CN105985445A - 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途 - Google Patents
一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与F3肽的融合蛋白,F3肽通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。本发明还公开了一种如核苷酸序列以及包括它的重组载体、重组菌,还公开了前述变异体的制备方法和用途。本发明通过基因工程的方式制备得到了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,其对肿瘤细胞的亲和力、诱导肿瘤细胞凋亡的能力、肿瘤靶向性和体内抗肿瘤活性均明显优于肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,用于治疗肿瘤的疗效优良,临床应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途。
背景技术
癌症是威胁人类生命的主要疾病之一。手术、放疗和化疗是目前癌症治疗的主要手段。能深入瘤内杀伤肿瘤细胞且对正常细胞损伤较小的药物是理想的化疗药物。然而大多数传统的化疗药物对细胞的杀伤缺乏选择性。随着对肿瘤发生、发展分子机制的深入了解和肿瘤标志物的发现,靶向性治疗药物已成为肿瘤化疗药物发展的新趋势(Nero TL et al.Nat Rev Cancer.2014,14:248–62;Goel HL et al.Nat Rev Cancer.2013,13:871-82)。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子TNF(Tumor NecrosisFactor)超家族成员。全长分子由281个氨基酸组成,包含N末端疏水跨膜区和暴露于胞膜外的C末端亲水区。TRAIL有四种膜结合型受体分子(TRAILR1,R2,R3和R4)和一种可溶性受体分子(OPG)。这些受体中,只有TRAILR1和R2是死亡受体(Death Receptor,DR),在细胞膜表面与TRAIL结合后即被活化,通过胞内死亡信号结构域招募系列信号分子,传递死亡信号诱导细胞凋亡。而TRAIL R3和R4两种受体都是诱骗受体(Decoy Receptor,DcR),分子内缺乏死亡信号传递结构域或该结构域不完整,与TRAIL结合后不传递死亡信号,不诱导细胞凋亡。死亡受体TRAIL R1和R2高表达于肿瘤细胞,而诱骗受体R3和R4在正常细胞高表达。因此,TRAIL能诱导肿瘤细胞凋亡却不伤害正常细胞,对肿瘤细胞的杀伤具有选择性(Gonzalvez Fet al.Oncogene.2010,29:4752–65)。体内外研究发现,利用基因工程生产的人可溶性TRAIL在体外和动物模型中对乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、骨肉瘤、软骨瘤、淋巴瘤、成神经细胞瘤、血液肿瘤和肿瘤内皮细胞等都表现强烈的杀伤作用(Stucke DW et al.Trends Mol Med.2013,19(11):685-94;Wilson NS et al.Cancer Cell.2012,22(1):80-90)。基因工程重组的人可溶性TRAIL作为抗肿瘤药物已进入临床I-II期试验。结果表明,TRAIL具有良好的安全性,多种肿瘤病人对TRAIL的治疗都有反应,极有可能被开发为新型抗肿瘤药物(Subbiah V et al.Mol Cancer Ther.2012,11(11):2541-6.Soria JC et al.J Clin Oncol.2011,29(33):4442-51)。
但是,现有基因工程重组的可溶性TRAIL抗肿瘤效果还不理想,主要原因在于其受体分布广泛,对肿瘤的靶向性不强。针对这一缺陷,采用能特异结合肿瘤细胞的单链抗体或者肿瘤导向肽与TRAIL连接,可能增强TRAIL的肿瘤靶向性,进而改善其体内抗肿瘤效果。
F3肽是由人高迁移率族核小体结合蛋白2(high mobility groupnucleosomal binding protein 2)17-48位氨基酸组成,其能够特异性结合肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞(Porkka K et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2002,99(11):7444-9),能增强某些抗肿瘤药物的靶向性,但未见用其增强TRAIL肿瘤靶向性进而提高其抗肿瘤活性的报道。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,即TRAIL变异体,及其制备方法和用途。
本发明肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,它是包含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和F3肽的融合蛋白。F3肽通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。
其中,所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
其中,所述F3肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。优选地,所述F3肽由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码。
其中,所述连接子由2-20个氨基酸组成。优选地,所述连接子是(G4S)3连接子,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
其中,所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体由SEQ ID NO:7或9所示的核苷酸序列编码。所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8或10所示。
本发明核苷酸序列,它包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列与F3肽的编码序列,二者之间通过连接子的编码序列连接。
其中,所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列如SEQ ID NO:1所示。
其中,所述F3肽的编码序列如SEQ ID NO:3所示。
其中,所述连接子是(G4S)3连接子,其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
所述核苷酸序列如SEQ ID NO:7或9所示。
本发明还提供了包含前述核苷酸序列的重组载体或重组菌。
本发明制备前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的方法,它是以前述核苷酸序列为目标片段,采用基因工程的方法制备得到的。
本发明还提供了前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体在制备治疗细胞增生性疾病的药物中的用途。
其中,所述治疗细胞增生性疾病的药物是治疗肿瘤或自身免疫性疾病的药物。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物,它是以前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体为活性成分,加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
目前,通过在抗肿瘤蛋白上添加导向肽、增强肿瘤靶向性是本领域提高蛋白药物抗肿瘤活性的方法之一。其中的关键问题在于,导向肽与蛋白药物连接在一起形成了新蛋白。新添加的导向肽与原有蛋白药物间可能相互影响而不能充分发挥各自原来的功能。因此,新蛋白不一定比原来的蛋白活性更强。目前的肿瘤导向肽众多,如RGD家族、NGR家族的肿瘤导向肽等。添加哪种导向肽,如何添加,能够最终制备得到一种抗肿瘤活性更强的新蛋白并不确定。比如,Bieker等(Blood 2009;113:5019-5027)利用一种L-NGR导向肽(GNGRAHA)与组织因子连接,增强了其抗肿瘤活性。但本发明人将L-NGR导向肽添加到TRAIL N-末端,获得的新蛋白抗肿瘤活性与TRAIL相比没有得到增强。这充分说明了利用肿瘤导向肽提高蛋白药物抗肿瘤活性的不确定性。
然而,本发明以F3肽为靶向肽,并对其核苷酸序列进行了优化以后,与TRAIL融合制备的融合蛋白,具有良好的肿瘤靶向性和选择杀伤肿瘤的活性,体内外实验均证明其抗肿瘤活性优于TRAIL,尤其是对TRAIL抗性肿瘤,取得了意料不到的技术效果。
本发明通过基因工程的方式,制备得到了纯品TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-C和TRAIL-F3-N,它们对肿瘤细胞的杀伤活性明显高于TRAIL,其中,TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N对肿瘤细胞的亲和力、稳定性、诱导肿瘤细胞的凋亡的能力、肿瘤靶向性和体内抗肿瘤活性均明显优于TRAIL,用于治疗肿瘤的疗效优良;更进一步地,TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N能抑制TRAIL抗性肿瘤,可用于治疗TRAIL抗性肿瘤,临床应用前景良好。
附图说明
图1融合蛋白结构示意图。
图2重组蛋白表达质粒的双酶切鉴定。M:DNA分子量标准。1:pET21d-TRAIL;2:pQE30-TRAIL-PC-N;3:pET21d-TRAIL-F3-N;4:pET21d-TRAIL-F3-C。箭头所示为酶切产生的目的基因片段。
图3纯化蛋白的SDS-PAGE电泳。M:蛋白质标准;1:TRAIL-F3-C;2:TRAIL-F3-N;3:TRAIL-PC-N;4:TRAIL。
图4融合F3增强了TRAIL对肿瘤细胞的杀伤活性。
A.F3与TRAIL共价连接增强了TRAIL的肿瘤细胞杀伤活性。B.随机对照肽PC与TRAIL融合对TRAIL肿瘤细胞杀伤活性无增强作用。
图5 TRAIL变异体蛋白与TRAIL的细胞杀伤活性比较。
图6 TRAIL变异体蛋白与TRAIL的细胞结合能力比较。
A.F3、TRAIL和TRAIL-F3-N对肿瘤细胞SMMC-7721的结合能力。B.F3(4μM)与肿瘤细胞和正常细胞结合率比较。C.TRAIL和TRAIL-F3-N对肿瘤细胞和正常细胞的结合率比较。
图7TRAIL变异体蛋白诱导肿瘤细胞凋亡。A,B.Annexin V(绿色荧光)/PI(红色荧光)染色联合荧光显微镜观察(A)和流式细胞分析(B)检测TRAIL-F3-N诱导的SMMC-7721细胞凋亡。C,D.TRAIL-F3-N与SMMC-7721细胞作用后细胞核形态变化(C)和DNA断裂(TUNEL阳性细胞百分率,D)。E.TRAIL-F3-N和TRAIL诱导SMMC-7721细胞Caspase-3、8、9的活化。
图8 TRAIL变异体蛋白在血浆(A)和全血(B)中的稳定性。
图9 TRAIL变异体蛋白在体内的肿瘤靶向性和组织分布。A.荧光活体成像显示肿瘤对TRAIL-F3-N和TRAIL的摄取(圆圈指示肿瘤部位)。B.肿瘤对TRAIL-F3-N和TRAIL的摄取量的比较。C.TRAIL-F3-N和TRAIL组织分布图。1:脑;2:心;3:肝;4:脾;5:肺;6:肾;7:肌肉;8:肿瘤。D.TRAIL-F3-N和TRAIL在各组织中的含量比较。
图10 TRAIL变异体对TRAIL敏感细胞COLO 205的体内抗肿瘤活性。
A.瘤内注射TRAIL-F3-N和TRAIL的肿瘤生长抑制作用(n=7)。B.尾静脉注射TRAIL-F3-N和TRAIL的肿瘤生长抑制作用(n=7)。C.尾静注射不同剂量TRAIL-F3-N(n=6)的肿瘤生长抑制作用。D.图C观察结束时各组瘤体大小比较。箭头显示给药时间。
图11 TRAIL变异体蛋白对TRAIL抗性细胞A549的体内抗肿瘤活性。
A.瘤内注射TRAIL-F3-N和TRAIL的肿瘤生长抑制作用(n=6)。B.尾静脉注射TRAIL-F3-N和TRAIL的肿瘤生长抑制作用(n=7~8)。C.图B观察结束时各组肿瘤的大小及瘤重比较。
图12 TRAIL变异体蛋白短期急性毒性评价。A.给药期间小鼠体重变化曲线。B.给药结束小鼠肝、肾功能血液生化指标。ALT:谷丙转氨酶;AST:谷草转氨酶;UREAL:尿素;UA:尿酸。C.给药结束小鼠肝、肾组织学观查。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容作进一步详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1本发明TRAIL变异体的制备
1、TRAIL变异体的设计和基因克隆
1)TRAIL变异体的设计
F3肽由31个氨基酸组成。TRAIL是截取人TRAIL114-281氨基酸组成的片段。F3可连接在TRAIL N末端或C末端,两片段之间加入柔性连接子,如(G4S)3等。如图1所示,F3连接在TRAIL N末端或C末端形成的融合蛋白分别命名为TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C。同时选择对照肽PC,连接在TRAIL N末端构建TRAIL-PC-N作为对照。
利用核酸分析软件,将各片段编码基因进行拼接,获得TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N、TRAIL-F3-C和TRAIL-PC-N的编码基因,然后提交南京金斯瑞公司人工合成。
表1 本发明涉及氨基酸及核酸序列
2)TRAIL变异体蛋白重组表达载体的构建
本实例中,以pET21d和pQE30作为载体表达为例。为方便克隆,在TRAIL、TRAIL-F3-N,TRAIL-F3-C编码基因两端分别添加Nco I和BamH I限制性内切酶位点,基因酶切后克隆至表达载体pET21d(购自Novagen),构建出表达质粒pET21d-TRAIL,pET21d-TRAIL-F3-N和pET21d-TRAIL-F3-C。在TRAIL-PC-N编码基因两端添加BamH I和Kpn I酶切位点,酶切后克隆至表达载体pQE30(购自Qiagen),构建出表达质粒pQE30-TRAIL-PC-N。表达质粒的构建方法均为常规方法,具体操作步骤参见《分子克隆实验技术指南》(J.萨姆布鲁克编著,黄培堂主译,2008年出版)。
构建好的质粒通过DNA序列分析,确保序列正确(图2)。
3)重组菌的构建和筛选
根据《分子克隆实验技术指南》(J.萨姆布鲁克编著,黄培堂主译,2008年出版)描述的方法将表达质粒pET21d-TRAIL,pET21d-TRAIL-F3-N和pET21d-TRAIL-F3-C转入大肠杆菌BL21-DE3,然后用含氨苄西林(100μg/ml)的LB抗性平板筛选阳性克隆。
2、TRAIL变异体蛋白的诱导表达和分离纯化
挑取单克隆菌体接种于含氨苄西林(100μg/ml)的液体LB培养基中,37℃振荡培养至A600nm=0.6~1。再加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导4~6小时。6000g离心10min收集菌体,用裂解液(10mM磷酸盐缓冲液,pH 7.6,10%甘油,10mM2-巯基乙醇)重悬,再加入终浓度为1mM苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),冰浴条件超声破菌(功率300-400W,工作10s间隔50s)。超声破菌完成后,样品于4℃,20000g离心15min,重复4次,收集破菌上清。pQE30-TRAIL-PC-N表达质粒则转入大肠杆菌M15(购自Qiagen),除了在培养基中加入karamycin(30μg/ml)外,其余方法同前。破菌上清首先与经裂解液平衡的阳离子交换柱SP-Sepharose(购自GE公司)结合,然后用含0.2M NaCl的裂解液洗掉杂蛋白,再用含0.8M NaCl的裂解液洗脱。洗脱的蛋白再与Ni-NTA-Agarose(购自Qiagen公司)结合,最后用50-300mM咪唑洗脱,即得纯品目的蛋白。纯化后的蛋白用内毒素去除试剂盒(购自Genscript公司)按说明书提供的方法去除内毒素备用。
如图3所示,纯化后的蛋白在还原性SDS-PAGE电泳后,按标准分子量计算,各蛋白单体分子量分别为:TRAIL,17.8KD;TRAIL-PC-N,22.8KD;TRAIL-F3-N,26.3KD;TRAIL-F3-C,25.6KD,所有蛋白表观分子量均与预期分子量相符。
实验结果说明,本发明制备得到了蛋白TRAIL和变异体蛋白TRAIL-F3-N、TRAIL-F3-C和TRAIL-PC-N。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果:
实验例1 TRAIL变异体功能片段共价连接方式对变异体活性的影响
1、实验方法
利用体外细胞毒性测试模型检测TRAIL变异体蛋白的细胞杀伤活性。
分别以人肝癌细胞株SMMC-7721和人肺癌细胞株A549进行实验:细胞在含10%小牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI 1640中于37℃,5%CO2条件下培养。将1×104个细胞接种于96孔板中贴壁过夜,然后将培养基换为含2%小牛血清的1640培养基,同时加入不同浓度的蛋白,作用过夜后,加入CCK-8溶液,反应2-4h后用酶标仪测定495nm吸光值。以未经蛋白处理的细胞存活率为100%来计算蛋白处理组细胞存活率。
2、实验结果
结果如图4所示:
1、如图4A所示,变异体TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C对肝癌细胞SMMC-7721和肺癌细胞A549都显示了杀伤活性。蛋白浓度越高,杀伤作用越强。
结果说明本发明构建的TRAIL变异体具有肿瘤细胞杀伤活性。
2、进一步比较发现,用于构建TRAIL变异体的F3肽在测试浓度范围内对肝癌细胞SMMC-7721和肺癌细胞A549均没有明显细胞毒作用。单独的TRAIL只在高浓度时对细胞有一定杀伤。F3肽与TRAIL的混合物与单独的TRAIL细胞杀伤活性相近,表明与F3简单混合不能增强TRAIL活性。但是,将F3分别共价连接在TRAIL N末端或C末端形成的变异体TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C均比相同浓度TRAIL的细胞杀伤活性强。
结果表明,只有采用本发明特定融合方式,将TRAIL与F3共价连接,才能显著增强了TRAIL对肿瘤细胞的杀伤活性(图4A),而二者的简单混合则无法达到目的。
3、对同一种肿瘤细胞,TRAIL-F3-N比TRAIL-F3-C的杀伤活性更强。
结果表明将F3连接在TRAIL N末端比连接在C末端更利于增强TRAIL的肿瘤细胞杀伤活性。
4、用随机对照PC肽替换F3与TRAIL共价连接,形成的变异体TRAIL-PC-N对肿瘤细胞的杀伤与TRAIL无显著差异(图4B)。
结果说明只有共价连接F3肽才能增强TRAIL抗肿瘤活性。
实验结果说明,前述3种变异体蛋白中,本发明变异体TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C对肿瘤细胞的杀伤活性明显高于TRAIL,而TRAIL-PC-N对肿瘤细胞的杀伤与TRAIL无显著差异,其中,TRAIL-F3-N的杀伤活性最强。
实验例2 变异体蛋白对肿瘤细胞的选择性杀伤特性检测
1、实验方法
利用体外细胞毒性测试模型比较TRAIL变异体蛋白对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤活性,以确定其细胞杀伤的选择性。将1×104个细胞(100μl)接种于96孔板中贴壁过夜,然后将培养基换为含2%小牛血清的1640培养基,同时加入不同浓度实施例1获得的TRAIL和TRAIL变异体蛋白,作用过夜后,加入10μl CCK-8溶液,反应2-4h后用酶标仪测定495nm吸光值。以未经蛋白处理的细胞存活率为100%来计算蛋白处理组细胞存活率。
2、实验结果
结果如图5所示:
1、对肿瘤细胞的杀伤作用:TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C对肝癌(SMMC-7721、SK-HEP-1、QGY-7703、QGY-7701、BEL-7402、BEL-7404、PLC/PRF/5)、肺癌(A549、SPC-A1、NCI-H358、NCI-H1650、95D、NCI-H446、NCI-H1299)、结肠癌(COLO 205、SW480)、乳腺癌(MDA-MB-231、MDA-MB-435S)和胶质瘤(T98G)细胞都具有杀伤作用,且活性明显强于TRAIL。
其中,TRAIL-F3-N对这些细胞的IC50介于0.1~0.5nM之间,比TRAIL的IC50低10-40倍。
2、对正常细胞的杀伤作用:与TRAIL一样,TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C对正常细胞(如皮肤成纤维细胞HSF和COS-7)均无明显杀伤作用。
结果表明,本发明制备的TRAIL变异体蛋白,TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C,都保留了TRAIL选择性杀死肿瘤细胞的特性,且TRAIL-F3-N对肿瘤的杀伤活性更强。
实验例3 TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N对肿瘤细胞的亲和力
1、实验方法
我们用FITC标记了F3肽,TRAIL和TRAIL-F3-N,然后将其与细胞共同孵育,再用流式细胞仪检测细胞与肽/蛋白的结合。FITC标记时,将肽/蛋白溶液用Na2CO3调至pH 8.5,然后与FITC按摩尔比1:24比例混合,避光25℃反应1h,透析去除未偶联的FITC。取2×105个细胞,悬浮于500μl磷酸盐缓冲液(PBS,50mM,150mM NaCl,pH7.4)中,加入不同浓度FITC标记物,4℃下结合1h,然后再用PBS洗涤2次后流式检测,统计细胞阳性率。阳性率越高,表明蛋白对细胞的结合能力越强。
2、实验结果
结果如图6所示:
1、如图6A所示,单独的F3肽(4μM)与肝癌细胞SMMC-7721孵育后,流式检测阳性率为55%,表明F3能与肿瘤细胞结合。单独的TRAIL在2.5,5.0和7.5nM浓度下对SMMC-7721的结合率为5.8%,13.2%,25.8%。而2.5,5.0和7.5nM的TRAIL-F3-N对SMMC-7721的结合率为42%,63.1%,88.8%,表明其对肿瘤细胞的结合能力高于单独的F3肽和TRAIL蛋白。
也就是说,在更低剂量下,本发明变异体蛋白对肿瘤细胞的亲和力高于高剂量单独使用的F3与TRAIL,说明F3与TRAIL采用本发明特定方式融合可发挥协同增效作用。
2、进一步分析发现,将相同剂量的F3肽(4μM)与不同种类肿瘤细胞和正常细胞进行孵育,F3肽对肿瘤细胞的结合率(50~90%)高于对正常细胞的结合率(<30%)(图6B)。同样,用流式细胞术比较1,2.5和5nM TRAIL和TRAIL-F3-N对多种肿瘤细胞和正常细胞的结合发现,相同剂量的TRAIL-F3-N对肿瘤细胞的结合强于TRAIL,但其对正常细胞的结合与TRAIL接近(图6C)。
结果表明,本发明TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N对正常细胞的亲和力与TRAIL接近,但对肿瘤细胞的亲和力却大大高于TRAIL,在一定的浓度下,TRAIL-F3-N可有效结合肿瘤细胞而不结合正常细胞。
同时,在相同剂量下,本发明变异体蛋白对肿瘤细胞的亲和力高于单独使用的F3与TRAIL,说明F3与TRAIL采用本发明特定方式融合可以发挥协同增效的作用。
实验例4 TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N诱导肿瘤细胞凋亡
1、实验方法
肿瘤细胞经蛋白处理后,利用Annexin V(绿色荧光)联合碘化丙啶(Propidium Iodide,PI,红色荧光)染色,通过荧光显微镜观察或流式细胞术检测凋亡细胞。Annexin V+PI-显示凋亡细胞,Annexin V+PI+显示坏死细胞,Annexin V-PI-显示活细胞。
2、实验结果
肝癌细胞SMMC-7721经2nM TRAIL-F3-N处理4h,用Annexin V/PI染色后于荧光显微镜下观察发现,大部分细胞为凋亡细胞(Annexin V+PI-)(图7A)。流式细胞术检测发现,经1、2、5nM TRAIL-F3-N处理后,凋亡细胞比率分别为48.6%、74.4%和85.9%,而相应的坏死细胞仅为0.19%、0.22%和0.4%(图7B)。用DAPI染色观察细胞核的变化发现,TRAIL-F3-N对细胞作用8h,可观察到大量细胞核固缩;作用24h,细胞核大量断裂形成不同长度的核小体片段(图7C)。TUNEL染色,然后用流式细胞术检测显示TUNEL阳性率为66.3%,进一步证实细胞核DNA断裂(图7D)。利用广谱Caspase抑制剂Z-VAD-FMK与细胞预先孵育2h,再加蛋白处理,发现Caspase抑制剂显著抑制TRAIL-F3-N对肿瘤细胞的杀伤。检测细胞Caspase3、8和9三种酶活性,发现TRAIL-F3-N作用后,肿瘤细胞三种酶均被活化。且与单独的TRAIL相比,相同剂量TRAIL-F3-N处理后三种Caspase酶的活化程度更高(图7E)。
实验结果说明,本发明TRAIL变异体TRAIL-F3-N与TRAIL一样,均通过Caspase途径诱导肿瘤细胞凋亡,并且,TRAIL变异体TRAIL-F3-N诱导肿瘤细胞凋亡的活性高于TRAIL。
实验例5 TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N的体外稳定性
1、实验方法
将血浆或全血与蛋白等体积混合,37℃孵育不同时间后,取样检测蛋白的细胞杀伤活性,并根据活性变化判断蛋白体外稳定性。
2、实验结果
结果如图8所示:
TRAIL在血浆中的活性随时间延长逐渐减弱,孵育3h活性至少降低一半,24h后绝大部分活性丧失。但TRAIL-F3-N在血浆中非常稳定,孵育72h活性无明显下降(图8A)。
图8B的结果显示,TRAIL-F3-N在全血中也很稳定性,孵育6h活性无明显下降。
实验结果说明,本发明TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N比TRAIL更稳定,也就是说,以本发明方式将F3与TRAIL融合,可以有效提高TRAIL的体外稳定性,便于储存。
实验例6 TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N体内肿瘤靶向性
1、实验方法
裸鼠皮下接种COLO 205(5×105个/只)建立荷瘤模型。同时,按照常规方法,用荧光染料CF750标记TRAIL-F3-N和TRAIL蛋白。待肿瘤生长至50~100mm3时,通过尾静脉给药。然后用荧光成像系统活体动态观察瘤体内蛋白含量的变化,以确定蛋白是否能到达肿瘤部位。观察结束,处死荷瘤裸鼠,取出重要器官和组织,用荧光成像系统检测蛋白在不同器官和组织中的分布。
2、实验结果
荧光成像结果如图9A、B所示:给药后10h,明显观察到TRAIL-F3-N在肿瘤部位富集。随时间延长,瘤体内累积的蛋白含量逐渐增多,至48h左右达峰值。肿瘤对TRAIL的摄入比TRAIL-F3-N略快,给药后6h即可在肿瘤部位观察到。但富集于肿瘤部位的TRAIL含量明显少于TRAIL-F3-N。这说明TRAIL-F3-N比TRAIL更容易到达并富集于肿瘤部位。
72h后处死动物,观察蛋白的组织分布结果如图9C、D所示:TRAIL和TRAIL-F3-N主要分布于肾、肝和肿瘤组织。两种蛋白均通过肝和肾清除。因此,蛋白在肝,尤其是肾脏中含量较多。而肿瘤组织内的蛋白含量显著高于肝肾以外的其它组织,说明TRAIL-F3-N和TRAIL两种蛋白均有肿瘤靶向性。但肿瘤部位富集的TRAIL-F3-N比TRAIL多,说明TRAIL-F3-N的靶向性更强。
实验结果说明,本发明TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N比TRAIL的靶向性更强,也就是说,以本发明方式将F3与TRAIL融合,可以有效提高TRAIL的肿瘤靶向性。
实验例7 TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N对TRAIL敏感细胞的体内抗肿瘤活性
1、实验方法
体外活性测试结果显示,结肠癌COLO 205为TRAIL敏感细胞。裸鼠皮下接种COLO 205(5×105个/只),待瘤体生长至100-200mm3时,瘤内注射TRAIL和TRAIL-F3-N蛋白(0.1和0.3mg/kg),每天1次,连续3天。以等体积PBS为对照。定期测量瘤体大小。
为进一步测试尾静脉注射蛋白的抗肿瘤效果,COLO205细胞皮下接种后6天,尾静脉注射TRAIL和TRAIL-F3-N蛋白(10mg/kg),全程给药1次。
2、实验结果
瘤内注射蛋白的抗肿瘤效果结果如图10A所示,与对照组相比,TRAIL和TRAIL-F3-N蛋白处理组肿瘤明显生长缓慢,说明两种蛋白均有抗肿瘤活性。但TRAIL-F3-N抑瘤效果比TRAIL好。TRAIL-F3-N蛋白处理组的肿瘤比相同剂量TRAIL处理后的肿瘤更小。不仅如此,0.1mg/kg TRAIL-F3-N抑瘤效果还优于0.3mg/kg的TRAIL。
尾静脉注射蛋白的抗肿瘤效果结果如图10B所示,TRAIL和TRAIL-F3-N均能显著抑制肿瘤生长。但同一时间点,TRAIL-F3-N处理组肿瘤小于TRAIL处理组,说明TRAIL-F3-N比TRAIL的抗肿瘤效果更好。尾静脉注射不同剂量TRAIL-F3-N,全程给药1次。结果如图10C所示,与对照组相比,所有蛋白处理组瘤体生长滞后,随着蛋白浓度增高,瘤体生长滞后越明显。观察结束后剥离瘤体进行比较发现,不同剂量(2,5和10mg/kg)TRAIL-F3-N处理组瘤体均明显小于对照组(图10D)。
实验结果说明,本发明TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N比TRAIL的体内抑瘤效果更好,也就是说,以本发明方式将F3与TRAIL融合,可以有效提高TRAIL的体内抑瘤效果。
实验例8 TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N对TRAIL抗性细胞的体内抗肿瘤活性
1、实验方法
体外杀伤活性测试发现,肺癌细胞A549为TRAIL抗性细胞。皮下接种A549(5×106个/只),待瘤体平均生长至50mm3左右,瘤内注射不同剂量(1,3mg/kg)TRAIL和TRAIL-F3-N蛋白,每天1次,共给药3次。以等体积PBS为对照。
在A549模型中,尾静脉注射TRAIL和TRAIL-F3-N,每天1次,连续5次。
2、实验结果
瘤内注射蛋白的抗肿瘤效果结果如图11A所示:1mg/kg TRAIL不能抑制肿瘤生长,3mg/kg TRAIL延缓了肿瘤生长,但瘤体大小与对照组无显著性差异。而TRAIL-F3-N对A549的杀伤作用显然强于TRAIL。1mg/kg和3mg/kg TRAIL-F3-N处理组瘤体大小与对照相比有显著性差异。
尾静脉注射蛋白的抗肿瘤效果结果如图11B所示:10mg/kg TRAIL处理组肿瘤大小与对照组无显著性差异。而5mg/kg TRAIL-F3-N处理组肿瘤生长就明显慢于对照组。10和20mg/kgTRAIL-F3-N处理组肿瘤生长更慢。观察结束后剥离瘤体进行比较,10mg/kg TRAIL处理组瘤体大小和重量与对照组相比无差异。TRAIL-F3-N各处理组(5,10,20mg/kg)瘤体和重量均小于对照组。其中,10和20mg/kg TRAIL-F3-N处理组瘤体平均重量与对照组比有显著性差异。10mg/kgTRAIL-F3-N处理组瘤体重量显著低于相同剂量TRAIL组(图11C)。
实验结果说明,本发明TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N对TRAIL抗性肿瘤有明显的抑瘤效果,可以用于治疗对TRAIL有抗性的肿瘤,取得了完全意料不到的技术效果。
实验例9 TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N的短期急性毒性
1、实验方法
SPF级BALB/c小鼠通过尾静脉注射20mg/kg的TRAIL-F3-N、TRAIL或等体积PBS,隔天1次共计10次。以小鼠给药前的体重为100%,定期测定并计算给药后小鼠体重的变化。
2、实验结果
如图12A所示,给药后小鼠体重逐渐增长,且各组小鼠体重无明显差异。最后1次给药后3天处死小鼠取血清检测肝肾功能指标结果如图12B所示,三组小鼠谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平无明显差异。TRAIL-F3-N组尿素氮(UREAL)为PBS组的1.6倍,尿酸(UA)约为PBS组0.7倍,但均在正常波动范围内。肝肾组织学检测也未发现TRAIL-F3-N和TRAIL有明显肝肾毒性(图12C)。
实验结果表明,TRAIL-F3-N具有良好的安全性,短期使用未出现明显的肝和肾毒性。
本发明通过基因工程的方式,制备得到了纯品TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C,它们对肿瘤细胞的杀伤活性明显高于TRAIL,其中,TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N对肿瘤细胞的亲和力、稳定性、诱导肿瘤细胞的凋亡的能力、肿瘤靶向性和体内抗肿瘤活性均明显优于TRAIL,用于治疗肿瘤的疗效优良;更进一步地,TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N对TRAIL抗性肿瘤有良好疗效,可用于治疗TRAIL抗性肿瘤。
综上,本发明TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C具有优良的性能,临床应用前景良好。
Claims (18)
1.一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,其特征在于:它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与F3肽的融合蛋白,F3肽通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。
2.根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,其特征在于:所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,其特征在于:所述F3肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求3所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,其特征在于:所述F3肽由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码。
5.根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,其特征在于:所述连接子由2~20个氨基酸组成。
6.根据权利要求5所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,其特征在于:所述连接子是(G4S)3连接子,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
7.根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,其特征在于:其由SEQ ID NO:7或9所示的核苷酸序列编码。
8.根据权利要求6所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体,其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO:8或10所示。
9.一种核苷酸序列,其特征在于:它包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列与F3肽的编码序列,二者之间通过连接子的编码序列连接。
10.根据权利要求9所述的编码序列,其特征在于:所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列如SEQ ID NO:1所示。
11.根据权利要求9所述的编码序列,其特征在于:所述F3肽的编码序列如SEQ ID NO:3所示。
12.根据权利要求9所述的核苷酸序列,其特征在于:所述连接子是(G4S)3连接子,其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
13.根据权利要求9所述的核苷酸序列,其特征在于:其如SEQ ID NO:7或9所示。
14.包含权利要求9~13任意一项所述核苷酸序列的重组载体或重组菌。
15.一种制备权利要求1~8任意一项所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的方法,其特征在于:它是以权利要求9~13任意一项所述核苷酸序列为目标片段,采用基因工程的方法制备得到的。
16.权利要求1~8任意一项所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体在制备治疗细胞增生性疾病的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途,其特征在于:所述治疗细胞增生性疾病的药物是治疗肿瘤或自身免疫性疾病的药物。
18.一种抗肿瘤药物,其特征在于:它是以权利要求1~8任意一项所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体为活性成分,加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
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