JP2006506097A - インターフェロン−αのポリペプチドおよび結合体 - Google Patents

インターフェロン−αのポリペプチドおよび結合体 Download PDF

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Abstract

本発明は、インターフェロン−αポリペプチドおよび結合体、ならびに、このポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、これらのポリペプチド、結合体、および核酸を含む組成物；このポリペプチド、結合体、および核酸を含むか、または、このポリペプチド、結合体、および核酸を発現する細胞；このポリペプチド、結合体、および核酸の作製方法；ならびに、このポリペプチド、結合体、および核酸の使用方法を提供する。

Description

（関連する出願に対する相互参照）
米国特許法第１１９条（ｅ）に従って、本出願は、米国仮特許出願第６０／５０２，５６０号（２００３年９月１２日出願）および米国仮特許出願第６０／４２７，６１２号（２００２年１１月１８日出願）（この開示の各々は、本明細書中であらゆる目的のためにその全体が参考として援用される）の利益を主張する。
（著作権の通知）
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．７１（ｅ）によって、出願人は、この開示の一部が、著作権保護の対象となる材料を含むことを注記する。著作権者は、その複製が特許庁の特許ファイルまたは記録に現れる場合は、特許文書または特許開示の何者かによる複製に意義を唱えないが、そうでなければ、どんなものであれ全ての著作権を保有する。
（発明の分野）
本発明は一般に、ポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、ポリペプチドの結合体ならびにベクター、細胞、抗体に関し、そしてこのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および結合体を使用する方法ならびに製造するための方法に関する。
（発明の背景）
インターフェロン−αは、サイトカイン遺伝子の多様ならせん状バンドルスーパーファミリーのメンバーである（Ｓｐｒａｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：８１５−８２７）。ヒトインターフェロン−αは、アミノ酸レベルで８５〜９８％配列同一性を共有する、２０を超える直列複製非対立遺伝子のファミリーによりコードされる（Ｈｅｎｃｏ，Ｋ．ら（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８５：２２７−２６０）。活性インターフェロン−αタンパク質を発現する遺伝子は、遺伝子座により１３ファミリーに分類されている。公知の発現されたヒトインターフェロン−αタンパク質およびその対立遺伝子改変物（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、表にされる（Ａｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１６：１８１−１８４）。
インターフェロン−αは、種々の型の細胞増殖を阻害することが示されており、そして癌（特に、白血病のような血液学的悪性腫瘍）と頻繁に関連する、種々の細胞増殖障害の処置のために特に有用である。これらのタンパク質は、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、低悪性度リンパ腫、カポージ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、膀胱腫瘍および卵巣癌に対して抗増殖活性を示した（Ｂｏｎｎｅｍ，Ｅ．Ｍ．ら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ３：５８０；Ｏｌｄｈａｍ，Ｒ．Ｋ．（１９８５）Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０：７１）。
インターフェロン−αはまた、種々の型のウイルス感染に対して有用である（Ｆｉｎｔｅｒ，Ｎ．Ｂ．ら（１９９１）Ｄｒｕｇｓ ４２（５）：７４９）。インターフェロン−αは、ヒトパピローマウイルス感染、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の感染に対して活性を有する（Ｆｉｎｔｅｒ，Ｎ．Ｂ．ら，１９９１，前出；Ｋａｓｈｉｍａ，Ｈ．ら（１９８８）Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ ９８：３３４；Ｄｕｓｈｅｉｋｏ，Ｇ．Ｍ．ら（１９８６）Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３（補遺２）：Ｓ１９９；Ｄａｖｉｓ，ＧＬら（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：１５０１）。特定の自己免疫疾患および炎症性疾患の病因学におけるインターフェロンおよびインターフェロンレセプターの役割も研究されている（Ｂｅｎｏｉｔ，Ｐ．ら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（３）：７０７）。
これらのタンパク質は、多くの疾患の処置における治療的価値を保有するが、これらは、医薬品としての用途に最適化されてきた。例えば、容量限定毒性、レセプター交差反応性および血清の短い半減期は、これらのサイトカインの多くの臨床的有用性を有意に減少させる（Ｄｕｓｈｅｉｋｏ，Ｇ．（１９９７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６：１１２Ｓ−１２１Ｓ；Ｖｉａｌ，Ｔ．およびＤｅｓｃｏｔｅｓ，Ｊ．（１９９４）Ｄｒｕｇ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ １０：１１５−１５０；Ｆｕｎｋｅ，Ｉ．ら（１９９４）Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：４９−５２；Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ，Ａ．ら（１９９３）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１９：７４５−７５５）。インターフェロン投与に伴う多様かつ重篤な副作用プロフィールとしては、インフルエンザ様症状、疲労、幻覚を含む神経性障害、発熱、肝臓酵素上昇および白血球減少症が挙げられる（Ｐｏｎｔｚｅｒ，Ｃ．Ｈ．ら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：５３０４；Ｏｌｄｈａｍ，１９８５，前出）。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非常に高い複製率を有する非宿主統合型ＲＮＡウイルスであり、そのため広範な遺伝的多様性に関連する。ＨＣＶ ＲＮＡの少なくとも６つの遺伝子型および３０以上のサブタイプが、同定されている。ＨＣＶ遺伝子型は、ＩＦＮ−α治療に対する応答の予測変数として示されている。ＨＣＶ遺伝子型２およびＨＣＶ遺伝子型３により感染した患者は、一般にインターフェロン治療に対してよく応答することが見出されている。遺伝子型４、遺伝子型５および遺伝子型６に感染した患者は、あまり良く応答しない傾向がある。ＨＣＶ遺伝子型１に感染した患者は、ＩＦＮ−α治療に対して非常に乏しい応答をする傾向がある（遺伝子型１の患者の約５０％は、インターフェロン治療に対して「非応答者」として分類される）。遺伝子型１は、現在最も優勢な形態のＣ型肝炎ウイルスであり、米国における患者のおよそ７０％およびヨーロッパにおける患者の５０％が感染している。明らかに、ＨＣＶ感染、特に遺伝子１の変種のための、より効果的な治療法に対する差し迫った必要性が存在する。
遺伝子型１ＨＣＶ（および他のサブタイプ）は、重要なＩＦＮ応答性タンパク質（例えば、ｄｓＲＮＡ活性化セリン／スレオニンプロテインキナーゼＰＫＲ）を阻害することにより、ＩＦＮ−αシグナル伝達経路を活発に減衰させるという遺伝学的証拠および生化学的証拠が存在する（Ｋａｔｚｅ Ｍ．Ｇ．ら（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（９）：６７５−６８７）。おそらくこの遺伝的多様性および抗ウイルス応答の積極的な阻害の結果として、ＨＣＶ（特に遺伝子型１）は、宿主の免疫監視機構から逃れ、高確率の慢性感染症を導く能力を有する。ＨＣＶのこの広範な遺伝子変異性は、診断上かつ臨床上の重要な意味を有し、臨床経過における変動、ワクチン開発の困難性、および治療に対する応答の欠如の潜在的な原因となる。
本発明は、増強された抗ウイルス効力および／または免疫調整効力を示すインターフェロン−α分子の必要性に取り込む。本発明は、新規のインターフェロン−αポリペプチドおよびポリペプチド結合体、このポリペプチドをコードする核酸、ならびにこのような分子を使用する方法を提供する。このような分子は、種々の用途において有益な用途を有する分子であり、この用途は、例えば、治療療法および予防療法、特にＨＣＶのようなウイルス感染のための治療療法および予防療法を含む。本発明は、様々な要求を満たす。
（発明の要旨）
本発明は、改変体および融合ポリペプチドを含む新規ポリペプチドを提供する。本発明はまた、１以上の非ポリペプチド部分に共有結合される本発明のポリペプチドを含む結合体も提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドのいずれかをコードする核酸、ならびにこのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、このようなポリペプチド、結合体、および核酸の作製の方法ならびに使用の方法を提供し、そしてさらなる再調査より明らかな他の特徴を提供する。
１つの局面において、本発明は、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、
Figure 2006506097
 の１つとして同定された配列を含む。
本発明はまた、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、これらの各々は、例えば、配列番号１〜１５、配列番号４７、または配列番号５３（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）の１つのような配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４の１つと、０〜１６アミノ酸位（例えば、０〜１４アミノ酸位において、０〜１２アミノ酸位、０〜１０アミノ酸位、０〜８アミノ酸位、０〜６アミノ酸位、０〜５アミノ酸位、０〜４アミノ酸位、０〜３アミノ酸位、０〜２アミノ酸位、または０〜１アミノ酸位）（例えば、０アミノ酸位、１アミノ酸位、２アミノ酸位、３アミノ酸位、４アミノ酸位、５アミノ酸位、６アミノ酸位、７アミノ酸位、８アミノ酸位、９アミノ酸位、１０アミノ酸位、１１アミノ酸位、１２アミノ酸位、１３アミノ酸位、１４アミノ酸位、１５アミノ酸位または１６アミノ酸位）異なる配列を含む。ある例において、このポリペプチドは、インターフェロン−α活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。ある例において、このポリペプチド配列は、配列番号１〜１５、配列番号４７または配列番号５３のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３のうちの１つ）に関連する、４７位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、６０位、６１位、６４位、６９位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、９０位、９３位、１３３位、１４０位、１５４位、１６０位、１６１位、および１６２位の１以上の位置での置換を含む。ある例において、このポリペプチド配列は、４７位のＨｉｓまたはＧｌｎ；５１位のＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；５２位のＧｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；５３位のＡｌａまたはＴｈｒ；５５位のＰｈｅ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ；５６位のＬｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａ；５７位のＰｈｅまたはＬｅｕ；５８位のＴｙｒまたはＨｉｓ；６０位のＭｅｔ、ＬｅｕまたはＶａｌ；６１位のＭｅｔまたはＩｌｅ；６４位のＴｈｒまたはＩｌｅ；６９位のＳｅｒまたＴｈｒ；７１位のＬｙｓまたはＧｌｕ；７２位のＡｓｎまたはＡｓｐ；７５位のＡｌａまたはＶａｌ；７６位のＡｌａまたはＴｈｒ；７７位のＴｒｐまたはＬｅｕ；７８位のＡｓｐまたはＧｌｕ；７９位のＧｌｕまたはＧｌｎ；８０位のＴｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇ；８３位のＧｌｕおよびＡｓｐ；８４位のＬｙｓまたはＧｌｕ；８５位のＰｈｅまたはＬｅｕ；８６位のＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；８７位のＩｌｅまたはＴｈｒ；９０位のＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；９３位のＭｅｔまたはＬｅｕ；１３３位のＬｙｓまたはＧｌｕ；１４０位のＳｅｒまたはＡｌａ；１５４位のＰｈｅまたはＬｅｕ；１６０位のＬｙｓまたはＧｌｕ；１６１位のＡｒｇまたはＳｅｒ；ならびに１６２位のＡｒｇまたはＳｅｒのうちの１以上を含む（位置の番号付けは、配列番号１の番号に関連する）。いくつかの例において、このポリペプチド配列は、１以上のＨｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３、およびＳｅｒ１４０を含む（位置の番号付けは、配列番号１の番号に関連する）。いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４を含む。本発明はまた、これらポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする核酸のいずれかを含む融合タンパク質および結合体、ならびにこのようなポリペプチドの作製の方法を提供する。
本発明のいくつかのポリペプチドは、１以上の置換を含み、この置換は、
Figure 2006506097
 から選択される置換を含むが、これらに限定されない。
本発明のいくつかのポリペプチドは、１以上の置換を含み、この置換は、
Figure 2006506097
 から選択される置換を含むが、これらに限定されない。
本発明のいくつかのポリペプチドは、異なるアミノ酸残基についての１以上のアミノ酸残基の置換、またはアミノ酸残基の１以上の欠失を含み、この欠失は、１以上のリジン（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）のような、本発明の任意のポリペプチドに由来する例えば、Ｋ３１、Ｋ５０、Ｋ７１、Ｋ８４、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０、および／またはＫ１６５（配列番号１に関連する））を除去する。この除去されるべき１以上のリジン残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得、Ａｒｇ（Ｒ）またはＧｌｎ（Ｑ）と置換されるかまたは、除去され得る。
本発明のいくつかのポリペプチドは、異なるアミノ酸残基についてアミノ酸残基の１以上の置換を含むか、またはアミノ酸残基の１以上の欠失を含み、この欠失は、１以上のヒスチジン（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）のような、本発明の任意のポリペプチドに由来する例えば、Ｈ７、Ｈ１１、Ｈ３４および／またはＨ４７（配列番号１に関連する））を除去する。除去されるべき１以上のヒスチジン残基は、任意の他のアミノ酸と置換され得、Ａｒｇ（Ｒ）またはＧｌｎ（Ｑ）と置換され得るか、または除去され得る。
本発明のいくつかのポリペプチドは、１以上の置換を含み、この置換は、
Figure 2006506097
 から選択される置換を含むが、これらに限定されない。
本発明はまた、上記のポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする核酸のいずれかを含む融合タンパク質および結合体、ならびにこのようなポリペプチドの作製方法および使用方法を提供する。
別の局面では、本発明は、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、これらの各々は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３のうちの１つの）に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。いくつかのこのようなポリペプチドは、インターフェロン−α活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。いくつかの例では、この配列は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３に対して少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。いくつかの例では、このポリペプチド配列は、例えば、配列番号１〜１５のうちの１つと比較して、４７位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、６０位、６１位、６４位、６９位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、９０位、９３位、１３３位、１４０位、１５４位、１６０位、１６１位および１６２位のうちの１つ以上において置換を含む。いくつかの例では、このポリペプチド配列は、以下のうちの１以上を含む：４７位でのＨｉｓまたはＧｌｎ；５１位でのＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；５２位でのＧｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；５３位でのＡｌａまたはＴｈｒ；５５位でのＰｈｅ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ；５６位でのＬｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａ；５７位でのＰｈｅまたはＬｅｕ；５８位でのＴｙｒまたはＨｉｓ；６０位でのＭｅｔ、ＬｅｕまたはＶａｌ；６１位でのＭｅｔまたはＩｌｅ；６４位でのＴｈｒまたはＩｌｅ；６９位でのＳｅｒまたはＴｈｒ；７１位でのＬｙｓまたはＧｌｕ；７２位でのＡｓｎまたはＡｓｐ；７５位でのＡｌａまたはＶａｌ；７６位でのＡｌａまたはＴｈｒ；７７位でのＴｒｐまたはＬｅｕ；７８位でのＡｓｐまたはＧｌｕ；７９位でのＧｌｕまたはＧｌｎ；８０位でのＴｈｒ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｒｇ；８３位でのＧｌｕまたはＡｓｐ；８４位でのＬｙｓまたはＧｌｕ；８５位でのＰｈｅまたはＬｅｕ；８６位でのＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；８７位でのＩｌｅまたはＴｈｒ；９０位でのＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；９３位でのＭｅｔまたはＬｅｕ；１３３位でのＬｙｓまたはＧｌｕ；１４０位でのＳｅｒまたはＡｌａ；１５４位でのＰｈｅまたはＬｅｕ；１６０位でのＬｙｓまたはＧｌｕ；１６１位でのＡｒｇまたはＳｅｒ；および１６２位でのＡｒｇまたはＳｅｒ（位置は、配列番号１の位置に対して番号付けられる）。いくつかの例では、このポリペプチド配列は、Ｈｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３、およびＳｅｒ１４０のうちの１以上を含み、この位置は、配列番号１に対して番号付けられる。いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４から選択される配列を含む。本発明はまた、上記のポリペプチドのうちのいずれかを含む、融合タンパク質および結合体、このようなポリペプチドをコードする核酸、ならびにこのようなポリペプチドの作製方法を提供する。
別の局面では、本発明は、親ポリペプチドの改変体である、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、各改変体は、親ポリペプチド配列と、親ポリペプチド配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸位置において異なる改変体配列を含み、ここで、この親ポリペプチド配列は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７および５３のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３））である。いくつかの例では、この改変体は、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。いくつかの例では、この改変体配列は、親ポリペプチド配列と１〜１６個のアミノ酸位置（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸位置（例えば、１〜１４のアミノ酸位置、１〜１２のアミノ酸位置、１〜１０のアミノ酸位置、１〜８のアミノ酸位置、１〜６のアミノ酸位置、１〜５のアミノ酸位置、１〜４のアミノ酸位置、１〜３のアミノ酸位置または１〜２のアミノ酸位置））が異なる。いくつかの例では、この改変体配列は、配列番号１〜１５のうちの１と比較して、４７位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、６０位、６１位、６４位、６９位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、９０位、９３位、１３３位、１４０位、１５４位、１６０位、１６１位、および１６２位のうちの１以上において置換を含む。いくつかの例では、この改変体配列は、以下のうちの１以上を含む：：４７位でのＨｉｓまたはＧｌｎ；５１位でのＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；５２位でのＧｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；５３位でのＡｌａまたはＴｈｒ；５５位でのＰｈｅ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ；５６位でのＬｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａ；５７位でのＰｈｅまたはＬｅｕ；５８位でのＴｙｒまたはＨｉｓ；６０位でのＭｅｔ、ＬｅｕまたはＶａｌ；６１位でのＭｅｔまたはＩｌｅ；６４位でのＴｈｒまたはＩｌｅ；６９位でのＳｅｒまたはＴｈｒ；７１位でのＬｙｓまたはＧｌｕ；７２位でのＡｓｎまたはＡｓｐ；７５位でのＡｌａまたはＶａｌ；７６位でのＡｌａまたはＴｈｒ；７７位でのＴｒｐまたはＬｅｕ；７８位でのＡｓｐまたはＧｌｕ；７９位でのＧｌｕまたはＧｌｎ；８０位でのＴｈｒ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｒｇ；８３位でのＧｌｕまたはＡｓｐ；８４位でのＬｙｓまたはＧｌｕ；８５位でのＰｈｅまたはＬｅｕ；８６位でのＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；８７位でのＩｌｅまたはＴｈｒ；９０位でのＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；９３位でのＭｅｔまたはＬｅｕ；１３３位でのＬｙｓまたはＧｌｕ；１４０位でのＳｅｒまたはＡｌａ；１５４位でのＰｈｅまたはＬｅｕ；１６０位でのＬｙｓまたはＧｌｕ；１６１位でのＡｒｇまたはＳｅｒ；および１６２位でのＡｒｇまたはＳｅｒ（位置は、配列番号１の位置に対して番号付けられる）。いくつかの例では、この改変体配列は、Ｈｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３、およびＳｅｒ１４０のうちの１以上を含み、この位置は、配列番号１の位置に対して番号付けられる。いくつかのこのような改変体は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４から選択される配列を含む。本発明はまた、これらの改変体のうちのいずれかを含む、融合タンパク質および結合体、これらの改変体のうちのいずれかをコードする核酸、ならびにこのような改変体の作製方法を提供する。
別の局面では、本発明は、親インターフェロン−αポリペプチドの改変体である、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、各改変体は、親インターフェロン−αポリペプチド配列と、少なくとも１つのアミノ酸位置において異なる改変体配列を含み、ここで、この改変体配列は、Ｈｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３、およびＳｅｒ１４０のうちの１以上を含み、この位置は、配列番号１の位置に対して番号付けられる。いくつかの例では、親インターフェロン−αポリペプチド配列は、天然に存在するヒトインターフェロン−αの配列（例えば、配列番号３１〜配列番号４２または配列番号３２＋Ｒ２３Ｋのうちの１つ）または天然に存在する（すなわち、合成の）インターフェロンαの配列（例えば、配列番号４３）である。いくつかの例では、この改変体配列は、親インターフェロン−αポリペプチド配列と１〜１６個のアミノ酸位置（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸位置（例えば、１〜１４のアミノ酸位置、１〜１２のアミノ酸位置、１〜１０のアミノ酸位置、１〜８のアミノ酸位置、１〜６のアミノ酸位置、１〜５のアミノ酸位置、１〜４のアミノ酸位置、１〜３のアミノ酸位置または１〜２のアミノ酸位置））が異なる。いくつかの例では、この改変体は、インターフェロン−α活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。本発明はまた、これらの改変体のうちのいずれかを含む、融合タンパク質および結合体、これらの改変体のうちのいずれかをコードする核酸、ならびにこのような改変体の作製方法を提供する。
本発明はまた、本発明のポリペプチド（例えば、上記の本発明のポリペプチド（改変体を含む）のうちのいずれか）およびこのポリペプチドの結合基に結合した少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含む結合体を提供し、ここで、この結合体は、インターフェロン−α活性を示す。いくつかの例では、この非ポリペプチド部分は、ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）、または糖部分である。この少なくとも１つの非ポリペプチド部分は、システインへ、リジンへ、ポリペプチドのＮ末端アミノ基へ、このポリペプチドのインビボグリコシル化部位へと結合され得る。本発明はまた、このような結合体の作製方法および使用方法を提供する。
本発明はまた、本発明のポリペプチド（改変体を含む）のうちのいずれかをコードする、単離された核酸または組換え核酸を提供する。本発明はまた、このような核酸を含む、ベクターおよび宿主細胞、ならびにこのような核酸を含む宿主細胞を培養する工程を包含する、本発明のポリペプチドの作製方法を提供する。
別の局面では、本発明は、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害方法を提供し、この方法は、このウイルス感染細胞を本発明のポリペプチドまたは結合体と接触させる工程を包含する。本発明はまた、ウイルス感染細胞におけるウイルスのコピー数を低下させる方法を提供し、この方法は、このウイルス感染細胞を、本発明のポリペプチドまたは結合体と接触させる工程を包含する。
本発明の、これらならびに他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と共に読まれると、より十分に明らかとなる。
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中または本明細書の残りの部分に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語または科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
「ポリペプチド配列」（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなど）は、状況に応じて、天然に存在するアミノ酸もしくは人工アミノ酸アナログ、またはアミノ酸ポリペプチドを表す一連の特徴を含む、アミノ酸のポリマーである。遺伝暗号の縮重を考慮して、特定のポリペプチド配列をコードする、１以上の核酸またはその相補核酸は、ポリペプチド配列から決定され得る。
「ポリヌクレオチド配列」（例えば、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）は、状況に応じて、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇまたは他の天然に存在するヌクレオチドもしくは人工のヌクレオチドアナログ、または核酸を表す一連の特徴を含む、ポリマーである。所定の核酸またはその相補核酸のいずれもが、任意の特定のポリヌクレオチド配列から決定され得る。
所定のアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーの番号付けは、任意の所定のポリマー成分（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、総称して「残基」とも呼ばれる）が、所定のポリマーにおけるその成分の実際の数字位置ではなく、選択されたアミノ酸または核酸ポリマー中の同じかまたは等価な位置を参照して称される場合、選択されたアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーの番号付けに「対応する」かまたは「と比較される」。従って、例えば、所定のポリペプチド配列における所定のアミノ酸位置の番号付けは、参照配列として用いられる選択されたポリペプチド配列における同じかまたは等価なアミノ酸位置に対応する。
「等価な位置」（例えば、「等価なアミノ酸位置」または「等価な残基位置」）は、本明細書中に記載される通りの整列アルゴリズムを用いて参照ポリペプチド配列の対応する位置と整列する、試験ポリペプチド配列の位置（例えば、アミノ酸位置または残基位置）と本明細書中で定義される。試験ポリペプチド配列の等価なアミノ酸位置は、試験ポリペプチドの対応する位置と同じ数字位置番号を有する必要はない。一例として、図２は、種々の公知のヒトインターフェロン−αポリペプチド配列と整列した、本発明のポリペプチドの配列（配列番号１）を示す。この例では、配列番号１のアミノ酸位置番号４７は、配列番号３２（ｈｕＩＦＮ−α２ｂ）のアミノ酸位置番号４６の等価なアミノ酸位置である（すなわち、等価である）と考えられる。なぜなら、配列番号１のアミノ酸番号４７は、配列番号３２のアミノ酸番号４６と整列するからである。言い換えると、配列番号１のアミノ酸位置４７は、配列番号３２のアミノ酸位置４６に対応する。同様に、配列番号１における残基Ｈ４７は、配列番号５における残基Ｑ４７と対応すると理解され、その結果、例えば、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｃは、例えば、配列番号５における置換Ｑ４７Ｃ（など）に対応すると理解される。
アミノ酸位置およびアミノ酸置換を同定するために用いられる用語は、以下の通りに例示される：Ｈ４７は、参照アミノ酸配列（例えば、配列番号１）におけるヒスチジン（Ｈｉｓ）残基によって占められる位置番号４７を示す。Ｈ４７Ｑは、４７位のヒスチジン残基がグルタミン（Ｇｌｎ）残基によって置換されたことを示す。代替的な置換は、「／」によって示される。例えば、Ｈ４７Ｓ／Ｔは、４７位のヒスチジン残基がセリンまたはトレオニン残基で置換されるアミノ酸配列を意味する。複数の置換は、「＋」によって示され得る。例えば、Ｈ４７Ｑ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔは、４７位でのヒスチジン残基のグルタミン残基での置換および５１位でのバリン残基のセリンまたはトレオニン残基での置換を含むアミノ酸配列を意味する。欠失は、アスターリスク（ａｓｔｅｒｉｘ）によって示される。例えば、Ｈ４７＊は、４７位のヒスチジン残基が欠失されたことを示す。２以上の連続したアミノ酸の置換は、以下の通りに示され得る：例えば、Ｒ１６１＊−Ｅ１６６＊は、残基Ｒ１６１−Ｅ１６６の欠失（すなわち、残基１６１、１６２、１６３、１６４、１６４、および１６６が欠失していること）を示す。挿入は、以下のようにして示される：４７位のヒスチジン残基の後ろでのさらなるセリン残基の挿入は、Ｈ４７ＨＳとして示される。置換と挿入との組み合わせは、以下のように示される：４７位のヒスチジン残基のセリン残基での置換および４７位のアミノ酸残基の後ろでのアラニン残基の挿入は、Ｈ４７ＳＡと示される。
他に示されない限り、本明細書中に記載されるアミノ酸残基の位置の番号付けは、アミノ酸配列の配列番号１に対してである。ことが理解されるべきである。親ポリペプチドに対する例および改変は、一般に、配列番号１の配列に対して（または別の特定の配列に対して）本明細書中に提供され、この例は、本発明の他のポリペプチドに関し、そして本明細書中に記載される改変は、本明細書中に記載の他のポリペプチドのいずれかの等価なアミノ酸位置において作製され得る。従って、一例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｃは、配列番号５における置換Ｑ４７Ｃに対応する、などと理解される。
用語「インターフェロン−α活性を示している（または示す、または有している、または有する）」は、本発明のポリペプチドまたは結合体が、参照インターフェロン−αポリペプチド（例えば、ヒトインターフェロン−αポリペプチド、例えば、配列番号３２として本明細書中で特定されるｈｕＩＦＮ−α２ｂ、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして本明細書中で特定されるｈｕＩＦＮ−α２ａ、配列番号３７として本明細書中で特定されるｈＩＦＮ−α８ｂ、または当該分野で公知の任意の他のヒトインターフェロンαポリペプチド（例えば、図２および図４に示されるか、ならびに／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６），前出に列挙される、インターフェロンα））によって示される少なくとも１つの活性を有することを示すことを意図する。このような活性としては、例えば、以下のうちの１以上によって証明される通りの、インターフェロン−αレセプターを通してシグナルを発する能力が挙げられる：ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害（「抗ウイルス活性」）；ＴＨ１表現型への未刺激Ｔ細胞の分化の増強またはＴＨ２表現型への未刺激Ｔ細胞の分化の抑制（「ＴＨ１分化活性」）；あるいは細胞増殖の阻害（「抗増殖活性」）。この１以上のインターフェロン−α活性は、当該分野で公知の、および／または実施例に記載の、アッセイを用いてアッセイされる。
インターフェロン−α活性を示すポリペプチドまたは結合体は、（例えば、当該分野で公知の、および／または実施例に記載の、アッセイによって決定した場合）これらが測定可能な活性（例えば、測定可能な抗ウイルス活性、抗増殖活性、またはＴＨ１分化活性）を提示する場合、このような活性を有すると考えられる。当業者は、行われるアッセイの性質に部分的に依存して、どれが、測定可能な活性を構成するかを認識するが、一般的ガイドラインとして、測定可能な活性は、試験化合物（例えば、本発明のポリペプチド）の存在下で作製されたアッセイシグナルが、その試験化合物の非存在下で作製されたアッセイシグナルとは定量可能に異なる、活性である。本発明のポリペプチドまたは結合体が、特定の参照インターフェロン−αの既知の活性の全てを示す必要も、参照インターフェロン−αと同じ程度までこのような活性を示す必要もないことが理解されるべきである。いくつかの例では、（例えば、ＥＣ５０、比活性、または活性に関連する他の値によって実証されるような）本発明のポリペプチドまたは結合体によって示される活性は、参照インターフェロン−αによって示される特定の活性の大きさとほぼ等価であってもよく、小さくてもよく、または大きくてもよい。
「改変体」は、１以上のアミノ酸位置が、親ポリペプチド配列のアミノ酸位置と異なる配列を含むポリペプチドである。例えば、改変体は、親ポリペプチド配列の残基の総数の１０％まで（例えば、親ポリペプチド配列の残基の総数の８％まで（例えば、５％、４％、３％、２％または１％まで）の残基）が親ポリペプチド配列と異なる配列を含み得る。例えば、配列番号１の改変体は、１〜１６のアミノ酸位置（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のアミノ酸位置）において（例えば、１〜１５のアミノ酸位置において、１〜１４のアミノ酸位置において、１〜１３のアミノ酸位置において、１〜１２のアミノ酸位置において、１〜１１のアミノ酸位置において、１〜１０のアミノ酸位置において、１〜９のアミノ酸位置において、１〜８のアミノ酸位置において、１〜７のアミノ酸位置において、１〜６のアミノ酸位置において、１〜５のアミノ酸位置において、１〜４のアミノ酸位置において、１〜３のアミノ酸位置において、または１〜２のアミノ酸位置において）配列番号１と異なる配列を含み得る。
用語「親ポリペプチド」または「親インターフェロン−α」は、本発明に従って改変されるポリペプチド配列を示すことが意図される。この親ポリペプチド配列は、天然に存在するＩＦＮ−αのポリペプチド配列（例えば、哺乳動物ＩＦＮ−α、例えば、霊長類ＩＦＮ−α、例えば、ヒトＩＦＮ−α、例えば、本明細書中で配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして特定されるｈｕＩＦＮ−αポリペプチド、もしくは本明細書および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６），前出に記載される他のｈｕＩＦＮ−α配列）であり得る。この親ポリペプチド配列は、天然に存在しない（すなわち、「合成の」）インターフェロン−α（例えば、ＩＦＮ−α Ｃｏｎ１（配列番号４３））のポリペプチド配列であり得る。いくつかの例では、改変されるべき親ポリペプチド自体は、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ）であり得る。
対象に適用される場合、「天然に存在する」とは、この対象が、人によって人工的に生成されるのとは異なって天然に見出され得るという事実をいう。例えば、天然の供給源から単離され得、そして人によって実験室において意図的には改変されてない、生物（ウイルス、細菌、原生動物、昆虫、植物または哺乳動物の組織を含む）中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。対象に適用される場合、「天然に存在しない」（「合成」または「人工」ともいう）は、この対象が、天然に存在しない、すなわち、この対象が、人によって人工的に生成されたものと区別して天然に見出すことができないことを意味する。
「フラグメント」または「部分配列」は、配列全体までの、しかし配列全体は含まない、配列全体のうちの任意の部分である。従って、フラグメントまたは部分配列とは、アミノ酸（例えば、ポリペプチド）または核酸（例えば、ポリヌクレオチド）のより長い配列の一部を含む、アミノ酸配列または核酸配列をいう。
本発明によって意図される１つの型のフラグメントは、アミノ酸残基が、親ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端（または両方）から除去されている、フラグメントである；そのようなポリペプチドは、それぞれ、「Ｎ末端短縮型」または「Ｃ末端短縮型」であると考えられる。Ｎ末端からの少なくとも最初の４アミノ酸の欠失は、インターフェロン−α活性に対して顕著には影響を与えないことが公知である（Ｌｙｄｏｎ，Ｎ．Ｂ．ら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４：４１３１−４１）。さらに、７アミノ酸と１１アミノ酸との間がＣ末端から欠失されている、インターフェロン−α活性を保持する改変体が記載されている（Ｃｈｅｅｔｈａｍ Ｂ．Ｆ．ら（１９９１）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１５（１）：２７−３９；Ｃｈａｎｇ Ｎ．Ｔ．ら（１９８３）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２１（２）：５８５−５８９；Ｆｒａｎｋｅ Ａ．Ｅ．ら（１９８２）ＤＮＡ １（３）：２２３−２３０）。
「レセプター」（例えば、「インターフェロン−αレセプター」（Ｉ型インターフェロンレセプターとしても公知））は、インターフェロン−αによって細胞中で活性化される（例えば、インターフェロン−αを結合して、細胞内シグナル伝達を開始する）レセプターである（例えば、Ｉ型レセプターは、レセプターサブユニットＩＦＮＡＲ−２およびＩＦＮＡＲ−１を含む）（Ｄｏｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（６）：３１４４−３１４７；Ｍｏｇｅｎｓｅｎら，（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１０６９−１０９８）。本発明の状況では、レセプターもまた、インターフェロン−αを結合するが、膜に必ずしも結合しないかもしれないか、そして／または細胞内シグナル伝達を開始する、細胞外結合ドメインを含む、膜結合部分（例えば、可溶性形態のレセプター部分）を欠く、短縮形態の全長レセプター分子（例えば、レセプター分子）（「可溶性レセプター」としても公知）を包含することを意味する。
２つの分子（例えば、リガンドおよびレセプター）の間の「特異的結合親和性」は、分子の混合物中での１つの分子の、他の分子への優先的結合を意味する。これらの分子の結合は、代表的に、結合親和性が、約１×１０４Ｍ−１〜約１×１０９Ｍ−１以上（すなわち、約１０４〜１０−９Ｍ以下のＫＤ）であると、特異的であると考えられる。リガンドとレセプターとの結合親和性は、当業者に公知の標準技術によって測定され得る。結合親和性を測定するための周知の技術の非限定的な例としては、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）技術（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）、等温力価測定微小熱量測定（ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ ＵＳＡ）、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳが挙げられる。例えば、ＦＡＣＳまたは他の選別方法は、関連した結合対メンバーに特異的に結合する分子集団（例えば、細胞表面に提示されたリガンド（例えば、レセプター（例えば、可溶性レセプター）））を選択するために用いられ得る。リガンド−レセプター複合体は、例えば、（例えば、この複合体を、この複合体を認識する蛍光抗体と反応させることによって）蛍光によって検出および選別され得る。関連した結合対メンバー（例えば、レセプター）に結合する目的の分子はプールされ、そしてより低濃度のレセプターの存在下で再選別される。漸減濃度（代表的な濃度範囲は、リガンド−レセプター相互作用の性質に依存して、１０−６Ｍから１０−９Ｍ（すなわち、１マイクロモル濃度（μＭ）から１ナノモル濃度（ｎＭ））以下の桁である）のレセプターの存在下で複数回選別を実施することによって、そのレセプターに対して特異的結合親和性を示す目的の分子集団が単離され得る。
ポリペプチド、核酸または他の成分は、それが天然で会合している成分（他のペプチド、ポリペプチド、タンパク質（複合体、例えば、ネイティブ配列に関連し得る、ポリメラーゼおよびリボソームが挙げられる）、核酸、細胞、合成試薬、細胞夾雑物、細胞成分など）から（例えば、元々由来した細胞中で通常会合している他の成分から）部分的または完全に分離された場合、「単離」されている。ポリペプチド、核酸または他の成分は、その天然環境の他の成分から部分的または完全に回収または分離されており、その結果、これが、その組成物、混合物または成分収集物中に存在する主な種である（すなわち、モル濃度に基づいて、これが、その組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）場合、単離されている。いくつかの例では、この調製物は、約６０％、７０％または７５％よりも多く、代表的には約８０％より多く、または好ましくは約９０％よりも多くの単離された種からなる。
「実質的に純粋な」または「単離された」核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、ポリペプチド、タンパク質、または組成物）はまた、対象種（例えば、核酸またはポリペプチド）が、全ての高分子種のうちの少なくとも約５０、６０または７０重量パーセント（モル濃度に基づく）を構成することを意味する。実質的に純粋な、または単離された組成物はまた、組成物中に存在する全ての高分子種のうちの少なくとも約８０、９０、または９５重量パーセントを構成し得る。単離された対象種はまた、本質的に均質（夾雑種が従来の検出方法によってこの組成物中に検出できない）になるまで精製され得、ここで、この組成物は、単一の高分子種の誘導体から本質的になる。用語「精製された」は、一般的に、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じることを示す。これは代表的に、この核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、少なくとも約５０％純粋、６０％純粋、７０％純粋、７５％純粋であることを意味し、より好ましくは少なくとも約８５％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。
用語「単離された核酸」は、本発明の核酸が由来する生物の天然に存在するゲノム中の、直接連続しているコード配列（すなわち、一方は５’において、そして一方は３’末端において）の両方と、直接は連続していない核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を言及し得る。従って、この用語は、このようなｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメントが、ベクター中に組み込まれようと、それが元々由来する生物と同じかまたは異なる種（例えば、ウイルス）のゲノムに組み込まれようと、キメラポリペプチドをコードするさらなるコード配列に連結されてハイブリッド遺伝子を形成しようと、または任意の他のＤＮＡ配列とは独立していようと、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成された、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメントを包含する。このＤＮＡは、二本鎖または一本鎖の、センスまたはアンチセンスであり得る。
「組換えポリヌクレオチド」または「組換えポリペプチド」は、それぞれ、１より多くの供給源核酸またはポリペプチドに由来する核酸またはアミノ酸配列を含み得る、天然に存在しない、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、供給源核酸またはポリペプチドは、天然に存在する核酸もしくはポリペプチドであり得るか、またはそれ自体が、変異誘発または他の種類の改変に供されていてもよい。核酸またはポリペプチドは、これが合成もしくは人工もしくは操作されたものであるか、または合成もしくは人工もしくは操作されたポリペプチドもしくは核酸に由来する場合、「組換え」とみなされ得る。組換え核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、代表的には一緒に含まれないか、代表的には互いに関連していないか、さもなければ代表的には互いに分離されている、配列の少なくとも２つのフラグメントの組み合わせ（例えば、人工的組み合わせ）によって作製され得る。組換え核酸は、異なる供給源由来の、および／または人工的に合成された核酸セグメントを一緒に連結することまたは組み合わせることによって形成された核酸分子を含み得る。「組換えポリペプチド」は、しばしば、クローニングされたかまたは組換えの核酸から生じたポリペプチドを言及する。異なる核酸またはアミノ酸配列が誘導される供給源ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、時々、相同（すなわち、同じかまたは類似の構造および／または機能をコードするポリペプチドを有するかまたはコードする）であり、そしてしばしば、例えば、異なる単離体、血清型、株、種、生物、または異なる疾患状態由来である。
用語「組換え」は、例えば、細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質またはポリペプチドを参照して用いられる場合、代表的に、細胞、ポリヌクレオチド、またはベクターが、異種（もしくは外来）核酸の導入もしくはネイティブ核酸の改変によって改変されていること、またはこのタンパク質もしくはポリペプチドが、異種アミノ酸の導入によって改変されていること、またはこの細胞がこのように改変された細胞に由来することを示す。組換え細胞は、ネイティブの（非組換え）形態の細胞中に見出されない核酸配列を発現するか、またはさもなければ異常に発現されるか、過少発現されるか、もしくは全く発現されないネイティブ核酸配列を発現する。用語「組換え」は、細胞を参照して用いられる場合、この細胞が、異種核酸を複製するか、または異種核酸によってコードされるポリペプチドを発現することを示す。組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）形態の細胞を中に見出されないコード配列を含み得る。組換え細胞はまた、ネイティブ形態の細胞中にコード配列を含み得、ここで、このコード配列は、改変されてこの細胞中に人工的手段によって再度導入される。この用語はまた、この細胞由来の核酸を除去することなく改変された細胞に対して内因性の核酸を含む細胞を包含する；このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、組換えおよび関連の技術によって得られる改変が挙げられる。
用語「組換え的に産生される」とは、化学合成手段、核酸セグメントの再帰的配列組換え、もしくはヌクレオチドの他の種々の生成方法（例えば、シャッフリング）、または核酸の単離されたセグメントを、例えば当業者に公知の遺伝子操作技術により操作することのうちのいずれかによって通常達成される、人工組換えをいう。「組換え的に発現される」とは、代表的に、インビトロでの組換え核酸の産生のための技術、およびインビボ、インビトロ、もしくはエキソビボ（ここで、細胞は発現され得るかもしくは増殖され得る）での組換え核酸の細胞への移行をいう。
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」とは、構造遺伝子の発現をそのような配列と適合性の宿主においてもたらすことが可能な核酸エレメントを含む、遺伝子組み換えまたは合成された核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーター、および必要に応じて、転写終結シグナルを含む。代表的には、組換え発現カセットは、転写されるべき核酸（例えば、望ましいポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現をもたらす際に必要であるかまたは役に立つ、さらなる因子もおまた、本明細書中に記載されるように使用され得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞から発現されるタンパク質の分泌を指示するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響を与える他の核酸配列もまた、発現カセット中に含まれ得る。
「免疫原」とは、免疫応答を惹起し得る物質をいう。免疫原としては、例えば、抗原、自己抗原（これは、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす）、および癌細胞において発現される腫瘍関連抗原が挙げられる。免疫応答とは、一般的には、因子（例えば、抗原もしくはそのフラグメント）またはそのような因子をコードする核酸に対する、細胞媒介性応答または抗体媒介性応答の発生を指す。いくつかの場合において、そのような応答は、目的の抗原を発現する抗原提示細胞に特異的に対する、ＣＴＬ、Ｂ細胞または種々のクラスのＴ細胞のうちの少なくとも１つもしくはそれらの組み合わせの生成を含む。
「抗原」とは、宿主における抗体の形成を惹起し得る物質、またはその物質と反応性であるリンパ球の特定の集団を生成し得る物質を指す。抗原は、代表的には、その宿主に対して外来の高分子（例えば、タンパク質および多糖）である。
「アジュバント」とは、抗原の免疫刺激特性または薬物の薬理学的特性を増強する物質を指す。アジュバントは、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強し得る。例えば、「フロイント完全アジュバント」は、免疫原と、乳化剤と、マイコバクテリアとを含む、油と水とのエマルジョンである。別の例である「フロイント不完全アジュバント」は、マイコバクテリア以外は同じである。
ベクターは、選択された核酸により細胞形質導入もしくは細胞トランスフェクション、またはその細胞中の核酸の発現を、容易にするための成分または組成物である。ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、細菌、ポリリジンなどが挙げられる。「発現ベクター」とは、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え生成または合成生成された核酸構築物もしくは核酸配列である。この発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。この発現ベクターは、代表的には、プロモーターに作動可能に連結された転写されるべき核酸を含む。転写されるべき核酸は、代表的には、このプロモーターの指示下または制御下にある。
「ポリヌクレオチド配列の実質的に全長」または「ポリペプチド配列の実質的に全長」とは、一定長のポリペプチド配列またはポリペプチド配列の少なくとも５０％、一般的は少なくとも約６０％、７０％、もしくは７５％、通常は少なくとも約８０％、または代表的には少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を指す。
用語「免疫アッセイ」とは、抗原に結合または特異的に結合する抗体もしくは免疫原を使用する、アッセイを包含する。この免疫アッセイは、代表的には、その抗原を単離、標的化、および／または定量するために、特定の抗体の特異的結合特性を使用することによって特徴付けられる。
用語「被験体」とは、本明細書中で使用される場合、生物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、オランウータン、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、もしくは他の非ヒト哺乳動物；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物脊椎動物（例えば、鳥類（例えば、ニワトリもしくはアヒル）または魚類）および非哺乳動物無脊椎動物が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「薬学的組成物」とは、被験体（動物またはヒトを含む）における薬学的使用のために適切な組成物を意味する。薬学的組成物は、一般的には、有効量の活性成分と、キャリア（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）とを含む。
用語「有効量」とは、望ましい結果を生じるために充分な投与量または量を意味する。望ましい結果とは、その投与量または量のレシピエントにおける、客観的もしくは主観的な改善を包含する。
「予防的処置」とは、疾患、病理、もしくは医学的障害の徴候も症状も提示しない被験体、または疾患、病理、もしくは医学的障害の初期徴候もしくは初期症状のみを提示する被験体に投与される処置であって、処置は、その疾患、病理、もしくは医学的障害が発症する危険を、消失するため、予防するため、または減少するために投与される。予防的処置は、疾患または障害に対する防止的処置として昨日する。「予防的活性」とは、疾患、病理、もしくは医学的障害の徴候も症状も提示しない被験体、または疾患、病理、もしくは医学的障害の初期徴候もしくは初期症状のみを提示する被験体に投与された場合に、病理、疾患もしくは障害を発症するその被験体の危険を消失、防止、または減少する、薬剤（例えば、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、またはそれらの組み合わせ）の活性である。「予防的に有用な」薬剤または化合物（例えば、核酸もしくはポリペプチド」とは、病理、疾患、もしくは障害の発症を消失、防止、処置、または減少する際に有用な、薬剤または化合物を指す。
「治療的処置」とは、疾患、病理、もしくは医学的障害の徴候もしくは症状を提示する被験体に投与される処置であって、処置は、それらの病理、疾患、もしくは障害の徴候もしくは症状を消失または除去するために、その被験体に投与される。「治療活性」とは、病理、疾患、もしくは障害の徴候もしくは症状を、そのような徴候または症状に罹患している被験体に投与された場合に除去または消失する薬剤（例えば、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、もしくはそれらの組み合わせ）の活性である。「治療的に有用な」薬剤または化合物（例えば、核酸またはポリペプチド）とは、その薬剤または化合物が、病理、疾患、もしくは障害のそのような徴候または症状を消失、処置または排除する際に有用である。
用語「遺伝子」とは、生物学的機能に関係する任意のＤＮＡセグメントを広範に指す。遺伝子は、その発現のために必要なコード配列および／または調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡ核酸セグメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、または他の調節領域）を含む。遺伝子は、種々の供給源（目的の供給源からのクローニング、または既知配列情報もしくは推定配列情報からの合成を含む）から入手され得、望ましいパラメーターを有するように設計された配列を含み得る。
一般的には、本明細書中で以後使用される命名法、ならびに下記の細胞培養における実験室手順、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、およびタンパク質化学は、周知のものであり、当業者によって一般的に使用される。標準的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．）Ｖｏｌ．１〜３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｌｏｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９（本明細書中で以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の共同事業（１９９４〜１９９９補遺）（本明細書中以後「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に記載されるもの）は、組換え核酸法、組換え合成、細胞培養法、およびトランスジーン組み込みのために使用される（例えば、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、皮膚を通しての押し付け、およびリポフェクション）。一般的に、オリゴヌクレオチド合成工程および精製工程が、仕様に従って実施される。上記技術および手順は、一般的には、当該分野における従来方法、およびこの文書全体を通して提供される種々の一般的参考文献に従って、実施される。その中における手順は、当業者にとって周知であると考えられ、読者の便宜のために提供されている。
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的または部分的にコードされる、１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質をいう。用語「抗体」は、抗体全体およびその結合フラグメントを意味するために使用される。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ定常領域遺伝子、λ定常領域遺伝子、α定常領域遺伝子、γ定常領域遺伝子、δ定常領域遺伝子、ε定常領域遺伝子、およびμ定常領域遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、次いで、これらは、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。代表的な免疫グロブリン（例えば、抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）および１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う、約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を規定する。用語「可変軽鎖（ＶＬ）」および「可変重鎖（ＶＨ）」は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
抗体はまた、単一アームの複合モノクローナル抗体、単鎖抗体（単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）抗体（可変重鎖および可変軽鎖が一緒に（直接にかまたはペプチドリンカーを介して）結合されて連続ポリペプチドを形成している）を含む）、ならびにディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）（Ｐａｃｋら（１９９５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４６：２８；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：１２７１；およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９）を包含する。上記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化交代、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメントなどである。
用語「エピトープ」とは、抗体に特異的結合可能であるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常は、分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖）の化学的に活性な表面グルーピングからなり、エピトープは、通常は、特定の３次元構造特徴、ならびに特定の電荷特徴を有する。高次構造エピトープおよび非高次構造エピトープは、前者に結合するが後者には結合しないことが、変性溶媒の存在下は失われる点で、区別される。
抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合する抗体のペプチドフラグメントまたはポリペプチドフラグメントである。抗原結合部位は、その抗原の結合に寄与するか、その抗原の結合に関与するか、またはその抗原の結合に影響を与える、その抗体のアミノ酸によって決定される。Ｓｃｏｔｔ，Ｔ．Ａ．およびＭｅｒｃｅｒ，Ｅ．Ｉ．，Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，第３版、１９９７）、ならびにＷａｔｓｏｎ，ＪＤ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ（第２版、１９９２）［本明細書中以後「Ｗａｔｓｏｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」］（これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
用語「スクリーニング」とは、一般的に、本発明の最適な分子（例えば、本発明のポリペプチド、ならびにそれを含む関連する融合ポリペプチド、およびそのようなすべての分子をコードする核酸）を同定するプロセスを記載する。これらの個々の分子のいくつかの特性は、例えば、個々の分子が、リガンドもしくはレセプターに結合する能力、細胞増殖を阻害する能力、ウイルス感染細胞においてウイルス複製を阻害する能力、細胞サイトカイン生成を誘導もしくは阻害する能力、試験系またはインビトロ適用、エキソビボ適用もしくはインビボ適用において免疫応答を変化させる（例えば、望ましい免疫応答を誘導もしくは阻害する）能力を、選択およびスクリーニングする際に使用され得る。抗原の場合、その抗原のいくつかの特性は、いくつかの関連する抗原由来のエピトープの選択およびスクリーニング（抗原発現、フォールディング、安定性、免疫原性および存在を含む）する際に使用され得る。
「選択」とは、同定および物理的分離が（例えば、選択マーカーの発現によって）同時に達成され、その後、いくつかの遺伝的環境においては、そのマーカーを発現する細胞は生存するが他の細胞は死ぬ（またはその逆）を可能にする、スクリーニング形式である。スクリーニングマーカーとしては、例えば、ルシフェラーゼ、β―ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質などが挙げられる。選択マーカーとしては、薬物耐性遺伝子および毒素耐性遺伝子などが挙げられる。別の選択様式は、検出可能な事象（例えば、レセプターへのリガンドの結合、基質と酵素との反応、または検出可能なシグナルを直接（例えば、発色基質もしくは発色リガンドを使用することにより）もしくは間接（たとえば、発色二次抗体との反応により）に生成し得る他の物理的プロセスに基づく、物理的選別を含む。物理的選別による選択は、種々の方法（例えば、全細胞計形式または微小液滴形式での、ＦＡＣＳ）によって、達成され得る。
「外因性核酸」、「外因性ＤＮＡセグメント」、「異種配列」または「異種核酸」とは、本明細書中で使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来性の供給源に由来するもの、または同じ供給源に由来する場合にはその元の形態から改変されているものである。従って、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが改変されている遺伝子を包含する。本明細書中に記載される適用における異種配列の改変は、代表的には、再帰的配列組換えの使用を介して生じる。この用語は、その細胞に対して外来性もしくは異種であるＤＮＡセグメント、またはその細胞に対して同種であるがその宿主細胞の核酸内のそのエレメントが通常は見出されない位置にあるＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを生じるように発現される。
用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態である、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、およびそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同じ結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。他のように示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存改変体（例えば、縮重コドン置換）、および相補的配列、ならびに明示的に示される配列もまた、暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（もしくはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって、達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：２６０５〜２６０８；Ｃａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８）。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＡＮ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
「遺伝子から誘導された核酸」とは、その合成のために、その遺伝子もしくはその部分配列が最終的にはテンプレートとして役立った、核酸を指す。従って、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、そのｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは、すべて、その遺伝子から誘導され、そのような誘導生成物は、サンプルにおけるもとの遺伝子および／または遺伝子転写物の、存在および／もしくは量の指標である。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置された場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写を増加する場合には、そのコード配列と作動可能に連結されている。「作動可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が、代表的には連続しており、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合には、連続しかつ読取り枠中にある。しかし、エンハンサーは、プロモーターと数ｋｂ離れている場合に機能し、イントロン配列は、可変長であり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されているが連続はしていないものであり得る。
用語「サイトカイン」としては、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、造血増殖因子、腫瘍壊死因子、およびトランスホーミング増殖因子が挙げられる。一般的に、これらは、免疫系細胞の成熟、活性化、増殖および分化を調節する、低分子量タンパク質である。
本明細書および特許請求の範囲において、例えば、非ポリペプチド部分、アミノ酸残基、置換、緩衝液、カチオンなどの文脈における、「ある」成分（「ａ」 ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）に対する言及は、そうでないように言及されない限り、またはこれが当てはまらないことがその特定の文脈から明らかではない場合には、１つ以上のそのような成分を指すことが意図される。例えば、表現「Ａ、ＢおよびＣからなる群より選択される成分」は、Ａ、Ｂ、およびＣのすべての組み合わせ（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、またはＡ＋Ｂ＋Ｃ）を包含することが意図される。
種々のさらなる用語が、本明細書中で規定されるかまたは他の方法で特徴付けられる。
（本発明の分子および方法）
慢性ＨＣＶ感染を有する患者は、代表的には、処置前に、１ｍｌの血清当たり、１０４〜１０７コピーのＨＣＶ ＲＮＡの範囲のウイルス負荷を有する。ＩＦＮ−αでの処置の際に、これらの患者におけるウイルス負荷は、特徴的には、２つの別個の対数―直線段階の減少を受ける（図１Ｂ；Ｎｅｕｍａｎｎ Ａ．Ｕ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１０３〜１０７）。最初の２日間のＩＦＮ−α治療において生じるウイルス負荷の迅速な初期減少は、感染した肝細胞におけるウイルス生成のインターフェロンα媒介性減少、および同時に生じる感染に対する未刺激細胞の防御に起因するとい考えられる。ウイルス生成速度は、約２日間で新たな定常段階に達し、この時、ウイルスクリアランスのより迅速ではない第２の対数―直線段階が、観察される。この第２のウイルスクリアランス段階は、一般的には、感染した肝細胞のＴ細胞媒介性死滅に部分的には起因すると考えられる（Ｎｅｒｕｍａｎｎら、前出）。ＩＦＮ−αは、抗原特異的Ｔ細胞がＴＨ１細胞へと分化するのを刺激するのを介して、この生物学的応答において重要な役割を果たすと考えられる。さらに、リバビリンの作用様式は、ＴＨ１応答の増強に起因すると考えられ、そしてＩＦＮ−αを用いる併用療法におけるその効力の機構的基礎であると考えられる。現在使用中であるインターフェロンα治療に対して非応答性であるＨＣＶ感染患者（一般的に「非応答者」と呼ばれる）は、かなり狭いウイルス負荷クリアランス特性を示す（図１Ａ）。
本発明は、基礎となる機構の特定の理論によって限定されることは意図されないが、代理アッセイ系（例えば、本明細書中により詳細に記載される系）における抗ウイルス活性は、例えば、ウイルスクリアランスの第１段階において、インターフェロンαの効力の前兆であり得ることが、提唱される。実施例の節において記載される例示的な抗ウイルスアッセイは、ヒト肝細胞におけるＨＣＶ複製のための代理系として、ＨｕＨ７ヒト肝臓由来細胞において、ＥＭＣＶ（ＲＮＡウイルス）の複製を阻害する際のＩＦＮ−αの有効性をモニターする。別の有用な抗ウイルスアッセイ系は、ＷＩＳＨ細胞におけるＥＭＣＶ、およびＷＩＳＨ細胞におけるＶＳＶを含む。感染肝細胞におけるＨＣＶ複製についての他の代理系としては、例えば、Ｌｏｈｍａｎｎ Ｖ．ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５（５４２４）：２８５〜３；Ｒａｎｄａｌｌ Ｇ．およびＲｉｃｅ Ｃ．Ｍ．（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １４（６）：７４３〜７；およびＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １：９１１に記載されるような、ＨＣＶ複製系が挙げられる。ＨＣＶ抗ウイルス効力をモニターするために有用なインビボ系の例は、Ｍｅｒｃｅｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（８）：９２７〜９３３により記載されるような、キメラヒト肝臓ＳＣＩＤマウスである。
ＩＦＮ−αによるＴＨ１分化の増強および／またはＴＨ２分化の抑制は、例えば、ウイルスクリアランスの第２段階において、インターフェロンαの効力に寄与する因子であり得ることが、さらに提唱されるが、理論によって限定されるわけではない。この理論に従うと、これらの生物学的活性（ＴＨ１分化の増強および／またはＴＨ２分化の抑制）の増加した能力を有する進化したＩＦＮ−αは、例えば、同じ投与量で投与される現在認可された治療用インターフェロンα分子と比較して、増加した効力を有すると推定される。本明細書中の実施例の節において記載される例示的アッセイは、ＥＬＩＳＡを介するか、または細胞内染色およびＦＡＣＳ選別を介して、ＴＨ１表現型に関連するサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）および／またはＴＨ２表現型に関連するサイトカイン（例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−４）の生成を測定することによって、未刺激ＴＨ０細胞に対するＩＦＮ−αによるＴＨ１分化の増強および／またはＴＨ２分化の抑制をモニターする。
ＩＦＮ−α分子の治療効力は、用量限定的毒性（例えば、血小板減少症および好中球減少症）に部分的には起因して、減少する傾向がある。本発明は、基礎となる機構の特定の理論によって限定されることが意図されないが、そのような毒性は、血小板前駆体および好中球前駆体に対するＩＦＮ−αの抗増殖効果に関係し得ること、および代理アッセイ系（例えば、本明細書中に記載される系）における抗増殖活性は、インターフェロンα分子の相対的毒性の前兆となり得ることが、提唱される。従って、ＩＦＮ−αに関連する用量限定的毒性は、例えば、現在認可されている治療用インターフェロンα分子（例えば、ＲＰＤＥＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα―２ｂ、組換え型；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα―２ｂ、組換え型；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（インターフェロンαｃｏｎ１；ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ，Ｉｎｃ．））と比較して減少した抗増殖活性を示すＩＦＮ−α分子において、減少され得る。本明細書中の実施例の節において記載される例示的抗増殖活性アッセイは、ヒトＤａｕｄｉリンパ系細胞の増殖に対するＩＦＮ−αの効果をモニターする。あるいは、またはさらに、用量限定的毒性は、より治療上活性な分子の投与の結果として減少され得、このことは、現在認可されている分子よりも低濃度または低頻度での投与を可能にする。
新規なインターフェロンαポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする核酸を提供することが、本発明の目的である。本発明のいくつかのポリペプチドは、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および／またはＴＨ１分化活性）を示す。本発明のいくつかのポリペプチドは、以下の特性のうちの１つ以上の示す：参照ＩＦＮ−αポリペプチドと比較して増加もしくは減少した抗ウイルス活性；参照ＩＦＮ−αポリペプチドと比較して増加もしくは減少したＴＨ１分化活性；参照ＩＦＮ−αポリペプチドと比較して増加もしくは減少した抗増殖活性。参照ＩＦＮ−αポリペプチドは、天然に存在しないインターフェロンα（例えば、ＩＦＮ−α Ｃｏｎ１）の配列（配列番号４３）を含み得るか、あるいは天然に存在する（すなわち、野生型）インターフェロンαポリペプチドの配列を含み得る。天然に存在するインターフェロンαポリペプチドの配列の例としては、ヒトＩＦＮ−αポリペプチドの配列（例えば、ｈｕＩＦＮ−α２ｂ（配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α２ａ（２３位がＬｙｓである配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α２ｃ（３４位がＡｒｇである配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α８ｂ（配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α８ａ（９８位がＶａｌであり、９９位がＬｅｕであり、１００位がＣｙｓであり、１０１がＡｓｐである配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α８ｃ（１６１がＡｓｐであり、１６２位〜１６６位のアミノ酸が欠失している配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α１４ａ（配列番号３９）、ｈｕＩＦＮ−α１４ｃ（１５２位がＬｅｕである配列番号３９）、または他の任意の天然に存在するヒトインターフェロンαポリペプチドの配列（例えば、本明細書中図２および図４に示される配列（配列番号３１〜４２）および／もしくはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に列挙される配列））が、挙げられる。
別の局面において、本発明は、参照インターフェロンα分子（例えば、現在治療剤として使用されている分子（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ、ＩＮＴＲＯＮ Ａ、またはＩＮＦＥＲＧＥＮ））と比較して、感染細胞からＨＣＶをクリアランスする際に増強された効力を示す、インターフェロンαポリペプチドを提供する。そのような増強された効力は、その参照分子と比較して、増強された抗ウイルス活性、増強されたＴＨ１分化活性、またはその両方から生じ得る。本発明のいくつかのインターフェロンαポリペプチドは、現在使用中のインターフェロンα分子による処置に対して応答性が乏しいＨＣＶ株（例えば、遺伝子型１のＨＣＶ）をクリアランスする際に特に有用であり得る。
本発明のいくつかのポリペプチドは、参照ＩＦＮ−α分子と比較して増加した（抗ウイルス活性／抗増殖活性）比、および／または参照ＩＦＮ−α分子と比較して増加した（ＴＨ１分化活性／抗増殖活性）比を示す。そのようなポリペプチドは、ウイルス感染（例えば、ＨＣＶ感染）の処置において特に有効であり得る。そのようないくつかのポリペプチドは、例えば、上記の二段階性ウイルスクリアランスプロフィールの一方の段階もしくは両方の段階において、ＨＣＶ処置において現在認可されているインターフェロンα分子を超えて増強された治療効力を提供し得、かつ／または減少した毒性を示し得る。そのようないくつかのポリペプチドは、遺伝子型１のＨＣＶの処置において、現在認可されているインターフェロンα分子を超えて増強された治療効力を提供し得る。
インターフェロンα活性（例えば、上記に列挙された活性のうちの１つ以上）を示し、そして必要に応じて、他の望ましい特性（例えば、非結合型ポリペプチドと比較して、増加した血清半減期、および／または機能的なインビボ半減期、および／または減少した抗原性）を示す、本発明のポリペプチドに結合した１つ以上の非ポリペプチド部分を含むそのような結合体を提供することが、本発明の別の目的である。そのようないくつかの結合体は、参照インターフェロンα分子（例えば、現在治療剤として使用されているインターフェロンα結合体（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグインターフェロンα―２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）もしくはＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグインターフェロンα―２ｂ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と比較して、感染細胞からＨＣＶをクリアランスする際に増強された効力を示す。そのような増強された効力は、その参照分子と比較して、増強された抗ウイルス活性、増強されたＴＨ１分化活性、またはその両方から生じ得る。本発明のいくつかのインターフェロンα結合体は、現在使用中のインターフェロンα分子による処置に対して応答性が乏しいＨＣＶ株（例えば、遺伝子型１のＨＣＶ）をクリアランスする際に特に有用であり得る。
本発明のいくつかの結合体は、参照ＩＦＮ−α分子と比較して増加した（抗ウイルス活性／抗増殖活性）比、および／または参照ＩＦＮ−α分子と比較して増加した（ＴＨ１分化活性／抗増殖活性）比を示す。そのような特性を示す結合体は、ウイルス感染（例えば、ＨＣＶ感染）の処置において特に有効であり得る。そのようないくつかの結合体は、例えば、上記の二段階性ウイルスクリアランスプロフィールの一方の段階もしくは両方の段階において、ＨＣＶ処置において現在認可されているインターフェロンα分子を超えて増強された治療効力を提供し得、かつ／または減少した毒性を示し得る。そのようないくつかのポリペプチドは、遺伝子型１のＨＣＶの処置において、現在認可されているインターフェロンα分子を超えて増強された治療効力を提供し得る。
ウイルス感染細胞におけるウイルス複製を阻害する方法を提供することが、本発明の別の目的である。この方法は、ウイルス感染細胞に、本発明のポリペプチドまたは結合体をその細胞におけるウイルス複製を阻害するために有効な量で投与する工程を包含する。本発明はまた、ウイルス感染細胞においてウイルスのコピー数を減少する方法を提供し、この方法は、そのウイルス感染細胞に、その細胞におけるそのウイルスのコピー数を減少するために有効な量で、本発明のポリペプチドまたは結合体を投与する工程を包含する。上記ウイルスは、例えば、ＲＮＡウイルス（例えば、ＨＣＶ）またはＤＮＡウイルス（例えば、ＨＢＶ）であり得る。上記細胞は、培養中であっても、または哺乳動物から単離されていても（すなわち、インビトロもしくはエキソビボ）よく、あるいは、インビボ（例えば、哺乳動物（例えば、Ｍｅｒｃｅｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（８）：９２７〜９３３）に記載されるようなＳＣＩＤマウスモデル）、霊長類、またはヒト）中に有り得る。
本発明はまた、ＴＨ０細胞のＴＨ１分化を増強する方法を提供し、この方法は、ＴＨ０細胞を含む集団に、上記集団におけるＴＨ１表現型に関係するサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）の生成を増加するため、および／またはＴＨ２表現型に関係するサイトカイン（例えば、ＩＬ−４もしくはＩＬ−５）の生成を減少するために有効な量で、本発明のポリペプチドもしくは結合体を投与する工程を包含する。この集団は、培養中であっても、または哺乳動物から単離されていても（すなわち、インビトロもしくはエキソビボ）よく、あるいは、インビボ（例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト）中に有り得る。
本発明はまた、細胞集団の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、その細胞集団を、その細胞集団の増殖を減少するために有効な量で、本発明のポリペプチド、改変体、もしくは結合体と接触させる工程を包含する。その細胞集団は、培養中であっても、または哺乳動物から単離されていても（すなわち、インビトロもしくはエキソビボ）よく、あるいは、インビボ（例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト）中に有り得る。
本発明のこれらの目的および他の目的が、以下により詳細に考察される。
（本発明のポリペプチド）
本発明は、新規なインターフェロンαポリペプチドを提供し、これらは、本明細書中ではまとめて「本発明のポリペプチド」と呼ばれる。用語「本発明のポリペプチド」とは、本明細書中に開示されるポリペプチド配列の改変体を包含することが全体を通して意図される。また、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質、および本発明のポリペプチドを含む結合体も、本発明に包含される。
種々のインターフェロンαコード配列のフラグメントが、組換えポリペプチドを含むライブラリーを形成するように再帰的に組み換えられた。このライブラリーから、本発明のいくつかのポリペプチドが発見された。組み換えポリペプチドのライブラリーを得るための方法、および／または再帰的配列組み換えのための基質として使用される核酸において多様性を得るための方法もまた、下記に記載される。
本発明の例示的なポリペプチドとしては、本明細書中で配列番号１〜１５（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５）として同定される配列を含むポリペプチドが挙げられ、これらは、本明細書中で配列番号１６〜３０（例えば、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０）として同定される核酸によってコードされる。本発明のポリペプチドとしてはまた、本明細書中で配列番号４４〜１０４（例えば、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、および配列番号１０４）として同定される配列を含むポリペプチドが挙げられる。いくつかのこのようなポリペプチドは、Ｎ末端に付加されたさらなるアミノ酸（例えば、メチオニン）をさらに含む。本発明はまた、これらのポリペプチドをコードする融合タンパク質を提供する。
本発明はまた、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７、および５３（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）のうちの１つ）に由来する、アミノ酸位置０〜１６において（例えば、アミノ酸位置０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６において）、例えば、位置０〜１６、位置０〜１５、位置０〜１４、位置０〜１３、位置０〜１２、位置０〜１１、位置０〜１０、位置０〜９、位置０〜８、位置０〜７、位置０〜６、位置０〜５、位置０〜４、位置０〜３、位置０〜２、位置０〜１において、異なる配列を含むポリペプチドを包含する。いくつかの事例において、このポリペプチドは、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。いくつかのこのようなポリペプチドは、Ｎ末端に付加されたさらなるアミノ酸（例えば、メチオニン）をさらに含む。本発明はまた、これらのポリペプチドを含む融合タンパク質および複合体、ならびにこれらのポリペプチドをコードする単離された核酸または組換え核酸を提供する。
いくつかの事例において、本発明のポリペプチドの配列は、配列番号１〜１５、４７、および５３（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）のうちのいずれか１つに対して、１以上の位置（例えば、位置４７、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６４、６９、７１、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８３、８４、８５、８６、８７、９０、９３、１３３、１４０、１５４、１６０、１６１、および１６２が挙げられるが、これらに限定されない）における異なるアミノ酸についてのアミノ酸の置換を含む。いくつかの事例において、このポリペプチド配列は、以下のうちの１以上を含み、その位置は、配列番号１の位置に対する番号付けである：位置４７におけるＨｉｓまたはＧｌｎ；位置５１におけるＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；位置５２におけるＧｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；位置５３におけるＡｌａまたはＴｈｒ；位置５５におけるＰｈｅ、ＳｅｒまたはＰｒｏ；位置５６におけるＬｅｕ、Ｖａｌ、またはＡｌａ；位置５７におけるＰｈｅまたはＬｅｕ；位置５８におけるＴｙｒまたはＨｉｓ；位置６０におけるＬｅｕまたはＶａｌ；位置６１におけるＭｅｔまたはＩｌｅ；位置６４におけるＴｈｒまたはＩｌｅ；位置６９におけるＳｅｒまたはＴｈｒ；位置７１におけるＬｙｓまたはＧｌｕ；位置７２におけるＡｓｎまたはＡｓｐ；位置７５におけるＡｌａまたはＶａｌ；位置７６におけるＡｌａまたはＴｈｒ；位置７７におけるＴｒｐまたはＬｅｕ；位置７８におけるＡｓｐまたはＧｌｕ；位置７９におけるＧｌｕまたはＧｌｎ；位置８０におけるＴｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇ；位置８３におけるＧｌｕまたはＡｓｐ；位置８４におけるＬｙｓまたはＧｌｕ；位置８５におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ；位置８６におけるＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；位置８７におけるＩｌｅまたはＴｈｒ；位置９０におけるＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；位置９３におけるＭｅｔまたはＬｅｕ；位置１３３におけるＬｙｓまたはＧｌｕ；位置１４０におけるＳｅｒまたはＡｌａ；位置１５４におけるＰｈｅまたはＬｅｕ；位置１６０におけるＬｙｓまたはＧｌｕ；位置１６１におけるＡｒｇまたはＳｅｒ；および位置１６２におけるＡｒｇまたはＳｅｒ。本発明はまた、これらのポリペプチドを含む融合タンパク質および複合体、ならびにこれらのポリペプチドをコードする単離された核酸または組換え核酸を提供する。
本発明のいくつかのポリペプチドは、親分子が、分子の表面に曝されるアミノ酸残基を含むことが予測される（例えば、その表面に曝されるその側鎖のうちの少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％）を有すると計算される）位置における置換を含む。本発明のいくつかのこのようなポリペプチドは、１以上の位置（２５％を超える部分接触可能表面積（ＡＳＡ）を有するアミノ酸残基を含む以下：
Figure 2006506097
 の位置が挙げられるが、これらに限定されない）における異なるアミノ酸についてのアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号１〜１５、４７、および５３（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）に対して、１以上の位置（５０％より大きい部分ＡＳＡを有するアミノ酸残基を含む以下：
Figure 2006506097
 の位置が挙げられるが、これらに限定されない）における異なるアミノ酸についてのアミノ酸の置換を含む。
本発明のいくつかのポリペプチドは、システインを２５％より大きい部分ＡＳＡを有する位置に導入する以下：
Figure 2006506097
 ならびにそれらの組み合わせの置換のうち１以上を含む。
本発明のいくつかのポリペプチドは、リジンを２５％より大きい部分ＡＳＡを有する位置に導入する以下：
Figure 2006506097
 ならびにそれらの組み合わせの置換のうち１以上を含む。
本発明のいくつかのポリペプチドは、本発明の任意のポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうち１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３））に由来する、１以上のリジン（Ｋ３１、Ｋ５０、Ｋ７１、Ｋ８４、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０、および／またはＫ１６５）を取り除く異なるアミノ酸残基についてのアミノ酸残基の置換、またはアミノ酸の欠失を含む。取り除かれるべき１以上のリジン残基は、その他のアミノ酸で置換されても、Ａｒｇ（Ｒ）もしくはＧｌｎ（Ｑ）で置換されても、欠失されてもよい。いくつかのこのようなポリペプチドは、置換Ｋ３１Ｒ＋Ｋ１２２Ｒ；Ｋ３１Ｒ＋Ｋ１３３Ｒ；Ｋ１２２Ｒ＋Ｋ１３３Ｒ；またはＬ３１Ｒ＋Ｋ１２２Ｒ＋Ｋ１３３Ｒを含む。他の例示的な置換としては、Ｋ７１Ｅ；Ｋ８４Ｅ；Ｋ１３３Ｅ／Ｇ；およびＫ１６０Ｅが挙げられる。
本発明のいくつかのポリペプチドは、本発明の任意のポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７、および５３（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）のうちの１つ）に由来する、１以上のヒスチジン（例えば、Ｈ７、Ｈ１１、Ｈ３４、および／またはＨ４７（配列番号１に対して））を取り除く置換または欠失を含む。取り除かれるべきヒスチジン残基は、その他のアミノ酸で置換されても、Ａｒｇ（Ｒ）もしくはＧｌｎ（Ｑ）で置換されても、欠失されてもよい。いくかのこのようなポリペプチドは、置換Ｈ３４Ｑ；Ｈ４７Ｑ；またはＨ３４Ｑ＋Ｈ４７Ｑを含む。
本発明のいくつかのポリペプチドは、Ｎ連結グリコシル化部位Ｎ７２ Ｓ７３ Ｓ７４（配列番号１に対して）の空間的配置を取り除くか、またはそうでない場合は空間的配置を混乱させる異なるアミノ酸についての置換、アミノ酸の欠失、またはアミノ酸の挿入を含む。この部位の除去は、多くの方法（例えば、Ｎ７２の欠失、または異なるアミノ酸に対するＮ７２の置換、ＰｒｏによるＳｅｒ７３の置換、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、もしくはＣｙｓ以外の他のアミノ酸に対するＮ７２の置換、または位置７３と７４との間のＳｅｒ、Ｔｈｒ、もしくはＣｙｓ以外のアミン酸残基の挿入）で達成され得る。例えば、いくつかのこのようなポリペプチドは、置換Ｎ７２Ｄを含む。
本発明のいくつかのポリペプチドは、例えば、潜在的なプロテアーゼ高感度部位の存在を最小限にするために、あるいはいくつかの事例では、アミン反応性結合（例えば、ＰＥＧ化）試薬に対する潜在的に反応性である部位を取り除くために、１以上の塩基性残基または１以上の塩基性残基対（例えば、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）を取り除く、１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む。例えば、Ｃ末端近辺の二塩基配列の除去は、Ｌｙｓ１６０、Ｌｙｅ１６１、Ｌｙｓ１６３、Ｌｙｓ１６４、およびＬｙｓ１６５（配列番号１に対して）のうちの１以上の除去によって達成され得る。取り除かれるべきＬｙｓまたはＡｒｇのうちの１以上は、例えば、欠失されるか、またはＬｙｓもしくはＡｒｇ以外のアミノ酸で置換される。本発明のいくつかのこのようなポリペプチドは、ＬｙａまたはＡｒｇ以外のアミノ酸（例えば、置換Ｌｙａ１６０Ｇｌｕ；Ａｒｇ１６１Ｓｅｒ／Ｃｙｓ；およびＡｒｇ１６４Ｓｅｒ／Ｃｙｓ）のうち１以上について、１以上のＬｙｓ１６０、Ａｒｇ１６１、およびＡｒｇ１６４の置換を含む。いくつかのこのようなポリペプチドは、あるいは、またはさらにＬｙｓ１６０、Ａｒｇ１６１、Ａｒｇ１６３、Ａｒｇ１６４、およびＲ１６５のうち１以上の欠失を含み、これは、個々の欠失（例えば、Ｋ１６５＊）または１より大きい群を介して（Ｃ末端切断（例えば、Ｋ１６５＊−Ｅ１６６）を介することを含む）成され得る。
本発明のポリペプチドについて意図される他の改変体としては、以下および標題「インターフェロンα結合体」の欄に記載されるポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドに対する例および改良は、一般的に、本明細書中で配列番号１（またはいくつかの他の特定の配列）に対して得られるが、開示された改良もまた、本明細書中で開示される本発明の他のポリペプチド（例えば、配列番号２〜１５および配列番号４４〜１０４ならびにそれらの変異体）のうちのいずれかに関する等価なアミノ酸位置でなされ得ることが理解される。従って、例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｃは、配列番号５でのＱ４７Ｃに相当することなどが理解される。
以下の表は、本発明のいくつかのインターフェロンαポリペプチドの配列を提供する。明確にするためにこの配列は、配列番号３（表１）または配列番号１２（表１２）に対して示されている。いくつかのこのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す、
（表１）
Figure 2006506097
Figure 2006506097
Figure 2006506097
 （表２）
Figure 2006506097
Figure 2006506097
 。
（改変体）
別の局面において、本発明は、親のインターフェロンαポリペプチドの改変体である単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、この改変体は、少なくとも１つのアミノ酸位置において親のポリペプチド配列と異なる配列を含み、ここで、この改変体配列は、位置４７のＨｉｓ、位置５１のＶａｌ、位置５５のＰｈｅ、位置５６のＬｅｕ、位置５８のＴｙｒ、位置１３３のＬｙｓ、および位置１４０のＳｅｒのうちの１以上を含み、この位置は、配列番号１の位置に対する番号付けである。いくつかの事例において、親のインターフェロンαポリペプチド配列は、天然に存在するヒトインターフェロンα（例えば、ｈｕＩＦＮ−α ２ｂ（配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α ２ａ（位置２３＝Ｌｙｓである配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α ２ｃ（位置３４＝Ａｒｇである配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α ８ｂ（配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ− ８ａ（位置９８＝Ｖａｌ、９９＝Ｌｅｕ、１００＝Ｃｙｓ、および１０１＝Ａｓｐである配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α ８ｃ（位置１６１＝Ａｓｐであり、そして位置１６２〜１６６が欠失された配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α １４ａ（配列番号３９）、ｈｕＩＦＮ−α １４ｃ（位置１５２＝Ｌｅｕである配列番号３９）、あるいは本明細書中の図２および４に示されるようなヒトインターフェロンαポリペプチド（配列番号３１〜４２）および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に列挙されるヒトインターフェロンαポリペプチドのような任意の他の天然に存在するヒトインターフェロンαポリペプチド）の配列である。いくつかの事例において、親のインターフェロンαポリペプチド配列は、天然に存在しない（すなわち、合成の）インターフェロンα（例えば、ＩＦＮ−α Ｃｏｎ１（配列番号４３））の配列である。いくつかの事例において、改良されるべき親のポリペプチドは、それ自体、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ）であり得る。いくつかの事例において、改変体配列は、アミノ酸位置１〜１６において（例えば、アミノ酸位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）、例えば、アミノ酸位置１〜１４において、アミノ酸位置１〜１２において、アミノ酸位置１〜１０において、アミノ酸位置１〜８において、アミノ酸位置１〜６において、アミノ酸位置１〜５において、アミノ酸位置１〜４において、アミノ酸位置１〜３において、またはアミノ酸位置１〜２において、親のポリペプチド配列と異なる。いくつかのこのような改変体は、インターフェロンα活性を示す。本発明はまた、このような改変体を含む融合タンパク質および結合体、ならびにこのような改変体を含む単離された核酸または組換え核酸を提供する。
（配列バリエーション）
上記のように、本発明のポリペプチドは、アミノ酸位置０〜１６において（例えば、アミノ酸位置０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６において）、例えば、位置０〜１６において、位置０〜１５において、位置０〜１４において、位置０〜１３において、位置０〜１２において、位置０〜１１において、位置０〜１０において、位置０〜９において、位置０〜８において、位置０〜７において、位置０〜６において、位置０〜５において、位置０〜４において、位置０〜３において、位置０〜２において、位置０〜１において、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７、および５３（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）のうちのいずれか１つ）と異なる配列を含むポリペプチドを含む。いくつかのこのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
例えば、本発明のいくつかのこのようなポリペプチドは、親のポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜１５のうちの１つ）に対する１個のアミノ酸と１６個のアミノ酸との間の欠失に対応する約１５０のアミノ酸（例えば、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５アミノ酸）の長さを有する配列を含む。いくつかの事例において、１と１１との間で、例えば、１と１０との間（例えば、１と７との間）、例えば、１と５との間（例えば、１と３との間）で、アミノ酸がＣ末端から欠失される。すなわち、このポリペプチドは、親のポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜１５、４７、または５３のうちの１１つ）と比較して、１〜１１アミノ酸残基まで（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１アミノ酸残基）（例えば、１〜１０、１〜７（例えば、１〜５）または１〜３アミノ酸残基まで）、Ｃ末端で切断されている。あるいは、またはさらに、いくつかのこのようなポリペプチドは、親のポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜１５、４７、または５３）と比較して、１〜４アミノ酸残基まで（例えば、１、２、３、または４アミノ酸残基まで）Ｎ末端で切断されており、例えば、１〜４、１〜３、１〜２、１個のアミノ酸残基が、Ｎ末端から除去されている。いくつかのこのようなポリペプチドは、Ｎ末端にメチオニンをさらに含む。いくつかのこのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
別の例として、本発明のいくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号１〜１５、４７、または５３に対して、０と１６との間のアミノ酸置換（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のアミノ酸置換）、例えば、０〜１４、０〜１２、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、０〜１のアミノ酸置換、を含む配列を含む。いくつかの事例において、１以上のアミノ酸置換が、例えば、以下に示すように、置換基（例えば、保存的置換基）に従ってなされる。いくつかのこのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
本発明のいくつかのポリペプチドは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）に対して、０〜１６のアミノ酸置換、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のアミノ酸置換（例えば、０〜１４、または０〜１２、または０〜１０、または０〜８、または０〜６、または０〜５、または０〜４、または０〜３、または０〜２、または０〜１のアミノ酸置換）を含む配列を含み、ここで、この置換のうち少なくとも１つは、非ポリペプチド部分のための連結基を含むアミノ酸残基を導入する。例としては、上記および「インターフェロンα結合体」の欄に記載されるように、１以上のＮ−グリコシル化部位、または１以上のシステイイン残基もしくはリジン残基の導入が挙げられる。いくつかのこのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
本発明のいくつかのポリペプチドは、配列番号１〜１５、および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）に対して、０〜１６のアミノ酸置換または欠失または挿入（例えば、０〜１４、または０〜１２、または０〜１０、または０〜８、または０〜６、または０〜５、または０〜４、または０〜３、または０〜２、または０〜１のアミノ酸置換または欠失または挿入（あるいはそれらの組み合わせ））を含む配列を含み、ここで、この置換または欠失のうち少なくとも１つが、非ポリペプチド部分についての連結基を含む親のポリペプチドからアミノ酸を取り除くか、またはアミノ酸挿入の場合（例えば、Ｎグリコシル化Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフを混乱させるための挿入）には、このような連結基に必要とされる残基の空間的配置を混乱させる。例としては、上記および「インターフェロンα結合体の欄で記載のように、親のポリペプチドからのＮグリコシル化部位の除去、またはリジン、ヒスチジン、もしくはシステイン残基の除去が挙げられる。いくつかのこのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
非限定的な例として、本発明ポリペプチドは、配列番号３の配列：または位置１６までの全体で配列番号３とは異なる配列（これは、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入（上記のものを含む））を有し得る。いくつかの例において、置換基のうちのいずれも下記で規定される置換基に従う置換基ではないか、置換基のうちいくつかもしくはすべてが、下記で規定される置換基に従う置換基である。
本発明に従うアミノ酸置換としては、１以上の保存的アミノ酸置換が挙げられ得るが、これらに限定されない。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。１つの例が以下の表に提供され（表３）、これは、互いに「保存的置換」と考えられ得るアミノ酸を含む６つの典型的な基を記載している。
（表３）
（保存的置換基）
Figure 2006506097
 。
アミノ酸の他の置換基が想定され得る。例えば、アミノ酸は、類似の機能または化学構造または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪性、芳香族性、硫黄含有性）によって分類され得る。例えば、脂肪性の集団は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）を含む。互いに保存性置換と考えられるアミノ酸を含む集団としては、芳香族性：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有性：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギンサン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）が挙げられる。アミノ酸のさらなる集団について、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。上記の置換基に関連して、本明細書中のポリペプチド配列のリストは、すべての保存的に置換されたポリペプチド配列の発現リストを提供する。
（配列同一性パーセント）
１つの局面において、本発明は、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、これらは各々、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のいずれか１つ（例えば、配列番号１〜１５ｍ、４７、および５３（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）のうちの少なくとも１つ）に対して、少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性）を有する配列を含む。いくつかの事例において、このポリペプチド配列は、配列番号１〜１５および４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３）に由来する、１以上のアミノ酸位置において（例えば、位置１６まで（例えば、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４位置、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置１〜５〜、位置１〜４、位置１〜３、または位置１〜２）において）異なる。例として、本発明に従って別のアミノ酸に置換され得るいくつかの位置としては、配列番号１〜１５および４４〜１０４に対する、位置４７、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６４、６９、７１、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８３、８４、８５、８６、８７、９０、９３、１３３、１４０、１５４、１６０、１６１、および１６２のうちの１つが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの事例において、この配列は、以下のうちの１以上を含み、その位置は、配列番号１の位置に対する番号付けである：位置４７におけるＨｉｓまたはＧｌｎ；位置５１におけるＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；位置５２におけるＰｒｏまたはＧｌｕ；位置５３におけるＡｌａまたはＴｈｒ；位置５５におけるＰｈｅ、ＳｅｒまたはＰｒｏ；位置５６におけるＬｅｕ、Ｖａｌ、またはＡｌａ；位置５７におけるＰｈｅまたはＬｅｕ；位置５８におけるＴｙｒまたはＨｉｓ；位置６０におけるＬｅｕまたはＶａｌ；位置６１におけるＭｅｔまたはＩｌｅ；位置６４におけるＴｈｒまたはＩｌｅ；位置６９におけるＳｅｒまたはＴｈｒ；位置７１におけるＬｙｓまたはＧｌｕ；位置７２におけるＡｓｎまたはＡｓｐ；位置７５におけるＡｌａまたはＶａｌ；位置７６におけるＡｌａまたはＴｈｒ；位置７７におけるＴｒｐまたはＬｅｕ；位置７８におけるＡｓｐまたはＧｌｕ；位置７９におけるＧｌｕまたはＧｌｎ；位置８０におけるＴｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇ；位置８３におけるＧｌｕまたはＡｓｐ；位置８４におけるＬｙｓまたはＧｌｕ；位置８５におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ；位置８６におけるＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；位置８７におけるＩｌｅまたはＴｈｒ；位置９０におけるＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；位置９３におけるＭｅｔまたはＬｅｕ；位置１３３におけるＬｙｓまたはＧｌｕ；位置１４０におけるＳｅｒまたはＡｌａ；位置１５４におけるＰｈｅまたはＬｅｕ；位置１６０におけるＬｙｓまたはＧｌｕ；位置１６１におけるＡｒｇまたはＳｅｒ；および位置１６２におけるＡｒｇまたはＳｅｒ。本発明の配列において意図される他の置換が、上記および以下の「インターフェロンα結合体」という表題の欄に記載される。本発明はまた、このようなポリペプチドを含む融合タンパク質、このようなポリペプチドを含む結合体、ならびにこのようなポリペプチドをコードする単離された核酸または組換え核酸を提供する。
別の局面において、本発明は、配列番号１６〜３０のうちの１以上に対して、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより大きい配列同一性パーセントを有する核酸を提供する。いくつかのこのような核酸は、本明細書中で記載されるようなインターフェロンα活性を示すポリペプチドをコードする。
配列（ポリペプチドまたは核酸）が、別の配列と類似する程度は、その２つの配列について類似の構造的特性および機能的特性の同定を提供する。従って、本発明の状況において、任意の所定の模範配列に対して類似の配列を有する配列は、本発明の特長である。特に、以下に規定されるような配列同一性パーセントを有する配列は、本発明の特長である。
配列関係を決定する種々の方法が使用され得、手動アラインメントならびにコンピュータ補助の配列アラインメントおよび分析が挙げられる。配列アラインメントを実施するための種々のコンピュータプログラムが利用可能であるか、または当業者により作製される。
上記のように、本発明で使用される核酸およびポリペプチドの配列は、同一である必要はないが、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸の配列に対して実質的に同一であり得る。例えば、本発明のポリペプチドは、種々の変更（例えば、１以上のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換（保存的もしくは非保存的のいずれか））に供され得、例えば、このような変更が、その使用（例えば、治療上の使用もしくは予防的使用または投薬または診断上の適用）において特定の利点を提供し得る場合が挙げられる。本発明の核酸はまた、種々の変更（例えば、特定のコドンが同じまたは異なるアミノ酸をコードし、サイレントバリエーション（ｓｉｌｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）（本明細書中で定義したように）または非サイレントバリエーションを生じるような、１以上のコドンにおける１以上の核酸の１以上の置換、あるいは配列中の１以上の核酸（またはコドン）の１以上の欠失）に供され得る。核酸はまた、発現系（例えば、細菌またはヒト）において最適な発現を提供する１以上のコドンを含むように改変され得、一方で、所望の場合には、この１以上のコドンは依然として同じアミノ酸をコードする。
このような核酸変更は、その治療上の使用もしくは予防的使用または投薬、または診断上の適用において特定の利点を提供し得る。核酸およびポリペプチドは、それらが本発明の代表的な核酸またはポリペプチドにおける配列に対して実質的に同一な配列を含む限りは、多くの方法で改変され得る。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の状況において、用語「同一の」または「同一性」は、以下に記載される配列比較アルゴリズムを使用するかまたは目視検査によって決定されるような最大類似度について比較かつアラインメントした場合に、同じかまたはアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列をいう。
参照（すなわちクエリー）配列に対する対象配列の「配列同一性パーセント」（「同一性％」）は、その対象配列が、比較長にわたってクエリー配列に対して特定のパーセンテージにより同一である（すなわち、ポリペプチド配列についてアミノ酸対アミノ酸の基準、またはポリヌクレオチド配列についてヌクレオチド対ヌクレオチドの基準に基づいて）ことを意味する。
クエリー配列に対する対象配列の配列同一性パーセントは、以下のように計算される。まず、２つの配列の最適アラインメントが、特定のアラインメントパラメータと共に配列比較アルゴリズムを使用して決定される。この最適アラインメントの決定は、コンピュータを使用して行われても、以下に記載されるように手動で計算されてもよい。次いで、２つの最適に整列された配列が、比較長にわたって比較され、同一の残基が両方の配列に存在する最適アラインメントにおける位置の数が決定され、一致した位置の数が提供される。次いで、一致した位置の数が、比較長（他に特定されていなければ、これはクエリー配列の長さである）の位置の数の総数で除算され、そしてその結果が１００で掛算されて、クエリー配列に対する対象配列の配列同一性パーセントが得られる。
ポリペプチド配列に関して、代表的には、１つの配列が、「クエリー配列」（例えば、本発明のポリペプチド配列）と見なされ、それに対して１以上の他の配列（すなわち、「対象配列」）（例えば、配列データベースに存在する配列）が比較される。配列比較アルゴリズムは、指定されたアラインメントパラメータを使用して、クエリー配列と対象配列との間の最適アラインメントを決定する。配列データベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（遺伝子配列データバンク；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ））またはＧＥＮＥＳＥＱ（登録商標）（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｄｅｒｗｅｎｔ；ＳＴＮにおけるＤＧＥＮＥ（登録商標））に対してクエリー配列を比較する場合、通常はクエリー配列およびアラインメントパラメータがコンピュータに入力され、クエリー配列と各々の対象配列との間の最適アラインメントが、対象配列の特定の数まで繰り返される。
２つのポリペプチド配列は、それらが規定したパラメータ（すなわち、規定されたアミノ酸置換マトリックス、ギャップ存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）ペナルティ（ギャップオープンペナルティとも称される）、およびギャップ伸長ペナルティ）を使用して、その配列の対について可能な最も高い類似性スコアを達成するように整列された場合に、「最適に整列される」。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（２２）：１０９１５−１０９１９）は、多くの場合、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ、以下に記載）における初期スコアリング置換マトリックスとして使用される。ギャップ存在ペナルティは、整列された配列の一方における単一のアミノ酸ギャップの導入を強いられ、そしてギャップ伸長ペナルティは、ギャップにおける各残基位置に課せられる。他に言及しない限り、本明細書中で使用されるアラインメントパラメータは：ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１。アラインメントスコアは、各配列のアミノ酸位置によって規定され、その位置にてアラインメントが始まり、終わり（例えば、アラインメントウインドウ）、必要に応じて、最も高い可能な同一性スコアに達するように一方または両方の配列にギャップまたは複数のギャップの挿入によって規定される。
２つ以上の配列間の最適アラインメントは、手動で（以下に記載されるように）決定され得るが、そのプロセスは、Ａｌｔｓｃｈｕｌｒａ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、および に記載されるように、コンピュータ作動のアラインメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ））の使用（例えば、ポリペプチド配列についてＢＬＡＳＴＰおよび核酸配列についてＢＡＬＳＴＮ）によって容易にされ、そして種々の発信元を通して公に利用可能にされる（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイト）。コンピュータ化したＢＬＡＳＴインタフェースを使用する場合、オプションが「低複雑性フィルター」を使用するために存在していれば、そのオプションは停止されるべきである（すなわち、フィルターなし）。
図３は、本発明のポリペプチド（Ｂ９ｘ１４、配列番号３）とヒトＩＦＮ−α １４ａ（ＬｅＩＦ Ｈとしても公知、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：２０−２６；配列番号３９）とのアラインメントを示し、これは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップオープンペナルティ １１、ギャップ伸長ペナルティ １を使用するＧＥＮＢＡＮＫおよびＧＥＮＥＳＥＱデータベースに対するクエリー配列（配列番号３）のＢＬＡＳＴ検索において、最も密接に関連した配列であった。これらの２つの配列は、１６６アミノ酸の長さにわたって、アミノ酸位置１８で異なっている（すなわち、配列番号３９は、配列番号３とアミノ酸位置１８で異なる）；さらに、配列番号３９は、（（１６６−１８）／１６６）×１００＝８９であるので、配列番号３に対して８９％同一である。
図５は、本発明の別のポリペプチド（Ｂ９ｘ２５、配列番号１２）とヒトＩＦＮ−α１４ａ（配列番号３９）とのアラインメントを示し、このヒトＩＦＮ−α１４ａは、配列番号１２照会配列のＢＬＡＳＴＰ検索（ＧＥＮＢＡＮＫデータベースおよびＧＥＮＥＳＥＱデータベースに対し、上記で特定されたパラメータを用いた）において検索された、最も近接した関連配列であった。配列番号３９は、１６６アミノ酸長にわたり、配列番号１２と２０アミノ酸位置で異なる；さらに、配列番号３９は、（（１６６−２０）／１６６）×１００＝８８であるため、配列番号３と８８％同一である。
２つのポリペプチド配列間の最適アラインメントは、また、上記で特定したのと同一のアラインメントパラメータ（行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープンペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１）を用いて、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの手による（すなわち、コンピューターを使用しない）計算によって決定され得る。手始めに、２つの配列を目視検査によって最初に並列する。次いで、初期アラインメントスコアを、以下のように計算する：アラインメントの各それぞれの位置（すなわち、並列した残基の各対）について、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（図６）に従って数値を代入する。アラインメントにおける残基の各対に代入される値の合計が、初期アラインメントスコアである。並列される２つの配列が非常に類似している場合、しばしば、この最初のアラインメントは、可能な限り最も高いアラインメントスコアを提供する。可能な限り最も高いアラインメントスコアを有するアラインメントは、使用されるアラインメントパラメータに基づく最適アラインメントである。図７Ａは、２つの配列（本明細書中で配列番号３の残基２９〜５０として同定される「参照」配列（上側）、および本明細書中で配列番号５の残基３０〜５２として同定される「目的」配列（下側））についてのアラインメントスコアの計算例を示す。配列を、目視検査によって配列した。各並列されたアミノ酸の対についてＢＬＯＳＵＭ６２行列によって代入された数値を、アラインメント中の各位置の下に示す（描出を助けるため、アラインメント中のアミノ酸の各同一の対を、太字で示す）。この例において、この初期アラインメントは、可能な限り最も高いアラインメントスコア（各並列位置の下に示す値の合計）を提供した；これら２つの配列の他のいかなるアラインメント（ギャップありまたはギャップなし）も、より低いアラインメントスコアを生じる。幾つかの場合、アラインメント内に１以上のギャップを導入することにより、より高いアラインメントスコアが得られうる。ギャップがアラインメント内に導入される場合は常に、そのギャップ内の各残基の位置について、ギャップオープンペナルティが代入され、さらに、ギャップ伸長ペナルティが代入される。従って、上述のアラインメントパラメータ（ギャップオープンペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１を含む）を用いて、アラインメント中の１残基のギャップは、ギャップに代入される値−（１１＋（１×１））＝−１２に相当する；３残基のギャップは、ギャップに代入される値−（１１＋（３×１））＝−１４に相当し、以下同様である。この計算は、アラインメント内に導入された各ギャップについて繰り返される。図７Ｂおよび図７Ｃは、アラインメント内のギャップの導入が、ギャップペナルティにも拘わらず、より高いアラインメントスコアをいかにしてもたらし得るかを実証する例を示す。図７Ｂは、目視検査によって作成された、配列番号３の残基２９〜５０（上側、参照）および配列番号３２の残基３０〜５０（下側、目的）の最初のアラインメントを示し、このアラインメントは、６７の初期アラインメントスコアを生じる。図７Ｃは、アラインメントスコアに対する配列番号３２における１残基ギャップの効果を示す；−１２のギャップペナルティにも拘わらず、２つの配列の全体のアラインメントスコアは、８８まで増加した。この例において、図７Ｃに示されるアラインメントは、可能な限り最も高いアラインメントスコアを提供し、従って、これが、これら２つの配列の最適なアラインメントである；これらの２つの配列の任意の他のアラインメント（ギャップありまたはギャップなし）は、より低いアラインメントスコアを生じる。
上述の比較的短い配列を用いた配列アラインメント計算の例は、例示目的のみで提供されることが理解されるべきである；実際には、使用されるアラインメントパラメータ（ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップオープンペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１）は、８５アミノ酸以上の長さのポリペプチド配列に最適である。ＮＣＢＩウェブサイトは、他の長さの配列について以下のアラインメントパラメータ（コンピューターを使用したアラインメント計算および手で行うアラインメント計算のために好適であり、上述と同じ手順を用いる）を提供する。５０〜８５アミノ酸長の配列について、最適パラメータは、ＢＬＯＳＵＭ８０行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、前出）、ギャップオープンペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。３５〜５０アミノ酸長の配列について、最適パラメータは、ＰＡＭ７０行列（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．＆Ｏｒｃｕｔｔ，Ｂ．Ｃ．（１９７８）「Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，補遺３，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編集），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）、ギャップオープンペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。３５アミノ酸長未満の配列について、最適パラメータは、ＰＡＭ３０行列（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、前出）、ギャップオープンペナルティ＝９、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。
一旦、配列が最適に並列されると、最適アラインメント中の同一残基対を含む位置の数を計数し、これを比較の長さ（これは、他に特定しない限り、参照配列の長さである）における残基の数によって割り、得られた数に１００を掛けることにより、参照配列に対する目的の配列の％同一性が計算される。図７に示される例を参照すると、各例において、参照配列と呼ばれる配列は、２２アミノ酸長である。図７Ａのアラインメントを参照すると、並列したアミノ酸残基の２０対（太字で示す）が、参照配列（上側）と目的配列（下側）の最適アラインメントにおいて同一である。従って、特定の目的配列は、参照配列に対し、（２０／２２）×１００＝９１．１％の同一性を有する。図７Ｃにおいて示すアラインメントにおいて、最適アラインメント中のアミノ酸残基の１８対（太字で示す）が、同一である；この特定の目的配列は、参照配列に対し、（１８／２２）×１００＝８１．８％同一性を有する。
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的同一性」（または「実質的に同一である」）は、代表的に、２つのアミノ酸配列（すなわち、参照配列および目的配列）が、上述の適切なパラメータを用いるＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて（手でまたはコンピューターを介して）最適に並べられている場合、目的の配列は、参照配列に対し、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。幾つかの場合、実質的同一性は、少なくとも約１００アミノ酸残基（例えば、少なくとも約１１０、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、または１６６アミノ酸残基）の比較の長さにわたって存在する。
同様に、２つの核酸配列に関して適用される場合、実質的同一性（または実質的に同一である）という用語は、２つの核酸配列（すなわち、参照配列および目的配列）が、以下の適切なパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて（手でまたはコンピューターを介して）最適に並べられている場合、目的の配列は、参照配列に対し、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。核酸配列アラインメントのために使用したパラメータは、以下である：マッチ報酬（ｍａｔｃｈ ｒｅｗａｒｄ） １、ミスマッチペナルティ −３、ギャップ存在ペナルティ ５、ギャップ伸長ペナルティ ２（置換行列は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムにおいて使用されない）。幾つかの場合において、実質的同一性は、少なくとも３００ヌクレオチド残基（例えば、少なくとも３３０、３６０、３７５、３９０、４０５、４２０、４３５、４５０、４６５、４８０、４８３、４８６、４８９、４９２、４９５、または４９８ヌクレオチド）の比較の長さにわたって存在する。
（さらなる局面）
本発明の任意のポリペプチドが、より長いポリペプチド配列（例えば、１以上のドメインの付加によって生じる融合タンパク質）の一部、または部分配列として、このポリペプチドの安定化もしくは検出または精製のために、存在し得る。ポリペプチド精製部分配列としては、例えば、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、ＧＳＴ融合、または当該分野で公知の他の検出／精製部分配列または「タグ」が挙げられる。これらのさらなるドメインまたは部分配列は、本発明のポリペプチドの活性に殆ど影響を有さないかもしくは全く影響を有さないか、または合成後プロセシング工程（例えば、プロテアーゼ処理）によって除去され得る（インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）などを含む）。
本発明の任意のポリペプチドはまた、１以上の修飾アミノ酸を含む。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分と結合体化されたアミノ酸、または有機誘導体化剤に結合体化されたアミノ酸であり得る。修飾アミノ酸の存在は、例えば、（ａ）ポリペプチドの血清半減期および／もしくは機能的インビボ半減期を延長するか、（ｂ）ポリペプチド抗原性を低下するか、（ｃ）ポリペプチド保存安定性を高めるか、または（ｄ）バイオアベイラビリティを高める（例えば、ＡＵＣＳＣを増大する）際に有利であり得る。アミノ酸は、例えば、組換え産生（例えば、哺乳動物細胞における発現の間のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフにおけるＮ連結グリコシル化）の間、翻訳と同時にまたは翻訳後に修飾されるか、または合成手段によって修飾される。この局面は、本明細書中「インターフェロンα結合体」と題された章でより詳細に記載される。
本発明はまた、少なくとも１種の本発明のポリペプチド、および賦形剤またはキャリアを含有する組成物を提供する。１局面において、この組成物は、０〜１６アミノ酸位置（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６アミノ酸位置）で、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３のうちの１つ）と異なるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド、およびキャリアまたは賦形剤を含有する。この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアを含有する組成物であり得る。例示的な組成物およびキャリアを、いかに記載する。
（ポリペプチドの作製）
本発明のポリペプチドを産生するかまたは単離するための組換え方法が、本明細書中で記載される。組換え産生に加えて、このポリペプチドは、固相技術（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら（１９６９）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．（１９６３）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４を参照）を用いる直接ペプチド合成によって産生され得る。ペプチド合成は、手動の技術を用いるかまたは自動的に実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１ Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を製造業者によって提供される指示に従って用いて、達成され得る。例えば、部分配列は、化学的方法を用いて、別々に合成されるかまたは組み合わせて合成され、全長ポリペプチドまたはそのフラグメントが提供され得る。あるいは、このような配列を、ポリペプチドの産生を専門とする任意の数の会社で注文し得る。最も一般的には、本発明のポリペプチドは、コード核酸を発現させ、ポリペプチドを回収すること（例えば、以下に記載するように）により、産生され得る。
本発明のポリペプチドの産生のための方法がまた、含まれる。１つのこのような方法は、細胞の集団内に、本明細書中で記載される本発明の任意の核酸を導入する工程であって、この核酸は、コードされるポリペプチドを産生するために効果的な制御配列に作動可能に連結されている工程、培養培地中で細胞を培養し、ポリペプチドを発現させる工程、および細胞または培養培地からポリペプチドを単離する工程を、包含する。細胞による取り込み（トランスフェクション）を促進しかつ／またはポリペプチドを発現するために十分な核酸の量が、利用される。核酸は、このような細胞に、本明細書中で記載される任意の送達方法によって導入され、この送達方法としては、例えば、注射、遺伝子銃、受動的取り込みなどが挙げられる。核酸は、ベクター（例えば、ＤＮＡプラスミドベクターを含む組換え発現ベクター、または本明細書中で記載される任意のベクター）の一部であり得る。本発明の核酸または核酸を含むベクターは、本明細書中上述のように調製され得、かつ処方され得る。このような核酸または発現ベクターは、取り込みおよびコードされたポリペプチドの発現を生じるために十分な量で、哺乳動物の細胞の集団内にインビボで導入され得るか、または選択された哺乳動物細胞（例えば、腫瘍細胞）が哺乳動物から取り出され得、そして核酸発現ベクターが、このような細胞の集団内にエキソビボで導入され得る。あるいは、本発明の核酸または核酸を含むベクターが、培養細胞を用いてインビトロで産生される。１局面において、本発明のポリペプチドを産生する方法は、以下の工程：細胞の集団内に、本明細書中で記載される本発明の任意の核酸を含む組換え発現ベクターを、ベクターの取り込みおよびコードされたポリペプチドの発現が生じる量および処方で導入する工程；発現ベクターを、本明細書中に記載される任意の導入／送達様式で哺乳動物内に投与する工程；および哺乳動物由来のポリペプチドまたは哺乳動物の副産物由来のポリペプチドを単離する工程、を包含する。
（抗体）
本発明の別の局面において、本発明のポリペプチド（またはその抗原性フラグメント）が使用され、例えば、診断用途、治療用途、または予防用途（例えば、ポリペプチドおよびそのフラグメントの活性、分布、発現に関連する）を有する抗体が産生される。本発明のポリペプチドは、当該分野で周知の方法によって産生され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメントが挙げられ得るが、これらに限定されない。抗体（例えば、レセプター結合を遮断する抗体）は、治療用途および／または予防用途のために特に好ましい。
抗体誘導のためのポリペプチドは、生物学的活性を必要としない；しかし、このポリペプチドまたはペプチドは、抗原性であるべきである。特定の抗体を誘導するために使用されるポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸、好ましくは少なくとも約１５もしくは２０アミノ酸、または少なくとも約２５もしくは３０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し得る。ポリペプチドの短い鎖は、別のタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）と融合され得、そして抗体が、キメラ分子に対して産生される。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当該分野で公知であり、そして多くの抗体が使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ’Ｃｏｌｌｉｇａｎら編，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９１および２００１，補遺）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓら（編集）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡおよびこの中で挙げられた文献；ならびにＧｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照のこと。抗体調製のための他の好適な技術としては、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択が挙げられる。Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６を参照のこと。特定のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と抗血清とは、通常、少なくとも約０．１μＭ、好ましくは少なくとも約０．０１μＭ以下、最も好ましくは０．００１μＭ以下のＫＤで結合する。
キメラ（ヒト化）抗体の調製のための詳細な方法は、米国特許第５，４８２，８５６号において見出され得る。ヒト化技術および他の抗体産生技術ならびに操作技術のさらなる詳細は、以下において見出され得る：Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編集）（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）、およびＰａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ（Ｐａｕｌ）。
１局面において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに対する完全ヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は、抗体が、治療剤および／または予防剤として、ヒト患者においてインビボで使用される場合、特に望ましい。ヒト抗体は、特徴上、ヒト免疫グロブリン配列からなる。本発明のヒト抗体は、広範な種々の方法を用いて産生され得る（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら，米国特許第５，００１，０６５号、ならびに概説については、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙおよびＰａｕｌ，前出を参照のこと）。１局面において、本発明のヒト抗体は、最初にトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）細胞において産生される。次いで、抗体をコードする遺伝子が、他の細胞（例えば、非ヒト哺乳動物細胞）においてクローン化され、発現される。トリオーマ技術によってヒト抗対を産生するための一般的アプローチは、Ｏｓｔｂｅｒｇら（１９８３），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７、Ｏｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号、およびＥｎｇｅｌｍａｎら，米国特許第４，６３４，６６６号によって記載される。この方法によって得られた抗体産生細胞株は、３種の細胞（２種のヒト細胞および１種のマウス細胞）の流れをくむため、トリオーマと呼ばれる。本発明のポリペプチドについて企図される他の用途は、明細書全体を通じて提供される。
（インターフェロンα結合体）
別の局面において、本発明は、インターフェロンα活性を示すポリペプチドを含む複合体に関連し、この複合体は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４、ならびにポリペプチドの結合基に結合する少なくとも１種の非ポリペプチド部分（例えば、ポリペプチドの結合基に結合する１〜６種、１〜５種、１〜４種、１〜３種、たとえば１種または２種の非ポリペプチド部分）のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。この結合体はまた、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示すことが理解される。
別の局面において、本発明は、インターフェロンα活性を示すポリペプチドを含む複合体に関連し、このポリペプチドは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のいずれか１つ（例えば、該列番号１〜１５、４７または５３のうち１つ）と非ポリペプチド部分に対する結合基を含む、導入されたかまたは取り除かれたアミノ酸残基から選択される少なくとも１アミノ酸で異なる、アミノ酸配列を含む。この局面に従って導入され、そして／または取り除かれるアミノ酸残基の例は、以下の章においてさらに詳細に記載される。この結合体自体もまた、インターフェロンα活性を示すことが理解される。
別の局面において、結合体は、０〜１６アミノ酸位置（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６アミノ酸位置）で、例えば、０〜１４アミノ酸位置、０〜１２アミノ酸位置、０〜１０アミノ酸位置、０〜８アミノ酸位置、０〜６アミノ酸位置、０〜５アミノ酸位置、０〜４アミノ酸位置、０〜３アミノ酸位置、０〜２アミノ酸位置、または０〜１アミノ酸位置で、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のいずれか１つ（例えば、該列番号１〜１５、４７または５３のうち１つ）と異なるアミノ酸配列を含む。本発明の１局面において、非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基が、（例えば、非ポリペプチド部分に対する結合基を含む異なった残基でのアミノ酸残基の置換、または非ポリペプチド部分に対する結合基を含むさらなるアミノ酸残基の挿入によって）導入される。
用語「結合体」（または相互交換可能に「ポリペプチド結合体」もしくは「結合体化ポリペプチド」）は、本発明の１以上のポリペプチドの１以上の非ポリペプチド部分への共有結合によって形成される、異種起源の（複合体の意味で）分子を意味する。用語「共有結合」は、ポリペプチドと非ポリペプチド部分とが、互いに直接的に共有結合するか、または介在する部分（例えば、架橋、スペーサー、または連結部分）を介して互いに間接的に共有結合するかのいずれかを意味する。好ましくは、結合体化ポリペプチドは、関連する濃度および条件において可溶であり、すなわち、生理学的液体（例えば、血液）に可溶である。本発明の結合体化ポリペプチドの例としては、グリコシル化および／またはＰＥＧ化ポリペプチドが挙げられる。用語「非結合体化ポリペプチド」は、結合体化ポリペプチドのポリペプチド部分をいうために使用され得る。
用語「非ポリペプチド部分」は、ポリペプチドの結合基に結合体化可能な部分を意味することが意図される。非ポリペプチド部分の好ましい例としては、ポリマー分子、糖部分、親油性化合物、または有機誘導体化剤が挙げられ、特に、ポリマー分子または糖部分である。非ポリペプチド部分が、ポリペプチドの結合基を介してこのポリペプチドに結合することが理解される。ポリペプチドに結合する非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子）の数が特別に示される場合を除き、ポリペプチドに結合するかまたは本発明において他に使用されるそれぞれの「非ポリペプチド部分」の言及は、ポリペプチドに結合する１以上の非ポリペプチド部分を言及するべきである。
用語「ポリマー部分」は、２以上のモノマーの共有結合によって形成される分子として定義され、ここで、アミノ酸残基であるモノマーはない。用語「ポリマー」は、用語「ポリマー分子」と相互交換可能に使用され得る。
用語「糖部分」は、インビボまたはインビトロのグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化）によって結合する炭水化物分子を示すことが意図される。
「Ｎ−グリコシル化部位」は、配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃを有し、ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｎは、アスパラギンであり、Ｓ／Ｔ／Ｃは、セリン、トレオニンまたはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはトレオニン、最も好ましくはトレオニンである。
「Ｏ−グリコシル化部位」は、セリンまたはトレオニン残基のＯＨ−基を含む。
用語「結合基」は、関連する非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子または糖部分）にカップリング可能なアミノ酸残基の基を示すことが意図される。有用な結合基および幾つかの対応する非ポリペプチド部分の非限定の例を、以下の表４に提供する。
Figure 2006506097
 。
インビボＮ−グリコシル化について、用語「結合基」は、従来的でない方法で使用され、Ｎ−グリコシル化部位（配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃを有し、ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｎは、アスパラギンであり、Ｓ／Ｔ／Ｃは、セリン、トレオニンまたはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはトレオニン、最も好ましくはトレオニンである）を構成するアミノ酸残基を示す。Ｎ−グリコシル化部位のアミノ酸残基は、グリコシル化の間に糖部分が結合する残基であるが、このような結合は、Ｎ−グリコシル化部位の他のアミノ酸残基が存在しない限り達成され得ない。従って、非ポリペプチド部分が糖部分であり、そして結合がＮ−グリコシル化によって達成される場合、用語「非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基」は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の改変に関して使用される場合、Ｎ−グリコシル化部位を構成する１、２または全てのアミノ酸残基が、機能的Ｎ−グリコシル化部位がアミノ酸配列内に導入されるか、この配列から取り除かれるか、または機能的Ｎ−グリコシル化部位がアミノ酸配列内で維持される（例えば、既にＮ−グリコシル化部位の一部を構成するセリン残基のトレオニンによる置換、またはその逆による）様式で改変されると理解される。
用語「導入」（すなわち、「導入された」アミノ酸残基、アミノ酸残基の「導入」）は、存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを主に意味することが意図されるが、さらなるアミノ酸残基の挿入もまた、意味し得る。
用語「取り除く」（すなわち、「取り除かれた」アミノ酸残基、アミノ酸残基の「除去」）は、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基と入れ替わる置換を意味することが意図されるが、アミノ酸残基を欠失（置換しない）して取り除くこともまた、意味し得る。
用語「非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基」は、非ポリペプチド部分が結合する（導入されたアミノ酸残基の場合）か、または結合を有する（取り除かれたアミノ酸残基の場合）アミノ酸残基を示すことが意図される。
用語「機能的インビボ半減期」は、通常の意味（すなわち、ポリペプチドの生物学的活性の５０％が、体内／標的器官においてなお存在する時点、またはポリペプチドの活性が初期値の５０％である時点）で使用され得る。機能的インビボ半減期は、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、イヌまたはサル）において決定され得る。好ましくは、機能的インビボ半減期は、非ヒト類人猿（例えば、サル）において決定される。さらに、機能的インビボ半減期は、静脈内または皮下に投与されているサンプルについて決定され得る。
機能的インビボ半減期を決定することの代替として、「血清半減期」（すなわち、ポリペプチドの５０％が血漿または血流中に循環し、排除される前の時点）が決定され得る。血清半減期の決定は、しばしば、機能的インビボ半減期の決定より単純であり、血清半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさのよい指標である。あるいは、血清半減期に対する用語としては、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」が挙げられる。血清半減期は、機能的インビボ半減期の決定に関連して、上述のように決定され得る。
用語「血清」は、その通常の意味で使用される。すなわち、フィブリノゲンおよび他の凝固因子を含まない血漿である。
機能的インビボ半減期または血清半減期に関して使用される場合、用語「延長した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」は、本発明の結合体の対応する半減期が、参照分子の対応する半減期と比較して統計的に有意に延長していることを意味し、参照分子は、例えば、ヒトインターフェロンαのような野生型インターフェロンα（例えば、配列番号３１〜配列番号４２のうちの１つ（または本明細書中および／もしくはＡｌｌｅｎＧ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）で示す他のｈｕＩＦＮ−α配列））または対応する非結合体化ポリペプチドである。従って、本発明の目的の結合体としては、上述の参照分子と比較して延長したインビボ半減期または延長した血清半減期を有する結合体が挙げられる。
用語「ＡＵＣＳＣ」または「皮下投与された場合の曲線下領域」は、その通常の意味で使用される。すなわち、結合体化分子が実験動物に皮下投与されている場合の血清中インターフェロンα活性 対 時間曲線である。一旦、実験的インターフェロン活性時点が決定されると、ＡＵＣＳＣは、コンピュータープログラム（例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０１）によって従来的に計算され得る。
ＡＵＣＳＣに関して使用される場合、用語「増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」は、皮下投与した場合の、本発明の結合体についての曲線下領域を示すために使用され、比較可能条件下で決定した場合の参照分子（例えば、ヒトインターフェロンαのような野生型インターフェロンα（例えば、配列番号３１〜配列番号４２のうちの１つ（または本明細書中および／もしくはＡｌｌｅｎＧ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）で示す他のｈｕＩＦＮ−α配列））または対応する非結合体化ポリペプチド）のそれと比較して、統計的に有意な増加である。明白に、本発明の結合体および参照分子について、同量のインターフェロンα活性が投与されるべきである。従って、異なるインターフェロンα分子間の直接比較を行うために、ＡＵＣＳＣは、代表的に標準化されるべきであり、すなわち、投与されるＡＵＣＳＣ／用量として表されるべきである。
用語「Ｔｍａｘ，ＳＣ」は、血清中インターフェロンα活性 対 時間曲線において、血清中で最高のインターフェロンα活性が観察された時点について使用される。親ポリペプチドに対する例および修飾は、本明細書中で、一般に配列番号１の配列に関連して提供されるが、開示された修飾はまた、上述の本発明の任意の他のポリペプチド（配列番号２〜１５および４４〜１０４、ならびにこれらの改変体）の等価のアミノ酸位置において成され得ると理解される。
非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸の除去および／または導入によって、ポリペプチドを特定に適合させ、選りすぐった非ポリペプチド部分に対する結合体に対してより感受性の分子を作製し、結合様式を最適化する（例えば、インターフェロンα分子の表面上の非ポリペプチド部分の選りすぐった最適な分布を確実にし、それによって、例えば、エピトープおよびポリペプチドの他の表面部分を、その機能を有意に損なうことなく有効に保護する）ことを可能にする。例えば、結合基の導入により、インターフェロンαポリペプチドは、関連の非ポリペプチド部分が結合する特定のアミノ酸残基に関連して改変され、それにより、より有効な、特異的かつ／または広範囲の結合が達成される。１以上の結合基の除去により、非ポリペプチド部分のポリペプチド部分に対する結合を避けることが可能になり、ここで、このような結合（例えば、ポリペプチドの機能部位またはその近傍に位置するアミノ酸への結合）は不利である（何故なら、このような部位における結合は、インターフェロンα活性の不活性化または減少をもたらし得、レセプター認識しない結合体を生じ得るからである）。さらに、別の結合基に近接した結合基を除去することが有利であり得る。
非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基が、それが取り除かれるにしろまたはそれが導入されにしろ、その非ポリペプチド部分の特性に基づいて選択され、いくつかの例においては、使用される結合体化法に基づいて選択される。例えば、その非ポリペプチド部分がポリマー分子（例えば、このようなポリエチレングリコール誘導分子またはポリアルキルレンオキシド誘導分子）である場合、結合基として機能し得るアミノ酸鎖残基は、システイン、リジン（および／またはそのポリペプチドのＮ末端アミノ基）、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群より選択され得る。その非ポリペプチド部分が、糖部分である場合、その結合基は、インビボまたはインビトロのＮ−グリコシル化部位またはＯ−グリコシル化部分であり、好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位である。
いくつかの例において、非ポリペプチド部分に対する結合基が、そのインターフェロンαポリペプチドに導入されるかまたはそのポリペプチドから取り除かれると、その改変されるインターフェロンαポリペプチドの位置が、首尾よく、以下のように、選択される。
改変される位置は、そのインターフェロンαポリペプチドの表面（例えば、溶媒に対して２５％を超える側鎖が露出されているアミノ酸（例えば、その溶媒に対して５０％を超えるその側鎖が露出されているアミノ酸）によって占められる位置）に位置づけられえる。このような位置は、本明細書中の「材料および方法」の節において記載されるようなヒトインターフェロンα ２ａの３次元（３Ｄ）構造の分析に基づいて同定された。
あるいは、もしくは、さらに、改変される位置は、インターフェロンαタンパク質配列ファミリーの分析（例えば、図２および４に示されるようなアライメント）に基づいて同定され得る。以下の例の目的のために、図２のアライメントの一番上の行に示されるような配列番号１は、改変される親インターフェロンαであると考えられ、そして、そのアライメントの残りの部分のヒトインターフェロンα配列は、そのファミリーの他のメンバーであると考えられる。例えば、その親配列において改変される位置は、その親インターフェロン以外のファミリーの１以上のメンバーにおいて、（ａ）直接関連のある結合基を含むアミノ酸残基によって占められるか（このとき、このようなアミノ酸残基は、その親配列に対して導入されるものである）、または（ｂ）その親インターフェロンαであって、その１以上の他のメンバーにおいては、その直接関連のある結合基を含むアミノ酸残基にによって示される（このとき、このようなアミノ酸残基は、その親配列から取り除かれる）。
結合基の最適な分布を決定するために、そのインターフェロンα分子の表面に位置づけられるアミノ酸の間の距離を、そのインターフェロンαポリペプチドの３Ｄ構造に基づいて計算した。より具体的には、このような結合基を含むアミノ酸残基のの間距離、または、結合基を含むあるアミノ酸残基の官能基（リジンに関してはＮＺ、アスパラギン酸にかんしてはＣＧ、グルタミン酸に関してはＣＤ、システインに関してはＳＧ）と、結合基を含む別のアミノ酸残基のＣＢとの間の距離が、決定される。グリシンの場合、ＣＡが、ＣＢの代わりに使用された。本発明の結合体のインターフェロンαポリペプチド部分において、上記の距離のいずれかが、不均一な結合体化を回避または低減し、そして、結合基の一様な分布を提供するために（例えば、エピトープシールディングの目的で）、８Åを超え得る（例えば、１０Å超える）。
さらに、本発明のインターフェロンαポリペプチド部分において、いくつかの例では、インターフェロンαのレセプター結合部部に位置するかまたはその近位に位置にする結合基は、例えば、このような基を含むアミノ酸残基の置換によって、取り除かれる。いくつかの例において、非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基（例えば、システインまたはリジン）は、そのインターフェロンα分子のレセプター結合部分またはその近位では導入されないことが多い。
インターフェロンポリペプチドを改変するための別のアプローチは、非ポリペプチド部分に対する結合体化によって、その親インターフェロンαにおいて存在するエピトープをシールドして、そして、それによってそのエピトープを改変または破壊するか、あるいはさもなければ、そのエピトープを不活性化することである。インターフェロンαポリペプチドのエピトープは、当該分野で公知の方法、または、エピトープマッピングとして知られているような方法によって同定され得る。例えば、Ｒｏｍａｇｎｏｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，１９９９，３８０（５）：５５３−９，ＤｅＬｉｓｓｅｒ ＨＭ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９９，９６：１１−２０，Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，１９９７，８５（３）：２２９−３５，Ｓａｉｎｔ−Ｒｅｍｙ ＪＭ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１９９７，１１９（１）：７７−８１ならびにＬａｎｅ ＤＰおよびＳｔｅｐｈｅｎ ＣＷ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９３，５（２）：２６８−７１を参照のこと。１つの方法は、例えば、９アミノ酸酸のランダムオリゴペプチドを発現するファージディスプレイライブラリーを確立することである。ヒトインターフェロンαに対する特異的抗血清に由来するＩｇＧ１抗体は、免疫沈降法によって精製され、そして、その反応性ファージが、免疫ブロッティングによって同定される。それらの精製した反応性ファージのＤＮＡをスクリーニングすることによって、そのオリゴペプチドの配列は、決定され、その後、そのインターフェロンαの３Ｄ構造上にその配列が位置づけられ得る。あるいは、エピトープは、米国特許第５，０４１，３７６号に記載される方法に従って同定され得る。その構造上でそれによって同定された領域は、非ポリペプチド部分に対する結合基の導入のため標的領域として選択され得る。好ましくは、インターフェロンαの少なくとも１つのエピトープ（例えば、２、３または４個のエピトープ）は、本発明に従う非ポリペプチド部分によってシールドされる。したがって、１つの局面において、本発明の結合体は、野生型ヒトインターフェロンα（市販のインターフェロンαの任意のものを含む）と比較して少なくとも１個、シールドされたエピトープを有する。これは、所定のエピトープの近傍（すなわち、その一次配列上で、アミノ酸４残基以内であるか、またはその３次元配列において約１０Å内にある）に位置づけられる位置に非ポリペプチド部分に対する結合基を導入することによって行われる。ＣＢ（グリシンにおいてはＣＡ）の間で、１０Åの距離が測定される。このような具体的な導入は、以下の節において記載される。
結合基を取り除く場合において、このような基を含み、かつ上記のように規定された関連するアミノ酸残基は、問題としている非ポリペプチド部分に対する結合基を含まない様々なアミノ酸残基で置換されるか、または取り除かれ得る。Ｎグリコシル基を取り除くことは、モチーフＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃ内のアミノ酸残基の挿入または除去によって達成され得る。
結合基の導入の場合において、このような基を含むアミノ酸残基は、例えば、このような位置を閉めるアミノ酸残基の置換によって、 その位置に導入される。
結合体化にとって利用可能であり、かつインターフェロンαポリペプチド中に存在する結合基の正確な数は、結合体化によって達成される所望の効果に依存する。得られる効果は、例えば、結合体化の特性および程度（例えば、非ポリペプチド部分の同一性、そのポリペプチドに対して結合体化するために所望であるかまたは可能であるポリペプチド部分（ここで、これらの部分は、結合体化されるか、またはそれらの部分は、結合体化されることが回避される））に依存する。例えば、免疫原性を低減することが必要と所望される場合、結合基の数（および位置）は、殆どまたは全てのエピトープをシールドするのに十分なものであるべきである。これは、さらに多くの集団のインターフェロンαポリペプチドがシールドされる場合に、通常は得られる。エピトープの効果的なシールドは、結合体化に利用可能である結合基の総数が、１〜６個の結合基の範囲（例えば、１〜５、１〜３の範囲、１、２、または３の結合基）にある。
機能のインビボ半減期は、その結合体の分子量に依存し、したがって、半減期の増大を提供するために必要な結合基の数は、問題とする非ポリペプチドの分子量に依存する。このようないくつかの結合体は、１〜６、例えば、１〜５（例えば、１〜３）、例えば、１、２、または３の非ポリペプチド部分を含み、そのれらの各々は、約２〜４０ｋＤａ（例えば、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａまたは約４０ｋＤａ）のＭＷを有する。
本発明の結合体において、いくつかの、殆ど、または実質的に全ての、結合体化可能基は、関連する非ポリペプチド部分によって占有されている。
本発明の結合体は、１以上の以下ような性質の改善を示し得る。
例えば、その結合体は、ヒトインターフェロン−α（例えば、配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ、または本明細書および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）、前出に記載されるような他のｈｕＩＦＮ−αのいずれか）または、その対応する非結合体化ポリペプチドと比較して低減した免疫原性（非結合体化ポリペプチドと比較した場合、またはヒトインターフェロンと比較した場合に、例えば、少なくとも１０％の低減、例えば、少なくとも２５％の低減、少なくとも５０％の低減、少なくとも７５％の低減）を示し得る。
別の局面において、この結合体は、対応する非結合体化ポリペプチドと比較して、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ、または本明細書および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）、前出に記載されるような他のｈｕＩＦＮ−αのいずれか）で処置した患者に由来する中和抗体との反応が低減されたか（例えば、少なくとも１０％の中和の減少、２５％の中和の減少、５０％の中和の減少、少なくとも７５％の中和の減少）、または全く反応しないことを示す。
本発明の別の局面において、その結合体は、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ、または本明細書および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）、前出に記載されるような他のｈｕＩＦＮ−αのいずれか）のような参照分子と比較する場合、または、その対応する非結合体化ポリペプチドと比較した場合の、機能のインビボ半減期の増大および／または血清の半減期の増大を示し得る。特定の好ましい結合体化は、上述の結合体の機能インビボ半減期（または血清半減期）と上述の参照分子の機能インビボ半減期（または血清半減期）の比が、少なくとも１．２５、少なくなくとも、１．５０、少なくとも１．７５、少なくとも２、少なくとも３、少なくなくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８である。上述のように、その半減期は、実験動物（例えば、ラットまたはサル）において慣用的され、そして、静脈投与または皮下投与に基づき得る。
さらなる局面において、その結合体は、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ、または本明細書および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）、前出に記載されるような他のｈｕＩＦＮ−αのいずれか）のような参照分子または対応する非結合体化ポリペプチドと比較した場合に、バイオアベイラビリティーの増大を示し得る。例えば、その結合体は、参照分子（例えば、ヒトインターフェロンαまたはその対応する非結合体化ポリペプチド）と比較視した場合に、ＡＵＣｓｃの増大を示し得る。したがって、例示的な結合体は、上述のＡＵＣｓｃと上述の参照分子のＡＵＣｓｃとの間の比が、皮下投与したときに、特に、ラットまたはサルのような実験動物の皮下に投与される場合に、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、例えば、少なくとも１６、少なくとも１８、または少なくとも２０であるような結合体である。同様に、本発明のいくつかの結合体は、上記結合体についてのＴｍａｘと上記参照分子（例えば、ヒトインターフェロンαまたはその対応する非結合体化ポリペプチド）についてのＴｍａｘとの間の比が、皮下投与したときに、特に、ラットまたはサルのような実験動物の皮下に投与される場合に、少なくとも１．２、少なくとも１．４、少なくとも１．６、少なくとも１．８、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、例えば、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、例えば、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０であるような結合体である。
いくつかの例において、本発明の結合体の抗ウイルス活性の大きさは、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ、または本明細書および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）、前出に記載されるような他のｈｕＩＦＮ−αのいずれか）の抗ウイルス活性の大きさ、または対応する非結合体化ポリペプチドの抗ウイルス活性の大きさに対して、（例えば、少なくとも７５％分、少なくとも５０％分、少なくとも２５％分、少なくとも１０％分）低減しているか、または（例えば、少なくとも１０％分）増大しているか、あるいは、ほぼ等しい（例えば、約±１０％または約±５％）。いくつかの例において、本発明の結合体の抗増殖性活性と比較したときの抗ウイルス活性の程度は、変化し得、したがって、ヒトインターフェロンαの抗ウイルス活性またはその対応する非結合体化ポリペプチドの抗ウイルス活性に対して、高い、低いまたはほぼ等しい。
（非ポリペプチド部分がシステイン残基に結合する本発明の結合体）
別の局面において、本発明は、インターフェロンα活性を提示しかつインターフェロンαの少なくとも１つのシステイン残基に結合体化した少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含む結合体に関連する。少なくとも１つのシステイン残基が、親インターフェロンα配列において、その分子の表面に出ているアミノ酸残基（好ましくは、その分子の表面に少なくとも２５％露出している側鎖、その表面に少なくとも５０％露出している側鎖を有している残基）によって占められている位置に、例えば、置換または挿入によって、少なくとも１つのシステイン残基が導入されている点で、そのインターフェロンαのアミノ酸配列は、親インターフェロンαのアミノ酸配列とはアミノ酸位置０〜１６において異なっている。このようなインターフェロンαポリペプチドは、配列番号１〜１５および４４〜１０４のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号３、破裂番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３のうちの１つ）を含む。代表的には、その結合体は、アミノ酸位置１〜１６（例えば、アミノ酸位置の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）において、配列番号１〜１５、４７、または５３のいずれかうちのいずれか１つのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。そのアミノ酸位置は、例えば、アミノ酸位置１〜１４、アミノ酸位置１〜１２、アミノ酸位置１〜１０、アミノ酸位置１〜８、アミノ酸位置１〜６、アミノ酸位置１〜５、アミノ酸位置１〜４、アミノ酸位置１〜３またはアミノ酸位置１〜２である。
本発明のいくつかの結合体は、配列番号１に対して、以下の置換のうちの１つ以上を含むポリペプチド配列を含み、この置換によって、約２５％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置に、システイン残基が導入される：Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｇ１０Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｑ２０Ｃ、Ｒ２２Ｃ、Ｒ２３Ｃ、Ｉ２４Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｌ２６Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ３０Ｃ、Ｋ３１Ｃ、Ｒ３３Ｃ、Ｈ３４Ｃ、Ｄ３５Ｃ、Ｒ３７Ｃ、Ｑ４０Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｅ４２Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｖ５１Ｃ、Ｑ５２Ｃ、Ｅ５９Ｃ、Ｑ６２Ｃ、Ｑ６３Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｓ６９Ｃ、Ｔ７０Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ｎ７２Ｃ、Ｓ７４Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｄ７８Ｃ、Ｅ７９Ｃ、Ｔ８０Ｃ、Ｌ８１Ｃ、Ｅ８３Ｃ、Ｋ８４Ｃ、Ｉ８７Ｃ、Ｆ９０Ｃ、Ｑ９１Ｃ、Ｎ９４Ｃ、Ｄ９５Ｃ、Ｅ９７Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｖ１００Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｖ１０４Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｍ１１２Ｃ、Ｎ１１３Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｑ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｔ１２８Ｃ、Ｌ１２９Ｃ、Ｔ１３２Ｃ、Ｋ１３３Ｃ、Ｋ１３４Ｃ、Ｋ１３５Ｃ、Ｙ１３６Ｃ、Ｓ１３７Ｃ、Ｐ１３８Ｃ、Ａ１４６Ｃ、Ｍ１４９Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｓ１５３Ｃ、Ｆ１５４Ｃ、Ｎ１５７Ｃ、Ｑ１５９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｒ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ。上記アミノ酸の位置は、配列番号１に対する位置づけれている。いくつかの例において、上述の位置の間で、４７、５７、および１３３の位置でアミノ酸残基は、システインで置換されていない。
例えば、本発明のいくつかのこのような結合体は、配列番号１に対する、１以上の以下の置換を含むポリペプチドを含み、この置換によって、約５０％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置に、システイン残基が導入される：Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｋ３１Ｃ、Ｒ３３Ｃ、Ｈ３４Ｃ、Ｄ３５Ｃ、Ｒ３７Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｄ７８Ｃ、Ｅ７９Ｃ、Ｔ８０Ｃ、Ｅ８３Ｃ、Ｋ８４Ｃ、Ｉ８７Ｃ、Ｆ９０Ｃ、Ｑ９１Ｃ、Ｎ９４Ｃ、Ｄ９５Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｑ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｌ１２９Ｃ、Ｔ１３２Ｃ、Ｋ１３３Ｃ、Ｋ１３５Ｃ、Ｐ１３８Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ。上記アミノ酸の位置は、配列番号１に対する位置づけれている。いくつかの例において、位置４７および１３３でのアミノ酸残基のうちの１つまたは両方が、システインで置換されていない。
上述のように、いくつかの例において、インターフェロンαの潜在的なレセプター結合部位の外側、すなわち、配列番号１に関する位置番号付けで、約２９〜４０位、７９〜９６位および１２４〜１４１位の外側にシステイン残基を導入することが好ましくあり得る。従って、いくつかの場合において、配列番号１に対する１つ以上のシステイン置換基が、以下からなる群より選択される：Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｇ１０Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｑ２０Ｃ、Ｒ２２Ｃ、Ｒ２３Ｃ、Ｉ２４Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｌ２６Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｅ４２Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｖ５１Ｃ、Ｑ５２Ｃ、Ｅ５９Ｃ、Ｑ６２Ｃ、Ｑ６３Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｓ６９Ｃ、Ｔ７０Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ｎ７２Ｃ、Ｓ７４Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｅ９７Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｖ１００Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｖ１０４Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｍ１１２Ｃ、Ｎ１１３Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ａ１４６Ｃ、Ｍ１４９Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｓ１５３Ｃ、Ｆ１５４Ｃ、Ｎ１５７Ｃ、Ｑ１５９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｒ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ（これら位置は、約２５％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置であり、かつ、推定レセプター結合部位の一部ではない）。いくつかの場合において、４７位と５１位との１つまたは両方が、システインで置換されていない。
他の局面において、配列番号１に対するシステイン置換は、以下からなる群から選択される：Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ（これら位置は、約５０％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置であり、かつ、推定レセプター結合部位の一部ではない）。いくつかの場合において、４７位は、システインで置換されていない。
本発明のこのような結合体のいくつかは、配列番号１に対して以下の置換基のうちの１つ以上を含むポリペプチド配列番号を含む：Ｓ２５Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ３０Ｃ、Ｋ３１Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ｓ７４Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｅ７９Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１３２Ｃ、Ｋ１３３Ｃ、Ｐ１３８ＣおよびＫ１３５Ｃ。
別の局面において、１つ以上のシステイン残基が、置換（例えば、配列番号１に対してＱ１５９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｒ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣまたはＥ１６６Ｃ）または、挿入（例えば、Ｅ１６６ＥＣ、また、本明細書中で１６７Ｃとも呼ばれる）のいずれかによってＣ末端またはその近くに導入される。システイン残基はまた、本明細書中に記載されるインターフェロン−α分子のＣ末端連結フラグメントに、置換または挿入のいずれかによって導入され得る。
いくつかの場合、２つ以上の導入されたシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を回避するために、単一のシステイン残基のみが導入される。
インターフェロン−αにおいて、ジスルフィド結合は、１／９９位のと２９／１３９位のシステインの間で形成される。ジスルフィド結合２９／１３９は、生物学的活性に必須であり、一方で、１／９９結合は、生物学的に活性に有意に影響を及ぼすことなく還元され得る（Ｂｅｉｌｈａｒｚ Ｍ．Ｗ．ら（１９８６）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．６（６）：６７７−６８５）。従って、本発明の別の局面において、Ｃ１〜Ｃ９９のうちの１つは、好ましくは、置換（例えば、Ｃ１ＳまたはＣ９９Ｓ）によって除去され、それにより、非ポリペプチド部分に対する結合体化のために利用可能な他のシステイン残基を残す。
本発明のこの局面において企図される非ポリペプチド部分としては、「ポリマー分子に対する結合体化」との表題の節において言及された分子のいずれかのようなポリマー分子（例えば、ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）が挙げられる。システイン含有ポリペプチドとポリマー分子との間の結合体化は、例えば、「ポリマー分子に対する結合体化」との表題の節に記載されたような任意の適切な様式、例えば、上記節で言及された一段階法を用いて、もしくは段階様式で達成され得る。インターフェロン−αポリペプチドをＰＥＧ化するための例示的な方法は、システイン反応性ＰＥＧを用いてＰＥＧをシステイン残基に共有結合することである。異なる基および異なるサイズの直鎖もしくは分枝のＰＥＧ（例えば、２〜４０ｋＤａ（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａ））を有する多数の高度に特異的なシステイン反応性のＰＥＧ（例えば、オルソピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、マレイミド（ＭＡＬ）およびビニルスルホン（ＶＳ））が、例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡまたはＳｕｎＢｉｏ，Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａから市販されている。
親ポリペプチドに対する改変の例は、一般に、配列番号１の配列に対して（または、いくつかの他の特定の配列番号に対して）本明細書中で提供されるが、開示される改変がまた、本明細書中に記載される本発明の任意の他のポリペプチド（配列番号２〜１５および配列番号４４〜１０４ならびにその改変体を含む）の等価なアミノ酸位置においてなされ得ることが理解されるべきである。従って、例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｃは、配列番号５におけるＱ４７Ｃに対応すると理解されるなどである。
（非ポリペプチド部分がリジン残基に結合する、本発明の結合体）
別の局面において、本発明は、インターフェロン−α活性を示し０〜１６のアミン酸位置（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸位置）（例えば、０〜１４のアミノ酸位置において、０〜１２のアミノ酸位置において、０〜１０のアミノ酸位置において、０〜８のアミノ酸位置において、０〜６のアミノ酸位置において、０〜５のアミノ酸位置において、０〜４のアミノ酸位置において、０〜３のアミノ酸位置において、０〜２のアミノ酸位置において、または０〜１のアミノ酸位置において）において、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４から選択される配列を含むか、もしくは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のいずれとも異なる配列（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３のうちの１つ）を含む、インターフェロン−αポリペプチドの少なくとも１つのリジン残基および／またはＮ末端アミノ基に結合体化された少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含む結合体に関する。この局面に従ういくつかの結合体は、少なくとも１つの除去されたリジン残基および／または少なくとも１つの除去されたヒスチジン残基、および／または少なくとも１つの導入されたリジン残基を含む。
本発明のいくつかの結合体は、異なるアミノ酸残基またはアミノ酸残基の欠失に対するアミノ酸残基の置換を含むポリペプチド配列を含み、このアミノ酸残基の欠失は、１つ以上のリジン（例えば、Ｋ３１、Ｋ５０、Ｋ７１、Ｋ８４、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０および／またはＫ１６５（配列番号１に対して））を、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３のうちの１つのような本発明の任意のポリペプチドから除去する。除去される１つ以上のリジン残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得るか、Ａｒｇ（Ｒ）もしくはＧｌｎ（Ｑ）で置換され得るか、または、欠失され得る。いくつかのこのような結合体は、置換基Ｋ３１Ｒ＋Ｋ１２２Ｒ；Ｋ３１Ｒ＋Ｋ１３３Ｒ；Ｋ１２２Ｒ＋Ｋ１３３Ｒ；またはＫ３１Ｒ＋Ｋ１２２Ｒ＋Ｋ１３３Ｒを含む。他の例示的な置換基としては、Ｋ７１Ｅ；Ｋ８４Ｅ；Ｋ１３３Ｅ／Ｇ；およびＫ１６０Ｅが挙げられる。
アミン反応性結合対化学が採用される例において、ヒスチジン残基に対する結合体化の可能性を回避するか、または最小限にすることが有利であり得る。従って、本発明のいくつかの結合体は、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７ ｏｒ 配列番号５３のような本発明の任意のポリペプチド配列から、１つ以上のヒスチジン（例えば、Ｈ７、Ｈ１１、Ｈ３４および／またはＨ４７（配列番号１に対して））を除去する置換または欠失を含むポリペプチド配列を含む。除去される１つ以上のヒスチジン残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得るか、Ａｒｇ（Ｒ）もしくはＧｌｎ（Ｑ）で置換され得るか、または、欠失され得る。いくつかのこのような結合体は、置換基Ｈ３４Ｑ；Ｈ４７Ｑ；またはＨ３４Ｑ＋Ｈ４７Ｑを含む。
あるいは、または、加えて、本発明のいくつかの結合体は、分子の表面に露出されているアミノ酸残基（例えば、表面に露出されているその側鎖の少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％）を有するアミノ酸残基）により、親配列（例えば、配列番号１〜１５、４７または５３のうちの１つ）において占拠されている位置にリジンを導入する改変を含む、ポリペプチド配列を含む。いくつかのこのような結合体は、配列番号１に対して、以下の置換の１つ以上を含むポリペプチド配列を含み、この置換は、約２５％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置に、リジン残基が導入される：Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｇ１０Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｒ２２Ｋ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２４Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｌ２６Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｌ３０Ｋ、Ｒ３３Ｋ、Ｈ３４Ｋ、Ｄ３５Ｋ、Ｒ３７Ｋ、Ｑ４０Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｅ４２Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｖ５１Ｋ、Ｑ５２Ｋ、Ｅ５９Ｋ、Ｑ６２Ｋ、Ｑ６３Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ｓ６９Ｋ、Ｔ７０Ｋ、Ｎ７２Ｋ、Ｓ７４Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｄ７８Ｋ、Ｅ７９Ｋ、Ｔ８０Ｋ、Ｌ８１Ｋ、Ｅ８３Ｋ、Ｉ８７Ｋ、Ｆ９０Ｋ、Ｑ９１Ｋ、Ｎ９４Ｋ、Ｄ９５Ｋ、Ｅ９７Ｋ、Ａ９８Ｋ、Ｖ１００Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｖ１０４Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｍ１１２Ｋ、Ｎ１１３Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｑ１２５Ｋ、Ｒ１２６Ｋ、Ｔ１２８Ｋ、Ｌ１２９Ｋ、Ｔ１３２Ｋ、Ｙ１３６Ｋ、Ｓ１３７Ｋ、Ｐ１３８Ｋ、Ａ１４６Ｋ、Ｍ１４９Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｓ１５３Ｋ、Ｆ１５４Ｋ、Ｎ１５７Ｋ、Ｑ１５９Ｋ、Ｒ１６１Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ（上記アミノ酸残基は、配列番号１に対する位置である）。いくつかの例において、上記の位置の間で、４７位、５１位、５２位および１５４位における１つ以上のアミノ酸残基はりジンで置換されていない。
本発明のいくつかのこのような結合体は、配列番号１に対して、以下の置換のうちの１つ以上を含むポリペプチド配列を含み、この置換は、約５０％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置に、リジン残基が導入される：Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｒ３３Ｋ、Ｈ３４Ｋ、Ｄ３５Ｋ、Ｒ３７Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｄ７８Ｋ、Ｅ７９Ｋ、Ｔ８０Ｋ、Ｅ８３Ｋ、Ｉ８７Ｋ、Ｆ９０Ｋ、Ｑ９１Ｋ、Ｎ９４Ｋ、Ｄ９５Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｑ１２５Ｋ、Ｒ１２６Ｋ、Ｌ１２９Ｋ、Ｔ１３２Ｋ、Ｐ１３８Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ（上記アミノ酸位置は、配列番号１に対する位置である）。いくつかの例において、上記の位置の間で、４７位は、リジンで置換されていない。
上記のように、いくつかの例において、インターフェロンαの潜在的なレセプター結合部位の外側、すなわち、配列番号１に関する位置番号付けで、約２９〜４０位、７９〜９６位および１２４〜１４１位の外側にリジン残基を導入することが好ましくあり得る。従って、いくつかの場合において、配列番号１に対する１つ以上のリジン置換基が、以下からなる群より選択される：Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｇ１０Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｒ２２Ｋ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２４Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｌ２６Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｅ４２Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｖ５１Ｋ、Ｑ５２Ｋ、Ｅ５９Ｋ、Ｑ６２Ｋ、Ｑ６３Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ｓ６９Ｋ、Ｔ７０Ｋ、Ｎ７２Ｋ、Ｓ７４Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｅ９７Ｋ、Ａ９８Ｋ、Ｖ１００Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｖ１０４Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｍ１１２Ｋ、Ｎ１１３Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ａ１４６Ｋ、Ｍ１４９Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｓ１５３Ｋ、Ｆ１５４Ｋ、Ｎ１５７Ｋ、Ｑ１５９Ｋ、Ｒ１６１Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ（これら位置は、約２５％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置であり、かつ、推定レセプター結合部位の一部ではない）。いくつかの場合において、４７位、５１位および１５４位の１つ以上が、リジンで置換されていない。
いくつかの例において、１つ以上のリジン置換は、以下からなる群より選択される：Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ（これら位置は、約５０％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置であり、かつ、推定レセプター結合部位の一部ではない）。いくつかの場合において、４７位の１つ以上が、リジンで置換されていない。
本発明のこの局面において企図される非ポリペプチド部分としては、「ポリマー分子に対する結合体化」との表題の節において言及された分子のいずれかのようなポリマー分子（例えば、ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）が挙げられる。リジン含有ポリペプチドとポリマー分子との間の結合体化は、例えば、「ポリマー分子に対する結合体化」との表題の節に記載されたような任意の適切な様式、例えば、上記節で言及された一段階法を用いて、もしくは段階様式で達成され得る。インターフェロン−αポリペプチドをＰＥＧ化するための例示的な方法は、リジン反応性ＰＥＧを用いてＰＥＧをリジン残基に共有結合することである。異なる基および異なるサイズの直鎖もしくは分枝のＰＥＧ（例えば、２〜４０ｋＤａ（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａ））を有する多数の高度に特異的なシステイン反応性のＰＥＧ（例えば、プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＡ）、ブタノール酸スクシンイミジル（ＳＢＡ）、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）およびアルデヒド（例えば、ＢｕｔｙｒＡＬＤ））が、例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡまたはＳｕｎＢｉｏ，Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａから市販されている。
親ポリペプチドに対する改変の例は、一般に、配列番号１の配列に対して（または、いくつかの他の特定の配列番号に対して）本明細書中で提供されるが、開示される改変がまた、本明細書中に記載される本発明の任意の他のポリペプチド（配列番号２〜１５および配列番号４４〜１０４ならびにその改変体を含む）の等価なアミノ酸位置においてなされ得ることが理解されるべきである。従って、例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｋは、配列番号５におけるＱ４７Ｋに対応すると理解されるなどである。
（非ポリペプチド部分が糖部分である、本発明の結合体）
別の局面において、本発明は、インターフェロン−α活性を示し、インターフェロン−αに結合体化された少なくとも１つの糖部分を含む結合体に関し、少なくとも１つのグリコシル化部位、好ましくは、インビボＮ−グリコシル化部位が、好ましくは、置換によって、親インターフェロン−αポリペプチドにおける位置に導入されている、１〜１６アミノ酸位置において、親インターフェロン−αポリペプチドのものとは異なるアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４の任意の１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３のうちの１つ））が、表面に露出されているその側鎖の少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％）を有する分子）の表面に露出されているアミノ酸残基によって占拠されている。代表的に、この結合体は、１〜１６のアミノ酸位置（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸位置）において、（例えば、１〜１４アミノ酸位置において、１〜１２アミノ酸位置において、１〜１０アミノ酸位置において、１〜８アミノ酸位置において、１〜６アミノ酸位置において、１〜５アミノ酸位置において、１〜４アミノ酸位置において、１〜３アミノ酸位置において、または１〜２アミノ酸位置において）例えば、配列番号１〜１５、４７または５２のうちのいずれかのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。
Ｎ−グリコシル化部位は、上記部位のＮ−残基（Ａｓｎ）が、指定された位置に配置されるような方法で、導入される。同様に、Ｏ−グリコシル化部位は、このような部位を構成するＳ（Ｓｅｒ）残基またはＴ（Ｔｈｒ）残基が上記位置に配置されるように、導入される。用語「表面に露出されるその側鎖の少なくとも２５％（または５０％）」が、インビボＮ−グリコシル化部位の導入と組み合せて用いられる場合、この用語は、糖部分が実際に結合している位置におけるアミノ酸側鎖の表面アクセス可能性を言うことが理解されるべきである。多くの場合において、糖部分が実際に結合しているアスパラギン残基に対して＋２の位置にセリン残基もしくはスレオニン残基を導入し、セリン残基もしくはスレオニン残基が導入されるこれらの位置を覆い隠すこと、すなわち、分子の表面に露出されるその側鎖の２５％（５０％）未満を有することを可能にする。
本発明のいくつかの結合体は、配列番号１に対して、以下の置換の１つ以上を含むポリペプチド配列を含み、この置換は、約２５％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置に、リジン残基が導入される：Ｄ２Ｎ＋Ｐ４Ｓ／Ｔ、Ｌ３Ｎ＋Ｑ５Ｓ／Ｔ、Ｐ４Ｑ、Ｐ４Ｑ＋Ｔ６Ｓ、Ｑ５Ｎ＋Ｈ７Ｓ／Ｔ、Ｔ６Ｎ、Ｔ６Ｎ＋Ｓ８Ｔ、Ｈ７Ｎ＋Ｌ９Ｓ／Ｔ、Ｓ８Ｎ＋Ｇ１０Ｓ／Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｈ１１Ｓ／Ｔ、Ｇ１０Ｎ＋Ｒ１２Ｓ／Ｔ、Ｒ１２Ｎ、Ｒ１２Ｎ＋Ｔ１４Ｓ、Ｒ１３Ｎ＋Ｍ１５Ｓ／Ｔ、Ｍ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ａ１９Ｎ＋Ｍ２１Ｓ／Ｔ、Ｑ２０Ｎ＋Ｒ２２Ｓ／Ｔ、Ｒ２２Ｎ＋Ｉ２４Ｓ／Ｔ、Ｒ２３Ｎ、Ｒ２３Ｎ＋Ｓ２５Ｔ、Ｉ２４Ｎ＋Ｌ２６Ｓ／Ｔ、Ｓ２５Ｎ＋Ｆ２７Ｓ／Ｔ、Ｌ２６Ｎ、Ｌ２６Ｎ＋Ｓ２８Ｔ、Ｓ２８Ｎ＋Ｌ３０Ｓ／Ｔ、Ｌ３０Ｎ＋Ｄ３２Ｓ／Ｔ、Ｋ３１Ｎ＋Ｒ３３Ｓ／Ｔ、Ｒ３３Ｎ＋Ｄ３５Ｓ／Ｔ、Ｈ３４Ｎ＋Ｆ３６Ｓ／Ｔ、Ｄ３５Ｎ＋Ｒ３７Ｓ／Ｔ、Ｒ３７Ｎ＋Ｐ３９Ｓ／Ｔ、Ｑ４０Ｎ＋Ｅ４２Ｓ／Ｔ、Ｅ４１Ｎ＋Ｆ４３Ｓ／Ｔ、Ｅ４２Ｎ＋Ｄ４４Ｓ／Ｔ、Ｄ４４Ｎ＋Ｎ４６Ｓ／Ｔ、Ｆ４８Ｓ／Ｔ、Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔ、Ｋ５０Ｎ＋Ｑ５２Ｓ／Ｔ、Ｖ５１Ｎ＋Ａ５３Ｓ／Ｔ、Ｑ５２Ｎ＋Ｉ５４Ｓ／Ｔ、Ｅ５９Ｎ＋Ｍ６１Ｓ／Ｔ、Ｑ６２Ｎ、Ｑ６２Ｎ＋Ｔ６４Ｓ、Ｑ６３Ｎ＋Ｆ６５Ｓ／Ｔ、Ｆ６８Ｓ／Ｔ、Ｓ６９Ｎ＋Ｋ７１Ｓ／Ｔ、Ｔ７０Ｎ＋Ｎ７２Ｓ／Ｔ、Ｋ７１Ｎ、Ｋ７１Ｎ＋Ｓ７３Ｔ、Ｓ７４Ｔ、Ｓ７４Ｎ＋Ａ７６Ｓ／Ｔ、Ａ７５Ｎ＋Ｗ７７Ｓ／Ｔ、Ｄ７８Ｎ、Ｄ７８Ｎ＋Ｔ８０Ｓ、Ｅ７９Ｎ＋Ｌ８１Ｓ／Ｔ、Ｔ８０Ｎ＋Ｌ８２Ｓ／Ｔ、Ｌ８１Ｎ＋Ｅ８３Ｓ／Ｔ、Ｅ８３Ｎ＋Ｆ８５Ｓ／Ｔ、Ｋ８４Ｎ＋Ｙ８６Ｓ／Ｔ、Ｉ８７Ｎ＋Ｌ８９Ｓ／Ｔ、Ｆ９０Ｎ＋Ｑ９２Ｓ／Ｔ、Ｑ９１Ｎ＋Ｍ９３Ｓ／Ｔ、Ｌ９６Ｓ／Ｔ、Ｄ９５Ｎ＋Ｅ９７Ｓ／Ｔ、Ｅ９７Ｎ＋Ｃ９９Ｓ／Ｔ、Ａ９８Ｎ＋Ｖ１００Ｓ／Ｔ、Ｖ１００Ｎ＋Ｑ１０２Ｓ／Ｔ、Ｍ１０１Ｎ＋Ｅ１０３Ｓ／Ｔ、Ｑ１０２Ｎ＋Ｖ１０４Ｓ／Ｔ、Ｅ１０３Ｎ＋Ｇ１０５Ｓ／Ｔ、Ｖ１０４Ｎ＋Ｖ１０６Ｓ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ＋Ｅ１０７Ｓ／Ｔ、Ｅ１０７、Ｅ１０７Ｎ＋Ｔ１０９Ｓ、Ｅ１０８Ｎ＋Ｐ１１０Ｓ／Ｔ、Ｌ１１１Ｎ＋Ｎ１１３Ｓ／Ｔ、Ｍ１１２Ｎ＋Ｖ１１４Ｓ／Ｔ、Ｎ１１３Ｎ＋Ｄ１１５Ｓ／Ｔ、Ｖ１１４Ｎ、Ｖ１１４Ｎ＋Ｓ１１６Ｔ、Ｄ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｌ１１８Ｎ＋Ｖ１２０Ｓ／Ｔ、Ｒ１２１Ｎ＋Ｙ１２３Ｓ／Ｔ、Ｋ１２２Ｎ＋Ｆ１２４Ｓ／Ｔ、Ｑ１２５Ｎ＋Ｉ１２７Ｓ／Ｔ、Ｒ１２６Ｎ、Ｒ１２６Ｎ＋Ｔ１２８Ｓ、Ｔ１２８Ｎ＋Ｙ１３０Ｓ／Ｔ、Ｌ１２９Ｎ＋Ｌ１３１Ｓ／Ｔ、Ｔ１３２Ｎ＋Ｋ１３４Ｓ／Ｔ、Ｋ１３３Ｎ＋Ｋ１３５Ｓ／Ｔ、Ｋ１３４Ｎ＋Ｙ１３６Ｓ／Ｔ、Ｋ１３５Ｎ、Ｋ１３５Ｎ＋Ｓ１３７Ｔ、Ｙ１３６Ｎ＋Ｐ１３８Ｓ／Ｔ、Ｐ１３８Ｎ、Ｐ１３８Ｎ＋Ｓ１４０Ｔ、Ａ１４６Ｎ＋Ｉ１４８Ｓ／Ｔ、Ｍ１４９Ｎ、Ｍ１４９Ｎ＋Ｓ１５１Ｔ、Ｒ１５０Ｎ＋Ｆ１５２Ｓ／Ｔ、Ｓ１５３Ｎ、Ｓ１５３Ｎ＋Ｓ１５５Ｔ、Ｆ１５４Ｎ＋Ｆ１５６Ｓ／Ｔ、Ｑ１５９Ｓ／Ｔ、Ｋ１６０Ｎ＋Ｌ１６２Ｓ／Ｔ、Ｒ１６１Ｎ＋Ｒ１６３Ｓ／Ｔ、Ｌ１６２Ｎ＋Ｒ１６４Ｓ／Ｔ、Ｒ１６３Ｎ＋Ｋ１６５Ｓ／ＴおよびＲ１６４Ｎ＋Ｅ１６６Ｓ／Ｔ。いくつかの例において、上記の位置の間で、４７位、５１位、１３３位および１４０位のうちの１つ以上におけるアミノ酸残基は、上記のように修飾されない。Ｓ／Ｔは、セリン残基もしくはスレオニン残基、好ましくはスレオニン残基に対する置換を意味する。
本発明のいくつかの結合体は、配列番号１に対して、１つ以上の以下の置換を含むポリペプチドを含み、この置換は、約５０％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置に、リジン残基が導入される：Ｄ２Ｎ＋Ｐ４Ｓ／Ｔ、Ｌ３Ｎ＋Ｑ５Ｓ／Ｔ、Ｐ４Ｑ、Ｐ４Ｑ＋Ｔ６Ｓ、Ｑ５Ｎ＋Ｈ７Ｓ／Ｔ、Ｔ６Ｎ、Ｔ６Ｎ＋Ｓ８Ｔ、Ｈ７Ｎ＋Ｌ９Ｓ／Ｔ、Ｓ８Ｎ＋Ｇ１０Ｓ／Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｈ１１Ｓ／Ｔ、Ｒ１２Ｎ、Ｒ１２Ｎ＋Ｔ１４Ｓ、Ｒ１３Ｎ＋Ｍ１５Ｓ／Ｔ、Ｍ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ａ１９Ｎ＋Ｍ２１Ｓ／Ｔ、Ｓ２５Ｎ＋Ｆ２７Ｓ／Ｔ、Ｓ２８Ｎ＋Ｌ３０Ｓ／Ｔ、Ｒ３３Ｎ＋Ｄ３５Ｓ／Ｔ、Ｈ３４Ｎ＋Ｆ３６Ｓ／Ｔ、Ｄ３５Ｎ＋Ｒ３７Ｓ／Ｔ、Ｒ３７Ｎ＋Ｐ３９Ｓ／Ｔ、Ｅ４１Ｎ＋Ｆ４３Ｓ／Ｔ、Ｄ４４Ｎ＋Ｎ４６Ｓ／Ｔ、Ｆ４８Ｓ／Ｔ、Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔ、Ｋ５０Ｎ＋Ｑ５２Ｓ／Ｔ、Ｆ６８Ｓ／Ｔ、Ｋ７１Ｎ、Ｋ７１Ｎ＋Ｓ７３Ｔ、Ａ７５Ｎ＋Ｗ７７Ｓ／Ｔ、Ｄ７８Ｎ、Ｄ７８Ｎ＋Ｔ８０Ｓ、Ｅ７９Ｎ＋Ｌ８１Ｓ／Ｔ、Ｔ８０Ｎ＋Ｌ８２Ｓ／Ｔ、Ｅ８３Ｎ＋Ｆ８５Ｓ／Ｔ、Ｋ８４Ｎ＋Ｙ８６Ｓ／Ｔ、Ｉ８７Ｎ＋Ｌ８９Ｓ／Ｔ、Ｆ９０Ｎ＋Ｑ９２Ｓ／Ｔ、Ｑ９１Ｎ＋Ｍ９３Ｓ／Ｔ、Ｌ９６Ｓ／Ｔ、Ｄ９５Ｎ＋Ｅ９７Ｓ／Ｔ、Ｍ１０１Ｎ＋Ｅ１０３Ｓ／Ｔ、Ｑ１０２Ｎ＋Ｖ１０４Ｓ／Ｔ、Ｅ１０３Ｎ＋Ｇ１０５Ｓ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ＋Ｅ１０７Ｓ／Ｔ、Ｅ１０７、Ｅ１０７Ｎ＋Ｔ１０９Ｓ、Ｅ１０８Ｎ＋Ｐ１１０Ｓ／Ｔ、Ｌ１１１Ｎ＋Ｎ１１３Ｓ／Ｔ、Ｖ１１４Ｎ、Ｖ１１４Ｎ＋Ｓ１１６Ｔ、Ｄ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｌ１１８Ｎ＋Ｖ１２０Ｓ／Ｔ、Ｒ１２１Ｎ＋Ｙ１２３Ｓ／Ｔ、Ｋ１２２Ｎ＋Ｆ１２４Ｓ／Ｔ、Ｑ１２５Ｎ＋Ｉ１２７Ｓ／Ｔ、Ｒ１２６Ｎ、Ｒ１２６Ｎ＋Ｔ１２８Ｓ、Ｌ１２９Ｎ＋Ｌ１３１Ｓ／Ｔ、Ｔ１３２Ｎ＋Ｋ１３４Ｓ／Ｔ、Ｋ１３３Ｎ＋Ｋ１３５Ｓ／Ｔ、Ｋ１３５Ｎ、Ｋ１３５Ｎ＋Ｓ１３７Ｔ、Ｐ１３８Ｎ、Ｐ１３８Ｎ＋Ｓ１４０Ｔ、Ｒ１５０Ｎ＋Ｆ１５２Ｓ／Ｔ、Ｋ１６０Ｎ＋Ｌ１６２Ｓ／Ｔ、Ｌ１６２Ｎ＋Ｒ１６４Ｓ／Ｔ、Ｒ１６３Ｎ＋Ｋ１６５Ｓ／ＴおよびＲ１６４Ｎ＋Ｅ１６６Ｓ／Ｔ。いくつかの例において、上記の位置の間で、４７位、５１位、１３３位および１４０位の１つ以上におけるアミノ酸残基が、上記のように改変されていない。Ｓ／Ｔは、セリン残基もしくはスレオニン残基、好ましくはスレオニン残基に対する置換を意味する。
いくつかの例において、インターフェロン−αの潜在的なレセプター結合部位の外側に、すなわち、配列番号１に対する位置番号付けで、約２９〜４０位、７９〜９６位および１２４〜１４１位の外側に、Ｎ−グリコシル化部位を導入することが好ましい。従って、１つ以上のＮ−グリコシル化部位の導入を生じる置換としては、以下のうちの１つ以上が挙げられ得る：Ｄ２Ｎ＋Ｐ４Ｓ／Ｔ、Ｌ３Ｎ＋Ｑ５Ｓ／Ｔ、Ｐ４Ｑ、Ｐ４Ｑ＋Ｔ６Ｓ、Ｑ５Ｎ＋Ｈ７Ｓ／Ｔ、Ｔ６Ｎ、Ｔ６Ｎ＋Ｓ８Ｔ、Ｈ７Ｎ＋Ｌ９Ｓ／Ｔ、Ｓ８Ｎ＋Ｇ１０Ｓ／Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｈ１１Ｓ／Ｔ、Ｇ１０Ｎ＋Ｒ１２Ｓ／Ｔ、Ｒ１２Ｎ、Ｒ１２Ｎ＋Ｔ１４Ｓ、Ｒ１３Ｎ＋Ｍ１５Ｓ／Ｔ、Ｍ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ａ１９Ｎ＋Ｍ２１Ｓ／Ｔ、Ｑ２０Ｎ＋Ｒ２２Ｓ／Ｔ、Ｒ２２Ｎ＋Ｉ２４Ｓ／Ｔ、Ｒ２３Ｎ、Ｒ２３Ｎ＋Ｓ２５Ｔ、Ｉ２４Ｎ＋Ｌ２６Ｓ／Ｔ、Ｓ２５Ｎ＋Ｆ２７Ｓ／Ｔ、Ｌ２６Ｎ、Ｌ２６Ｎ＋Ｓ２８Ｔ、Ｓ２８Ｎ＋Ｌ３０Ｓ／Ｔ、Ｅ４１Ｎ＋Ｆ４３Ｓ／Ｔ、Ｅ４２Ｎ＋Ｄ４４Ｓ／Ｔ、Ｄ４４Ｎ＋Ｎ４６Ｓ／Ｔ、Ｆ４８Ｓ／Ｔ、Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔ、Ｋ５０Ｎ＋Ｑ５２Ｓ／Ｔ、Ｖ５１Ｎ＋Ａ５３Ｓ／Ｔ、Ｑ５２Ｎ＋Ｉ５４Ｓ／Ｔ、Ｅ５９Ｎ＋Ｍ６１Ｓ／Ｔ、Ｑ６２Ｎ、Ｑ６２Ｎ＋Ｔ６４Ｓ、Ｑ６３Ｎ＋Ｆ６５Ｓ／Ｔ、Ｆ６８Ｓ／Ｔ、Ｓ６９Ｎ＋Ｋ７１Ｓ／Ｔ、Ｔ７０Ｎ＋Ｎ７２Ｓ／Ｔ、Ｋ７１Ｎ、Ｋ７１Ｎ＋Ｓ７３Ｔ、Ｓ７４Ｔ、Ｓ７４Ｎ＋Ａ７６Ｓ／Ｔ、Ａ７５Ｎ＋Ｗ７７Ｓ／Ｔ、Ｅ９７Ｎ＋Ｃ９９Ｓ／Ｔ、Ａ９８Ｎ＋Ｖ１００Ｓ／Ｔ、Ｖ１００Ｎ＋Ｑ１０２Ｓ／Ｔ、Ｍ１０１Ｎ＋Ｅ１０３Ｓ／Ｔ、Ｑ１０２Ｎ＋Ｖ１０４Ｓ／Ｔ、Ｅ１０３Ｎ＋Ｇ１０５Ｓ／Ｔ、Ｖ１０４Ｎ＋Ｖ１０６Ｓ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ＋Ｅ１０７Ｓ／Ｔ、Ｅ１０７、Ｅ１０７Ｎ＋Ｔ１０９Ｓ、Ｅ１０８Ｎ＋Ｐ１１０Ｓ／Ｔ、Ｌ１１１Ｎ＋Ｎ１１３Ｓ／Ｔ、Ｍ１１２Ｎ＋Ｖ１１４Ｓ／Ｔ、Ｎ１１３Ｎ＋Ｄ１１５Ｓ／Ｔ、Ｖ１１４Ｎ、Ｖ１１４Ｎ＋Ｓ１１６Ｔ、Ｄ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｌ１１８Ｎ＋Ｖ１２０Ｓ／Ｔ、Ｒ１２１Ｎ＋Ｙ１２３Ｓ／Ｔ、Ｋ１２２Ｎ＋Ｆ１２４Ｓ／Ｔ、Ａ１４６Ｎ＋Ｉ１４８Ｓ／Ｔ、Ｍ１４９Ｎ、Ｍ１４９Ｎ＋Ｓ１５１Ｔ、Ｒ１５０Ｎ＋Ｆ１５２Ｓ／Ｔ、Ｓ１５３Ｎ、Ｓ１５３Ｎ＋Ｓ１５５Ｔ、Ｆ１５４Ｎ＋Ｆ１５６Ｓ／Ｔ、Ｑ１５９Ｓ／Ｔ、Ｋ１６０Ｎ＋Ｌ１６２Ｓ／Ｔ、Ｒ１６１Ｎ＋Ｒ１６３Ｓ／Ｔ、Ｌ１６２Ｎ＋Ｒ１６４Ｓ／Ｔ、Ｒ１６３Ｎ＋Ｋ１６５Ｓ／ＴおよびＲ１６４Ｎ＋Ｅ１６６Ｓ／Ｔ（これら位置は、約２５％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置であり、かつ、推定レセプター結合部位の一部ではない）。いくつかの場合において、４７位のおよび５１位の１つまたは両方が、上に示されるようには修飾されていない。Ｓ／Ｔは、セリン残基もしくはスレオニン残基、好ましくはスレオニン残基に対する置換を意味する。
いくつかの例において、置換は、以下からなる群より選択される：Ｄ２Ｎ＋Ｐ４Ｓ／Ｔ、Ｌ３Ｎ＋Ｑ５Ｓ／Ｔ、Ｐ４Ｑ、Ｐ４Ｑ＋Ｔ６Ｓ、Ｑ５Ｎ＋Ｈ７Ｓ／Ｔ、Ｔ６Ｎ、Ｔ６Ｎ＋Ｓ８Ｔ、Ｈ７Ｎ＋Ｌ９Ｓ／Ｔ、Ｓ８Ｎ＋Ｇ１０Ｓ／Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｈ１１Ｓ／Ｔ、Ｒ１２Ｎ、Ｒ１２Ｎ＋Ｔ１４Ｓ、Ｒ１３Ｎ＋Ｍ１５Ｓ／Ｔ、Ｍ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ａ１９Ｎ＋Ｍ２１Ｓ／Ｔ、Ｓ２５Ｎ＋Ｆ２７Ｓ／Ｔ、Ｓ２８Ｎ＋Ｌ３０Ｓ／Ｔ、Ｅ４１Ｎ＋Ｆ４３Ｓ／Ｔ、Ｄ４４Ｎ＋Ｎ４６Ｓ／Ｔ、Ｆ４８Ｓ／Ｔ、Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔ、Ｋ５０Ｎ＋Ｑ５２Ｓ／Ｔ、Ｆ６８Ｓ／Ｔ、Ｋ７１Ｎ、Ｋ７１Ｎ＋Ｓ７３Ｔ、Ａ７５Ｎ＋Ｗ７７Ｓ／Ｔ、Ｍ１０１Ｎ＋Ｅ１０３Ｓ／Ｔ、Ｑ１０２Ｎ＋Ｖ１０４Ｓ／Ｔ、Ｅ１０３Ｎ＋Ｇ１０５Ｓ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ＋Ｅ１０７Ｓ／Ｔ、Ｅ１０７、Ｅ１０７Ｎ＋Ｔ１０９Ｓ、Ｅ１０８Ｎ＋Ｐ１１０Ｓ／Ｔ、Ｌ１１１Ｎ＋Ｎ１１３Ｓ／Ｔ、Ｖ１１４Ｎ、Ｖ１１４Ｎ＋Ｓ１１６Ｔ、Ｄ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｌ１１８Ｎ＋Ｖ１２０Ｓ／Ｔ、Ｒ１２１Ｎ＋Ｙ１２３Ｓ／Ｔ、Ｋ１２２Ｎ＋Ｆ１２４Ｓ／Ｔ、Ｒ１５０Ｎ＋Ｆ１５２Ｓ／Ｔ、Ｋ１６０Ｎ＋Ｌ１６２Ｓ／Ｔ、Ｌ１６２Ｎ＋Ｒ１６４Ｓ／Ｔ、Ｒ１６３Ｎ＋Ｋ１６５Ｓ／ＴおよびＲ１６４Ｎ＋Ｅ１６６Ｓ／Ｔ（これら位置は、約５０％を超える部分ＡＳＡでその分子の表面に露出されていると予測される位置であり、かつ、推定レセプター結合部位の一部ではない）。いくつかの場合において、４７位のおよび５１位の１つまたは両方が、上に示されるようには修飾されていない。Ｓ／Ｔは、セリン残基もしくはスレオニン残基、好ましくはスレオニン残基に対する置換を意味する。
導入されたＮ−グリコシル化部位の効率的な利用を得るために、約１００ Ｎ−末端アミノ酸残基以内のようなおよそ１２５ Ｎ−末端アミノ酸残基以内（例えば、７５ Ｎ−末端アミノ酸残基以内または５０ Ｎ−末端アミノ酸残基以内）の上記置換のいずれかを選択することが望ましい。
本発明の結合体のインターフェロン−αポリペプチドがグリコシル化される場合、これは、単一の導入されたインビボグリコシル化部位（例えば、単一の導入されたインビボＮ−グリコシル化部位）を含み得る。しかし、本発明のポリペプチドの表面上のエピトープ提示の効率的な遮蔽を得るためには、ポリペプチドが、１つ以上のインビボグリコシル化部位（例えば、２〜５個のインビボグリコシル化部位（例えば、２、３、４、または５個のインビボグリコシル化部位）を含むことが望ましくあり得る。
親ポリペプチドの改変の例は、一般に、配列番号１の配列に対して（または、いくつかの他の特定の配列に対して）、本明細書中で提示されるが、開示される改変はまた、本明細書中に記載される本発明の任意の他のポリペプチド（配列番号２〜１５および配列番号４４〜１０４ならびにその改変体を含む）の等価なアミノ酸位置においてなされ得ることが理解されるべきである。従って、例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔは、配列番号５におけるＱ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔに対応すると理解されるなどである。
（本発明の結合体の非ポリペプチド部分）
上記に示したように、発明の結合体の非ポリペプチド部分は、一般的に、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分（例えば、インビボＮ−グリコシル化による）、および有機誘導体化剤からなる群より選択される。これらの薬剤の全ては、この結合体のポリペプチド部分に所望の特性（例えば、低下した免疫原性、増加した機能的インビボ半減期、増加した血清半減期、増加したバイオアベイラビリティー、および／または増加したＡＵＣＳＣ）を与える。この結合体のポリペプチド部分は、しばしば１つの型の非ポリペプチド部分にのみ結合されるが、二以上の異なる型の非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子および糖部分など）にもまた結合され得る。二以上の異なる非ポリペプチド部分への結合は、同時にもしくは順次行われ得る。非ポリペプチド部分の選択は、特に、この結合によって達成されることを所望される効果に依存する。例えば、糖部分は、免疫原性を減少するために特に有用であり、一方ポリマー分子（例えば、ＰＥＧ）は、機能的インビボ半減期、および／もしくは血清半減期を増加するために特に使用される。ポリマー分子および糖部分の組み合わせの使用は、免疫原性の減少および機能的インビボ半減期もしくは血清半減期の増加を増強し得る。
以下の章、「親油性化合物との結合」、「ポリマー分子との結合」、「糖部分との結合」、および「有機誘導体化剤との結合」において、特定の型の非ポリペプチド部分への結合が記載される。
（親油性化合物との結合）
親油性化合物との結合のため、以下のポリペプチド群：ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、アミノ酸残基、Ｓｅｒ、ＴｈｒもしくはＴｙｒのヒドロキシ基、Ｌｙｓのε−アミノ基、ＣｙｓのＳＨ基もしくはＡｓｐおよびＧｌｕのカルボキシル基が、結合基として働き得る。このポリペプチドおよび親油性化合物は、互いに、直接的もしくはリンカーの使用によってのいずれかで結合され得る。親油性化合物は、天然化合物（例えば、飽和もしくは不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドもしくはステロイド、または炭素酸、アルコール、アミンおよび１以上のアルキル、アリール、アルキニルもしくは他の複数の非飽和化合物を有するスルホン酸（ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）のような合成化合物）であり得る。必要に応じてリンカーを通じた、ポリペプチドと親油性化合物との結合は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６においてＢｏｄａｎｓｚｋｙにより記載されるような方法およびＷＯ９６／１２５０５における方法）に従って行われ得る。
（ポリマー分子との結合）
ポリペプチドに結合されるべきポリマー分子は、任意の適切なポリマー分子（例えば、天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマー）であって、代表的に約３００〜１００，０００Ｄａの範囲、例えば、約１，０００〜５０，０００Ｄａ（例えば、約１，０００〜４０，０００Ｄａの範囲）の分子量を有する。より特別には、ポリマー分子（例えば、ＰＥＧ、特にｍＰＥＧ）は、代表的に２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａもしくは５０ｋＤａの分子量（特に、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａもしくは、約４０ｋＤａの分子量）を有する。ＰＥＧ分子は、分枝されてもよく（例えば、ｍＰＥＧ２）、または分枝されなくともよい（すなわち、直鎖）。
本明細書においてポリマー分子について使用される場合、語「約」は、おおよその平均分子量を示し、そして所定のポリマー調製物中に、通常、特定の分子量の分布があるという事実を反映する。
ホモポリマーの例としては、ポリオール（すなわち、ポリ−ＯＨ）、ポリアミン（すなわち、ポリ−ＮＨ２）およびポリカルボン酸（すなわち、ポリ−ＣＯＯＨ）が挙げられる。ヘテロポリマーは、１以上の異なる結合基（例えば、へドロキシ基およびアミン基）を含むポリマーである。
適切なポリマー分子の例としては、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）およびポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、分枝ＰＥＧ（ＰＥＧ２）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリ−（ビニルピロリドン）、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、カルボキシメチルデキストランを含むデキストラン、あるいは免疫原性を減少し、ならびに／または機能的インビボ半減期および／もしくは血清半減期を増加する任意の他の生体高分子からなる群より選択されるポリマーが挙げられる。
一般的に、ポリアルキレングリコールに由来するポリマーは、生体適合性、無毒性、非抗原性、非免疫原性であり、種々の水溶性特性を有し、そして生体から容易に分泌される。
ＰＥＧは、使用されるに好ましいポリマー分子である。なぜなら、例えばデキストランのような多糖類と比べて、数個の架橋し得る反応基しか有さないからである。特に、単官能性のＰＥＧ、例えばモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が、該当する。なぜなら、その結合化学が比較的単純（ただ１つの反応基が、ポリペプチド上の結合基（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）との結合に利用可能）だからである。結果として、架橋の危険性が消失し、得られるポリペプチド結合体は均一であり、かつポリマー分子のポリペプチドとの反応は制御し易い。
ポリマー分子のポリペプチドへの共有結合を達成するため、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は、活性形態で、すなわち、反応性の官能基とともに提供されなければならない（例としては、一級アミノ基、ヒドラジド（ＨＺ）、チオール、スクシネート（ＳＵＣ）、スクシニミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシニミジルスクシナミド（ＳＳＡ）、スクシニミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシニミジルブタノエート（ＳＢＡ）、スクシニミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、ベンゾトリアゾールカルボネート（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）、アルデヒド、ニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ）、およびトレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）（ＴＲＥＳ）が挙げられる。）適切に活性化されたポリマー分子が市販されている（例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ；ＰｏｌｙＭＡＳＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｐｌｃ，ＵＫ；またはＳｕｎＢｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａより）。あるいは、ポリマー分子は、当該分野で公知の従来の方法（例えば、ＷＯ９０／１３５４０に開示されるような方法）によって活性化され得る。本発明における使用に適切な活性化された直鎖状もしくは分枝状ポリマー分子の特定の例は、本明細書中に参考として援用される、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．２００３ カタログ（「Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ２００３」）に開示される。活性化されたＰＥＧポリマーの特定の例としては、以下の直鎖状ＰＥＧ：
Figure 2006506097
 ならびに分枝したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ２−ＭＡＬ）、ならびにＵＳ５，９３２，４６２およびＵＳ５，６４３，５７５（これら両方は、本明細書において参考として援用される）に開示されるようなＰＥＧポリマーが挙げられる。さらに、以下の刊行物（本明細書において参考として援用される）は、有用なポリマー分子および／またはＰＥＧ化化学を開示する：
Figure 2006506097
 。
ポリペプチドと活性化されたポリマー分子との結合は、例えば、以下の参考文献に開示されるような任意の従来の方法（これらの参考文献はまた、ポリマー分子の活性化のための適切な方法を開示する）の使用によって実行される：ＨａｒｒｉｓおよびＺａｌｉｐｓｋｙ（編）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＺＣ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，（１９９１）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２），「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ」，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら（１９９３），「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．。
システイン残基のＰＥＧ化のため、ポリペプチドは、通常、ＰＥＧ化の前にジチオスレイトール（ＤＤＴ）のような還元剤で処理される。還元剤は、その後任意の従来の方法によって（例えば、脱塩によって）除去される。ＰＥＧのシステイン残基への結合は、代表的に、適切な緩衝液中において、ｐＨ６〜９、４℃〜２５℃の種々の温度で、約１６時間までの期間で起こる。システイン残基と結合するための活性化されたＰＥＧポリマーの例としては、以下の直鎖状および分枝したＰＥＧが挙げられる：ビニルスルホン−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＶＳ）（例えば、ビニスルホン−ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＶＳ）；オルトピリジル−ジスルフィド−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＰＳＳ）（例えば、オルトピリジル−ジスルフィド−ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ）；ならびにマレイミド−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＭＡＬ）（例えば、マレイミド−ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）および分枝したマレイミド−ｍＰＥＧ２（ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ））。
リジンのＰＥＧ化には、しばしばＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシルスクシニミド（例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨＳもしくはｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）、またはエステル（例えば、ＰＥＧスクシニミジルプロピオネート（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）もしくはＰＥＧスクシニミジルブタノエート（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ））を利用する。ほぼ等モル量のＰＥＧとタンパク質とが混合される場合、１以上のＰＥＧが、ｐＨ８〜９．５、室温で、３０分以内にタンパク質に結合され得る。タンパク質アミノ基に対するＰＥＧのモル比が、１に対して１〜５であれば、通常十分である。ｐＨの上昇は反応速度を上昇させ、一方より低いＰＨは反応速度を低下させる。これらのより反応性の高い活性エステルは生理学的ｐＨで結合し得るが、より反応性の低い誘導体は、代表的に、より高いｐＨを必要とする。不安定なタンパク質が使用されるべき場合、低温もまた利用され得る。低温条件下では、より長い反応時間が使用され得る。
Ｎ−末端ＰＥＧ化は、Ｎ−末端アミノ酸のα−アミノ基のｐＫａ値（約７．６〜８．０）とリジンのε−アミノ基のｐＫａ値（約１０）との間の差によって促進される。Ｎ−末端アミノ基のＰＥＧ化には、ＰＥＧ−アルデヒド（例えば、ｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒドまたはｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド）をしばしば利用する（これらは、アミンに対してより選択的であり、したがってヒスチジンのイミダゾール基と反応する可能性がより低い）；加えて、リジン結合のために使用されるＰＥＧ試薬（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＰＡもしくはｍＰＥＧ−ＳＢＡ）はまた、Ｎ−末端アミンの結合のために使用され得る。Ｎ−末端アミノ基に対するＰＥＧ−アルデヒドの結合は、代表的に、適切な緩衝液（例えば、２０ｍＭナトリウムシアノボロヒドライドを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウムまたは１００ｍＭナトリウムビスホスフェート緩衝液）中において、ｐＨ約５．０で一晩、約４℃〜２５℃の種々の温度で起こる。有用なＮ−末端ＰＥＧ化法および化学はまた、米国特許第５，９８５，２６５号および同第６，０７７，９３９号（これら両方は、本明細書において参考として援用される）に開示される。
代表的に、直鎖状のＰＥＧもしくはｍＰＥＧポリマーは、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有する。分枝したＰＥＧ（ＰＥＧ２もしくはｍＰＥＧ２）ポリマーは、代表的に、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの例では、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａのＰＥＧ２のような、より高い分子量の分枝したＰＥＧ試薬（例えば、リジンＰＥＧ化のためのｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、システインＰＥＧ化のためのｍＰＥＧ２−ＭＡＬ、もしくはＮ−末端ＰＥＧ化のためのＭＰＥＧ２−アルデヒドが挙げられる；これら全ては、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬから入手可能）が使用され得る。ＰＥＧ２化合物の分枝構造は比較的大きな分子容を生じ、したがってより少ない結合分子（もしくは１つの結合分子）が、ＰＥＧ化された分枝の所望の特徴を与え得る。
当業者は、使用される活性法および／または結合化学が、インターフェロン−αポリペプチドの吸着基およびポリマーの官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドもしくはスルフヒドリル）に依存することを承知している。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上の全ての利用可能な吸着基（すなわち、ポリペプチドの表面に露出される吸着基）への結合に方向付けられ得るか、または特定の吸着基（例えば、システイン残基、リジン残基もしくはＮ−末端アミノ基）に方向付けられ得る。さらに、この結合は、一工程または段階的様式で（例えば、ＷＯ９９／５５３７７に開示されるように）実現され得る。
いくつかの例では、ポリマー結合は、可能な限り多数の利用可能なポリマー吸着基とポリマー分子とを反応させることを目的とする条件下で行われる。これは、ポリペプチドに対して適切なモル過剰のポリマーによって達成される。活性化されたポリマー分子のポリペプチドに対する代表的なモル比は、約１０００−１まで（例えば、約２００−１までもしくは約１００−１まで）である。いくつかの場合では、この比はある程度低いが、例えば、約５０−１、１０−１もしくは５−１までである。等モル比もまた使用され得る。
本発明に従って、リンカーを通じてポリマー分子をポリペプチドに結合することが、また検討される。適切なリンカーは当業者に周知である。好ましい例は、塩化シアヌルである（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら（１９７７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５７８−３５８１；ＵＳ４，１７９，３３７；Ｓｈａｆｅｒら（１９８６），Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．（編）２４，３７５−３７８）。
この結合に続いて、残りの活性化されたポリマー分子は、当該分野で公知の方法に従って（例えば、反応混合物への一級アミンの添加により）ブロックされ、そして得られた不活性化ポリマー分子は適切な方法で除去される。
インターフェロンαのアミノ酸残基への糖分子のインビトロ共有結合は、糖置換基の数またはプロフィールを改変または増加するのに使用され得る。使用される結合様式に依存して、炭水化物が以下に結合される：ａ）アルギニンおよびヒスチジン（ＬｕｎｄｂｌａｄおよびＮｏｙｅｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＩ）；ｂ）（例えば、Ｃ−末端アミノ酸残基、アスパラギンもしくはグルタミンの）遊離カルボキシル基；ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システイン）；ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニン、チロシンもしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基）；ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニンもしくはトリプトファンの芳香族残基）、またはｆ）グルタミンのアミド基。これらのアミノ酸残基は、インターフェロンαポリペプチドにおいて導入および／もしくは除去され得る糖部分に対する吸着基の例を構成する。インビトロ結合の適切な方法は、ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎら、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６，１９８１に開示される。タンパク質結合Ｇｌｎ残基およびペプチド結合Ｇｌｎ残基への糖部分またはＰＥＧのインビトロ結合はまた、によって例えば、Ｓａｔｏら、１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１３０７２−１３０８０またはＥＰ７２５１４５によって開示されるように、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）によって実行され得る。
（糖部分との結合）
１以上のグリコシル化部位の導入によって改変されたインターフェロン−αポリペプチドのインビボグリコシル化を達成するため（「非ポリペプチド部分が糖部分である、本発明の結合体」の章を参照のこと）、この結合体のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列が、グリコシル化する真核生物発現宿主に挿入される。発現宿主は、真菌（糸状菌もしくは酵母）、昆虫、哺乳動物細胞から、トランスジェニック植物細胞から、またはトランスジェニック動物から選択され得る。さらに、グリコシル化は、本発明の結合体のポリペプチド部分または遺伝子治療おける本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて、ヒト体内で達成され得る。１つの局面において、宿主細胞は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫもしくはＨＥＫ２９３のようなＨＥＫ細胞）、または昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、または酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓもしくは任意の他の適切なグリコシル化宿主（例えば、以下にさらに開示されるような宿主）である。必要に応じて、インビトログリコシル化によってインターフェロン−αポリペプチドに結合された糖部分は、糖転移酵素の使用によって（例えば、Ｎｅｏｓｅ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ，ＵＳＡによって販売されるＧｌｙｃｏＡｄｖａｎｃｅＴＭ技術を用いて）さらに改変される。これらによって、例えば、ＣＨＯ細胞による発現およびインビボグリコシル化に続くグリコシル化インターフェロン−αポリペプチドのシアリル化を増進することが可能である。
（有機誘導体化剤との結合）
インターフェロン−αポリペプチドの共有結合性改変は、ポリペプチドの吸着基を有機誘導化剤と反応させることによって行われ得る。適切な有機誘導体化剤および方法は、当該分野で公知である。例えば、最も一般的なシステイニル残基は、α−ハロアセテート（および対応するアミン）（例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応し、カルボキシチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β（４−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７でのジエチルピロカルボネートとの反応によって、誘導体化される。なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して相対的に特異的だからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；この反応は、好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で、ｐＨ６．０で行われる。リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸もしくは他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤との誘導体化は、リジニル残基の電荷を楽典する効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な薬剤としては、イミドエステル（例えば、メチルピコリンイミデート）；リン酸ピリドキサル；ピリドキサル；クロロボロヒドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。アルギニル残基は、一もしくはいくつかの従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジエン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって改変される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、アルカリ条件で行われる反応を必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの基およびアルギニンのグアニジノ基と反応し得る。カルボキシル側基（アスパラチルもしくはグルタミル、またはＣ−末端アミノ酸残基）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に改変される（ここで、ＲおよびＲ’は、異なるアルカリ基（例えば、１−シクロヒキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド）である）。さらに、アスパラチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
（官能部位のブロッキング）
過剰なポリマー結合は、そのポリマーが結合されるインターフェロン−αポリペプチドの活性の消失をもたらし得るため、官能部位に位置する吸着基を除去すること、または結合前に官能部位をブロックすることは、有利であり得る。これらの後者の戦略は、本発明のさらなる局面を構成する（第一戦略は、上記にさらに例示される、例えば、観桜部位に近接して配置され得るリジン残基の除去による）。より具体的には、第二戦略に従って、インターフェロン−αポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合は、このポリペプチドの官能部位が、このポリペプチドの官能基に結合し得るヘルパー分子によってブロックされる条件下で行われる。好ましくは、このヘルパー分子は、ポリペプチドの１つの官能部位（例えば、レセプター、特にＩ型インターフェロンレセプター）を特異的に認識する分子である。あるいは、このヘルパー分子は、抗体、特にインターフェロン−αポリペプチドを認識するモノクローナル抗体であり得る。特に、このヘルパー分子は、中和モノクローナル抗体であり得る。
ポリペプチドは、結合を達成する前にヘルパー分子と相互作用し得る。これにより、ポリペプチドの官能部位が遮断されるかまたは保護されて、結果としてポリマーのような非ポリペプチド部分による誘導体化のために利用できなくなることが確実となる。ヘルパー分子からのその溶出に続いて、非ポリペプチド部分とポリペプチドとの間の結合は、少なくとも部分的に保存された官能部位によって回復され得る。
ブロックされた官能部位を有するポリペプチドの、ポリマー、親油性化合物、有機誘導化剤または他の任意の化合物とのその後の結合は、通常の方法で（例えば、「・・・との結合」という表題の上記の章に記載されるように）行われる。
ポリペプチドの官能部位の結合からの遮断に使用されるヘルパー分子の性質に関係なく、ヘルパー分子が、その分子の一部に選択された非ポリペプチド部分に対する吸着基を全く含まないかほとんど含まないことが、このような基との結合がヘルパー分子からの結合されたポリペプチドの脱離を妨害する場合には望ましい。これによって、ポリペプチドの非遮断部分に存在する吸着基との選択的結合が達成され得、そしてこのヘルパー分子を結合の繰り返しサイクルのために再使用することが可能となる。例えば、非ポリペプチド部分が、吸着基としてリジンのεアミノ基もしくはＮ−末端アミノ酸残基を有するＰＥＧのようなポリマー分子である場合、ヘルパー分子が実質的に結合可能なεアミノ基を含まないこと、好ましくはεアミノ基を全く含まないことが所望される。したがって、いくつかの例では、ヘルパー分子は、ポリペプチドの官能部位と結合し得るタンパク質もしくはペプチドであり、このタンパク質もしくはペプチドは、あらゆる選択された非ポリペプチド部分に対して結合可能な吸着基を含まない。
さらなる局面においては、ヘルパー分子は、初めにカラムパッキング材料のような固相（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘもしくはアガロースビーズ、または表面（例えば、反応容器））に共有結合される。続いて、ポリペプチドは、ヘルパー分子を有するカラム材料にローディングされて、当該分野で公知の方法に従って（例えば、「・・・との結合」という表題の上記の章に記載されるように）結合が行われる。この手順は、ポリペプチド結合体を溶出することによってヘルパー分子から分離することを可能にする。ポリペプチド結合体は、ポリペプチド結合体の実質的分解をもたらさない物理化学的条件下で、従来技術によって溶出される。ポリペプチド結合体を含む流体相は、ヘルパー分子が共有結合したままの固相から分離される。分離は、他の方法で達成され得る。例えば、ヘルパー分子は、特異的結合剤（例えば、ストレプトアビジン）によって認識され得る第二分子（例えば、ビオチン）で誘導体化される。特異的結合剤は、固相に連結され得、それによって、第二ヘルパー−固相カラム（これは、後の溶出の際、ヘルパー分子−第二分子複合体を保持するが、ポリペプチド結合体は保持しない）上の通過を通して、ヘルパー分子−第二分子複合体からのポリペプチド結合の分離を可能にする。ポリペプチド結合体は、任意の適切な形式でヘルパー分子から放出される。脱保護は、ヘルパー分子が、結合するインターフェロン−αの官能部位から解離する条件を提供することによって、達成される。例えば、ポリマーが結合する抗体と抗イディオタイプ抗体との間の複合体は、ｐＨを酸性もしくはアルカリ性ｐＨへと調整することによって解離し得る。
（標識インターフェロン−αポリペプチドの結合）
別の局面において、インターフェロン−αポリペプチドは、標識を有する融合タンパク質（すなわち、例えば、ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に付加された、代表的に１〜３０（例えば、１〜２０もしくは１〜１５もしくは１〜１０もしくは１〜５）のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列もしくはペプチド）として発現される。標識は、迅速および簡易な精製を可能にするほかに、標識ポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合を達成するのに便利な手段である。特に、タグは、マイクロタイタープレートや他のキャリア（例えば、標識ポリペプチドが、その標識を介して固定される常磁性ビーズ）中での結合を実現するために使用され得る。例えば、マイクロタイタープレートにおける標識ポリペプチドへの結合は、標識ポリペプチドが培養ブロスからマイクロタイタープレートに（任意の精製なしの原理で）直接的に固定され得、そして結合に供され得るという利点を有する。これによって、プロセス工程の総数（発現から結合まで）が減少され得る。さらに、標識は、結合されるべき固定されたポリペプチドに対する改善した接触性を保証するスペーサー分子として機能し得る。標識ポリペプチドを用いた結合は、本明細書において開示される非ポリペプチド部分のいずれかに対する（例えば、ＰＥＧのようなポリマー分子に対する）。
使用されるべき特定の標識の同定は、標識が、ポリペプチドとともに発現され得る限り、および適切な表面もしくはキャリア材料上に固定され得る限り、重要ではない。多くの適切な標識は、例えば、Ｕｎｉｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから市販されている。このような標識に対する抗体は、例えば、ＡＤＩ，Ａｖｅｓ Ｌａｂ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されている。
（本発明のポリヌクレオチド）
本発明は、単離された核酸または組み換え型の核酸（本明細書において、やはりポリヌクレオチドを呼ばれる）を提供する。これらは、正確には「本発明の核酸（もしくはポリヌクレオチド）」と呼ばれ、本発明のポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドは、種々の用途に有用である。上記で議論されるように、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを産生するに有用である。加えて、本発明のポリヌクレオチドは、以下でより詳細に記載されるような遺伝子治療、ＤＮＡワクチン接種、および免疫治療に有用な発現ベクターに組み込まれ得る
１つの局面において、本発明は、単離された核酸または組み換え型の核酸を提供する。これらの各々は、以下：（ａ）配列番号１６〜３０から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらの相補的ポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１〜１５および４４〜１０４から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそれらの相補的ポリヌクレオチド配列、から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、単離された核酸または組み換え型の核酸を提供する。これらの各々は、配列番号ｌ〜１５および配列番号４４〜１０４のいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７もしくは配列番号５３の１つ）と、０〜１６アミノ酸位置（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６アミノ酸位置）が異なる（例えば、０〜１６位、０〜１５位、０〜１４位、０〜１３位、０〜１２位、０〜１１位、０〜１０位、０〜９位、０−８位、０〜７位、０〜６位、０〜５位、０〜４位、０〜３位、０〜２位、もしくは０〜１位が異なる）配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの例において、コードされたポリペプチドは、インターフェロン−α活性を示す。
本発明はまた、単離された核酸または組み換え型の核酸を提供する。これらの各々は、配列番号ｌ〜１５および配列番号４４〜１０４のいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７もしくは配列番号５３の１つ）と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの例において、コードされたポリペプチドは、インターフェロン−α活性を示す。
本発明はまた、単離された核酸または組み換え型の核酸を提供する。これらの各々は、親インターフェロン−αポリペプチドの改変体であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。このコードされた改変体は、親インターフェロン−αポリペプチド配列と、少なくとも一アミノ酸位置が異なる配列を含む。ここで、この改変体配列は、配列番号１に対して番号付けされた位置で、４７位に１以上のＨｉｓを、５１位にＶａｌを、５５位にＰｈｅを、５６位にＬｅｕを、５８位にＴｙｒを、１３３位にＬｙｓを、そして１４０位にＳｅｒを含む。いくつかの例において、親インターフェロン−αポリペプチド配列は、天然に存在するヒトインターフェロン−αの配列である（例えば、配列番号３１〜配列番号４２もしくは配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ、または本明細書ならびに／もしくはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（上記）に記載される他のｈｕＩＦＮ−α配列のいずれか１つ）か、または天然に存在しない（すなわち、合成の）インターフェロン−α配列（例えば、ＩＦＮ−α Ｃｏｎ１（配列番号４３））である。いくつかの例において、この改変体配列は、親ポリペプチド配列と１〜１６アミノ酸位置（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６アミノ酸位置）が異なる（例えば、１〜１０アミノ酸位置、１〜５アミノ酸位置または１〜３アミノ酸位置）。いくつかの例において、この改変体は、インターフェロン−α活性を示す。
別の局面において、本発明は、単離された核酸または組み換え型の核酸を提供する。これらの各々は、高ストリンジェント条件下で、実質的に配列番号１６〜３０の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。このポリヌクレオチド配列は、インターフェロン−α活性を示すポリペプチドをコードする。
（さらなる局面）
任意の本発明の核酸（上記に記載される核酸を含む）は、少なくとも１つの付加的なアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。これらの付加的な配列は、例えば、分泌／局在化配列、ポリヌクレオチドの安定化もしくは固定化（例えば、細胞表面表示のため）に有用な配列、ポリヌクレオチドの検出および／もしくは精製に有用な配列（例えば、エピトープタグのようなポリペプチド精製配列、ポリヒスチジン配列など）のような配列である。別の局面において、本発明は、１以上の本発明の核酸を含む細胞を提供する。このような細胞は、本発明の核酸によってコードされる１以上のポリペプチドを発現し得る。
本発明はまた、本発明の任意の核酸を含むベクターを提供する。このようなベクターとしては、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、またはウイルスフラグメントが挙げられる。このようなベクターは発現ベクターを含み、所望される場合、その核酸は、本明細書および以下で議論されるプロモーターを含むプロモーターに操作可能に連結される。さらに、別の局面において、本発明は、賦形剤およびキャリア、ならびに少なくとも１つの本発明の核酸、またはベクター、細胞、またはこのような核酸を含む宿主を含有する組成物を提供する。このような組成物は、薬学的組成物であり得、そして賦形剤およびキャリアは、薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリアであり得る。
本発明はまた、本発明の二つ以上の核酸またはそれらのフラグメント（例えば、組換えのための基質としてのフラグメント）を含有する組成物を包含する。その組成物は、組換え核酸のライブラリーを含み得、そのライブラリーは、上記の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、または少なくとも１００以上の核酸を含む。この核酸は、必要に応じて発現ベクター中にクローン化され、発現ライブラリーを提供する。
本発明の核酸およびそのフラグメント、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターは、適切なキャリア（例えば、薬学的キャリア）と組み合わされて、治療的用途または予防的用途に使用され得る。そのような組成物は、治療上有効な量および／または予防上有効な量の化合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を包含する。そのようなキャリアまたは賦形剤には、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。その処方物は、その投与様式に合うはずである。核酸、ポリペプチドおよびタンパク質の投与方法は、当該分野において十分に公知であり、以下でさらに議論される。
本発明はまた、本発明の１つ以上の任意の核酸を、（例えば、上で記述された特定の組換え形式で実行されるように）制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅで消化することにより産生される組成物；および本発明の１つ以上の核酸を、機械的方法（例えば、超音波処理、ボルテックスなど）でフラグメント化またはせん断することにより産生される組成物を含む。そしてその機械的方法はまた、本明細書に記載の方法における組換えのための基質を提供するのにも使用され得る。本発明はまた、本発明の核酸の任意のもののうち、少なくとも１つを切断することにより産生される組成物を提供する。この切断は、機械的切断、化学的切断、または酵素的切断を含み得、そしてこの酵素的切断は、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅでの切断を含み得る。
本発明にさらに含まれるのは、本発明の１つ以上のフラグメント化された核酸を、リボヌクレオチド３リン酸またはデオキシリボヌクレオチド３リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下でインキュベートすることを含むプロセスにより生産される組成物である。得られた組成物は、上で記述された組換えフォーマットの多くの形態について組換え混合物を形成する。核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ指向型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、「逆転写酵素」）であり得る；このポリメラーゼは、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＶＥＮＴ、ＴＡＱなど）であり得る。
同様に、本発明の１つ以上の核酸に対応するオリゴヌクレオチドのセットを含有する組成物は、組換え基質として有用であり、そして本発明の特徴である。便宜のため、これらのフラグメント化された混合物、せん断された混合物、またはオリゴヌクレオチド合成混合物は、フラグメント化された核酸のセットとして言及される。
本発明はまた、インターフェロン−α活性（本発明の少なくとも１つの核酸に変異を導入することまたは本発明の少なくとも１つの核酸を組換えることにより産生される）を示すポリペプチドをコードする、単離された核酸または組換え核酸を提供する。
（ポリヌクレオチドの作製）
本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および核酸フラグメントは、公知の合成方法に従って、標準的固相法で調製され得る。代表的には、約１００塩基までのフラグメントは、個々に合成され、その後、（例えば、酵素的連結法もしくは化学的連結法によって、またはポリメラーゼ媒介性組換え法によって）連結され、任意の所望の連続配列を基本的に形成する。（例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、古典的ホスホラミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９〜６９に記載の方法）、または、例えば、Ｍａｔｔｈｅｓら（１９８４）、ＥＭＢＯ Ｊ ３：８０１〜０５に記載の方法を用いて）化学合成により調製され得る（代表的には、自動合成法で実行される）。ホスホラミダイト法に従い、オリゴヌクレオチドが合成される（例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクター中に連結される）。
さらに、基本的にどのポリヌクレオチドも、種々の市販の供給源（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）およびその他多数）のうち、任意の供給源から特別注文され得る。同様に、ペプチドおよび抗体は、種々の供給源（例えば、Ｃｅｌｔｅｋ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ）；Ｇｌｏｂａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎ ＣＯ）およびその他多数）のうち、任意の供給源から特別注文され得る。
本発明の特定のポリヌクレオチドはまた、インターフェロン−αポリペプチドおよびそれらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ、またはインターフェロン−αポリペプチドおよびそれらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリー（例えば、代表的な反復配列組換え法におけるような、相同核酸の組換えにより産生されるライブラリー）をスクリーニングすることによって取得され得る。ｃＤＮＡクローンのスクリーニングおよび単離の手順は、当業者に十分に公知である。そのような技術は、例えば、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２巻，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）に記載されている。本発明のいくつかのポリヌクレオチドは、天然に存在する配列の変更（例えば、突然変異誘発、反復配列組換え（例えば、シャッフリング））、またはオリゴヌクレオチド組換えにより取得され得る。他の場合では、このようなポリヌクレオチドは、コンピューター内でまたは本明細書に引用される参考文献に記載されるようなオリゴヌクレオチド組換え法を通して作製され得る。
本明細書にさらに詳細に記述のように、本発明のポリヌクレオチドとして、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列、および少なくともストリンジェントな条件下で本明細書に規定される配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。コード配列とは、特定のポリペプチドまたは上記ポリペプチドのドメイン、領域、もしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列をいう。コード配列は、上に記載のようにインターフェロン活性を示す本発明のポリペプチドをコードし得る。本発明のそのポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態であり得るか、またはＤＮＡの形態であり得る。そして、本発明のそのポリヌクレオチドとして、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡおよび合成ＤＮＡ、ならびにｃＤＮＡが挙げられ得る。そのポリペプチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。そして一本鎖の場合、そのポリヌクレオチドは、コード鎖であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖、相補鎖）であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）単離物としての本発明のポリペプチドのコード配列、（ｉｉ）例えば、融合タンパク質、プレタンパク質、プレプロタンパク質などをコードするように、１つ以上の追加のコード配列と組み合わせた本発明のポリペプチドのコード配列、（ｉｉｉ）非コード配列（例えば、イントロン、制御エレメント（例えば、プロモーター（例えば、天然に存在するプロモーターまたは組換えプロモーターもしくはシャッフルプロモーター）、ターミネーターエレメント、または適切な宿主細胞中でのコード配列の発現に有効な５’および３’非翻訳領域）と組み合わせた本発明のポリペプチドのコード配列、ならびに／あるいは（ｉｖ）コード配列が異種遺伝子である、ベクター、細胞、宿主環境における本発明のポリペプチドのコード配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドはまた、代表的な核酸の組成処方物（当業者に知られているように、キャリア、緩衝液、アジュバント、賦形剤などを含む処方物を含む）との組み合わせで見出され得る。ポリヌクレオチドフラグメントは、代表的には少なくとも約２００ヌクレオチド塩基（例えば、少なくとも約２５０塩基、少なくとも約３００塩基、少なくとも約３５０塩基、少なくとも約４００塩基、少なくとも約４５０塩基、少なくとも約４６０塩基、少なくとも約４７０塩基、あるいはそれ以上の塩基）を含む。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチドフラグメントは、高ストリンジェントな条件下で本明細書に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、そして／または本明細書に記載の本発明のポリペプチドの特性の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードし得る。
（改変コード配列）
当業者に理解され得るように、コード配列を改変し、特定の宿主中での発現を増大することは好都合であり得る。遺伝暗号は、６４個の可能性のあるコドンに関して重複しているが、ほとんどの生物は、優先的にこれらのコドンのサブセットを用いる。ある種において最も頻繁に使用されるコドンは、最適コドンと考えられ、それほど頻繁に使用されないコドンは、まれに使用されるコドンまたは低使用のコドン（例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９１），Ｇｅｎｅ １０５：６１〜７２を参照のこと）として分類される。宿主の好ましいコドン使用を反映するように、コドンは置換され得る。これは、「コドンの最適化」または「種コドン（ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｄｏｎ）の偏りについての制御」と呼ばれることのあるプロセスである。
例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主によって好まれるコドンを含む改変コード配列（例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．ら（１９８９）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４７７〜５０８を参照のこと）が調製され得、翻訳速度を増加したり、または所望の特性（例えば、非最適化配列から産生された転写物と比較して、より長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生する。翻訳終止コドンはまた、宿主の優先度を反映するように改変され得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにとって好ましい終止コドンおよび哺乳動物にとって好ましい終止コドンは、それぞれ、ＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物にとって好ましい終止コドンはＵＧＡであり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは、終止コドンとしてＵＡＡを使うことを好む（Ｄａｌｐｈｉｎ，Ｍ．Ｅ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２１６〜２１８）。
本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明のコード配列を種々の理由で変更するために、操作され得る。そしてその変更として、その遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現を改変する変更が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、変更は当該分野で周知の技術（例えば、新たな制限酵素部位を挿入するための部位特異的突然変異誘発、グリコシル化型を変更するための部位特異的突然変異誘発、結合基（例えば、ペグ化もしくは他の結合のための結合基）を導入または除去するための部位特異的突然変異誘発、コドンの優先度を変化させるための部位特異的突然変異誘発、スプライス部位を導入するための部位特異的突然変異誘発など）の技術を用いて導入され得る。
（サイレントバリエーション）
遺伝コードの縮重のために、非常に多くの機能的に同一の核酸は、任意の既定ペプチドをコードする。例えば、以下のコドン表（表５）は、コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧおよびＣＧＵの全てが、アミノ酸アルギニンをコードすることを示す。従って、アルギニンがコドンにより特定される核酸配列中の各々の部位において、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなしに、上で記述された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸バリエーションは、「サイレントバリエーション」である。ＲＮＡ配列におけるＵが、ＤＮＡ配列のＴに対応することは理解されるべきである。
Figure 2006506097
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 。
従って、遺伝コードの縮重により、本発明のポリペプチドをコードする多数の核酸配列は産生され得、これらのうちのいくつかは、本明細書で明確に開示される核酸配列に対して最小限の配列同一性を有し得るということは、当業者によって理解される。当業者は、核酸における各々のコドン（ＡＵＧおよびＵＧＣを除き、通常はそれぞれメチオニンおよびトリプトファンに対する唯一のコドンである）は、機能的に同じポリペプチドをコードするので、標準的技術により改変され得るということを理解する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された任意の配列において暗黙的（ｉｍｐｌｉｃｉｔ）である。本発明はまた、可能性のあるコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによりなされ得る、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の、各々および全ての可能性のあるバリエーションを提供する。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に適用される場合、これらの組み合わせは、標準的トリプレット（コドン）遺伝子コード（例えば、表５に記載されているような）に従って作られる。本明細書のあらゆる核酸の、このようなすべてのバリエーションは、遺伝子コードと組み合わせた配列を考慮して、詳細に提供され、そして記述される。技術の１つは、本明細書に連挙された配列の、任意のサイレント置換を十分に生成し得る。
（ポリヌクレオチドの用途）
本発明のポリヌクレオチドには、種々の用途がある。これらの用途は、例えば、本発明のポリペプチドの組換え産生（すなわち、発現）（代表的には、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする配列を含むプラスミド発現ベクターの発現による）；治療剤として；予防薬として；診断用具として；免疫原として；アジュバントとして；相補的核酸または部分的相補的核酸の存在についての診断プローブ（野生型インターフェロン−α核酸の検出を含む）；さらなる反応（例えば、新規バリエーションおよび／もしくは改善バリエーションを産生するための反復配列組換え反応または変異反応）の基質として、などである。
（ベクター、プロモーターおよび発現系）
本発明はまた、上で広く記述されたような、１つ以上の核酸配列を含む組換え構築物を含む。その構築物は、本発明の核酸配列が順方向または逆方向に挿入されているベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを含む。いくつかの場合、構築物はさらに調節配列（例えば、核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む）を含む。適切なベクターおよびプロモーターの多数は、当業者に公知であり、そして市販されている。
本明細書で有用な分子生物学的技術（ベクターの使用、プロモーターの使用および他の多くの関連するトピックの使用が挙げられる）を記述する一般的な教科書としては、Ｂｅｒｇｅｒ（前出）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）（前出），およびＡｂｓｕｂｅｌ（前出）が挙げられる。例えば、本発明の相同性核酸の産生については、インビトロ増幅方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む）に通じた人に対して十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ（すべて前出）ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲプロトコール：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（「Ｉｎｎｎｉｓ」）；Ａｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ ３６〜４７；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１〜９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：１１７３〜１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１８７４〜１８７８；Ｌｏｍｅｌｉら（１９８９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３５：１８２６〜１８３１；Ｌａｎｄｅｒｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７〜１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２９１〜２９４；Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ ４：５６０〜５６９；Ｂｅｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７〜１２２およびＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３〜５６４）が挙げられる。増幅された核酸をインビトロでクローニングする改良方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。大きな核酸をＰＣＲによって増幅する改良方法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６８４〜６８５およびその中の参考文献に要約されている。その改良方法では、４０キロベース（ｋｂ）までのＰＣＮアンプリコンが産生される。当業者は、基本的にいかなるＲＮＡも、逆転写酵素およびポリメラーゼを用いて、制限消化、ＰＣＲ増幅、および配列決定に適した二本鎖ＤＮＡへと変えられ得ることを理解する。Ａｕｓｕｂｅｌ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（全て前出）を参照のこと。
本発明はまた、本発明のベクターを用いて形質導入された宿主細胞を提供し、組換え技術によって本発明のポリペプチドの産生を提供する。宿主細胞は、本発明のベクターを用いて、（例えば、形質導入されるか、形質転換されるかまたはトランスフェクトされ）遺伝的に操作される。そのベクターは、例えば、クローニングベクターであり得るか、または発現ベクターであり得る。そのベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または遺伝子を増幅するのに適切であるように改変された、従来の栄養培地で培養され得る。その培養条件（温度、ｐＨなど）は、発現用に選択された宿主細胞に対して、以前用いられた条件であり、そしてその培養条件は、当業者に理解され、そして本明細書に引用された参考文献（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびその参考文献を含む）において明白である。
本発明のポリペプチドはまた、非動物細胞（例えば、植物、酵母、真菌、細菌など）中で産生され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、細胞培養に関する詳細は、例えば、Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｎｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ＮＹ）；Ａｔｌａｓ＆Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬにおいて見出される。
本発明のポリヌクレオチドおよびそのフラグメントは、ポリペプチド発現用の種々の発現用発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターには、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドＤＮＡおよびファージＤＮＡの結合体由来のベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス（ｆｏｗｌ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、仮性狂犬病ウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス）およびその他多くのものの誘導体）が挙げられる。遺伝的物質を細胞中に形質導入する任意のベクター、および、複製が所望される場合には、適切な宿主中で複製可能でかつ生存可能なベクターが使用され得る。
発現ベクター中の核酸配列は、適切な転写制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍＲＮＡ合成を指令する。そのようなプロモーターの例としては、以下が挙げられる：ＬＴＲプロモーターまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーター、ファージλＰＬプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそのウイルス中で遺伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーター。その発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを含む。そのベクターは、必要に応じて、発現を増幅するのに適切な配列（例えば、エンハンサー）を含む。さらに、その発現ベクターは、必要に応じて、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型上の特性（例えば、真核生物細胞培養物に対するジヒドロ葉酸還元酵素耐性もしくはネオマイシン耐性、またはＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性）を提供する。
本発明のポリペプチドをコードする適切なＤＮＡ配列、および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換し、その宿主にそのポリペプチドを発現させるために使用され得る。適切な発現宿主の例としては、以下が挙げられる：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；昆虫細胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ＢＨＫ，ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫）；植物細胞など。全ての細胞または細胞株が、本発明の機能的なポリペプチドおよびそのフラグメントを十分に産生し得る必要があるわけではないということが理解される；例えば、そのポリペプチドの抗原性フラグメントは、細菌発現系または他の発現系において産生され得る。本発明は、使用される宿主細胞に限定されない。
細菌系では、多くの発現ベクターが、そのポリペプチドおよびそのフラグメントの意図された用途に応じて選択され得る。例えば、大量のそのポリペプチドまたはそのフラグメントが、抗体の誘導に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。そのようなベクターとしては、配列をコードするヌクレオチドが、ベクター中にインフレームでアミノ末端メチオニンおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列と連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））が挙げられるが、これらに限定されない；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４；５５０３〜５５０９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）；など。
同様に、酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅにおいて、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α−因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多くのベクターが本発明のポリペプチドの産生のために使用され得る。総説として、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出），Ｂｅｒｇｅｒ（前出），およびＧｒａｎｔら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６〜５４４を参照のこと。
哺乳動物宿主細胞においては、多数の発現系（例えば、ウイルスベースの系）が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、必要に応じてコード配列が、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中に連結され得る。ウイルスゲノムを、非必須なＥ１およびＥ３領域中に挿入することにより、感染宿主細胞中で本発明のポリペプチドを発現し得る、生存可能なウイルスを生じる（Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：３６５５〜３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）は、哺乳動物宿主細胞での発現を増大するために用いられる。宿主細胞、培地、発現系、および産生方法は、種々の哺乳動物インターフェロン−α（例えば、ヒトインターフェロン−α）のクローニングおよび発現について公知のものを含む。
（さらなる発現要素）
特定の開始シグナルは、本発明のポリヌクレオチドコード配列および／またはそのフラグメントの効率的な翻訳を補助し得る。これらのシグナルは、例えば、ＡＴＧ開始コドンおよびその隣接配列を含み得る。コード配列、コード配列の開始コドンおよび上流の配列が適切な発現ベクター中に挿入された場合、さらなる翻訳制御シグナルは、必要とされ得ない。しかし、コード配列（例えば、成熟タンパク質コード配列）またはその一部分のみが、挿入された場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性核酸転写制御シグナルが提供されねばならない。さらに、開始コドンは、挿入部分全体の転写を保証するために、正確なリーディングフレーム中に存在しなければならない。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、種々の起源を有し得、天然および合成の両方のものであり得る。発現効率は、使用中の細胞系に適したエンハンサーの含有により増大され得る。（例えば、Ｓｃｈａｒｆ Ｄ．ら（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ２０：１２５〜６２；およびＢｉｔｔｎｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６〜５４４を参照のこと）。
（分泌／局在化配列）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、分泌／局在化配列をコードする核酸にインフレームで融合され得、ポリペプチドの発現を所望の細胞コンパートメント、膜もしくは細胞小器官に標的化するか、またはポリペプチドの分泌を細胞膜周辺腔（に方向付けるか、）もしくは細胞培養培地中に方向付ける。そのような配列は当業者に公知であり、そのような配列として、分泌リーダーまたはシグナルペプチド、細胞小器官標的化配列（例えば、核局在化配列、ＥＲ保持シグナル、ミトコンドリア輸送配列、葉緑体輸送シグナル）、膜局在化／アンカー配列（例えば、終止トランスファー配列、ＧＰＩアンカー配列）などが挙げられる。
（発現宿主）
さらなる局面において、本発明は、上記の本発明の核酸、ベクターまたは他の構築物の任意のものを含有する宿主細胞に関する。その宿主細胞は、真核生物細胞（例えば、ホ乳動物細胞、酵母細胞または植物細胞）であっても原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であってもよい。その構築物の宿主細胞中への導入は、インビボ、エキソビボまたはインビトロの方法について、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃もしくはワクチン銃、注射または他の一般的技術により達成され得る（例えば、Ｄａｖｉｓ、Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）。
宿主細胞系統は、必要に応じて、挿入される配列の発現を調節する能力または発現タンパク質を所望の様式で処理する能力に関して選択される。このようなタンパク質の改変として、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、アシル化が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後プロセシング（タンパク質の「プレ（ｐｒｅ）」形態または「プロ（ｐｒｏ）」形態を切断する）はまた、正確な挿入、フォールディングおよび／または機能のために重要であり得る。種々の宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，酵母または哺乳動物の細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８など））は、そのような翻訳後の活性について、特異的細胞性機構および特徴的機序を有しており、そして導入される外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを保証するように選択され得る。
安定な発現は、組換えタンパク質の、長期で多産の生産のために使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて、形質導入される。そのベクターの導入に続いて、細胞は、１日〜２日間にわたって富化培地中で増殖され、その後、選択培地に切り替えられ得る。選択可能なマーカーの目的は、選択への耐性を与えることであり、そして選択可能マーカーの存在は、導入される配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。例えば、安定に形質転換された細胞の耐性集塊は、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖され得る。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換された宿主細胞は、必要に応じて、コードされたタンパク質の発現および細胞培養物からの回収に適した条件下で、培養される。組換え細胞により産生されたポリペプチドは、使用される配列および／またはベクターに応じて、分泌されるか、膜に結合されるか、または細胞内に含まれ得る。当業者に理解されるように、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、成熟ポリペプチドの、原核生物細胞または真核生物細胞の膜を通しての分泌を指向するシグナル配列で設計され得る。
（追加配列）
本発明のポリヌクレオチドは、必要に応じて、インフレームでマーカー配列（例えば、コードされたポリペプチドの精製および／または検出を促進する）に融合されたコード配列を含む。そのような精製部分配列には、金属キレートペプチド（例えば、固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール）、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：７６７）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ延長／親和性精製系において使用されるＦＬＡＧエピトープなどが挙げられるが、これらに限定されない。精製ドメインとポリペプチド配列との間の、プロテアーゼ−切断可能ポリペプチドリンカー配列の含有は、精製を促進するのに有用である。
例えば、本明細書に記載の組成物および方法において使用可能な１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位から分離されたポリヒスチジン領域に融合された本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。そのヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー、Ｐｏｒａｔｈら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３：２６３〜２８１に記載のように）による精製を促進する。一方、そのエンテロキナーゼ切断部位は、所望のポリペプチドをポリヒスチジン領域から分離する方法を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、必要に応じて、外来ペプチドを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現するために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ−融合物の場合には、グルタチオン−アガロース）に対する吸着、次いで遊離リガンドの存在下での抽出により溶解した細胞から容易に精製され得る。
本明細書に記載の組成物および方法のさらなる構築物は、タンパク質およびそれらをコードする核酸を提供する。この構築物は、例えば、本明細書に記載のように、Ｉｇ分子（例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ（「結晶化可能なフラグメント」つまりフラグメント補体結合）ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列）に融合された本発明のポリペプチド（または１つ以上のそのフラグメント）とを含む。Ｆｃは、細胞上の抗体レセプターおよび補体のＣ１ｑ成分への結合を担う、抗体の一部である。これらの融合タンパク質またはそのフラグメントおよびそれらをコードする核酸は、必要に応じて、予防薬物および／もしくは治療薬物として、または診断用具として、有用である（また、例えば、Ｃｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ，Ｐ．ら（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３４１９〜３４２６；Ｓｔｕｒｍｈｏｅｆｅｌ，Ｋ．ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：４９６４〜４９７２を参照のこと。）
（ポリペプチド産生および回収）
適切な宿主株の形質導入および宿主株の適切な細胞密度までの増殖に続き、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度変更または化学的誘導）により誘導される。そして細胞は、さらなる期間培養される。細胞は、代表的には、遠心分離により回収され、機械的手段または化学的手段により崩壊され、そしてその結果生じた粗製抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に使用される真核生物細胞または細菌細胞は、任意の便利な方法（凍結融解循環、超音波処理、機械的崩壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または当業者に周知の他の方法）により崩壊され得る。
記述のように、多くの細胞（細菌細胞、植物細胞、動物（特に哺乳動物）および古細菌系（ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｒｉｇｉｎ）を含む）の培養および産生に関する多くの参考文献が、入手可能である。例えば、
Figure 2006506097
 を参照のこと。
本発明のポリペプチドは、組換え細胞培養物から当該分野で周知の多くの方法のうちの任意の方法（硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、本明細書に記載のタッギングシステムの任意のものの使用）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）により、回収ならびに精製され得る。タンパク質の再フォールディング工程は、所望の場合、成熟タンパク質またはそのフラグメントの立体配置を完成させる際に使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終精製工程において使用され得る。記述された参考文献（前出）に加えて、種々の精製方法（例えば、
Figure 2006506097
 に記載されているものを含む）は、当該分野で周知である。
（インビトロ発現系）
細胞を含まない転写／翻訳系をまた用いて、本発明のポリペプチドを使用して本発明のポリペプチドを生成し得る。いくつかのこのような系は市販されている。インビトロ転写および翻訳のプロトコールに対する一般的なガイドは、Ｔｙｍｍｓ（１９９５）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｌｏｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹに見出される。
（インビボでの使用および適用）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは、このポリヌクレオチドの相補体（例えば、アンチセンスまたはリボザイム分子を含む）は、必要に応じて細胞に投与されて、治療的に有用なプロセスを達成するか、または、治療的に有用な生成物を発現する。これらのインビボでの適用（遺伝子治療を含む）は、遺伝子発現が細胞において変更され得る多数の技術を含む。このような方法としては、例えば、本発明のポリペプチドのような治療的および／または予防的に有用なポリペプチドの発現のための遺伝子の導入が挙げられる。
（インビボでのポリペプチド発現）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知の技術を用いるインビボ治療適用に特に有用である。例えば、培養細胞を、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、および／または、例えば、少なくとも１種の抗原、サイトカイン、他の同時刺激分子、アジュバントなどをコードする他のポリヌクレオチド配列を用いて、エキソビボで加工され、加工された細胞が次いで、患者にもどされる。細胞はまた、インビボで、本発明のポリペプチドおよび／または抗原性ペプチドを含む、１種以上のポリペプチドの発現のために、インビボで加工され得る。
生物体のインビボでの形質導入および発現のために適切な多数のウイルスベクターが公知である。このようなベクターとしては、レトロウイルスベクター（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１５８：１−２４；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｕｒｇ（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：５８１−５９９を参照のこと）およびアデノ随伴ウイルスベクター（Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｃｙｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９において総説されている）が挙げられる。使用される他のウイルスベクターとしては、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１：５１−６４；Ｌａｔｃｈｍａｎ（１９９４）Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２：１７９−１９５；およびＪｏｈａｎｎｉｎｇら（１９９５）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：１４９５−１５０１に一般的に記載されているような、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびシンドビスウイルスベクターが挙げられる。
１つの局面において、ポックスウイルスベクターが使用され得る。ポックスウイルスベクターは、本発明のポリペプチド（例えば、ｅＩＬ−２ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトされ、そして、予防的適用、治療的適用および診断的適用において有用であり、ここで、免疫応答の増強（例えば、Ｔ細胞増殖の増加または改善）が望ましい。例えば、Ｂｅｒｅｎｃｓｉら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ（２００１）１８３（８）：１１７１−９；Ｒｏｓｅｎｗｉｒｔｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２００１ Ｆｅｂ ８；１９（１３−１４）：１６６１−７０；Ｋｉｔｔｌｅｓｅｎ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１６４ （８）：４２０４−１１；Ｂｒｏｗｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００ ７（１９）：１６８０−９；Ｋａｎｅｓａ−ｔｈａｓａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１９（４−５）：４８３−９１；Ｓｔｅｎ（２０００）Ｄｒｕｇ ６０（２）：２４９−７１で議論されているウイルスベクターを参照のこと。このようなベクターおよび受容可能な賦形剤を含む組成物がまた、本発明の特徴である。
遺伝子治療および遺伝的ワクチンは、慢性感染性疾患（例えば、ＨＩＶ感染症、ウイルス性肝炎）、ならびに、非感染性疾患（癌および酵素不全のような先天性の欠損のいくつかの形態）を治療するための方法を提供し、そして、このような方法は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、このようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞）と共に用いされ得る。核酸およびベクターを細胞内に導入するためのいくつかのアプローチが、インビボ、エキソビボおよびインビトロで用いられており、本発明のポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオチドを含むベクターと共に用いられ得る。これらのアプローチは、リポソームベースの遺伝子送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３）ＷＯ ９３／２４６４０ならびに米国特許第５，６４１，６６２号；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２−６９１；Ｒｏｓｅ，米国特許第号５，２７９，８３３；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１）ＷＯ ９１／０６３０９；およびＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１４；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２９８：２７８−２８１；Ｎａｂｅｌら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１２８５−１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉら（１９９１）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ４：２０６−２０９；ならびにＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５）；アデノウイルスベクター媒介性の遺伝子送達（例えば、癌を処置するため（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７；Ｔｏｎｇら（１９９６）Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ６１：１７５−１７９；Ｃｌａｙｍａｎら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１−６；Ｏ’Ｍａｌｌｅｙら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：１０８０−１０８５；Ｈｗａｎｇら（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３：７−１６；Ｈａｄｄａｄａら（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９５（Ｐｔ．３）：２９７−３０６；Ａｄｄｉｓｏｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：８５２２−８５２６；Ｃｏｌａｋら（１９９５）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ６９１：７６−８２；Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０；Ｅｌｓｈａｍｉら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７：１４１−１４８；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ８５：６４８−６５４を参照のこと）などを含む。特に、単純ＭｕＬＶベクターに関して、レトロウイルスゲノムの一部として治療的ポリヌクレオチド配列を有する複製欠損型レトロウイルスベクターがまた用いられる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０：４２３９（１９９０）；Ｋｏｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ ＮＩＨ Ｒｅｓ ４：４３およびＣｏｒｎｅｔｔａら（１９９１）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２：２１５）を参照のこと。リガンド特異的なカチオンベースの輸送系に結合した核酸輸送（ＷｕおよびＷｕ（１９８８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６３：１４６２１−１４６２４）がまた用いられる。裸のＤＮＡ発現ベクターがまた記載されている（Ｎａｂｅｌら（１９９０），前出）；Ｗｏｌｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）。一般に、これらのアプローチは、本発明のポリペプチドをコードする核酸を適切なベクターに組み込むことによって本発明に適合され得る。
本発明の核酸を患者に導入することによって本発明に適合され得る遺伝子治療プロトコールを記載する、一般的な文書としては、例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪおよびＪｏｙｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄが挙げられる。
（アンチセンス技術）
遺伝子置換核酸としての本発明の核酸の発現に加えて、この核酸はまた、例えば、核酸の発現がもはや細胞内で所望でない場合に、本発明の核酸の発現をダウンレギュレートするための、発現のセンスおよびアンチセンスの抑制に有用である。同様に、本発明の核酸、または、そのサブ配列もしくはアンチセンス配列もまた用いて、天然に存在する相同な核酸の発現をブロックし得る。種々のセンスおよびアンチセンスが当該分野で公知であり、例えば、ＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＮｅｌｌｅｎ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＥｎｇｌａｎｄならびにＡｇｒａｗａｌ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ、ならびに、これらに引用される参考文献に示されている。
（プローブとしての使用）
また意図されるのは、ポリヌクレオチドの使用であり、このポリヌクレオチドは、本明細書中でオリゴヌクレオチドとも呼ばれ、代表的に、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも２０塩基、少なくとも３０塩基、もしくは少なくとも５０塩基、またはそれ以上の塩基を有し、高度にストリンジェンとな条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントにハイブリダイズする。このポリヌクレオチドは、上記のような方法に従って、プローブ、プライマー、センス因子およびアンチセンス因子などとして使用され得る。
（核酸ハイブリダイゼーション）
核酸は、代表的には溶液中で、これらが解離している場合に「ハイブリダイズ」する。核酸は、水素結合、溶媒除去、塩基スタッキングなどのような種々の十分に特徴付けられた物理化学的な力によってハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対するさらなるガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（本明細書中以後「Ｔｊｉｓｓｅｎ」）ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，前出、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ １）に見出され、そして、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ ２）は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）の合成、標識、検出および定量についての詳細を提供する。
２つの核酸配列が実質的に同一であるという指標は、２つの分子が、少なくともストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。句「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、その配列が、複雑な混合（例えば、総細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合に、ストリンジェントな条件下での、特定のヌクレオチド配列のみに対する１つの分子の結合、二重鎖化またはハイブリダイゼーションをいう。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的なハイブリダイゼーションをいい、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下させて、標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成し得る、わずかなミスマッチを含む。
核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノザンハイブリダイゼーション）の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメータの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対するさらなるガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）前出ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ １ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ ２，前出に見出される。
本発明の目的のためには、一般に、「高度にストリンジェント」なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が選択されて、これらは、所望のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される（以下に記載されるように、高度にストリンジェントな条件はまた、比較用語で言及され得る）。Ｔｍは、（所望のイオン強度およびｐＨ下で）５０％の試験配列が、好ましくはマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。言い換えると、Ｔｍは、核酸二重鎖が所定の条件下で５０％変性している温度を意味し、これは、核酸ハイブリッドの安定性の直接的な指標を表す。従って、Ｔｍは、ヘリックスからランダムコイルへの変遷の中間点に対応する温度に対応し；これは、ヌクレオチドの長いストレッチについての長さ、ヌクレオチドの組成およびイオン強度に依存する。代表的には、「ストリンジェントな条件」下で、プローブは、その標的サブ配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。「非常にストリンジェントな条件」とは、特定のプローブに対するＴｍに等しくなるように選択される。
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていない核酸物質が、一連の洗浄により除去され得、そのストリンジェンシーは、所望の結果に依存して調節され得る。低いストリンジェンシーの洗浄条件（例えば、高塩濃度および低温を用いる）は、感度を高めるが、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルおよび高いバックグラウンドシグナルを生じ得る。より高いストリンジェンシーの条件（例えば、低塩濃度およびハイブリダイゼーション温度に近い高温を用いる）は、代表的には特異的なシグナルのみを残したまま、バックグラウンドシグナルを低下させる。Ｒａｐｌｅｙ，Ｒ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）（本明細書中、以下「ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ」）（これらは、その全体が、あらゆる目的のために本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、以下の等式（１）を用いて推定され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ｆ）−５００／ｎ
ここで、Ｍは、単価カチオン（通常はＮａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）は、グアノシン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの割合であり、（％ｆ）は、ホルムアミドの割合であり、そして、ｎは、ハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である。ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ，前出を参照のこと。
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、以下の等式（２）を用いて推定され得る：
Ｔｍ（℃）＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．５８（％Ｇ＋Ｃ）−１１．８（％Ｇ＋Ｃ）２−０．５６（％ｆ）−８２０／ｎ
ここで、Ｍは単価カチオン（通常はＮａ＋）であり、（％Ｇ＋Ｃ）は、グアノシン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの割合であり、（％ｆ）は、ホルムアミドの割合であり、そして、ｎは、ハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である。Ｉｄ。上記の等式１および２は、代表的に、約１００〜２００ヌクレオチドより長いハイブリッド二重鎖についてのみ正確である。Ｉｄ。
５０ヌクレオチドより短い核酸配列のＴｍは、以下のように算出され得る：
Ｔｍ（℃）＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）
ここで、Ａ（アデニン）、Ｃ、Ｔ（チミン）およびＧは、対応するヌクレオチドの数である。
サザンブロットまたはノザンブロットにおける、フィルター上に１００以上の相補的な残渣を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃にて、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ ホルマリン（または彫るムアミド）であり、ハイブリダイゼーションは、一晩行なわれる。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ前出を参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシーの洗浄が、低ストリンジェンシーの洗浄に先立ち、バックグラウンドプローブシグナルを除く。低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃にて１５分間の２×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーの洗浄条件の例は、７２℃にて約１５分間の０．１５Ｍ ＮａＣｌである。例えば、１００ヌクレオチド以上の二重鎖についての中程度のストリンジェンシーの洗浄の例は、４５℃にて１５分間の１×ＳＳＣである。例えば１００ヌクレオチド以上の二重鎖についての低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃にて１５分間の４〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については、ストリンジェントな条件は、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３にて、約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオンの塩濃度、代表的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）を含み、温度は代表的に、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成され得る。
一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブについて観察されるものの２×または２．５×〜５×（これ以上）の信号雑音比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。本発明の文脈における、２つの配列間の少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中の配列表に提供される本発明の核酸に対する比較的強い構造類似性または相同性を示す。
上記のように、「高度にストリンジェント」な条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける、特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。目的のヌクレオチド配列（例えば、プローブ）に近いか、または、同一な標的配列は、高ストリンジェンシーな条件下で同定され得る。より低いストリンジェンシー条件は、あまり相補的でない配列に適している。例えば、ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（全て前出）を参照のこと。
競合ハイブリダイゼーションを用いて、本発明の核酸を同定し得、そして、この競合ハイブリダイゼーション法は、本発明の核酸を識別する好ましい方法である。本発明の文脈における２つのヌクレオチド配列間の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中の配列表に提供される核酸に対する、比較的強い構造類似性／または相同性を示す。２つのヌクレオチド配列間の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件により検出されるものよりも高い、構造、ヌクレオチド塩基組成、配列または順序の類似性もしくは相同性の程度を示す。特に、本発明の文脈における高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中の配列表に提供される核酸に対して、強力な構造類似性または構造相同性（例えば、ヌクレオチド構造、塩基組成、配列または順序）を示す。例えば、ストリンジェントな条件下で、本明細書中の例示的な核酸にハイブリダイズする試験核酸を同定することが望ましい。
従って、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの１つの指標は、本発明の列挙される核酸（例えば、配列番号１６〜３０の核酸配列、および、これらの相補的なポリヌクレオチド配列）のうちの１つに、高度にストリンジェントな条件下で（または、非常にストリンジェントな条件下、または超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、もしくは、超−超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で）、ハイブリダイズする能力である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、高度なストリンジェント、超高度なストリンジェンシー、または、超−超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を含む）および洗浄条件は、任意の試験核酸について、容易に実験的に決定され得る。
例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を決定する際に、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、選択された一連の判定基準が満たされるまで、（例えば、温度を増加させること、塩濃度を減少させること、界面活性剤の濃度を増加させること、および／またはハイブリダイゼーションまたは洗浄中の有機溶媒（例えば、ホルマリン）の濃度を増加させることによって）次第に増加される。例えば、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、配列番号１６〜３０から選択される１つ以上の核酸配列およびその相補的なポリヌクレオチド配列を含むプローブが、マッチしていない標的に対するプローブのハイブリダイゼーションについて観察されたものに対して少なくとも２．５×、そして必要に応じて、５×以上の信号対雑音比で、完全にマッチした相補的標的（再度、配列番号１６〜３０から選択される１つ以上の核酸配列およびその相補的なポリヌクレオチド配列）に結合するまで、次第に増加される。この場合、マッチしていない標的は、例えば、公知のインターフェロン核酸配列（例えば、本出願の出願時に、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧＥＮＥＳＥＱのような公的データベース中に存在するインターフェロン核酸配列）に対応する核酸である。
試験核酸は、完全にマッチした相補的な標的に、少なくともプローブに対して１／２ハイブリダイズする場合に、すなわち、完全にマッチするプローブが、完全にマッチする相補的標的に、マッチしていない標的核酸（例えば、上記のような公知のインターフェロン−α核酸）のいずれかに対するハイブリダイゼーションについて観察されるものの、少なくとも約２．５×〜１０×、代表的には、５×〜１０×の信号対雑音比で結合する条件下での標的に対するプローブのハイブリダイゼーションの、少なくとも１／２の信号対雑音比でハイブリダイズする場合に、プローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言われる。このような核酸のいくつかについて、ストリンジェントな条件は、コードオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的なオリゴヌクレオチドが、上記のような公知のインターフェロン−α配列に対応するコントロール核酸完全に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションについてのものの、少なくとも約５×高い信号対雑音比でハイブリダイズするように選択される。
超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、完全にマッチした相補的な標的核酸に対するプローブの結合についての信号対雑音比が、マッチしていない標的核酸（例えば、上記のような公知のインターフェロン−α核酸）のいずれかに対するハイブリダイゼーションについて観察されたものの、少なくとも１０×高くなるまで、増加される。このような条件下で、完全にマッチした相補的標的核酸のものの少なくとも１／２の信号対雑音比でハイブリダイズする標的核酸は、超高度なストリンジェンシー条件下でプローブに結合すると言われる。
同様に、なお高いレベルのストリンジェンシーが、関連するハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を次第に増加させることによって決定され得る。例えば、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件のストリンジェンシーは、完全にマッチした相補的標的核酸に対するプローブの結合についての信号対雑音比が、マッチしていない標的核酸（例えば、上記のような公知のインターフェロンα核酸）に対するハイブリダイゼーションについて観察されたものの、少なくとも１０×、２０×、５０×、１００×または５００×になるまで、増加される。このような条件下で、完全にマッチした相補的標的核酸のものの少なくとも１／２の信号対雑音比でハイブリダイズする標的核酸は、超−超高度なストリンジェンシーの条件下でプローブに結合すると言われる。
超高度な、および超−超高度なストリンジェンシーの条件下で、配列番号１６〜３０により表される核酸にハイブリダイズする標的核酸が、本発明の１つの特徴である。このような核酸の例としては、所定の核酸配列と比較して、１または２〜３のサイレントもしくは保存的な核酸置換を有する核酸が挙げられる。
（配列組換えのための物質および形式）
本発明のポリヌクレオチドおよびそのフラグメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋに示されるような標準的なクローニング法におけるその用途に加えて、種々の組換えおよび繰り返しの配列組換え反応のいずれかについての基質として必要に応じて用いられて、所望の特性を有するポリペプチドをコードするさらなるポリヌクレオチドを生成する。種々のこのような反応は、公知であり、本発明者らおよびその共同実験者によって開発されたものも含む。
本明細書中に記載される１つ以上の特性を有する分子を生成および同定するための種々の多様な生成プロトコールが利用可能であり、当該分野において記載されている。このような手順は、１つ以上の核酸の改変体または一連の核酸、ならびに、コードされるタンパク質の改変体を生成するために、別個におよび／または組み合せて使用され得る。個々に、そして、集合的に、これらの手順は、例えば、新規および／または改善された特徴を有する、核酸、タンパク質、経路、細胞および／または生物の遺伝子操作または迅速な進化のために有用な、多様な核酸および一連の核酸（例えば、核酸ライブラリーを含む）を生成する、強固で、広範に適用可能な方法を提供する。区別および分類が、以下の明確さの議論の過程でなされるが、これらの技術は、しばしば、相互排除的でないということが理解される。実際、種々の方法が、多様な配列改変体にアクセスするために、単一で、または組み合せて、平行して、または一連の流れで用いられ得る。
本明細書中に記載される多様性生成手順のいずれかの結果は、１つ以上の核酸の生成であり得、この核酸は、核酸について選択もしくはスクリーニングされ得るか、または、所望の特性を与えるか、タンパク質をコードするか、または、所望の特性を与える。本明細書中の１つ以上の方法によるか、または、当業者に利用可能な他の方法による多様化の後、生成される任意の核酸は、所望の活性または特性（例えば、インターフェロン−αレセプターについての結合親和性の変更、抗ウイルス活性もしくは抗増殖活性の変更、ＴＨ１分化を誘導する能力の変更、サイトカイン生成を誘導もしくは阻害する能力の変更）について選択され得る。これは、例えば、自動化もしくは自動化可能な形式で、当該分野におけるアッセイならびに本節および以下の実施例の節で議論された本発明のアッセイのいずれかによって、検出され得る任意の活性の同定を含み得る。種々の関連する（または、無関係でありもする）特性は、開業医の判断で、一連の流れで、または、平行して、評価され得る。
本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする修飾された核酸配列を生成するための、種々の多様な生成手順の説明は、以下の刊行物および本明細書中で引用される参考文献において見出される：Ｓｏｏｎｇ，Ｎ．ら（２０００）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ」Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２５（４）：４３６−４３９；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ４：１−４；Ｎｅｓｓら（１９９９）「ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６；Ｃｈａｎｇら（１９９９）「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：７９３−７９７；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９９）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら（１９９９）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ ＡＺＴ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｓｅｎａｔｅ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら（１９９７）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９；Ｐａｔｔｅｎら（１９９７）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７２４−７３３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：１００−１０３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３１５−３１９；Ｇａｔｅｓら（１９９６）「Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ａ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ’ｈｅａｄｐｉｅｃｅ ｄｉｍｅｒ’」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５５：３７３−３８６；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９６）「Ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ」Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．４４７−４５７；Ｃｒａｍｅｒｉ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｃｒｅａｔｅｓ ａｌｌ ｔｈｅ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：１９４−１９５；Ｓｔｅｍｍｅｒら，（１９９５）「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｔｉｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒｍ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｇｅｎｅ，１６４：４９−５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１５１０；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐａｃｅ」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５４９−５５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ： Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１。
用語「シャッフリング」とは、本明細書中において、非同一な配列間の組換えを示すために用いられ、いくつかの場合、シャッフリングは、相同組換えまたは非相同組換え（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘおよび／またはｆｌｐ／ｆｒｔシステム）を介する交差を含み得る。シャッフリングは、種々の異なる形式（例えば、インビトロおよびインビボのシャッフリング形式、インシリコのシャッフリング形式、二重鎖もしくは単鎖テンプレートのいずれかを利用するシャッフリング形式、プライマーベースのシャッフリング形式、核酸フラグメントベースのシャッフリング形式、ならびに、オリゴヌクレオチド媒介性のシャッフリング形式（これらは全て、非同一な配列間の組換え事象に基づき、本明細書中以下より詳細に記載されるか、または参照される）ならびに、他の類似の組換えベースの形式が挙げられる）を用いて実施され得る。
多様性を生じるための変異法としては、例えば、以下が挙げられる：部位指向型変異誘発（Ｌｉｎｇら（１９９７）「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８；Ｄａｌｅら（１９９６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｈｏｒｔｌｅ（１９８５）「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ（１９８６）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；ならびにＫｕｎｋｅｌ（１９８７）「Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ））；ウラシル含有テンプレートを用いる変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２；ａｎｄ Ｂａｓｓら（１９８８）「Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０−２４５）；オリゴヌクレオチド指向型変異誘発（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９８２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９８３）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；
ならびにＺｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９８７）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０）；ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）「Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ ＆ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８６）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎｃｉ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８；Ｓａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｙ−Ｔ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２；ならびにＳａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４）；ギャップ化二重鎖ＤＮＡを用いる変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ ＆ Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ」１５４：３５０−３６７；Ｋｒａｍｅｒら（１９８８）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７２０７；ａｎｄ Ｆｒｉｔｚら（１９８８）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９）。
さらなる適切な方法としては、以下が挙げられる：点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ」Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８７），ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｐａｉｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ（Ｃａｒｔｅｒら（１９８５）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ（１９８７）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３）、欠損変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８６）「Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１１５）、制限選択および制限増幅（Ｗｅｌｌｓら（１９８６）「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ ３１７：４１５−４２３）、全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら（１９８４）「Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１；Ｓａｋａｍａｒ ａｎｄ Ｋｈｏｒａｎａ（１９８８）「Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２；Ｗｅｌｌｓら（１９８５）「Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ」Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３；ａｎｄ Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍら（１９８５）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ’ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６）、二重鎖破壊修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ（１９８６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１；ならびにＡｒｎｏｌｄ（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５５）。上記の方法の多くについてのさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５４に見出され得、これはまた、種々の変異誘発法を用いて問題をトラブルシューティングするための有用なコントロールを記載する。
種々の多様性生成法に関するさらなる詳細は、以下の米国特許、ＰＣＴ公報および出願、ならびに、ＥＰＯ公報に見出され得る：Ｓｔｅｍｍｅｒに対する米国特許第５，６０５，７９３号（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２５，１９９７），「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８１１，２３８号（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２２，１９９８）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｂｙ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３０，７２１号（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ３，１９９８），「ＤＮＡ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」、Ｓｔｅｍｍｅｒ，らに対する米国特許第５，８３４，２５２号（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １０，１９９８）「Ｅｎｄ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ，らに対する米国特許第５，８３７，４５８号（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １７，１９９８），「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、ＷＯ ９５／２２６２５，ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉ「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」、ＳｔｅｍｍｅｒおよびＬｉｐｓｃｈｕｔｚによるＷＯ ９６／３３２０７「Ｅｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＷＯ ９７／２００７８「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｂｙ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ ９７／３５９６６「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ ９９／４１４０２「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ ９９／４１３８３「Ａｎｔｉｇｅｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」、ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ ９９／４１３６９「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ ９９／４１３６８「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＥＰ ７５２００８「ＤＮＡ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」、ＳｔｅｍｍｅｒによるＥＰ ０９３２６７０「Ｅｖｏｌｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ Ｕｐｔａｋｅ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ ９９／２３１０７「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ Ｔｒｏｐｉｓｍ ａｎｄ Ｈｏｓｔ Ｒａｎｇｅ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、ＡｐｔらによるＷＯ ９９／２１９７９「Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、ｄｅｌ ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ ９８／３１８３７「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、ＰａｔｔｅｎおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ ９８／２７２３０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ ９８／２７２３０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、
ＷＯ ００／００６３２「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ ００／０９６７９「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ ９８／４２８３２「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｎｄｏｍ ｏｒ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ」、ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ ９９／２９９０２「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｒｅａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＶｉｎｄによるＷＯ ９８／４１６５３「Ａｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ」、ＢｏｒｃｈｅｒｔらによるＷＯ ９８／４１６２２「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」ならびに、ＰａｔｉおよびＺａｒｌｉｎｇによるＷＯ ９８／４２７２７「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、ＰａｔｔｅｎらによるＷＯ ００／１８９０６「Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ−Ａｌｔｅｒｅｄ Ｇｅｎｅｓ」、ｄｅｌ ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ ００／０４１９０「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、ＷＯ ００／４２５６１ ｂｙ Ｃｒａｍｅｒｉら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、ＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ ００／４２５５９「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ ００／４２５６０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、ＷｅｌｃｈらによるＰＣＴ／ＵＳ００／２６７０８「Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」ならびに、ＡｆｆｈｏｌｔｅｒによるＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」。
いくつかの異なる一般分類の配列改変法（例えば、変異、組換えなど）が、本発明に適用可能であり、例えば、上記および下記の参考文献に示されている。以下は、本発明の文脈における多様性生成のためのいくつかの異なる型の好ましい形式（例えば、特定の組換えベースの多様性生成形式を含む）を例示する。
核酸は、上記の参考文献に記載される種々の技術のいずれかによって、インビトロで組換えられ得、これらの技術としては、例えば、組換えの後に核酸の連結および／またはＰＣＲ再構築される、核酸のＤＮＡｓｅ消化が含まれる。例えば、性的ＰＣＲ変異誘発が用いられ得、ここでは、ＤＮＡ分子のランダム（または擬ランダム、もしくは非ランダムでさえある）な断片化の後に、ＤＮＡ分子と異なるが関連するＤＮＡ配列番号との間の配列番号同一性に基づく、インビトロでの組換えを行い、その後、ポリメラーゼ連鎖反応における伸長による重なりが続く。このプロセスおよび多くのプロセス改変物は、上記の参考文献のいくつかに記載され、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１に記載される。
同様に、核酸は、例えば、細胞において核酸間で生じる組換えを可能にすることによって、インビボで再帰的に組み換えられ得る。多くのこのような組換え形式は、上記の参考文献内に示される。このような形式は、必要に応じて、目的の核酸間の直接的な組換えを提供するか、または、目的の核酸を含むベクター、ウイルス、プラスミドなどの間の組換えを提供するか、ならびに、他の形式である。このような手順に関する詳細は、上記の参考文献に見出される。
全ゲノム組換え法がまた用いられ得、ここで、細胞もしくは他の生物の全ゲノムが組換えられ、必要に応じて、所望のライブラリー成分（例えば、本発明の経路に対応する遺伝子）とのゲノム組換え混合物のスパイクを含む。これらの方法は、多くの用途を有し、その用途としては、標的遺伝子のアイデンティティーが公知でないものが含まれる。このような方法についての詳細は、例えば、ｄｅｌ ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ ９８／３１８３７「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；および、例えば、ｄｅｌ ＣａｒｄａｙｒｅらによるＰＣＴ／ＵＳ９９／１５９７２（発明の名称「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」）に見出される。
合成組換え法がまた用いられ得、ここでは、目的の標的に対応するオリゴヌクレオチド（１つ以上の親核酸に対オするオリゴヌクレオチドを含む）が、ＰＣＲまたは連結反応において合成および再構築され、それにより、新規の組換え核酸を生成する。オリゴヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド付加法により作製され得るか、または、例えば、３つのヌクレオチド合成アプローチによって作製され得る。このようなアプローチに関する詳細は、上記の参考文献中に見出され、このような文献としては、例えば、以下が挙げられる：ＣｒａｍｅｒｉらによるＷＯ ００／４２５６１「Ｏｌｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、ＷｅｌｃｈらによるＰＣＴ／ＵＳ００／２６７０８「Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ ００／４２５６０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」ならびにＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ ００／４２５５９「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」。
組換えのインシリコ法がまた有効であり得、ここでは、遺伝的アルゴリズムが、コンピュータにおいて用いられ、相同な（または非相同でありさえする）核酸に対応する配列ストリングを再結合する。得られる再結合された配列ストリングは、必要に応じて、例えば、オリゴヌクレオチド合成／遺伝子再構築技術と組み合せて、組換え配列に対応する核酸の合成によって核酸中に変換される。このアプローチは、ランダムな、部分的にランダムな、または、設計された改変体を生じ得る。インシリコ組換え（対応する核酸（および／またはタンパク質）の生成、ならびに、設計された核酸および／またはタンパク質（例えば、重なり部位の選択に基づく）と設計された、擬ランダムな、またはランダムな組換え法との組合せと組み合せての、コンピュータシステムにおける遺伝的アルゴリズム、遺伝的オペレーターなどの使用を含む）に関する多くの詳細は、ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ ００／４２５６０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、ならびに、ＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒａｎｄらによるＷＯ００／４２５５９「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」に記載される。インシリコ組換え法に関するさらなる詳細は、これらの出願に見出される。これらの方法論は、一般に、インシリコでの分子の組換えおよび／または対応する核酸もしくはタンパク質の生成を提供することにおいて、本発明に適用可能である。
天然の多様性にアクセスする多くの方法（例えば、多様な核酸もしくは核酸フラグメントの、単鎖テンプレートに対するハイブリダイゼーション、その後の、重合および／または連結による、全長配列の再生成、必要に応じてその後の、テンプレートの分解、および、得られた修飾核酸の回収）が同様に使用され得る。単鎖テンプレートを採用する１つの方法において、ゲノムライブラリーに由来するフラグメント集団は、対向鎖に対応する、部分ｓｓＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、しばしばほぼ全長のｓｓＤＮＡもしくはＲＮＡにアニーリングする。この集団からの複合キメラ遺伝子の構築は、次いで、ハイブリダイズしていないフラグメント末端のヌクレアーゼベースの除去、重合により媒介されて、このようなフラグメントの間のギャップを埋め、その後、単鎖連結が生じる。親ポリヌクレオチド鎖は、消化によって（例えば、ＲＮＡまたはウラシルが含まれる場合）、変性条件下での磁気分離によって（このような分離に対して導電性の様式で標識されている場合）、および他の利用可能な分離／精製法によって除去され得る。あるいは、親鎖は、必要に応じて、キメラ鎖と同時に精製され、その後のスクリーニング工程および処理工程の間に除去される。このアプローチに関するさらなる詳細は、例えば、Ａｆｆｈｏｌｔｅｒによる「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」，ＰＣＴ／ＵＳＯ１／０６７７５に見出される。
別のアプローチにおいて、単鎖分子は、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換され、ｄｓＤＮＡ分子は、リガンドが媒介する結合によって固体支持体に結合される。未結合のＤＮＡの分離後、選択されたＤＮＡ分子を、支持体から解離させ、適切な宿主細胞に導入して、プローブにハイブリダイズするライブラリー富化された配列を生じる。このように生成されたライブラリーは、本明細書中に記載される任意の手順を用いて、さらなる多様化のための所望の基質を提供する。
上記の任意の一般的な組換え形式は、反復様式で実施され得（例えば、変異／組み換えまたは他の多様性生成法の１つ以上のサイクル、必要に応じて、１つ以上の選択法が続く）、より多様なセットの組換え核酸を生じる。
ポリヌクレオチド鎖終結法を用いる変異誘発がまた提案されており（例えば、Ｓｈｏｒｔに対する米国特許第５，９６５，４０８号、「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｙ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」および上記の参考文献を参照のこと）、本発明に適用され得る。このアプローチにおいて、配列類似性の領域を共有する１つ以上の遺伝子に対応する二重鎖ＤＮＡが、このイでんんしに特異的なプライマーの存在下または不在下で、合わせられ、変性される。次いで、単鎖ポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ、鎖終結試薬（例えば、紫外線照射、γ線照射もしくはＸ線照射；エチジウムブロマイドもしくは他のインターカレーター；ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、単鎖結合タンパク質、転写活性化因子もしくはヒストン）；多環芳香族炭化水素；三価クロムもしくは三価クロム得ん；または、迅速な熱サイクリングに媒介される重合など）の存在下でアニーリングおよびインキュベートされ、部分的に二重鎖の分子を生成する。この部分的に二重鎖の分子（例えば、部分的な伸長鎖を含む）が、次いで、その後の複製もしくは部分的複製のラウンドにおいて変性され、再度アニーリングされて、配列類似性の可変の程度を共有し、ＤＮＡ分子の最初の集団に関して多様化されているポリヌクレオチドを生じる。必要に応じて、生成物、もしくはこの生成物の部分的なプールが、プロセスの１つ以上の工程において増幅され得る。上記のような鎖終結法によって生じるポリヌクレオチドは、任意の他の記載される組換え形式についての適切な基質である。
多様性はまた、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）「Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１２０５に記載される、「ハイブリッド酵素の作製のための増分的短縮（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）」（「ＩＴＣＨＹ」）といわれる組換え手順を使用して、核酸または核酸集団において精製されうる。このアプローチは、１種以上のインビトロまたはインビボでの組換え法のための基質として必要に応じて働きうる改変体の初期ライブラリーを生成するために使用されうる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９），「Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ」，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４もまた参照のこと。
個々のヌクレオチドまたは連続するもしくは連続しないヌクレオチドの群の変化を生じる変異法は、都合の良いことには、ヌクレオチド多様性を導入するために使用されうる。多くの変異誘発法は、上記で引用された参考文献に見出される；変異誘発法に関するさらなる詳細は、以下において見出され得、これはまた、本発明に適用されうる。例えば、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲは、核酸改変体を生成するために使用されうる。この技術を使用して、ＰＣＲは、ｉｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｈｅｒｅ ｔｈｅ ｃｏｐｙｉｎｇ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡポリメラーゼの忠実度をコピーすることが低い条件下で行われる。その結果、そのＰＣＲ生成物の長さ全体に沿って、高い割合で点変異が得られる。このような技術の例は、上記の参考文献において見出され、例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５およびＣａｌｄｗｅｌｌら（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３において見出される。同様に、アセンブリＰＣＲは、小さなＤＮＡフラグメントの混合物からＰＣＲ生成物をアセンブリすることを包含するプロセスにおいて、使用されうる。多数の異なるＰＣＲ反応が、同じ反応混合物中で並行して存在し得、１反応の生成物は、別の反応の生成物を刺激する。
オリゴヌクレオチド指向性変異誘発は、目的の核酸配列中に部位特異的変異を導入するために使用されうる。このような技術の例は、上記の参考文献中に、例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：５３−５７に見出される。同様に、カセット変異誘発は、二本鎖ＤＮＡ分子の小さな領域を、そのネイティブな配列とは異なる合成オリゴヌクレオチドカセットで置換するプロセスにおいて、使用されうる。そのオリゴヌクレオチドは、例えば、完全におよび／または部分的にランダム化したネイティブ配列を含みうる。
再帰的集合的変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、タンパク質変異誘発のためのアルゴリズムが、表現型的に関連した変異体の多様な集団を生成するために使用されるプロセスであり、その多様な集団のメンバーは、アミノ酸配列が異なる。この方法は、コンビナトリアルカセット変異誘発の連続するラウンドをモニターするためにフェードバック機構を利用する。このアプローチの例は、Ａｒｋｉｎ＆Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５に見出される。指数関数的集合的変異誘発は、高い割合の独特のかつ機能的変異体を有するコンビナトリアルライブラリーを生成するために使用されうる。目的の配列における残基の小さな群は、並行してランダム化されて、各変化した位置で、機能的タンパク質をもたらすアミノ酸が同定される。このような手順の例は、Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ＆Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：１５４８−１５５２にある。
インビボ変異誘発は、目的の任意のクローニングされたＤＮＡにおけるランダム変異を、そのＤＮＡを、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（これは、そのＤＮＡ修復経路のうちの１以上において変異を有する）の株において遺伝させることによって、生成するために使用されうる。これらの「ミューテーター」株は、野生型親のものより高いランダム変異率を有する。これらの株のうちの１つにおけるそのＤＮＡの遺伝は、最終的に、そのＤＮＡ内でランダム変異を生成する。このような手順は、上記の参考文献に記載される。
ゲノム（例えば、細菌ゲノム、真菌ゲノム、動物ゲノムまたは植物ゲノム）に多様性を導入するための他の手順は、上記の方法および／または参照された方法とともに使用されうる。例えば、上記の方法に加えて、種々の種への形質転換に適した核酸マルチマーを生成する技術が提唱されてきた（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ 米国特許第５，７５６，３１６号および上記の参考文献を参照のこと）。互いに関して多様な（例えば、天然の多様性から、または部位指向性変異誘発、誤りがちなＰＣＲ、変異誘発性細菌株を介する経路などから得られる）遺伝子からなる、このようなマルチマーでの適した宿主の形質転換は、ＤＮＡ多様化のための核酸多様性の供給源を、例えば、上記のインビボ組換えプロセスによって、提供する。
あるいは、部分的配列類似性の領域を共有するモノマーポリヌクレオチドの多様性は、宿主種に形質転換され得、その宿主細胞によってインビボで組み換えられ得る。細胞分裂のその後のラウンドは、ライブラリーを生成するために使用され得、そのライブラリーのメンバーは、単一の均質な集団またはモノマーポリヌクレオチドのプールを含む。あるいは、そのモノマー核酸は、標準的な技術（例えば、ＰＣＲおよび／またはクローニング）によって回収され得、その組換え形式（上記の再帰的組換え形式を含む）のいずれかにおいて組み換えられ得る。
複数の発現ライブラリーを生成するための方法が記載されており（上記の参考文献に加えて、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（１９９８）米国特許第５，７８３，４３１号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＮＯＶＥＬ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＰＡＴＨＷＡＹＳ」およびＴｈｏｍｐｓｏｎら（１９９８）米国特許第５，８２４，４８５号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＮＯＶＥＬ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＰＡＴＨＷＡＹＳ」を参照のこと）、目的のタンパク質活性を同定するためのそれらの用途が提唱されてきた（上記の参考文献に加えて、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許第５，９５８，６７２号「ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＯＦ ＣＬＯＮＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＮＡ ＦＲＯＭ ＵＮＣＵＬＴＩＶＡＴＥＤ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ」を参照のこと）。多種発現ライブラリーは、一般に、発現カセットにおいて、適切な調節配列に作動可能に連結される、複数の種または株に由来するｃＤＮＡ配列またはゲノム配列を含むライブラリーを含む。そのｃＤＮＡおよび／またはゲノム配列は、必要に応じて、多様性をさらに増強するためにランダムに連結される。そのベクターは、宿主生物の１を超える種（例えば、細菌種、真核生物細胞）における形質転換および発現のために適したシャトルベクターであり得る。いくつかの場合に、そのライブラリーは、目的のタンパク質をコードするか、または目的の核酸にハイブリダイズする配列を予め選択することによって偏らせられる。任意のこのようなライブラリーは、本明細書中に記載の方法のいずれかのための基質として提供されうる。
上記の手順は、主に、核酸および／またはコードされるタンパク質多様性を増大させることに関する。しかし、多くの場合、多様性の全てが有用（例えば、機能的）であるわけではなく、改変体のバックグラウンドを増大させることには滅多に寄与せず、小数の都合の良い改変体を同定するためにスクリーニングされるかまたは選択されなければならない。いくつかの適用において、例えば、組換えベースの変異誘発手順によって、多様化の前に、ライブラリー（例えば、増幅されたライブラリー、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、正規化ライブラリーなど）または他の基質核酸を予め選択または予めスクリーニングするか、そうでなければ、その基質を、機能的生成物をコードする核酸へ偏らせることが望ましい。例えば、上記の方法のいずれかによって操作する前に、抗体操作の場合において、インビボ組換え事象を利用することによって、機能的抗原結合部位を有する抗体へと多様性生成プロセスを偏らせることが可能である。例えば、Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリーから得られる、組換えられたＣＤＲは増幅され得、本明細書中に記載される方法のいずれかに従って多様化する前に、フレームワーク領域にアセンブルされ得る（例えば、Ｊｉｒｈｏｌｔら．（１９９８）「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐａｃｅ：ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｒｍｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ａ ｍａｓｔｅｒ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ」Ｇｅｎｅ ２１５：４７１）。
ライブラリーは、望ましい酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸へと偏らせ得る。例えば、特異化された活性を示すライブラリーからクローンを同定した後、そのクローンを、ＤＮＡ変化を導入するために任意の公知の方法を用いて変異誘発されうる。その変異誘発されたホモログを含むライブラリーは、次いで、望ましい活性のためにスクリーニングされ、この活性は、最初に特異化された活性と同じであってもよいし、異なっていてもよい。このような手順の例は、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許第５，９３９，２５０号「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＥＮＺＹＭＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ ＢＹ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ」において提唱される。所望の活性は、当該分野で公知の任意の方法によって同定されうる。例えば、ＷＯ９９／１０５３９は、ｐｒｏｐｏｓｅｓ 遺伝子ライブラリーが、その遺伝子ライブラリーからの抽出物と、代謝が強い細胞とを組み合わせて、その望ましい活性を示す組み合わせを同定することによって、スクリーニングされうることを提唱する。所望の活性を有するクローンが、生体活性基質をそのライブラリーのサンプルに挿入し、そして、本明細書中に記載されるように、所望の活性の生成物に対応する生体活性蛍光を蛍光分析器（例えば、フローサイトメトリーデバイス、ＣＣＤ、蛍光測定器、または分光光度計）を用いて検出することによって、同定されうることもまた提唱されてきた（例えば、ＷＯ９８／５８０８５）。
ライブラリーはまた、特異化された特性（例えば、選択された核酸プローブに対するハイブリダイゼーション）を有する核酸に偏らせられ得る。例えば、出願ＷＯ９９／１０５３９は、ｐｒｏｐｏｓｅｓ ｔｈａｔ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ 所望の活性（例えば、酵素活性，例えば：リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、ヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼ、またはアシラーゼ）をコードするポリヌクレオチドが、以下の様式でゲノムＤＮＡ配列の中から同定されうる。ゲノムＤＮＡの集団からの一本鎖ＤＮＡ分子は、リガンド結合体化プローブにハイブリダイズされる。そのゲノムＤＮＡは、培養もしくは培養されていない微生物、または環境サンプルのいずれかから選られうる。あるいは、そのゲノムＤＮＡは、多細胞生物またはこれらの由来する組織に由来しうる。第２鎖合成は、その捕捉培地からの事前の放出ありまたはなしで、あるいは当該分野で公知の種々の他のストラテジーのによって、その捕捉において使用されるハイブリダイズプローブから直接行われ得る。あるいは、その単離された一本鎖ゲノムＤＮＡ集団は、さらにクローニングすることなくフラグメント化され得、例えば、上記の一本鎖テンプレートを使用する組換えベースのアプローチにおいて直接使用されうる。
核酸およびポリペプチドを生成する「非確率的」方法は、Ｓｈｏｒｔ「Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＷＯ００／４６３４４において主張される。これらの方法は、提唱された非確率的ポリヌクレオチド再アセンブリおよび部位飽和変異誘発法を含め、本発明においても同様に適用されうる。添加された（ｄｏｐｅｄ）オリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム変異誘発または半ランダム変異誘発はまた、例えば、Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｔｏ ｅｎｃｏｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９７−３００；Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）「Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６；ＬｉｍおよびＳａｕｅｒ（１９９１）「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３５９−７６；ＢｒｅｙｅｒおよびＳａｕｅｒ（１９８９）「Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ５１Ｆ ｔｏ ｌａｍｂｄａ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３３５５−６０）；ならびに「Ｗａｌｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」（Ｃｒｅａ，Ｒ；米国特許第５，８３０，６５０号および同第５，７９８，２０８号、ならびにＥＰ特許第０５２７８０９ Ｂ１号）において記載される。
多様化の前にライブラリーを富化するために適切な任意の上記の技術はまた、多様性生成法によって錯生成された生成物、またはその生成物のライブラリーをスクリーニングするために使用されうることが容易に李ｋらいされる。
変異誘発、ライブラリー構築および他の多様性生成法のためのキットもまた、市販されている。例えば、キットは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位指向性変異誘発キット；およびＣｈａｍｅｌｅｏｎＴＭ二本鎖部位しく尾性変異誘発キット）、Ｂｉｏ／Ｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（例えば、上記のＫｕｎｋｅｌ法を使用する）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、５プライム３プライムキット）；Ｇｅｎｐａｋ Ｉｎｃ、Ｌｅｍａｒｇｏ Ｉｎｃ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ（例えば、上記のＥｃｋｓｔｅｉｎ法を使用する）、およびＡｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ（例えば、上記のＣａｒｔｅｒ／Ｗｉｎｔｅｒ法を使用する）から入手可能である。
上記の参考文献は、多くの変異形式（組換え、再帰的組換え、再帰的変異および組み合わせまたは変異誘発の他の形態との組換えを含む）、ならびにこれらの形態の多くの改変を提供する。使用される多様性生成形式に関係なく、本発明の核酸は、（互いに、または関連した配列と（関連していない配列とも））組み換えられて、組換え核酸の多様なセット（例えば、相同核酸のセット、および対応するポリペプチドを含む）が生成され得る。
１以上の本発明のポリヌクレオチド配列を、上記の形式のいずれかを単独でまたは組み合わせて使用する１以上のさらなる核酸と組み換えることによって生成される組換え核酸はまた、本発明の一部を形成する。その１以上のさらなる核酸は、本発明の別のポリヌクレオチドを含みうる；必要に応じて、代わりに、またはさらに、その１以上のさらなる核酸は、例えば、天然に存在するインターフェロン−αもしくはその部分配列、または任意の相同なインターフェロン−αもしくはその部分配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の利用可能な文献において見出される）または任意の他の相同なもしくは非相同な核酸もしくはそれらのフラグメント（上記の特定の組換え形式、特に、合成によりまたはインシリコで生成されたものは、組換えのための方法論を必要としない）をコードする核酸を含みうる。
（治療的用途）
種々のインターフェロン−αポリペプチドおよびインターフェロン−α結合体が認可されており、慢性Ｃ型肝炎および慢性Ｂ型肝炎のようなウイルス状態の処置のために臨床開発中である、従って、本発明は、このような状態を処置するための１以上の本発明のポリペプチドまたは結合体を含む組成物（すなわち、「本発明の組成物」）の使用を企図する。
（Ｃ型肝炎ウイルス）
一実施形態において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者を処置する方法を提供し、この方法は、その患者に、１以上の本発明のポリペプチドまたは結合体を含む、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する。本発明はまた、ＨＣＶに感染した患者を処置することにおいて使用するための組成物を提供し、この組成物は、１以上の本発明のポリペプチドまたは結合体および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。ＨＣＶに感染していると診断された患者は、血液中のＨＣＶ ＲＮＡを示し、そして／または血清中に抗ＨＣＶ抗体を示す患者を含む。
本発明のポリペプチドを含む組成物は、臨床用に認可されたインターフェロン−αポリペプチド（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ、組換え；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ、組換え；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、およびＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（インターフェロンαｃｏｎ−１；ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、一般に、ＨＣＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の用量および頻度で投与される。慢性ＨＣＶの処置のためのＲＯＦＥＲＯＮまたはＩＮＴＲＯＮ Ａの例示的に推奨される投薬スケジュールは、例えば、２４〜４８週間にわたる、１週間に３回皮下注射による３００万ＩＵ（約１５μｇ（ｍｃｇ））である。慢性ＨＣＶの処置のためのＩＮＦＥＲＧＥＮの例示的な推奨される投薬スケジュールは、例えば、２４〜４８週間にわたる、１週間に３回皮下注射による９ｍｃｇである。多くの要因（本発明のポリペプチドの活性および薬物動態ならびに患者の大きさおよび健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、そのポリペプチドは、上記よりも低用量（例えば、約２ｍｃｇ、３ｍｃｇ、４ｍｃｇ、５ｍｃｇ、６ｍｃｇ、７ｍｃｇ、または８ｍｃｇ）および／または低頻度（例えば、１週間に１回または１週間に２回）で投与されうる。
同様に、本発明の結合体を含む組成物は、一般に、臨床用に認可されたインターフェロン−α結合体（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）またはＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ｂ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用するＨＣＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の用量または頻度で投与される。慢性ＨＣＶの処置のためのＰＥＧＡＳＹＳの例示的に推奨される投薬スケジュールは、例えば、２４〜４８週間にわたる、１週間に１回の皮下注射による１８０ｍｃｇである。多くの要因（本発明の結合体の分子量、活性、および薬物動態、ならびに患者の大きさおよび健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、その結合体は、上記よりも低い量（例えば、約２５ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、７５ｍｃｇ、１００ｍｃｇ、１２５ｍｃｇ、または１５０ｍｃｇ）および／または低頻度（例えば、１０日毎に１回、または２週間毎に１回）で投与されうる。
いくつかの場合において、本発明のポリペプチドまたは結合体は、１種以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与される。例えば、本発明のポリペプチドまたは結合体は、抗ウイルス薬物（例えば、Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ（これは、名称ＣＯＰＥＧＵＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ）およびＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の下で販売されている）と組み合わせて投与されうる。
本発明のポリペプチドまたは結合体の投与の正確な量および頻度は、多くの要因（例えば、そのポリペプチドまたは結合体の比活性および薬物動態特性、ならびに処置される状態の性質（例えば、処置されるＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型））、とりわけ、当業者に公知の他の要因に依存する。通常、その用量は、処置される適応症の重篤度または拡がりを防止または減少させうるはずである。このような用量は、「有効」量または「治療有効」量といわれ得る。本発明のポリペプチド、結合体または組成物の有効量が、特に、その処置される状態、用量、投与スケジュール、そのポリペプチドまたは結合体または組成物が単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、そのポリペプチド、結合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢、および全身の健康状態に依存することは、当業者に明らかである。投与の投薬量および頻度は、公知の技術を使用して当業者によって確認できる。
処置の有効性は、ウイルス負荷を測定することによって、例えば、当該分野で公知の方法を使用して、血清または血漿中のウイルスの力価またはレベルを決定することによって（例えば、定量的ＰＣＲベースの試験（例えば、ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）ＨＣＶ Ｔｅｓｔ，ｖ２．０またはＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＣＶ ＭＯＮＩＴＯＲ（登録商標）Ｔｅｓｔ，ｖ２．０（ともに、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから）を用いてウイルスＲＮＡレベルをモニターすることによって）決定されうる。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、処置前のウイルス負荷（通常、慢性ＨＣＶ患者について、１０５〜１０７コピーのＨＣＶ ＲＮＡ／ｍｌの範囲である）と比較して、少なくとも２ｌｏｇ単位、少なくとも３ｌｏｇ単位、少なくとも４ｌｏｇ単位、少なくとも５ｌｏｇ単位、少なくとも６ｌｏｇ単位または少なくとも７ｌｏｇ単位、処置期間にわたってウイルス負荷の減少を達成するために十分な量である。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、本質的に検出不能であるレベル（例えば、約５００コピー／ｍｌ血清未満または約１００コピー／ｍｌ血清未満）までウイルス負荷を減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＣＶに感染した患者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを減少する方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するＨＣＶ ＲＮＡレベルと比較して、ＨＣＶ ＲＮＡのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
処置の有効性は、代わりに、または加えて、ＨＣＶ感染と関連した状態（例えば、肝臓損傷）を示すパラメーターを測定することによって、決定されうる。例えば、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルは、標準的アッセイを使用して測定されうる。一般に、約５０国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）血清未満のＡＬＴレベルは、正常であるとみなされる。より高いＡＬＴレベルは、進行している肝臓損傷の指標であり得る。いくつかの場合において、有効量の本発明の組成物は、正常ＡＬＴレベルより高い患者におけるＡＬＴレベルを、約５０ＩＵ／ｍｌの血清未満に低下させるに有効な量である。従って、本発明は、５０ＩＵ／ｍｌより高い初期ＡＬＴレベルを示す、ＨＣＶに感染した患者の血清ＡＬＴレベルを低下させる方法を包含し、この方法は、約５０ＩＵ／ｍｌ未満にＡＬＴレベルを低下するに有効な量の本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
（Ｂ型肝炎ウイルス）
別の局面において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者を処置する方法を提供し、この方法は、その患者に、１以上の本発明のポリペプチドまたは結合体を含む本発明の組成物の有効量を投与する工程を包含する。本発明はまた、ＨＢＶに感染した患者を処置することにおいて使用するための組成物を提供し、この組成物は、１以上の本発明のポリペプチドまたは結合体および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。
ＨＢＶに感染したと診断される患者は、血清中に、検出可能なＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を示す。慢性ＨＢＶ感染は、「複製」または「非複製」のいずれかとしてさらに分類される。複製感染において、その患者は、通常、ウイルスＤＮＡおよび検出可能なＨＢｅＡｇの比較的高い血清濃度を有し、このＨＢｅＡｇは、高いウイルス複製の条件下で合成されるＨＢＶプレコア遺伝子の選択的プロセシングタンパク質である。しかし、そのプレコア遺伝子において変異を有する稀なＨＢＶ株において、複製感染は、検出可能な血清ＨＢｅＡｇの非存在下で起こりうる。慢性Ｂ型肝炎および複製感染を有する患者は、一般に、より悪い予後を有し、かつＨＢｅＡｇなしのものよりも、肝硬変および／または肝細胞癌種を発症する可能性が高い。非複製感染において、肝臓におけるウイルス複製の速度は低く、血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度は、一般に低く、かつ肝炎Ｂｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は検出されない。
本発明のポリペプチドを含む組成物は、一般に、臨床用に認可されたインターフェロン−αポリペプチド（例えば、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロン−２ｂ、組換え；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＨＢＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の用量および頻度で投与される。成体の慢性ＨＢＶの処置のためのＩＮＴＲＯＮ Ａの例示的に推奨される投薬スケジュールは、１６週間にわたる、５００万ＩＵ／日（ｑｄ）または１週間に３回（ｔｉｗ）の１０００万ＩＵ／日である。多くの要因（本発明のポリペプチドの活性および薬物動態ならびに患者の大きさおよび健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、本発明のポリペプチドは、上記よりも低い量（例えば、１週間あたり約５００万ＩＵ、１０００万ＩＵ、１５００万ＩＵ、２０００万ＩＵ、または２５００万ＩＵ）および／または低頻度（例えば、１週間に１回または１週間に２回）で投与されうる。
同様に、本発明の結合体を含む組成物は、一般に、現在臨床試験を行っているインターフェロン−α結合体（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）を使用するＨＢＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の用量または頻度で投与される。慢性ＨＢＶの処置のためのＰＥＧＡＳＹＳの例示的に推奨される投薬スケジュールは、例えば、２４週間にわたる、１週間に１回の注射による９０ｍｃｇ〜２７０ｍｃｇである。多くの要因（本発明の結合体の分子量、活性、および薬物動態、ならびに患者の大きさおよび健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、その結合体は、上記よりも低い量（例えば、約２５ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、７５ｍｃｇ、１００ｍｃｇ、１２５ｍｃｇ、または１５０ｍｃｇ）および／または低頻度（例えば、１０日毎に１回、または２週間毎に１回）で投与されうる。
いくつかの場合において、本発明のポリペプチドまたは結合体は、１種以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与される。例えば、本発明のポリペプチドまたは結合体は、抗ウイルス薬物（例えば、ラミブジン（３ＴＣとしても知られる）（これは、名称Ｅｐｉｖｉｒ−ＨＢＶ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）の下で販売されている）またはアデフォビルジピボキシル（これは、名称Ｈｅｐｓｅｒａ（登録商標）（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の下で販売されている））と組み合わせて投与されうる。
本発明のポリペプチドまたは結合体の投与の正確な量および頻度は、多くの要因（例えば、そのポリペプチドまたは結合体の比活性および薬物動態特性、ならびに処置される状態の性質（例えば、慢性Ｂ型肝炎の場合、感染が複製か被覆性か）、とりわけ、当業者に公知の他の要因に依存する。通常、その用量は、処置される適応症の重篤度または拡がりを防止または減少させうるはずである。このような用量は、「有効」量または「治療有効」量といわれ得る。本発明のポリペプチド、結合体または組成物の有効量が、特に、その処置される状態、用量、投与スケジュール、そのポリペプチドまたは結合体または組成物が単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、そのポリペプチド、結合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢、および全身の健康状態に依存することは、当業者に明らかである。投与の投薬量および頻度は、公知の技術を使用して当業者によって確認できる。
処置の有効性は、ウイルス負荷を測定することによって、例えば、当該分野で公知の方法を使用して、血清または血漿中のウイルスの力価またはレベルを決定することによって（例えば、定量的ＰＣＲベースの試験（例えば、ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）ＨＣＶ Ｔｅｓｔ，ｖ２．０またはＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＣＶ ＭＯＮＩＴＯＲ（登録商標）Ｔｅｓｔ，ｖ２．０（ともに、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから）を用いてウイルスＲＮＡレベルをモニターすることによって）決定されうる。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、処置前のウイルス負荷（通常、慢性ＨＣＶ患者について、１０５〜１０７コピーのＨＣＶ ＲＮＡ／ｍｌの範囲である）と比較して、少なくとも２ｌｏｇ単位、少なくとも３ｌｏｇ単位、少なくとも４ｌｏｇ単位、少なくとも５ｌｏｇ単位、少なくとも６ｌｏｇ単位または少なくとも７ｌｏｇ単位、処置期間にわたってウイルス負荷の減少を達成するために十分な量である。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、本質的に検出不能であるレベル（例えば、約５００コピー／ｍｌ血清未満または約１００コピー／ｍｌ血清未満）までウイルス負荷を減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＣＶに感染した患者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを減少する方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するＨＣＶ ＲＮＡレベルと比較して、ＨＣＶ ＲＮＡのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
処置の有効性は、当該分野で公知の方法を用いて、例えば、ウイルス負荷（例えば、血清または血漿中のウイルスＤＮＡのレベル）を測定することによって、決定されうる。ＨＢＶ ＤＮＡレベルをモニターするための方法は、定量的ＰＣＲベースの試験（例えば、ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＢＶ ＭＯＮＩＴＯＲ（登録商標）Ｔｅｓｔ，ｖ２．０またはＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＢＶ ＭＯＮＩＴＯＲ（登録商標）Ｔｅｓｔ，ｖ２．０（ともに、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから）を含む。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、ウイルスＤＮＡを、例えば、約５００，０００コピー／ｍｌ血清未満または約１００，０００コピー／ｍｌ血清未満または約１０，０００コピー／ｍｌ血清未満に、あるいは本質的に検出不能であるレベル（例えば、約１０００コピー／ｍｌ血清未満、約５００コピー／ｍｌ血清未満、約２００コピー／ｍｌ血清未満）に減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＢＶに感染した患者の血清中のＨＢＶ ＤＮＡのレベルを減少させる方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するＨＢＶ ＤＮＡレベルと比較して、ＨＢＶ ＤＮＡのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
処置の有効性は、代わりに、または加えて、ＨＢＶ複製のための他の血清マーカー（例えば、ＨＢｅＡｇ）を測定することにより決定されうる。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、ＨＢｅＡｇのレベルを本質的に検出不能であるレベルに減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＢＶに感染した患者の血清中のＨＢｅＡｇのレベルを減少させる方法を包含し、この方法は、処置の開始間に存在するＨＢｅＡｇレベルと比較して、ＨＢｅＡｇのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
上記で議論されるように、ＨＢＶ感染を示す別の血清マーカーは、ＨＢｓＡｇである。従って、その処置の有効性は、代わりに、または加えて、血清中のＨＢｓＡｇのレベルを測定することにより決定されうる。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、ＨＢｓＡｇのレベルを本質的に検出不能であるレベルに減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＢＶに感染した患者の血清中のＨＢｓＡｇのレベルを減少させる方法を包含し、この方法は、処置の開始間に存在するＨＢｓＡｇレベルと比較して、ＨＢｓＡｇのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
その処置の有効性は、代わりに、または加えて、ＨＢＶ感染と関連した状態（例えば、肝臓損傷）を示すパラメーターを測定することによって、決定されうる。例えば、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルは、標準的アッセイを使用して測定されうる。一般に、約５０国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）血清未満のＡＬＴレベルは、正常であるとみなされる。より高いＡＬＴレベルは、進行している肝臓損傷の指標であり得る。いくつかの場合において、有効量の本発明の組成物は、正常ＡＬＴレベルより高い患者におけるＡＬＴレベルを、約５０ＩＵ／ｍｌの血清未満に低下させるに有効な量である。従って、本発明は、５０ＩＵ／ｍｌより高い初期ＡＬＴレベルを示す、ＨＢＶに感染した患者の血清ＡＬＴレベルを低下させる方法を包含し、この方法は、約５０ＩＵ／ｍｌ未満にＡＬＴレベルを低下させるに有効な量の本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
（処方物および投与経路）
本発明のポリペプチドまたは結合体の治療用処方物は、代表的には、１種以上の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む組成物中で投与される。このような薬学的組成物は、十分に保存安定性でかつヒトまたは動物への投与に適したポリペプチド薬品を生じるように当該分野でそれ自体公知の様式で調製され得る。
（薬物形態）
本発明のポリペプチドまたは結合体は、「そのまま」使用されうるか、そして／またはその塩形態で使用されうる。適切な塩としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム）との塩、ならびに例えば、亜鉛塩が挙げられるが、これらに限定されない。これらの塩または錯体は、結晶および／または非晶質構造として存在しうる。
（賦形剤）
「薬学的に受容可能」とは、使用される投薬量および濃度において、投与される患者においていかなる望ましくない効果も引き起こさないキャリアまたは賦形剤を意味する。このような薬学的に受容可能なキャリアおよび賦形剤は、当該分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．ＦｒｏｋｊａｅｒおよびＬ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，編，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第３版，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。
（薬物の混合）
本発明の薬学的組成物は、単独でまたは他の治療剤とともに投与され得る。例えば、リバビリンは、ＩＦＮ−αと同時に同時投与され、ＨＣＶ処置の効力を増加することが示されている。種々の低分子が、ウイルス標的（ウイルスプロテアーゼ、ウイルスポリメラーゼ、ウイルス複製複合体のアセンブリ）および宿主標的（ウイルスプロセシングに必要とされる宿主プロテアーゼ、ＮＳ５Ａのようなウイルス標的のリン酸化に必要とされる宿主キナーゼ、およびウイルスＩＲＥＳを効率的に利用するのに必要とされる宿主因子のインヒビター）の両方に対して開発されている。他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、またはＩＦＮ−γ）は、同時投与される。これらの薬剤は、同じ薬学的組成物の一部として組み込まれ得るか、または本発明のポリペプチドまたは結合体とは別々に、同時にまたは別の処置スケジュールに従って、投与され得る。さらに、本発明のポリペプチド、結合体または薬学的組成物は、他の治療に対するアジュバントとして使用され得る。
（患者）
本発明の目的で、「患者」は、ヒトおよび他の哺乳動物の両方を包含する。従って、本方法は、ヒト治療適用および獣医適用の両方に適用可能である。
（組成物の型および投与経路）
本発明のポリペプチドまたは結合体を含む薬学的組成物は、種々の形態（例えば、液体、ゲル、凍結乾燥された形態として、または圧縮固体として）処方され得る。好ましい形態は、処置される特定の適応症に依存し、当業者に明らかである。
本発明の処方物の投与は、種々の方法で実行され得、これには、経口的、皮下的、静脈内的、大脳内的、鼻内的、経皮的、腹腔内的、筋肉内的、肺内的、膣内的、直腸的、眼内的、または任意の他の受容可能な様式が挙げられるが、これらに限定されない。処方物は、ポンプ（例えば、皮下浸透圧ポンプ）または移植のような当該分野で周知の技術を使用して、ボーラス注射が受容可能であるが、注入によって連続的に投与され得る。いくつかの例において、処方物は、溶液または噴霧として直接的に適用され得る。
（非経口物）
薬学的組成物の例は、非経口投与にために設計された溶液である。多くの場合において、薬学的処方物が液体形態で提供されるが、迅速な使用に適切な場合、このような非経口処方物はまた、凍結形態または凍結乾燥形態で提供され得る。前者の場合、組成物は、使用の前に解凍されなければならない。後者形態は、しばしば、幅広い種々の状態下で組成物に含まれる活性化合物の安定性を向上するために使用される。なぜなら、凍結乾燥調製物は、一般的に、それらの液体対応物よりも安定であることが認識されているからである。このような凍結乾燥調製物は、注入のための滅菌水または滅菌生理学的生理食塩水溶液のような一種以上の適切な薬学的受容可能な希釈剤の添加によって、使用の前に、再構成される。
非経口物は、所望の程度の純度を有するポリペプチドを、当該分野において代表的に使用される一種以上の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤（これら全てが、「賦形剤」と呼ばれる）（例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤および／または他の雑多な添加剤）と混合することによって、凍結乾燥処方物または水溶液としての保存のために調製され得る。
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲のｐＨを維持するのに役立つ。これらは、代表的に、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明での使用に適切な緩衝剤としては、有機酸および無機酸の両方ならびにそれらの塩が挙げられ、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など
）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、ならびに酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）である。さらなる可能性は、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩（例えば、Ｔｒｉｓ）である。
保存剤は、微生物増殖を遅らせるために添加され、そして代表的に、約０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の量で添加される。本発明での使用に適切な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンザルコニウム、またはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが挙げられる。
等張化剤は、液体組成物の等張性を確実にするために添加され、多水酸基糖アルコール、好ましくは、三価またはより高次の糖アルコール（例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール）が挙げられる。多水酸基アルコールは、他の成分の相対量を考慮して、０．１重量％と２５重量％との間、代表的には１重量％〜５重量％の量で存在し得る。
安定化剤は、幅広いカテゴリーの賦形剤を示し、これは、機能において、充填剤から、治療剤を溶解させるかまたは変性を妨げるかもしくは容器の壁への接着を妨げるのに役立つ添加剤までの範囲であり得る。代表的な安定化剤は、多水酸基糖アルコール（上に挙げられる）；アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなど）、有機糖または糖アルコール（例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなど）（イノシトールのようなシクリトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤（例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、ナトリウムチオグリコレート、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム）；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０残基）；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコース）；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、およびスクロース）；三糖（例えば、ラフィノース）、ならびに多糖（例えば、デキストラン）であり得る。安定化剤は、代表的に、活性タンパク質重量に基づいて、０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在する。
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても公知）は、治療剤を溶解させるのを助けるため、そして治療ポリペプチドを撹拌誘導凝集から保護するために存在し得、これはまた、ポリペプチドの変性を引き起こさないで、表面応力を剪断するために処方物が暴露されることを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０など）が挙げられる。
さらなる雑多な賦形剤としては、充填剤またはフィラー（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が挙げられる。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション（ｃｏａｓｅｒｖａｔｉｏｎ）技術によってまたは界面重合によって調製されるマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン）中に閉じ込められ得る。このような技術は、上記、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示される。
本発明の１つの局面において、この組成物は、液体組成物（例えば、水性組成物）であり、以下の式
Figure 2006506097
 のスルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体を含み、ここで、ｎは、４、５、または６であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、それぞれ、独立して、−Ｏ−基または−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６アルキル）−ＳＯ３−基であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３の少なくとも１つが、独立して、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６アルキル）−ＳＯ３−基であり；Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、およびＳ９は、それぞれ、独立して、薬学的に受容可能なカチオン（Ｈ＋を含む）である。
ｎ＝４の場合、スルホアルキルエーテルシクロデキストリンが、α−スルホアルキルエーテルシクロデキストリンであり得ることが注意されるべきである。類似の様式において、ｎ＝５である場合、用語β−スルホアルキルエーテルシクロデキストリンが使用され得、そしてｎ＝６である場合、スルホアルキルエーテルシクロデキストリンはまた、γ−スルホアルキルエーテルシクロデキストリンと呼ばれ得る。
さらなる実施形態において、ｎは、５または６である。好ましい実施形態において、ｎ＝６である。
なおさらなる実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３は、独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、および−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−からなる群より選択される。最も好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３は、独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−である。
さらなる実施形態において、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、およびＳ９は、それぞれ、独立して、Ｈ＋、アルカリ金属（例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋）、アルカリ土類金属（例えば、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２）、アンモニウムイオンおよびアミンカチオン（例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミン、ピペリジン、ピラジン、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノールアミンおよび（Ｃ４〜Ｃ８）シクロアルカノールアミンのようなアミンカチオンから選択される薬学的に受容可能なカチオンである。最も好ましくは、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、およびＳ９は、それぞれ独立して、Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋からなる群より選択される薬学的に受容可能なカチオン（特に、Ｎａ＋）である。
スルホアルキルエーテルシクロデキストリンは、１〜１８個のスルホアルキル基（ｎ＝４の場合）、１〜２１個のスルホアルキル基（ｎ＝５の場合）、または１〜２１個（ｎ＝６の場合）を含み得る。本発明の好ましい実施形態において、ｎ＝５およびスルホアルキルエーテル誘導体は、平均して、２〜２０個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）、例えば、３〜１０個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）、より好ましくは、４〜９個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）、さらにより好ましくは、５〜９個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）、例えば、６〜８個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）（例えば、７個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）を含む。
いくつかの例において、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体は、β−シクロデキストリンスルホブチルエーテル（すなわち、ｎ＝５）の塩、特に、ナトリウム塩であり、これは、平均して、７個のスルホブチル基を含む。このスルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体はまた、ＳＢＥ７−β−ＣＤと呼ばれ、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）（Ｃｙｄｅｘ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｋｎａｎｓａｓ）として入手可能である。
用語「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有する分枝または直鎖のアルキル基を表す。代表的なＣ１〜Ｃ６アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよびイソ−ヘキシルが挙げられるがこれらに限定されない。
用語「Ｃ２〜Ｃ６アルキル」は、２〜６個の炭素原子を有する分枝または直鎖のアルキル基を表す。代表的なＣ２〜Ｃ６アルキル基としては、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよびイソ−ヘキシルが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中に開示されるポリペプチドおよびスルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体を含む組成物に関するさらなる詳細は、ＷＯ０３／００２１５２、特に、３７〜４９頁の「Ｔｈｅ ｓｕｌｆｏａｌｋｙｌ ｅｔｈｅｒ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ」と題されたセクションに見出され得、本明細書中において参考として援用される。
インビボ投与に使用される非経口処方物は、滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することによって、容易に達成される。
（徐放調製物）
徐放調製物の適切な例は、ポリペプチドまたは結合体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、このマトリクスは、フィルムまたはマイクロカプセルのような適切な形態を有する。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＰｒｏＬｅａｓｅ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたはＬｕｐｒｏｎ（登録商標））（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートから構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーが１００日までまたは１００日を超えて長期間、分子を放出し得るものの、特定のヒドロゲルは、より短い期間の間、タンパク質を放出する。カプセル化されたポリペプチドが長期間体内に残る場合、これらは、３７°の水蒸気への暴露の結果として変性し得るかまたは凝集し得、生物的活性の喪失および免疫原性の可能な変化を生じする。合理的な戦略は、関与する機構に依存して安定化のために考え出され得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、そして特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
（経口投与）
経口投与について、薬学的組成物は、固体形態または液体形態（例えば、カプセル、錠剤、懸濁液、エマルジョンまたは溶液の形態）であり得る。薬学的組成物は、好ましくは、所定量の活性成分を含む投薬単位の形態で作製される。ヒトまたは他の哺乳動物に適切な毎日の用量は、患者の状態および他の因子に依存して幅広く変化し得るが、慣用的な方法を使用して当業者によって決定され得る。
経口投与のための固体投薬形態としては、カプセル、錠剤、坐剤、散剤および顆粒剤が挙げられ得る。このような固体投薬形態において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンのような少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。このような投薬形態はまた、通常の実行のように、さらなる物質（例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤）を含み得る。カプセル、錠剤および丸剤の場合、投薬形態はまた、緩衝剤を含み得る。錠剤および丸剤は、さらに、腸溶性コーティングで調製され得る。
ポリペプチドまたは結合体は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリジン、および／またはポリビニルアルコールのようなアジュバントと混合され得、そして簡便な投与のために錠剤にされ得るかまたはカプセル化され得る。あるいは、これらは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、オイル（例えば、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油またはゴマ油）、トラガカントゴムおよび／または種々の緩衝剤中に溶解され得る。他のアジュバントおよび投与様式は、薬学の分野において周知である。キャリアまたは希釈剤は、時間遅延材料（例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート）を単独でまたはワックス、もしくは当該分野で周知の他の材料と含み得る。
薬学的組成物は、滅菌のような従来の薬学的操作に供され得、および／または保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、フィラーなど（例えば、本明細書中において他で開示される）のような従来のアジュバントを含み得る。
経口投与のための液体投薬形態としては、当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤（例えば、水）を含む、薬学的に受容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が挙げられ得る。このような組成物はまた、湿潤剤、甘味料、矯味矯臭剤および芳香剤を含み得る。
（肺送達）
ジェットまたは超音波のいずれかで噴霧器とともに使用するために適切な処方物は、代表的に、例えば、溶液１ｍＬ当たり、約０．００１〜２５ｍｇの結合体、好ましくは、約０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、水中に溶解されたポリペプチドまたは結合体を含む。処方物はまた、緩衝液および単純な糖（例えば、タンパク質安定化および浸透圧の調節のため）、ならびに／または０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の範囲のヒト血清アルブミンを含み得る。使用され得る緩衝液の例は、酢酸ナトリウム、シトレート、およびグリシンである。好ましくは、緩衝液は、溶液を３〜９の範囲のｐＨに調節するのに適切な組成およびモル濃度を有する。一般的に、１ｍＭ〜５０ｍＭの緩衝液モル濃度が、この目的に適する。利用され得る糖の例は、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、およびキシロースであり、通常、処方物の１重量％〜１０重量％の範囲の量である。
噴霧器処方物はまた、エアロゾルを形成する際の溶液の微粒子化によって引き起こされるタンパク質の表面誘導凝集を減少させるかまたは妨げるための界面活性剤を含み得る。種々の従来の界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）が使用され得る。量は、一般的に、処方物の０．００１重量％〜４重量％の間の範囲である。本発明の目的のための特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。
本発明の液体粒子の適切な分散を生成する特定の処方物および方法は、ＷＯ９４／２００６９、ＵＳ５，９１５，３７８、ＵＳ５，９６０，７９２、ＵＳ５，９５７，１２４、ＵＳ５，９３４，２７２、ＵＳ５，９１５，３７８、ＵＳ５，８５５，５６４、ＵＳ５，８２６，５７０およびＵＳ５，５２２，３８５（これらは、これによって、参考として援用される）に記載される。
計量用量吸入器デバイスで使用するための処方物は、一般的に、微細に分割された粉末を含む。この粉末は、凍結乾燥し、次いで、液体結合体処方物をを粉砕することによって作製され得、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような安定化剤を含み得る。代表的には、０．５％（ｗ／ｗ）より多くが添加される。さらに、一種以上の糖または糖アルコールが、必要な場合に、調製物に添加され得る。例としては、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、ソルビトース、トレハロース、キシリトール、およびキシロースが挙げられる。処方物に添加される量は、存在する結合体の約０．０１〜２００％（ｗ／ｗ）、好ましくは、約１〜５０％の範囲であり得る。次いで、このような処方物は、凍結乾燥され、所望の粒子サイズに粉砕される。
次いで、適切なサイズの粒子は、界面活性剤の補助とともに噴霧剤中に懸濁される。噴霧剤は、この目的のために使用される任意の従来の材料（例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはこれらの組み合わせ）であり得る。適切な界面活性剤としては、ソルビタントリオレエートおよびダイズレシチンが挙げられる。オレイン酸はまた、界面活性剤として有用であり得る。次いで、この混合物は、送達デバイスに装填される。本発明における使用に適切な市販の計量用量吸入器の例は、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡによって製造される、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ計量用量吸入器である。
粉末吸入器のための処方物は、結合体を含む微細に分割された乾燥粉末を含み、また、ラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールのような充填剤を、デバイスからの粉末の分散を容易にする量（例えば、処方物の５０重量％〜９０重量％）で含み得る。粉末の粒子は、１０ミクロメートル未満の中央直径（ｍｅｄｉａｎ ｄｉａｍｅｔｅ）、好ましくは、０．５〜５ミクロメートルの間、最も好ましくは、１．５〜３．５ミクロメートルの間を有する約１ｇ／ｃｍ２の密度を有する粒子に対応する、肺中での空気力学特性を有する。本明細書中の技術に従った使用に適切な粉末吸入器の例は、Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡによって製造されたＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
これらのデバイスの粉末は、ＵＳ５，９９７，８４８、ＵＳ５，９９３，７８３、ＵＳ５，９８５，２４８、ＵＳ５，９７６，５７４、ＵＳ５，９２２，３５４、ＵＳ５，７６８５，０４９およびＵＳ５，６５４，００７に開示される方法によって作製および／または送達され得る。
治療製品の肺送達のために設計された機械的デバイスとしては、噴霧器、計量用量吸入器、および粉末吸入器が挙げられるが、これらに限定されず、これらの全てが、当業者によく知られている。本発明の実施に適切な市販のデバイスの特定の例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡによって製造された、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ；Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ，ＵＳＡによって製造されたＡｃｏｒｎ ＩＩ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ；Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡによって製造されるＶｅｎｔｏｌｉｎ ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｓｅ ｉｎｈａｌｅｒ；Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡによって製造されるＳｐｉｎｈａｌｅｒ ｐｏｗｄｅｒ ｉｎｈａｌｅｒ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡの「ｓｔａｎｄｉｎｇ ｃｌｏｕｄ」デバイス；Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡによって製造されるＡＩＲ ｉｎｈａｌｅｒ；およびＡｒａｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡによって製造されるＡＥＲｘ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍである。
（キット）
本発明はまた、本発明のポリペプチド、結合体、ポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、方法、組成物、およびシステム、ならびに装置を含むキットを提供する。本発明のキットは、必要に応じて、本発明の以下の少なくとも１つを含む：（１）本明細書中に記載される装置、システム、システム成分、または装置成分；（２）本発明のポリペプチドまたは結合体またはポリヌクレオチド；本発明のポリペプチドをコードするプラスミド発現ベクター；本発明のポリペプチドを発現する細胞；または任意のこのような成分の少なくとも１つを含む組成物を含む少なくとも１つのキット成分；（３）本明細書中に記載される任意の方法（治療方法または予防方法を含む）を実行するための説明書、（２）において同定される任意の成分または任意のこのような成分の任意の組成を使用するための説明書；および／または本明細書中に記載される任意の装置、システムもしくは成分を操作するための説明書；（４）少なくとも１つのこのような成分または組成物を保持するための容器；ならびに（５）包装材料。
さらなる局面において、本発明は、上記および本明細書中に記載の任意の装置、成分、組成物またはキットの使用のため、本明細書中に記載される任意の方法またはアッセイの実施のため、および／または本明細書中に記載される任意のアッセイまたは方法を実施するための任意の装置、成分、組成物またはキットの使用のために提供される。
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明の精神または範囲をいかなるようにも制限しない。
（材料および方法）
（Ｉ．表面接近可能残基の決定）
（接近可能表面積（ＡＳＡ））
コンピュータプログラムＡｃｃｅｓｓ（Ｂ．ＬｅｅおよびＦ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９−４００（１９７１））ｖｅｒｓｉｏｎ ２（著作権 １９８３ Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して、構造の個々の原子の接近可能表面積（ＡＳＡ）を計算した。この方法は、代表的に、１．４Åのプローブサイズを使用し、プローブの中心によって形成される面積として、接近可能表面積（Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａ（ＡＳＡ））を規定する。この計算の前に、全ての水分子および全ての水素原子を、座標セット（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｓｅｔ）から除去するべきである。なぜなら、他の原子が、タンパク質に直接関係しないからである。
（側鎖の画分的（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）ＡＳＡ）
側鎖原子の画分的ＡＳＡは、側鎖の原子のＡＳＡの合計を伸長されたＡＬＡ−ｘ−ＡＬＡトリペプチドのその残基の型の側鎖のＡＳＡを表す値によって除算することによって計算される。Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＆ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０，５０７−５３０を参照のこと。この例について、ＣＡ原子は、グリシン残基の側鎖の一部としてみなされるが、残りの残基については、そうではない。以下の値は、側鎖についての標準１００％ＡＳＡとして使用される。
Figure 2006506097
 。
構造において検出されていない残基は、１００％曝露を有するとして規定される。なぜなら、これらは、可撓性領域に存在すると考えられる。ＮＭＲ構造のアンサンブルが分析される場合、アンサンブルの平均ＡＳＡ値が使用される。
（三次元構造が利用可能でない場合の表面曝露残基の決定）
三次元構造が利用可能でない場合、またはこの構造が、表面接近可能性を決定するのに十分に詳細ではない場合（例えば、ＣＡ原子の位置のみが公知である場合）、表面接近可能性は、以下のようになされる配列アライメントから推測され得る：
Ａ：構造が公知であるが、表面接近可能性を決定するの十分に詳細ではない場合：
低い詳細構造が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．から利用可能なＭＯＤＥＬＥＲプログラムを使用して、配列ファミリーの公知の構造に対する構造ベースの配列アライメントに含まれる、
Ｂ．構造が公知でない場合：
配列は、プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０）の「ｐｒｏｆｌｅ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」選択肢を使用して調製され得る配列ファミリーの公知の構造の配列を含む所定の配列アライメントに対して整列される。
ＡまたはＢにおいて得られる配列アライメントから、公知の構造を有する他の配列の少なくとも１つに曝露される残基に等価な位置で分析される配列の残基を、曝露されると規定する。曝露の程度は、他の配列の等価な残基について、最も大きな値であるようにとられる。分析される配列が挿入である（すなわち、他の配列に等価な残基が存在しない）場合、この残基は、この残基は、完全に曝露されているとして規定される。なぜなら、ターン／ループ領域に位置することが最も確からしいからである。低い詳細構造が存在する場合、構造内に観察されないこれらの残基は、完全に曝露されていると規定される。なぜなら、これらは、可撓性領域にあると考えられるからである。
（原子間距離の決定）
原子間距離は、分子グラフィックソフトウェア（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ製のＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（登録商標）９８．０）を使用して容易に決定される。
（ＩＩ．タンパク質発現および精製）
（Ａ．ＣＨＯ細胞からの発現および精製）
本発明のいくつかのポリペプチドは、安定にトランスフェクトされ、そしてクローン細胞株を確立するためにＧ４１８で選択されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生された。本発明のポリペプチドをコードする核酸を、ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ら（１９８８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８（１）：４６６−７２）の制御下、ならびにＮ末端リーダーペプチド、および必要に応じてＣ末端エピトープタグをコードする配列とインフレームで、ＣＨＯ発現ベクターにクローニングした。
（１．ＩＦＮ−αポリペプチドを発現する安定なサブクローンの選択：）
（材料）
培養培地：Ｇ４１８、ＦＢＳおよびペニシリン、ストレプトマイシンならびにグルタミン［ＰＳＧ］（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
トリプシン／ＥＤＴＡ
抗Ｅ−タグ抗体−ＨＲＰ結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）
ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）。
（手順）安定なトランスフェクト体を、ＦＢＳおよびペニシリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中でＧ４１８による選択により生成した。細胞を、５０ｍｌの選択培地を有するＴ１７５フラスコに分け、３７℃ ＣＯ２インキュベーター中で、約２４時間、または細胞が８０％のコンフルーエンスに達するまでインキュベートした。細胞を、ＰＢＳで洗浄することにより回収し、その後、２．５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡを添加し、３７℃で３〜５分間インキュベートした。細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ卓上遠心分離機で、１０００ｇで３０分間遠心することにより、回収した。細胞を一回ＰＢＳ中で洗浄し、１％ ＦＢＳを含む３ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。細胞密度を測定し、ＰＢＳ／ＦＢＳを用いて、１×１０６細胞／ｍｌに調整した。各ＩＦＮαポリペプチドについて、細胞を、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＭｏＦｌｏ選別機で、２００ｍｌの選択培地を含む２〜５個の９６ウェルプレート中に選別した。このプレートを、選別した細胞が増殖するのを可能にするために、３７℃インキュベーター中で１０〜１４日間インキュベートした。各ＩＦＮαポリペプチドに対して二つのサブクローンを、ドットブロット分析による最初の高いレベルの発現に関して選択し、その後、Ｅ−タグ抗体ＨＲＰ結合体および化学発光検出を使用して、ウエスタンブロット分析により確認した。
（２．タンパク質発現）
（材料）
ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ウルトラＣＨＯ培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）
ＣＨＯ ＩＩＩ Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｅｘ−Ｃｙｔｅ 増殖増強培地サプリメント（血清学的タンパク質）
ＩＴＳＡ（インスリン、トランスフェリン、付着培養のためのセレニウムサプリメント；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）
ＦＢＳ、ＰＢＳ、トリプシン
（手順）
１日目：細胞を、１つのＴ−１７５フラスコから１つのローラーボトル（１７００ｃｍ２）に、１０％ ＦＢＳおよび１×Ｐ／Ｓを含む３００ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２中に移し、３７℃ ＣＯ２インキュベーター中で増殖させた。
３日目：培地を、３００ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ−Ｆ１２−ＦＢＳ−Ｐ／Ｓに交換した。
５日目：培地を、１／１０００ Ｅｘ−ＣｙｔｅおよびＰ／Ｓを含む３００ｍｌのウルトラＣＨＯに交換した。
７日目：培地を、３００ｍｌのＣＨＯ ＩＩＩＡ＋Ｐ／Ｓ生成培地と置換した。
上清を、８日目、９日目および１０日目で収集した。この上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ卓上遠心分離機で、２０００ｇで２０分間遠心し、０．２μ ＰＥＳボトルトップ滅菌フィルターを使用してろ過し、精製のために４℃で保存した。
（３．タンパク質精製）
本発明のいくつかのポリペプチドを、Ｃ末端に１３アミノ酸のＥ−タグ配列を含有する融合タンパク質として発現させた。このようなポリペプチドを、以下のように、Ｅ−タグアフィニティーカラムを使用して精製した。
（材料）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｒｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号１７−１３６２−０１）。精製キットは、直径１６ｍｍ×高さ２５ｍｍ（５ｍｌ総容積）抗Ｅ−タグカラムおよび対応する緩衝液。
（手順）ローラーボトル中のＣＨＯ−ＨＫ１細胞から収集した上清を、２８００×ｇで２０分間の遠心および０．２μボトルトップフィルターモジュールを使用するろ過の組み合わせを用いて精製した。上清を、ＲＰＡＳ結合緩衝液中で１５０ｃｍ／時間（５ｍｌ／分）で平衡化したＥ−タグカラム上にローディングした。このカラムを、５ＣＶ（カラム容積）の結合緩衝液で洗浄し、タンパク質を、ＲＰＡＳ溶出緩衝液により７５ｃｍ／時間（２．５ｍｌ／分）で溶出した。溶出画分を０．０５体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０により中和し、ＰＢＳ中に透析し、０．１〜１．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、アリコート中で、−８０℃で凍結保存した。アッセイのためのサンプルを５０μｇ／ｍｌで、０．５％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中に処方し、−８０℃でアリコート中に凍結保存した。サンプルを、慣用的にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た物質、試薬およびプロトコルを使用するクーマシー染色を行なった。タンパク質濃度を、ＩＦＮ−α標準を使用するＢＣＡアッセイによって測定し、その濃度を、アミノ酸分析によって確認した。
（Ｂ．発現およびＥ．ｃｏｌｉからの精製）
本発明のいくつかのポリペプチドを、封入体としてＥ．ｃｏｌｉ中に産生し、それを以下のように精製し、リフォールディングした。
（１．Ｅ．ｃｏｌｉ発現構築物）
ポリペプチドＢ９ｘ１４（配列番号３）をコードする核酸配列（配列番号１８）を、ヌクレオチド位置３４〜３９の希少なＡｒｇ−Ａｒｇコドン対ＡＧＧＡＧＧ、およびヌクレオチド位置６４〜６９のＡＧＧＡＧＡそれぞれをＥ．ｃｏｌｉ中で好ましいＡｒｇ−Ａｒｇコドン対ＣＧＴＣＧＣで置換することによりＥ．ｃｏｌｉでの改良された発現のために改変した。Ｍｅｔコドン（ＡＴＧ）もまた、コード配列の５’末端に付加した。改変配列を、カナマイシン選択マーカーを有するＴ７プロモーターの制御の下で、ｐＥＴ−４２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に配置した。
（２．タンパク質発現）
インターフェロンコード配列を含むベクターを、標準的な方法を使用してＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ株中に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する寒天プレート上に配置し、３７℃でインキュベートした。１８〜２４時間後、三個の別々のコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有する５ｍｌの２×ＹＴを含むチューブ中に移し、３７℃で一晩インキュベートした。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有する１００ｍｌの２×ＹＴを含む２組のフラスコに接種するために一晩の培養物を使用した。３７℃での培養物の増殖を、ＯＤ６００でモニタリングした。この培養物を、３７℃で３時間の１ｍＭのＩＰＴＧにより、０．５〜０．８のＯＤ６００で誘導した。ＩＰＴＧ誘導した培養物を、ペレット化した細胞をＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解させることにより、発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
（３．封入体の単離およびリフォールディング）
解凍した細胞を、細胞の湿重量グラムあたり１０ｍｌのＰＢＳで、ＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を、ホモジナイザーを三回通して、１０，０００ｐｓｉで、ＡＰＶ１０００ホモジナイザー中に溶解した。この溶解物を、８０００ｇで３０分間遠心し、封入体（ＩＢ）をペレット化した。ＩＢを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中に再懸濁することにより二回洗浄した。ＩＢをさらに、８Ｍ 尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．０中で一回洗浄し、次いで、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含まない同一の緩衝液で洗浄し、最後に水で洗浄した。洗浄したＩＢを、８Ｍグアニジンヒドロクロライド、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁した。
８Ｍグアニジン溶解したＩＢを、冷却（４℃）したリフォールディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．８Ｍ アルギニン、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ グルタチオンおよび１ｍＭ 酸化型グルタチオン、ｐＨ８．０）中に、１００μｇ／ｍｌタンパク質濃度で希釈することによりリフォールディングした。リフォールディングを、４℃で４８時間行なった。リフォールディングされたインターフェロンサンプルを、４０×容積の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡに対して透析し、Ｑ−セファロースＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にローディングし、５０〜６００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。ピークの画分をプールし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。アッセイのためのサンプルを、ＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡ中に、５μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌで処方し、−８０℃で凍結保存した。タンパク質濃度を、慣用的に、ＩＦＮ−α標準を使用するＢＣＡアッセイによって測定し、その濃度をアミノ酸分析によって確認した。
（ＩＩＩ活性アッセイ）
（ＥＭＣＶ−ＨｕＨ７ 抗ウイルスアッセイ）
インターフェロンαポリペプチドおよび本発明の結合物の抗ウイルス活性に対する例示的なアッセイを以下に提供する。このアッセイは、薬物の抗ウイルス有効性を評価するために使用される細胞ベースの用量反応アッセイであり、そして、「細胞変性効果からの防御（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）」（またはＰＣＰＥ）アッセイと称されることもある。手短には、細胞を薬物と一緒にインキュベートし、ウイルスに暴露する。薬物の非存在下で、細胞を、ウイルス死に暴露した。薬物の濃度を増加させると、細胞の生存の割合は増加する。生存細胞の数を、直接（例えば、視覚的に計数することにより）または代謝速度を測定することにより間接的に測定し得る。例えば、代謝色素（例えば、ＭＴＴまたはＷＳＴ−１）を、細胞生存の間接的な指標として使用し得る。生存細胞は、このような色素を代謝し、分光分析（光学濃度）により定量化され得る代謝生成物を形成する。
（材料）
（細胞）
ＨｕＨ７細胞：ヒト肝臓癌細胞株（Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌａｉ、ＵＳＣ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、ＣＡから入手した）。ＨｕＨ７細胞株は、最初は、Ｄｒ．Ｊ．Ｓａｔｏ（Ｏｋａｙａｍａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の研究室で、よく分化した肝細胞癌腫を有する５７歳の日本人男性から確立された。この細胞株は、Ｂ型肝炎表面抗原に対してネガティブである。
ＶＥＲＯ細胞：アフリカサバンナモンキー腎臓細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）
Ｌ−９２９細胞：マウス線維芽細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）
（ウイルス）
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）：組織培養適合株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１２９Ｂ）。高力価のウイルスストックを、ＶＥＲＯ細胞を継代することにより会社内で生成した。
（完全培地）
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１９６５−０９２）
１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ カタログ番号Ｓｈ３００７１．０３）
１×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ、Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１５１４０−１２２）
（還元血清培地）
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１９６５−０９２）
２％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ カタログ番号Ｓｈ３００７１．０３）
１×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ、Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１５１４０−１２２）
トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号２５３００−０５４）
ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号１６４４８０７）
ＨｕＨ７細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で完全培地で維持した。この細胞をトリプシンを用いて収集し、Ｔ１７５フラスコ中で２５ｍｌあたり１〜２×１０６細胞の最終密度のコンフルーエントまで、週に二回分割した。アッセイの前に日、細胞をトリプシン処理し、細胞が、アッセイの前に対数期であることを確実にするために、新しいＴ７５フラスコ中に、２５ｍｌあたり４．５×１０６細胞の密度で播種した。
（手順）
高力価のＥＭＣＶウイルスストックをＶＥＲＯ細胞中で増殖させた。９５％の細胞が死滅する致死濃度（ＬＣ９５）を、ＨｕＨ７細胞単層のＥＭＣＶウイルス死滅曲線により決定した。手短かには、ＨｕＨ７細胞を一日９６ウェルマイクロタイタープレート上に、ウェルあたり６×１０４細胞で配置した。ウイルスを、１０の希釈ポイントで、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ中で１：３に連続希釈し、二日目に細胞に添加した。注入の２４時間後、細胞生存を、テトラゾリウム塩代謝アッセイ、ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）により決定した。ＨｕＨ７−ＥＭＣＶアッセイのために決定したＬＣ９５は、０．０３４のＭＯＩ（ＰＦＵ／細胞）に対応した。ウイルスストックの力価を、Ｌ９２９細胞上の標準的なプラークアッセイにより決定した。
１つのアッセイの日に、対数期のｐＨｕＨ７細胞をトリプシンを用いて収集し、還元血清培地に再懸濁し、遠心分離により濃縮した。５個のＴ１７５フラスコの細胞に対応する細胞ペレットを、１０ｍｌの還元血清培地に再懸濁し、４０ミクロンのナイロン細胞ろ過器を通してろ過し、そして、血球計数器を用いて計数した。細胞の生存度を、トリパンブルー排除（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）により測定した。その細胞を、６×１０５細胞／ｍｌの最終密度まで還元血清培地中に再懸濁した。１００μｌの希釈細胞を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加し（６×１０４細胞／ウェル）、そして、プレートを加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした。
「参照」インターフェロンαポリペプチドおよび本発明のインターフェロンαポリペプチド（「試験サンプル」とも称される）の力価を、用量反応分析により測定した。一般に、プレートあたり１つの試験サンプルおよび１つの参照ＩＦＮ−αが存在し、それぞれは、ＩＦＮ−α処理／ＥＭＣＶ誘発細胞の三つの複製曲線およびＩＦＮα処理のみの二つの複製曲線を有する。後者を、ＨｕＨ７細胞上のＩＦＮ−αの潜在的な抗増殖効果についてコントロールに対してアッセイした。参照ＩＦＮ−αに対する用量反応曲線は、一般に、１００ｎｇ／ｍｌ〜０．０５ｎｇ／ｍｌの範囲の８個の三倍希釈物からなる。ＩＦＮ−α試験サンプルについては、三倍希釈物は一般的に、５ｎｇ／ｍｌ〜０．００２ｎｇ／ｍｌの範囲である。８個のウェルの各細胞をＩＦＮ−α無しにウイルスで処理し、細胞のみをコントロールとして行なった。
ＩＦＮ−α希釈物を、還元血清培地を使用して調製した。１００μｌの希釈ＩＦＮ−α調製物を、アッセイプレートに移した。このアッセイプレートを、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１６時間インキュベートした。
二日目、細胞をＥＭＣウイルスで惹起した。培地をアッセイプレートの各ウェルから吸引した。ＥＭＣＶストックを、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ中で、１：５４００に希釈した。１００μｌの希釈ウイルス（これは、細胞あたり０．０３４ウイルス粒子に相当する）を、各ウェルに添加した。この細胞を加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で２４時間ウイルスとともにインキュベートした。
三日目、各ウェル中の生存能力のある細胞の数を、ＷＳＴ−１アッセイにより定量した。培地をアッセイプレートの各ウェルから吸引した。ＷＳＴ−１試薬を、還元血清培地中で１：２０に希釈し、１００μｌの希釈ＷＳＴ−１試薬を各ウェルに添加し、細胞を加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で６０分間インキュベートした。各ウェル中の生存能力のある細胞の数を、プレートリーダー上で４５０ｎｍでＯＤを測定することにより定量した。
（分析）
ＩＦＮα参照および試験サンプルの抗ウイルス力価を、以下の式：
抗ウイルス力価＝（生存能力のある細胞Ｃ＋Ｉ＋Ｖ−生存能力のある細胞Ｃ＋Ｖ）／（生存能力のある細胞Ｃ＋Ｉ−生存能力のある細胞Ｃ＋Ｖ）＊１００％
を用いて計算した。
ここで、Ｃ＋Ｖ＝ＨｕＨ７細胞＋ＥＭＣＶ、Ｃ＋Ｉ＝ＨｕＨ７細胞＋ＩＦＮ−α、およびＣ＋Ｉ＋Ｖ＝ＨｕＨ７細胞＋ＩＦＮ−α＋ＥＭＣＶ
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて非線形回帰によって分析した。以下の式：
Figure 2006506097
 を、曲線のあてはめに使用した。
ボトムは、底のプラトー値におけるＹ値であり；トップは、最高のプラトー値におけるＹ値であり、ＬｏｇＥＣ５０は、反応がボトムとトップの間の中間である場合のＸ値である。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ方法を、最適化アルゴリズムとして使用した。
（Ｂ．ＴＨ１分化アッセイ）
インターフェロンαポリペプチドおよび本発明の結合物のＴＨ１分化活性に対する例示的なアッセイを以下に提供する。
（アッセイ手順）
白血球を含むヒト軟膜（２５〜３０ｍｌ）および５００ｍｌの血液から調製された赤血球を、アッセイ開始の日にＳｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから収集し、室温で保存した。各軟膜を注意深く、Ｔ７５フラスコに移し、ＰＢＳで１００ｍｌに希釈した。各軟膜について、１３ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ／Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ Ｈ８８８９）をピペットで四個の５０ｍｌ遠心管に移し、２５ｍｌの希釈した血液サンプルを、境界面を崩壊させることなく、慎重にＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ／Ｆｉｃｏｌｌの上面に被せた。次いで、この管を２０分間遠心した（２０℃、２５００ｒｐｍ）。３ｍｌのプラスチックの移動ピペット（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｉｐｅｔｔｅ）を使用して、上面の血漿を単核細胞層に取り除き、その後、ＰＢＭＣを５０ｍｌの円錐管に移した（２個のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ／Ｆｉｃｏｌｌ／軟膜管の細胞を１つの管に）。次いで、ＰＢＭＣを、ＰＢＳを含む５０ｍｌ／管に希釈し、１０分間遠心して（２０℃、１０００ｒｐｍ）血小板を除去した。ＰＢＳの除去後、凝集を防止するために、ＰＢＭＣおよび残存するＲＢＣを混合した。５ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液（塩化アンモニウム緩衝液）を添加し、二つの管の細胞を１つの管に合わせた。ここで、各管は、一のドナーからの総ＰＢＭＣ単離体およびＲＢＣ単離体を含み。これを、室温で１０分間インキュベートした。潜在的な血球の塊を、細胞を細胞ろ過器（７０μｍ、Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号２３５０）でろ過することにより除去した。ＰＢＳを、５０ｍｌの総体積に添加し、その後、１０分間遠心（２０℃、１０００ｒｐｍ）した。最後に血球計数器を使用して細胞の数を計数した。
次に、各ＰＢＭＣ調製物の画分を前染色し、ＦＡＣＳにより分析し、約１５％の割合の未処理のＴｈ０細胞を有するＰＢＭＣ調製物を選択した。２ｍｌのＰＢＭＣを、２０μｌ ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４５ＲＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５４８８）、２０μｌ Ｃｙ−クロム結合抗ヒトＣＤ４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５３４８）、１０μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５３６７）、１０μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５３９８）および１０μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ２０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５６２３）で染色し、氷上で４５分間インキュベートした。この細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁し、４０μｍ細胞ろ過器（Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号２３４０）でろ過した。未処理のＴＨ０細胞（ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡに対してポジティブであって、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０に対してネガティブ）をＦＡＣＳにより定量し、１５％より多い未処理のＴＨ０細胞を含むＰＢＭＣ調製物をアッセイのために選択した。
選択したＰＢＭＣ調製物を、８００μｌ ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４５ＲＡ、８００μｌのＣｙ−クロム結合抗ヒトＣＤ４、５００μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ８、２００μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１４および２００μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ２０を用いて染色し、氷上で６０分間インキュベートした。この細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＩを添加し、そして、細胞を２０ｍｌ／ｍｌのＰＢＳで希釈した後、４０μｍ細胞ろ過器でろ過した。その細胞をＦＡＣＳ選別し、１×１０４の未処理ＴＨ０細胞（ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡに対してポジティブであって、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０に対してネガティブ）を、ＭＯＦＬＯによって９６ウェル丸底プレートの各ウェル（ペニシリン−ストレプトマイシン＋２ｍＭのグルタミンおよび１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）を含む１６０μｌのＤＭＥＭを含む）中に移した。
２０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔエキスパンダー（Ｄｙｎａｌ、カタログ番号１１１．３２）を各ウェルに添加した。ロット間の変動を避けるために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓの刺激効果を、実験の前に、校正した。次に、２０μｌ／ウェルのタンパク質サンプルをアッセイプレートに添加した。一般的に、ＩＬ−４およびＩＬ−１２標準（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手）に対する濃度は、０．０４ｐｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲であり、ＩＦＮ−α試験サンプルおよびＩＦＮ−α参照サンプルに対する濃度範囲は、０．７６ｐｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌであった。
この細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７時間インキュベートした。各ウェル由来の上清を回収し、ＴＨ１増殖の程度を、ＩＦＮ含有量の定量化を介して、標準的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。
（分析）
反応＝ｐｇ／ｍｌ中のＩＦＮ−γ濃度。
以下の式：
Figure 2006506097
 を、曲線のあてはめに使用した。
ボトムは、底のプラトー値におけるＹ値であり；トップは、最高のプラトー値におけるＹ値であり、ＬｏｇＥＣ５０は、反応がボトムとトップの間の中間である場合のＸ値である。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ方法を、最適化アルゴリズムとして使用した。
（Ｃ．Ｄａｕｄｉ抗増殖アッセイ）
インターフェロンαポリペプチドおよび本発明の結合物の抗増殖活性に対する例示的なアッセイを以下に提供する。
（細胞株維持）
懸濁液中で増殖したＤａｕｄｉ Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞を、５０ｍｌ培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号Ｓｈ３００７１．０３）＋１×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０−１２２）＋２ｍＭ グルタミン）を含むＴ１７５組織培養フラスコ中で、３７℃で、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で維持した。コンフルーエントになった場合に、この細胞を１：１０にわけた。
（アッセイ手順）
Ｄａｕｄｉ細胞を、遠心分離し、１×ＰＢＳを用いて洗浄した。細胞数を１０５細胞／ｍｌに調整した。８０μｌの培養培地を、９６ウェル丸底アッセイプレートの各ウェルに添加し、その後、１００μｌの細胞を各ウェルに移した（１０４細胞／ウェル）。
ＩＦＮα参照物質およびＩＦＮ−α試験サンプルの１１個の希釈物（２００ｎｇ／ｍｌ〜０．２ｐｇ／ｍｌの範囲である（４倍希釈物））を、培養培地を使用して希釈プレートに調製した。次いで、２０μｌの希釈ＩＦＮ−α調製物をアッセイプレートに移した。
この細胞を、３７℃で、加湿した５％ＣＯ２インキュベーターで、インキュベートした。４８時間後、１μＣｉのメチル３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＴＲＫ７５８）を各ウェルに添加し、その後、３７℃で、加湿した５％ＣＯ２インキュベーターで、２４時間インキュベートした。この細胞を次の日収集し、チミジンの取り込みを定量した。
（分析）
ＩＦＮ−α参照およびサンプルのＥＣ５０を、以下の式：
Figure 2006506097
 を使用して計算し、ここで、ボトムは、底のプラトー値におけるＹ値であり；トップは、最高のプラトー値におけるＹ値であり、ＬｏｇＥＣ５０は、反応がボトムとトップの間の中間である場合のＸ値である。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ方法を、最適化アルゴリズムとして使用した。
（実施例１：インターフェロンαの表面到達可能残基の決定）
（ヒトインターフェロンα２ａ残基の表面露出）
Ｋｌａｕｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７４：６６１〜６７５（１９９７）によって報告されたヒトインターフェロンα２ａの２４個のＮＭＲ構造に基づいて、側鎖の画分のＡＳＡを計算した。以下に使用した配列の番号は、ヒトインターフェロンα２ａタンパク質（本明細書中では、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして同定される）の成熟配列に基づく。この構造は、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ９８およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ１３８をそれぞれ含む二つのジスルフィド架橋を含む。ＡＳＡおよび画分ＡＳＡを算出し、２４個の構造の平均をとることによって、側鎖のＡＳＡに焦点をあて、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして本明細書中で同定されるインターフェロンα２ａ配列の位置に対する位置の番号付けで、以下の残基：
Figure 2006506097
 が２５％より多い画分ＡＳＡを有することを決定した。
以下の残基が、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして本明細書中で同定されるインターフェロンα２ａ配列の位置に対する位置の番号付けで、以下の残基：
Figure 2006506097
 がそれらの側鎖の平均５０％より多い画分ＡＳＡを有することを決定した。
（配列番号１に対応する残基の表面露出）
多くのインターフェロンα配列（全ての公知のヒトインターフェロンα配列を含む（ＩＦＮ−α２サブタイプ以外））のヒトインターフェロンα２サブタイプ（例えば、インターフェロンα２ｂ（配列番号３２）およびインターフェロンα２ａ（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ））および本発明の特定のポリペプチドの４４位の後のアミノ酸の挿入に起因して、表面露出残基の位置の番号付けは、例えば、ｈＩＦＮα２ｂ（配列番号３２）と示される配列の番号付けと比較して配列図２に示される配列の位置４４の後の１残基シフトする。
上記分析に基づいて、配列番号１に対して番号付けされた以下の位置：
Figure 2006506097
 は、２５％より多く画分ＡＳＡを有するアミノ酸残基を含むと考えられる。
同様に、以下の位置（再度、配列番号１に対して番号付けされた）：
Figure 2006506097
 は、平均５０％より多く、側鎖の画分ＡＳＡをを有するアミノ酸残基を含むと考えられる。
（実施例２：インターフェロンαポリペプチドの抗ウイルス活性）
慢性ＨＣＶ感染を有する患者は、１０４〜１０７コピーのＨＣＶ ＲＮＡ／ｍｌの範囲で、初期ウイルスロードを有する。ＩＦＮ−αによる処理において、ウイルスロードは、特徴的に、二つの別の機構を反映する二つの別の減少するログ直線相を生じる（図１Ｂ）。ウイルスロードにおける最初の低下は、ほぼ最初の二日間に生じ、それは、ＩＦＮα治療を受けた、感染した肝臓細胞によるウイルス増殖の速度の減少に起因すると考えられる。
ＨＣＶを用いた主要な技術的課題は、ウイルスがインビボで増殖し得ないということであり、取扱いやすい動物モデルにおいて最近になって培養された。しかし、ＨＣＶウイルス複製に対する有用な代理となると考えられる、インビトロで複製するウイルスが存在する。インビトロ代理アッセイは、インビボＨＣＶ抗ウイルス活性の予測となると考えられ、これらとしては、上記のアッセイが挙げられ、そのアッセイは、ヒト肝臓由来細胞株ＨｕＨ−７中でＥＭＣ ＲＮＡウイルス（ＥＭＣＶ）を使用して、ウイルス感染の細胞変性効果から細胞を防御する、試験分子の能力を測定する。
本発明のいくつかのＩＦＮ−αポリペプチドの抗ウイルス活性を、上記、材料および方法の節において記載したＥＭＣＶ／ＨｕＨ−７抗ウイルスアッセイにおいてアッセイした。いくつかのこのようなポリペプチドは、参照分子（例えば、ｈｕＩＦＮ−α２ｂ（配列番号３２）またはｈｕＩＦＮ−α２ａ（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ））の抗ウイルス活性とほぼ等しいかまたはそれより高い抗ウイルス活性を示し、このことは、本発明のポリペプチドのＥＣ５０（アッセイにおいて最大の防御反応の半分の反応を生じるサンプルの濃度）が参照分子のＥＣ５０とほぼ等しいかまたはそれより小さいことによって証明された。いくつかの本発明のこのようなポリペプチドは、参照分子より少なくとも約１．５倍高い、少なくとも約２倍高い、少なくとも約４倍高い、少なくとも約５倍高い、または少なくとも約１０倍高い抗ウイルス活性を示した（このことは、ポリペプチドのＥＣ５０が、参照分子のＥＣ５０より約０．６６倍以下、約０．５倍以下、約０．２５倍以下、約０．２倍以下、約０．１倍以下であることによって証明されている）。
以下の表７は、同一条件下でアッセイしたＩＦＮ−αコントロールおよびＩＦＮ−α２ｂと比較した本発明の例示的なＩＦＮ−αポリペプチドの相対的な抗ウイルス活性を、ｈｕＩＦＮ−α２ｂに対する抗ウイルス活性として示す（ＥＣ５０ｈｕＩＦＮ−α２ｂ／ＥＣ５０サンプル）。
（表７）
Figure 2006506097
Figure 2006506097
 。
（実施例３ ＴＨ１分化は、インターフェロンαポリペプチドを活性化する）
慢性ＨＣＶ感染を有する患者は、１０４〜１０７コピーのＨＣＶ ＲＮＡ／ｍｌの範囲で、初期ウイルスロードを有する。ＩＦＮ−αによる処理において、ウイルスロードは、特徴的に、二つの別の機構を反映する二つの別の減少するログ直線相を生じる（図１）。ウイルスロードにおける最初の低下は、ほぼ最初の二日間に生じ、それは、ＩＦＮα治療に反応した感染した肝臓細胞によるウイルス産生の速度の減少に起因すると考えられる。ウイルスロードは、約二日後の新規の安定状態に到達し、この時に、二番目のあまり急速ではないウイルスクリアランスのログ直線相が観察される。この二番目の相は、抗原特異的Ｔ細胞による感染肝細胞の死滅に起因すると考えられる。ＩＦＮ−α治療は、抗原特異的Ｔ細胞のＴＨ１細胞への分化に対する刺激を介して、この生物学的応答に重要な役割を果たしていると考えられる。
特定の理論に限定されることなく、ＴＨ０細胞からＴＨ１細胞への分化を刺激する改良された能力を有するインターフェロンαが、ウイルスクリアランスのより強い二番目の相を示し得ること、従って、ウイルスクリアランスの改善された有効性を有し得ることが提案される。この研究の仮説に基づいて、血液ドナーから単離した未処理のＴＨ０細胞に対するインターフェロンαのＴＨ１分化活性を測定するためのアッセイを開発した。
本発明のいくつかのＩＦＮ−αポリペプチドのＴＨ１分化活性を、上記、材料および方法の節において記載したようにアッセイした。本発明のいくつかのこのようなポリペプチドは、参照分子（例えば、ｈｕＩＦＮ−α２ｂ（配列番号３２）またはｈｕＩＦＮ−α２ａ（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ））のＴＨ１分化活性とほぼ等しいＴＨ１分化活性を示し、このことは、本発明のポリペプチドのＥＣ５０（アッセイにおいて最大のインターフェロンγ産生の半分の産生を生じるサンプルの濃度）が参照分子のＥＣ５０とほぼ等しいことによって証明された。いくつかの本発明のポリペプチドは、参照分子のＴＨ１分化活性より高いＴＨ１分化活性を示し、このことは、本発明のポリペプチドのＥＣ５０が、参照分子のＥＣ５０より低いことによって証明された。
（実施例４：インターフェロンαポリペプチドの抗増殖活性）
ＩＦＮ−αは、多くの細胞型の増殖を阻害するが、この抗増殖効果は、しばしば、抗ウイルス応答に必要とされるものよりも高い用量で生じる。Ｄａｕｄｉ細胞は、ヒト由来のＥＶＢ形質転換Ｂ細胞株であり、ＩＦＮ−α感受性である。このＩＦＮ−α応答性細胞株は、本発明のＩＦＮ−αポリペプチドの抗増殖効果の有用なプローブとして機能する。さらに、巨核球および好中球に対する高用量でのＩＦＮ−αの抗増殖活性は、それぞれ、血小板減少症および好中球減少症に寄与すると考えられる。Ｄａｕｄｉ抗増殖アッセイは、これらの他のリンパ細胞型に対する抗増殖効果についての有用な代理アッセイとして機能し得る。
本発明のいくつかのＩＦＮ−αポリペプチドの抗増殖活性を、上記の材料および方法の節に記載されたようにアッセイした。本発明のいくつかのポリペプチドは、ｈｕＩＦＮ−α２ｂ（配列番号番号３２）またはｈｕＩＦＮ−α２ａ（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ）のような参照分子のものとほぼ同じ抗増殖活性を示し、このことは、このポリペプチドのＥＣ５０（アッセイにおける最大のチミジン取り込みの半分を生じる濃度）が参照分子のＥＣ５０にほぼ等しいということにより証明される。本発明のいくつかのポリペプチドは、参照分子とほぼ同じか、またはそれ以上の抗増殖活性を示し、このことは、このポリペプチドのＥＣ５０が、参照分子のＥＣ５０とほぼ同じか、それ未満である（例えば、約０．７５倍、約０．５倍、または約０．２５倍）であることにより証明される。本発明のいくつかのポリペプチドは、参照分子とほぼ同じか、またはそれ未満の抗増殖活性を示し、このことは、このポリペプチドのＥＣ５０が、参照分子のＥＣ５０とほぼ同じか、それ以上であるであることにより証明される。本発明のいくつかのこのようなポリペプチドは、参照分子の抗増殖活性の、約０．７５倍未満、約０．６６倍未満、約０．５倍未満、約０．２５倍未満、約０．２倍未満、または約０．１倍未満の抗増殖活性を示し（それぞれ、ポリペプチドのＥＣ５０が、参照分子のＥＣ５０よりも少なくとも約１．３倍以上、少なくとも約１．５倍以上、少なくとも約２倍以上、少なくとも約４倍以上、少なくとも約５倍以上、または少なくとも約１０倍以上のＥＣ５０であることにより証明される）；本発明のこのようなポリペプチドは、それでもなお、測定可能な抗増殖活性を示す。
以下の表８は、同じ条件下でアッセイされた、ヒトＩＦＮ−α２ｂおよびＩＦＮαＣｏｎＩと比較した、ｈｕＩＦＮ−α２ｂに対する抗増殖活性（ＥＣ５０ ｈｕＩＦＮ−α２ｂ／ＥＣ５０ サンプル）として表される、本発明のいくつかの例示的なポリペプチドの相対的な抗増殖活性を示す。
（表８）
Figure 2006506097
 。
（実施例５：インターフェロンαポリペプチドのペグ化）
以下は、本発明の結合体を調製するためのいくつかの例示的な手順を提供する。
（Ｃｙｓ−ＰＥＧ化）
遊離システインを含む本発明のポリペプチド（例えば、１６４位にシステインを含む、Ｂ９ｘ１４ＣＨＯ６（配列番号４９））は、以下のようにシステイン−ＰＥＧ化され得る。ポリペプチドを、まず、５０ ｍＭ ＭＥＳ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ６．０中、４℃にて３０分間、等モル濃度のＴＣＥＰ（トリスカルボキシエチルホスフィン）で部分的に還元する。次いで、還元されたポリペプチドを、同じ条件下、４℃にて１時間、４倍モル過剰のｍＰＥＧ−ＭＡＬ試薬（２０ｋＤａもしくは３０ｋＤａの直鎖ｍＰＥＧ、または、４０ｋＤａの分枝ｍＰＥＧ２のようなＰＥＧ部分）を用いて、還元する。ＰＥＧ化された反応混合物を、５０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ ６．０、１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム上に充填する。１０ＣＶ（カラム容積）の洗浄工程の後、０〜６００ｍＭ ＮａＣｌの勾配を適用して、ＰＥＧ化されている分画とＰＥＧ化されていない分画とを分画する。分画を回収し、アリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。モノＰＥＧされた種を含む分画をプールし、上記のように、インターフェロン−α活性についてのアッセイのために処方する。
（Ｌｙｓ−ＰＥＧ化）
リジン−ＰＥＧ化を、Ｆｏｓｅｒら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３０：７８−８７により記載された手順に基づく手順を用いて達成し得る。簡単にいうと、ポリペプチドを、５０ ｍＭ ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ ９．０中、４℃にて２時間、１：３のモル比のポリペプチド：ＰＥＧで、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ試薬（例えば、２０ｋＤａもしくは３０ｋＤａの直鎖ｍＰＥＧ、または、４０ｋＤａの分枝ｍＰＥＧ２）と反応させる。結合体を、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰを用いて、カチオン交換クロマトグラフィーにより単離する。モノＰＥＧ化された種を含む分画をプールし、上記のようなインターフェロン−α活性アッセイのために処方し、そして、アミノ酸分析および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によりさらに特徴づけし得る。
（Ｎ末端ＰＥＧ化）
ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒドまたはｍＰＥＧ−ＮＨＳ（いずれもＰＥＧ部分（例えば、２０ｋＤａもしくは３０ｋＤａの直鎖ｍＰＥＧ、または４０ｋＤａの分枝ｍＰＥＧ２）を有する）を用いるＮ末端ＰＥＧ化を、５０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ ５．５、１００ ｍＭ ＮａＣｌ中、または、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ ５．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ中にて、５倍モル過剰のＰＥＧ試薬：ポリペプチドを用いて、４℃にて４〜８時間行なう。ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒドとの反応はまた、２０ｍＭ シアノホウ化水素ナトリウムを含む。結合体を、５０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ ５．５中１００〜６００ｍＭ ＮａＣｌの勾配を用いて、５０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ ５．５、１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムにより単離する。モノＰＥＧ化された種を含む分画をプールし、上記のようなインターフェロン−α活性についてのアッセイのために処方する。
（実施例６：インビボアッセイ）
（本発明のポリペプチドまたは結合体の半減期の測定）
生物学的半減期または血清半減期の測定は、文献に記載される多数の方法で実施し得る。例えば、生物学的半減期は、例えば、皮下投与または筋肉内投与後のインターフェロン−αの血清レベルを検出するＥＬＩＳＡ法を用いて決定され得る。皮下投与されたインターフェロン−αの薬力学を決定するためのＥＬＩＳＡ法の使用は、例えば、Ｒｏｓｔａｉｎｇら（１９９８），Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９（１２）：２３４４−４８により記載されている。Ｍｅｒｉｍｓｋｙら（１９９１），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２７（５）；４０６−８は、筋肉内投与されたインターフェロン−αの血清レベルの決定を記載する。
（インビトロ免疫原性の決定）
本発明のポリペプチドまたは結合体の免疫原性の減少を、参照分子または調製物（代表的には（公知のインターフェロン−αタンパク質）に対するこの分子の免疫原性を測定する、ＥＬＩＳＡ法を使用することによって決定し得る。ＥＬＩＳＡ法は、参照タンパク質で処置された患者に由来する抗体に基づく。免疫原性は、本発明のポリペプチドまたは結合体が、参照分子もしくは調製物よりも、アッセイにおいて統計的に有意に低い応答を有する場合に、減少したと考えられる。
上記の本発明は、明確にする目的および理解する目的のためにいくらか詳細に記載されているが、種々の形式および詳細の変更が、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、本開示を読むことによって、当業者に明らかである。本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみのためであり、これらを考慮する種々の改変または変更が、当業者によって示唆され、本出願の精神および範囲、ならびに、添付の特許請求の範囲内に含まれ得ることが理解される。例えば、上記の全ての技術および装置が、種々の組合せで使用され得る。本出願中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願および／または他の文献が、あらゆる目的でその全体が本明細書中に参考として援用されていると示されるのと同じ程度に、あらゆる目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
図１Ａおよび図１Ｂは、ＩＮＦ−α処置後のＨＣＶ感染細胞からのウイルスクリアランスについての二相時間経過（Ａ．非応答者反応速度；Ｂ．応答者反応速度）を示す。 図２は、本発明のポリペプチド配列（配列番号１）と、以下のヒトインターフェロン−αポリペプチド配列との整列を示す：ｈｕＩＦＮ−α ｌａ（配列番号３１）、ｈｕＩＦＮ−α ２ｂ（配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α ４ｂ（配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α ５（配列番号３４）、ｈｕＩＦＮ−α ６（配列番号３５）、ｈｕＩＦＮ−α ７（配列番号３６）、ｈｕＩＦＮ−α ８ｂ（配列番号３７）、ｈｕＩＦＮ−α １０ａ（配列番号３８）、ｈｕＩＦＮ−α １４ａ（配列番号３９）、ｈｕＩＦＮ−α １６（配列番号４０）、ｈｕＩＦＮ−α １７ｂ（配列番号４１）およびｈｕＩＦＮ−α ２１ｂ（配列番号４２）。ｈｕＩＦＮ−α配列についての命名規則は、Ａｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚＭ．Ｏ．（１９９６）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１６：１８１−１８４に従う。矢印は、配列番号３１〜配列番号４２のいずれにおいても存在しない、配列番号１の残基Ｈｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３、およびＳｅｒ１４０を示す。配列番号３１〜４２において配列番号１と同一のアミノ酸残基位置を、ピリオド（．）で示し、そしてこの配列におけるギャップを、ダッシュ（−）で示す。 図３は、以下のパラメーターを用いた、本発明のポリペプチド配列（配列番号３）と、ｈｕＩＦＮ−α １４ａのポリペプチド配列（配列番号３９）（ＬｅＩＦ Ｈ；Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：２０−２６）との整列を示す：ＢＬＯＳＵＭ６２ マトリクス、ギャップオープンペナルティ１１、ギャップ伸長ペナルティ１。配列番号３９において配列番号３と同一のアミノ酸位置をピリオド（．）で示す。 図４は、本発明のポリペプチド配列（配列番号８）と、ヒトインターフェロン−αのポリペプチド配列（配列番号３１〜配列番号４２）との整列を示す。配列番号３１〜４２において、配列番号８と同一のアミノ酸残基の位置を、ピリオド（．）で示し、そしてこの配列におけるギャップを、ダッシュ（−）で示す。 図５は、以下のパラメーターを用いた、本発明のポリペプチド配列（配列番号１２）と、ｈｕＩＦＮ−α １４ａのポリペプチド配列（配列番号３９）（ＬｅＩＦ Ｈ；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：２０−２６）との整列を示す：ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップオープンペナルティ１１、ギャップ伸長ペナルティ１。配列番号３９にいて、配列番号１２と同一のアミノ酸を、ピリオド（．）で示す。 図６は、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリクスを示す。 図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃは、以下のパラメーターを用いて最適な配列整列を決定するために用いられた整列スコアの計算例を示す：ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップオープンペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１。

Claims (40)

  1. 単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号１２、配列番号４７、配列番号５３、配列番号１、配列番号８、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５から選択される配列と０〜１６アミノ酸位で異なる配列を含み、該ポリペプチドは、抗ウイルス活性を示す、ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドであって、０〜１６アミノ酸位で配列番号３と異なる配列を含む、ポリペプチド。
  3. 請求項２に記載のポリペプチドであって、０〜８アミノ酸位で配列番号３と異なる配列を含む、ポリペプチド。
  4. 請求項１に記載のポリペプチドであって、０〜１６アミノ酸位で配列番号１２と異なる配列を含む、ポリペプチド。
  5. 請求項４に記載のポリペプチドであって、０〜８アミノ酸位で配列番号１２と異なる配列を含む、ポリペプチド。
  6. 前記ポリペプチドの前記抗ウイルス活性は、ｈｕＩＦＮ−α２ｂまたはｈｕＩＦＮ−α２ａの抗ウイルス活性と等しいかまたはより大きい、請求項１に記載のポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチドの前記抗ウイルス活性は、ｈｕＩＦＮ−α２ｂまたはｈｕＩＦＮ−α２ａの抗ウイルス活性よりも少なくとも２倍大きい、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 請求項１に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、ｈｕＩＦＮ−α２ｂまたはｈｕＩＦＮ−α２ａにより示される抗ウイルス活性／抗増殖活性の割合よりも、少なくとも２倍大きい抗ウイルス活性／抗増殖活性の割合を示す、ポリペプチド。
  9. 請求項８に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、ｈｕＩＦＮ−α２ｂまたはｈｕＩＦＮ−α２ａにより示される抗ウイルス活性／抗増殖活性の割合よりも、少なくとも４倍大きい抗ウイルス／抗増殖活性の割合を示す、ポリペプチド。
  10. 結合体であって、該結合体は、以下、
    （ａ）請求項１に記載のポリペプチド；および
    （ｂ）該ポリペプチドの付着基に共有結合される非ポリペプチド部分
    を含む、結合体。
  11. 少なくとも二つの非ポリペプチド部分を含む、請求項１０に記載の結合体。
  12. システイン残基に共有結合される非ポリペプチド部分を含む、請求項１０に記載の結合体。
  13. リジン残基またはＮ−末端アミノ基に共有結合される非ポリペプチド部分を含む、請求項１０に記載の結合体。
  14. リジン残基に共有結合される非ポリペプチド部分を含む、請求項１０に記載の結合体。
  15. Ｎ−末端アミノ基に結合される非ポリペプチド部分を含む、請求項１０に記載の結合体。
  16. リジン残基に結合される非ポリペプチド部分およびＮ−末端アミノ基に結合される非ポリペプチド部分を含む、請求項１０に記載の結合体。
  17. 前記非ポリペプチド部分は、ポリマーである、請求項１０に記載の結合体。
  18. 前記ポリマーは、ポリエチレングリコールである、請求項１７に記載の結合体。
  19. 前記非ポリペプチド部分は、糖である、請求項１０に記載の結合体。
  20. 前記糖は、Ｎ−グリコシル化部位に結合される、請求項１９に記載の結合体。
  21. 請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組成物。
  22. 請求項２５に記載の結合体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組成物。
  23. 単離された核酸または組換え核酸であって、該核酸は、請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
  24. 請求項２３に記載の核酸を含む宿主細胞。
  25. 請求項２３に記載の核酸を含むベクター。
  26. 請求項２５に記載のベクターであって、ここで該ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、またはウイルスのフラグメントを含む、ベクター。
  27. プロモーターに作動可能に結合された核酸を含む発現ベクターである、請求項２６に記載のベクター。
  28. 請求項２７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  29. 請求項２３に記載の核酸および賦形剤を含む、組成物。
  30. 請求項１に記載のポリペプチドを調製するための方法であって、該方法は、以下：
    宿主細胞を含む培養物を提供する工程であって、該宿主細胞は、核酸に作動可能に結合されたプロモーターを含む発現ベクターを含み、該核酸は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、工程、
    該ポリペプチの発現を可能とする条件の下、該培養物を培養する工程、および
    該ポリペプチドを回収する工程、
    を包含する、方法。
  31. 請求項３０に記載の方法であって、ここで前記宿主細胞は、グリコシル化する宿主細胞または細菌性の宿主細胞である、方法。
  32. 結合体を調製するための方法であって、該方法は、以下、
    （ｉ）請求項１に記載のポリペプチドを提供する工程、および
    （ｉｉ）該ポリペプチドの結合基に少なくとも１つの非ポリペプチド部分を結合する工程であって、ここで生じた結合体は、抗ウイルス活性を示す、工程、
    を包含する、方法。
  33. 請求項３２に記載の方法であって、ここで前記ポリペプチドを提供する工程は以下：
    宿主細胞を含む培養物を提供する工程であって、該宿主細胞は、核酸に作動可能に結合されたプロモーターを含み、該核酸は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、工程、
    該ポリペプチドの発現を可能とする条件の下、該培養物を培養する工程、および
    該ポリペプチドを回収する工程、
    を包含する、方法。
  34. 前記宿主細胞は、グリコシル化する宿主細胞または細菌性宿主細胞である、請求項３３に記載の方法。
  35. ウイルスを感染させた細胞内で該ウイルスの複製を阻害するための方法であって、該方法は、以下：
    該細胞中における該ウイルスの複製を阻害するのに有効な量の請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項１０に記載の結合体を該細胞に投与し、それによって該細胞中における該ウイルスの複製を阻害する工程、
    を含む、方法。
  36. ウイルスを感染させた細胞中における該ウイルスのコピー数を減少させるための方法であって、該方法は、以下：
    該細胞中における該ウイルスの該コピー数を減少させるのに有効な量の請求項１に記載の前記ポリペプチドまた請求項１０に記載の前記結合体を該細胞に投与し、それによって該細胞中における該ウイルスのコピー数を減少させる工程、
    を包含する、方法。
  37. 医薬として使用するための請求項１に記載のポリペプチド、または請求項１０に記載の結合体。
  38. ウイルスを感染させた細胞中における該ウイルスの複製を阻害するための医薬の製造のための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項１０に記載の結合体の使用。
  39. ウイルスにより感染させた細胞中における該ウイルスのコピー数を減少させるための医薬を製造するための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項１０に記載の結合体の使用。
  40. 請求項３７〜４０のいずれかに記載の使用であって、ここで前記ウイルスは、ＨＣＶまたはＨＢＶである、使用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010504909A (ja) * 2006-09-14 2010-02-18 メドジェニクス・メディカル・イスラエル・リミテッド 長期持続性の医薬製剤
JP2010513333A (ja) * 2006-12-21 2010-04-30 北京三元基因工程有限公司 インターフェロンα変異体およびそのポリエチレングリコール誘導体

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7435562B2 (en) 2000-07-21 2008-10-14 Modular Genetics, Inc. Modular vector systems
US7959910B2 (en) * 2000-07-31 2011-06-14 Biolex Therapeutics, Inc. C-terminally truncated interferon alpha variants
DE60332358D1 (de) * 2002-09-09 2010-06-10 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
US20040136952A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-15 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
KR101238517B1 (ko) 2002-12-26 2013-02-28 마운틴 뷰 파마슈티컬즈, 인크. 생물학적 효능이 향상된 인터페론-베타의 중합체 접합체
CA2516552A1 (en) * 2003-02-26 2004-09-10 Intermune, Inc. Polyethylene glycol modified interferon compositions and methods of use thereof
CN1934143B (zh) 2004-01-21 2010-10-20 耐科塔医药公司 丙酸封端聚合物的制备方法
EP1753779A2 (en) * 2004-05-19 2007-02-21 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
WO2006004959A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Egen Corporation Pegylated interferon alpha-1b
US20060024272A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-02 Large Scale Biology Corporation C-terminally truncated interferon
ATE540110T1 (de) 2004-11-11 2012-01-15 Modular Genetics Inc Oligonukleotid-leiterkonstruktion und system zur erzeugung von molekularer vielfalt
US9931413B2 (en) * 2005-04-06 2018-04-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
JP2008544746A (ja) 2005-05-12 2008-12-11 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 免疫応答を調節するための組成物および方法
MX2007014524A (es) 2005-05-18 2008-02-07 Maxygen Inc Polipeptidos desarrollados de interferon-alfa.
US8454948B2 (en) 2006-09-14 2013-06-04 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations
WO2008124086A2 (en) * 2007-04-05 2008-10-16 President And Fellows Of Harvard College Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
US7625555B2 (en) 2007-06-18 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human interferon-like proteins
CN103260649A (zh) 2010-06-15 2013-08-21 迈德詹尼克斯医疗以色列有限公司 长效药物制剂
US20130225789A1 (en) * 2012-02-29 2013-08-29 Yi Sun Polyethylene Glycol Having Hetero Multiple Functional Groups
AU2022328512A1 (en) * 2021-08-18 2024-03-28 Remd Biotherapeutics, Inc. Novel interferon variants and bifunctional fusion molecules thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000069913A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-23 Lexigen Pharmaceuticals Corp. EXPRESSION AND EXPORT OF INTERFERON-ALPHA PROTEINS AS Fc FUSION PROTEINS
WO2001025438A2 (en) * 1999-10-07 2001-04-12 Maxygen, Inc. Ifn-alpha homologues
JP2001506855A (ja) * 1996-12-18 2001-05-29 マキシジェン，インコーポレイテッド ポリペプチド操作のための方法および組成物
WO2001095929A2 (en) * 2000-06-16 2001-12-20 Schering Aktiengesellschaft Interferon for treatment of multiple sclerosis

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610830B1 (en) * 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
US4414150A (en) * 1980-11-10 1983-11-08 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4801685A (en) * 1981-08-14 1989-01-31 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
US4678751A (en) * 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
EP0205404B1 (en) * 1985-06-11 1992-07-15 Ciba-Geigy Ag Hybrid interferons
US5574138A (en) * 1993-03-08 1996-11-12 Immunex Corporation Epithelium-derived T-cell factor
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
WO2002044197A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 Fish Eleanor N Cytokine receptor binding peptides
EP1562634B1 (en) * 2002-11-15 2006-08-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Positional isomers of pegylated interferon alpha 2a

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001506855A (ja) * 1996-12-18 2001-05-29 マキシジェン，インコーポレイテッド ポリペプチド操作のための方法および組成物
WO2000069913A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-23 Lexigen Pharmaceuticals Corp. EXPRESSION AND EXPORT OF INTERFERON-ALPHA PROTEINS AS Fc FUSION PROTEINS
WO2001025438A2 (en) * 1999-10-07 2001-04-12 Maxygen, Inc. Ifn-alpha homologues
WO2001095929A2 (en) * 2000-06-16 2001-12-20 Schering Aktiengesellschaft Interferon for treatment of multiple sclerosis

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010504909A (ja) * 2006-09-14 2010-02-18 メドジェニクス・メディカル・イスラエル・リミテッド 長期持続性の医薬製剤
JP2010513333A (ja) * 2006-12-21 2010-04-30 北京三元基因工程有限公司 インターフェロンα変異体およびそのポリエチレングリコール誘導体

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