KR20100021627A - Ｃｈ1 도메인의 절단에 의한 가용성 항체 단편의 발현 - Google Patents

Abstract

활성 항체 단편 (Fab)의 개선된 발현은 중쇄 불변 영역을 절단함으로써 달성된다. Fab 단편의 CH1 도메인의 절단은 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens)에서 가용성 활성 항체 단편의 생산량을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에는 각종 C-말단을 지닌 중쇄의 단편 (예를 들어, 상이한 길이로 절단된 VH-CH1)과 경쇄를 분비시키는 것이 포함된다. 절단된 CH1 영역은 다른 Fab를 창출시키기 위한 스캐폴드 (scaffold)로서 사용할 수 있다. 또한, Fab 단편의 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄 도메인을 절단시키는 것이 포함된다. 본 발명에는 또한, 기타 펩티드 또는 분자 (예: 독소, 단백질, 펩티드, 효소 등)와 융합된 Fab 단편을 발현시키는 것이 포함된다.

가용성 활성 항체 단편, 활성 항체 단편의 발현 개선, 중쇄 불변 영역 (CH1)의 절단, 슈도모나스 플루오레센스

Description

ＣＨ1 도메인의 절단에 의한 가용성 항체 단편의 발현{EXPRESSION OF SOLUBLE ANTIBODY FRAGMENT BY TRUNCATION OF CH1 DOMAIN}

우선권 청구

본 출원은 "CH1 도메인의 절단에 의한 가용성 항체 단편의 발현"이란 발명의 명칭으로 2007년 6월 8일자로 출원된 미국 가특허원 제60/942,997호의 이권을 우선권으로 청구하고 있다.

본 발명은 일반적으로, 가용성 활성 항체 단편의 생성에 관한 것이고, 보다 구체적으로 언급하면 그의 중쇄 불변 영역을 절단함으로써 활성 항체 단편 (Fab)을 발현시키는 것에 관한 것이다.

효소적 절단에 의해 유래될 수 있는 각종 그의 단편, 예를 들어 Fab, (Fab'), sub2, 및 Fc 단편을 갖는 바와 같은 천연 면역글로불린이 수 년 동안 공지되어 왔다. 천연 면역글로불린은 각 암 (arm)의 말단에 항원 결합 부위를 갖는 일반적인 Y자형 분자를 포함한다. 나머지 구조, 특히 Y 줄기는 면역글로불린과 연관된 효과기 기능을 매개한다.

이러한 Y자형 분자의 암 연접부에는 힌지 (hinge) 영역으로서 공지된 부위가 있다. 이러한 영역에는, 항체의 부류에 따라서 2개 이상의 중쇄간 디설파이드 결 합이 존재한다. 이들 디설파이드 결합은 완전한 항체 분자의 두 부분을 함께 유지시켜 주는 데에 책임이 있다. Fab 단편에서는 힌지 영역이 항원 결합성 영역과 효소적으로 분리되어 있다. 따라서, Fab 단편은 경쇄/절단된 중쇄 이량체를 포함한다.

천연 면역글로불린 및 그의 단편은 진단에 사용되어 왔고, 요법에서는 보다 제한된 정도로 사용되어 왔다. 그러나, 특히 요법에 있어서의 이러한 사용은 천연 면역글로불린의 폴리클로날 특성으로 인해 저지되었다. 치료제로서의 면역글로불린의 잠재력을 실현하고자 하는 데에 있어서 중요한 진척은 한정된 항원 특이성을 지닌 모노클로날 항체를 발견한 것이었다.

지금까지 수행된 모든 연구 작업에서는, 항체 분자 또는 단편 내에 힌지 영역이 존재하는 경우에, 이는 통상 항체 분자의 CH1 도메인과 연합되었다. 이러한 힌지 영역은 Fab 또는 Fab' 단편 또는 변경된 항체 분자를 생성시키거나 또는 이러한 단편의 C- 또는 N-말단 서열을 변경시켜 재조합 DNA 기술에 의한 조작을 촉진시키도록 변경 또는 돌연변이된다고 제안되었다.

예를 들어, 국제공개공보 WO 2005/003170에는 1개 이상의 효과기 분자가 부착된 항체 Fab 또는 Fab' 단편이 기재되어 있다. 이러한 단편은 단편 내의 중쇄가 경쇄와 공유적으로 결합되지 않고, C_L의 쇄간 시스테인과 C_H1의 쇄간 시스테인 둘 다를 또 다른 아미노산으로 대체시켰다는 것을 특징으로 한다. 국제공개공보 WO 2005/003170에는 중쇄가 경쇄와 공유적으로 결합되지 않고 2개 이상의 효과기 분자 가 단편에 부착된 항체 Fab 또는 Fab' 단편이 기재되어 있다. 1개 이상의 효과기 분자가 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 내의 시스테인에 부착된다.

미국 특허 제5,677,425호 및 국제공개공보 WO 89/01974 (Bodmer et al.)에는 통상 항체 분자의 C_H1 도메인과 연합된 힌지 영역에서 발견된 것과는 상이한 수의 시스테인 잔기를 갖는 힌지 영역을 갖는 변경된 항체 분자 (AAM) 및 재조합 DNA 기술을 사용하여 이를 생성시키는 방법이 기재되어 있다.

활성 항체 단편의 개선된 폴딩 및 용해도 뿐만 아니라 활성 항체 단편의 개선된 발현을 제공하는 것이 유리할 것이다. 보다 활성인 항체 단편을 생성시키는 방법을 제공하는 것이 추가로 유리할 것이다.

발명의 요약

본 발명에는 중쇄 불변 영역을 절단함으로써 활성 항체 단편 (Fab)의 발현을 개선시키는 것이 포함된다. 절단에는 경쇄와의 디설파이드 결합 형성에 요구되는 시스테인 아미노산을 제거하는 것이 포함될 수 있는데, 이로써 원핵 생물에서의 활성 Fab의 소규모 및 대규모 발현이 개선될 수 있다. 미생물 시스템에서의 Fab 단편의 발현이 개선되면 이들 분자의 사용을 통한 치료제 및 진단제의 생성을 개선시킬 수 있다. 부가적으로, 이로써 생성되는 절단된 C_H1 영역은 다른 Fab 분자를 구축하기 위한 스캐폴드 (scaffold) 도구로서 사용할 수 있다.

본 발명의 한 양태에는 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens)에서 가용성 활성 항체 단편의 생성을 증가시키기 위해 Fab 단편의 C_H1 도메인을 절 단시키는 것이 포함된다. 본 발명의 또 다른 양태에는 각종 C-말단을 지닌 중쇄의 단편 (예를 들어, 상이한 길이로 절단된 V_H-C_H1)과 경쇄를 분비시키는 것이 포함된다. 또 다른 한편으론, 절단된 C_H1 영역은 다른 Fab를 창출시키기 위한 (예를 들어, 대체 V_H와 경쇄의 조합을 통하여 이루어짐) 스캐폴드로서 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에는 Fab 단편의 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄 도메인을 절단시키는 것이 포함된다. 본 발명의 또 다른 양태에는 카파 및/또는 람다 경쇄(들)를 발현 또는 분비시키는 것이 포함된다.

또 다른 국면에서, 본 발명에는 기타 펩티드 또는 분자 (예: 독소, 단백질, 펩티드, 효소 등)와 융합된 Fab 단편을 발현시키는 것이 포함된다.

도 1은 3가지 Gal2 Fab 변이체를 발현하도록 설계된 플라스미드 (pDOW1196, pDOW3716 및 pDOW3717)를 도시한 것이고;

도 2는 시험된 Fab 중쇄 C-말단의 정렬을 도시한 것이며;

도 3 내지 5는 3가지 구조물에 대한 Fab 암호화 영역을 도시한 것이고;

도 6은 본 발명의 한 양태에 따라서 진탕 플라스크 규모의 Fab 발현을 분석한 것을 도시한 것이며;

도 7은 본 발명의 한 양태에 따라서 진탕 플라스크 규모의 Fab 발현을 웨스턴 (Western) 분석한 것을 도시한 것이고;

도 8은 본 발명의 한 양태에 따라서 진탕 플라스크 규모를 ELISA 분석한 것 을 도시한 것이며;

도 9는 본 발명의 한 양태에 따라서 발효 규모로 발현된 Gal2 Fab의 활성을 도시한 것이고;

도 10은 본 발명의 한 양태에 따라서 반응 (가용성 활성 단백질)을 예시하는 실험 설계를 위한 분석 결과를 도시한 것이며;

도 11은 본 발명의 한 양태에 따라서 FrnE를 과발현하는 Fab 균주의 ELISA 분석을 도시한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 "발현 벡터를 도입시킨 배양 세포"에는 이러한 벡터를 함유하도록 물리적으로 조작한 세포 뿐만 아니라 그 자손이 해당 벡터를 또한 함유하는 경우에는 상기 조작된 세포의 자손이 포함된다.

용어 "아미노-말단" (또는 "N-말단") 및 "카복실-말단" (또는 "C-말단")은 폴리펩티드 내에서의 위치를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 전후 관계가 허용되는 경우, 이들 용어는 폴리펩티드의 특별한 서열이나 부분과 관련하여 근접하거나 상대적인 위치를 의미하기 위해 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드 내의 기준 서열에 대해 카복실 말단에 위치한 특정 서열은 이러한 기준 서열의 카복실 말단에 근접하여 위치한 것이지, 반드시 완전한 폴리펩티드의 카복실 말단에 위치하는 것은 아니다.

용어 "항체"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 단일 모노클로날 항체, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (이는 상응하는 폴리펩티드, 예를 들어 IFN-γ 또는 IFN-γ 수용체와 면역학적으로 반응한다) 뿐만 아니라 이러한 특성을 지니고 폴리에피토프 특이성을 수반한 항-IFN-γ 및 항-IFN-γ 수용체 항체 조성물을 포괄한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" (mAb)는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 구성하는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수도 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체 (상기 정의된 바와 같음)를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원성 부위에 대항하여 유도된다. 더우기, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 모노클로날 항체는 그의 특이성 이외에도, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 채로 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다.

모든 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 2가지 명백한 별개의 유형 (카파 및 람다로 지칭됨) 중의 하나로 지정될 수 있다.

서열 내의 아미노산 잔기 위치에 적용되는 경우의 용어 "상응하는"이란 해당 서열이 최적으로 정렬되는 경우에는 복수 개의 서열 내의 상응하는 위치를 의미한다.

용어 "발현 벡터"는 그의 전사를 제공해 주는 부가의 절편과 작동적으로 연결된 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 절편을 포함하는 선형 또는 환상 DNA 분자를 의미하기 위해 사용된다. 이러한 부가의 절편에는 프로모터 및 종결인자 서열이 포함되고, 또한 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선별성 마커, 증강인자 등이 포함될 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로, 플라스미드 또는 바이러스성 DNA로부터 유래되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유할 수 있다.

"면역글로불린"은 척추동물 유기체에서 항체로서 기능하는 혈청 단백질이다. 5가지 부류의 "면역글로불린", 또는 항체, 단백질 (IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE)이 고등 척추동물에게서 확인되었다. IgG가 주요 부류를 차지하는데, 이는 통상 혈장 내에서 발견된 두 번째로 가장 풍부한 단백질로서 존재한다. 인간에서는, IgG가 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 명명된 4가지 아부류로 이루어진다. IgG 부류의 중쇄 불변 영역은 그리스어 부호 γ로 확인된다. 예를 들어, IgG1 아부류의 면역글로불린은 γ1 중쇄 불변 영역을 함유하고 있다. 각 면역글로불린 중쇄는 특정 종에서 소정의 아부류에 대해 본질적으로 가변적이지 않는 불변 영역 단백질 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3)으로 이루어지는 불변 영역을 보유하고 있다. 인간 및 비-인간 면역글로불린 쇄를 암호화하는 DNA 서열은 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Ellison et al., DNA 1:11-18, 1981; Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kenten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6661-6665, 1982; Seno et al., Nuc. Acids Res. 11:719-726, 1983; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Amster et al., Nuc. Acids Res. 8:2055-2065, 1980; Rusconi and Kohler, Nature 314:330-334, 1985; Boss et al., Nuc. Acids Res. 12:3791-3806, 1984; Bothwell et al., Nature 298:380-382, 1982; van der Loo et al., Immunogenetics 42:333-341, 1995; Karlin et al., J. Mol. Evol. 22:195-208, 1985; Kindsvogel et al., DNA 1:335-343, 1982; Breiner et al., Gene 18:165-174, 1982; Kondo et al., Eur. J. Immunol. 23:245-249, 1993; and GenBank Accession No. J00228]. 면역글로불린 구조 및 기능을 고찰하기 위해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987; and Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994].

용어 "면역글로불린 CH1 도메인" 또는 "CH1"은 야생형 면역글로불린 중쇄 CH1 불변 도메인 또는 그의 변이체를 의미하는데, 이러한 변이체는 천연 면역글로불린 중쇄 불변 도메인의 특징적인 보다 고 차수 구조물 [단일 디설파이드 결합에 의해 안정화된 2개의 트위스트된 β 시트; 참고 (예를 들어, Amzel and Poljak, Annu. Rev. Immunol. 48:961-997, 1979)]로 폴딩되고 면역글로불린 경쇄 불변 도메인과 이량체를 형성할 수 있다.

"면역글로불린 힌지" 또는 "힌지"는 가변 도메인과 CH1 도메인을 연결하는 면역글로불린 중쇄의 일부이다.

용어 "경쇄 《카파》 또는 《람다》 불변 영역"은 《카파》 또는 《람다》 이소형의 천연 면역글로불린 경쇄 불변 도메인 또는 그의 변이체를 의미하는데, 이러한 변이체는 천연 면역글로불린 경쇄 불변 도메인의 특징적인 보다 고 차수 구조물로 폴딩되고 면역글로불린 CH1 도메인과 이량체를 형성할 수 있다.

폴리펩티드 또는 단백질 간의 "비-공유적 연합"에는 수소 결합, 입체적 상호 작용, 소수성 상호 작용, 및 이온성 상호 작용이 포함된다.

"비-면역글로불린 폴리펩티드"는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 단편이 아닌 폴리펩티드이다. 그러나, 용어 "비-면역글로불린 폴리펩티드"에는 그 자체가 면역글로불린이 아닌 한은, 면역글로불린-유사 도메인을 함유하는 폴리펩티드가 배제되지는 않는다.

"작동적으로 연결된"이란 둘 이상의 실재물이 그들의 의도한 목적대로 기능하도록 함께 연결되는 것을 의미한다. DNA 절편을 지칭하는 경우에는, 암호화 서열이 정확한 판독 프레임 내에서 연결되고 전사가 프로모터에서 개시하여 암호화 절편(들)을 통하여 종결인자까지 진행된다는 것을 나타낸다. 폴리펩티드를 지칭하는 경우, "작동적으로 연결된"에는 공유적으로 연결된 (예를 들어, 디설파이드 결합에 의해 이루어짐) 및 비-공유적으로 연결된 (예를 들어, 수소 결합, 소수성 상호 작용 또는 염-브릿지 상호 작용에 의해 이루어짐) 서열이 포함되는데, 이러한 서열의 목적하는 기능(들)은 유지된다.

"폴리뉴클레오티드"는 5' 말단에서부터 3' 말단까지 판독된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 가닥 또는 이중 가닥 중합체이다. 폴리뉴클레오티드에는 RNA 및 DNA가 포함되고, 이는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 시험관 내에서 합성될 수 있거나, 또는 천연 분자와 합성 분자의 조합물로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 크기는 염기 쌍 ("bp"로 약칭됨), 뉴클레오티드 ("nt"), 또는 킬로염기 ("kb")로서 표현된다. 전후 관계가 허용되는 경우, 후자 2가지 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥인 폴리뉴클레오티드를 기술할 수 있다. 상기 용어가 이중 가닥 분자에 적용되는 경우, 이는 전체 길이를 의미하기 위해 사용되고, 용어 "염기 쌍"과 등가라는 것은 인지해야 할 것이다. 당업자는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥이 길이상 약간 상이할 수 있고, 그의 말단이 효소적 절단의 결과로서 엇갈릴 수 있으므로, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내의 모든 뉴클레오티드가 쌍을 형성하지 않을 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 이와 같이 쌍을 형성하지 않은 말단은 일반적으로, 길이가 20 nt를 초과하지 않을 것이다.

"폴리펩티드"는 천연상 존재하거나 또는 합성적으로 생성되든지 간에, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 10개 미만 아미노산 잔기의 폴리펩티드가 흔히 "펩티드"로서 지칭된다.

용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제의 결합과 전사 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하는 유전자의 일부를 의미하는 것으로 당해 기술 분야에서 승인되고 있는 의미로 본원에 사용된다. 프로모터 서열은 항상은 아니지만, 흔히 유전자의 5' 비-암호화 영역에서 발견된다.

"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 거대분자이다. 단백질은 비-펩티드성 성분, 예를 들어 탄수화물 기를 포함할 수도 있다. 탄수화물 및 기타 비-펩티드성 치환체는 단백질이 생성되는 세포에 의해 이러한 단백질에 가할 수 있고, 이는 세포의 유형에 따라서 다양할 것이다. 단백질은 그의 아미노산 주쇄 구조 측면에서 본원에서 규정되고; 탄수화물 기와 같은 치환체는 일반적으로 특정되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.

"절편"은 명시된 특징을 지닌 보다 큰 분자 (예: 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)의 일부이다. 예를 들어, 명시된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 절편은 5'에서 3' 방향으로 판독하는 경우에 상기 명시된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 보다 긴 DNA 분자의 일부, 예를 들어 플라스미드 또는 플라스미드 단편이다.

본 발명에는 중쇄 불변 영역 (C_H1)을 절단시킴으로써 활성 항체 단편의 발현을 개선시키는 것이 포함된다. 절단에는 경쇄와의 디설파이드 결합 형성에 요구되는 시스테인 아미노산을 제거하는 것이 포함될 수 있는데, 이로써 원핵 생물, 예를 들어 피. 플루오레센스 (P. fluorescens)에서의 활성 Fab의 소규모 (예를 들어, 0.5 L) 및 대규모 (예를 들어, 20 L 발효) 발현이 개선될 수 있다. 피. 플루오레센스 및/또는 기타 미생물 시스템에서의 Fab 단편의 발현이 개선되면 이들 분자의 사용을 통한 치료제 및 진단제의 생성에 있어서 이점을 제공할 수 있다. Fab의 개선된 가용성 발현으로 인해, 특이적 항원을 인식하는 Fab를 고 처리능력 (HTP) 포맷으로 확인할 수도 있다. 부가적으로, 이로써 생성되는 절단된 CH1 영역은 기타 Fab 분자를 구축하기 위한 스캐폴드 도구로서 사용할 수 있다.

기타 공지된 방법과는 달리, 본 발명은 힌지 영역에서의 1개 이상의 시스테인 잔기(들)를 돌연변이시키는 것에 좌우되는 것이 아니라, 중쇄와 경쇄 간의 쇄간 디설파이드에 관여한 cys의 상류에 있는 5개 이하 아미노산까지 IgG1의 CH1 영역을 절단시키는 것에 좌우된다. 이와 같이 절단된 CH1은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 개선된 발현/폴딩/용해도를 제공할 수 있고 보다 활성인 Fab를 산출시킬 수 있다. 이러한 CH1 영역은 다른 항체 단편을 구축하기 위한 스캐폴드 도구로서 사용할 수 있다.

보다 구체적으로 언급하면, CH1 영역은 중쇄-경쇄 디설파이드 결합에 대해 책임이 있는 시스테인을 결실시킴으로써 절단시킨다. 임의로, 시스테인 잔기를 벗어나 결실된 아미노산의 수는 다양할 수 있다. 임의로, 시스테인의 상류 또는 하류에 있는 부가의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 및 100개 이하의 아미노산을 결실시킬 수 있다. 이와 같이 절단된 CH 영역을 임의의 가변 영역과 융합시키고 적당한 경쇄와 쌍을 형성시켜, 원핵 생물, 예를 들어 피. 플루오레센스, 또는 기타 적합한 발현 시스템에서 보다 높은 용해도로 발현되는 항체 단편을 생성시킬 수 있다.

본 발명의 특별한 양태에서는, 쇄간 디설파이드에 대해 책임이 있는 CH1 내의 시스테인 잔기를 결실시키고, 이러한 시스테인의 상류에 있는 4개 아미노산은 유지시킨다. 또 다른 양태에서는, 시스테인의 상류에 있는 4개 아미노산을 포함한, 보다 큰 CH1 영역을 결실시킬 수 있다. 이러한 CH1 영역 (대체 가변 영역을 수반하거나 수반하지 않음)을 기타 원핵 생물 시스템에서 발현시킬 수 있다.

본 발명의 Fab는 일반적으로, 항원과 선택적으로 결합할 수 있을 것이다. 항원은 모든 세포 관련 항원, 예를 들어 세포 (예: 세균성 세포, 효모 세포, T-세포, 내피 세포 또는 종양 세포) 상의 세포 표면 항원일 수 있거나, 또는 가용성 항원일 수 있다. 항원은 또한, 의학적으로 관련된 모든 항원, 예를 들어 질병 또는 감염 동안 조절되지 않는 항원, 예를 들면 수용체 및/또는 그의 상응하는 리간드일 수 있다. 세포 표면 항원의 특별한 예에는 부착 분자, 예를 들어 인테그린 (integrin), 예를 들면 파이 (pi) 인테그린, 예를 들어 VLA-4, E 셀렉틴 (selectin), 파이 셀렉틴 또는 L-셀렉틴, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, 암배아성 항원 (CEA), 인간 유지방구 (HMFG1 및 2), MHC 부류 I 및 MHC 부류 II 항원, 및 VEGF, 및 경우에 따라, 그의 수용체가 포함된다. 가용성 항원에는 인터루킨, 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16 또는 IL-17, 바이러스성 항원, 예를 들어 호흡기 합포체 바이러스 또는 시토메갈로바이러스 항원, 면역글로불린, 예를 들어 IgE, 인터페론, 예를 들어 인터페론 oc, 인터페론 8 또는 인터페론, 종양 괴사 인자-oc, 종양 괴사 인자-B, 집락 자극 인자, 예를 들어 G-CSF 또는 GM-CSF, 및 혈소판 유래된 성장 인자, 예를 들어 PDGF-oc, 및 PDGF-p, 및 경우에 따라, 그의 수용체가 포함된다.

본 발명의 한 국면에 따르면, 선별된 표적에 대항하여 유도된 항체 단편 (Fab)의 집합체를 클로닝하고 가변 C-말단을 갖는 원핵 생물 (예: 피. 플루오레센스)에서 발현시킬 수 있다. 이러한 Fab의 가변 영역은 단일 쇄 항체로부터 유래될 수 있다. 이어서, 중쇄 및 경쇄를 플라스미드 프로모터 (예: 후술되는 바와 같은 플라스미드 pDOW1169의 Ptac 프로모터)로부터 전사된 단일 오페론 (operon)으로서 클로닝할 수 있다. 이어서, 중쇄 단편을 상기 플라스미드로부터 증폭시킬 수 있는데, 이로써 이는 VH 및 CH1을 통하여 pbp 분비 신호 서열로부터 암호화 서열을 포함한다. CH1 암호화 영역 다음에, 3개의 동일 프레임내 해독 중지 신호를 XbaI 부위를 따라 공학 처리할 수 있다. 그 다음, pbp 분비 신호를 포함한 경쇄를 증폭시킬 수 있고, XbaI 및 XhoI 부위 내로 클로닝할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에는 각종 C-말단을 지닌 중쇄의 단편 (예를 들어, 상이한 길이로 절단된 V_H-C_H1)과 경쇄를 분비시키는 것이 포함된다. 또 다른 한편으론, 절단된 C_H1 영역은 다른 Fab를 창출시키기 위한 (예를 들어, 대체 V_H와 경쇄의 조합을 통하여 이루어짐) 스캐폴드로서 사용할 수 있다.

또 다른 국면에서, 본 발명에는 기타 펩티드 또는 분자와 융합된 상기 언급된 항체 단편을 발현시키는 것이 포함된다. 분자는 수 많은 상이한 방법, 예를 들어 알데히드 당을 통하여, 또는 보다 통상적으로는 항체 단편에 위치한 이용 가능한 모든 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 모든 자유 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카복실 기를 통하여, 항체 단편에 부착시킬 수 있다. 효과기 분자의 부착 부위는 무작위적이거나 부위 특이적일 수 있다.

무작위적 부착은 리신과 같은 아미노산을 통하여 종종 달성되는데, 이로써 효과기 분자는 리신의 위치에 따라서 항체 단편 전반에 걸쳐 수 많은 부위에 부착된다.

분자의 부위 특이적 부착은 시스테인 잔기에 대한 부착에 의해 달성될 수 있는데, 이는 이러한 잔기가 항체 단편에서 비교적 흔하지 않기 때문이다. 항체 힌지가 부위 특이적 부착에 잘 선호되는 영역인데, 이는 항체 힌지가 시스테인 잔기를 함유하고 있고 항원 결합에 관여하는 것으로 예상되는 항체의 기타 영역으로부터 멀리 떨어져 있기 때문이다. 적합한 힌지는 단편 내에 천연상 존재하거나 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 창출시킬 수도 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,677,425호; W098/25971; Leong et al., 2001 Cytokine, 16, 106-119; Chapman et al., 1999 Nature Biotechnology, 17, 780-783]. 또 다른 한편, 부위 특이적 시스테인을 항체 단편 내로 공학 처리하여, 예를 들어 표면 노출된 시스테인(들)을 창출시킬 수 있다 [참고: 미국 특허 제5,219,996호].

본 발명에 사용하기 적합한 분자에는, 예를 들어 항종양제, 약물, 독소 (예를 들면, 세균성 또는 식물 기원의 효소적 활성 독소 및 그의 단편, 예를 들면 리신 및 그의 단편), 생물학적 활성 단백질, 예를 들면 효소, 기타 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생적 중합체, 핵산 및 그의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 그의 단편, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오드화물, 방사성 동위원소, 킬레이트화 금속, 나노입자 및 리포터 (reporter) 기, 예를 들어 형광성 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 탐지될 수 있는 화합물이 포함된다.

특별한 항종양제에는, 예를 들어 세포독성제 및 세포증식 억제제, 예를 들면 알킬화제, 예를 들어 질소 머스타드 [예: 클로람부실 (chlorambucil), 멜팔란 (melphalan), 메클로르에타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 또는 우라실 머스타드] 및 그의 유도체, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 부설판 (busulphan), 또는 시스플라틴 (cisplatin); 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플록수리딘, 시타라빈, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 플루오로아세트산 또는 플루오로시트르산, 항생제, 예를 들어 블레오마이신 (예: I 블레오마이신 설페이트), 독소루비신, 다우노루비신, 미토마이신 (예: 미토마이신 C), 악티노마이신 (예: 닥티노마이신), 플리카마이신, 칼리캐미신 및 그의 유도체, 또는 I 에스페라미신 및 그의 유도체; 유사분열 억제제, 예를 들어 에토포시드, 빈크리스틴 또는 빈블라스틴 및 그의 유도체; 알카로이드, 예를 들어 엘립티신; 폴리올, 예를 들어 탁시신-I 또는 탁시신-II; 호르몬, 예를 들어 안드로겐 (예: 드로모스타놀론 또는 테스토락톤), 프로게스틴 (예: 메게스트롤 아세테이트 또는 메드록시프로게스테론 아세테이트), 에스트로겐 (예: 디메틸스틸베스트롤 디포스페이트, 폴리에스트라디올 포스페이트 또는 에스트라무스틴 포스페이트) 또는 항에스트로겐제 (예: 타목시펜); 안트라퀴논, 예를 들어 미톡산트론, 우레아, 예를 들어 히드록시우레아; 히드라진, 예를 들어 프로카바진; 또는 이미다졸, 예를 들어 다카르바진이 포함된다. 적합한 킬레이트화 금속에는, 예를 들어 배위 수가 2 내지 8인 2+ 또는 3+ 금속의 킬레이트가 포함된다.

본 발명에 사용하기 적합한 분자에는 또한, 단백질, 펩티드 및 효소가 포함된다. 관심있는 예에는 단백질 분해성 효소, 가수분해 효소, 용해효소, 이소머라제, 트랜스퍼라제가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 관심있는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드에는 면역글로불린, 독소, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예를 들어 인슐린, 종양 괴사 인자, oc-인터페론, p-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제, 혈전 작용제 또는 항혈관형성제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생체 반응 조정제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-6 (IL-6), 과립구 대식 세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 집락 I 자극 인자 (G-CSF), 신경 성장 인자 (NGF) 또는 기타 성장 인자 및 면역글로불린이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

기타 분자에는, 예를 들어 진단에 유용한 탐지 가능한 물질이 포함될 수 있다. 탐지 가능한 물질의 예에는 각종 효소, 보결 분자단, 형광성 물질, 발광성 물질, 생물발광성 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출성 금속 (양전자 방출 단층촬영술에 사용하기 위함), 및 비방사성 상자성 금속 이온이 포함된다. 적합한 효소에는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고; 적합한 보결 분자단에는 스트렙타비딘, 아비딘 및 바이오틴이 포함되며; 적합한 형광성 물질에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린이 포함되고; 적합한 발광성 물질에는 루미놀이 포함되며; 적합한 생물발광성 물질에는 루시퍼라제, 루시페린 및 아쿠오린이 포함되고; 적합한 방사성 핵종에는 125I, 131I, 111In 및 99Tc가 포함된다.

분자로서 사용하기 위한 합성 또는 천연 발생적 중합체에는, 예를 들어 임의로 치환된 직쇄 또는 측쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지되거나 분지되지 않은 다당류, 예를 들어 동종- 또는 이종-다당류, 예를 들면 락토스, 아밀로스, 덱스트란 또는 글리코겐이 포함된다. 상기 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 특별한 임의의 치환체에는 1개 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시 기가 포함된다. 합성 중합체의 특별한 예에는 임의로 치환된 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 그의 유도체, 특히 임의로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예를 들어 메톡시폴리(에틸렌글리콜) I 또는 그의 유도체가 포함된다. 특별히 바람직한 중합체에는 폴리알킬렌 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌글리콜), 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 그의 유도체, 및 특히 분자량이 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da의 범위인 상기 중합체가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "유도체"에는 반응성 유도체, 예를 들어 티올-선택적 반응성 기, 예를 들면 α-할로카복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드 말레이미드 등이 포함된다.

한 예에서, 본 발명의 분자는 Fab 내에 위치한 이용 가능한 모든 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용성 기, 예를 들어 모든 자유 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카복실 기를 통하여, 단백질에 부착시킬 수 있다. 이러한 아미노산은 Fab에 천연상 존재할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편으로 공학 처리할 수 있다.

본 발명의 특별한 국면에서, 항체 단편에 부착된 분자 중의 하나 이상은 중합체 분자, 바람직하게 PEG 또는 그의 유도체이다.

본 발명에는 또한, 항체 Fab 단편 중간체 (예: CH1 절단된 단편 또는 VH-CH1 절단된 단편)를 발현하는 숙주 세포가 포함된다. 본 발명의 항체 Fab 중간체를 암호화하는 DNA 서열을 발현시키는 데에 적합한 모든 숙주 세포/벡터 시스템을 사용할 수 있다. 원핵 숙주 세포, 예를 들어 세균 슈도모나스 (Pseudomnonas), 이. 콜라이 (E. coli), 바실루스 (Bacillus) 및 기타 속의 균주가 또한, 본 발명 내에서 유용한 숙주 세포이다. 이들 숙주를 형질전환시키고, 이들 내부에 클로닝된 외래 DNA 서열을 발현하는 기술을 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 폴리펩티드 융합물을 세균에서 발현시키는 경우, 폴리펩티드는 불용성 과립으로서 세포질 내에 유지될 수 있거나, 또는 세균성 분비 서열에 의해 주변세포질 공간으로 유도될 수 있다. 단백질은, 예를 들어 인산염 완충 식염수 중의 수성 추출물로서 세포로부터 회수한다. 관심있는 단백질을 포획하기 위해, 추출물을 크로마토그래피 매질, 예를 들어 고정화 항체 또는 헤파린-세파로스 칼럼에 직접 적용한다. 분비된 폴리펩티드는 세포를 붕괴시키고 (예를 들어, 초음파처리 또는 삼투압 쇽에 의해 이루어짐) 단백질을 회수하여, 변성 및 재폴딩에 대한 필요성을 미연에 방지함으로써 주변세포질 공간으로부터 가용성 및 작용성 형태로 회수할 수 있다 [참고: 예를 들어, Lu et al., J. Immunol. Meth. 267:213-226, 2002].

형질전환시키거나 형질감염시킨 숙주 세포는 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 영양분과 기타 성분을 함유하는 배양 배지에서 통상적인 과정에 따라서 배양할 수 있다. 한정 배지 및 복합 배지를 포함한, 적합한 각종 배지가 당해 분야에 공지되어 있고, 이에는 일반적으로, 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄이 포함된다. 배지는 또한, 성장 인자 또는 혈청과 같은 성분을 필요한 만큼 함유할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로, 발현 벡터 상에 수반되거나 숙주 세포 내로 공동-형질감염된 선별성 마커에 의해 보충되는 필수 영양분의 결핍 또는 약물 선별에 의해 외적으로 부가된 DNA를 함유하는 세포에 관하여 선별할 것이다.

본 발명에 따르는 항체 단편은 수 많은 질환 또는 장애를 탐지 또는 치료하는 데에 유용할 수 있다. 이러한 질환 또는 장애에는 감염성 질환의 총칭적 표제 하에 기재된 질환 또는 장애, 예를 들어 세균성 감염증; 진균성 감염증; 염증성 질환/자가면역 질환, 예를 들면 류마티스성 관절염, 골관절염, 염증성 장 질환; 암; 알레르기성/아토피성 질환, 예를 들어 천식, 습진; 선천성 질환, 예를 들어 낭포성 섬유증, 겸상 적혈구 빈혈증; 피부 질환, 예를 들어 건선; 괴사 질환, 예를 들어 다발성 경화증; 이식, 예를 들어 기관 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환; 및 대사성/특발성 질환, 예를 들어 당뇨병이 포함될 수 있다. 본 발명에 따르는 항체 단편은 요법 및/또는 진단에 사용하기 위해 제형화할 수 있고, 본 발명의 추가의 국면에 따르면, 항체 단편 (단독으로 사용되거나, 또는 펩티드 또는 분자와 병용해서 사용된다)을 하나 이상의 제약상 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

본 발명은 다음 실시예에 보다 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이로써 제한되지 않는다.

실시예 1

Fab 변이체의 구축

3가지 Gal2 Fab 변이체를 발현하도록 플라스미드를 설계하였는데 (pDOW1196, pDOW3716 및 pDOW3717), 각각은 도 1에 도시된 바와 같이, Gal2 경쇄를 수반하고 상이한 길이의 CH1 영역을 함유하는 Gal2 중쇄를 수반한다. 중쇄 C-말단을 비교한 것이 도 2에 도시되어 있다. 플라스미드 pDOW1196은 경쇄와의 가닥간 디설파이드 결합에 관여한 시스테인 잔기에 대해 N-말단에 있는 절단된 4개 아미노산의 가장 짧은 CH1 영역을 함유하고 있다. 플라스미드 pDOW3716은 가닥간 디설파이드에 필요한 시스테인까지 연장되는 CH1 영역을 함유하고 있고, pDOW3717은 힌지 영역을 통하여 연장되는 CH1 영역을 함유하고 있다. 인산염 결합성 단백질 (pbp) 신호 서열과 융합된 Gal2 중쇄 및 경쇄를 Gal2 mAB 발현 플라스미드 pDOW2788로부터 증폭시켰다. 각 중쇄/경쇄 조합물을 단일 오페론으로서 Ptac 프로모터를 벗어나 클로닝시켰는데, 이는 중쇄 암호화 서열에 이어 3개의 논센스 코돈을 수반하고, pbp-경쇄 암호화 서열이 출발하기에 앞서 XbaI 부위, 최적의 리보솜 결합 부위 및 7개 뉴클레오티드 공간을 수반하였다. 이로써 생성되는 암호화 영역이 도 3 내지 5에 도시되어 있다.

실시예 2

피. 플루오레센스에서의 Gal2 Fab 변이체의 구축 및 발현

피. 플루오레센스 균주 DC454 (ΔpyrF lsc::lacI^Q) [참고: Schneider et al. 2005] 및 DC572 (ΔpyrFΔproCΔbenAB ΔmtlDYZ lsc::lacI^Q Pmtl:frnE proC)를 발현 숙주로서 사용하였다. DC572는 추정상의 디설파이드 이소머라제인 frnE 상동체 (RXF08657)를 과발현한다.

Fab 발현 플라스미드 구축: Fab 발현 플라스미드를 구축하기 위해 표준 클로닝 기술을 사용하였다 [참고: Sambrook et al. 2001]. 플라스미드 pDOW1196은 다음과 같이 구축하였다: Gal2 mAB의 중쇄 영역 [참고: V. Lee et al., report in preparation]은 프라이머 gal2HC_5' (ACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATGGC (서열 1)) 및 XbaI_VhCH1_R (TCTAGATCATTACTAAACGCGCTTGTCACCTTTCGTGTT (서열 2))를 사용하여 pDOW2788로부터 증폭시켰다. PCR 단편을 pCR2.1TOPO (공급처: Invitrogen) 내로 클로닝시키고, 이. 콜라이 Top1O 내로 형질전환시킨 다음, LB 소이 한천 Amp100 (공급처: Teknova) 상에서 선별하였다. 형질전환체로부터 제조된 플라스미드를 서열 분석함으로써 스크리닝하고, 양성 클론을 확인하였다. 서열 확인 결과, 단편은 SpeI 및 XbaI로 제한 분해되었고, 동일한 효소로 분해시킨 pDOW1173에 연결되었다. 이로써 생성된 연결물을 이용하여 DC454를 형질전환시키고, 형질전환체를 M9 글루코스 한천 (공급처: Teknova) 상에서 선별하고, 이를 대상으로 하여 SpeI 및 XbaI로 제한 분해시킴으로써 삽입물에 관하여 스크리닝하였다. Gal2 경쇄를, 프라이머 XbaI_pbp_F (TCTAGAAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG (서열 3)) 및 XhoI_L_R (CTCGAGCTATCATTAGCACTCGCCGCGATTAAACGACTT (서열 4))를 사용하여 pDOW2788로부터 증폭시키고, 이로써 생성된 단편을 pCR2.1TOPO 내로 클로닝시킨 다음, 앞서 기재된 바와 같이 확인하였다. 서열 확인 결과, 경쇄 단편은 XbaI 및 XhoI로 제한 분해되었고, 동일한 효소로 분해시킨 pDOW1173+ gal2 중쇄 단편 (상기 언급된 바와 같이 구축됨)에 연결되었다. DC454를 연결 혼합물로 형질전환시키고, 형질전환체를 M9 글루코스 한천 (공급처: Teknova) 상에서 선별하고, 이를 대상으로 하여 XbaI 및 XhoI로 제한 분해시킴으로써 삽입물에 관하여 스크리닝하였다.

gal2의 힌지 영역을 수반한 pbp-gal2 중쇄 및 gal2의 힌지 영역을 수반하지 않는 pbp-gal2 중쇄를 각각 함유하는 플라스미드 pDOW1197 및 pDOW1198을 구축하기 위해, 주형으로서 gal2 모노클로날 항체 (mAb)를 함유하는 플라스미드 pDOW2787를 사용하여 PCR (Stratagene Cat#600600)함으로써 단편을 증폭시켰다. 상기 힌지 영역을 수반하지 않는 pbp-gal2 중쇄는 2분 동안 94℃, (30초 동안 94℃; 30초 동안 45℃; 2분 동안 70℃) 30X, 10분 동안 72℃의 사이클링 조건 하에 프라이머 gal2HC_5' (ACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATGGCGG CAA (서열 5)) 및 CH1_rev (CGTCTAGATTATCACTAGCACGATTTCGGCTCAAC (서열 6))를 사용하여 증폭시켰다. 힌지 영역을 수반하는 pbp-gal2 중쇄는 상기 언급된 바와 동일한 조건 하에 프라이머 gal2HC_5' 및 CH1_힌지 (GCTCTAGATTACTATCAGCACGGCGGGCAGGTATGC (서열 7))를 사용하여 증폭시켰다. 정제된 PCR 생성물을 제한 효소 SpeI 및 XbaI로 분해시키고, 동일한 제한 부위 사이에 플라스미드 pDOW1169 내로 연결시킨 다음, DC454 내로 형질전환시켰다 (ΔpyrF lsc::lacIq1). 이로써 생성되는 형질전환체를 서열 분석하였고, 양성 클론은 각각 pDOW1197 및 pDOW1198로 명명하였다. gal2 경쇄 암호화 영역을 함유하는, pDOW1196로부터의 XbaI-XhoI 단편을, 동일한 효소로 분해시킨 각 pDOW1197 및 pDOW1198에 연결시켰다. 피. 플루오레센스 DC454를 상기 연결 생성물로 형질전환시키고, M9 글루코스 한천 상에서 선별한 다음, 양성 클론을 서열 분석하여 확인하였다. 이로써 생성된 플라스미드는 각각 pDOW3716 및 pDOW3717로 명명 되었다.

진탕 플라스크 발현: 각 클론을 수반하는 피. 플루오레센스 균주 DC454 또는 DC572를 표준 다우 (Dow) 1L-규모 진탕-플라스크 발현 프로토콜에 의해 분석하였다. 1% 글루코스와 미량 원소가 보충된 표준 배지에서 성장시킨 시드 배양물을 사용하여, 탄소원으로서 5% 글리세롤을 수반하는 200 ml의 한정 최소 염 배지에 접종하였다. 초기 성장 기 이후에, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 이용하여 Ptac 프로모터를 통한 발현을 유도시켰다. 표시되는 경우, 0.5% 만니톨을 이용하여 frnE를 유도시켰다. 배양물을 유도 시점 (IO) 및 유도 후 24시간째 (I24)에 샘플링하였다. 세포 밀도는 600 nm 하에서의 광밀도 (OD₆₀₀)로써 측정하였다. OD₆₀₀ = 20이 되도록 세포 밀도를 조정하고, 100 ㎕ 분취액을 5분 동안 14000 x g으로 원심분리시켰다. 상등액 (세포 무함유 육즙)을 새로운 미소원심분리용 튜브 내로 피펫팅한 다음, 세포 펠릿 및 세포 무함유 육즙 샘플을 나중의 처리 공정을 위해 -80℃ 하에 동결시켰다.

미니-생물 반응기에서의 발현: 균주에게 TDCC 배양 컬렉션으로부터의 글리세롤 원액을 공급하였다. 글리세롤을 수반한 600 ml PS/2 처방 배지로 구성된 시드 플라스크에, 각 균주에 대한 600 ㎕의 해동 글리세롤 원액을 접종하고, 20 내지 24시간 동안 3O℃, 300 rpm 하에 항온 배양하였다. 시드 플라스크 세포 밀도는 전형적으로, 가시광 분광측정계 상에서 575 nm 하에 12 내지 20 광밀도 (O.D.)로서 측정되었다. 시드 플라스크는 전형적으로, 5.5 내지 6.8 pH였다.

500 ml 소규모 발효기의 DASGIP FedBatch Pro 시스템을 균주 평가 및 실험 과정 설계에 사용하였다. 유도 후 0, 8, 16 및 24시간째에 분석용 샘플을 취하였다. 샘플을 대상으로 하여 O.D. 및 pH에 관하여 즉시 분석하였다. 0.100 g 분취액을 꺼내고, 미소원심분리기에서 최대 속도로 10분 동안 원심분리시킨 다음, 상등액을 피펫으로 제거하였다. 펠릿 및 상등액 (세포 무함유 육즙 또는 CFB)을 웨스턴 블롯팅 (Western Blotting) 및/또는 ELISA에 의해 분석할 때까지 -20℃ 하에 별개로 저장하였다.

실시예 3

SDS-PAGE, 웨스턴 및 ELISA 분석

이지 라이스 [Easy Lyse (공급처: Epicentre Technologies)]를 사용하여, 진탕 플라스크 샘플로부터 가용성 및 불용성 분획을 생성시켰다. 동결된 펠릿을 재현탁시키고, 용해 완충액에서 1:4로 희석시킨 다음, 30분 동안 실온 하에 진탕시키면서 항온 배양하였다. 용해물을 20분 동안 (4℃) 14,000 rpm으로 원심분리시키고, 상등액을 제거하였다. 상등액을 가용성 분획으로서 저장하였다. 이어서, 펠릿 (불용성 분획)을 등 용적의 용해 완충액에 재현탁시키고, 위 아래로 피펫팅함으로써 재현탁시켰다. 세포 무함유 육즙 샘플을 해동시키고, 완전한 강도로 사용하였다. 샘플을 β-머캅토에탄올을 함유하는 2X 램리 (Laemmli) 샘플 완충액 (BioRad cat# 161-0737)과 1:1로 혼합하고, 5분 동안 비등 시킨 후, 바이오-래드 (Bio-Rad) 기준 12% 기준 XT 겔 (공급처: BioRad) 상에 15 ㎕를 부하하고 권장된 1X MES 완충액 (공급처: BioRad)에서 전기영동시켰다. 겔을 제조업자의 프로토콜 에 따라서 염색물 [Simply Blue Safe Stain (Invitrogen cat# LC6060)]로 염색하고, 알파 이노테크 (Alpha Innotech) 영상화 시스템을 이용하여 영상화하였다. 웨스턴 분석을 기재된 바와 같이 수행하였다 (RP-MB-015). 진탕 플라스크 샘플의 경우, 10 ㎕ 20 OD 표준화 샘플을 부하하였다. 발효 샘플에 대해서는, 10 ㎕의 4Ox 희석율의 가용성 및 불용성 분획, 또는 5 ㎕의 2Ox 희석율의 CFB 분획을 12% 비스-트리스 (Bis-Tris) 폴리아크릴아미드 겔 상으로 부하하였다. 1:5000으로 희석된 항-인간 카파 경쇄 서양고추냉이 퍼옥시다제 HRP 접합체 (Sigma A7164)를 탐지 항체로서 사용하였다.

ELISA: 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 항체 염소 항-인간 카파 (Sigma A7164)를, 2% w/v 탈지유를 수반한 PBS로 이루어지는 차단성 용액에서 1:30,000 희석율로 사용하였다. ELISA 판의 웰을 200 ㎕의 10 ㎍/ml β-갈락토시다제 용액으로 채우고 실온 하에 밤새 항온 배양하여 시험용 판을 제조하였다. 상기 차단성 용액 중에서 100배로 정제된 단백질 A (050628B)를 희석시킨 다음, 매회 4배 희석율로 일련으로 7회 희석시킴으로써 Gal2 표준물을 제조하였다. 8개 표준 희석물을 상기 제조된 시험용 판의 별개 웰에 두번 되풀이 하여 옮겼다. 상기 언급된 바와 같이 제조된 발효 샘플을 별개로 3회씩 일련으로 희석시켜 (매번 5배 희석시킴) 4가지 상이한 희석물을 동일하게 하였다. 이 희석물을 상기 제조된 시험용 판의 별개 웰에 두번 되풀이 하여 옮겼다. 완성된 시험용 판을 실온 하에 2시간 동안 항온 배양한 다음, PBST로 세척하였다. 카파 항체를 모든 웰에 가하고 실온 하에 2시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 판을 PBST로 세척하였다. 세척한 후, 비색 기질 TMB를 모든 웰에 가하고, 판을 실온 하에 8분 내지 10분 동안 항온 배양하였다. 색상 전개가 완료된 후, 2N H2SO4를 가하여 반응을 중지시켰다. 이어서, 판을 UV 분광광도 판 판독기로 판독하였다.

실험 발효 설계: SAS JMP 소프트웨어 (버전 6.0)을 사용하여, 2가지 인자와 중간점을 수반한 전-계승 스크리닝 디자인을 설계 및 분석하였다. Gal2Fab의 가장 우수한 것으로 선별된 균주 (DC536)를 10개의 별개의 DASGIP 발효기 내로 접종하고, 예정된 2x2x2 인자 (및 이중 중간점)과 함께 성장시켰다. 배양물을 표적 O.D. 180 (±18)이 되도록 성장시킨 다음, 다음 표에 표시된 바와 같이 예정된 조건 하에 유도시켰다. 실험 조건 순서는 JMP 프로그램에 의해 무작위로 하였다. 유도 후 24시간째에 수거시, 샘플을 취하고, 처리한 다음, 상기 언급된 바와 같이 분석하였다. 가용성 분획에 대한 ELISA 값을 JMP 통계 파일에 효과로서 기록하고, 효과 스크리닝에 대한 모델을 이차 상호 작용물로서 및 별개로 모델링된 모든 인자와 함께 수행하였다.

실시예 4

진탕 플라스크 규모의 Fab 변이체의 발현

각 플라스미드를 야생형 피. 플루오레센스 (DC454) 뿐만 아니라 추정상의 디설파이드 이소머라제 FrnE를 과발현하는 피. 플루오레센스 균주 (DC572) 내로 형질전환시켰다. 이제까지는, 디설파이드 산화-환원효소 및 이소머라제 DsbA 및 DsbC 단백질의 과발현이 시험된 모노클로날 항체, 항체 단편 또는 기타 디설파이드 결합된 단백질의 용해도를 개선시키는 것으로 밝혀지지 않았다 [참고: Retallack et al. 2006a; Retallack et al. 2006b; Shao et al. 2006; Coleman, Schneider et al. 2007]. 각 Fab 구조물 pDOW1196 (절단된 CH1), pDOW3716 (Fab) 및 pDOW3717 (Fab + 힌지)로 형질전환시킨 DC454 및 DC572 (표 1 참고)를 대상으로 하여 소규모 (진탕 플라스크) 발현 분석을 수행하였다.

본 연구를 위해 구축된 균주

플라스미드 번호	DC454 숙주 균주	DC572 숙주 균주
pDOW1196	DC536	DC593
pDOW3716	DC589	DC591
pDOW3717	DC590	DC592

모든 균주는 유도 시점에 대략 15 OD가 되도록 성장시켰다. 성장한지 24시간 후에 IPTG 및 만니톨을 각각 이용하여, 중쇄 및 경쇄 유전자를 DC572 숙주 내의 frnE 유전자와 함께 유도시켰다. 광밀도가 약간 감소된, pDOW3717를 수반한 DC572 (DC592)를 제외한 모든 균주에 대한 세포 밀도가 16 내지 20 OD로 증가하였다.

절단된 CH1 생성물 중쇄 (pDOW1196)는 분비 리더 프로세싱 없이는 25.4 kDa인 것으로 예상되었고, 리더 프로세싱을 수반한 경우에는 23 kDa인 것으로 예상되었다. pDOW3716에 의해 암호화된 중쇄 생성물은 리더 프로세싱 없이는 26 kDa인 것으로 예상되었고, 리더 프로세싱을 수반한 경우에는 23.5 kDa인 것으로 예상되었고; pDOW3717에 의해 암호화된 중쇄 생성물은 리더 프로세싱 없이는 26.7 kDa인 것으로 예상되었고, 리더 프로세싱을 수반한 경우에는 24.5 kDa인 것으로 예상되었다. 경쇄는 리더 프로세싱 없이는 25.7 kDa인 것으로 예상되었고, 리더 프로세싱을 수반한 경우에는 23.3 kDa인 것으로 예상되었다. 환원성 SDS-PAGE 분석 결과, 도 6에 도시된 바와 같이 pDOW1196 구조물과 pDOW3717 구조물 둘 다로부터 주로 불용성인 중쇄 및/또는 경쇄가 발현된 것으로 밝혀졌다. frnE의 과발현은 pDOW1196으로부터 발현된 유도된 불용성 단백질의 양을 감소시키는 것으로 여겨지는 반면, 보다 유도된 불용성 단백질은 pDOW3716 또는 pDOW3717을 수반하는 frnE 과발현성 균주에서 관찰되었다. 항-카파 항체를 사용하여 경쇄 발현을 탐지하기 위한 웨스턴 분석을 수행하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 환원성 조건 하에 수행된 샘플은 주로 프로세싱된 경쇄를 나타내었지만, 프로세싱되지 않은 소량의 가용성 경쇄가 DC454/pDOW1196 균주로부터 발현되었다 (도 7A). 비-환원성 조건 하에 수행된 웨스턴 분석 (도 7B)은 경쇄를 함유하는 이량체가 형성되었다는 것을 나타내었다. pDOW1196 함유 균주 (절단된 CH1)에서는, 양 경쇄 단량체 뿐만 아니라 중간 크기의 다량체가 탐지되었다. 더우기, 경쇄는 비-환원성 조건 하에 pDOW1196-함유 균주의 가용성 및 세포 무함유 육즙 분획에서만 탐지되었지만, SDS-PAGE 분석과 웨스턴 분석 둘 다에서는 환원성 조건 하에 상당량의 불용성 경쇄가 탐지되었다. 그러나, pDOW3716 및 pDOW3717을 수반하는 균주로부터 발현된 다량체와 연합된 불용성 경쇄가 탐지되었다 (도 7B). pDOW3717를 수반하는 균주의 경우에는 (힌지를 수반한 CH1), 경쇄가 야생형 숙주에서 불용성 단백질로서 탐지되었다. 그러나, 경쇄는 FrnE 과발현 숙주에서와 마찬가지로 가용성 및 세포 무함유 육즙 분획에서도, 환원성 조건 하에서는 단량체로서 탐지되었고 비-환원성 조건 하에서는 다량체로서 탐지되었다. 더우기, FrnE 과발현 숙주에서 증가된 양의 불용성 경쇄는 도 7에 도시된 바와 같이, 야생형 숙주에서 탐지된 것과 비교되는 것으로 관찰되었다.

발현된 활성 항체 단편 수준을 검정하기 위한 ELISA를 수행하였다. 경쇄 단독 또는 중쇄 단독 이량체가 β-갈락토시다제와 결합할 수 있는 지의 여부는 공지되어 있지 않았지만, 활성이 적당하게 폴딩되고 어셈블리된 중쇄-경쇄 이량체의 양에 상응한 것으로 추정되었다. 6개 균주 각각으로부터의 가용성 및 세포 무함유 육즙 분획을 대상으로 하여, 도 8에 도시된 바와 같이 결합 활성에 관하여 시험하였다. pDOW1196으로부터 발현된 항체 단편은 pDOW3716 및 pDOW3717로부터 발현된 것 보다 상당히 더 높은 활성을 나타내었다. FrnE의 과발현은 pDOW1196 함유 균주의 가용성 또는 세포 무함유 육즙 분획에서 탐지된 활성 양에 강한 영향력을 미치지 못하였다. FrnE는 pDOW3716 및 pDOW3717로부터 발현된 활성 Fab의 양을 개선시킨 것으로 여겨지는데, 대략 2배 더 높은 활성이 탐지되었다.

실시예 5

DASGIP 미니-생물 반응기에서의 Fab 변이체의 발현

야생형 숙주 DC454에서 3개 Fab 구조물 각각으로부터의 Fab 발현은 DASGIP 미니-생물 반응기에서 300 ml 발효 규모로 확인하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 4개 복제물 중의 3개에서, DC536 (pDOW1196을 수반함)은 세포 무함유 육즙 (CFB) 및/또는 가용성 분획에서 상당 량의 활성 Gal2 Fab를 발현하였다. 균주 DC589 (pDOW3716)는 비록 4개 복제물 실험 모두에서 활성 Fab 발현이 존재한다 해도 거의 없는 것으로 나타난 반면, 균주 DC590 (pDOW3717)는 수행된 4개 실험 중의 1개에서 상당한 활성을 나타내었다. 이들 결과는 진탕 플라스크 규모에서 관찰된 것을 확인시켜 주었는데, 가장 다량의 활성 Fab는 pDOW1196으로부터 절단된 Fab를 발현하는 DC536으로부터 탐지되었다.

실험 설계 (DoE) 분석은 DC536을 사용하여 수행하여, 발현된 가용성 활성 Gal2 Fab의 양을 추가로 개선시키기 위해 발효 조건을 최적화시킬 수 있었는지를 결정하였다. 시험된 조건이 표 1에 제시되었다. 반응 (가용성 활성 단백질) 분석 결과는 도 10에 도시된 바와 같이 정상적인 데이터 분포도를 나타내었다. 그 결과는 예정된 결과에 대항하여 플롯한 경우에 모두 신뢰 한계 범위 내에 속하였다. 가용성 활성 단백질의 발현에 대한 가장 유의적 효과는 IPTG 농도와 유도 온도의 상호 작용에서 관찰되었다. 각 박스 내의 라인의 관계에 의해 효과를 가시화하였다. 평행 선은 그래프화된 두 인자 간의 상호 작용 효과가 없다는 것을 나타낸다. 교차하는 선은 두 인자가 병용해서 반응에 보다 큰 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 상호 작용 프로파일은 인자 "유도 pH"와 "유도 온도" 간에는 상호 작용 효과가 전혀 없고, "IPTG 농도"와 "유도 pH" 간에는 상호 작용 효과가 거의 없다는 것을 나타낸다. "IPTG 농도"와 "유도 온도" 간의 상호 작용 효과는 가장 높은 유의성을 나타낸다.

frnE 디설파이드 이소머라제를 과발현하는 3개 균주 (DC591, DC592, DC593) 각각을 DASGIP 미니-생물 반응기에서 두번 되풀이 하여 성장시켰다. 이들 균주의 성장을 대조군 (DC536)과 비교한 경우, 이는 성장 기 동안에는 거의 동등한 수준이었다. 후기 유도 기 동안에는, OD가 상기 frnE 과발현 균주에서는 감소하였는데, 이는 세포 용해의 가능한 지표이다. 최종 샘플은 점액성이어서, 샘플 수집과 제조 동안에 별개로 분리시키는 것이 어려워졌다. 샘플의 점도는 몇몇 단백질을 세포 펠릿이 아니라 CFB에 고립되도록 함으로써 도 11에 도시된 바와 같이 2개의 균주 DC593로부터의 ELISA 결과에서 불일치의 원인이 될 수 있다. 그러나, 이러한 점도는 아마도, 균주 DC591/592와 균주 DC593 간의 단백질 양에 있어서의 상당한 차이에 기여하지는 않은 것으로 결정되었는데, 이는 모든 frnE 과발현 균주가 수거 시점에 점성이었기 때문이다. 균주 DC593은 2개 복제물 중의 하나에서 대조군 DC536보다 더 많은 Gal2 Fab를 발현하였다. 제2 DC593 복제물은 대조군보다 적은 Gal2 Fab를 발현하였지만, ELISA에 의해 결정된 바와 같이 DC591 또는 DC592보다 훨씬 더 많은 단백질을 발현하였다 (도 11). DC593 복제물 간의 변동과 상관없이, pDOW1196으로부터의 절단된 Gal2 Fab의 발현으로 인해, pDOW3716 (DC589 및 DC591) 또는 pDOW3717 (DC590 및 DC592)로부터의 부가의 시스테인 잔기를 함유하는 Gal2 Fab의 발현과 비교해서 가용성 활성 단백질 (DC536 및 DC593)의 생산량이 증가하였다.

<110> Dow Chemical Retallack, Diane M Mitchell, Jon C <120> Expression of Soluble Antibody Fragment by Truncation of CH1 Domain <130> 2971.01-8345US <160> 22 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized: primer gal2HC_5' <400> 1 actagtagga ggtaacttat gaaactgaaa cgtttgatgg c 41 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized: primer XbaI_VhCH1_R <400> 2 tctagatcat tactaaacgc gcttgtcacc tttcgtgtt 39 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized: primer XbaI_pbp_F <400> 3 tctagaagga ggtaacttat gaaactgaaa cgtttgatg 39 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized: primer XhoI_L_R <400> 4 ctcgagctat cattagcact cgccgcgatt aaacgactt 39 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized: primer gal2HC_5' <400> 5 actagtagga ggtaacttat gaaactgaaa cgtttgatgg cggcaa 46 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His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 <210> 11 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <400> 11 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 12 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pbp heavy chain <400> 12 aggaggtaac tt 12 <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pbp light chain <400> 13 aggaggtaac tt 12 <210> 14 <211> 1620 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> CDS <222> (119)..(844) <223> Coding Region of 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Gly Ser Ile Ser Ser Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Gly Pro Ala Gly 115 120 125 Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Val Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala 245 250 255 Ala Gly Val Ala 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Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Met Lys Leu Lys Arg Leu 245 250 255 Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn Ala 260 265 270 Val Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser 275 280 285 Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr 290 295 300 His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 305 310 315 320 Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe 325 330 335 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 340 345 350 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr 355 360 365 Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Val 370 375 380 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 385 390 395 400 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 405 410 415 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 420 425 430 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 435 440 445 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 450 455 460 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 465 470 475 480 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 485 <210> 22 <211> 1639 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Complementary Strand of Coding region of pDOW3717 <400> 22 gactttactc gacaactgtt aattagtagc cgagcatatt acacacctta acactcgcct 60 attgttaaag tgtgtccttt gtcttaaaat tagatgatca tcctccattg aatactttga 120 ctttgcaaac taccgccgtt actgaaaaca gcgacgaccg caacgctggc ggttgcgcca 180 ccgggtccac gtcgacgtcc tcagcccggg tcctgaccac ttcggaagcc tctgggacag 240 ggagtggacg tgacagagac caccaaggta gtcatcaata gtgacctcga cctaggccgt 300 cgggggtccc ttccctgacc tcacctaacc catatagata atgtcaccct cgtggttgat 360 gttggggagg gagttcttag ctcagtggta tagacatctg tgcaggttct tggtcaagag 420 ggacttggac tccagacact ggcgacgtct gtgccggcac ataatgacac gcgctccttg 480 cataccgggt cggcctctac gaaaactata gacccccgtt ccctggtgcc agtggcagag 540 cagccggagg tgctttccgg gctcgcacaa gggcgaccgc ggttcgaggt tctcgtggtc 600 gccgccgtgg cggcgcgacc caacagagca gtttctaatg aaggggcttg gccactggca 660 cagcaccttg aggccccgcg actggtcgcc acaggtatgg aagggacggc acgaggtcag 720 gaggccggac ataagggact cgagccacca ctggcacggc agcagctcga acccgtgggt 780 ttggatgtag acgttgcagt tggtattcgg gaggttgtgc tttcaactgt tcgcgcaact 840 cggctttagc acgctgttct gcgtatggac gggcggcacg actatcatta gatcttcctc 900 cattgaatac tttgactttg caaactaccg ccgttactga aaacagcgac gaccgcaacg 960 ctggcggttg cgccaccggc tgtaggtcta ctgggtcaga ggaaggtggg acagacgtag 1020 ataacctctg tctcagtggt agtggacggc ccggtcactc ccataaatag tgaccaaccg 1080 gaccatagtc gtcttcggtc cctttcgggg atttgaggac tagatattcc ggagatcaaa 1140 tcggtcaccc cggggtagtt ccaagtcgcc gtcacctaga ccctgtctaa agtgagagtg 1200 gtagtcgtcg gacgtcggac tactaaaacg ttgaataatg acggttgtta tatcattaat 1260 aggcgagtga aagccgcctc cctggttcga cctctagttt gcacgccagc ggcggggcag 1320 ccaaaagtaa aagggcggta gcctactcgt cgagttcagc ccgtgccgct cgcaccagac 1380 ggacgagttg ttgaaaatgg gcgcgctccg gttccacgtc accttccagc tgttgcggga 1440 cgtcagcccg ttgtcggtcc tcagccagtg gctcgtccta tcgttcctaa ggtggataag 1500 ggagtcgagc tgggactgcg actcgttccg gctaatactc ttcgtatttc aaatgcgaac 1560 acttcactgg gtggtcccgg actcgtcggg ccactggttc agcaaattag cgccgctcac 1620 gattactatc gagctcggg 1639

Claims (31)

1. 항체 단편 (Fab)을 제공하는 단계;

   Fab의 중쇄 불변 영역 (CH1)을 절단(truncating)시켜 경쇄와의 디설파이드 결합 형성에 요구되는 시스테인 아미노산이 제거된 Fab 단편을 형성시키는 단계;

   상기 Fab 단편을 원핵 생물에서 클로닝하는 단계; 및

   Fab 단편을 원핵 생물에서 발현 또는 분비시키는 단계

   를 포함하는, 활성 항체 단편의 발현을 개선시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 원핵 생물이 세균을 포함하는 방법.
3. 제3항에 있어서, 원핵 생물이 슈도모나스 (Pseudomonas) 균주를 포함하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 원핵 생물이 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens)를 포함하는 방법.
5. 제1항에 있어서, Fab의 CH1을 절단시키는 단계가 디설파이드 결합 형성에 요구되는 시스테인 아미노산의 상류 또는 하류에 있는 100개 이하 아미노산을 제거하는 것을 포함하는 방법.
6. 제1항에 있어서, Fab의 CH1을 절단시키는 단계가 디설파이드 결합 형성에 요구되는 시스테인 아미노산의 상류 또는 하류에 있는 5개 이하 아미노산을 제거하는 것을 포함하는 방법.
7. 제1항에 있어서, Fab의 CH1을 절단시키는 단계가 디설파이드 결합 형성에 요구되는 시스테인 아미노산의 상류에 있는 4개 아미노산을 제거하는 것을 포함하는 방법.
8. 제1항에 있어서, Fab 단편이 플라스미드 프로모터로부터 전사된 단일 오페론 (operon)으로서 클로닝되는 방법.
9. 제8항에 있어서, 플라스미드 프로모터가 플라스미드 pDOW1169의 Ptac 프로모터인 방법.
10. 제1항에 있어서, 분자, 중합체 또는 펩티드를 Fab 단편에 융합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 융합 단계가 Fab의 단편의 PGE화(pegylation)를 포함하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 융합 단계가, Fab 단편이 발현 또는 분비된 후에 분자, 중합체 또는 펩티드를 Fab 단편에 융합시키는 것을 포함하는 방법.
13. 제10항에 있어서, 융합 단계가 분자, 중합체 또는 펩티드를 Fab 단편에 해독적으로 융합시키는 것을 포함하는 방법.
14. 제10항에 있어서, 분자가 약물, 독소, 단백질, 펩티드, 효소, 중합체, 핵산, 단편 및 그의 유도체로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
15. 제1항에 있어서, Fab 단편을 제약 조성물 내로 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
16. 제15항에 있어서, Fab 단편이 펩티드 또는 분자를 추가로 포함하는 방법.
17. 작동적으로 연결된 다음 요소를 포함하는 발현 벡터:

    전사 프로모터;

    절단된 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 경쇄와의 디설파이드 결합 형성에 요구되는 시스테인 아미노산이 제거된 Fab 단편을 암호화하는 DNA 절편; 및

    전사 종결인자.
18. 제17항에 있어서, 프로모터가 플라스미드 pDOW1169의 Ptac 프로모터인 발현 벡터.
19. 제17항에 있어서,

    프로모터 다음에 리보솜 결합 부위; 및

    절단된 중쇄 및 경쇄 암호화 서열과 융합된 주변세포질 분비 리더 암호화 서열

    을 추가로 포함하는 발현 벡터.
20. 제17항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
21. 제20항에 있어서, 미생물을 포함하는 숙주 세포.
22. 제21항에 있어서, 슈도모나스 균주를 포함하는 숙주 세포.
23. 제22항에 있어서, 슈도모나스 플루오레센스를 포함하는 숙주 세포.
24. 항체 단편 (Fab)을 제공하는 단계;

    Fab의 중쇄 불변 영역 (CH1)을 절단시켜 경쇄와의 디설파이드 결합 형성에 요구되는 시스테인 아미노산이 제거된 Fab 단편을 형성시키는 단계;

    상기 Fab 단편을 원핵 생물에서 클로닝하는 단계; 및

    Fab 단편을 원핵 생물에서 분비시키는 단계

    를 포함하는, 활성 항체 단편의 발현을 개선시키는 방법.
25. 제24항에 있어서, 원핵 생물이 세균을 포함하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 원핵 생물이 슈도모나스 균주를 포함하는 방법.
27. 제25항에 있어서, 원핵 생물이 슈도모나스 플루오레센스를 포함하는 방법.
28. 항체 단편 (Fab)을 제공하는 단계;

    Fab의 카파 또는 람다 경쇄를 절단시켜 Fab 단편을 형성시키는 단계;

    상기 Fab 단편을 원핵 생물에서 클로닝하는 단계; 및

    Fab 단편을 원핵 생물에서 발현 또는 분비시키는 단계

    를 포함하는, 활성 항체 단편의 발현을 개선시키는 방법.
29. 작동적으로 연결된 다음 요소를 포함하는 발현 벡터:

    전사 프로모터;

    절단된 카파 경쇄 또는 절단된 람다 경쇄를 갖는 Fab 단편을 암호화하는 DNA 절편; 및

    전사 종결인자.
30. 제29항에 있어서,

    프로모터 다음에 리보솜 결합 부위; 및

    절단된 중쇄 및 경쇄 암호화 서열과 융합된 주변세포질 분비 리더 암호화 서열

    을 추가로 포함하는 발현 벡터.
31. 제30항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.

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