptido, y es posible reutilizar la molécula auxiliar para ciclos repetidos de conjugación. Por ejemplo, si la porción no polipeptídica es una molécula de polímero tal como PEG, que tiene el grupo epsilon amino de una lisina o un residuo de aminoácido N terminal como un grupo de unión, es deseable que la molécula auxiliar esté sustancialmente libre de grupos epsilon amino conjugables, de manera preferida, libre de cualquier grupo epsilon amino. En consecuencia, en algunos casos, la molécula auxiliar es una proteína o un péptido capaz de unirse al sitio funcional del polipéptido, proteína o péptido el cual está libre de cualquier grupo de unión conjugable para la porción no polipeptídica de elección. En un aspecto adicional, la molécula auxiliar se enlaza primer covalentemente a una fase sólida, tal como materiales de empaque de columna, por ejemplo, Sephadex o perlas de agarosa, o a una superficie, por ejemplo, un recipiente de reacción. Posteriormente, el polipéptido se carga en el material de la columna que porta la molécula auxiliar y la conjugación se lleva a cabo de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describen en las secciones anteriores tituladas "Conjugación a Este procedimiento permite que el conjugado polipeptídico se separe de la molécula auxiliar mediante elución. El conjugado polipeptídico se eluye mediante técnica convencionales bajo condiciones fisicoquímicas que no conducen a una degradación sustancial del conjugado polipeptídico. La fase fluida que contiene el conjugado polipeptídico se separa de la fase sólida a la cual la molécula auxiliar permanece enlazada covalentemente. La separación puede lograrse de varias maneras: Por ejemplo, la molécula auxiliar puede derivarse con una segunda molécula (por ejemplo, biotina), que puede reconocerse por un ligante específico (por ejemplo, estreptavidina). El ligante específico puede enlazarse a una fase sólida, permitiendo por lo tanto la separación del conjugado polipeptídico del complejo molécula auxiliar-segunda molécula, a través del paso sobre una segunda columna en fase sólida auxiliar que retendrá, tras la elución subsiguiente, el complejo de la molécula auxiliar-segunda molécula, pero no el conjugado polipeptídico. El conjugado polipeptídico puede liberarse de la molécula auxiliar de cualquier manera apropiada. La desprotección puede lograrse proporcionando condiciones en las cuales la molécula auxiliar se disocia del sitio funcional del interferón-cc al cual se une. Por ejemplo, un complejo entre un anticuerpo al cual un polímero se conjuga y un anticuerpo antiidíotípico, puede disociarse ajustando el pH a un pH ácido o alcalino.

Conjugación de un polipéptido del interferón alfa marcado En otro aspecto, el polipéptido del interferón alfa es expresado como una proteína de fusión con una marca, es decir, una secuencia de aminoácidos o un péptido constituido de típicamente 1-30, tal como 1-20 ó 1-15 ó 1-10 ó 1-5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, agregados al término N o al término C del polipéptido. Además de permitir una purificación más rápida y fácil, la marca es una herramienta conveniente para lograr la conjugación entre el polipéptido marcado y la porción no polipeptídica. En particular, la marca puede utilizarse para lograr la conjugación en placas de microtitulación u otros portadores, tales como perlas paramagnéticas, en las cuales el polipéptido marcado puede inmovilizarse vía la marca. La conjugación al polipéptido marcado en, por ejemplo, placas de microtitulación, tiene la ventaja de que el polipéptido marcado puede inmovilizarse en las placas de microtitulación directamente del caldo de cultivo (en principio sin ninguna purificación), y someterse a conjugación. Por lo tanto, puede reducirse el número total de pasos del procedimiento (de la expresión a la conjugación). Además, la marca puede funcionar como una molécula separadora, asegurando una accesibilidad mejorada al polipéptido inmovilizado a ser conjugado. La conjugación utilizando un polipéptido marcado puede ser a cualquiera de las porciones no polipeptídicas descritas en la presente, por ejemplo, a una molécula de polímero tal como PEG. La identidad de la marca específica a ser utilizada no es crítica siempre que la marca sea capaz de ser expresada con el polipéptido y que sea capaz de ser inmovilizada en una superficie o material portador adecuado. Varias marcas adecuadas están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Unizyme Laboratories, Dinamarca. Los anticuerpos contra tales marcas están comercialmente disponibles, por ejemplo, de ADI, Aves Lab and Research Diagnostics.

Polinucleótidos de la invención La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes (también referidos en la presente como polinucleótidos), referidos colectivamente como "ácidos nucleicos (o polinucleótidos) de la invención", que codifican los polipéptidos de la invención. Los polinucleótidos de la invención son útiles en una variedad de aplicaciones. Como se discutió anteriormente, los polinucleótidos son útiles para producir los polipéptidos de la invención. Además, los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en vectores de expresión útiles para la terapia génica, vacunación del ADN e inmunoterapia, como se describe con más detalle a continuación. En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes, que comprenden cada uno una secuencia polinucleotídica seleccionada de: (a) una secuencia polinucleotídica seleccionada de las SEQ ID NOS:16-30, o una secuencia polinucleotídica complementaria de las mismas; (b) una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido seleccionado de las SEQ ID NOS:1-15 y 44-104, o una secuencia polinucleotídica complementaria de las mismas.

La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden cada uno, una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que comprende una secuencia que difiere en 0-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 0-16 posiciones, 0-15 posiciones, 0-14 posiciones, 0-13 posiciones, 0-12 posiciones, 0-1 1 posiciones, 0-10 posiciones, 0-9 posiciones, 0-8 posiciones, 0-7 posiciones, 0-6 posiciones, 0-5 posiciones, 0-4 posiciones, 0-3 posiciones, 0-2 posiciones, o 0-1 posiciones, de cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (tal como una de la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). En algunos casos, el polipéptido codificado exhibe una actividad del interferón alfa. La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden cada uno una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de la secuencia de los aminoácidos con cualquiera de las SEQ ID NOS:1-15 y las SEQ ID NOS:44-104 (tal como una de la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:53). En algunos casos el polipéptido codificado exhibe una actividad del interferón alfa. La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes, que comprenden cada uno una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido, que es una variante de un polipéptido del interferón alfa original, la variante codificada que comprende una secuencia que difiere de la secuencia del polipéptido del interferón alfa original en al menos una posición del aminoácido, en donde la secuencia variante comprende uno o más de His en la posición 47, Val en la posición 51 , Phe en la posición 55, Leu en la posición 56, Tyr en la posición 58, Lys en la posición 133 y en la posición Ser140, la numeración de la posición es con relación a aquélla de la SEQ ID NO:1. En algunos casos, la secuencia del polipéptido del interferón alfa original es una secuencia de un interferón alfa humano natural (tal como cualquiera de las SEQ ID NO:31 -SEQ ID NO:42 o la SEQ ID NO:32+R23K, u otra secuencia de hulFN-alfa como se describe en la presente y/o en Alien G. y Díaz M.O. (1996), supra), o es una secuencia de un interferón alfa no natural (es decir, sintético), tal como el IFN-alfa Con1 (SEQ ID NO:43). En algunos casos, la secuencia variante difiere de la secuencia polipeptídica original en 1-16 posiciones de los aminoácidos (tales como en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 posiciones de los aminoácidos), por ejemplo, en 1-10 posiciones de los aminoácidos, en 1-5 posiciones de los aminoácidos, o en 1 -3 posiciones de los aminoácidos. En algunos casos, la variante exhibe una actividad del interferón alfa. En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes, que comprenden cada uno, una secuencia polinucleotídica que se híbrida bajo condiciones altamente rigurosas sobre sustancialmente toda la longitud de una de las SEQ ID NO: 16-30, secuencia polinucleotídica la cual codifica un polipéptido que exhibe una actividad del ¡nterferón alfa.

Aspectos adicionales Cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención (que incluyen aquéllos descritos anteriormente), puede codificar una proteína de fusión que comprende al menos una secuencia de aminoácidos adicional, tal como, por ejemplo, una secuencia de secreción/localización, una secuencia útil para la solubilización o inmovilización (por ejemplo, para la representación en una superficie celular) del polipéptido, una secuencia útil para la detección y/o purificación del polipéptido (por ejemplo, una subsecuencia para la purificación del polipéptido, tal como una marca del epítope, una secuencia de polihistidina y lo similar). En otro aspecto, la invención proporciona células que comprenden uno o más de los ácidos nucleicos de la invención. Tales células pueden expresar uno o más polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de la invención. La invención también proporciona vectores que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Tales vectores pueden comprender un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, o un fragmento de un virus. Tales vectores pueden comprender un vector de expresión y, si se desea, el ácido nucleico está enlazado de manera operativa a un promotor, incluyendo aquéllos discutidos en la presente y a continuación. Además, en otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden un excipiente o portador y al menos uno de cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención, o vectores, células u hospederos que comprenden tales ácidos nucleicos. Tal composición puede ser una composición farmacéutica, y el excipiente o portador puede ser un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. La invención también incluye composiciones que comprenden dos o más ácidos nucleicos de la invención, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, como sustratos para la recombinación). La composición puede comprender una biblioteca de ácidos nucleicos recombinantes, en donde la biblioteca contiene al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 50, o al menos 100 o más ácidos nucleicos descritos anteriormente. Los ácidos nucleicos se clonan opcionalmente en los vectores de expresión, proporcionando bibliotecas de expresión. Los ácidos nucleicos de la invención y fragmentos de los mismos, así como vectores que comprenden tales polinucleótidos, pueden emplearse para usos terapéuticos o profilácticos, en combinación con un portador adecuado, tal como un portador farmacéutico. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéutica y/o profilácticamente efectiva del compuesto, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal portador o excipiente incluye, de manera no exclusiva, suero fisiológico, suero fisiológico amortiguado, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación puede adecuarse al modo de administración. Los métodos de administración de los ácidos nucleicos, polipéptidos y proteínas son bien conocidos en la técnica, y se discuten adicionalmente a continuación. La invención también incluye composiciones producidas digiriendo uno o más de los ácidos nucleicos de la invención con una endonucleasa de restricción, una ARNasa o un ADNasa (por ejemplo, como se realiza en ciertos de los formatos de recombinación indicados anteriormente); y las composiciones producidas por la fragmentación o corte de uno o más ácidos nucleicos de la invención mediante medios mecánicos (por ejemplo, sonicación, sometiendo a un vórtex y lo similar), los cuales también pueden utilizarse para proporcionar sustratos para la recombinación en los métodos descritos en la presente. La invención también proporciona composiciones producidas escindiendo al menos uno de cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. La escisión puede comprender escisión mecánica, química o enzimática, y la escisión enzimática puede comprender escisión con una endonucleasa de restricción, una ARNasa o una ADNasa. También están incluidas en la invención las composiciones producidas mediante un procedimiento que comprende incubar uno o más de los ácidos nucleicos fragmentados de la invención en la presencia de trifosfatos ribonucleótídicos o desoxirribonucleotídicos y de polimerasa del ácido nucleico. Ésta composición resultante forma una mezcla de recombinación para muchos de los formatos de recombinación indicados posteriormente. La polimerasa del ácido nucleico puede ser una ARN polimerasa, una ADN polimerasa, o una ADN polimerasa dirigida al ARN (por ejemplo, una "transcriptasa inversa"); la polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, VENT, TAQ, o lo similar). De manera similar, las composiciones que comprenden conjuntos de oligonucleótidos que corresponden a uno o más de los ácidos nucleicos de la invención, son útiles como sustratos para la recombinación, y son una característica de la invención. Por conveniencia, estas mezclas fragmentadas, cortadas o sintetizadas con oligonucleótidos, se refieren como conjuntos de ácidos nucleicos fragmentados. La invención también proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un polipéptido que exhibe una actividad del interferón alfa, producida mutando o recombinando al menos un ácido nucleico de la invención.

Haciendo polinucleótidos Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de ácidos nucleicos de la invención, pueden prepararse mediante métodos en fase sólida estándar, de acuerdo con los métodos sintéticos conocidos. Típicamente, los fragmentos de hasta aproximadamente 100 bases se sintetizan individualmente, a continuación se unen (por ejemplo, mediante métodos de ligado enzimático o químico, o métodos de recombinación mediada por polimerasa), para formar esencialmente cualquier secuencia continua deseada. Por ejemplo, los polinucleótidos y oligonucleótidos de la invención pueden prepararse mediante síntesis química utilizando, por ejemplo, el método clásico de fosforamidita descrito por, por ejemplo, Beaucage et al. (1981 ) Tetrahedron Letters 22:1859-69, o el método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO J 3:801-05, por ejemplo, como se practica típicamente en los métodos sintéticos automatizados. De acuerdo con el método de la fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, recocen, ligan y clonan en vectores apropiados. Además, esencialmente cualquier polinucleótido puede ordenarse a la medida, de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales tales como Operan Technologies Inc. (Alameda, CA), y muchas otras. De manera similar, los péptidos y anticuerpos pueden ordenarse a la medida de cualquiera de una variedad de fuentes, por ejemplo, Celtek Peptides (Nashville, TN); Washington Biotechnology, Inc. (Baltimore MD); Global Peptide Services (Ft. Collin CO), y muchas otras. Ciertos polinucleótidos de la invención también pueden obtenerse seleccionando bibliotecas de ADNc (por ejemplo, bibliotecas generadas recombinando ácidos nucleicos homólogos como en los métodos típicos de recombinación recursiva de la secuencia), utilizando sondas oligonucleotídicas que pueden hibridarse a, o polinucleótidos que se amplifican por PCR, que codifican los polipéptidos de interferón alfa y los fragmentos de esos polipéptidos. Los procedimientos para seleccionar y aislar las clonas de ADNc son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Tales técnicas se describen en, por ejemplo, Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymol. Vol. 152, Acad. Press, Inc., San Diego, CA ("Berger"); Sambrook, supra, y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, supra. Algunos polinucleótidos de la invención pueden obtenerse alterando una secuencia natural, por ejemplo, mediante mutagénesis, recombinación recursiva de la secuencia (por ejemplo, redistribución), o recombinación de los oligonucleótidos. En otros casos, tales polinucleótidos pueden hacerse en silico o a través de métodos de recombinación de oligonucleótidos, como los descritos en las referencias citadas en la presente. Como se describe con más detalle en la presente, los polinucleótidos de la invención incluyen polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención, las secuencias polinucleotídicas complementarias a estas secuencias polinucleotídicas, y polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones menos rigurosas a las secuencias definidas en la presente. Una secuencia codificante se refiere a una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido particular o dominio, región o fragmento del polipéptido. Una secuencia codificante puede codificar (codificar para) un polipéptido de la invención que exhiba una actividad del ¡nterferón alfa como se describió anteriormente. Los polinucleótidos de la invención pueden estar en la forma de ARN o en la forma de ADN, e incluyen ARNm, ARNc, ARN y ADN sintético y ADNc. Los polinucleótidos pueden ser de doble hebra o de una sola hebra, y si son de una sola hebra, pueden ser de la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido, complementaria). Los polinucleótidos de la invención incluyen la secuencia codificante de un polipéptido de la invención (i) en aislamiento, (ii) en combinación con una o más secuencias codificantes adicionales, para codificar, por ejemplo, una proteína de fusión, una preproteína, una preproproteína o lo similar, (¡ii) en combinación con las secuencias no codificantes, tales como intrones, elementos de control, tales como un promotor (por ejemplo, un promotor natural o recombinante o redistribuido), un elemento terminador, o regiones 5' y/o 3' no traducidas efectivas para la expresión de la secuencia codificante en un hospedero adecuado y/o (¡v) en un vector, célula o medio hospedero en el cual la secuencia codificante es un gen heterólogo. Los polinucleótidos de la invención también pueden encontrarse en combinación con formulaciones de composiciones típicas de ácidos nucleicos, incluyendo la presencia de portadores, amortiguadores, adyuvantes, excipientes y lo similar, como es sabido por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Los fragmentos polinucleotídicos comprenden típicamente al menos aproximadamente 200 bases nucleotídicas, tales como al menos aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 460, 470 o más bases. Los fragmentos nucleotídicos de los polinucleótidos de la invención pueden hibridarse bajo condiciones altamente rigurosas a una secuencia polinucleotídica descrita en la presente y/o codificar las secuencias de aminoácidos que tienen al menos una de las propiedades de los polipéptidos de la invención descritos en la presente.

Secuencias codificantes modificadas Como se entenderá por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, pueden ser ventajoso modificar una secuencia codificante para mejorar su expresión en un hospedero particular. El código genético es redundante con 64 codones posibles, pero la mayoría de los organismos utilizan de manera preferencial un subconjunto de estos codones. Los codones que se utilizan más frecuentemente en una especie, se consideran los codones óptimos, y aquéllos que no se utilizan muy frecuentemente, se clasifican como codones raros o de uso bajo (véase, por ejemplo, Zhang, S. P. et al. (1991 ) Gene 105:61-72). Los codones pueden sustituirse para reflejar el uso preferido del codón del hospedero, un procedimiento denominado algunas veces "optimización del codón" o "control de la desviación del codón de las especies". La secuencia codificante modificada que contiene los codones preferidos por un hospedero procariótico o eucariótico particular (véase, por ejemplo, Murray, E. et al. (1989) Nuc Acids Res 17:477-508) puede prepararse, por ejemplo, para incrementar la velocidad de traducción o para producir transcriptos de ARN recombinante que tienen propiedades deseables, tales como vida media más larga, en comparación con los transcriptos producidos a partir de una secuencia no optimizada. Los codones de paro de la traducción también pueden aplicarse para reflejar la preferencia del hospedero. Por ejemplo, los codones de paro preferidos para S. cerevisiae y mamíferos son UAA y UGA, respectivamente. El codón de paro preferido para las plantas monocotlledóneas es UGA, mientras que los insectos y E. coli prefieren utilizar UAA como el codón de paro (Dalphin, .E. et al. (1996) Nucí. Aclds Res. 24:216-218). Las secuencias polinucleotídicas de la presente invención pueden manipularse tecnológicamente con el fin de alterar una secuencia codificante de la invención por una variedad de razones, Incluyendo, de manera no exclusiva, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento y/o expresión del producto génico. Por ejemplo, pueden producirse alteraciones utilizando técnicas que son bien conocidas en el campo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de glucosilación, para introducir o eliminar grupos de unión (por ejemplo, para la pegllación u otra conjugación), para cambiar el codón de preferencia, para introducir sitios de empalme, etc.

Variaciones silenciosas Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos, codifican cualquier polipéptldo dado. Por ejemplo, la inspección del cuadro de codones siguiente (Cuadro 5), muestra que los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU codifican todo el aminoácido arginina. Así, en cada posición en una secuencia de ácidos nucleicos en donde una arginina está especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos anteriormente, sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de los ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas". Se entenderá que U en una secuencia de ARN corresponde a T en una secuencia de ADN.

CUADRO 5 Cuadro de codones Aminoácido Codón Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Acido Asp D GAC GAU aspártico Acido Glu E GAA GAG glutámico Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina lie I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Thptófano Trp w UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Se apreciará por lo tanto por aquellos con experiencia en la técnica que debido a la degeneración del código genético, puede producirse una multitud de secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención, algunas de las cuales pueden portar una identidad de la secuencia mínima con las secuencias de los ácidos nucleicos descritos de manera explícita en la presente. Alguien con experiencia ordinaria en la técnica, reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG y UGC, los cuales son ordinariamente los únicos codones para la metionina y el triptófano, respectivamente), pueden modificarse mediante técnicas estándar para codificar un polipéptido funcionalmente idéntico. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido, está implícita en cualquier secuencia descrita. La invención también proporciona todas y cada una de las variaciones posibles de una secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen un polipéptido de la invención, que puede hacerse seleccionando combinaciones basadas en posibles selecciones del codón. Estas combinaciones se hacen de acuerdo con el código genético de triplete estándar (codón) (por ejemplo, como se expone en el Cuadro 5), como se aplica a la secuencia de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención. Todas de tales variaciones de cada ácido nucleico en la presente se proporcionan específicamente, y se describen por consideración de la secuencia en combinación con el código genético. Alguien con experiencia es totalmente capaz de generar cualquier sustitución silenciosa de las secuencias listadas en la presente.

Utilizando los polinucleótidos Los polinucleótidos de la invención tienen una variedad de usos en, por ejemplo, la producción recombinante (es decir, la expresión) de los polipéptidos de la invención, típicamente a través de la expresión de un vector de expresión del plásmido, que comprende una secuencia que codifica el polipéptido o fragmento del mismo; como herramientas terapéuticas; como profilácticas; de diagnóstico; como inmunógenos; como adyuvantes; como sondas para diagnóstico para la presencia de ácidos nucleicos complementarios o parcialmente complementarios (incluyendo la detección de un ácido nucleico del interferón alfa del tipo silvestre), como sustratos para reacciones adicionales, por ejemplo, reacciones de recombinación recursiva de la secuencia o reacciones de mutación para producir variantes nuevas y/o mejoradas, y lo similar.

Vectores, promotores y sistemas de expresión La presente invención también incluye constructos recombinantes que comprenden una o más de las secuencias de ácidos nucleicos como se describió ampliamente en lo anterior. Los constructos comprenden un vector, tal como, un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC) y lo similar, en el cual se ha insertado una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, en una orientación hacia delante o inversa. En algunos casos el constructo comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, enlazado de manera operativa a una secuencia de ácidos nucleicos. Aquellos con experiencia en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y están comercialmente disponibles.

Los textos generales que describen las técnicas de biología molecular útiles en la presente, incluyendo el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes, incluyen Berger, supra; Sambrook (1989), supra y Ausubel, supra. Los ejemplos de técnicas suficientes para dirigir a las personas con experiencia a través de los métodos de amplificación in vitro, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación con Qp-replícasa y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA), por ejemplo, para la producción de los ácidos nucleicos homólogos de la invención, se encuentran en Berger, Sambrook y Ausubel, todo supra, así como Mullís et al. (1987) Patente de E.U.A. No. 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) ("Innis"); Arnheim & Levinson (Octubre 1 , 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991 ) 3:81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc Nati Acad Scí EUA 86:1173-1 177; Guatelli et al. (1990) Proc Nati Acad Scí EUA 87:1874-1878; Lomeli et al. (1989) J Clin Chem 35:1826-1831 ; Landegren et al. (1988) Science 241 :1077-1080; Van Brunt (1990) Bíotechnology 8:291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4:560-569; Barringer et al. (1990) Gene 89:1 17-122 y Sooknanan y Malek (1995) Bíotechnology 13:563-564. Los métodos mejorados para clonar in vitro los ácidos nucleicos amplificados se describen en Wallace et al., Patente de E.U.A. No. 5,426,039. Los métodos mejorados para amplificar ácidos nucleicos grandes mediante PCR, se resumen en Cheng et al. (1994) Nature 369:684-685 y las referencias en la misma, en los cuales se generan amplicones por PCR de hasta 40 kilobases (kb). Alguien con experiencia apreciará que esencialmente cualquier ARN puede convertirse a un ADN de doble hebra adecuado para la digestión por restricción, la expansión por PCR y el secuenciamiento utilizando la transcríptasa y la polimerasa inversa. Véase Ausubel, Sambrook y Berger, todos supra. La presente invención también proporciona células hospederas que son transducidas con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Las células hospederas son manipuladas genéticamente (por ejemplo, transducidas, transformadas o transfectadas), con los vectores de esta invención, los cuales pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células hospederas manipuladas tecnológicamente pueden cultivarse en un medio nutriente convencional modificado conforme sea apropiado para los promotores activantes, los transformantes de selección o los genes amplificantes. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y lo similar, son aquéllas utilizadas previamente con la célula hospedera seleccionada para la expresión, y serán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica y en las referencias citadas en la presente, incluyendo, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias citadas en la misma.

Los polipéptidos de la invención también pueden producirse en células no animales tales como plantas, levaduras, hongos, bacterias y lo similar. Además de Sambrook, Berger y Ausubel, los detalles con respecto al tejido celular se encuentran en, por ejemplo, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg NY); Atlas & Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Los polinucleótidos de la presente invención y los fragmentos de los mismos pueden incluirse en cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias cromosómicas, no cromosómicas y de ADN sintético, por ejemplo, derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN del fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral, tales como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela de aves de corral, pseudorrabias, virus adenoasociados, retrovirus y muchos otros. Puede utilizarse cualquier vector que transduzca el material genético en una célula y, si se desea la replicación, que sea replicable y viable en el hospedero relevante. La secuencia de ácidos nucleicos en el vector de expresión está enlazada de manera operativa a una secuencia de control de la transcripción apropiada (promotor), para dirigir la síntesis del ARNm. Los ejemplos de tales promotores incluyen: promotor LTR o SV40, promotor lac o trp de E. coli, promotor PL del fago lambda, promotor CMV y otros promotores conocidos para controlar la expresión de los genes en células procarióticas o eucarióticas o en sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción, y un terminador de la transcripción. El vector incluye opcionalmente secuencias apropiadas para amplificar la expresión, por ejemplo, un mejorador. Además, los vectores de expresión comprenden opcionalmente uno o más genes marcadores seleccionares para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células hospederas transformadas, tal como la resistencia a la dihidrofolato reductasa o a la neomicina para un cultivo celular eucariótico, o tal como la resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli. El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada que codifica un polipéptido de la invención, así como un promotor o secuencia de control apropiado, puede emplearse para transformar un hospedero apropiado para permitir que el hospedero exprese el polipéptido. Los ejemplos de hospederos de expresión apropiados incluyen: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células de hongos, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Neurospora crassa; células de insecto, tales como Drosophila y Spodoptera frugiperda; células de mamífero tales como CHO, COS, BHK, HEK 293 o melanoma de Bowes; células de plantas, etc. Se entenderá que no todas las células son líneas celulares que necesitan ser capaces de producir polipéptidos completamente funcionales de la invención o fragmentos de los mismos; por ejemplo, pueden producirse fragmentos antigénicos del polipéptido en un sistema bacteriano u otro sistema de expresión. La invención está limitada por las células hospederas empleadas. En los sistemas bacterianos, varios vectores de expresión pueden seleccionarse dependiendo del uso pretendido para el polipéptido o el fragmento del mismo. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades de un polipéptido o fragmentos de los mismos, para la inducción de anticuerpos, pueden ser deseables vectores que dirijan un alto nivel de expresión de las proteínas de fusión que son purificadas fácilmente. Tales vectores incluyen, de manera no exclusiva, vectores de clonación y expresión multifuncionales de E. coli, tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los cuales la secuencia que codifica al nucleótido puede ligarse en el vector en bloque con las secuencias para el Met amino terminal y los 7 residuos subsiguientes de la beta-galactosidasa, de manera que se produce una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); vectores pET (Novagen, Madison Wl); y lo similar. De manera similar, en la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden utilizarse varios de los vectores que contienen los promotores constitutivos o inducibles, tales como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH, para la producción de los polipéptidos de la invención. Para las revisiones, véase Ausubel, supra, Berger, supra y Grant et al. (1987) Methods in Enzymology 153:516-544.

En las células hospederas de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión, tales como sistemas basados en virus. En los casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, una secuencia codificante está ligada opcionalmente a un complejo de transcripción/traducción del adenovirus que consiste del promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral resulta en un virus viable capaz de expresar un polipéptido de la invención en las células hospederas infectadas (Logan y Shenk (1984) Proc Nati Acad Sci EUA 81 :3655-3659). Además, se utilizan mejoradores de la transcripción, tales como el promotor del virus del sarcoma de rous (RSV), para incrementar la expresión en células hospederas de mamífero. Las células hospederas, el medio, los sistemas de expresión y los métodos de producción incluyen aquéllos conocidos para clonar y expresar varios interferones alfa de mamíferos (por ejemplo, interferones alfa humanos).

Elementos de expresión adicionales Las señales de inicio específicas pueden ayudar a la traducción eficiente de una secuencia que codifica un polinucleótido de la invención y/o fragmentos de los mismos. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en donde una secuencia codificante, su codón de inicio y las secuencias corriente arriba se insertan en el vector de expresión apropiado, puede no necesitarse señales adicionales de control de la traducción. Sin embargo, en los casos en donde sólo la secuencia codificante (por ejemplo, una secuencia codificante de una proteína madura), o una porción de la misma se inserta, deben proporcionarse señales exógenas del control transcripcional del ácido nucleico, incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la transcripción de todo el inserto. Los elementos transcripcionales y los codones de inicio exógenos pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede mejorarse por la inclusión de mejoradores apropiados al sistema celular en uso (véase, por ejemplo, Scharf D. et al. (1994) Results ProbI Cell Differ 20:125-62; y Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544).

Secuencias de secreción/localización Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención también pueden fusionarse, por ejemplo, en bloque con el ácido nucleico que codifica una secuencia de secreción/localización, para dirigir la expresión del polipéptido a un compartimiento, membrana u organelo celular deseado, o para dirigir la secreción del polipéptido al espacio periplásmico o hacia el medio del cultivo celular. Tales secuencias son conocidas por aquellos con experiencia, e incluyen péptidos líderes o de señal de la secreción, secuencias que seleccionan el organelo (por ejemplo, secuencias de localización nuclear, señales de retención ER, secuencias de tránsito mitocondrial, secuencias de tránsito del cloroplasto), secuencias de localización/anclaje de la membrana (por ejemplo, secuencias de transferencia de paro, secuencias de anclaje GPI) y lo similar.

Hospederos de expresión En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con células hospederas que contienen cualquiera de los ácidos nucleicos, vectores, u otros constructos descritos anteriormente de la invención. La célula hospedera puede ser una célula eucariótica, tal como una célula de mamífero, una célula de levadura, o una célula de planta, o la célula hospedera puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula hospedera puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE-Dextrano, electroporación, cañón génico o de vacuna, inyección u otras técnicas comunes (véase, por ejemplo, Davis, L., Dibner, M. y Battey, I. (1986) Basic Methods in Molecular Biology), para los métodos in vivo, ex vivo o in vitro. Una cepa de una célula hospedera se elige opcionalmente por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada en la manera deseada. Tales modificaciones de la proteína incluyen, de manera no exclusiva, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional que escinde una forma "pre" o "prepro" de la proteína, también puede ser importante para la inserción, plegamiento y/o función correctos. Diferentes células hospederas tales como E. coli, Bacillus sp., células de levadura o de mamífero, tales como CHO, HeLa, BHK, MDCK, HEK 293, WI38, etc., tienen una maquinaría celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales y pueden elegirse para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña introducida. La expresión estable puede utilizarse para la producción a largo plazo, con alto rendimiento, de proteínas recombinantes. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable un polipéptido de la invención, se transducen utilizando vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales o elementos endógenos de expresión y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, las células pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresen de manera exitosa las secuencias introducidas. Por ejemplo, puede hacerse proliferar agregados resistentes de células transformadas de manera estable, utilizando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo celular. Las células hospederas transformadas con la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de la invención, se cultivan opcionalmente bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. El polipéptido producido por una célula recombinante puede secretarse, unirse a la membrana o estar contenido intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o el vector utilizado. Como se entenderá por aquellos con experiencia en la técnica, los vectores de expresión que contienen los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención, pueden diseñarse con secuencias de señal que dirigen la secreción de los polipéptidos maduros a través de la membrana celular procariótica o eucariótica.

Secuencias adicionales Los polinucleótidos de la presente invención comprenden opcionalmente una secuencia codificante fusionada en bloque a una secuencia marcadora, la cual, por ejemplo, facilita la purificación y/o detección del polipéptido codificado. Tales subsecuencias de purificación incluyen, de manera no exclusiva, péptidos quelantes de metal, tales como módulos de histidina-triptófano, que permiten la purificación en metales inmovilizados, una secuencia que se une a la glutationa (por ejemplo, GST), una marca de hemaglutinina (HA) (que corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de la influenza; Wilson, I. et al. (1984) Cell 37:767), secuencias de proteína que se unen a la maltosa, el epítope FLAG utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS, y lo similar. La inclusión de una secuencia enlazante polipeptídica escindible con proteasa entre el dominio de purificación y la secuencia polipeptídica, es útil para facilitar la purificación.

Por ejemplo, un posible vector de expresión para utilizarse en las composiciones y métodos descritos en la presente, proporciona la expresión de una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la invención, fusionado a una región de polihistidina separada por un sitio de escisión de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía por afinidad con un ión metálico inmovilizado, como se describe en Porath et al. (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281 ), mientras que el sitio de escisión de enterocinasa proporciona un método para separar el polipéptido deseado de la región de polihistidina. Los vectores pGEX (Promega; Madison, Wl), se utilizan opcionalmente para expresar los polipéptidos extraños como las proteínas de fusión con glutation S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a través de células lisadas mediante adsorción en perlas de ligando-agarosa (por ejemplo, glutation-agarosa en el caso de fusiones con GST), seguido por la elución en la presencia del ligando libre. Una construcción adicional en las composiciones y métodos descritos en la presente, proporciona proteínas y sus ácidos nucleicos codificantes, que comprenden los polipéptidos de la invención (o uno o más fragmentos de los mismos), por ejemplo, como se describe en la presente, fusionados a una molécula de Ig, por ejemplo, una articulación de IgG Fe humana ("cristalizable con el fragmento", o unión al complemento del fragmento), el dominio CH2 y el dominio CH3 (y las secuencias nucleotídicas que los codifican). Fe es la porción del anticuerpo responsable de la unión a los receptores del anticuerpo en las células y el componente C1q del complemento. Estas proteínas de fusión o fragmentos de las mismas y sus ácidos nucleicos codificantes, son útiles opcionalmente como fármacos profilácticos y/o terapéuticos, o como herramientas de diagnóstico (véase también, por ejemplo, Challita-Eid, P. et al. (1998) J Immunol 160:3419-3426; Sturmhoefel, K. et al. (1999) Cáncer Res 59:4964-4972).

Producción y recuperación de polipéptidos Después de la transducción de una cepa hospedera adecuada y del crecimiento de la cepa hospedera a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce por medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de la temperatura o inducción química), y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células se recolectan típicamente mediante centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para la purificación adicional. Las células eucarióticas o microbianas empleadas en la expresión de las proteínas, pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclo de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes lisantes celulares u otros métodos, los cuales son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Como se indicó, muchas referencias están disponibles para el cultivo o producción de muchas células, incluyendo células de origen bacteriano, de platas, de animales (especialmente mamíferos) y arquebacteriano. Véase, por ejemplo, Sambrook, Ausubel y Berger (todos supra), así como Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias citadas en la misma; Doyle y Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, cuarta edición W.H. Freeman and Company; y Ricciardelli et al. (1989) In vitro Cell Dev Biol 25:1016-1024. Para el cultivo y regeneración de células de plantas, véase, por ejemplo, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York) y Plant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy (ed.) Bios Scientific Publishers, Oxford, R. U. ISBN 0 12 198370 6. El medio de cultivo celular en general se expone en Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. La información adicional para el cultivo celular se encuentra en la literatura comercial mente disponible, tal como el Life Science Research Cell Culture Catalogue de Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO) ("Sigma-LSRCCC") y, por ejemplo, el Plant Culture Catalog y el suplemento, también de Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO) ("Sigma-PCCS"). Los polipéptidos de la invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante cualquier número de métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía con intercambio de aniones o cationes, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía con interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad (por ejemplo, utilizando cualquiera de los sistemas de marcado indicados en la presente), cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Pueden utilizarse los pasos de replegamiento de la proteína conforme se desee, para completar la configuración de la proteína madura o los fragmentos de la misma. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), en los pasos de purificación final. Además de las referencias indicadas, supra, una variedad de métodos de purificación son bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, aquéllos expuestos en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2a Edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3a Edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edición Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

Sistemas de expresión in vitro Los sistemas de transcripción/traducción libres de células, también pueden emplearse para producir los polipéptidos de la invención, utilizando los polinucleótidos de la presente invención. Varios de tales sistemas están comercialmente disponibles. Una guía general para los protocolos de la transcripción y traducción in vitro se encuentra en Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology Volumen 37, Garland Publishing, NY.

Usos y aplicaciones in vivo Los polinucleótidos que codifican un polipéptido de la invención, o complementos de los polinucleótidos (incluyendo, por ejemplo, moléculas antisentido o de ribozima), se administran opcionalmente a una célula para lograr un procedimiento terapéuticamente útil o para expresar un producto terapéuticamente útil. Estas aplicaciones in vivo, incluyendo la terapia génica, incluyen una multitud de técnicas mediante las cuales la expresión génica puede alterarse en las células. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la introducción de genes para la expresión de, por ejemplo, polipéptidos terapéutica y/o profilácticamente útiles, tales como los polipéptidos de la presente invención.

Expresión del polipéptido in vivo Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas in vivo, utilizando técnicas bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, las células cultivadas son manipuladas tecnológicamente ex vivo con al menos un polinucleótido (ADN o ARN) de la invención y/u otras secuencias polinucleotídicas que codifican, por ejemplo, al menos uno de un antígeno, citocina, otra molécula coestimuladora, adyuvante, etc., y lo similar, con las células manipuladas tecnológicamente que se regresan a continuación al paciente. Las células también pueden manipularse tecnológicamente in vivo para la expresión de uno o más polipéptidos in vivo, incluyendo los polipéptidos y/o los péptidos antigénicos de la invención. Se conocen varios vectores virales adecuados para la transducción y expresión en organismos in vivo. Tales vectores incluyen vectores retrovirales (véase, por ejemplo, Miller, Curr Top Microbiol Immunol (1992) 158:1-24; Salmons y Gunzburg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141 ; Miller et al. (1994) Methods in Enzymology 217:581-599) y los vectores adenoasociados (revisados en Cárter (1992) Curr Opinión Biotech 3:533-539; Muzcyzka (1992) Curr Top Microbiol Immunol. 158:97-129). Otros vectores virales que se utilizan, incluyen vectores adenovirales, vectores virales de herpes y vectores virales de Sindbis, como se describe generalmente en, por ejemplo, Jolly (1994) Cáncer Gene Therapy 1 :51 -64; Latchman (1994) Molec Biotechnol 2:179-195; y Johanning et al. (1995) Nucí Acids Res 23:1495-1501.

En un aspecto, puede utilizarse un vector de virus de la viruela. El vector viral de la viruela se transfecta con una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido de la invención, tal como un polipéptido elL-2, y es útil en aplicaciones profilácticas, terapéuticas y de diagnóstico, en donde se desea la mejora de una respuesta inmune, tal como por ejemplo, una proliferación incrementada o mejorada de los linfocitos T. Véanse los vectores virales discutidos en, por ejemplo, Berencsi et al., J Infect Dis (2001 )183(8):1171-9; Rosenwirth et al., Vaccine 2001 Feb 8;19(13-14):1661-70; Kittlesen et al., J Immunol (2000) 164(8):4204-11 ; Brown et al. Gene Ther 2000 7(19):1680-9; Kanesa-thasan et al., Vaccine (2000) 19(4-5):483-91 ; Sten (2000) Drug 60(2):249-71. Las composiciones que comprenden tales vectores y un excipiente aceptable, son también una característica de la invención. La terapia génica y las vacunas genéticas proporcionan métodos para combatir enfermedades infecciosas crónicas (por ejemplo, infección con VIH, hepatitis viral), así como enfermedades no infecciosas, incluyendo el cáncer y algunas formas de defectos congénitos, tales como deficiencias enzimáticas, y tales métodos pueden emplearse con los polinucleótidos de la invención, incluyendo, por ejemplo, vectores y células que comprenden tales polinucleótidos. Se han utilizado varios procedimientos para introducir los ácidos nucleicos y los vectores en las células in vivo, ex vivo e in vitro, y pueden emplearse con los polinucleótidos de la invención y los vectores que comprenden tales polinucleótidos. Estos procedimientos incluyen el suministro génico basado en liposomas (Debs y Zhu (1993) WO 93/24640 y la Patente de E.U.A. No. 5,641 ,662; Mannino y Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7):682-691 ; Rose, Patente de E.U.A. No. 5,279,833; Brigham (1991 ) WO 91/06309; y Felgner et al. (1987) Proc Nati Acad Sci EUA 84:7413-7414; Brigham et al. (1989) Am J Med Sci 298:278-281 ; Nabel et al. (1990) Science 249:1285-1288; Hazinski et al. (1991 ) Am J Resp Cell Molec Biol 4:206-209; y Wang y Huang (1987) Proc Nati Acad Sci EUA 84:7851-7855); suministro génico mediado por un vector adenoviral, por ejemplo, para tratar el cáncer (véase, por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc Nati Acad Sci EUA 91 :3054-3057; Tong et al. (1996) Gynecol Oncol 61 :175-179; Clayman et al. (1995) Cáncer Res. 5:1-6; O'Malley et al. (1995) Cáncer Res 55:1080-1085; Hwang et al. (1995) Am J Respir Cell Mol Biol 13:7-16; Haddada et al. (1995) Curr Top Microbiol Immunol. 1995 (Pt. 3):297-306; Addison et al. (1995) Proc Nati Acad Sci EUA 92:8522-8526; Colak et al. (1995) Brain Res 691 :76-82; Crystal (1995) Science 270:404-410; Elshami et al. (1996) Human Gene Ther 7:141-148; Vincent et al. (1996) J Neurosurg 85:648-654) y muchos otros. También se han utilizado vectores retrovirales defectuosos para la replicación, que alojan una secuencia polinucleotídica terapéutica como parte del genoma retroviral, particularmente con respecto a los vectores MuLV simples. Véase, por ejemplo, Miller et al. (1990) Mol Cell Biol 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J NIH Res 4:43 y Cornetta et al. (1991 ) Hum Gene Ther 2:215). Se ha utilizado el transporte de ácidos nucleicos acoplados a sistemas de transporte basados en cationes, específicos del ligando (Wu y Wu (1988) J Biol Chem, 263:14621-14624). También se han descrito vectores de expresión de ADN descubiertos (Nabel et al. (1990), supra); Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468). En general, estos procedimientos pueden adaptarse a la invención, incorporando los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención en los vectores apropiados. Los textos generales que describen los protocolos de la terapia génica, que pueden adaptarse a la presente invención introduciendo los ácidos nucleicos de la invención en pacientes, incluyen, por ejemplo, Robbins (1996) Gene Therapy Protocols, Humana Press, NJ y Joyner (1993) Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Inglaterra.

Tecnología antisentido Además de la expresión de los ácidos nucleicos de la invención como ácidos nucleicos de reemplazo génico, los ácidos nucleicos también son útiles para la supresión sentido o antisentido de la expresión, por ejemplo, para desregular la expresión de un ácido nucleico de la invención, una vez que, o cuando la expresión del ácido nucleico ya no es deseada más en la célula. De manera similar, los ácidos nucleicos de la invención, o las subsecuencias o secuencias antisentido de los mismos, pueden utilizarse para bloquear la expresión de ácidos nucleicos homólogos naturales. Una variedad de tecnologías sentido y antisentido se conocen en la técnica, por ejemplo, como se expone en Lichtenstein y Nellen (1997) Antisense Technology: A Practical Approach IRL Press en Oxford University, Oxford, Inglaterra y en Agrawal (1996) Antisense Therapeutics Humana Press, NJ, y las referencias citadas en las mismas.

Uso como sondas También están contemplados los usos de los polinucleótidos, también referidos en la presente como oligonucleótidos, típicamente que tienen al menos 12 bases, de manera preferida, al menos 15, de manera más preferida al menos 20, al menos 30, o al menos 50 o más bases, que se hibridan bajo condiciones altamente rigurosas a un polinucleótido de la invención o fragmentos de los mismos. Los polinucleótidos pueden utilizarse como sondas, cebadores, agentes sentido y antisentido, y lo similar, de acuerdo con los métodos como se indicaron supra.

Hibridación del ácido nucleico Los ácidos nucleicos se "hibridan" cuando se asocian, típicamente en solución. Los ácidos nucleicos se hibridan debido a una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, tales como enlaces de hidrógeno, exclusión de solvente, apilado de las bases y lo similar. Una guía extensa para la hibridación de los ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays," (Elsevier, New York) (de aquí en adelante "Tjissen"), así como en Ausubel, supra, Hames y Higgins (1995) Gene Probes 1, IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 1 ) y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2, IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 2), que proporcionan detalles de la síntesis, marcado, detección y cuantificación de ADN y ARN, incluyendo los oligonucleótidos. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, es que las dos moléculas se hibridan una con la otra bajo condiciones rigurosas. La frase "se híbrida específicamente a", se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula sólo a una secuencia nucleotídica particular bajo condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja de ADN o ARN (por ejemplo, celular total). "Se une sustancialmente", se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico de sonda y un ácido nucleico objetivo, y abarca malas coincidencias menores que pueden acomodarse reduciendo la rigurosidad del medio de hibridación para alcanzar la sección deseada de la secuencia polinucleotídica objetivo. Las "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas", en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como las hibridaciones Southern y northern, son dependientes de la secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993), supra y en Hames y Higgins 1 y Hames y Higgins 2, supra. Para los propósitos déla presente invención, generalmente, las condiciones de hibridación y de lavado "altamente rigurosas", se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C o menos más bajas que el punto de fusión térmico (Tm), para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos (como se indica a continuación, las condiciones altamente rigurosas también pueden referirse en términos comparativos). El Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos), en la cual 50% de la secuencia de prueba se híbrida a una sonda perfectamente coincidente. En otras palabras, el Tm indica la temperatura a la cual el ácido nucleico duplicado está desnaturalizado al 50% bajo las condiciones dadas y representa una medida directa de la estabilidad del híbrido del ácido nucleico. Así, el Tm corresponde a la temperatura que corresponde al punto medio en la transición de hélice a espira aleatoria; depende de la longitud, la composición del nucleótido y la fuerza iónica para largos tramos de nucleótidos. Típicamente, bajo "condiciones rigurosas", una sonda se hibridará a su subsecuencia objetivo, pero no a otras secuencias. Las "condiciones muy rigurosas", se seleccionan para que sean ¡guales al Tm para una sonda particular. Después de la hibridación, el material del ácido nucleico no hibrídado puede retirarse medíante una serie de lavados, la rigurosidad de los cuales puede ajustarse dependiendo de los resultados deseados. Las condiciones de lavado poco rigurosas (por ejemplo, utilizando más sal y una temperatura inferior), incrementan la sensibilidad, pero pueden producir señales de hibridación no específicas y señales de fondo altas. Las condiciones más rigurosas (por ejemplo, utilizando menos sal y una temperatura más alta que está más cercana a la temperatura de hibridación), disminuyen la señal de fondo, típicamente sólo permanece la señal específica. Véase, Rapley, R. y Waiker, J.M. eds., Molecular Biomethods Handbook (Humana Press, Inc. 1998) (de aquí en adelante "Rapley y Waiker"), la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad para todos los propósitos. El Tm del duplo de ADN-ADN, puede estimarse utilizando la ecuación (1 ): Tm (°C) = 81.5°C + 16.6 (log-???) + 0.41 (%G + C) - 0.72 (%f) - 500/n, en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes (usualmente Na+), (%G + C) es el porcentaje de nucleótidos de guanosina (G) y cistosina (C), (%f) es el porcentaje de formamida y n es el número de bases nucleotídicas (es decir, longitud) del híbrido. Véase, Rapley y Waiker, supra. El Tm de un duplo de ARN-ADN puede estimarse utilizando la ecuación (2): Tm (°C) = 79.8°C + 18.5 (logi0M) + 0.58 (%G + C) - 11 ,8(%G + C)2 - 0.56 (%f) - 820/n, en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes (usualmente Na+), (%G + C) es el porcentaje de nucleótidos de guanosina (G) y cistosina (C), (%f) es el porcentaje de formamida y n es el número de bases nucleotídicas (es decir, longitud) del híbrido. Id Las ecuaciones 1 y 2 anteriores son exactas típicamente sólo para duplos híbridos mayores que aproximadamente 100-200 nucleótidos. Id. El Tm de secuencias de ácidos nucleicos menores que 50 nucleótidos, puede calcularse como sigue: Tm (°C) = 4(G + C) + 2(A + T), en donde A (adenina), C, T (timina) y G, son los números de los nucleótidos correspondientes. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para hibridar los ácidos nucleicos complementarios que tienen más que 100 residuos complementarios en un filtro, en una transferencia Southern o northern, es 50% de formalina (o formamida) con 1 mg de heparina a 42°C, con la hibridación que se lleva a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado de 0.2x SSC a 65°C durante 15 minutos (véase Sambrook, supra, para una descripción del amortiguador de SSC). Con frecuencia, el lavado muy riguroso es precedido por un lavado poco riguroso para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de un lavado poco riguroso es 2x SSC a 40°C durante 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCI 0.15M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de un lavado de rigor medio para un duplo de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1x SSC a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de un lavado poco riguroso para un duplo de, por ejemplo, más que 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40°C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones rigurosas involucran típicamente concentraciones de sal menores que aproximadamente 1.0 M de ión de Na+, típicamente aproximadamente de 0.01 a 1.0 M de concentración del ión Na+ (u otras sales), a pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es típicamente al menos de aproximadamente 30°C. Las condiciones rigurosas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2x o 2.5x-5x (o más alta) que aquélla observada para la sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular, indica la detección de una hibridación específica. La detección de una hibridación menos rigurosa entre dos secuencias en el contexto de la presente invención indica una similitud u homología estructural relativamente fuerte, por ejemplo, a los ácidos nucleicos de la presente invención, proporcionados en los listados de secuencias de la presente. Como se indicó, las condiciones "altamente rigurosas", se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C o menos, más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Las secuencias objetivo que están estrechamente relacionadas o que son idénticas a la secuencia nucleotídica de interés (por ejemplo, "sonda"), pueden identificarse bajo condiciones altamente rigurosas. Las condiciones poco rigurosas, son apropiadas para secuencias que son menos complementarias. Véase, por ejemplo, Rapley y Walker; Sambrook, todos supra. La hibridación comparativa puede utilizarse para identificar los ácidos nucleicos de la invención, y este método de hibridación comparativa es un método preferido para distinguir los ácidos nucleicos de la invención. La detección de la hibridación altamente rigurosa entre dos secuencias nucleotidicas en el contexto de la presente invención, indica una similitud/homología muy fuerte a, por ejemplo, los ácidos nucleicos proporcionados en el listado de secuencias de la presente. La hibridación altamente rigurosa entre dos secuencias nucleotidicas demuestra un grado de similitud u homología de la estructura, composición de las bases nucleotidicas, arreglo u orden que es mayor que el detectado por las condiciones de hibridación rigurosas. En particular, la detección de la hibridación altamente rigurosa en el contexto de la presente invención, indica una fuerte similitud estructural u homología estructural (por ejemplo, estructura nucleotídica, composiciones de las bases, arreglo u orden) con, por ejemplo, los ácidos nucleicos proporcionados en los listados de secuencias de la presente. Por ejemplo, es deseable identificar los ácidos nucleicos de prueba que se hibridan a los ácidos nucleicos ejemplares de la presente bajo condiciones rigurosas. Así, una medida de la hibridación rigurosa es la capacidad de hibridarse a uno de los ácidos nucleicos listados de la invención (por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos SEQ ID NOS:16-30 y las secuencias polinucleotídicas complementarios de los mismos), bajo condiciones altamente rigurosas (o condiciones muy rigurosas, o condiciones de hibridación con rigor ultra alto, o condiciones de hibridación con rigor ultra ultra alto). Las condiciones de hibridación y de lavado rigurosas (incluyendo, por ejemplo, condiciones de hibridación de rigor alto, rigor ultra alto, o rigor ultra ultra alto), pueden determinarse fácilmente de manera empírica para cualquier ácido nucleico de prueba. Por ejemplo, en la determinación de las condiciones de hibridación y de lavado altamente rigurosas, las condiciones de hibridación y lavado se incrementan gradualmente (por ejemplo, incrementando la temperatura, disminuyendo la concentración de la sal, incrementando la concentración del detergente y/o incrementando la concentración de los solventes orgánicos, tales como la formalina en la hibridación o lavado), hasta que se cumple un conjunto de criterios seleccionados. Por ejemplo, las condiciones de hibridación y lavado se incrementan gradualmente hasta que una sonda que comprende una o más secuencias de ácidos nucleicos seleccionada de las SEQ ID NOS: 16-30 y las secuencias polinucleotídicas complementarias de las mismas, se unen a un objetivo complementario perfectamente coincidente (nuevamente, un ácido nucleico que comprende una o más secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas de las SEQ ID NOS:16-30, y las secuencias polinucleotídicas complementarias de las mismas), con una relación de señal a ruido que es al menos 2.5x y opcionalmente 5x o más, tan alta como aquélla observada para la hibridación de la sonda a un objetivo que no coincide. En este caso, el objetivo que no coincide es un ácido nucleico que corresponde a, por ejemplo, una secuencia conocida de ácidos nucleicos del interferón alfa (por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos del interferón alfa presente en una base de datos pública tal como GenBank o GENESEQ al momento de presentar la solicitud objeto). Se dice que un ácido nucleico de prueba se híbrida específicamente a un ácido nucleico de la sonda cuando se híbrida al menos ½ también a la sonda como al objetivo complementario perfectamente coincidente, es decir, con una relación de señal a ruido al menos ½ tan alta como la hibridación de la sonda al objetivo bajo condiciones en las cuales la sonda perfectamente coincidente se une al objetivo complementario perfectamente coincidente con una relación de señal a ruido que es al menos aproximadamente 2.5x-10x, típicamente 5x-10x tan alta como aquélla observada para la hibridación a cualquiera de los ácidos nucleicos objetivo no coincidentes, tales como, por ejemplo, una secuencia conocida de ácidos nucleicos de interferón alfa, como se expuso anteriormente. Para algunos de tales ácidos nucleicos, las condiciones rigurosas se seleccionan de manera que un oligonucleótido perfectamente complementario al oligonucleótido codificante, se híbrida al oligonucleótido codificante con al menos aproximadamente una relación de señal a ruido 5x más alta que para la hibridación del oligonucleótido perfectamente complementario a un ácido nucleico de control, que corresponde a una secuencia conocida del interferón alfa, como se expuso anteriormente.

Las condiciones de hibridación y lavado con rigor ultra alto, son aquéllas en las cuales el rigor de las condiciones de la hibridación y lavado se incrementa hasta que la relación de señal a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico objetivo complementario perfectamente coincidente, es al menos 10x tan alta como aquélla observada para la hibridación a cualquiera de los ácidos nucleicos objetivo no coincidentes, tales como, por ejemplo, una secuencia conocida de ácidos nucleicos del ¡nterferón alfa, como se expuso anteriormente. Se dice que un ácido nucleico objetivo que se híbrida a una sonda bajo tales condiciones, con una relación de señal a ruido de al menos ½ aquélla del ácido nucleico objetivo complementario perfectamente coincidente, se une a la sonda bajo condiciones de rigor ultra alto. De manera similar, pueden determinarse niveles incluso más altos de rigor incrementando gradualmente las condiciones de la hibridación y/o el lavado del ensayo de hibridación relevante. Por ejemplo, aquéllos en los cuales el rigor de las condiciones de hibridación y lavado se incrementan hasta que la relación de señal a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico objetivo complementario perfectamente coincidente es al menos 10x, 20X, 50X, 100X o 500X o más, tan alto como aquél observado para la hibridación a cualquiera de los ácidos nucleicos objetivo no coincidentes, tales como, por ejemplo, una secuencia conocida de ácidos nucleicos del ¡nterferón alfa, como se expuso anteriormente. Se dice que un ácido nucleico objetivo que se híbrida a una sonda bajo tales condiciones, con una relación de señal a ruido de al menos ½ aquélla del ácido nucleico objetivo complementario perfectamente coincidente, se une a la sonda bajo condiciones de rigor ultra ultra alto. Los ácidos nucleicos objetivo que se hibridan a los ácidos nucleicos representados por las SEQ ID NOS: 16-30 bajo condiciones de rigor alto, ultra alto y ultra ultra alto son una característica de la invención. Los ejemplos de tales ácidos nucleicos incluyen aquéllos con una o pocas sustituciones conservadoras o silenciosas de los ácidos nucleicos en comparación con una secuencia de ácidos nucleicos dada.

Sustratos y formatos para la recombinación de la secuencia Los polinucleótidos de la invención y los fragmentos de los mismos se utilizan opcionalmente como sustratos para cualquiera de una variedad de reacciones de recombinación y de recombinación recursiva de la secuencia, además de su uso en métodos de clonación estándar, como se expone en, por ejemplo, Ausubel, Berger y Sambrook, por ejemplo, para producir polipéptidos adicionales que codifican los polipéptidos que tienen las propiedades deseadas. Se conoce una variedad de tales reacciones, incluyendo aquéllas desarrolladas por los inventores y sus colaboradores. Está disponible una variedad de diversos protocolos de generación, para generar e identificar moléculas que tienen una o más propiedades descritas en la presente y se describen en la técnica. Los procedimientos pueden utilizarse de manera separada y/o en combinación para producir una o más variantes de un ácido nucleico o conjunto de ácidos nucleicos, así como variantes de proteínas codificadas. De manera individual y colectiva, estos proporcionan maneras robustas, ampliamente aplicables para generar ácidos nucleicos y conjuntos de ácidos nucleicos diversificados (incluyendo, por ejemplo, bibliotecas de ácidos nucleicos) útiles, por ejemplo, para la manipulación tecnológica o evolución rápida de ácidos nucleicos, proteínas, trayectorias, células y/u organismos con características nuevas y/o mejoradas. Aunque se hacen distinciones y clasificaciones en el curso de la discusión siguiente por claridad, se apreciará que las técnicas no son con frecuencia mutuamente exclusivas. En realidad, los varios métodos pueden utilizarse solos o en combinación, en paralelo o en serie, para acceder a diversas variantes de la secuencia. El resultado de cualquiera de los procedimientos para generar la diversidad, descritos en la presente, puede ser la generación de uno o más ácidos nucleicos, los cuales pueden seleccionarse o clasificarse para los ácidos nucleicos con, o que confieren las propiedades deseables, o que codifican las proteínas con, o que confieren las propiedades deseables. Después de la diversificación por uno o más de los métodos de la presente, o de otra manera disponibles para alguien con experiencia, cualquiera de los ácidos nucleicos que se producen pueden seleccionarse para una actividad o propiedad deseada, por ejemplo, una afinidad por la unión alterada para un receptor del interferón alfa, una actividad antiviral o actividad antiproliferativa alterada, capacidades alteradas para inducir la diferenciación a TH1 , capacidades alteradas para inducir la producción de citocina. Esto puede incluir la identificación de cualquier actividad que pueda detectarse, por ejemplo, en un formato automatizado o automatizable, por cualquiera de los ensayos en la técnica y los ensayos de la invención discutidos en la presente y en la sección de Ejemplos siguiente. Puede evaluarse una variedad de propiedades relacionadas (o incluso no relacionadas), en serie o en paralelo, a discreción del practicante. Las descripciones de una variedad de procedimientos para generar la diversidad, para generar las secuencias modificadas de ácidos nucleicos, que codifican los polipéptidos como se describe en la presente, se encuentran en las siguientes publicaciones y las referencias citadas en las mismas: Soong, N. et al. (2000) "Molecular breeding of viruses" Nat Genet 25(4):436-439; Stemmer, et al. (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1-4; Ness et al. (1999) "DNA Shuffling of subgenomic sequences of subtilisin" Nature Biotechnology 17:893-896; Chang et al. (1999) "Evolution of a cytokina using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull y Stemmer (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinión in Chemical Biology 3:284-290; Christians et al. (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri et al. (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391 :288-291 ; Crameri et al. (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling," Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang et al. (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinión ¡n Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage librarles by DNA shuffling" Nature Medicine 2:100-103; Crameri et al. (1996) "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling" Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide librarles through display on a lac repressor 'headpiece dimer"' Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York, pp.447-457; Crameri y Stemmer (1995) "Combinatorial múltiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al., (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxy-ribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391 ; y Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91 :10747-10751.

El término "redistribución", se utiliza en la presente para indicar la recombinación entre secuencias no idénticas, en algunos casos, la redistribución puede incluir el cruce vía la recombinación homologa o vía la recombinación no homologa, tal como vía los sistemas cre/lox y/o flp/frt. La redistribución puede llevarse a cabo empleando una variedad de formatos diferentes, incluyendo por ejemplo, formatos de redistribución ¡n vitro e in vivo, formatos de redistribución en silico, formatos de redistribución que utilizan patrones de doble hebra o de una sola hebra, formatos de redistribución basados en un cebador, formatos de redistribución basados en la fragmentación del ácido nucleico y formatos de redistribución mediados por los oligonucleótidos, todos de los cuales se basan en eventos de recombinación entre secuencias no idénticas, y se describen con más detalle o se refieren en la presente a continuación, así como otros formatos similares basados en la recombinación. Los métodos mutacionales para generar diversidad, incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagénesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagénesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) "In vitro mutagénesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagénesis" Science 229:1193-1201 ; Cárter (1986) "Site-directed mutagénesis" Biochem. J. 237:1-7; y Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagénesis" en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis utilizando patrones que contiene uracilo (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagénesis without phenotypic selection" Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagénesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382; y Bass et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245); mutagénesis dirigida al oligonucleótido (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) Oligonucleotide-directed mutagénesis using M13-derived vectores: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) Oligonucleotide-directed mutagénesis of DNA fragment cloned into M13 vectores" Methods in Enzymol. 100:468-500; y Zoller & Smith (1987) Oligonucleotide-directed mutagénesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA témplate" Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagénesis del ADN modificada con fosforotioato (Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucí. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucí. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein (1986) "Inhibition of endonuclease de restriction Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagénesis" Nucí. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucí. Acids Res. 16:791-802; y Sayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucí. Acids Res. 16: 803-814); mutagénesis utilizando un ADN doble con huecos (Kramer et al. (1984) "The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucí. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA" 154:350-367; Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucí. Acids Res. 16: 7207; y Fritz et al. (1988) Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucí. Acids Res. 16: 6987-6999). Los métodos adecuados adicionales incluyen la reparación del punto de mala coincidencia (Kramer et al. (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887), mutagénesis utilizando cepas del hospedero deficientes a la reparación (Cárter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectores" Nucí. Acids Res. 13: 4431-4443; y Cárter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectores" Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagénesis de supresión (Eghtedarzadeh & Henikoff (1986) "Use of oligonucleotides to genérate large deletions" Nucí. Acids Res. 14: 5115), selección por restricción y purificación por restricción (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagénesis mediante síntesis genética total (Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301 ; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" Nucí. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagénesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites" Gene 34:315-323; y Grundstróm et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagénesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis" Nucí. Acids Res. 13: 3305-3316), reparación del rompimiento de la doble hebra (Mandecki (1986) Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia colr. a method for site-specific mutagénesis" Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 83:7177-7181 ; y Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinión in Biotechnology 4:450-455). Los detalles adicionales para muchos de los métodos anteriores pueden encontrarse en Methods in Enzymology, Volumen 154, el cual también describe controles útiles para la solución de los problemas con varios métodos de mutagénesis. Los detalles adicionales con respecto a varios métodos para generar la diversidad, pueden encontrarse en las siguientes patentes de E.U.A., publicaciones y solicitudes del PCT y publicaciones EPO: Patente de 2 5 E.U.A. No. 5,605,793 de Stemmer (Febrero 25, 1997), "Methods for In Vitro Recombination"; Patente de E.U.A. No. 5,811 ,238 de Stemmer et al. (Septiembre 22, 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; Patente de E.U.A. No. 5,830,721 de Stemmer et al. (Noviembre 3, 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; Patente de E.U.A. No. 5,834,252 de Stemmer, et al. (Noviembre 10, 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction"; Patente de E.U.A. No. 5,837,458 de Minshull, et al. (Noviembre 17, 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; WO 96/33207 por Stemmer y Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; WO 97/20078 por Stemmer y Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; WO 97/35966 por Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; WO 99/41402 por Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"; WO 99/41383 por Punnonen et al. "Antigen Library Immunization"; WO 99/41369 por Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering"; WO 99/41368 por Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; EP 752008 por Stemmer y Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; EP 0932670 por Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"; WO 99/23107 por Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"; WO 99/21979 por Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors"; WO 98/31837 por del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; WO 98/27230 por Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"; WO 98/27230 por Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection," WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries," WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences," WO 98/42832 por Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers," WO 99/29902 por Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences," WO 98/41653 por Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library," WO 98/41622 por Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling," y WO 98/42727 por Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination"; WO 00/18906 por Patten et al., "Shuffling of Codon-Altered Genes"; WO 00/04190 por del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Recombination"; WO 00/42561 por Crameri et al., "Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination"; WO 00/42559 por Selifonov y Stemmer "Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations"; WO 00/42560 por Selifonov et al., "Methods for Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics"; PCT/US00/26708 por Welch et al., "Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling"; y PCT/US01/06775 "Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation", por Affholter. Varias clases generales diferentes de métodos de modifiación de la secuencia, tales como mutación, recombinación, etc., son aplicables a la presente invención y se exponen, por ejemplo, en las referencias antenores y siguientes. Lo siguiente ejemplifica uno de los diferentes tipos de formatos preferidos para la generación de la diversidad, en el contexto de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, ciertos formatos de generación de la diversidad, basados en la recombinación. Los ácidos nucleicos pueden recombinarse in vitro por cualquiera de una variedad de técnicas discutidas en las referencias anteriores, incluyendo, por ejemplo, digestión con ADNasa de ácidos nucleicos a ser recombinados después del ligado y/o el rearmado mediante PCR de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, puede utilizarse la mutagénesis sexual por PCR en la cual la fragmentación aleatoria (o pseudoaleatoria, o incluso no aleatoria) de la molécula de ADN es seguida por la recombinación, basada en la similitud de la secuencia, entre las moléculas de ADN con diferentes secuencias de ADN, pero relacionadas in vitro, seguido por la fijación del cruce por la extensión en la reacción en cadena de la polimerasa. Este procedimiento y muchas variantes del procedimiento se describen en varias de las referencias anteriores, por ejemplo, en Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91 :10747-10751.

De manera similar, los ácidos nucleicos pueden recombinarse recursivamente in vivo, por ejemplo, permitiendo que ocurra la recombinación entre los ácidos nucleicos en las células. Muchos de tales formatos de recombinación ¡n vivo se exponen en las referencias indicadas anteriormente. Tales formatos proporcionan opcionalmente la recombinación directa entre los ácidos nucleicos de interés, o proporciona una recombinación entre vectores, virus, plásmidos, etc., que comprenden los ácidos nucleicos de interés, así como otros formatos. Los detalles con respecto a tales procedimientos se encuentran en las referencias indicadas anteriormente. Aunque también pueden utilizarse métodos de recombinación del genoma, en los cuales los genomas completos de las células u otros organismo se recombinan, incluyendo opcionalmente la alteración de las mezclas de recombinación genómica por los componentes deseados de la biblioteca (por ejemplo, genes que corresponden a las trayectorias de la presente invención). Estos métodos tienen muchas aplicaciones, incluyendo aquéllas en las cuales la identidad de un gen objetivo no se conoce. Los detalles de tales métodos se encuentran, por ejemplo, en WO 98/31837, por del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; y en, por ejemplo, PCT/US99/15972 por del Cardayre et al., también titulada "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination." También pueden utilizarse métodos de recombinación sintética, en los cuales los oligonucleótidos que corresponden a los objetivos de interés se sintetizan y se rearman en reacciones de PCR o de ligado, que incluyen los oligonucleótidos que corresponden a más de un ácido nucleico original, generando por lo tanto nuevos ácidos nucleicos recombinados. Los oligonucleótidos pueden hacerse mediante métodos estándar de adición de nucleótidos, o pueden hacerse, por ejemplo, mediante procedimientos sintéticos de trinucleótidos. Los detalles con respecto a tales procedimientos se encuentran en las referencias indicadas anteriormente, incluyendo, por ejemplo, WO 00/42561 por Crameri et al., "Olgonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination"; PCT/US00/26708 por Welch et al., "Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling"; WO 00/42560 por Selifonov et al., "Methods for Making Character Strings, Polynucleotides and Polypeptides Having Desired Characteristics"; y WO 00/42559 por Selifonov y Stemmer "Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations". Pueden efectuarse métodos de recombinación in silico, en los cuales los algoritmos genéticos se utilizan en una computadora para determinar cadenas de secuencias que corresponden a ácidos nucleicos homólogos (o incluso no homólogos). Las cadenas de secuencias recombinadas resultantes, se convierten opcionalmente en ácidos nucleicos mediante la síntesis de los ácidos nucleicos que corresponden a las secuencias recombinadas, por ejemplo, en conjunto con técnicas de síntesis de oligonucleótidos/remontaje de genes. Este procedimiento puede generar variantes aleatorias, parcialmente aleatorias o diseñadas. Muchos detalles con respecto a la recombinación in silico, incluyendo el uso de algoritmos genéticos, operadores genéticos y lo similar en sistemas para computadora, combinados con la generación de los ácidos nucleicos correspondientes (y/o proteínas), así como las combinaciones de los ácidos nucleicos y/o proteínas diseñados (por ejemplo, basándose en las selección del sitio del cruce), así como métodos de recombinación diseñados, pseudoaleatorios o aleatorios, se describen en WO 00/42560 por Selifonov et al., "Methods for Making Character Strings, Polynucleotides and Polypeptides Having Desired Characteristics" y WO 00/42559 por Selifonov y Stemmer "Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations". Los detalles extensos con respecto a los métodos de recombinación ¡n silico se encuentran en estas solicitudes. Esta metodología es generalmente aplicable a la presente invención para proporcionar la recombinación de las moléculas in silico y/o la generación de los ácidos nucleicos o proteínas correspondientes. Muchos métodos para tener acceso a la diversidad natural, por ejemplo, mediante la hibridación de diversos ácidos nucleicos o fragmentos de ácidos a patrones de una sola hebra, seguidos por la polimerización y/o ligado para regenerar secuencias de longitud completa, seguido opcionalmente por la degradación de los patrones y la recuperación de los ácidos nucleicos modificados resultantes, pueden utilizarse de manera similar. En un método que emplea un patrón de una sola hebra, la población del fragmento derivada de las bibliotecas genómicas se recoce con ADNss o ARN parcial, o frecuentemente, de aproximadamente la longitud completa, que corresponde a la hebra opuesta. El montaje de los genes quiméricos complejos de esta población está mediado a continuación por la eliminación de la base de la nucleasa de los extremos no hibridados del fragmento, la polimerización para llenar los huecos entre tales fragmentos y el ligado subsiguiente de una sola hebra. La hebra polinucleotídica original puede eliminarse mediante digestión (por ejemplo, si contiene ARN o uracilo), separación magnética bajo condiciones desnaturalizantes (si está marcada de una manera que conduzca a tal separación), y otros métodos de separación/purificación disponibles. De manera alterna, la hebra original se copurifica opcionalmente con las hebras quiméricas que se eliminan durante los pasos de selección y procesamiento siguientes. Los detalles adicionales con respecto a este procedimiento se encuentran, por ejemplo, en "Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation", por Affholter, PCT/US01/06775. En otro procedimiento, las moléculas de una sola hebra se convierten a ADN de doble hebra (ADNds), y las moléculas de ADNds se unen a un soporte sólido mediante una unión mediada por el ligando. Después de la separación del ADN no unido, las moléculas seleccionadas de ADN se liberan del soporte y se introducen en una célula hospedera adecuada para generar una biblioteca de secuencias enriquecidas que se hibridan a la sonda. Una biblioteca producida de esta manera, proporciona un sustrato deseable para la diversificación adicional utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en la presente.

Cualquiera de los formatos generales de recombinación precedentes, pueden practicarse de una manera reiterativa (por ejemplo, uno o más ciclos de mutación/recombinación u otros métodos de generación de la diversidad, seguido opcionalmente por uno o más métodos de selección), para generar un conjunto más diverso de ácidos nucleicos recombinantes. También se ha propuesto la mutagénesis que emplea los métodos de terminación de la cadena polinucleotídica (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,965,408, "Method of DNA reassembly by interrupting synthesis" de Short y las referencias anteriores), y puede aplicarse a la presente invención. En este procedimiento, los ADN de doble hebra que corresponden a uno o más genes que comparten regiones de similitud de la secuencia, se combinan y desnaturalizan en la presencia o ausencia de cebadores específicos para el gen. Los polinucleótidos de una sola hebra se recocen a continuación y se incuban en la presencia de una polimerasa y un reactivo para terminar la cadena (por ejemplo, radiación ultravioleta, gamma o de rayos X; bromuro de etidio u otros intercaladores; proteínas de unión al ADN, tales como proteínas de unión de una sola hebra, factores que activan la transcripción o histonas; hidrocarburos aromáticos policíclicos; cromo trivalente o una sal de cromo trivalente; o polimerización abreviada mediada por termociclado rápido y lo similar), resultando en la producción de moléculas dobles parciales. Las moléculas dobles parciales, por ejemplo, que contienen cadenas parcialmente extendidas, se desnaturalizan y recocen a continuación en rondas subsiguientes de replicación o replicación parcial, resultando en polinucleótidos que comparten varios grados de similitud de la secuencia y los cuales están diversificados con respecto a la población inicial de las moléculas de ADN. Opcionalmente, los productos, o los conjuntos parciales de los productos, pueden amplificarse en una o más etapas en el procedimiento. Los polinucleótidos producidos mediante un método de terminación de la cadena, tal como el descrito anteriormente, son sustratos adecuados para cualquier otro formato de recombinación descrito. La diversidad también puede generarse en los ácidos nucleicos o poblaciones de ácidos nucleicos utilizando un procedimiento recombinacional denominado "truncado incrementado para la creación de enzimas híbridas" ("ITCHY"), descrito en Ostermeier et al. (1999) "A combinatorial approach to hybrid enzymes ¡ndependent of DNA homology" Nature Biotech 17:1205. Este procedimiento puede utilizarse para generar una biblioteca inicial de variantes, que sirve opcionalmente como un sustrato para uno o más métodos de recombinación in vitro o in vivo. Véase, también, Ostermeier et al. (1999) "Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation," Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 96: 3562-67; Ostermeier et al. (1999), "Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts," Biological and Medicinal Chemistry, 7: 2139-44. Los métodos mutacionales que resultan en la alteración de nucleótidos individuales o grupos de nucleótidos contiguos o no contiguos, pueden emplearse de manera favorable para introducir diversidad en el nucleótido. Muchos métodos de mutagénesis se encuentran en las referencias citadas anteriormente; los detalles adicionales con respecto a los métodos de mutagénesis pueden encontrarse en lo siguiente, lo cual también puede aplicarse a la presente invención. Por ejemplo, puede utilizarse PCR propensa al error, para generar variantes de ácidos nucleicos. Utilizando esta técnica, la PCR se realiza bajo condiciones en donde la fidelidad del copiado de la ADN polimerasa es baja, de manera que se obtiene una alta proporción de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de la PCR. Los ejemplos de tales técnicas se encuentran en las referencias anteriores y, por ejemplo, en Leung et al. (1989) Technique 1 :11-15 y Caldwell et al. (1992) PCR Methods Applic. 2:28-33. De manera similar, puede utilizarse PCR de montaje, en un procedimiento que involucra el montaje de un producto de la PCR a partir de una mezcla de pequeños fragmentos de ADN. Un gran número de diferentes reacciones por PCR puede ocurrir en paralelo en la misma mezcla de reacción, con los productos de una reacción que ceban los productos de otra reacción. La mutagénesis dirigida al oligonucleótido puede utilizarse para introducir mutaciones específicas al sitio en una secuencia de ácidos nucleicos de interés. Los ejemplos de tales técnicas se encuentran en las referencias anteriores y, por ejemplo, en Reidhaar-Olson et al. (1988) Science, 241 :53-57. De manera similar, puede utilizarse la mutagénesis de cásete en un procedimiento que reemplaza una pequeña región de una molécula de ADN de doble hebra con un cásete de un oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido puede contener, por ejemplo, secuencias nativas aleatorizadas completa y/o parcialmente. La mutagénesis recursiva colectiva, es un procedimiento en el cual un algoritmo para la mutagénesis de la proteína se utiliza para introducir diversas poblaciones de mutantes relacionadas linotípicamente, los miembros de los cuales difieren en la secuencia de los aminoácidos. Este método utiliza un mecanismo de retroalimentación para verificar las rondas sucesivas de la mutagénesis combinatoria en cásete. Los ejemplos de este procedimiento se encuentran en Arkin & Youvan (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:781 1 -7815. La mutagénesis exponencial colectiva puede utilizarse para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales. Pequeños grupos de residuos en una secuencia de interés se aleatorizan en paralelo para identificar, en cada posición alterada, los aminoácidos que conducen a las proteínas funcionales. Los ejemplos de tales procedimientos están en Delegrave & Youvan (1993) Biotechnology Research 11 :1548-1552. La mutagénesis in vivo puede utilizarse para generar mutaciones aleatorias en cualquier ADN clonado de interés propagando el ADN, por ejemplo, en una cepa de E. coli que porta mutaciones en una o más de las trayectorias de reparación del ADN. Estas cepas "mutantes" tienen una proporción de mutación aleatoria más alta que aquélla de la original del tipo silvestre. La propagación del ADN en una de estas cepas generará finalmente mutaciones aleatorias dentro del ADN. Tales procedimientos se describen en las referencias indicadas anteriormente. Pueden utilizarse otros procedimientos para introducir diversidad en el genoma, por ejemplo, un genoma bacteriano, de hongos, de animales o plantas, en conjunto con los métodos descritos y/o referidos anteriormente. Por ejemplo, además de los métodos anteriores, se han propuesto técnicas que producen multímeros de ácidos nucleicos adecuados para la transformación en una variedad de especies (véase, por ejemplo, Schellenberger, Patente de E.U.A. No. 5,756,316, y las referencias anteriores). La transformación de un hospedero adecuado con tales multímeros, que consisten de genes que son divergentes unos con respecto a los otros (por ejemplo, derivados de la diversidad natural o a través de la aplicación de mutagénesis dirigida al sitio, PCR propensa a error, paso a través de cepas bacterianas mutagénicas y lo similar), proporciona una fuente de diversidad de ácidos nucleicos para la diversificación del ADN, por ejemplo, mediante un procedimiento de recombinación in vivo como se indicó anteriormente. De manera alterna, puede transformarse una multitud de polinucleótidos monoméricos que comparten regiones de similitud parcial de la secuencia, en especies hospederas y recombinarse in vivo por la célula hospedera. Pueden utilizarse rondas subsiguientes de división celular para generar bibliotecas, los miembros de las cuales incluyen una sola población homogénea o un conjunto de polinucleótidos monoméricos. De manera alterna, el ácido nucleico monomérico puede recuperarse mediante técnicas estándar, por ejemplo, PCR y/o clonación, y recombinarse en cualquiera de los formatos de recombinación, incluyendo formatos de recombinación recursiva, descritos anteriormente. Se han descrito métodos para generar bibliotecas de expresión de múltiples especies (además de la referencia indicada anteriormente, véase, por ejemplo, Peterson et al. (1998) Patente de E.U.A. No. 5,783,431 " ETHODS FOR GENERATING AND SCREENING NOVEL METABOLIC PATHWAYS," y Thompson, et al. (1998) Patente de E.U.A. No. 5,824,485 METHODS FOR GENERATING AND SCREENING NOVEL METABOLIC PATHWAYS), y se ha propuesto su uso para identificar las actividades de interés de la proteína. (Además de las referencias indicadas anteriormente, véase Short (1999), Patente de E.U.A. No. 5,958,672. "PROTEIN ACTIVITY SCREENING OF CLONES HAVING DNA FROM UNCULTIVATED MICROORGANISMS"). Las bibliotecas de expresión de múltiples especies incluyen, en general, bibliotecas que comprenden secuencias de ADNc o genómicas de una pluralidad de especies o cepas, enlazadas de manera operativa a secuencias reguladoras apropiadas, en un cásete de expresión. Las secuencias de ADNc y/o genómicas se ligan aleatoriamente de manera opcional, para aumentar adicionalmente la diversidad. El vector puede ser un vector lanzadera adecuado para la transformación y expresión en más de una especie del organismo hospedero, por ejemplo, especies bacterianas, células eucarióticas. En algunos casos, la biblioteca es sesgada preseleccionando secuencias que codifican una proteína de interés, o que se hibridan a un ácido nucleico de interés. Cualquiera de tales bibliotecas puede proporcionarse como los sustratos para cualquiera de los métodos descritos en la presente. Los procedimientos descritos anteriormente, se han dirigido en gran medida para incrementar la diversidad del ácido nucleico y/o la proteína codificada. Sin embargo, en muchos casos, no toda la diversidad es útil, por ejemplo, funcional, y contribuye simplemente a incrementar la base de variantes que deben seleccionarse o clasificarse para identificar las pocas variantes favorables. En algunas aplicaciones, es deseable preseleccionar o preclasificar bibliotecas (por ejemplo, una biblioteca amplificada, una biblioteca genómica, una biblioteca de ADNc, una biblioteca normalizada, etc.), u otros ácidos nucleicos del sustrato antes de la diversificación, por ejemplo, mediante procedimientos de mutagénesis basados en la recombinación, o sesgar de otra manera los sustratos hacia los ácidos nucleicos que codifican los productos funcionales. Por ejemplo, en el caso de la manipulación tecnológica del anticuerpo, es posible sesgar el procedimiento que genera la diversidad hacia los anticuerpos con sitios funcionales de unión al antígeno, tomando ventaja de sus eventos de recombinación in vivo antes de la manipulación por cualquiera de los métodos descritos. Por ejemplo, los CDR recombinados derivados de las bibliotecas de ADNc de células B, pueden amplificarse y montarse en regiones de la estructura (por ejemplo, Jirholt et al. (1998) "Exploiting sequence space: shuffling in vivo formed complementarity determining regions into a master framework" Gene 215:471 ), antes de la diversificación de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. Las bibliotecas pueden sesgarse hacia los ácidos nucleicos que codifican las proteínas con las actividades enzimáticas deseables. Por ejemplo, después de identificar una clona de una biblioteca que exhibe una actividad específica, la clona debe mutagenizarse utilizando cualquier método conocido para introducir alteraciones en el ADN. A continuación, se selecciona una biblioteca que comprende los homólogos mutagenizados para la actividad deseada, la cual puede ser la misma o diferente de la actividad especificada inicialmente. Un ejemplo de tal procedimiento se propone en Short (1999), Patente de E.U.A. No. 5,939,250 para "PRODUCTION OF ENZYMES HAVING DESIRED ACTIVITIES BY MUTAGENESIS". Las actividades deseadas pueden identificarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, WO 99/10539, propone que las bibliotecas génicas pueden seleccionarse combinando los extractos de la biblioteca génica con componentes obtenidos a partir de células metabólicamente ricas e identificando las combinaciones que exhiban la actividad deseada. También se ha propuesto (por ejemplo, WO 98/58085), que las clonas con las actividades deseadas pueden identificarse insertando sustratos bioactivos en las muestras de la biblioteca, y detectando la fluorescencia bioactiva que corresponde al producto de una actividad deseada, como se describe en la presente, utilizando un analizador fluorescente, por ejemplo, un dispositivo de citometría de flujo, un CCD, un fluorómetro, o un espectrofotómetro. Las bibliotecas también pueden sesgarse hacia los ácidos nucleicos que tienen características específicas, por ejemplo, hibridación a una sonda seleccionada de ácido nucleico. Por ejemplo, la solicitud WO 99/10539, propone que los polinucleótidos que codifican una actividad deseada (por ejemplo, una actividad enzimática, por ejemplo: una lipasa, una esterasa, una proteasa, una glucosidasa, una glucosil transferasa, una fosfatasa, una cinasa, una oxigenasa, una peroxidasa, una hidrolasa, una hidratasa, una nitrilasa, una transaminasa, una amidasa o una acilasa), puedan identificarse de entre secuencias de ADN genómico de la siguiente manera. Las moléculas de ADN de una sola hebra de una población de ADN genómico se hibridan a una sonda conjugada con el ligando. El ADN genómico puede derivarse de un microorganismo cultivado o no cultivado, o de una muestra ambiental. De manera alterna, el ADN genómico puede derivarse de un organismo multicelular, o un tejido derivado del mismo. La síntesis de la segunda hebra puede realizarse directamente a partir de la sonda de hibridación utilizada en la captura, con o sin la liberación previa del medio de captura o mediante una amplia variedad de otras estrategias conocidas en la técnica. De manera alterna, la población aislada de ADN genómico de una sola hebra puede fragmentarse sin clonación adicional y utilizarse directamente en, por ejemplo, un procedimiento basado en la recombinación, que empleé un patrón con una sola hebra, como se describió anteriormente. Los métodos "No Estocásticos" para generar ácidos nucleicos y polipéptidos, son referidos en Short "Non-Stochastic Generation of Genetic Vaccines and Enzymes" WO 00/46344. Estos métodos, incluyendo el remontaje no estocástico del polinucleótido y los métodos de mutagénesis de saturación del sitio, se aplican también a la presente invención. La mutagénesis aleatoria o semialeatoria utilizando oligonucleótidos adulterados o degenerados, también se describe en, por ejemplo, Arkin y Youvan (1992) "Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagénesis" Biotechnology 10:297-300; Reidhaar-Olson et al. (1991 ) "Random mutagénesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes" Methods Enzymol. 208:564-86; Lim y Sauer (1991 ) "The role of infernal packing interactions in determining the structure and stability of a protein" J. Mol. Biol. 219:359-76; Breyer y Sauer (1989) "Mutational analysis of the fine specificity of binding of monoclonal antibody 51 F to lambda repressor" J. Biol. Chem. 264:13355-60); y "Walk-Through Mutagénesis" (Crea, R; Patentes de E.U.A. 5,830,650 y 5,798,208 y Patente EP 0527809 B1. Se apreciará fácilmente que cualquiera de las técnicas descritas anteriormente adecuadas para enriquecer una biblioteca antes de la diversificación, también puede utilizarse para seleccionar los productos o las bibliotecas de productos, producidas mediante los métodos para generar la diversidad.

También están comercialmente disponibles equipos para la mutagénesis, construcción de la biblioteca y otros métodos de generación de la diversidad. Por ejemplo, los equipos están disponibles de, por ejemplo, Stratagene (por ejemplo, el equipo de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange™; y el equipo de mutagénesis dirigida al sitio de doble hebra Chameleon™), Bio/Can Scientific, Bio-Rad (por ejemplo, utilizando el método de Kunkel descrito anteriormente), Boehringer Mannheim Corp., Clonetech Laboratories, DNA Technologies, Epicentre Technologies (por ejemplo, equipo 5 prima 3 prima); Genpak Inc, Lemargo Inc, Life Technologies (Gibco BRL), New England Biolabs, Pharmacia Biotech, Promega Corp., Quantum Biotechnologies, Amersham International pie (por ejemplo, utilizando el método de Eckstein anterior), y Anglian Biotechnology Ltd (por ejemplo, utilizando el método de Carter/W ínter anterior). Las referencias anteriores proporcionan muchos formatos mutacionales, incluyendo recombinación, recombinación recursiva, mutación recursiva y combinaciones o recombinaciones con otras formas de mutagénesis, así como muchas modificaciones de estos formatos. Sin importar el formato de generación de la diversidad que se utilice, los ácidos nucleicos de la invención pueden recombinarse (unos con otros, o con secuencias relacionadas (o incluso no relacionadas)), para producir un conjunto diverso de ácidos nucleicos recombinantes, incluyendo, por ejemplo, conjuntos de ácidos nucleicos homólogos, así como los polipéptidos correspondientes.

Un ácido nucleico recombinante producido recombinando una o más de las secuencias polinucleotídicas de la invención, con uno o más ácidos nucleicos adicionales, utilizando cualquiera de los formatos descritos anteriormente, solos o en combinación, también forma parte de la invención. Uno o más ácidos nucleicos adicionales pueden incluir otro polinucleótido de la invención; de manera opcional, alterna o adicional, uno o más ácidos nucleicos adicionales pueden incluir, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un interferón alfa natural o una subsecuencia del mismo, o cualquier interferón alfa homólogo o subsecuencia del mismo (por ejemplo, como se encuentra en GenBank u otra literatura disponible), o, por ejemplo, cualquier otro ácido nucleico homólogo o no homólogo o fragmentos del mismo (ciertos formatos de recombinación indicados anteriormente, especialmente aquéllos realizados sintéticamente o in silico, no requieren de homología para la recombinación).

Usos terapéuticos Varios polipéptidos del interferón alfa y conjugados del interferón alfa están aprobados y están en desarrollo clínico para el tratamiento de condiciones virales, tales como la Hepatitis C crónica y la Hepatitis B crónica. En consecuencia, la presente invención contempla el uso de composiciones que comprenden uno o más polipéptidos o conjugados de la invención (es decir, "composiciones de la invención"), para tratar tales condiciones.

Virus de la hepatitis C En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar un paciente infectado con el Virus de la Hepatitis C (HCV), que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición de la invención, que comprende uno o más polipéptidos o conjugados de la invención. La invención también proporciona una composición para utilizarse en el tratamiento de un paciente infectado con HCV, que comprende uno o más polipéptidos o conjugados de la invención, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Un paciente diagnosticado como infectado con HCV, incluye un paciente que exhibe un ARN HCV en la sangre y/o que exhibe un anticuerpo anti-HCV en el suero. Una composición que comprende un polipéptido de la invención, generalmente se administrará a una dosis y frecuencia similares a las que se emplean en los regímenes terapéuticos de HCV, utilizando polipéptidos del interferón alfa aprobados clínicamente, tales como, por ejemplo, ROFERON®-A (Interferón alfa-2a, recombinante; Hoffmann-La Roche Inc.), INTRON® A (Interferón alfa-2b, recombinante; Schering Corporation) y INFERGEN® (interferón alfacon-1 ; InterMune, Inc.). Los esquemas recomendados ejemplares para la dosificación del ROFERON o el INTRON A para el tratamiento del HCV crónica es de 3 millones de IU (aproximadamente 15 microgramos (mcg)), tres veces a la semana, mediante inyección subcutánea durante, por ejemplo, 24 a 48 semanas. Un esquema recomendado ejemplar para la dosificación del INFERGEN para el tratamiento de la HCV crónica es 9 mcg tres veces a la semana mediante inyección subcutánea durante, por ejemplo, 24 a 48 semanas. Dependiendo de varios factores (incluyendo, de manera no exclusiva, la actividad y la farmacocinética del polipéptido de la invención, y el tamaño y la salud del paciente), el polipéptido puede administrarse en cantidades menores (tales como, por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 mcg) y/o menos frecuentemente (tal como una vez a la semana o dos veces a la semana), que lo descrito anteriormente. De igual manera, una composición que comprende un conjugado de la invención, se administrará generalmente a una dosis y frecuencia similares a aquéllas empleadas en los regímenes terapéuticos de HCV, utilizando los conjugados del interferón alfa aprobados clínicamente, tales como, por ejemplo, PEGASYS® (Peginterferon alfa-2a¡ Hoffmann-La Roche, Inc.) o PEG-INTRON® (peginterferon alfa-2b; Schering Corporation). Un esquema recomendado ejemplar de dosificación del PEGASYS para el tratamiento de HCV crónica es 180 mcg una vez a la semana mediante inyección subcutánea durante, por ejemplo, 24 a 48 semanas. Dependiendo de varios factores (incluyendo, de manera no exclusiva, el peso molecular, la actividad y la farmacocinética del conjugado de la invención y el tamaño y salud del paciente), el conjugado puede administrarse en cantidades menores (tales como, por ejemplo, aproximadamente 25, 50, 75, 100, 125 ó 150 mcg) y/o menos frecuentemente (tal como una vez cada 10 días, o una vez cada 2 semanas), que lo descrito anteriormente.

En algunos casos, el polipéptido o conjugado de la invención se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, el polipéptido o conjugado de la invención puede administrarse en combinación con un fármaco antiviral, tal como Ribavirina, el cual se vende bajo los nombres COPEGUS® (Hoffmann-La Roche, Inc) y REBETOL® (Schering Corporation). La cantidad precisa y la frecuencia de administración del polipéptido o conjugado de la invención, dependerá de varios factores, tales como la actividad específica y las propiedades farmacocinéticas del polipéptido o el conjugado, así como la naturaleza de la condición siendo tratada (tal como el genotipo del virus de la Hepatitis C siendo tratado), entre otros factores conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Normalmente, la dosis debe ser capaz de prevenir o aminorar la severidad o la dispersión de la indicación siendo tratada. Tal dosis puede denominarse como una cantidad "efectiva" o "terapéuticamente efectiva". Será evidente para aquellos con experiencia en la técnica, que una cantidad efectiva de un polipéptido, conjugado o composición de la invención depende, inter alia, de la condición siendo tratada, la dosis, el esquema de administración, si el polipéptido o conjugado o composición se administra solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, la vida media en suero y otras propiedades farmacocinéticas del polipéptido, conjugado o composición, así como el tamaño, edad y salud general del paciente. La dosificación y la frecuencia de la administración, se determina por alguien con experiencia en la técnica utilizando técnicas conocidas. La efectividad del tratamiento puede determinarse midiendo la carga viral, por ejemplo, determinando el título o nivel de virus en el suero o plasma utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, verificando los niveles del ARN viral utilizando pruebas cuantitativas basadas en PCR, tales como la Prueba para HCV COBAS AMPLICOR®, v2.0, o la Prueba COBAS AMPLICOR HCV MONITOR®, v2.0 (ambas de Roche Diagnostics). En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición de la invención es una que es suficiente para lograr una reducción en la carga viral de al menos 2 unidades logarítmicas, al menos 3 unidades logarítmicas, al menos 4 unidades logarítmicas, al menos 5 unidades logarítmicas, al menos 6 unidades logarítmicas o al menos 7 unidades logarítmicas durante el curso del tratamiento, en comparación con la carga viral antes del tratamiento (la cual generalmente está en el intervalo de 105-107 copias de ARN HCV/ml para pacientes con HCV crónica). En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición de la invención es una cantidad que es suficiente para reducir la carga viral a niveles que son esencialmente indetectables, tales como, por ejemplo, menos que aproximadamente 500 copias/ml de suero o menos que aproximadamente 100 copias/ml de suero. La invención incluye un método para reducir el nivel del ARN HCV en el suero, de un paciente infectado con HCV, que comprende administrar al paciente una composición de la invención, en una cantidad efectiva para reducir el nivel del ARN HCV en comparación con el nivel del ARN HCV presente antes del inicio del tratamiento. La efectividad del tratamiento puede determinarse de manera alterna o además, midiendo un parámetro indicativo de una condición asociada con la infección por HCV, tal como, por ejemplo, el daño en el hígado. Por ejemplo, el nivel de la alanina aminotransferasa (ALT) en suero, puede medirse utilizando un ensayo estándar. En general, un nivel de ALT menor que aproximadamente 50 unidades ¡nternacionales/ml (lU/ml) de suero se considera normal. Un nivel de ALT más alto, puede ser indicativo de un daño al hígado en curso. En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición de la invención es una cantidad efectiva para reducir el nivel de ALT, en un paciente con un nivel de ALT más alto que el normal, a menos que aproximadamente 50 lU/ml de suero. Así, la invención incluye un método para reducir un nivel de ALT en suero de un paciente infectado con HCV, que exhibe un nivel inicial de ALT mayor que 50 lU/ml, que comprende administrar al paciente una composición de la invención, en una cantidad efectiva para reducir el nivel de ALT a menos de aproximadamente 50 lU/ml.

Virus de la hepatitis B En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un paciente infectado con el Virus de la Hepatitis B (HBV), que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición de la invención, que comprende uno o más polipéptidos o conjugados de la invención. La invención también proporciona una composición para utilizarse en el tratamiento de un paciente infectado con HBV, que comprende uno o más polipéptidos o conjugados de la invención, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Un paciente diagnosticado como infectado con HBV, exhibe un antígeno superficial de la hepatitis B (HBsAg) detectable en el suero. La infección crónica por HBV, se clasifica además como "replicante" o "no replicante". En la infección replicante, el paciente usualmente tiene una concentración en suero relativamente alta del ADN viral y HBeAg detectable, que es una proteína procesada de manera alterna del gen del prenúcleo del HBV, que se sintetiza bajo condiciones de alta replicación viral. Sin embargo, en cepas raras del HBV con mutaciones en el gen del prenúcleo, la infección replicante puede ocurrir en la ausencia de HBeAg detectable en el suero. Los pacientes con hepatitis B crónica e infección replicante, tienen generalmente un pronóstico más grave y una mayor oportunidad de desarrollar cirrosis y/o carcinoma hepatocelular que aquéllos sin HBeAg. En la infección no replicante, la velocidad de la replicación viral en el hígado es baja, la concentración de ADN HBV en suero es generalmente baja y el antígeno B de la hepatitis (HBeAg), no se detecta. Una composición que comprende un polipéptido de la invención, se administrará generalmente a una dosis y frecuencia similares a aquéllas que se emplean en los regímenes terapéuticos de HBV, utilizando los polipéptidos de interferón alfa aprobados clínicamente, tales como, por ejemplo, INTRON® A (Interferón alfa-2b, recombinante; Schering Corporation). Un esquema recomendado ejemplar de dosificación del INTRON A para el tratamiento del HBV crónica en adultos, es de 30 a 35 millones de IU por semana, mediante inyección subcutánea o intramuscular, ya sea como 5 millones de IU por día (qd), o como 10 millones de IU tres veces por semana (tiw) durante 16 semanas. Dependiendo de varios factores (incluyendo, de manera no exclusiva, la actividad y la farmacocinética del polipéptido de la invención, y el tamaño y la salud del paciente), el polipéptido de la invención puede administrarse en cantidades menores (tales como, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20 ó 25 millones de IU por semana) y/o menos frecuentemente (tal como una vez por semana o dos veces por semana), que lo descrito anteriormente. De igual manera, una composición que comprende un conjugado de la invención, generalmente se administrará a una dosis y frecuencia similares que aquéllas que se emplean en los regímenes terapéuticos de HBV, utilizando los conjugados del interferón alfa actualmente en ensayos clínicos en curso, tales como por ejemplo, PEGASYS® (Peginterferon alfa-2a; Hoffmann-La Roche, Inc.). Los esquemas ejemplares de dosificación del PEGASYS para el tratamiento de HBV crónica son de entre 90 mcg-270 mcg inyectados una vez por semana durante un total de 24 semanas. Dependiendo de varios factores (incluyendo, de manera no exclusiva, el peso molecular, la actividad y la farmacocinética del conjugado de la invención, y el tamaño y salud del paciente), el conjugado puede administrarse en cantidades menores (tal como, por ejemplo, aproximadamente 25, 50, 75, 100, 125, 150 ó 200 mcg) y/o menos frecuentemente (tal como una vez cada 10 días, o una vez cada 2 semanas), que lo descrito anteriormente. En algunos casos, el polipéptido o conjugado de la invención se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, el polipéptido o conjugado de la invención puede administrarse en combinación con fármacos antivirales, tales como lamivudina (también conocida como 3TC), la cual se vende bajo el nombre Epivir-HBV® (GlaxoSmithKIine), o adefovir dipivoxilo, el cual se vende bajo el nombre Hepsera® (Gilead Sciences). La cantidad precisa y la frecuencia de administración del polipéptido o conjugado de la invención, dependerá de varios factores, tales como la actividad específica y las propiedades farmacocinéticas del polipéptido o el conjugado, así como la naturaleza de la condición siendo tratada (tal como, por ejemplo, en el caso de infección crónica por HBV, si la infección es replicante o no replicante), entre otros factores conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Normalmente, la dosis debe ser capaz de prevenir o aminorar la severidad o dispersión de la indicación siendo tratada. Tal dosis puede denominarse una cantidad "efectiva" o "terapéuticamente efectiva". Será evidente para aquellos con experiencia en la técnica, que una cantidad efectiva de un polipéptido, conjugado o composición de la invención depende, ínter alia, de la condición siendo tratada, la dosis, el esquema de administración, si el polipéptido o conjugado o composición se administra solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, la vida media en suero y otras propiedades farmacocinéticas del polipéptido, conjugado o composición, así como el tamaño, edad y la salud general del paciente. La dosificación y la frecuencia de administración se determinan por alguien con experiencia en la técnica utilizando las técnicas conocidas. La efectividad del tratamiento puede determinarse por ejemplo, midiendo la carga viral, por ejemplo, el nivel del ADN viral en el suero o el plasma, utilizando los métodos conocidos en la técnica. Los métodos para verificar los niveles del ADN HBV incluyen pruebas cuantitativas basadas en PCR, tales como la Prueba COBAS AMPLICOR HBV MONITOR®, v2.0 o la Prueba AMPLICOR HBV MONITOR®, v2.0 (ambas de Roche Diagnostics). En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición de la invención, es una cantidad que es suficiente para reducir el ADN viral a, por ejemplo, menos que aproximadamente 500,000 copias/ml de suero o menos que aproximadamente 100,000 copias/ml de suero o menos que aproximadamente 10,000 copias/ml de suero, o a niveles que son esencialmente ¡ndetectables (tales como, por ejemplo, menos que aproximadamente 1000 copias/ml de suero, menos que aproximadamente 500 copias/ml de suero, o menos que aproximadamente 200 copias/ml de suero). La invención incluye el método para reducir el nivel del ADN HBV en suero de un paciente infectado con HBV, que comprende administrar al paciente una composición de la invención, en una cantidad efectiva para reducir el nivel del ADN HBV, en comparación con el nivel del ADN HBV presente antes del inicio del tratamiento. La efectividad del tratamiento puede determinarse de manera alterna o adicional, midiendo otros marcadores en suero para la replicación del HBV, tal como el HBeAg. En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición de la invención, es una cantidad que es suficiente para reducir el nivel de HBeAg a niveles que son esencialmente indetectables. La invención incluye un método para reducir el nivel de HBeAg en suero de un paciente infectado con HBV, que comprende administrar al paciente una composición de la invención, en una cantidad efectiva para reducir el nivel de HBeAg en comparación con el nivel de HBeAg presente antes del inicio del tratamiento. Como se discutió anteriormente, otro marcador en suero indicativo de la infección por HBV, es el HBsAg. Así, la efectividad del tratamiento puede determinarse de manera alterna o adicional, midiendo el nivel de HBsAg en el suero. En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición de la invención, es una cantidad que es suficiente para reducir el nivel de HBsAg a niveles que son esencialmente indetectables. La invención incluye un método para reducir el nivel de HBsAg en suero en un paciente infectado con HBV, que comprende administrar al paciente una composición de la invención, en una cantidad efectiva para reducir el nivel de HBsAg en comparación con el nivel de HBsAg presente antes del inicio del tratamiento. La efectividad del tratamiento puede determinarse de manera alterna o adicional, midiendo el parámetro indicativo de una condición asociada con la infección con HBV, tal como, por ejemplo, el daño al hígado. Por ejemplo, el nivel de la alanina aminotransferasa (ALT) en suero, puede medirse utilizando un ensayo estándar. En general, un nivel de ALT menor que aproximadamente 50 unidades ¡nternacionales/ml (lU/ml) de suero se considera normal. Un nivel de ALT más alto, puede ser indicativo de un daño al hígado en curso. En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición de la invención, es una cantidad efectiva para reducir el nivel de ALT, en un paciente con un nivel de ALT más alto que el normal, a menos que aproximadamente 50 lU/ml de suero. Así, la invención incluye un método para reducir el nivel de ALT en suero de un paciente infectado con HBV, que exhibe un nivel inicial de ALT mayor que 50 lU/ml, que comprende administrar al paciente una composición de la invención, en una cantidad efectiva para reducir el nivel de ALT a menos que aproximadamente 50 lU/ml.

Formulaciones y rutas de administración Las formulaciones terapéuticas del polipéptido o conjugado de la invención, se administran típicamente en una composición que incluye uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones farmacéuticas pueden prepararse de una manera conocida per se en la técnica, para que resulten en un producto farmacéutico polipeptídico que es suficientemente estable durante el almacenamiento, y que es adecuado para la administración a humanos o animales.

Forma del fármaco El polipéptido o conjugado de la invención puede utilizarse "como tal" y/o en forma de una sal del mismo. Las sales adecuadas incluyen, de manera no exclusiva, sales con metales alcalinos o metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, calcio y magnesio, así como por ejemplo, sales de zinc. Estas sales o complejos pueden estar presentes como una estructura cristalina y/o amorfa.

Excipientes "Farmacéuticamente aceptable", significa un portador o excipiente que a las dosis y concentraciones empleadas, no causa ningún efecto perjudicial en los pacientes a quienes se administran. Tales portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables, son bien conocidos en la técnica (véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).

Mezcla de fármacos La composición farmacéutica de la invención puede administrarse sola o en conjunto con otros agentes terapéuticos. La ribavirina, por ejemplo, se coadministra actualmente con el IFN-alfa, y ha mostrado aumentar la eficacia en el tratamiento del HCV. Se está desarrollando una variedad de moléculas pequeñas contra los objetivos virales (proteasas virales, polimerasa viral, montaje de complejos de replicación viral), y los objetivos hospederos (proteasas hospederas requeridas para el procesamiento viral, cinasas hospederas requeridas para la fosforilación de los objetivos virales, tales como NS5A e inhibidores de los factores del hospedero requeridos para utilizar de manera eficiente los IRES virales). Otras citocinas pueden coadministrarse, tales como IL-12, IL-23, IL-27 o IFN-gamma. Estos agentes pueden incorporarse como parte de la misma composición farmacéutica o pueden administrarse de manera separada a partir del polipéptido o conjugado de la invención, ya sea concurrentemente o de acuerdo con otro esquema de tratamiento. Además, el polipéptido, conjugado o composición farmacéutica de la invención, puede utilizarse como un adyuvante para otras terapias.

Pacientes Un "paciente", para los propósitos de la presente invención incluye tanto humanos como otros mamíferos. Así, los métodos son aplicables tanto a terapia humana como a aplicaciones veterinarias.

Tipos de composiciones y ruta de administración La composición farmacéutica que comprende el polipéptido o conjugado de la invención, puede formularse en una variedad de formas, por ejemplo, como un líquido, gel, liofilizado o como un sólido comprimido. La forma preferida dependerá de la indicación particular siendo tratada, y será evidente para alguien con experiencia en la técnica. La administración de las formulaciones de la presente invención, puede realizarse en una variedad de formas, incluyendo, de manera no exclusiva, oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraocular o cualquier otra manera aceptable. Las formulaciones pueden administrarse de manera continua mediante infusión, aunque una inyección de un bolo es aceptable, utilizando técnicas bien conocidas en el campo, tales como bombas (por ejemplo, bombas osmóticas subcutáneas) o implante. En algunos casos, las formulaciones pueden aplicarse directamente como una solución o rocío.

Soluciones parenterales Un ejemplo de una composición farmacéutica es una solución diseñada para la administración parenteral. Aunque en muchos casos, las formulaciones de la solución farmacéutica se proporcionan en forma líquida, apropiadas para el uso inmediato, tales formulaciones parenterales pueden proporcionarse también en una forma congelada o liofilizada. En el primer caso, la composición debe descongelarse antes del uso. La segunda forma se utiliza con frecuencia para mejorar la estabilidad del compuesto activo contenido en la composición, bajo una variedad más amplia de condiciones de almacenamiento, como se reconoce por aquellos con experiencia en la técnica, las preparaciones liofilizadas son generalmente más estables que sus contrapartes líquidas. Tales preparaciones liofilizadas se reconstituyen antes del uso, mediante la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables, adecuados, tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril. Las soluciones parenterales pueden prepararse para el almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas, mezclando, conforme sea apropiado, el polipéptido que tiene el grado deseado de pureza, con uno o más portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, empleados típicamente en la técnica (todos los cuales se denominan "excipientes"), por ejemplo, agentes amortiguantes, agentes estabilizantes, conservadores, isotonificantes, detergentes no iónicos, antioxidantes y/u otros aditivos misceláneos. Los agentes amortiguantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Están presentes típicamente, una concentración que varía de aproximadamente 2 m a aproximadamente 50 mM. Los agentes amortiguantes adecuados para utilizarse con la presente invención, incluyen tanto ácido orgánicos como inorgánicos y sales de los mismos, tales como amortiguadores de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), amortiguadores de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico- succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), amortiguadores de tartrato (por ejemplo, ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), amortiguadores de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), amortiguadores de gluconato (por ejemplo, ácido glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), amortiguador de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), amortiguadores de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.), y amortiguadores de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Las posibilidades adicionales son amortiguadores de fosfato, amortiguadores de histidina y sales de trimetilamina, tal como Tris. Los conservadores se agregan para retardar el crecimiento microbiano, y se agregan típicamente en cantidades de aproximadamente 0.2%-1 % (peso/volumen). Los conservadores adecuados para utilizarse con la presente invención incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metil parabeno, propil parabeno, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro o yoduro de benzalconio), cloruro de hexametonio, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol. Los isotonificantes se agregan para asegurar la isotonicidad de la composición líquida, e incluyen alcoholes de azúcares polihídricos, de manera preferida, alcoholes de azúcares trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los alcoholes polihídricos pueden estar presentes en una cantidad entre 0.1 % y 25% en peso, típicamente 1 % a 5%, tomando en cuenta las cantidades relativas de los otros ingredientes. Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes, que pueden variar en función de un agente de carga a un aditivo, que solubiliza el agente terapéutico, o ayuda a evitar la desnaturalización o adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes de azúcares polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, omitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcares, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y lo similar, incluyendo ciclitoles tales como el inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir <10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofóbicos tales como polívínílpirrolídona; monosacáridos tales como xilosa, mañosa, fructosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sucrosa; trisacáridos tales como rafinosa y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizantes están presentes típicamente en el intervalo de 0.1 a 10,000 partes en peso, en base al peso de la proteína activa. Los tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes"), pueden estar presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger el polipéptido terapéutico contra la agregación inducida por la agitación, lo cual permite también que la formulación se exponga a un esfuerzo cortante superficial sin causar la desnaturalización del polipéptido. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188 etc.), polioles de Pluronic®, monoéteres de polioxietilen sorbitan (Tween®-20, Tween®-80, etc.). Los excipientes misceláneos adicionales incluyen agentes de carga o rellenos (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbíco, metionina, vitamina E) y cosolventes. El ingrediente activo también puede estar atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización ¡nterfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa, gelatina o poli-(metilmetacrilato), en sistemas coloidales de suministro del fármaco (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. En un aspecto de la invención, la composición es una composición líquida, tal como una composición acuosa, y comprende un derivado de sulfoalquil éter ciclodextrina de la fórmula en donde n es 4, 5 ó 6; Ri, R2, R3, R4, R5, 6, R7, Re y R9 son cada uno, de manera independiente, -O- o un grupo -0-(alquil de C2-C6)-S03-, en donde al menos uno de R-i, R2 o R3 es de manera independiente un grupo -0-(alquil de C2-C6)-S03-; y , S2, S3, S4, S5, Se, S7, Ss y S9 son cada uno, de manera independiente, un catión farmacéuticamente aceptable, incluyendo H+. Deberá notarse que cuando n=4, la sulfoalquil éter ciclodextrina puede referirse también como una a-sulfoalquil éter ciclodextrina. De una manera similar, cuando n=5, puede emplearse el término ß-sulfoalquil éter ciclodextrina, y cuando n=6, la sulfoalquil éter ciclodextrina también puede referirse como una ?-sulfoalquil éter ciclodextrina.

En una modalidad adicional, n es 5 ó 6. En una modalidad preferida n=6. En aún una modalidad adicional, Ri, F¾ o R3 se seleccionan de manera independiente del grupo que consiste de -OCH2CH2CH2SO3-, -OCH2CH2CH2CH2SO3- y -OCH2CH2CH2CH2CH2SO3-. De manera más preferida, R2 o R3 son de manera independiente -OCH2CH2CH2CH2S03-. En una modalidad adicional, S-i, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8 y S9 son cada uno, de manera independiente, un catión farmacéuticamente aceptable, seleccionado de H+, metales alcalinos (por ejemplo, Li+, Na+, K+), metales alcalinotérreos (por ejemplo, Ca+2, Mg+2), iones de amonio y cationes de amina, tales como los cationes de alquilaminas de (C-i-Ce), piperidina, piracina, alcanolamina de (C-i-C6) y cicloalcanolamina de (C4-C8). De manera más preferida, Si, S2, S3, S4, S5, Se, S7, Ss y S9 son cada uno, de manera independiente, un catión farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste de H+, L¡+, Na\ K+, en particular Na+. La sulfoalquil éter ciclodextrina puede contener de 1 a 18 grupos sulfoalquilo (cuando n=4), de 1-21 grupos sulfoalquilo (cuando n=5) o de 1 -21 (cuando n=6). En una modalidad preferida de la invención, n=5 y el derivado de sulfoalquiléter comprende, en promedio, 2-20 grupos sulfoalquilo (en particular, grupos sulfobutilo), tales como 3-10 grupos sulfoalquilo (en particular, grupos sulfobutilo), de manera más preferida, 4-9 grupos sulfoalquilo (en particular, grupos sulfobutilo), aún de manera más preferida 5-9 grupos sulfoalquilo (en particular, grupos sulfobutilo), tales como 6-8 grupos sulfoalquilo (en particular, grupos sulfobutilo), por ejemplo, 7 grupos sulfoalquilo (en particular, grupos sulfobutilo). En algunos casos, el derivado de sulfoalquil éter ciclodextrina es una sal, en particular una sal de sodio, de la sulfobutil éter ß-ciclodextrina (es decir, n=5), que en promedio contiene 7 grupos sulfobutilo. El derivado de sulfoalquil éter ciclodextrina también se denomina SBE7-P-CD, y está disponible como Captisol® (Cydex, Overland Park, Kansas). El término "alquilo de C-i-Ce" representa un grupo alquilo ramificado o lineal, que tiene de uno a seis átomos de carbono. Los grupos alquilo de C1-C6 típicos incluyen, de manera no exclusiva, metilo, etilo, n-propilo, ¡so-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, n-pentilo, iso-pentilo, n-hexilo e iso-hexilo. El término "alquilo de C2-C6" representa un grupo alquilo ramificado o lineal, que tiene de dos a seis átomos de carbono. Los grupos alquilo de C2-C6 típicos incluyen, de manera no exclusiva, etilo, n-propilo, ¡so-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, n-pentilo, iso-pentilo, n-hexilo e iso-hexilo. Los detalles adicionales con respecto a las composiciones que comprenden los polipéptidos descritos en la presente y los derivados de sulfoalquil éter ciclodextrina, pueden encontrarse en WO 03/002152, particularmente, la sección titulada "El derivado de sulfoalquil éter ciclodextrina", en las páginas 37-49, incorporada aquí como referencia.

Las formulaciones parenterales a ser utilizadas para la administración in vivo, deben ser estériles. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

Preparaciones de liberación sostenida Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido o conjugado, las matrices tienen una forma adecuada, tal como una película o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como la tecnología ProLease® o Lupron Depot® (microesferas inyectables compuestas de un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como el etileno-acetato de vinilo y de ácido láctico-glicólico permiten la liberación de moléculas durante periodos largos, tales como de hasta o más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan las proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37°C, resultando en una pérdida de la actividad biológica y en posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden considerarse estrategias racionales para la estabilización, dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación intermolecular del enlace S-S a través del intercambio de tiodisulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.

Administración oral Para la administración oral, la composición farmacéutica puede estar en forma sólida o líquida, por ejemplo, en la forma de una cápsula, tableta, suspensión, emulsión o solución. La composición farmacéutica se hace de manera preferida en la forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad dada del ingrediente activo. Una dosis diaria adecuada para un humano u otro mamífero, puede variar ampliamente, dependiendo de la condición del paciente y otros factores, pero puede determinarse por las personas con experiencia en la técnica, utilizando métodos de rutina. Las formas de dosificación sólida para la administración oral pueden incluir cápsulas, tabletas, supositorios, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólida, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte, tal como sucrosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como en la práctica normal, sustancias adicionales, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las formas de dosificación pueden comprender también agentes amortiguadores. Las tabletas y pildoras pueden prepararse además con recubrimientos entéricos. Los polipéptldos o conjugados pueden mezclarse con adyuvantes tales como lactosa, sucrosa, polvo de almidón, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, acacia, gelatina, alginato sódico, polivinilpirrolidina y/o alcohol polivinílico, y tabletearse o encapsularse para la administración convencional. De manera alterna, pueden disolverse en suero fisiológico, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceites (tales como aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón o aceite de sésamo), goma de tragacanto y/o varios amortiguadores. Otros adyuvantes y modos de administración son bien conocidos en la técnica farmacéutica. El portador o diluyente puede incluir un material de retardo en el tiempo, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales, tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, emulsificantes, amortiguadores, rellenos, etc., por ejemplo, como se describe en otro lugar en la presente.

Las formas de dosificación líquida para la administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires farmacéuticamente aceptables, que contienen diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tal como agua. Tales composiciones pueden comprender también adyuvantes tales como agentes humectantes, edulcorantes, agentes saborizantes y agentes perfumantes.

Suministro pulmonar Las formulaciones adecuadas para utilizarse con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, comprenderán típicamente el polipéptido o conjugado disuelto en agua a una concentración de, por ejemplo, aproximadamente 0.01 a 25 mg del conjugado por mL de solución, de manera preferida, de aproximadamente 0.1 a 10 mg/mL. La formulación también puede incluir un amortiguador y un azúcar simple (por ejemplo, para la estabilización de la proteína y la regulación de la presión osmótica), y/o seroalbúmina humana que varía en concentración de 0.1 a 10 mg/ml. Los ejemplos de amortiguadores que pueden utilizarse son acetato sódico, citrato y glicina. De manera preferida, el amortiguador tendrá una composición y molaridad adecuada para ajustar la solución a un pH en el intervalo de 3 a 9. Generalmente, las molaridades del amortiguador de 1 mM a 50 mM son adecuadas para este propósito. Los ejemplos de azúcares que pueden utilizarse son lactosa, maltosa, manitol, sorbitol, trehalosa y xilosa, usualmente en cantidades que varían de 1 % a 10% en peso de la formulación.

La formulación del nebulizador también puede contener un tensioactivo para reducir o evitar la agregación inducida en la superficie de la proteína, causada por la atomización de la solución en la formación del aerosol. Pueden emplearse varios tensioactivos convencionales, tales como ésteres de ácidos grasos de polioxietileno y alcoholes, y ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitan. Las cantidades variarán generalmente, entre 0.001% y 4% en peso de la formulación. Un tensioactivo especialmente preferido para los propósitos de esta invención, es el monooleato de polioxietilen sorbitan. Las formulaciones y los métodos específicos para generar dispersiones adecuadas de partículas líquidas de la invención se describen en WO 94/20069, US 5,915,378, US 5,960,792, US 5,957,124, US 5,934,272, US 5,915,378, US 5,855,564, US 5,826,570 y US 5,522,385, las cuales se incorporan aquí como referencia. Las formulaciones para utilizarse con un dispositivo inhalador dosificador presurizado, comprenderán generalmente un polvo finamente dividido. Este polvo puede producirse mediante liofilización, y a continuación moliendo una formulación de conjugado líquido y puede contener también un estabilizante tal como seroalbúmina humana (HSA). Típicamente, se agrega más que el 0.5% (peso/peso) de HSA. Además, pueden agregarse uno o más azúcares o alcoholes de azúcar a la preparación, si es necesario. Los ejemplos incluyen lactosa, maltosa, manítol, sorbitol, sorbitosa, trehalosa, xilitol y xilosa. La cantidad agregada a la formulación puede variar de aproximadamente 0.01 a 200% (peso/peso), de manera preferida, de aproximadamente 1 a 50% del conjugado presente. Tales formulaciones se liofilizan y muelen al tamaño de partícula deseado. Las partículas dimensionadas de manera apropiada se suspenden a continuación en un propelente, con la ayuda de un tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarbono, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitan y lecitina de soya. El ácido oleico también puede ser útil como un tensioactivo. A continuación, la mezcla se carga en el dispositivo de suministro. Un ejemplo de un inhalador dosificador presurizado, disponible comercialmente, adecuado para utilizarse en la presente invención, es el inhalador dosificador presurizado Ventolín, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC, EUA. Las formulaciones para los inhaladores de polvo, comprenderán un polvo seco finamente dividido, que contiene el conjugado, y que puede incluir también un agente de carga, tal como lactosa, sorbitol, sucrosa, o manitol, en cantidades que faciliten la dispersión del polvo del dispositivo, por ejemplo, 50% a 90% en peso de la formulación. Las partículas del polvo deberán tener propiedades aerodinámicas en el pulmón, correspondientes a partículas con una densidad de aproximadamente 1 g/cm2, que tienen un diámetro medio menor que 10 micrometros, de manera preferida entre 0.5 y 5 micrometros, de manera aún más preferida entre 1.5 y 3.5 micrometros. Un ejemplo de un inhalador de polvo adecuado para utilizarse de acuerdo con las enseñanzas de la presente, es el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, MA, EUA. Los polvos para estos dispositivos pueden generarse y/o suministrarse mediante los métodos descritos en US 5,997,848, US 5,993,783, US 5,985,248, US 5,976574, US 5,922,354, US 5,785,049 y US 5,654,007. Los dispositivos mecánicos diseñados para el suministro pulmonar de productos terapéuticos incluyen, de manera no exclusiva, nebulizadores, inhaladores dosificadores presurizados e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para aquellos con experiencia en la técnica. Los ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles, adecuados para la práctica de esta invención, son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, MO, EUA; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, CO, EUA; el inhalador dosificador presurizado Ventolín, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC, EUA; el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, MA, EUA, el dispositivo de "nube estable" de Nektar Therapeutics, Inc., San Carlos, CA, EUA; el inhalador AIR fabricado por Alkermes, Cambridge, MA, EUA; y el sistema pulmonar de suministro de fármacos AERx, fabricado por Aradigm Corporation, Hayward, CA, EUA.

Equipos La presente invención también proporciona equipos que incluyen los polipéptidos, conjugados, polinucleótidos, vectores de expresión, células, métodos, composiciones y sistemas y los aparatos de la invención. Los equipos de la invención comprenden opcionalmente al menos uno de lo siguiente de la invención: (1 ) un aparato, sistema, componente del sistema o componente del aparato como se describe en la presente; (2) al menos un componente del equipo que comprende un polipéptido o un conjugado o un polinucleótido de la invención; un vector de expresión del plásmido que codifica un polipéptido de la invención; una célula que expresa un polipéptido de la invención; o una composición que comprende al menos uno de cualquiera de tales componentes; (3) instrucciones para practicar cualquier método descrito en la presente, incluyendo un método terapéutico o profiláctico, instrucciones para utilizar cualquier componente identificado en (2) o cualquier composición de cualquiera de tales componentes; y/o instrucciones para operar cualquier aparato, sistema o componente descrito en la presente; (4) un recipiente para mantener al menos uno de tales componentes o composiciones y (5) materiales de empaque. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de cualquier aparato, componente, composición o equipo descrito anteriormente y en la presente, para la práctica de cualquier método o ensayo descrito en la presente y/o para el uso de cualquier aparato, componente, composición o equipo, para practicar cualquier ensayo o método descrito en la presente.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar la presente invención, pero no para limitar el espíritu o alcance de la presente invención de ninguna manera.

Materiales y Métodos I. Determinación de los residuos accesibles a la superficie Area superficial accesible (ASA) El programa para computadora Access (B. Lee y F.M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971 )) versión 2 (©1983 Universidad de Yale), se utilizó para calcular el área superficial accesible (ASA) de los átomos individuales en la estructura. Este método utiliza típicamente un tamaño de sonda de 1.4 Á y define el Area Superficial Accesible (ASA), como el área formada por el centro de la sonda. Antes de este cálculo, deben eliminarse todas las moléculas de agua y todos los átomos de hidrógeno del conjunto coordinado, así como otros átomos no relacionados directamente con la proteína.

ASA fraccionada de la cadena lateral El ASA fraccionada de los átomos de la cadena lateral se calcula dividiendo la suma del ASA de los átomos en la cadena lateral, entre un valor que representa el ASA de los átomos de la cadena lateral de ese tipo de residuo en un tripéptido ALA-x-ALA extendido. Véase Hubbard, Campbell & Thomton (1991 ) J. Mol. Biol. 220, 507-530. Para este ejemplo, el átomo CA se considera como parte de la cadena lateral de los residuos de lisina, pero no para los residuos restantes. Los siguientes valores se utilizaron como el ASA 100% estándar para la cadena lateral (Cuadro 6): Ala 69.23 A2 Leu 140.76 A2 Arg 200.35 A2 Lys 162.50 A2 Asn 106.25 Á2 Met 156.08 A2 Asp 102.06 A2 Phe 163.90 A2 Cys 96.69 A2 Pro 1 19.65 A2 Gln 140.58 A2 Ser 78.16 A2 Glu 134.61 A2 Thr 101.67 A2 Gly 32.28 A2 Trp 210.89 A2 His 147.00 A2 Tyr 176.61 A2 He 137.91 A2 Val 1 14.14 A2 Los residuos no detectados en la estructura se definen como que tienen 100% de exposición, puesto que se piensa que residen en regiones flexibles. En el caso en donde se analiza un conjunto de estructuras mediante RMN, se utiliza el valor ASA promedio del conjunto.

Determinación de los residuos expuestos a la superficie cuando no está disponible una estructura tridimensional: Cuando no está disponible una estructura tridimensional o si la estructura no se detalla lo suficiente para determinar la accesibilidad superficial (por ejemplo, si sólo se conoce la posición de los átomos CA), la accesibilidad de la superficie puede inferirse a partir de la alineación de la secuencia creada como sigue: A: Si la estructura es conocida pero no suficientemente detallada para determinar la accesibilidad superficial: La estructura con bajo detalle se incluye en una alineación de la secuencia basada en la estructura, con las estructuras conocidas de la familia de las secuencias, utilizando el programa MODELER, disponible de Molecular Simulations, Inc. B: Si no se conoce la estructura: La secuencia se alinea a una alineación de la secuencia predefinida, incluyendo las secuencias de las estructuras conocidas de la familia de las secuencias, que pueden prepararse utilizando la opción de "alineación del perfil/estructura" del programa ClustalW (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Research 22:4673-4680). Para la alineación de la secuencia obtenida en A o B, se define que los residuos en la secuencia a ser analizados en las posiciones equivalentes a los residuos expuestos en al menos una de las otras secuencias que tienen una estructura conocida, están expuestos. El grado de exposición se toma como el valor más grande para los residuos equivalentes en las otras secuencias, En los casos en donde la secuencia a ser analizada está en una inserción (es decir, no hay residuos equivalentes en las otras secuencias), este residuo se define como completamente expuesto, y es más probable que esté localizado en una región de vuelta/espira. En los casos en donde existe una estructura con poco detalle, aquellos residuos que no se observan en la estructura, se definen como completamente expuestos, puesto que se piensa que están en regiones flexibles.

Determinación de las distancias entre los átomos: La distancia entre los átomos se determina fácilmente utilizando un programa de gráficas moleculares, por ejemplo, Insightll® 98.0 de Molecular Simulations, Inc.

II. Expresión y purificación de la proteína A. Expresión y purificación a partir de células CHO Algunos polipéptidos de la invención se produjeron en células de Ovario de Hámster Chino (CHO), que se transfectaron de manera estable y se seleccionaron con G418 para establecer las líneas celulares clónales. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención se clonaron en el vector de expresión CHO, bajo el control de un promotor SR alfa (Takebe, Y. et al. (1988) Mol Cell Biol. 8(1 ):466-72), y en bloque con una secuencia que codifica un péptido líder N terminal, y opcionalmente, una marca del epítope C terminal. 1. Selección de las subclonas estables que expresan los polipéptidos de IFN-alfa: Materiales: Medio de cultivo: DMEM-F12 con G418, FBS y Penicilina, Estreptomicina y Glutamina [PSG] (Gibco/lnvitrogen) ; 1xPBS (Gibco/lnvitrogen); Tripsina/EDTA Conjugado de Anticuerpo-HRP Anti E-Tag (Amersham BioSciences) Reactivos para la detección de la Transferencia Western ECL Plus (Amersham BioSciences) Procedimiento: Se generan transfectantes estables bajo la selección con G418 en medio DMEM/F-12 con FBS y penicilina. Las células se dividieron en matraces T175 con 50 mi de medio de selección y se incubaron en una incubadora con CO2 a 37°C durante -24 horas, o hasta que las células alcanzaron 80% de confluencia. Las células se recolectaron lavando con PBS, seguido por la adición de 2.5 mi de Tripsina/EDTA y la incubación a 37°C durante 3-5 minutos. Las células se recolectaron y recuperaron mediante centrifugación a 1000 g durante 30 minutos en una centrífuga de banco Modelo Beckman. Las células se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en 3 mi de PBS con 1 % de FBS. La densidad celular se determinó y ajustó a 1x106 células/ml con PBS/FBS. Para cada polipéptido de IFNa, las células se clasificaron en un clasificador DakoCytomation MoFlo en 2-5 placas de 96 pozos, que contienen 200 mi de medio de selección. Las placas se incubaron en una incubadora a 37°C durante 10-14 días para permitir que las células clasificadas crezcan. Se seleccionaron dos subclonas para cada polipéptido de IFNa para un alto nivel de expresión, primero mediante un análisis de transferencia por puntos, y posteriormente se confirmó mediante un análisis de transferencia Western utilizando un conjugado de anticuerpo-HRP anti-E-Tag y detección quimioluminiscente. 2. Expresión de la proteína: Materiales: DMEM-F12 (Gibco/lnvitrogen) Medio Ultra CHO (BioWhittaker) Medio CHO III A (Gibco/lnvitrogen) Suplemento del medio para mejorar el crecimiento Ex-Cyte (Serologicals Proteins) ITSA (suplemento de Insulina, Transferrina, Selenio para un cultivo adherente; Gibco/lnvitrogen) Penicilina/Estreptomicina (P/S) FBS, PBS, Tripsina 59 Procedimiento: Día 1 : Las células de un matraz T-175 se transfirieron a una botella cilindrica (1700 cm2), en 300 mi de DMEM-F12 con FBS al 10% y 1xP/S y crecieron en una incubadora con C02 a 37°C. Día 3: El medio se cambió a 300 mi de DMEM-F12-FBS-P/S fresco. Día 5: El medio se cambió a 300 mi de Ultra CHO con 1/1000 de Ex-Cyte y P/S. Día 7: El medio se reemplazó con 300 mi de CHO III A + medio de producción P/S. Los sobrenadantes se recolectaron en el Día 8, 9 y 10. Los sobrenadantes se centrifugaron a 2000 g durante 20 minutos en una centrífuga de banco Beckman Coulter Allegra 6R y se filtraron utilizando un filtro estéril superior para botella PES de 0.2µ y se almacenaron a 4°C para la purificación. 3. Purificación de la proteína: Algunos polipéptidos de la invención se expresaron como proteínas de fusión que contienen una secuencia E-Tag de 13 aminoácidos en el término C. Tales polipéptidos se purificaron utilizando una columna de afinidad E-Tag, como sigue. Materiales: Módulo de Purificación del Sistema del Anticuerpo del Fago Recombinante (Amersham BioSciences, No. Cat. 17-1362-01 ). El equipo de purificación contiene una columna anti E-Tag de 16 mm de diámetro x 25 mm de altura (volumen del lecho de 5 mi), y los amortiguadores asociados. Procedimiento: Los sobrenadantes recolectados de las células CHO-HK1 en las botellas se clarificaron utilizando una combinación de centrifugación a 2800xg durante 20 minutos y filtración utilizando un módulo de un filtro superior para botella PES de 0.2 µ. Los sobrenadantes se cargaron en la columna E-Tag equilibrada en amortiguador de unión RPAS a 150 cm/hora (5 ml/minuto). Las columnas se lavaron con 5 CV (volumen de la columna) de amortiguador de unión, y la proteína se eluyó a 75 cm/hora (2.5 ml/minuto) con amortiguador de elución RPAS. Las fracciones de elución se neutralizaron con 0.05 volúmenes de Tris-CI 1 M, pH 8.0, se dializaron en PBS, se concentraron a 0.1-1.5 mg/ml y se almacenaron congeladas en alícuotas a -80°C. Las muestras para los ensayos se formularon a 50 pg/ml en PBS con BSA al 0.5% y se almacenaron congeladas en alícuotas a -80°C. Las muestras se analizaron de manera rutinaria mediante SDS-PAGE seguido por tinción con Coomassie, utilizando los materiales, reactivos y protocolos obtenidos de Invitrogen. Las concentraciones de la proteína se determinaron de manera rutinaria mediante el ensayo de BCA utilizando un IFN-a, estándar, la concentración del cual se verificó mediante análisis de los aminoácidos.

B. Expresión y purificación de E. coli Algunos polipéptidos de la invención se produjeron en E. coli como cuerpos de inclusión, los cuales se purificaron y replegaron como sigue. 1. Constructo de expresión de E. coli Una secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO:18), que codifica el polipéptido B9x14 (SEQ ID NO:3), se modificó para una expresión mejorada en E. coli, reemplazando los pares de codones raros de Arg-Arg AGGAGG en las posiciones de los nucleótidos 34-39, y AGGAGA en las posiciones de los nucleótidos 64-69, cada uno con los pares de codones de Arg-Arg CGTCGC que son los preferidos en E. coli. También se agregó un codón Met (ATG) al extremo 5' de la secuencia codificante. La secuencia modificada se colocó en el vector pET-42 (Novagen), bajo el control del promotor T7 con el marcador de selección de la kanamicina. 2. Expresión de la proteína El vector que contiene la secuencia que codifica el ¡nterferón, se transformó en una cepa de E. coli BL21 (DE3) utilizando métodos estándar, y se emplacó en placas de agar, que contienen 50 pg/ml de kanamicina, y se incubó a 37°C. Después de 18-24 horas, se recolectaron tres colonias separadas, y se transfirieron a tubos que contienen 5 mi de 2xYT con 50 pg/ml de kanamicina, y se incubaron durante la noche a 37°C. El cultivo durante la noche se utilizó para inocular 2 conjuntos de matraces que contienen 100ml de 2xYT con 50 pg/ml de kanamicina. El crecimiento del cultivo a 37°C se verificó a OD6oo. El cultivo se indujo a una OD6oo de 0.5-0.8 con IPTG 1 mM durante 3 horas a 37°C. Los cultivos inducidos por IPTG se analizaron para la expresión mediante SDS-PAGE lisando las células granuladas en un amortiguador de muestra de SDS. 3. Aislamiento v replegado de los cuerpos de inclusión Las células descongeladas se resuspendieron en PBS a 10ml de PBS por gramo de peso húmedo de células. Las células se lisaron en un homogeneizador APV 1000 a 703.06 kgf/cm2 (10,000 psi) con tres pasos a través del homogeneizador. El lisado se centrifugó a 8000g durante 30 minutos para granular los cuerpos de inclusión (IB). Los IB se lavaron dos veces resuspendiendo en PBS con TritonX-100 al 1 %. Los IB se lavaron además una vez en urea 8M, Tris-CI 50mM, NaCI 200m, EDTA 1 mM, TritonX-100 al 1 %, pH 8.0, y a continuación en el mismo amortiguador sin TritonX-100 y un lavado final en agua. Los IB lavados se resuspendieron en clorhidrato de guanidina 8M, Tris-CI 50 mM, pH 8.0, NaCI 200 mM, EDTA 1 mM. Los IB solubilizados en guanidina 8M se replegaron por dilución en amortiguador de replegado enfriado (4°C) (Tris-CI 50 mM, Arginina 0.8 M, NaCI 20 mM, EDTA 1 mM, glutationa 2 mM y glutationa oxidada 1 mM, pH 8.0), a una concentración de 100 pg/ml de proteína. El replegado se llevó a cabo a 4°C durante 48 horas. La muestra replegada del ¡nterferón se dializó contra un volumen de 40x de Tris-CI 50 mM, NaCI 50 mM, EDTA 1 mM, se cargó en una columna Q-Sepharose HP (Amersham Biosciences), y se eluyó utilizando un gradiente de NaCI de 50-600 mM. Las fracciones pico se reunieron y dializaron contra Tris-CI 50 mM, NaCI 150 mM. Las muestras para los ensayos se formularon en PBS + BSA al 0.5% a 5 pg/ml y 20 pg/ml y se almacenaron congeladas a -80°C. Las concentraciones de la proteína se determinaron de manera rutinaria mediante el ensayo de BCA utilizando un IFN-alfa estándar, la concentración del cual se ha verificado mediante análisis de los aminoácidos.

III. Ensayos de la actividad A. Ensayo antiviral EMCV-HuH7 A continuación se proporciona un ensayo ejemplar para la actividad antiviral de los polipéptidos del interferón alfa y los conjugados de la invención. El ensayo es un ensayo de dosis-respuesta basado en las células, utilizado para valorar la potencia antiviral de un fármaco, y se refiere algunas veces como el ensayo de "protección del efecto citopático" (o PCPE). Brevemente, las células se incuban con el fármaco y se exponen al virus. En ausencia del fármaco, las células expuestas al virus mueren. Con concentraciones que se incrementan del fármaco, una proporción que se incrementa de células sobrevive. El número de células sobrevivientes puede medirse directamente (por ejemplo, mediante conteos visuales), o indirectamente, estimando la velocidad metabólica. Por ejemplo, pueden utilizarse tintes metabólicos tales como MTT o WST-1 como una medida indirecta de la supervivencia celular. Las células vivas metabolizan tales tintes para formar productos metabólicos, los cuales pueden cuantificarse mediante espectrofotometría (densidad óptica).

Materiales: Células: Células HuH7: Línea celular del hepatoma humano (recibido del Dr. Michael Lai, USC-Departamento de Cirugía, Los Angeles, CA). La línea celular HuH7 se estableció originalmente en el laboratorio del Dr. J. Sato (Escuela de Medicina de la Universidad de Okayama), de un hombre japonés de 57 años con carcinoma hepatocelular bien diferenciado. La línea celular es negativa para el antígeno superficial de la Hepatitis B. Células VERO: Línea celular de riñon de mono verde Africano (ATCC # CCL-81 ) Células L-929: Línea celular del fibroblasto murino (ATCC # CCL-1 ) Virus: Virus de la encefalomiocarditis (EMCV): cepa adaptada al cultivo del tejido (ATCC # VR-129B). Se produjeron de manera interna patrones virales con un alto título, mediante en paso en células VERO Medio completo: Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco No. Cat. 11965-092) Suero bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone No. Cat. SH30071.03) 1 x Penicilina-estreptomicina (PS, Gibco No. Cat. 15140-122) Medio de suero reducido: Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco No. Cat. 1 1965-092) Suero bovino fetal al 2% (FBS, Hyclone No. Cat. SH30071.03) 1 x Penicilina-estreptomicina (PS, Gibco No. Cat. 15140-122) Tripsina/EDTA (Gibco No. Cat. 25300-054) WST-1 (Roche; No. Cat. 1 644 807) Las células HuH7 se mantuvieron en Medio Completo a 37°C en una incubadora con C02 al 5%, humidificada. Las células se recolectaron con tripsina y se dividieron dos veces semanalmente cuando confluyen a una densidad final de 1-2 x 106 células por 25 mi en un matraz T175. Un día antes del ensayo, las células se tripsinizaron y sembraron en nuevos matraces T175 con una densidad de 4.5 x 106 células por 25 mi para asegurar que las células estaban en la fase logarítmica antes del ensayo.

Procedimiento: Un patrón de virus EMCV de alto título se amplificó en células VERO. La concentración letal a la cual 95% de las células murieron (LC95), se determinó mediante una curva de destrucción viral de EMCV en monocapas celulares HuH7. Brevemente, las células HuH7 se emplacaron en el día 1 en placas de microtitulación de 96 pozos a 6x104 células por pozo. Los virus se diluyeron en serie a 1 :3 en DMEM+ FBS al 2% con 10 puntos de dilución y se agregaron a las células en el día dos. Veinticuatro horas postinfección, las células sobrevivientes se determinaron mediante un ensayo de metabolismo de la sal de tetrazolio, WST-1 (Roche). La LC95 determinada para el ensayo de HuH7-EMCV correspondió a un MOI de 0.034 (PFU/célula). El título del patrón del virus se determinó mediante un ensayo en placa estándar en células L929. En el día uno del ensayo, las células HuH7 en fase logarítmica se recolectaron con tripsina, se resuspendieron en Medio de Suero Reducido y se concentraron mediante centrifugación. Los gránulos celulares, que corresponden a 5 matraces T175 de células, se resuspendieron en 10 mi de Medio de Suero Reducido, se filtraron a través de un tamiz celular de Nylon de 40 mieras y se contaron con un hemocitómetro. La viabilidad celular se determinó mediante exclusión con azul de tripan. Las células se resuspendieron en Medio de Suero Reducido a una densidad final de 6x105 células/ml. Se agregaron cien microlitros de las células diluidas a cada pozo de placas de ensayo de 96 pozos (6x104 células/pozo), y las placas se incubaron a 37°C en una incubadora con C02 al 5%, humidificada, durante 4 horas. Las potencias de los interferones alfa de "referencia" y los polipéptidos del ¡nterferón alfa de la invención (también llamados "muestras de prueba"), se determinaron mediante un análisis de respuesta a la dosis. Hubo generalmente una muestra de prueba y un IFN-alfa de referencia por placa, cada uno con tres curvas replicadas de células tratadas con IFN-alfa/desafiadas con EMCV y dos curvas replicadas del tratamiento con IFN-alfa solo. Lo último se ensayó para el control de los efectos antiproliferativos potenciales del IFN-alfa en las células HuH7. Las curvas de dosis-respuesta para los IFN-alfa de referencia, consistieron generalmente de 8 diluciones de tres veces que varían de 100 ng/ml a 0.05 ng/ml. Para las muestras de prueba del IFN-alfa, las diluciones de tres veces variaron generalmente de 5 ng/ml a 0.002 ng/ml. Ocho pozos de cada una de las células tratadas con el virus, pero no con el IFN-alfa y las células solas, también se corrieron como controles. Las diluciones del IFN-alfa se prepararon utilizando Medio de Suero Reducido. Cien microlitos de las preparaciones del IFN-alfa diluido se transfirieron a las placas de ensayo. Las placas de ensayo se incubaron a 37°C en una incubadora con CO2 al 5% humidificada durante 16 horas. En el día dos, las células se desafiaron con el virus EMC. El medio se aspiró de cada pozo de la placa de ensayo. El patrón de EMCV se diluyó a 1 :5400 en DMEM + FBS al 2%. Se agregaron cien microlitos del virus diluido, que corresponden a 0.034 partículas virales por células, a cada pozo. Las células se incubaron con el virus a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%, humidificada, durante 24 horas. En el día tres, el número de células viables en cada pozo, se cuantificó mediante un ensayo con WST-1. El medio se aspiró de cada pozo de la placa de ensayo. El reactivo WST-1 se diluyó a 1 :20 en Medio de Suero Reducido, se agregaron 100 µ? del reactivo WST-1 diluido a cada pozo, y las células se incubaron a 37°C en una incubadora con C02 al 5%, humidificada, durante 60 minutos. El número de células viables en cada pozo se cuantificó midiendo la OD a 450 nm en un lector de placa.

Análisis: La potencia antiviral del IFN-alfa de referencia y las muestras de prueba se calcula con la ecuación: Potencia antiviral =(Células viablesc+?+? - Células viablesc+v)/(Células viablesc+i-Células viablesc+v)*100% en donde C+V=células HuH7 +EMCV, C+I=células HuH7 +IFN-a y C+I+V=células HuH7 +IFN-oc+EMCV Las curvas de dosis-respuesta, se analizaron mediante regresión no lineal utilizando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software Inc.). La siguiente ecuación se utilizó para el ajuste de la curva: „ , (Superior - Fondo) Y = Fondo + j Q „(LogtC50-X)Pendient ,eHui-lul El Fondo es el valor de Y en el plato inferior; Superior es el valor de Y en el plato superior y LogEC50 es el valor de X cuando la respuesta está a la mitad entre Inferior y Superior. Se utilizó el método de Levenberg-Marquardt como el algoritmo de optimización.

B. Ensayo de diferenciación a ?µ1 A continuación se proporciona un ensayo ejemplar para la actividad de diferenciación a TH1 de los polipéptidos de interferón alfa y los conjugados de la invención.

Procedimiento del ensayo: Se recolectaron cubiertas amarillas humanas (25-30 mi) que contienen leucocitos y eritrocitos, preparadas a partir de 500 mi de sangre, del Banco de Sangre de Stanford, el día del inicio del ensayo y se mantuvieron a temperatura ambiente. Cada cubierta amarilla se transfirió cuidadosamente a un matraz T75 y se diluyó a 100 mi con PBS. Para cada cubierta amarilla, se pipetearon 13 mi de Histopaque/Ficoll (Sigma H8889) en cuatro tubos para centrífuga de 50 mi, y 25 mi de la muestra de sangre diluida se colocaron cuidadosamente en la parte superior del Histopaque/Ficoll sin perturbar la interfaz. A continuación, los tubos se centrifugaron (20°C, 2500 rpm) durante 20 minutos. Utilizando pipetas de transferencia de plástico de 3 mi, el plasma superior se retiró de la capa celular mononuclear, seguido por la transferencia de los PBMC a dos tubos cónicos de 50 mi (células de 2 tubos de Histopaque/Ficoll/cubierta amarilla a un tubo). Los PBMC se diluyeron a continuación a 50 ml/tubo con PBS, y se centrifugaron (20°C, 1000 rpm) durante 10 minutos para retirar las plaquetas. Después del retiro del PBS, los PBMC y los RBC restantes, se mezclaron para evitar la agregación. Se agregaron 5 mi de amortiguador de lisis de RBC (amortiguador de cloruro de amonio) y se combinaron dos tubos de células en un tubo. Cada tubo que contiene ahora el aislado total de PBMC y RBC de un donador, se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los coágulos de células sanguíneas potenciales se eliminaron filtrando las células con un tamiz celular (70um, Falcon No. Cat. 2350). Se agregó PBS a un volumen total de 50 mi, seguido por centrifugación (20°C, 1000 rpm) durante 10 minutos. El número de células se contó finalmente utilizando un hemocitómetro. A continuación, una fracción de cada preparación de PBMC se pretiñó y analizó mediante FACS para seleccionar las preparaciones de PBMC con un porcentaje de células ThO sin estimular por encima del 15%. Dos mi de PBMC se tiñeron con 20 µ? de CD45RA antihumano conjugado con FITC (Pharmigen, No. Cat. 555488), 20 µ? de CD4 antihumano conjugado con Cy-cromo (Pharmigen, No. Cat. 555348), 10 µ? de CD8 antihumano conjugado con PE (Pharmigen, No. Cat. 555367), 10 µ? de CD14 antihumano conjugado con PE (Pharmigen, No. Cat.555398) y 10 µ? de CD20 antihumano conjugado con PE (Pharmigen, No. Cat.555623), y se incubaron en hielo durante 45 minutos. Las células se lavaron con PBS, se resuspendieron en 1 mi de PBS y se filtraron con un tamiz celular de 40 µ?? (Falcon, No. Cat. 2340). El porcentaje de células TH0 sin estímulo (positivas a CD4 y CD45RA y negativas a CD8, CD14, CD20) se cuantificó mediante FACS, y las preparaciones de PBMC con más que el 15% de células TH0 sin estimular, se seleccionaron para el ensayo. Las preparaciones seleccionadas de PBMC se tiñeron con 800 µ? de CD45RA antihumano conjugado con FITC, 800 µ? de CD4 antihumano conjugado con Cy-cromo, 500 µ? de CD8 antihumano conjugado con PE, 200 µ? de CD14 antihumano conjugado con PE y 200 µ? de CD20 antihumano conjugado con PE y se incubaron en hielo durante 60 minutos. Las células se lavaron con PBS, se agregó Pl y las células se diluyeron con 20 ml/ml de PBS seguido por filtración con un tamiz celular de 40 µ?t?. Las células se clasificaron mediante FACS, y 1x104 células THO sin estimular (positivas a CD4 y CD45RA, y negativas a CD8, CD14, CD20), se transfirieron mediante MOFLO a cada pozo de placas de 96 pozos con fondo redondo, que contienen 160 µ? de DMEM más Penicilina-estreptomicina más Glutamina 2 mM y Suero Bovino Fetal al 10% (Hyclone No. Cat. SH30071 .03). Se agregaron veinte µ? de expansor de los linfocitos T CD3/CD28 de Dynabeads (Dynal, No. Cat.11 1 .32), a cada pozo. El efecto estimulador de las Dynabeads se calibró antes del experimento para evitar una variación lote a lote. A continuación, 20 µ?/???? de muestras de proteína se agregaron a las placas de ensayo. Generalmente, la variación de la concentración para los estándares de IL-4 e IL-12 (obtenidas de R&D Systems), fueron de 0.04 pg/ml a 10 ng/ml, y las variaciones de la concentración para las muestras de prueba del IFN-alfa y la muestra de referencia del IFN-alfa fueron de 0.76 pg/ml a 200 ng/ml. Las células se incubaron a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%, humidificada, durante 7 días. Los sobrenadante para cada pozo se recolectaron para determinar el grado de expansión a TH1 a través de la cuantificación del contenido del IFN-?, utilizando un ELISA estándar.

Análisis: Respuesta = concentraciones de IFN-? en pg/ml. Se utilizó la siguiente ecuación para el ajuste de la curva: , (Superior - Fondo) Y = Fondo + r™ La variable Fondo es el valor de Y en el plato inferior; Superior es el valor de Y en el plato superior y LogEC50 es el valor de X cuando la respuesta está a la mitad entre Fondo y Superior. Se utilizó el método de Leven berg-Marquardt como el algoritmo de optimización.

C. Ensayo de antiproliferación de Daudi A continuación se proporciona un ensayo ejemplar para la actividad antiproliferativa de los polipéptidos del interferón alfa y los conjugados de la invención.

Mantenimiento de la línea celular: Las células del linfoma de Burkitt de Daudi que crecieron en suspensión, se mantuvieron en matraces de cultivo de tejido T175, que contienen 50 mi de medio de cultivo (RPMI+Suero Bovino Fetal al 10% (FBS, Hyclone No. Cat. SH30071.03) + IxPenicilina-estreptomicina (PS, Gibco No. Cat. 15140-122)+Glutamina 2 mM), a 37°C, en una incubadora con C02 al 5%, humidificada. Las células se dividieron a 1 :10 cuando confluyeron.

Procedimiento del ensayo: Las células de Daudi se centrifugaron y lavaron con 1xPBS. El número de células se ajustó a 105 células/ml. Se agregaron 80 µ? de medio de cultivo a cada pozo en placas de ensayo de 96 pozos de fondo redondo, seguido por la transferencia de 100 µ? de células (104 células/pozo) a cada pozo. Once diluciones del material de referencia del IFN-alfa y las muestras de prueba del IFN-alfa, que varían de 200 ng/ml a 0.2 pg/ml (diluciones de 4 veces), se prepararon en placas de dilución utilizando medio de cultivo. Veinte µ? de las preparaciones diluidas del IFN-alfa se transfirieron a continuación a las placas de ensayo. Las células se incubaron a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%, humidificada. Después de 48 horas, se agregó 1pC¡ de metil-3H timidina (Amersham Pharmacia, No. Cat. TRK758) a cada pozo, seguido por una incubación durante 24 horas a 37°C en una incubadora con C02 al 5%, humidificada. Las células se recolectaron al siguiente día y se determinó la incorporación de la timidina.

Análisis: La EC50 de la referencia y las muestras del IFN-alfa se calculó utilizando la siguiente ecuación: , {Superior - Fondo) I — G??a? + Q(LogECSO-X)Pendienle ill en donde Inferior es el valor de Y en el plato inferior; Superior es el valor de Y en el plato superior y LogEC50 es el valor de X cuando la respuesta está a la mitad entre Inferior y Superior. Se utilizó el método de Levenberg-Marquardt como el algoritmo de optimización.

EJEMPLO 1 Determinación de los residuos accesibles a la superficie de los interferones alfa Exposición superficial de los residuos del interferón 2a humano: Basándose en la 24 estructuras de RMN del interferón alfa humano 2a reportadas por Klaus et al., J. Mol. Biol., 274: 661-675 (1997), se calculó el ASA fraccionada de las cadenas laterales. La numeración de la secuencia utilizada a continuación se basa en la secuencia madura de la proteína del interferón alfa humano 2a (identificada en la presente como la SEQ ID NO:32 +R23K). Nótese que esta estructura contiene dos puentes de disulfuro que involucran a Cys1-Cys98 y Cys29-Cys138, respectivamente. Calculando el ASA y el ASA fraccionado y tomando el promedio de las 24 estructuras, enfocándose en el ASA de las cadenas laterales, se determinó que los siguientes residuos tienen más que el 25% del ASA fraccionada: D2, L3, P4, Q5, T6, H7, S8, L9, G10, R12, R13, M16, A19, Q20, R22, K23, I24, S25, L26, F27, S28, L30, K31 , R33, H34, D35, G37, Q40, E41 , E42, G44, N45, Q46, Q48, K49, A50, E51 , E58, Q61 , Q62, N65, S68, T69, K70, D71 , S73, A74, D77, E78, T79, L80, D82, K83, T86, Y89, Q90, N93, D94, E96, A97, V99, 1100, Q101 , G102, V103, G104, T106, E107, T108, P109, L110, M11 1 , K1 12, E1 13, D114, L1 17, R120, K121 , Q124, R125, T127, L128, K131 , E132, K133, K134, Y135, S136, P137, C138, A145, M148, R149, S152, L153, N156, Q158, E159, S160, L161. R162, S163, K164 y E165, la numeración de la posición es con relación a aquélla de la secuencia del interferón alfa 2a, identificada en la presente como la SEQ ID NO:32+R23K. Se determinó que los siguientes residuos tienen un promedio de más que el 50% del ASA fraccionada de la cadena lateral: D2, L3, P4, Q5, T6, H7, S8, L9, R12, R13, M16, A19, S25, F27, S28, K31 , R33, H34, D35, G37, E41 , G44, N45, Q46, Q48, K49, N65, K70, A74, D77, E78, T79, D82, K83, T86, Y89, Q90, N93, D94, 1100, Q101 , G102, G104, T106, E107, T108, P109, L1 10, E113, D114, L1 17, R120, K121 , Q124, R125, L128, K131 , E132, K134, P137, R149, E159, L161 , R162, S163, K164 y E165, la numeración de la posición es con relación a aquélla de la secuencia del interferón alfa 2a, identificada en la presente, como SEQ ID NO:32+R23K.

Exposición superficial de los residuos que corresponden a la SEQ ID NO:1 : Debido a una inserción de un amino ácido después de la posición 44 de los subtipos del interferón alfa humano 2 - tales como, por ejemplo, interferón alfa 2b (SEQ ID NO:32) e interferón alfa 2a (SEQ ID NO:32 +R23K) - en muchas secuencias del interferón alfa, incluyendo todas las secuencias conocidas del interferón alfa humano (aparte de los subtipos del IFN-alfa 2) y ciertos polipéptidos de la invención, la numeración de la posición de los residuos expuestos a la superficie será desplazada por un residuo más allá de la posición número 44 en, por ejemplo, las secuencias mostradas en la alineación de la Figura 2, con relación a la numeración de la secuencia denotada hlFNalfa 2b (SEQ ID NO:32). Basándose en los análisis anteriores, se considera que las siguientes posiciones, numeradas con relación a la SEQ ID NO:1 , contienen residuos de aminoácidos que tienen más que el 25% del ASA fraccionada: posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31 , 33, 34, 35, 37, 40, 41 , 42, 44, 46, 47, 49, 50, 51 , 52, 59, 62, 63, 66, 69, 70, 71 , 72, 74, 75, 78, 79, 80, 81 , 83, 84, 87, 90, 91 , 94, 95, 97, 98, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110, 1 11 , 1 12, 1 13, 114, 1 15, 1 18, 121 , 122, 125, 126, 128, 129, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 146, 149, 150, 153, 154, 157, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165 y 166. De igual manera, se considera que las siguientes posiciones, numeradas nuevamente con relación a la SEQ ID NO:1 , contienen residuos de aminoácidos que tienen en promedio, más que el 50% del ASA fraccionada en su cadena lateral: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 25, 27, 28, 31 , 33, 34, 35, 37, 41 , 44, 46, 47, 49, 50, 66, 71 , 75, 78, 79, 80, 83, 84, 87, 90, 91 , 94, 95, 101 , 102, 103, 105, 107, 108, 109, 110, 1 11 , 114, 1 15, 118, 121 , 122, 125, 126, 129, 132, 133, 135, 138, 150, 160, 162, 163, 164, 165 y 166.

EJEMPLO 2 Actividades antivirales de los polipéptidos del ¡nterferón alfa Los pacientes con infección crónica con HCV tienen cargas virales iniciales en el intervalo de 104 - 107 copias de ARN HCV/ml. Tras el tratamiento con el IFN-alfa, de manera característica, la carga viral experimenta dos fases logarítmicas lineales distintas de declinación, que reflejan dos mecanismos diferentes (Figura 1 B). La caída inicial en la carga viral ocurre a aproximadamente los primeros dos días y se cree que se debe a la reducción en la velocidad de producción del virus por las células del hígado infectadas, frente a la terapia con IFN-alfa. El mayor desafío técnico con el HCV es que el virus no puede hacerse crecer in vitro y sólo recientemente se ha cultivado en modelos animales viables. Sin embargo, hay virus que se replican in vitro, los cuales se consideran sustitutos útiles para la replicación viral del HCV. Los ensayos sustitutos in vitro que se creen que son predictivos de la actividad viral del HCV in vivo, incluyen el ensayo descrito anteriormente, que mide la capacidad de las moléculas de prueba de proteger las células del efecto citopático de la infección viral, utilizando virus ARN EMC (EMCV) en la línea celular HuH-7 derivada del hígado humano. Las actividades antivirales de algunos polipéptidos del IFN-alfa de la invención, se probaron en el ensayo antiviral con EMCV/HuH-7 descrito en la sección de Materiales y Métodos anterior. Algunos de tales polipéptidos exhibieron actividades antiviral aproximadamente iguales que o mayores que aquéllas de una molécula de referencia, por ejemplo, hulFN-alfa 2b (SEQ ID NO:32) o hulFN-alfa 2a (SEQ ID NO:32+R23K), como se evidencia por la EC50 (la concentración de la muestra que proporciona la mitad de la respuesta protectora máxima en el ensayo) del polipéptido de la invención, que es aproximadamente igual que o menor que la EC50 de la molécula de referencia. Algunos de tales polipéptidos de la invención exhibieron al menos aproximadamente una actividad antiviral 1.5 veces más alta, al menos aproximadamente dos veces más alta, al menos aproximadamente cuatro veces más alta, al menos aproximadamente cinco veces más alta o al menos aproximadamente diez veces más alta que la molécula de referencia (como se evidencia por la EC5o del polipéptido, que es aproximadamente 0.66x o menor, aproximadamente 0.5x o menor, aproximadamente 0.25x o menor, aproximadamente 0.2x o menor o aproximadamente 0.1x o menor que la EC50 de la molécula de referencia, respectivamente). El Cuadro 7 siguiente muestra las actividades antivirales relativas de los polipéptidos de IFN-alfa ejemplares de la invención, en comparación con el IFN-alfa Con1 y el IFN-alfa 2b humano, probados bajo las mismas condiciones, expresadas como la actividad antiviral relativa al hulFN-alfa 2b ( EC50 del hulFN-alfa 2b/EC5o de la muestra ).

CUADRO 7 Actividad Nombre de antiviral con Secuencia la muestra relación a la hulFNa-2b B9x14 SEQ ID NO:3 10 B9x25 SEQ ID O:12 10 SEQ ID NO:3 B9x16 10 + H47Q SEQ ID NO: 12 B9x28 10 + E133K, A140S SEQ ID NO:12 B9x23 10 + H47Q SEQ ID NO:3 B9x18 10 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H SEQ ID NO: 12 B9x22 10 + V51T, F55S, L56V, Y58H SEQ ID NO:3 B9x11 10 + E133 , A140S SEQ ID NO:3 B9x17 10 + V51T, F55S, L56V, Y58H SEQ ID NO:12 B9x27 10 + H47Q, E133K, A140S SEQ ID NO:3 B9x12 10 + H47Q, E133K, A140S SEQ ID NO:12 B9x21 10 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H SEQ ID NO:12 B9x26 + V51T, F55S, L56V, Y58H, E133K, 5 A140S SEQ ID NO:12 B9x24 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H, 5 E133K, A140S SEQ ID NO:3 B9x15 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H, 5 E133K, A140S SEQ ID NO:12 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H, 25Ep05 2.5 N72D, N95D, F154L, K160E, R161 S, R164S IFNa-Con1 SEQ ID NO:43 ~ 2 hulFNa-2b SEQ ID NO:32 1 EJEMPLO 3 Actividades de diferenciación a TH1 de los polipéptidos del interferón alfa Los pacientes con infección crónica con HCV tienen cargas virales iniciales en el intervalo de 104 - 107 copias de ARN HCV/ml. Tras el tratamiento con el IFN-alfa, de manera característica, la carga viral experimenta dos fases logarítmicas lineales distintas de declinación, que reflejan dos mecanismos diferentes (Figuras 1A y 1 B). La caída inicial en la carga viral ocurre a aproximadamente los primeros dos días y se cree que se debe a la reducción en la velocidad de producción del virus por las células del hígado infectadas, en respuesta a la terapia con IFN-alfa. Esto alcanza un nuevo estado estacionario después de aproximadamente dos días, tiempo en el cual, se observa una segunda fase logarítmica lineal, menos rápida, de eliminación viral. Se cree que esta segunda fase se debe a la destrucción de las células del hígado infectadas, por los linfocitos T específicos para el antígeno. Se cree que la terapia con el IFN-alfa juega un papel clave en esta respuesta biológica a través de la estimulación de los linfocitos T específicos para el antígeno, para diferenciarse en células TH1. Sin estar limitado a una teoría particular, se propone que un interferón alfa con una capacidad mejorada para estimular la diferenciación de las células TH0 a las células TH1 , puede exhibir una segunda fase más robusta de eliminación viral y por lo tanto, puede tener una eficacia mejorada en la eliminación viral. Basándose en esta hipótesis de trabajo, se desarrolló un ensayo para medir la actividad de la diferenciación a TH1 de los interferones alfa, en células TH0 sin estímulos, a partir de donadores de sangre. Las actividades de la diferenciación a TH1 de algunos polipéptidos del IFN-alfa de la invención, se probaron como se describió en la sección de Materiales y Métodos anterior. Algunos de tales polipéptidos de la invención exhiben actividades de diferenciación a TH1 aproximadamente iguales a aquélla de una molécula de referencia, por ejemplo, hulFN-alfa 2b (SEQ ID NO:32) o hulFN-alfa 2a (SEQ ID NO:32+R23K), como se evidencia por la EC5o (la concentración de la muestra que proporciona la mitad de la producción máxima del interferón gamma en el ensayo) del polipéptido que es aproximadamente igual a la EC50 de la molécula de referencia. Algunos polipéptidos de la invención exhibieron actividades de diferenciación a TH1 mayores que aquélla de la molécula de referencia, como se evidencia por la EC50 del polipéptido, que es menor que la EC50 de la molécula de referencia.

EJEMPLO 4 Actividades antiproliferativas de los polipéptidos del interferón alfa El IFN-alfa inhibe la proliferación de muchos tipos celulares, aunque los efectos antiproliferativos con frecuencia ocurren a dosis mayores que las requeridas para la respuesta antiviral. Las células de Daudi es una línea de linfocitos B transformados con EVB derivados de humano, que es sensible al IFN-Alfa. Esta línea celular sensible al IFN-Alfa sirve como una sonda útil de los efectos antiproliferativos de los polipéptidos de IFN-Alfa de la invención. Además, se cree que la actividad antiproliferativa del IFN-Alfa en los megacariocitos y los neutrófilos a altas dosis, contribuye a la trombocitopenia y a la neutropenia, respectivamente. El ensayo de antiproliferación de Daudi puede servir como un ensayo sustituto útil para los efectos antiproliferativos en estos otros tipos celulares linfoides. Las actividades antiproliferativas de algunos polipéptidos de IFN-alfa de la invención se probaron como se describe en la sección de Materiales y Métodos anterior. Algunos polipéptidos de la invención exhibieron actividades antiproliferativas aproximadamente iguales a aquélla de una molécula de referencia, tal como hulFN-alfa 2b (SEQ ID NO:32) o hulFN-alfa 2a (SEQ ID NO:32+R23K), como se evidencia por la EC50 (la concentración que proporciona la incorporación media máxima de timidina en el ensayo) del polipéptido que es aproximadamente igual a la EC5o de la molécula de referencia. Algunos polipéptidos de la invención exhibieron actividades antiproliferativas aproximadamente iguales que o mayores que aquélla de la molécula de referencia, como se evidencia por la EC50 del polipéptido, que es aproximadamente igual que o menor que (por ejemplo, aproximadamente 0.75 veces, aproximadamente 0.5 veces o aproximadamente 0.25 veces) la EC50 de la molécula de referencia. Algunos polipéptidos de la invención exhibieron actividades antiproliferativas que son aproximadamente ¡guales que o menores que aquélla de la molécula de referencia, como se evidencia por la EC5o del polipéptido, que es aproximadamente igual que o mayor que la EC50 de la molécula de referencia. Algunos de tales polipéptidos de la invención exhibieron una actividad antiproliferativa aproximadamente de 0.75 veces o menor, aproximadamente de 0.66 veces o menor, aproximadamente de 0.5 veces o menor, aproximadamente de 0.25 veces o menor, aproximadamente de 0.2 veces o menor o aproximadamente de 0.1 veces o menor que aquélla de la molécula de referencia (como se evidencia por la EC50 del polipéptido que es al menos aproximadamente 1.3 veces mayor, al menos aproximadamente 1.5 veces mayor, al menos aproximadamente 2 veces mayor, al menos aproximadamente 4 veces mayor, al menos aproximadamente 5 veces mayor o al menos aproximadamente 10 veces mayor que la EC50 de la molécula de referencia, respectivamente); sin embargo, tales polipéptidos de la invención exhiben una actividad antiproliferativa mensurable. El Cuadro 8 siguiente muestra las actividades antiproliferativas relativas de varios polipéptidos ejemplares de la invención, en comparación con el IFN-alfa 2b humano y el IFN-alfa Con1 probados bajo las mismas condiciones, expresadas como la actividad antiproliferativa relativa al hulFN-alfa 2b ( EC50 del hu IFN-alfa 2b / EC50 de la muestra).

CUADRO 8 Actividad Nombre antiproliferativa de la Secuencia con relación al muestra hulFNa-2b B9x14 SEQ ID NO 3 0.5 B9x25 SEQ ID NO 12 0.5 SEQ ID NO 3 B9x16 0.25 + H47Q SEQ ID NO:12 B9x23 0.5 + H47Q SEQ ID NO:3 B9x18 0.25 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H SEQ ID NO:12 B9x22 0.5 + V51T, F55S, L56V, Y58H SEQ ID NO:3 B9x17 0.5 + V51T, F55S, L56V, Y58H SEQ ID NO:12 B9x27 0.25 + H47Q, E133K, A140S SEQ ID NO:12 B9x21 0.5 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H SEQ ID NO:12 B9x26 + V51T, F55S, L56V, Y58H, E133K, 0.25 A140S SEQ ID NO:12 B9x24 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H, 0.25 E133K, A140S SEQ ID O:3 B9x15 + H47Q, V51T, F55S, L56V, Y58H, 0.25 E133K, A140S IFNa- SEQ ID NO:43 ~ 1.5 Con1 hulFNa- SEQ ID NO:32 1 2b EJEMPLO 5 PEGilación de los polipéptidos del interferón alfa Lo siguiente proporciona algunos procedimientos ejemplares para preparar los conjugados de la invención.

PEGilación con Cys Un polipéptido de la invención que contiene una cisteína libre (tal como, por ejemplo, B9x14CH06 (SEQ ID NO:49), que contiene una cisteína en la posición 164), puede ser PEGilado con cisteína como sigue. El polipéptido se reduce primero parcialmente con una concentración equimolar de TCEP (Triscarboxietilfosfina) a 4°C durante 30 minutos en MES 50 mM, NaCI 100 mM, pH 6.0. El polipéptido reducido se hace reaccionar a continuación con un exceso molar de 4 veces del reactivo mPEG-MAL (con una porción de PEG, tal como una mPEG lineal de 20 kDa o 30 kDa, o un mPEG2 ramificado de 40 kDa) durante 1 h a 4°C, bajo las mismas condiciones. La mezcla de reacción PEGilada se carga a una columna de SP-Sepharose HP equilibrada con MES 50mM, pH 6.0, NaCI 100mM. Después de un paso de lavado con 10 CV (volumen de la columna) se aplica un gradiente de NaCL de 0-600 mM, para fraccionar las fracciones PEGiladas y no PEGiladas. Las fracciones se recolectan y las alícuotas se analizan mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contienen las especies monoPEGiladas se reúnen y formulan para los ensayos para la actividad del inferieron alfa, como se describió anteriormente.

PEGilación con Lvs La PEGilación con lisina puede lograrse utilizando un procedimiento basado en aquél descrito por Foser et al. (2003) Protein Expression & Purification 30:78-87. Brevemente, el polipéptido se hace reaccionar con un reactivo mPEG-NHS (tal como un mPEG lineal de 20 kDa o 30 kDa, o un mPEG2 ramificado de 40 kDa) a una relación molar de 1 :3 de polipéptido:PEG en amortiguador de borato 50 mM, pH 9.0, durante 2 horas a 4°C. Los conjugados se aislan mediante cromatografía por intercambio de cationes, utilizando SP-Sepharose HP. Las fracciones que contienen las especies monoPEGiladas se reúnen y formulan para los ensayos de la actividad del interferón alfa, como se describió anteriormente y pueden caracterizarse además, mediante el análisis de los aminoácidos y/o con espectrometría de masas MALDI-TOF.

PEGilación N terminal La PEGilación N terminal con mPEG-butiraldehído o mPEG-NHS (cualquiera de los cuales tiene una porción de PEG tal como un mPEG lineal de 20 kDa o 30 kDa o un mPEG2 ramificado de 40 kDa) se realiza a 4°C utilizando un exceso molar de 5 veces de reactivo de PEG:polipéptido durante 4-8 hora, en MES 50 mM, pH 5.5, NaCI 100 mM o en acetato de sodio 50 mM, pH 5.5, NaCI 100 mM. La reacción con el mPEG-butiraldehído también contiene cianoborohidruro de sodio 20 mM. Los conjugados se aislan mediante cromatografía sobre una columna de SP-Sepharose HP equilibrada en MES 50 mM pH 5.5, NaCI 100 mM, utilizando un gradiente de NaCI de 100-600 mM en MES 50mM pH 5.5. Las fracciones que contienen las especies monoPEGiladas se reúnen y formulan para los ensayos para la actividad del interferón alfa, como se describió anteriormente.

EJEMPLO 6 Ensayos In Vivo Medición de la vida media de un polipéptido o conjugado de la invención La medición de la vida media en suero o biológica puede llevarse a cabo de varias maneras descritas en la literatura. Por ejemplo, la vida media biológica puede determinarse utilizando un método de ELISA para detectar los niveles en suero del interferón alfa después de, por ejemplo, la administración subcutánea o intramuscular. El uso de un método de ELISA para determinar la farmacocinética del interferón alfa administrado subcutáneamente, se describe, por ejemplo, por Rostaing et al. (1998), J. Am. Soc. Nephrol. 9(12): 2344-48. Merimsky et al. (1991 ), Cáncer Chemother. Pharmacol. 27(5); 406-8, que describen la determinación del nivel en suero de un interferón alfa administrado ¡ntramuscularmente.

Determinación de la ¡nmunoqenicidad in vitro La ¡nmunogenicidad reducida de un polipéptido o conjugado de la invención puede determinarse mediante el uso de un método de ELISA que mida la inmunorreactividad de la molécula con relación a la molécula o preparación de referencia, típicamente, una proteína de interferón alfa conocida. El método de ELISA se basa en los anticuerpos de los pacientes tratados con la proteína de referencia. Se considera que la ¡nmunogenicidad es reducida cuando el polipéptido o conjugado de la invención tiene una respuesta menor estadísticamente significativa en el ensayo que la molécula o preparación de referencia. Aunque la invención se ha descrito con algunos detalles para el propósito de claridad y entendimiento, estará claro para alguien con experiencia en la técnica a partir de la lectura de esta descripción que pueden hacerse varios cambios en la forma y los detalles, sin apartarse del verdadero alcance de la invención. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas en la presente, son para propósitos ilustrativos únicamente y que varias modificaciones y cambios a la luz de los mismos, se sugerirán a las personas con experiencia en la técnica y deben incluirse dentro del espíritu y sustancia de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Por ejemplo, todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente pueden utilizarse en varias combinaciones. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y/u otros documentos citados en esta solicitud, se incorporan en la presente como referencia en su totalidad, para todos los propósitos, al mismo grado en que cada publicación, patente, solicitud de patente y/u otro documento individual, estuviera indicado como que está incorporado en la presente en su totalidad, como referencia, para todos los propósitos, de manera individual.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> axygen, inc. <120> Polipéptidos y Conjugados del interferón <130> 0269wo310 <150> US 60/502,560 <151> 2003-09-12 <150> US 60/427,612 <151> 2002-11-18 <160> 104 <170> FastSEQ para Windows versión 4.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> IFNalfa B9xll <400> 1 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg He Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Arg Phe pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn H S Phe 35 40 45 Gln Lys val Gln Ala He Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr He Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys val Met Gln Glu val Gly val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn val ASP ser lie Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr ser Pro Cys ser Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe ser Phe ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> secuencia artifi 220> 223> IFNalfa B9xl2 <400> 2 Cys Asp Leu Pro Gln Thr H s Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys val Gln Ala lie Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr 50 55 60 Phe ?5? Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr He Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala cys val Met Gln Glu val Gly val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn val Asp Ser lie Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg He Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr ser Pro cys ser Trp Glu val val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Phe ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial B9xl4 <220> <223> IFNalfa <400> 3 cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg H s Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Hi S Phe 35 40 45 Gln Lys val Gln Ala lie Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr He Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn ASP Leu 85 90 95 Glu Ala cys val Met Gln Glu val Gly val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn val Asp ser He Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser pro cys Ala Trp Glu Val val 130 135 140 Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Phe ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 4 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9xl5 <400> 4 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly H s Arg Arg Thr Met Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg He ser Leu Phe ser cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg HIS Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala lie Ser val Phe HÍS Glu Met Met Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr He Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala cys val Met Gln Glu val Gly val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn val ASp Ser lie Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg He Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val val 130 135 140 Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 5 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9xl6 <400> 5 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys val Gln Ala He Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Th 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr He Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys val Met Gln Glu val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Val Asp Ser He Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg He Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro cys Ala Trp Glu val val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 6 <211> 166 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9xl7 <400> 6 cys Asp Leu Pro Gln Thr H s ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn HIS phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala He Ser val Phe His Glu Met Met Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn al Asp ser lie Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu al Val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Phe Se Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 7 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artifi c al <220> <223> 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ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360 aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420 tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480 agattaagga ggaaggaa 498 <210> 21 <211> 498 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia codificante iFNalfa B9xl7 <400> 21 tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60 atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120 gaggagtttg atggcaacca cttccagaag actcaagcta tctctgtctt ccatgagatg 180 atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240 ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300 atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360 aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420 tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480 agattaagga ggaaggaa 498 <210> 22 <211> 498 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia codificante iFNalfa B9xl8 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ccatgagctg 180 atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240 ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300 atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360 aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacaaaga agaaatacag cccttgttcc 420 tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480 agattaagga ggaaggaa 498 <210> 27 <211> 498 <212> ADN <213> Secuencia art ficial <220> <223> Secuencia codificante IFNalfa B9x25 <400> 27 tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60 atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120 gaggagtttg atggccacca cttccagaag gttcaagcca tcttccttct ctatgagctg 180 atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240 ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300 atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360 aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420 tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480 agattaagga ggaaggaa 498 <210> 28 <211> 498 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> secuencia codificante IFNalfa B9x26 <400> 28 tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60 atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120 gaggagtttg atggccacca cttccagaag actcaagcca tctctgtcct ccatgagctg 180 atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240 ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300 atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360 aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacaaaga agaaatacag cccttgttcc 420 tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480 agattaagga ggaaggaa 498 <210> 29 <211> 498 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> Secuencia codificante IFNalfa B9x27 <400> 29 tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60 atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120 gaggagtttg atggccacca gttccagaag gttcaagcca tcttccttct ctatgagctg 180 atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240 ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300 atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360 aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacaaaga agaaatacag cccttgttcc 420 tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480 agattaagga ggaaggaa 498 <210> 30 <211> 498 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia codificante IFNalfa E?9x28 <400> 30 tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60 atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120 gaggagtttg atggccacca cttccagaag gttcaagcca tcttccttct ctatgagctg 180 atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240 ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300 atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360 aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacaaaga agaaatacag cccttgttcc 420 tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480 agattaagga ggaaggaa 498 <210> 31 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> hulFN alfa-la maduro <400> 31 Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg lie Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30 Arg HÍS Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Al ro Ala He Ser Val Leu His Glu Leu lie Gln Gln He 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala cys val Met Gln Glu Glu Arg val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Ala ASp Ser He Leu Ala val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu val Val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu 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135 140 Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 92 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9x25Ep06 <400> 92 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly HIS Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu He Gln Gln Thr 50 55 60 phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala cys val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu He Ala Leu Met 100 105 110 Asn Glu ASP Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu val val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 93 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia arti icial <220> <223> IFNalfa B9x25Ep07 <400> 93 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg He Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val lie Gln Glu Val Gly Val Glu Glu He Ala Leu Met 100 105 110 Asn val Asp Ser lie Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg He Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 94 <211> 166 <212> P T <213> Secuencia artific al <220> <223> IFNalfa B9x25Ep08 <400> 94 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu ser Asn Arg Arg 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Phe Asp Gly HÍS H S Phe 35 40 45 Gln Lys val Gln Ala He Phe Leu Leu Tyr Glu Leu lie Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys he Tyr He Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala Cys val He Gln Glu val Gly val Glu Glu He Ala Leu Met 100 105 110 Asn Val Asp Ser ile Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg He Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe ser Leu ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 96 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9x25Epll <400> 96 Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe 35 40 45 Gln Lys Val Gln Ala lie Phe Leu Leu Tyr Glu Leu lie Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala cys Val lie Gln Glu Val Gly Val Glu Glu lie Ala Leu Met 100 105 110 Asn Val Asp Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 97 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9x25Epl2 <400> 97 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg lie Ser Pro Phe ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe 35 40 45 Gln Lys val Gln Ala lie Phe Leu Leu Tyr Glu Leu lie Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala Cys val lie Gln Glu val Gly val Glu Glu lie Ala Leu Met 100 105 110 Asn val Asp Ser He Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser pro cys Ala Trp Glu val val 130 135 140 Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg ser Lys Glu 165 <210> 98 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9x25Epl3 <400> 98 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 lie Met Ala Gln Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg H s Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His H S Phe 35 40 45 Gln Lys val Gln Ala lie Phe Leu Leu Tyr Glu Leu lie Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val lie Gln Glu val Gly val Glu Glu He Ala Leu Met 100 105 110 Asn val ASp Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu val val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 99 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9x25Epl4 <400> 99 Cys Asn Leu Ser Gln Thr His ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg lie ser Pro Phe ser cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe 35 40 45 Gln Lys val Gln Ala He Phe Leu Leu Tyr Glu Leu He Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe ser Thr Lys Asp ser ser Ala Ala Trp ASp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr He Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala cys val He Gln Glu val Gly val Glu Glu He Ala Leu Met 100 105 110 Asn val Asp Ser He Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg He Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu val val 130 135 140 Arg Ala Glu He Met Arg ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 ser Leu Arg ser Lys Glu 165 <210> 100 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> iFNalfa B9x25Epl5 <400> 100 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg He Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly H S Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala He Ser val Leu His Glu Leu lie Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala Cys val lie Gln Glu val Gly Val Glu Glu lie Ala Leu Met 100 105 110 Asn val ASp Ser lie Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu val Val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Leu ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 101 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9x25Epl6 <400> 101 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 lie Met Ala Gln Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly H s Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala He Ser val Leu His Glu Leu ríe Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser ser Ala Ala Trp ASp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr He Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala cys val lie Gln Glu Val Gly val Glu Glu ríe Ala Leu Met 100 105 110 Asn val ASp ser lie Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro cys Ala Trp Glu val Val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg ser Phe ser Leu ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 102 <211> 166 <212> P T <213> Secuencia artificial <220> <223> iFNalfa B9x25Epl7 <400> 102 Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg He Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys ASp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu ríe Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala cys val lie Gln Glu Val Gly Val Glu Glu lie Ala Leu Met 100 105 110 Asn val Asp Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg ríe Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr ser Pro Cys Ala Trp Glu val val 130 135 140 Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 103 <211> 166 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9x25EFl <400> 103 cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 lie Met Ala Gln Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly HÍS Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala He Ser Val Leu His Glu Met r e Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys val Thr Gln Glu val Gly val Glu Glu lie Ala Leu Met 100 105 110 Asn Glu Asp Ser lie Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lie Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser pro Cys Ala Trp Glu Val val 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg ser Lys Glu 165 <210> 104 <211> 166 <212> RT <213> Secuencia artificial <220> <223> IFNalfa B9x25EF2 <400> 104 Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg He Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala lie Ser Val Leu HÍS Glu Met lie Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu val Gly Val Glu Glu lie Ala Leu Met 100 105 110 Asn Glu Asp Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg He Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu val Val 130 135 140 Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia que difiere en 0 a 16 posiciones de los aminoácidos de una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:1 1 , SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, y SEQ ID NO:15, polipéptido el cual exhibe una actividad antiviral.

2.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:3 en 0 a 16 posiciones de los aminoácidos.

3.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:3 en 0 a 8 posiciones de los aminoácidos.

4. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:12 en 0 a 16 posiciones de los aminoácidos.

5. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende una secuencia que difiere de la SEQ ID ??. 2 en 0 a 8 posiciones de los aminoácidos.

6. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la actividad antiviral del polipéptido es igual que o mayor que la actividad antiviral del hulFN-alfa 2b o el hulFN-alfa 2a.

7. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la actividad antiviral del polipéptido es al menos dos veces mayor que la actividad antiviral del hulFN-alfa 2b o el hulFN-alfa 2a.

8. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polipéptido exhibe una relación de actividad antiviral/actividad antiproliferativa al menos dos veces mayor que la relación de la actividad antiviral/actividad antiproliferativa exhibida por el hulFN-alfa 2b o el hulFN-alfa 2a.

9. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el polipéptido exhibe una relación de la actividad antiviral/actividad antiproliferativa al menos cuatro veces mayor que la relación de la actividad antiviral/actividad antiproliferativa exhibida por el hulFN-alfa 2b o el hulFN-alfa 2a.

10. - Un conjugado que comprende (a) el polipéptido que se reclama en la reivindicación 1 ; y (b) una porción no polipeptídica unida covalentemente a un grupo de unión del polipéptido.

11 . - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque que comprende al menos dos porciones no polipeptídicas.

12. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende una porción no polipeptídica unida covalentemente a un residuo de cisterna.

13. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende una porción no polipeptídica unida covalentemente a un residuo de lisina o al grupo amino N terminal.

14. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende una porción no polipeptídica unida covalentemente a un residuo de lisina.

15.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque que comprende una porción no polipeptídica unida al grupo amino N terminal.

16. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende una porción no polipeptídica unida a un residuo de lisina y una porción no polipeptídica unida al grupo amino N terminal.

17. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la porción no polipeptídica es un polímero.

18. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el polímero es un polietilenglicol.

19. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la porción no polipeptídica es un azúcar.

20. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el azúcar está unido a un sitio de N glucosilación.

21. - Una composición que comprende el polipéptido que se reclama en la reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

22. - Una composición que comprende el conjugado que se reclama en la reivindicación 10 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

23. - Un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido que se reclama en la reivindicación 1.

24. - Una célula hospedera que comprende el ácido nucleico que se reclama en la reivindicación 23.

25. - Un vector que comprende el ácido nucleico que se reclama en la reivindicación 23.

26.- El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el vector comprende un plásmido, un cósmido, un fago, un virus o un fragmento de un virus.

27. - El vector de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque es un vector de expresión que comprende el ácido nucleico enlazado de manera operativa a un promotor.

28. - Una célula hospedera que comprende el vector que se reclama en la reivindicación 27.

29. - Una composición que comprende el ácido nucleico que se reclama en la reivindicación 23 y un excipiente.

30. - Un método para preparar el polipéptido que se reclama en la reivindicación 1 , el método comprende: proporcionar un cultivo que comprende una célula hospedera, la célula hospedera comprende un vector de expresión que comprende un promotor enlazado de manera operativa a un ácido nucleico, el ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido, cultivar el cultivo bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido y la recuperación del polipéptido.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la célula hospedera es una célula hospedera glucosilante o una célula hospedera bacteriana.

32. - Un método para preparar un conjugado, el método comprende (i) proporcionar el polipéptido que se reclama en la reivindicación 1 y (ii) unir al menos una porción no polipeptídica a un grupo de unión del polipéptido, en donde el conjugado resultante exhibe una actividad antiviral.

33. - El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el paso de proporcionar el polipéptido comprende: proporcionar un cultivo que comprende una célula hospedera, la célula hospedera comprende un vector de expresión que comprende un promotor enlazado de manera operativa a un ácido nucleico, el ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido, cultivar el cultivo bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido.

34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque la célula hospedera es una célula hospedera glucosilante o una célula hospedera bacteriana.

35. - Un método para inhibir la replicacion de un virus en células infectadas con el virus, el método comprende: administrar a las células una cantidad del polipéptido que se reclama en la reivindicación 1 o el conjugado que se reclama en la reivindicación 10, efectiva para inhibir la replicacion del virus en las células, inhibiendo por lo tanto la replicacion del virus en dichas células.

36. - Un método para reducir el número de copias de un virus en células infectadas con el virus, el método comprende: administrar a las células una cantidad del polipéptido que se reclama en la reivindicación 1 o el conjugado que se reclama en la reivindicación 10, efectiva para reducir el número de copias del virus en las células, reduciendo por lo tanto el número de copias del virus en dichas células.

37. - El polipéptido que se reclama en la reivindicación 1 o el conjugado que se reclama en la reivindicación 10, para su uso como un medicamento.

38. - El uso del polipéptido que se reclama en la reivindicación 1 o el conjugado que se reclama en la reivindicación 10, para la fabricación de un medicamento para inhibir la replicación de un virus en las células infectadas con el virus.

39. - El uso del polipéptido que se reclama en la reivindicación 1 o el conjugado que se reclama en la reivindicación 10, para la fabricación de un medicamento para reducir el número de copias de un virus en células infectadas con el virus.

40. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 38 y 39, en donde el virus es HCV o HBV.