CN101372502A - 一种枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的分离提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的分离提取方法。具体为将枯草芽孢杆菌发酵液的粗提物经SephadexG－25柱层析，层析收集活性峰，经Sephadex G－25柱收集的活性峰再通过Sephadex G－100柱层析，收集活性峰，所得物质通过质谱检测，即为7种脂肽类抗菌物质。本发明分离提纯工艺具有简单、快速、高效、操作条件温和等特点。并且提取出的脂肽类抗菌物质对多种病原真菌具有很好的抑制效果，且具有对温度、pH稳定，耐蛋白酶水解等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的分离提取方法。
技术背景
枯草芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，脂肽类抗菌物质是其中重要的一类，它们具有很强的抗菌活性，该类抗菌物质性质稳定，对高温、酸碱、蛋白酶均具有很好的耐受性，且低毒、低残留，在生物农药、饲料添加剂、食品添加剂、抗真菌药物、抗病毒药物等方面具有潜在的应用价值，已成为当前国内外研究的一个热点。
枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质由于结构的不同，通常被分成三个组:伊枯草菌素(iturins)、表面活性素(surfactin)和plipastatin-fengycin家族抗菌物质，iturins由7个氨基酸组成的肽链和1条β-氨基脂肪酸链构成，surfactin和plipastatin-fengycin分别由7个氨基酸和10个氨基酸组成的肽链及1条β-羟基脂肪酸链构成。
枯草芽孢杆菌及其发酵产物可作为生物农药使用，由于其中杂质较多，限制了它的使用范围，对其活性成分进行分离提取，可以解决杂质污染带来的问题，使其有效成分能更好的发挥作用。目前，枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的提取方法主要是分以下三个步骤(1)发酵液用盐酸调至pH2.0，收集沉淀；(2)甲醇抽提；(3)反相高效液相色谱柱层析分离。现有技术取方法操作复杂、对设备要求高，可用于脂肽类抗菌物质的少量制备，不适合大规模生产。
发明内容
本发明目的在于提供一种操作简单、快速有效、条件温和、适合工业化生产的枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的分离提取方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为:
分离提取方法:将枯草芽孢杆菌发酵液的粗提物经Sephadex G-25柱层析，用去离子水进行洗脱，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脱峰，经Sephadex G-25柱收集的洗脱峰再通过Sephadex G-100柱层析，用去离子水进行洗脱，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脱峰，所得物质通过质谱检测，即为7种脂肽类抗菌物质。
所述枯草芽孢杆菌发酵液粗提物为:将发酵的枯草芽孢杆菌液以6000-8000转/分钟离心10分钟，取上清液并加入发酵的枯草芽孢杆菌液2-3倍体积的丙酮，0-4℃沉淀12小时；而后再以11000-14000转/分钟离心10-20分钟收集上清，所得上清液经40-60℃旋转蒸发浓缩至原发酵液体积的5-10％，冷冻干燥后即得发酵液粗提物，待用。
所述Sephadex G-25柱层析是将待用的枯草芽孢杆菌发酵粗提物经Sephadex G-25层析柱层析，用去离子水进行洗脱，流速为0.15-0.2mL/min，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脱峰，所得洗脱峰冷冻干燥，待用。
所述SephadexG-100柱层析是将经Sephadex G-25层析柱层析收集的物质，再经Sephadex G-100层析柱纯化，用去离子水进行洗脱，流速为0.15-0.2mL/min，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脱峰，所得洗脱峰冷冻干燥，待用。
本发明所具有的优点:
本发明提供的方法可快速有效分离提取枯草芽孢杆菌发酵液中脂肽类抗菌物质，其制备工艺简单快速，操作条件温和，对试剂、仪器设备要求低，更适合于工业化生产。分离提取后通过MALDI-TOF质谱及氨基酸组成分析确定出分离的7种脂肽类抗菌物质的分子构成，其7种脂肽类抗菌物质为C16itruin A(M+H)、C16itruin A(M+Na)、C16itruin A(M+K)、C17itruinA(M+H)、C17itruin A(M+Na)、C17itruin A(M+K)和C15surfactin C(M+K)。
并且分离的7种脂肽类抗菌物质具有广谱的抗真菌活性，可用于番茄早疫病、芹菜菌核病、莴笋菌核病、黄瓜枯萎病、苹果轮纹病等植物真菌病害的防治；同时，该7种脂肽类抗菌物质也可做为饲料添加剂用于防治黄曲霉等真菌引起的霉变，另外它们在抗真菌、抗病毒、抗肿瘤方面也具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明分离出7种脂肽类抗菌物质的MALDI-TOF质谱图。
具体实施方式
枯草芽孢杆菌发酵液的粗提物的制备:
将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基，在37℃，200转/分钟摇床振荡培养24h，得到枯草芽孢杆菌发酵液。所述LB培养基:蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，水100mL，pH7.2-7.4。
取上述制备枯草芽孢杆菌发酵液50mL，按6000转/分钟的速度进行离心10分钟，取上清液，并在上清液中加入100mL丙酮，4℃沉淀过夜，12000转/分钟离心收集上清，60℃旋转蒸发浓缩至5mL，冷冻干燥，得到发酵液粗提物干物质200mg，待用。
称取Sephdex G-25凝胶40g，充分溶涨，常规装柱，床体积为100mL(φ1.7cm×44cm)，将上述得到的冻干后的发酵液粗提物配成400mg/mL水溶液，取0.5mL加至SephdexG-25层析柱上，用去离子水洗脱，流速为0.2mL/min，用部分收集器每15分钟收集一管，收集30管，每管3mL。以啤酒酵母作指示菌，采用管碟法(见参考文献“胡昌勒、刘炜，《抗生素微生物检定法及其标准操作》，气象出版社，2004，198页”)检测每管的抗菌活性，收集具有抗啤酒酵母的活性峰(一般为第11-14管)，冷冻干燥，得到干物质5mg，待用。
称取Sephdex G-100凝胶10g，充分溶涨，常规装柱，床体积为100mL(φ1.7cm×44cm)，将过Sephadex G-25柱后冷冻干燥的干物质配成10mg/mL水溶液，取0.5mL加至Sephdex G-100层析柱上，用去离子水洗脱，流速为0.2mL/min，用部分收集器每15分钟收集一管，收集30管，每管3mL。以啤酒酵母作指示菌，采用管碟法检测每管的抗菌活性，收集具有抗啤酒酵母的活性峰(一般为7-10管)，冷冻干燥，得到干物质1.9mg即为脂肽类抗菌物质。
将提取后的脂肽类抗菌物质经MALDI-TOF质谱检测含有7种抗菌活性成分，相对分子质量分别为:1071.63、1074.68、1085.65、1093.62、1107.66、1109.63、1123.66，(参见图1)。综合氨基酸组成分析结果，可以判断上述7种活性成分为脂肽类抗菌物质iturin A和surfactin(Joachim V，BarbelKablitz.Matrix-assisted laster desorption ionization-time offlight mass spectrometry of lipopeptide biosurfactants in wholecells and culture filtrates of Bacillus subtilis C-1 isolated frompetroleum sludge.Appl.Envir.Microbiol，2002，68:6210-6219)各峰归属详见表1。
表1 抗菌物质MALDI-TOF质谱各峰值的归属
| 抗菌物质的相对分子质量 | 抗菌物质 |
| 1071.63 | C16itruin A(M+H)+ |
| 1093.62 | C16itruin A(M+Na)+ |
| 1109.63 | C16itruin A(M+K)+ |
| 1085.65 | C17itruin A(M+H)+ |
| 1107.66 | C17itruin A(M+Na)+ |
| 1123.66 | C17itruin A(M+K)+ |
| 1074.68 | C15surfactin C(M+K)+ |
Claims (4)
1.一种枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的分离提取方法，其特征在于：将枯草芽孢杆菌发酵液的粗提物经Sephadex G-25柱层析，用去离子水进行洗脱，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脱峰，经Sephadex G-25柱收集的洗脱峰再通过Sephadex G-100柱层析，用去离子水进行洗脱，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脱峰，所得物质通过质谱检测，即为7种脂肽类抗菌物质。
2.按权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌发酵液粗提物为：将发酵的枯草芽孢杆菌液以6000-8000转/分钟离心10分钟，取上清液并加入发酵的枯草芽孢杆菌液2-3倍体积的丙酮，0-4℃沉淀12小时；而后再以11000-14000转/分钟离心10-20分钟收集上清，所得上清液经40-60℃旋转蒸发浓缩至原发酵液体积的5-10％，冷冻干燥后即得发酵液粗提物，待用。
3.按权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于：所述Sephadex G-25柱层析是将待用的枯草芽孢杆菌发酵粗提物经Sephadex G-25层析柱层析，用去离子水进行洗脱，流速为0.15-0.2mL/min，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脱峰，所得洗脱峰冷冻干燥，待用。
4.按权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于：所述SephadexG-100柱层析是将经Sephadex G-25层析柱层析收集的物质，再经Sephadex G-100层析柱纯化，用去离子水进行洗脱，流速为0.15-0.2mL/min，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脱峰，所得洗脱峰冷冻干燥，待用。
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